CN101165182B

CN101165182B - 用金磁微粒纯化dna的方法

Info

Publication number: CN101165182B
Application number: CN200610104755A
Authority: CN
Inventors: 崔亚丽; 陈超; 曹树辉
Original assignee: XIDA BEIMEI GENE CO Ltd SHANXI
Current assignee: Shaanxi Lifegen Co Ltd; Xi'an Goldmag Nanobiotech Co Ltd
Priority date: 2006-10-19
Filing date: 2006-10-19
Publication date: 2010-05-12
Anticipated expiration: 2026-10-19
Also published as: CN101165182A

Abstract

本发明涉及一种用金磁微粒纯化DNA的方法，包括：1.制备含有DNA的液态样品；2.金磁微粒与含有DNA的液态样品混合，形成金磁微粒-DNA复合物；其中金磁微粒是以磁性纳米粒子或磁性纳米粒子的聚集体为核，在核表面包覆单质金、银等贵金属壳层形成的磁性复合微粒，也是以磁性纳米粒子或磁性纳米粒子的聚集体为核，在核表面组装纳米金、银等贵金属粒子形成的磁性复合微粒；平均直径为0.05～100μm；3.施加外磁场将吸附了DNA的金磁微粒与液态样品其他组分分离；4.将吸附在磁性材料表面的DNA洗脱。本发明可有效地从各种样品中纯化DNA，具有纯化率高，DNA完整性好、纯度高，操作方便快捷的优点。

Description

用金磁微粒纯化DNA的方法

技术领域

本发明涉及一种对DNA进行纯化的方法。

背景技术

DNA纯化是分子生物学实验中的一项关键技术，是下游实验的前提和基础，纯化的质量将直接关系到以后实验的成功与否，如PCR扩增、酶切反应、从血液、唾液等样品中纯化DNA用于亲子鉴定、刑事犯罪的基因鉴定以及从各种组织中纯化DNA以构建文库等。因此寻求快速、高效、简易、低成本的DNA纯化方法一直是人们关注的方向。

目前常用的几种DNA提取方法均存在一些缺点。酚-氯仿纯化方法，虽然适用于大多数生物样本，但实验操作时间长、步骤繁琐、容易造成DNA的污染，也不利于自动化和多个样本的同时纯化，对微量生物样品DNA纯化亦存在困难。此外，酚、氯仿等有机试剂易造成环境污染，有损操作者的健康。Chelex-100方法简单，其原理基于树脂的络合作用，提取的DNA可直接用于PCR扩增，但该方法得到的DNA纯度不高而不利于后继分子生物学实验的进行，并且这种方法只适用于微量样品，不适合大量样品的操作。玻璃珠法依赖于DNA与玻璃珠表面的静电吸附，优点在于操作简便，采用物理吸附法纯化DNA不需要特殊的设备。但是由于玻璃珠比表面积小，纯化效率低，而且不能彻底除去抑制剂，限制了其应用的范围。

磁珠法是近年来发展迅速的一种DNA纯化方法，它具有操作简单、纯化质量高、无酚、氯仿等有机试剂的污染等优点，因此该方法越来越受到人们的亲睐。专利ZL 02139818.6采用氨基化二氧化硅磁性纳米颗粒快速抽提纯化DNA的方法，专利CN 1370230A采用二氧化硅磁性颗粒对DNA的分离和专利CN1535979A用磁性纳米复合材料提取DNA的方法都对以磁性材料为载体纯化DNA进行了公开，但是现有的磁性材料纯化技术中存在纯化率低、纯度差、操作时间长等缺点。

组装型磁性复合微粒和核/壳型超顺磁性复合微粒的制备方法以及结构组成已经在中国专利ZL 03153486.4和ZL 03124061.5分别进行了公开，但其应用中主要包括分子固定以及相关检测的内容，未涉及到对DNA进行纯化的内容。

