CN1580765A - 一种组装型磁性复合微粒及其制备方法与应用 - Google Patents
一种组装型磁性复合微粒及其制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1580765A CN1580765A CN 03153486 CN03153486A CN1580765A CN 1580765 A CN1580765 A CN 1580765A CN 03153486 CN03153486 CN 03153486 CN 03153486 A CN03153486 A CN 03153486A CN 1580765 A CN1580765 A CN 1580765A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- magnetic
- assembled
- particles
- magnetic composite
- particle
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000002131 composite material Substances 0.000 title claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 10
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 title claims description 7
- 239000011246 composite particle Substances 0.000 claims abstract description 59
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 claims abstract description 21
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 21
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 claims abstract description 13
- 229910000510 noble metal Inorganic materials 0.000 claims abstract description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 10
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N ferrosoferric oxide Chemical compound O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims abstract description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 10
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 10
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims abstract description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 7
- -1 antibody Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 claims abstract description 6
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims abstract description 3
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 claims abstract description 3
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims abstract description 3
- 239000007769 metal material Substances 0.000 claims abstract description 3
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 claims abstract description 3
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 claims description 21
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 18
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 claims description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 12
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 11
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 9
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 7
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 7
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 6
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 claims description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 6
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 5
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 5
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000004332 silver Substances 0.000 claims description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 5
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 4
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 claims description 4
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 4
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 claims description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 4
- UUEWCQRISZBELL-UHFFFAOYSA-N 3-trimethoxysilylpropane-1-thiol Chemical group CO[Si](OC)(OC)CCCS UUEWCQRISZBELL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 claims description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 3
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical group CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- SJECZPVISLOESU-UHFFFAOYSA-N 3-trimethoxysilylpropan-1-amine Chemical group CO[Si](OC)(OC)CCCN SJECZPVISLOESU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N Ruthenium Chemical compound [Ru] KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 2
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 claims description 2
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 2
- HQLZFBUAULNEGP-UHFFFAOYSA-N hexan-3-amine Chemical compound CCCC(N)CC HQLZFBUAULNEGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- VOIGMFQJDZTEKW-UHFFFAOYSA-N hexane-3-thiol Chemical compound CCCC(S)CC VOIGMFQJDZTEKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011553 magnetic fluid Substances 0.000 claims description 2
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 claims description 2
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 2
- SUVIGLJNEAMWEG-UHFFFAOYSA-N propane-1-thiol Chemical compound CCCS SUVIGLJNEAMWEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- WGYKZJWCGVVSQN-UHFFFAOYSA-N propylamine Chemical compound CCCN WGYKZJWCGVVSQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052703 rhodium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000010948 rhodium Substances 0.000 claims description 2
- MHOVAHRLVXNVSD-UHFFFAOYSA-N rhodium atom Chemical compound [Rh] MHOVAHRLVXNVSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 238000002444 silanisation Methods 0.000 claims description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 claims description 2
- MBNRBJNIYVXSQV-UHFFFAOYSA-N 3-[diethoxy(methyl)silyl]propane-1-thiol Chemical group CCO[Si](C)(OCC)CCCS MBNRBJNIYVXSQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- HYLBVZVDIWDKJM-UHFFFAOYSA-N [O].C(CC)[Si](OC)(OC)OC.C(C1CO1)OCC1CO1 Chemical group [O].C(CC)[Si](OC)(OC)OC.C(C1CO1)OCC1CO1 HYLBVZVDIWDKJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229910001566 austenite Inorganic materials 0.000 claims 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 claims 1
