CN106552600A - 一种磁性壳核结构纳米粒子及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种磁性壳核结构纳米粒子及其制备方法与应用。该磁性壳核结构纳米粒子包括若干磁性纳米粒子、包覆若干磁性纳米粒子的二氧化硅壳层、包覆二氧化硅壳层的多孔二氧化硅壳层及接枝于多孔二氧化硅壳层表面的二肽功能化聚合物。该方法是先制备磁性纳米粒子；然后将磁性纳米粒子分别包覆二氧化硅壳层及多孔二氧化硅壳层；再采用硅氧烷类交联改性剂修饰改性；最后将二肽功能化聚合物接枝于硅氧烷改性的多孔二氧化硅壳层表面，得到所述材料。该磁性壳核结构纳米粒子可应用于在糖基化蛋白富集分离。本发明成功将该磁性壳核结构纳米粒子材料与分散固相萃取结合，实现了从复杂样品中对糖基化蛋白、多肽类物质的高选择性、高重复性和高通量地富集。

Description

一种磁性壳核结构纳米粒子及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及糖基化蛋白领域，尤其涉及一种磁性壳核结构纳米粒子及其制备方法与应用。
背景技术
糖基作为生命体中各种生物大分子的重要组成部分，参与到一系列丰富多样且重要的生命活动中。其中，尤其是在蛋白质糖基化的过程中，糖基的种类、排列顺序及不同的组合方法将对蛋白质的构象及其生理过程起到重要的影响，包括细胞的粘附与信息传递、细胞的增殖与分化、免疫应答等。并且，在许多疾病，如肿瘤、心血管疾病、免疫性疾病及神经退行性疾病的发生、发展过程中，也与蛋白质糖基化的不正常化有着密切的关系。因此，糖基化蛋白成为了蛋白质组学研究的热门方向之一。然而，糖基化蛋白、肽类等在生物体内的含量很低，需要将复杂多样的天然样品中有效且微量的糖基化蛋白优先富集出来，并且与多种检测技术相结合进行对其信号的检测。为了解决该问题，提高对糖基化蛋白从复杂生物样品富集的能力，以改善质谱对糖基化蛋白、肽类的信号响应成为主要有效的手段之一。
目前，关于糖蛋白的分离富集的方法种类繁多，包括了阱化学富集法、苯硼酸法、凝集素亲和法、亲水相互作用色谱法等；另外，材料所修饰的无机基质也丰富多样，包括二氧化硅、石墨碳、活性炭、金属粒子及金属氧化物等，但在实际应用中仍然都有一定的局限性。其中，因材料特异性吸附强弱能力对样品富集的效果，以及在对生物样品中的处理方法导致生物样本信息的丢失是在解决糖基化蛋白富集过程中的难题之一。
发明内容
本发明的目的在于针对上述技术问题提供一种磁性壳核结构纳米粒子及其制备方法与应用。该磁性壳核结构纳米粒子能够实现从复杂样品中对糖基化多肽类物质的高选择性、高重复性和高通量地富集。
本发明目的采用下述方案来实现：
一种磁性壳核结构纳米粒子，所述磁性壳核结构纳米粒子包括若干磁性纳米粒子、包覆所述若干磁性纳米粒子的二氧化硅壳层、包覆所述二氧化硅壳层的多孔二氧化硅壳层及接枝于所述多孔二氧化硅壳层表面的二肽功能化聚合物；所述二肽功能化聚合物的结构为：
聚合度n为5～200000。
上述方案中，所述磁性壳核结构纳米粒子的直径为1×10-2～5μm，孔径为2-100nm。
上述方案中，所述磁性纳米粒子为四氧化三铁纳米粒子。
所述的磁性壳核结构纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
制备磁性纳米粒子；