发明内容

本发明目的是提供一种用金磁微粒纯化DNA的方法，其解决了现有技术对DNA纯化效率低、纯度差、操作时间长等缺点。

本发明的技术解决方案是：

一种用金磁微粒纯化DNA的方法，该方法包括以下步骤：

1]制备含有DNA的液态样品：用裂解液将细胞或组织样品裂解得到含有DNA的液态样品，或者对DNA分离凝胶进行溶解得到含有DNA的液态样品，或者直接使用PCR扩增产物中含有DNA的液态样品；

2]将金磁微粒和含有DNA的液态样品混合：将金磁微粒与含有DNA的液态样品混合，加入偶联缓冲液，形成含有金磁微粒一DNA复合物的混合溶液；所述偶联缓冲液为聚乙二醇和盐的混合溶液，其中聚乙二醇的分子量在6000～10000之间，浓度为10％～35％，其中的盐是氯化钠、氯化锂、氯化钡、氯化钾、氯化钙、氯化镁或氯化铯，浓度为0.5M～5.0M；

3]将金磁微粒-DNA复合物从混合溶液中分离：将混合溶液磁性分离，弃上清，用清洗缓冲液清洗金磁微粒，重复磁性分离，直至上清澄清，移除上清，得金磁微粒一DNA复合物；所述的清洗缓冲液为50％～100％的乙醇溶液；

4]将吸附在金磁微粒表面的DNA洗脱：用洗脱缓冲液对金磁微粒进行洗脱，磁性分离至上清澄清，所得上清即为纯化后的DNA的液态样品，所述洗脱缓冲液为水或pH＝7.0～9.0的TE缓冲液。

上述方法还包括金磁微粒的预处理步骤：为了去除影响DNA吸附的游离铁氧化物，在金磁微粒与含有DNA的液态样品混合前，先用预处理缓冲液对金磁微粒进行清洗，所述预处理缓冲液为0.1M～1.0M的pH＝6.0～8.5的EDTA溶液。

上述方法还包括金磁微粒的再生步骤：将吸附在金磁微粒表面的DNA洗脱完毕，磁性分离后的金磁微粒可以重复使用或是保存在预处理缓冲液中备用。

上述预处理缓冲液优选0.6M的pH＝7.6的EDTA；偶联缓冲液优选25％的PEG 8000和2.0M的氯化钠的混合溶液，混合溶液中PEG 8000的终浓度为25％，氯化钠的终浓度为2.0M；清洗缓冲液优选75％的乙醇溶液；洗脱缓冲液优选pH＝7.6的TE缓冲液。

上述裂解液选自碱性裂解液、酸性裂解液、碘化钠裂解液、胍裂解液或SDS裂解液。

上述DNA的液态样品包括PCR液。

本发明的优点是：

1、纯化率高，DNA的纯化率一般在90％左右。现有技术采用纳米技术(CN1535979A)的纯化率为80％，本发明金磁微粒均具有金、银组成的表面具有较大的比表面积，因此具有更大的固定容量，在相同条件下，金磁微粒纯化相同样品时用量比现有技术(CN 1535979A)的磁性微粒少，1mg的金磁微粒能够纯化0.6mg的基因组DNA。

2、金磁微粒纯化的DNA完整性好：金磁微粒表面的金、银颗粒，因其较大的比表面积使得在吸附同样长度的DNA链时，所需要的金磁微粒数量少，对DNA链的破坏小，纯化的DNA完整性好。

3、得到的DNA纯度高。本发明纯化的DNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.7～1.9之间，表明本发明能够有效的去除抑制剂和污染物；另外在金磁微粒和DNA形成复合物时加入的偶联缓冲液可以促进DNA的吸附，同时减少其他物质的吸附；清洗过程中使用乙醇溶液多次洗涤，可以洗掉一些吸附的杂质，尤其是易溶于有机试剂的脂类或多糖，由于乙醇易挥发，不会留下残留，所以得到的DNA纯度高。现有技术(CN 1535979A)的洗涤液成分复杂，特别是洗涤液II中的乙酸钠容易残留，对后继实验有一定的影响，而且乙酸钠不易挥发，导致磁粒干燥时间长。