- 229910006297 γ-Fe2O3 Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- 229910000859 α-Fe Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 12
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 12
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 12
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000011258 core-shell material Substances 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 239000006148 magnetic separator Substances 0.000 description 3
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- FOIXSVOLVBLSDH-UHFFFAOYSA-N Silver ion Chemical compound [Ag+] FOIXSVOLVBLSDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- CWAFVXWRGIEBPL-UHFFFAOYSA-N ethoxysilane Chemical compound CCO[SiH3] CWAFVXWRGIEBPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 159000000014 iron salts Chemical class 0.000 description 1
- WTFXARWRTYJXII-UHFFFAOYSA-N iron(2+);iron(3+);oxygen(2-) Chemical compound [O-2].[O-2].[O-2].[O-2].[Fe+2].[Fe+3].[Fe+3] WTFXARWRTYJXII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Substances [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000006884 silylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种组装型磁性复合微粒及其制备方法与应用。该磁性复合微粒由具有超顺磁性的磁性核心部分和组装层部分组成。其磁性核心部分是由Fe3O4、γ－Fe2O3、结构通式为MeO.Fe2O3 (其中M＝Ni，Co，Mg，Zn，Mn等二价金属离子)的正铁酸盐和/或铁、镍、钴等金属材料的纳米级颗粒和/或其聚集体构成；其组装层部分由纳米级的贵金属微粒构成。该磁性复合微粒的制备方法是首先对磁性复合微粒的磁性核心部分用有机试剂处理，然后将纳米级的贵金属微粒在核心磁性微粒表面组装而成。该磁性复合微粒可用于标记核酸、抗原、抗体、酶、多肽、多糖、亲和素、链亲和素等生物分子或者细胞以及非生物材料，标记后的复合微粒可以用于多种生物及非生物分子的富集、分离及检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种组装型磁性复合微粒及其制备方法与应用。具体来说，本发明涉及一种可标记核酸、抗原、抗体、酶、多肽、多糖、亲和素或链亲和素、细胞等生物及非生物材料的组装型磁性复合微粒及其制备方法与应用。本发明的组装型磁性复合微粒可作为标记物、也可作为一种快速富集手段应用于多种生物及非生物分子的分离、纯化及检测。
背景技术
金纳米颗粒(胶体金)或银纳米颗粒(胶体银)由于具有与含巯基、氨基等功能基团的抗体、修饰有功能基团的寡核苷酸探针牢固结合的特性，已被广泛用于免疫组化、抗原-抗体快速检测以及核酸杂交检测等方面。表面修饰有功能基团的超顺磁性氧化铁颗粒因具有较好的磁响应性，亦被应用于生物大分子的分离、纯化及检测中。但将磁性颗粒的可分离性和胶体金表面的生物或非生物分子的可修饰性结合起来的复合材料的研究和产品还很少。
崔亚丽等人合成了核/壳结构的Fe3O4/Au超顺磁性微粒并对其形成机理作了探讨(核/壳型Fe3O4/Au超顺磁性微粒的制备及机理，中国科学(B辑)：31(4)：319～324)，这种颗粒粒度均一，单分散性好，有较好的磁响应性和对生物分子修饰性。专利CN 03124061.5对核壳型超顺磁性复合微粒及其制备方法与应用进行了公开(图1是核壳型超顺磁性复合微粒的剖面图)。但这种核壳结构的磁性复合微粒对生物分子的固定容量以及对微量样品的富集方面尚需要改进。
本发明针对现有技术中存在的不足，发明了一种新型的组装型磁性复合微粒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可标记核酸、抗原、抗体、酶、多肽、多糖、亲和素或链亲和素等生物分子、细胞或其它非生物材料并可实际应用于相关生物活性物质或其它物质的分离、纯化及检测的组装型磁性复合微粒。
本发明的另一个目的在于提供组装型磁性复合微粒的制备方法。
本发明的另一个目的还在于将本发明提供的组装型磁性复合微粒在标记核酸、抗原、抗体、酶、多肽、多糖、亲和素、链亲和素等生物分子或者细胞之类生物及非生物材料方面的应用。
本发明的另一个目的还在于将本发明提供的组装型磁性复合微粒在抗原-抗体、DNA-DNA、DNA-寡核苷酸、配体-受体、亲和素-生物素等生物分子的反应体系或配合物-金属污染物环境监测，以及细菌、病毒等临床致病微生物或食品污染物等领域的生物分子或其他分子的分离、纯化及检测方面的应用。