将所述磁性纳米粒子分散于乙醇、去离子水、氨水和正硅酸酯的混合溶液中，室温下充分搅拌12-16小时后，通过磁力分离出二氧化硅包覆的磁性纳米粒子；
将上述二氧化硅包覆的磁性纳米粒子分散于去离子水和乙醇中，然后加入十六烷基三甲基溴化铵，氨水和正硅酸酯，充分搅拌6-8小时后，将分离出的产品分散在丙酮中，70-80℃温度下冷凝回流24-28小时，在包覆的磁性纳米粒子的二氧化硅壳层表面形成多孔二氧化硅壳层包覆，将其分散于溶剂中，加入硅氧烷类交联改性剂；
制备二肽功能化聚合物，将所述二肽功能化聚合物接枝于上述硅氧烷改性的多孔二氧化硅壳层表面，得到所述磁性壳核结构纳米粒子。
上述方案中，所述磁性纳米粒子为四氧化三铁纳米粒子，通过化学共沉淀法制备得到。
所述的磁性壳核结构纳米粒子在糖基化蛋白富集分离中的应用方法。
上述方案中，所述应用方法采用分散固相萃取模式，其包括以下步骤：
1)先采用平衡液平衡所述磁性壳核结构纳米粒子，然后将所述磁性壳核结构纳米粒子与蛋白酶解物以质量比例为1:1-1000:1混合，在10-60℃下孵化；利用磁力分离，弃上层清液，收集沉淀；
2)采用pH＝0-7的有机溶液多次对沉淀清洗，并利用磁力分离出固体沉淀，收集上层清液，得到含有分离后的糖肽的洗脱液。
上述方案中，所述步骤2)中的有机溶液是将有机酸溶解于有机溶剂所得，所述有机酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸，所述有机溶剂为乙腈、甲醇或乙醇的水溶液，所述有机溶剂的体积浓度为40-90％，所述有机溶液中有机酸的体积浓度为0.1-0.5％。
上述方案中，所述糖基化蛋白为牛胎球蛋白。
上述方案中，所述步骤1)中的孵化时间为0.5分钟-12小时。
本发明开发了一种基于二肽L-Asp-L-Phe功能化的多氢键作用聚合物修饰的磁性纳米粒子，利用二氧化硅包覆的磁性纳米粒子多孔核壳结构(Fe3O4@SiO2@mSiO2)，将磁性纳米粒子包覆在二氧化硅内部，延缓了其被氧化的时间，提高了磁性粒子在实验操作中的化学耐受性和稳定性，并包覆了一层多孔的二氧化硅材料，增大了该材料的比表面积，可用于提高聚合物的接枝密度。另外，利用该聚合物功能化材料与糖蛋白、糖肽的特异性相互作用，成功将该磁性微纳米材料与分散固相萃取模式结合，实现了从复杂样品中对糖基化蛋白、多肽类物质的高选择性、高重复性和高通量地富集。
本发明的有益效果为：
1、本发明制备的磁性壳核结构纳米粒子在分离富集糖基化肽类时表现出了高选择性和操作简易方便，可以实现糖基化蛋白/多肽的有效分离和富集；
2、多孔二氧化硅包覆磁性纳米粒子(Fe3O4@SiO2@mSiO2)的提供了更大的比表面积，提高了聚合物的接枝密度，提高了磁性粒子在实验操作中的稳定性和化学耐受性。
2、本发明制备的磁性壳核结构纳米粒子可以直接添加于离心管，操作简单，易于重复，特别适合微量生物样品中糖基化肽段的分离富集；
3、本发明富集得到的糖基化肽可直接用于电喷雾-质谱分析(ESI-MS)或者基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)的检测，提高了质谱对目标分子的检测限和灵敏度。
附图说明
图1为磁性壳核结构纳米粒子的结构示意图。
图2为磁性壳核结构纳米粒子的合成示意图。
图3为磁性壳核结构纳米粒子形成过程中各个阶段产物的动态光散射DLS测试(其中MSPs@PEI-L-DF表示磁性壳核结构纳米粒子)。