4、操作方便、快捷。一支离心管即可完成全过程，整个过程用时不到一个小时。偶联缓冲液中合适的聚乙二醇(PEG)和盐浓度可以促进DNA在磁粒表面的吸附。

5、碱性裂解液相比胍裂解液和酸性裂解液，纯化效果好。

附图说明

图1为利用本专利方法纯化全血中基因组DNA的电泳照片；

图2为纯化前和纯化后样品的UV对比图；

图3是利用本专利方法纯化全血中基因组DNA与传统的酚/氯仿提取法相对比的电泳图片；

图4为利用本专利方法纯化的基因组DNA所作的PCR电泳图片。

具体实施方式

实施例1是从全血中快速纯化基因组DNA具体过程：

1]金磁微粒的预处理：

1.1]充分混匀金磁微粒确保磁粒完全悬浮在溶液中；

1.2]取100μl金磁微粒于1.5ml离心管中，把离心管置于磁性分离器上磁性分离直至上清澄清；分离可在1min内完成，移除上清；

1.3]把离心管和磁性分离器分开。向管中加入200μl预处理缓冲液，用移液器吹打混匀，然后重新置于磁性分离器上，移除上清；

1.4]重复步骤1.3]～1.4]两次。然后在离心管中加入200μl偶联缓冲液，充分混匀。

2]DNA纯化步骤：

2.1]取200μl全血加入1.5ml离心管中，然后在管中加入800μl超纯水，充分混合，室温静置5min；

2.2]8000r/min离心3min。移除上清，在管底留有肉眼可见的白细胞层；如果仍有红细胞残留，重复步骤2.1]～2.2]；

2.3]向管中加入30μl裂解缓冲液I和60μl裂解缓冲液II，然后加入1μl RNase A溶液，用移液器吹打混匀；室温静置5min；

2.4]向管中加入45μl裂解缓冲液III，用移液器吹打混匀；冰浴10min；

2.5]向管中加入预处理的金磁微粒，用移液器轻轻吹打混匀；室温静置3min。把离心管置于磁性分离器上磁性分离5min，移除上清；

2.6]把离心管从磁性分离器上取下；向管中加入200μl清洗缓冲液并用移液器吹打混匀；离心管重新置于磁性分离器上磁性分离直至上清澄清，移除上清；

2.7]重复步骤2.6]两次。

2.8]室温晾干3min。向管中加入50μl洗脱缓冲液，用移液器吹打混匀，80℃水浴5min；

2.9]把离心管重新置于磁性分离器上分离直至上清澄清；把上清转移到另一离心管中保存备用。

实施例2是从细菌中纯化质粒DNA的具体过程：

1]金磁微粒的预处理：

1.1]充分混匀金磁微粒确保磁粒完全悬浮在溶液中；

1.2]取500μl金磁微粒于1.5ml离心管中，把离心管置于磁性分离器上磁性分离直至上清澄清；分离可在1min内完成，移除上清；

1.4]重复步骤1.3]～1.4]两次；然后在离心管中加入200μl偶联缓冲液，充分混匀；

2]DNA纯化步骤：

2.1]取1ml过夜培养菌液，最高速离心30sec，移除上清；

2.2]向管中加入60μl裂解缓冲液I和120μl裂解缓冲液II，然后加入2μl RNase A溶液，用移液器吹打混匀；室温静置5min；

2.3]向管中加入90μl裂解缓冲液III，用移液器吹打混匀；冰浴10min；

2.4]向管中加入预处理的金磁微粒，用移液器轻轻吹打混匀；室温静置3min；把离心管置于磁性分离器上磁性分离5min，移除上清；

2.5]把离心管从磁性分离器上取下。向管中加入200μl清洗缓冲液并用移液器吹打混匀；离心管重新置于磁性分离器上磁性分离直至上清澄清，移除上清；

2.6]重复步骤2.6]两次。

2.7]室温晾干3min；向管中加入50μl洗脱缓冲液，用移液器吹打混匀，80℃水浴5min；

2.8]把离心管重新置于磁性分离器上分离直至上清澄清；把上清转移到另一离心管中，保存备用。

实施例3是从组织中纯化基因组DNA的具体过程：

1.1]取10mg～100mg组织高速匀浆加入1.5ml离心管中；

1.2]向管中加入30μl～300μl裂解缓冲液I和60μl～600μl裂解缓冲液II，然后加入1μl～l0μl RNase A溶液，用移液器吹打混匀；室温静置5min；