上述所要解决的技术问题是通过本发明提供的组装型磁性复合微粒得以实现。本发明提供的组装型磁性复合微粒由具有超顺磁性的核心部分和组装层部分构成，核心部分为磁性微粒，组装层部分为纳米级贵金属颗粒。
上述组装型磁性复合微粒的核心部分为Fe3O4、γ-Fe2O3、正铁酸盐和/或铁、镍、钴等金属材料的纳米级颗粒和/或其聚集体；组装层部分纳米级贵金属颗粒为金、银、钯、铂、钌、铑。
上述组装型磁性复合微粒的核心部分的正铁酸盐的结构通式为MeO.Fe2O3，其中Me为Ni，Co，Mg，Zn，Mn的二价金属离子。
上述组装型磁性复合微粒的组装层部分为纳米级贵金属颗粒为金或银。
上述组装型磁性复合微粒的粒径为0.05～100μm；以磁性复合微粒固形物总重量计，磁性核心部分的重量占磁性复合微粒固形物总重量的70-99％，组装层部分的重量占磁性复合微粒固形物总重量的1-30％。
上述组装型磁性复合微粒的组装层部分的金属颗粒的粒径为5-100nm，吸附于磁性核心部分的金属颗粒的量为颗粒5-50mL金属颗粒/mg磁性复合微粒，组装层部分为单层或多层。
上述组装型磁性复合微粒的制备是通过下述方案实现的。
a.对购得或制备的超顺磁性核心部分表面进行有机试剂的处理；
b.将处理过的磁性核心部分与一定体积的纳米级金属颗粒充分混合，使之在核心部分磁性微粒周围进行组装，得到具有较强磁响应性能的组装型复合微粒。
优选定方法包括下述步骤：
(1)磁性核心部分的制备：将Fe2+、Mn2+、Ni2+、Zn2+或Cu2+中的一种金属盐的水溶液和/或几种金属盐水溶液的混合物按比例1∶2-1∶4与Fe3+盐水溶液混合均匀后，加入1～6mol/L的NaOH或30％NH3·H2O的碱液，调节混合物的pH为10-13，20℃下快速搅拌20-60分钟，然后升温至60-70℃，并继续搅拌孵育30-60分钟，在外磁场中分离出超顺磁性微粒沉淀物，并用二次蒸馏水洗涤，得到中性的磁性微粒；然后用二次蒸馏水将磁性微粒稀释定容成磁性流体，形成固形物的含量为5-20mg/ml的磁性核心部分，该磁性核心部分的粒径在5nm-10μm之间；
(2)磁性核心部分的表面修饰：取步骤1中所得磁性纳米粒子1-10mL，磁性分离，除去上层的溶液后，将其加入至1-100mL、体积比为1∶1-1∶5的水/醇混合溶剂中，然后加入20-1000μL的有机试剂，在20-80℃的温度下反应0.5-24小时，将其冷却至室温或4℃冰箱中，用二次水清洗至中性，得到磁芯；
(3)贵金属颗粒在磁性核心表面的组装：在步骤2中得到的磁芯中加入质量比为1∶20-1∶120的贵金属溶胶，在空气振荡器上混合形成磁性核心部分的表面组装层，磁性分离，除去上层的溶液后，用二次蒸馏水反复洗涤至中性，即可得到组装型磁性复合微粒。
上述制备方法中所有的有机试剂为3-氨丙基-三甲氧基硅烷、3-氨丙基-三乙氧基硅烷、3-巯基丙基-三甲氧基硅烷、3-巯基丙基-三甲氧基硅烷等所有含有功能基团的硅烷化试剂，或含有巯基的3-巯基丙烷、3-巯基己烷、含有氨基的3-氨基丙烷、3-氨基己烷。
和现有技术相比，本发明具有如下一些优点：
本发明对生物分子的固定容量以及对微量样品的富集方面有较大改进。与核壳结构的磁性复合微粒相比，本发明提供的组装型磁性复合微粒的组装层部分是纳米级的金属颗粒，因此有更大的固定容量和更强的对生物分子的富集能力。比如对亲和素的固定，100μL的核壳结构的复合微粒可以固定20～80μg的亲和素，而100μL组装型复合微粒可固定亲和素的量可以达到200～300μg。此外，用少量包被促红细胞生成素(EPO)抗体的组装型复合微粒，可以在20-50mL尿样中富集5-50ng的EPO。这种优点在固定其他分子时也有同样的效果。
本发明组装型磁性复合微粒可用来标记核酸、寡核苷酸深针、抗原、抗体、酶、多肽、多糖、亲和素或链亲和素、细胞等生物及非生物材料。经本发明组装型磁性复合微粒标记过的核酸、寡核苷酸探针、抗原、抗体、酶、多肽、多糖、亲和素或链亲和素、细胞等生物及非生物材料后，可用于对核酸、蛋白、多糖等生物分子及其它非生物分子的分离、纯化与检测。
本发明超顺磁性复合微粒兼具超顺磁性微粒在磁场作用下易于分离和金、银表面极易与巯基化寡核苷酸、蛋白质、多糖等生物活性物质结合而易被修饰的优点，使其非常适用于核酸、蛋白质等生物及非生物样品的富集与分离，核酸杂交与检测，抗原-抗体免疫学检测等生物体系的检测，也可适用于食品安全检测领域。由于表面结构与核壳结构磁性复合微粒的区别，使该复合微粒具有极强的对外加磁场的响应性和较大的对生物分子的固定容量，只需通过一步简单的磁性分离，就可对捕获至复合微粒表面的反应物进行富集、分离和纯化，从而增加了检测的灵敏度和特异性，缩短了检测时间；使检测过程更为便捷，同时摆脱了昂贵检测仪器的束缚。
附图说明
下面结合附图对本发明进行进一步的说明。
图1为核壳型超顺磁性复合微粒的剖面结构模式图。
图2为组装型磁性复合微粒的剖面结构模式图。
图3为修饰了有机试剂的磁性核心部分的粒径测定曲线图。
图4为胶体金在修饰有功能基团的磁性核心部分组装时的动态监测曲线。
具体实施方式
以下各实施例仅作为实施本发明的示例，用以进一步阐明本发明，并非用于限定本发明的保护范围。
图中，520nm的特征峰为胶体金的最大吸收峰，图中曲线由上而下表示随着时间的增加胶体金的最大吸收峰逐渐降低，证明体系中的胶体金逐渐在磁性核心部分表面进行组装。
实施例1
本实施例旨在阐明本发明组装型超顺磁性复合微粒制备的可实施性，图2揭示了本实施例制备的组装型超顺磁性复合微粒的剖面图。
1.超顺磁性Fe3O4微粒的合成：
化学共沉淀法合成Fe3O4的方程式为：
取Fe2+∶Fe3+(1∶1.5)的铁盐混合溶液50mL，在充分搅拌的条件下，加入100mL浓度为1mol/L的NaOH，调节pH＝9-10，室温下反应20分钟，然后升温至65-75℃，熟化30分钟。生成的Fe3O4种子微粒用磁性分选器分离，然后用高纯水反复洗涤至中性。测定其固形物含量备用。化学共沉淀法合成得到的磁性核心均为纳米级颗粒，但当其分散到水中，由于颗粒之间较强的相互作用，颗粒聚集形成1-10μm范围内的聚集体。
2.磁性核心的表面修饰：
取25ml固形物含量4mg/mL的Fe3O4悬浮液，磁场中分离20分钟后，弃上清液，加入H2O∶C2H5OH(体积比1∶1)的混合溶剂250ml左右，然后加入三巯基丙基-3乙氧基硅烷2mL，50℃反应10小时进行硅烷化处理，磁性分离后用双蒸水反复洗涤至中性，最后定容。图3是粒径的测定结果。