图4为多孔二氧化硅包覆的磁性纳米粒子(Fe3O4@SiO2@mSiO2)N2吸附脱附曲线及孔径分布曲线。
图5为二肽功能化聚合物修饰的芯片对不同糖的耗散型石英微天平(QCM-D)对L-半乳糖的吸附曲线。
图6为二肽功能化聚合物修饰的芯片对不同糖的耗散型石英微天平(QCM-D)对唾液酸的吸附曲线。
图7为二肽功能化聚合物修饰的芯片对不同糖的耗散型石英微天平(QCM-D)对N-乙酰基葡萄糖胺的吸附曲线。
图8为两种二肽功能化的聚合物(PEI-g-D-Asp-D-Phe和PEI-g-L-Asp-L-Phe)对D-阿拉伯糖的动态吸附数据比较说明。
图9为磁性壳核结构纳米粒子的X射线光电子能谱(XPS)元素分析谱图。
图10为磁性壳核结构纳米粒子的热重(TG)分析图。
图11(a)为磁性纳米粒子四氧化三铁的扫描电子显微镜图像，(b)为磁性壳核结构纳米粒子的扫描电子显微镜图像。
图12为磁性粒子能谱(EDS mapping)图像。
图13为应用方法实施例采用分散固相萃取模式示意图。
图14为采用分散固相萃取模式下，ESI-MS和MALDI-TOF检测到的牛胎球蛋白与牛血清蛋白分别在1：10(a)和1:200(b)质量比的条件下酶解后，经磁性壳核结构纳米粒子材料富集分离的糖基化多肽信号。表示糖基化多肽信号。
图15为采用分散固相萃取模式下，ESI-MS和MALDI-TOF检测到的，在胎球蛋白：牛胰岛蛋白质量比为1：50的条件下酶解后，经二肽功能化聚合物修饰的二氧化硅球体富集分离后的糖基化多肽的信号。表示糖基化多肽信号。
具体实施方式
为使本发明的内容、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例和附图进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明，而本发明不仅限于以下实施例。
实施例中所用原料及设备:
二肽L-Asp-L-Phe由梯希爱(上海)化成工业发展有限公司购得。三乙胺、氯乙酰氯、碘化钠、聚乙烯亚胺、硅烷偶联剂由Sigma-Aldrich公司购得。丙酮、甲醇、二甲基甲酰胺(DMF)、碳酸钠、甲苯、六水氯化铁、七水硫酸亚铁、十六烷基三甲基溴化铵、正硅酸酯、氨水等由国药试剂公司购得。各种测试用的肽链由上海强耀生物科技有限公司购得。各种糖类试剂由阿法埃莎(中国)化学有限公司购得。石英微天平(QCM)吸附数据由Q-SenseE4system检测获得。质谱分析结果由MALD-TOF MS获得。
实施例1
二肽功能化聚合物的制备
二肽(L-Asp-L-Phe)功能化聚合物的制备步骤如下：将1mol甲酯化二肽L-Asp-L-Phe溶解在氯仿中，并滴加三乙胺至碱性，在冰水浴中，逐滴滴加1.2～1.5mol的氯乙酰氯并反应12小时，得到氯乙酰化的二肽。将1g的氯乙酰化的二肽、聚乙烯亚胺(PEI，聚合度范围为5～200000)、碳酸钾、碘化钠溶于100mL无水的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，室温氮气保护下避光反应24小时后，纯化透析获得二肽功能化聚合物。
以下为二肽功能化聚合物的制备过程示意：
实施例2
多孔二氧化硅包覆磁性纳米粒子(以Fe3O4@SiO2@mSiO2表示)的制备