1.3]向管中加入45μl～450μl裂解缓冲液III，用移液器吹打混匀；冰浴10min；

1.4]向管中加入预处理的金磁微粒，用移液器轻轻吹打混匀；室温静置3min；把离心管置于磁性分离器上磁性分离5min，移除上清；

1.5]把离心管从磁性分离器上取下；向管中加入200μl～1000μl清洗缓冲液并用移液器吹打混匀。离心管重新置于磁性分离器上磁性分离直至上清澄清，移除上清；

1.6]重复步骤1.5]两次；

1.7]室温晾干3min；向管中加入50μl洗脱缓冲液，用移液器吹打混匀，80℃水浴5min；

1.8]把离心管重新置于磁性分离器上分离直至上清澄清；把上清转移到另一离心管中保存备用。

图1为利用本专利方法纯化全血中基因组DNA的电泳照片；泳道1为Marker；泳道2～泳道6为相同样品纯化的DNA，体现出重复性好，纯化的片段大等优点。

图2为纯化前和纯化后样品的UV对比图，曲线1为纯化前；曲线2为纯化后。纯化前可以看出样品中包含很多杂质，没有特征峰。而纯化后在OD₂₆₀处有明显的特征峰，而且OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.7～1.9之间，表明没有或很少有蛋白质和RNA的污染。

图3是利用本专利方法纯化全血中基因组DNA与传统的酚/氯仿提取法相对比的电泳图片；泳道1为Marker；泳道2～泳道3为用本发明纯化的DNA；泳道4～泳道5为相同样品用传统方法一酚/氯仿法纯化的DNA。图中表明本发明纯化的DNA不但量大而且重复性好。而酚/氯仿法纯化的DNA量每次不一致，重复性不好，在操作过程中会因人而异。

图4为利用本专利方法纯化的基因组DNA所作的PCR电泳图片。泳道1为Marker，泳道2～泳道5为人类Y染色体片段PCR扩增片段所做的电泳图；泳道2～泳道3为男性，泳道4～泳道5为女性。图可表明本发明纯化的DNA纯度可以满足下游的PCR等分子生物学实验。

本发明原理：

利用金磁微粒从生物样品中纯化DNA只需通过一步简单的磁性分离，就可对捕获至金磁微粒表面的反应物进行富集、分离和纯化。核壳型磁粒在水中有良好的悬浮性，而且对外磁场有良好的磁响应性，更易于与液态混合物中的游离DNA结合和纯化；组装型金磁微粒的组装层部分是纳米级的金属颗粒，因此有更大的固定容量和更强的对生物分子的富集能力。因此，金磁微粒在DNA纯化方面极具应用价值。

样品处理：通过某种途径将样品变成含有DNA的液态混合物。样品为血液、精液、唾液、微生物、植物、质粒、凝胶、PCR液及动物组织等包含DNA的物质。

形成金磁微粒-DNA的复合物：向含有DNA的液态混合物中加入偶联缓冲液和金磁微粒。DNA会迅速的非特异性的结合到金磁微粒的表面，形成金磁微粒-DNA的复合物

分离收集金磁微粒-DNA的复合物：利用金磁微粒的超顺磁性，在外加磁场的作用下可迅速的分离金磁微粒-DNA复合物。

偶联缓冲液中聚乙二醇的分子量可以是从6000～10000，合适的浓度在10％～35％之间。盐可以是氯化钠、氯化锂、氯化钡、氯化钾、氯化钙、氯化镁、氯化铯等，适合的盐浓度一般在0.5～5.0M之间。加入含有聚乙二醇(PEG)和盐的偶联缓冲液。