3.组装型磁性复合微粒的合成
取30mL表面修饰有功能基团的磁性微粒(固形物含量为4mg/mL)，磁性分离去上清，然后加入100mL粒径为20nm的胶体金，在振荡器上反应5-8小时，使其组装在磁性颗粒的表面。胶体金在硅烷化修饰磁性颗粒表面的组装过程可通过观察胶体金在520nm处吸收峰的强度随着时间的增加而减弱的过程得到证实。图4中，520nm的特征峰为胶体金的最大吸收峰，图中曲线由上而下代表随着时间的增加胶体金的最大吸收峰逐渐降低，说明体系中的胶体金逐渐在磁性核心部分表面进行组装。
实施例2
本实施例旨在证明本发明组装型超顺磁性复合微粒对链亲和素的修饰。
Fe3O4/Au磁性复合微粒悬浮液100μL，用0.1mol/L浓度的K2CO3水溶液将其pH值调至7.0左右平衡2-3次，磁性分离，去上清。取1μg/μL链亲和素溶液(溶于0.1mol/L，pH为7.0的PBS，即磷酸盐缓冲液)150μL，置于磁性复合微粒中混合均匀，并在旋转混匀器反映30分钟。磁性分离并用清洗液反复清洗后以含1％的牛血清白蛋白(BSA)的缓冲液封闭后储存于4℃冰箱中备用。
实施例3
本实施例旨在证明本发明组装型超顺磁性复合微粒表面可用常规方法偶联寡核苷酸探针。
将10μL组装型超顺磁性复合微粒悬浮液(4μg/μL)与末端巯基修饰的寡核苷酸探针混合，使探针终浓度为5μM，反应10小时，然后将混合溶液置于含0.1M NaCl的10mM磷酸盐缓冲(pH＝7.0)，继续反应6-8小时，用磁式分离器对反应后的混合物进行分离，用含0.1M NaCl的10mM磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)清洗，保存于含0.3M NaCl的10mM磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)中。
实施例4
本实施例用来阐明本发明组装型超顺磁性复合微粒表面修饰EPO抗体及将固定抗体的组装型磁性复合微粒用于EPO检测的方法。
EPO抗体的固定化：取0.1ml组装型超顺磁性复合微粒悬浮液，磁性分离弃上清，加入0.5ml、0.05M的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl)(pH＝7.6)，平衡5分钟，磁性分离弃上清。将EPO抗体200μg(0.05M Tris-HCl，pH＝7.6的溶液)加入复合微粒中，混匀，反应30分钟，间歇振荡。用磁式分离器对反应后的混合物进行分离，并用缓冲溶液进行清洗，并用1％BSA缓冲液封闭后保存。通过对抗体在100μL组装型复合微粒表面固定前后OD280(紫外区280nm处的光密度吸收值)的测定可知，可固定的抗体可高达100μg。
上述组装型超顺磁性复合微粒对尿样中EPO的富集与测定：
取一定量固定有EPO抗体的组装型超顺磁性复合微粒(含有1000-5000ng的抗体)于检测容器中，加入被测尿样20mL进行充分反应，对尿样中的EPO进行富集，磁性分离，去上清，然后加入辣根过氧化物酶(HRP)-标记的EPO抗体在反应20分钟后清洗2-3次，加显色底物反应后测定OD450(可见区450nm处的光密度吸收值)值，已确定被测物EPO的量。
Claims (11)
1、一种可标记核酸、抗原、抗体、酶、多肽、多糖、亲和素、链亲和素等生物分子或者细胞以及非生物材料的组装型磁性复合微粒，其特征在于：该磁性复合微粒由具有超顺磁性的核心部分和组装层部分构成，核心部分为磁性微粒，组装层部分为纳米级贵金属颗粒。
2、根据权利要求1所述的组装型磁性复合微粒，其特征在于：该组装型磁性复合微粒的核心部分为Fe3O4、γ-Fe2O3、正铁酸盐和/或铁、镍、钴等金属材料的纳米级颗粒和/或其聚集体；组装层部分纳米级贵金属颗粒为金、银、钯、铂、钌、铑。
3、根据权利要求1或2所述的组装型磁性复合微粒，其特征在于：核心部分的正铁酸盐的结构通式为MeO.Fe2O3，Me为Ni，Co，Mg，Zn，Mn的二价金属离子。
4、根据权利要求1或2所述的组装型磁性复合微粒，其特征在于该组装型磁性复合微粒的组装层部分为纳米级贵金属颗粒为金或银。
5、根据权利要求1或2所述的组装型磁性复合微粒，其特征在于：该组装型磁性复合微粒的粒径为0.05～100μm；以磁性复合微粒固形物总重量计，磁性核心部分的重量占磁性复合微粒固形物总重量的70-99％，组装层部分的重量占磁性复合微粒固形物总重量的1-30％。
6、根据权利要求1或2所述的组装型磁性复合微粒，其特征在于：组装层部分的金属颗粒的粒径为5-100nm，吸附于磁性核心部分的金属颗粒的量为颗粒5-50mL金属颗粒/mg磁性复合微粒，组装层部分为单层或多层。
7、根据权利要求1或2所述的组装型磁性复合微粒的制备方法，其特征在于：
a.对购得或制备的超顺磁性核心部分表面进行有机试剂的处理；
b.将处理过的磁性核心部分与一定体积的纳米级金属颗粒充分混合，使之在核心部分磁性微粒周围进行组装，得到具有较强磁响应性能的组装型复合微粒。
8、根据权利要求6所述的组装型磁性复合微粒的制备方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：
(1)磁性核心部分的制备：将Fe2+、Mn2+、Ni2+、Zn2+或Cu2+中的一种金属盐的水溶液和/或几种金属盐水溶液的混合物按比例1∶2-1∶4与Fe3+盐水溶液混合均匀后，加入1-6mol/L的NaOH或30％NH3·H2O的碱液，调节混合物的pH为10-13，20℃下快速搅拌20-60分钟，然后升温至60-70℃并继续搅拌孵育30-60分钟，在外磁场中分离出超顺磁性微粒沉淀物，并用二次蒸馏水洗涤，得到中性的磁性微粒；然后用二次蒸馏水将磁性微粒稀释定容成磁性流体，形成固形物的含量为5-20mg/ml的磁性核心部分，该磁性核心部分的粒径在5nm-10μm之间；
(2)磁性核心部分的表面修饰：取步骤1中所得磁性纳米粒子1-10mL，磁性分离，除去上层的溶液后，将其加入至1-100mL、体积比为1∶1-1∶5的水/醇混合溶剂中，然后加入20-1000μL的有机试剂，在20-80℃的温度下反应0.5-24小时，将其冷却至室温或4℃冰箱中，用二次水清洗至中性，得到磁芯；