本实施例的磁性纳米粒子选用Fe3O4，可以理解的是，其他种类的磁性纳米粒子也适用于本发明。
1)制备Fe3O4磁性纳米粒子：将0.3M的六水氯化铁与0.2M的七水硫酸亚铁置于水溶液(H2O)中充分溶解，在氮气保护下，加入体积比为15％的氨水(NH3·H2O)，并在85℃温度下充分搅拌，2小时后，利用磁力将磁性纳米粒子(Fe3O4)分离出来，并用乙醇充分清洗；
2)制备Fe3O4@SiO2：将Fe3O4磁性纳米粒子分散于乙醇、去离子水、氨水和正硅酸酯(体积比为80:17:2.5:0.5)的混合溶液中，得到的2g/L的磁性纳米粒子，室温下充分搅拌12小时后，通过磁力分离出二氧化硅包覆的磁性纳米粒子(Fe3O4@SiO2)；
3)制备Fe3O4@SiO2@mSiO2：称取步骤2)所得的0.5g的产物分散于80mL去离子水和60mL乙醇中，然后加入0.3g的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，1mL氨水(NH3·H2O)和0.4mL正硅酸酯(TEOS)，充分搅拌6小时后，将分离出的产品分散在60mL丙酮中，80℃温度下冷凝回流24小时，并得到多孔二氧化硅包覆的磁性纳米粒子，将其分散于乙醇中常温下保存。
实施例3
磁性壳核结构纳米粒子的制备
1)将表面为多孔二氧化硅包覆的磁性纳米粒子(Fe3O4@SiO2@mSiO2)0.1g分散于100mL甲苯中，加入占前述溶液体积比为5％的异硫氰酸硅氧烷改性剂，85℃温度下回流反应24小时后，用乙醇清洗三次；
2)将实施例1得到的二肽功能化聚合物与上述步骤1)得到的硅氧烷改性后的磁性纳米粒子于100mL N,N-二甲基甲酰胺溶液混合分散均匀，加入三乙胺至碱性，并反应24小时后，离心并用乙醇清洗三次得到磁性壳核结构纳米粒子。
图1为磁性壳核结构纳米粒子的结构示意图。该磁性壳核结构纳米粒子包括若干磁性纳米粒子1、包覆若干磁性纳米粒子1的实心二氧化硅壳层2、包覆实心二氧化硅壳层2的多孔二氧化硅壳层3及接枝于多孔二氧化硅壳层3表面的二肽功能化聚合物4。图2为磁性壳核结构纳米粒子的合成示意图。图9至图12为对磁性壳核结构纳米粒子的表征示意图。
图9为磁性壳核结构纳米粒子在接枝二肽修饰的聚合物前后的X射线光电子能谱(XPS)元素分析谱图。对比实验结果可知，接枝了聚合物的磁性壳核结构纳米粒子的N1s元素显著提高，而N1s元素来自于聚合物，说明了聚合物接枝到该粒子表面。图10为磁性壳核结构纳米粒子接枝聚合物前后的热重(TG)分析图。对比实验结果可知，接枝了聚合物的纳米粒子相对于接枝前，每100mg失重相差大16mg。图11(a)为磁性纳米粒子四氧化三铁的扫描电子显微镜图像，(b)为磁性壳核结构纳米粒子的扫描电子显微镜图像。图12为磁性粒子能谱(EDS mapping)图像。其中，能谱显示的C、O、Fe、S、Si元素均为在合成聚合物修饰的磁性粒子过程中所需要的元素，充分说明了聚合物成功接枝到材料表面。
实施例4