用75％的乙醇溶液(DNA不溶于75％的乙醇溶液)清洗吸附有DNA的金磁微粒，以去除残留在金磁微粒表面的污染物；洗脱缓冲液可以是水、TE缓冲液等溶液。用乙醇溶液对金磁微粒-DNA复合物进行清洗。洗脱液可以是水、TE缓冲液或其他液体。

细胞或组织等样品的裂解是采用碱性裂解液，分为裂解液I、II、III和RNaseA溶液。

使用前用预处理缓冲液对金磁微粒进行清洗，可除影响DNA吸附的铁氧化物。

金磁微粒是指以磁性纳米粒子或磁性纳米粒子的聚集体为核，在核表面包覆单质金、银等贵金属壳层形成的磁性复合微粒，也指以磁性纳米粒子或磁性纳米粒子的聚集体为核，在核表面组装纳米金、银等贵金属粒子形成的磁性复合微粒。所述磁性纳米粒子包括Fe₃O₄、γ-Fe₂O₃等铁的氧化物粒子，单质Fe、Co、Ni粒子，或由Fe与其它金属元素形成的正铁酸盐粒子；磁性纳米粒子的聚集体是指经修饰后形成的Fe₃O₄、γ-Fe₂O₃等铁的氧化物粒子聚集体，经修饰后形成的单质Fe、Co、Ni粒子聚集体，或经修饰后形成的Fe与其它金属元素形成的正铁酸盐粒子聚集体。

Claims

1.一种用金磁微粒纯化DNA的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

2]将金磁微粒和含有DNA的液态样品混合：将金磁微粒与含有DNA的液态样品混合，加入偶联缓冲液，形成含有金磁微粒-DNA复合物的混合溶液；所述偶联缓冲液为聚乙二醇和盐的混合溶液，其中聚乙二醇的分子量在6000～10000之间，聚乙二醇在混合溶液中的终浓度为10％～35％，其中的盐是氯化钠、氯化锂、氯化钡、氯化钾、氯化钙、氯化镁或氯化铯，盐在混合溶液中的终浓度为0.5M～5.0M；

3]将金磁微粒-DNA复合物从混合溶液中分离：将混合溶液磁性分离，弃上清，用清洗缓冲液清洗金磁微粒，重复磁性分离，直至上清澄清，移除上清，得金磁微粒-DNA复合物；所述的清洗缓冲液为50％～100％的乙醇溶液；

2.根据权利要求1所述的用金磁微粒纯化DNA的方法，其特征在于：所述方法包括金磁微粒的再生步骤：将吸附在金磁微粒表面的DNA洗脱完毕，磁性分离后的金磁微粒可以重复使用或是保存在预处理缓冲液中备用。

3.根据权利要求1所述的用金磁微粒纯化DNA的方法，其特征在于：所述方法包括金磁微粒的预处理步骤：为了去除影响DNA吸附的游离铁氧化物，在金磁微粒与含有DNA的液态样品混合前，先用预处理缓冲液对金磁微粒进行清洗，所述预处理缓冲液为0.1M～1.0M的pH＝6.0～8.5的EDTA溶液。

4.根据权利要求3所述的用金磁微粒纯化DNA的方法，其特征在于：所述方法包括金磁微粒的再生步骤：将吸附在金磁微粒表面的DNA洗脱完毕，磁性分离后的金磁微粒可以重复使用或是保存在预处理缓冲液中备用。

5.根据权利要求1或2或3或4所述的用金磁微粒纯化DNA的方法，其特征在于：所述预处理缓冲液为0.6M的pH＝7.6的EDTA；所述偶联缓冲液为PEG8000和氯化钠的混合溶液，混合溶液中PEG 8000的终浓度为25％，氯化钠的终浓度为2.0M；所述清洗缓冲液为75％的乙醇溶液；洗脱缓冲液为pH＝7.6的TE缓冲液。

6.根据权利要求1或2或3或4所述的用金磁微粒纯化DNA的方法，其特征在于：所述裂解液选自碱性裂解液、酸性裂解液、碘化钠裂解液、胍裂解液或SDS裂解液。

7.根据权利要求1或2或3或4所述的用金磁微粒纯化DNA的方法，其特征在于：所述DNA的液态样品包括PCR液。