(3)贵金属颗粒在磁性核心表面的组装：在步骤2中得到的磁芯中加入质量比为1∶20-1∶120的贵金属溶胶，在空气振荡器上混合形成磁性核心部分的表面组装层，磁性分离，除去上层的溶液后，用二次蒸馏水反复洗涤至中性，即可得到组装型磁性复合微粒。
9、根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述的有机试剂为3-氨丙基-三甲氧基硅烷、3-氨丙基-三乙氧基硅烷、3-巯基丙基-三甲氧基硅烷、3-巯基丙基-三甲氧基硅烷，巯丙基甲基二乙氧基硅烷、缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷等含所有含有功能基团的硅烷化试剂或含有巯基的3-巯基丙烷、3-巯基己烷，含有氨基的3-氨基丙烷、3-氨基己烷。
10、根据权利要求1或2所述的组装型磁性复合微粒在标记核酸、抗原、抗体、酶、多肽、多糖、亲和素、链亲和素等生物分子或者细胞以及非生物材料方面的应用。
11、根据权利要求1或2所述的组装型磁性复合微粒在抗原-抗体、DNA-DNA、DNA-寡核苷酸、配体-受体、亲和素-生物素等生物分子的反应体系或配合物-金属污染物环境监测，以及细菌、病毒等临床致病微生物或食品污染物等领域的生物分子的富集、分离、纯化及检测等方面的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 03153486 CN1268930C (zh) | 2003-08-14 | 2003-08-14 | 一种组装型磁性复合微粒及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 03153486 CN1268930C (zh) | 2003-08-14 | 2003-08-14 | 一种组装型磁性复合微粒及其制备方法与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1580765A true CN1580765A (zh) | 2005-02-16 |
| CN1268930C CN1268930C (zh) | 2006-08-09 |
Family
ID=34580079
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 03153486 Expired - Lifetime CN1268930C (zh) | 2003-08-14 | 2003-08-14 | 一种组装型磁性复合微粒及其制备方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1268930C (zh) |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101164621B (zh) * | 2006-10-19 | 2010-05-12 | 陕西西大北美基因股份有限公司 | 超顺磁性复合微粒载药体及其制备方法 |
| CN101165182B (zh) * | 2006-10-19 | 2010-05-12 | 陕西西大北美基因股份有限公司 | 用金磁微粒纯化dna的方法 |
| CN101165183B (zh) * | 2006-10-19 | 2010-05-12 | 陕西西大北美基因股份有限公司 | 利用金磁微粒分离mRNA的方法 |
| WO2010078675A1 (zh) * | 2008-12-30 | 2010-07-15 | 陕西北美基因股份有限公司 | 多糖金磁复合微粒载药体及其制备方法 |
| CN102147358A (zh) * | 2011-01-21 | 2011-08-10 | 东南大学 | 一种基于纳米钯标记及其催化沉积放大的生物检测方法 |
| CN1952659B (zh) * | 2005-10-19 | 2011-09-14 | 陕西北美基因股份有限公司 | 一种亲和素/链亲和素磁性复合微粒及其制备方法与用途 |
| CN101303342B (zh) * | 2008-07-03 | 2012-05-23 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 用于细胞识别与分离的抗体-金壳铁核磁纳米粒子合成方法 |
| CN102565411A (zh) * | 2010-12-08 | 2012-07-11 | 中国科学院生物物理研究所 | 示踪磁性纳米颗粒的新方法 |
| CN102721804A (zh) * | 2012-05-29 | 2012-10-10 | 西安金磁纳米生物技术有限公司 | 一种基于金磁微粒的电化学发光免疫分析方法 |
| CN102879564A (zh) * | 2011-07-14 | 2013-01-16 | 磁量生技股份有限公司 | 用于检测水产动物病毒的检测试剂 |
| CN106782967A (zh) * | 2017-02-28 | 2017-05-31 | 必欧瀚生物技术（合肥）有限公司 | 一种银纳米颗粒修饰的磁珠、其制备方法及应用 |
| CN108821353A (zh) * | 2018-08-01 | 2018-11-16 | 济南大学 | 一种RuO2-LaFeO3纳米复合材料的制备方法 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101165173B (zh) * | 2006-10-19 | 2010-09-29 | 陕西西大北美基因股份有限公司 | 利用金磁微粒进行细胞分选的方法 |
| WO2008089666A1 (en) * | 2007-01-19 | 2008-07-31 | Tianjin Medical University | A high-throughput detect technique for protein or nucleic acid――multi-forms of suspended micro-granular bioreactor |
| CN101893627B (zh) * | 2010-07-08 | 2014-12-17 | 崔亚丽 | 金磁微粒标记免疫层析快速检测方法 |
-
2003