采用QCM-D实验中所用的金表面芯片，对不同种类的糖进行特异性吸附动态测定实验，以L-Asp-L-Phe二肽修饰的聚合物为例。将0.4g二肽功能化聚合物溶解在干燥的20mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，利用聚合物与金表面的静电吸附作用，将聚合物接枝到QCM-D芯片表面，在实验温度20℃的条件下，对不同种类的糖分别进行动态吸附实验。二肽功能化聚合物修饰的芯片对不同糖的耗散型石英微天平(QCM-D)吸附曲线，以L-半乳糖(图5)、唾液酸(图6)和N-乙酰基葡萄糖胺(图7)为例说明。该实验显示出该材料能够对糖单元进行特异性吸附，并且展示出对端基不同的糖分子具有不同的动力学吸附过程和特异的吸附大小能力，充分展现了该材料在糖基化蛋白/多肽类的分离富集领域具有应用前景。
将本发明中的二肽聚合物与专利(公开号为CN105199101A)中所保护的二肽功能化聚合物PEI-g-D-Asp-D-Phe相比，对糖分子的吸附能力和特异性具有很大的差异性，具体在图8中，以该两种聚合物(PEI-g-D-Asp-D-Phe和PEI-g-L-Asp-L-Phe)对D-阿拉伯糖的动态吸附数据比较说明。PEI-g-D-Asp-D-Phe对D-阿拉伯糖吸附量小(约7Hz)，而PEI-g-L-Asp-L-Phe却展现出完全不同的吸附能力，对D-阿拉伯糖吸附量约42Hz，说明了二肽单元的替换改变了二肽功能化聚合物对糖分子的特异性作用，进而说明了二肽单元的引入对聚合物材料性能的影响。
实施例5
如图13所示，采用分散固相萃取模式进行糖肽富集实验。具体实验结果见图14。在分散固相萃取模式下，经磁性壳核结构纳米粒子材料富集后，牛胎球蛋白中糖基化多肽质谱信号示意图。
其中，关于牛血清蛋白(BSA)和牛胎球蛋白(Fetuin)的处理方法如下：1.0mg的牛胎球蛋白溶解在0.9mL碳酸氢铵溶液中(50mM，pH＝8.0)，加入0.1mL的50mM二硫苏糖在37℃温度下处理45分钟，然后冷却到室温。再加入碘乙酰胺至其浓度为15mM，并室温黑暗中处理30分钟，再加入一定量的二硫苏糖醇至其浓度为5mM用于处理多余的碘乙酰胺，室温处理15分钟。按照胰蛋白酶与牛胎球蛋白的质量比1:100(w/w)的比例进行酶解，37℃反应12小时，所得蛋白酶解液进行下述实验操作。其中，牛血清蛋白采用以上相同的酶解实验方法进行处理。
将1mg磁性壳核结构纳米粒子材料装入凝胶吸头中，1μL(约40pmol)蛋白酶解液上样后，分别用30μL的体积浓度85％乙腈水溶液/0.1％甲酸(pH＝3)洗脱两次；然后用30μL含有70％乙腈水溶液/0.1％甲酸(pH＝3)溶液洗脱两次；最后用20μL50％乙腈水溶液/3％三氟乙酸溶液洗脱。以上均采用磁力分离粒子的方式进行洗脱，且洗脱液直接在质谱上进行分析。以85％乙腈/0.1％甲酸为例说明，85％乙腈水溶液指的是乙腈的体积浓度为85％，甲酸加入至乙腈水溶液后体积浓度为0.1％。
图14为检测到的牛胎球蛋白与牛血清蛋白分别在1：10(a)和1:200(b)质量比的条件下酶解后，经磁性壳核结构纳米粒子材料富集分离的糖基化多肽信号。在1：10的质量比下，经该材料富集洗脱后的糖肽信号有43个；而在1：200的质量比的条件下，经该材料富集洗脱后的糖肽信号有30个。可见，牛胎球蛋白酶解产物中的糖基化多肽可以与磁性壳核结构纳米粒子发生较为高效的结合，并能依次从该材料上洗脱下来。说明该磁性壳核结构纳米粒子能特异性的富集和纯化糖基化多肽。
比较例
为了进一步说明磁性壳核结构纳米粒子在糖肽富集应用中的优越性，制备二肽功能化聚合物直接修饰的Fe3O4以及二肽功能化聚合物直接修饰的二氧化硅这两种材料。实验接枝方法参照图2。