- 2003-08-14 CN CN 03153486 patent/CN1268930C/zh not_active Expired - Lifetime
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1952659B (zh) * | 2005-10-19 | 2011-09-14 | 陕西北美基因股份有限公司 | 一种亲和素/链亲和素磁性复合微粒及其制备方法与用途 |
| CN101165182B (zh) * | 2006-10-19 | 2010-05-12 | 陕西西大北美基因股份有限公司 | 用金磁微粒纯化dna的方法 |
| CN101165183B (zh) * | 2006-10-19 | 2010-05-12 | 陕西西大北美基因股份有限公司 | 利用金磁微粒分离mRNA的方法 |
| CN101164621B (zh) * | 2006-10-19 | 2010-05-12 | 陕西西大北美基因股份有限公司 | 超顺磁性复合微粒载药体及其制备方法 |
| CN101303342B (zh) * | 2008-07-03 | 2012-05-23 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 用于细胞识别与分离的抗体-金壳铁核磁纳米粒子合成方法 |
| WO2010078675A1 (zh) * | 2008-12-30 | 2010-07-15 | 陕西北美基因股份有限公司 | 多糖金磁复合微粒载药体及其制备方法 |
| CN101766818B (zh) * | 2008-12-30 | 2013-05-22 | 陕西北美基因股份有限公司 | 多糖金磁复合微粒载药体及其制备方法 |
| CN102565411A (zh) * | 2010-12-08 | 2012-07-11 | 中国科学院生物物理研究所 | 示踪磁性纳米颗粒的新方法 |
| CN102565411B (zh) * | 2010-12-08 | 2014-05-28 | 中国科学院生物物理研究所 | 示踪磁性纳米颗粒的新方法 |
| CN102147358A (zh) * | 2011-01-21 | 2011-08-10 | 东南大学 | 一种基于纳米钯标记及其催化沉积放大的生物检测方法 |
| CN102147358B (zh) * | 2011-01-21 | 2012-11-28 | 东南大学 | 一种基于纳米钯标记及其催化沉积放大的生物检测方法 |
| CN102879564A (zh) * | 2011-07-14 | 2013-01-16 | 磁量生技股份有限公司 | 用于检测水产动物病毒的检测试剂 |
| CN102721804A (zh) * | 2012-05-29 | 2012-10-10 | 西安金磁纳米生物技术有限公司 | 一种基于金磁微粒的电化学发光免疫分析方法 |
| CN106782967A (zh) * | 2017-02-28 | 2017-05-31 | 必欧瀚生物技术（合肥）有限公司 | 一种银纳米颗粒修饰的磁珠、其制备方法及应用 |
| CN108821353A (zh) * | 2018-08-01 | 2018-11-16 | 济南大学 | 一种RuO2-LaFeO3纳米复合材料的制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1268930C (zh) | 2006-08-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1268930C (zh) | 一种组装型磁性复合微粒及其制备方法与应用 | |
| US7175912B2 (en) | Super-paramagnetic composite particle with core/shell structure, preparation method and use thereof | |
| US7868145B2 (en) | Magnetic particles containing a copolymer core, magnetic layer and silicon layer | |
| EP3043905B1 (en) | New diagnostic assay using particles with magnetic properties | |
| Ye et al. | An electrochemical immunoassay for Escherichia coli O157: H7 using double functionalized Au@ Pt/SiO2 nanocomposites and immune magnetic nanoparticles | |
| KR102021663B1 (ko) | 자성비드 기반의 효소 모방 나노자임을 이용한 타켓 물질의 검출 방법 | |
| CN112326623B (zh) | 一种双层拉曼分子标记的硅核银壳复合纳米标签、制备方法及免疫层析应用 | |
| KR101277696B1 (ko) | 타겟팅-금 자성 나노입자―기반된 미생물의 원-스텝 분리, 농축 및 검출 방법 | |
| KR102341666B1 (ko) | 생체물질 검출용 미세 입자 및 이를 이용한 생체물질 검출방법 | |
| CN111650379A (zh) | 一种金壳磁性拉曼增强纳米标签的制备及免疫层析应用 | |
| KR100962286B1 (ko) | 식중독균 검출을 위한 자성 코어 금 나노입자 및 그제조방법, 상기 나노입자를 이용한 식중독균 검출방법 | |
| KR101489868B1 (ko) | 생체 분자의 도입을 위한 고상 표면 개질방법, 이에 의해 표면이 개질된 나노입자 및 시트 | |
| JP2007078595A (ja) | 機能性粒子及びその製造方法 | |
| CN114459877B (zh) | 用于富集外泌体的dna四面体复合磁性纳米材料及制备 | |
| KR101884061B1 (ko) | 비표지 전기화학 면역바이오센서용 전극, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 비표지 전기화학 면역바이오센서 | |
| CN112526120B (zh) | 一种基于spr技术检测沙丁胺醇的方法 | |
| CN115236063A (zh) | 基于氧化铜纳米片组装空心立方体纳米酶的化学发光成像免疫传感器及其制备方法 | |
| Wang et al. | Aspects of recent development of immunosensors | |
| Ren et al. | Glucose oxidase-doped magnetic silica nanostrutures as labels for localized signal amplification of electrochemical immunosensors | |
| JP2006169623A (ja) | 機能性粒子及びその製造方法 | |
| JP2006225744A (ja) | 機能性粒子及びその製造方法 | |
| CN117079959B (zh) | 一种用于检测糖蛋白的磁性纳米材料及其制备方法 | |
| CN117074658B (zh) | 一种黄曲霉毒素m1快速检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN114965637B (zh) | 一种基于纳米复合材料构建夹心型适配体传感器检测gpc3的方法 | |
| KR101251603B1 (ko) | 클로로계 실란을 이용하여 시스테인계 단백질 ｇ가 고정화된 기능성 실리카 자성나노입자의 제조방법 및 그 자성나노입자 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Assignee: XI'AN GOLDMAG NANOBIOTECH Co.,Ltd. Assignor: Shaanxi North American Gene Co.,Ltd. Contract record no.: 2011610000173 Denomination of invention: Assembled magnetic composite micro particle, and its preparing method and use Granted publication date: 20060809 License type: Exclusive License Open date: 20050216 Record date: 20110913 |
|
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: XI'AN GOLDMAG NANOBIOTECH CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: SHAANXI BAIMEI GENE CO., LTD. Effective date: 20130906 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| C56 | Change in the name or address of the patentee |
Owner name: SHAANXI BAIMEI GENE CO., LTD. Free format text: FORMER NAME: SHAANXI LIFEGEN CO., LTD. Owner name: SHAANXI LIFEGEN CO., LTD. Free format text: FORMER NAME: XIDA BEIMEI GENE CO., LTD., SHANXI |
|
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 710000 XI'AN, SHAANXI PROVINCE TO: 710077 XI'AN, SHAANXI PROVINCE |
|
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 386 mailbox, Northwestern University, Shaanxi, Xi'an 710000, China Patentee after: SHAANXI LIFEGEN Co.,Ltd. Address before: 386 mailbox, Northwestern University, Shaanxi, Xi'an, China Patentee before: Shaanxi North American Gene Co.,Ltd. Address after: 386 mailbox, Northwestern University, Shaanxi, Xi'an 710000, China Patentee after: Shaanxi North American Gene Co.,Ltd. Address before: 386 mailbox, Northwestern University, Shaanxi, Xi'an, China Patentee before: Shanxi Lifegen Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20130906 Address after: 710077, Shaanxi, Xi'an hi tech Zone, No. 85, No. 4, No. 2, modern enterprise center, 3 east side, 10402A Patentee after: XI'AN GOLDMAG NANOBIOTECH Co.,Ltd. Address before: 386 mailbox, Northwestern University, Shaanxi, Xi'an 710000, China Patentee before: SHAANXI LIFEGEN Co.,Ltd. |
|
| CX01 | Expiry of patent term |
Granted publication date: 20060809 |
|
| CX01 | Expiry of patent term |