实验结果表明，二肽功能化聚合物修饰的Fe3O4并不能达到有效的富集并分离糖肽的目的，在实验中大多数的蛋白/多肽类物质富集到该粒子表面，然而Fe3O4与生物分子的过强作用力导致了无法将糖肽洗脱，进而无法得到有效的质谱检测信号。该实验说明了在Fe3O4表面包覆二氧化硅的必要性。
将二肽功能化聚合物修饰到二氧化硅球体表面，在胎球蛋白：牛胰岛蛋白质量比为1：50的条件下，富集分离后的糖基化多肽的信号如图15所示，仅检测到26个糖基化多肽的信号。由此可以说明多孔二氧化硅的包覆提高了该聚合物功能化粒子与糖肽富集能力。
利用本发明的磁性壳核结构纳米粒子对于糖基化多肽的高效的特异性吸附能力，可以将其应用于复杂体系中糖基化多肽的选择性分离富集，结合质谱，该材料在翻译后修饰蛋白质组学研究等领域具有广阔的应用前景。

Claims (10)

1.一种磁性壳核结构纳米粒子，其特征在于，所述磁性壳核结构纳米粒子包括若干磁性纳米粒子、包覆所述若干磁性纳米粒子的二氧化硅壳层、包覆所述二氧化硅壳层的多孔二氧化硅壳层及接枝于所述多孔二氧化硅壳层表面的二肽功能化聚合物；所述二肽功能化聚合物的结构为：
聚合度n为5～200000。
2.如权利要求1所述的磁性壳核结构纳米粒子，其特征在于，所述磁性壳核结构纳米粒子的直径为1×10-2～5μm，孔径为2-100nm。
3.如权利要求1所述的磁性壳核结构纳米粒子，其特征在于，所述磁性纳米粒子为四氧化三铁纳米粒子。
4.如权利要求1所述的磁性壳核结构纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：制备磁性纳米粒子；
将所述磁性纳米粒子分散于乙醇、去离子水、氨水和正硅酸酯的混合溶液中，室温下充分搅拌12-16小时后，通过磁力分离出二氧化硅包覆的磁性纳米粒子；
将上述二氧化硅包覆的磁性纳米粒子分散于去离子水和乙醇中，然后加入十六烷基三甲基溴化铵，氨水和正硅酸酯，充分搅拌6-8小时后，将分离出的产品分散在丙酮中，70-80℃温度下冷凝回流24-28小时，在包覆的磁性纳米粒子的二氧化硅壳层表面形成多孔二氧化硅壳层包覆，将其分散于溶剂中，加入硅氧烷类交联改性剂；
制备二肽功能化聚合物，将所述二肽功能化聚合物接枝于上述硅氧烷改性的多孔二氧化硅壳层表面，得到所述磁性壳核结构纳米粒子。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述磁性纳米粒子为四氧化三铁纳米粒子，通过化学共沉淀法制备得到。
6.如权利要求1所述的磁性壳核结构纳米粒子在糖基化蛋白富集分离中的应用方法。
7.如权利要求6所述的应用方法，其特征在于，所述应用方法采用分散固相萃取模式，其包括以下步骤：
1)先采用平衡液平衡所述磁性壳核结构纳米粒子，然后将所述磁性壳核结构纳米粒子与蛋白酶解物以质量比例为1:1-1000:1混合，在10-60℃下孵化；利用磁力分离，弃上层清液，收集沉淀；
2)采用pH＝0-7的有机溶液多次对沉淀清洗，并利用磁力分离出固体沉淀，收集上层清液，得到含有分离后的糖肽的洗脱液。
8.如权利要求7所述的应用方法，其特征在于，所述步骤2)中的有机溶液是将有机酸溶解于有机溶剂所得，所述有机酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸，所述有机溶剂为乙腈、甲醇或乙醇的水溶液，所述有机溶剂的体积浓度为40-90％，所述有机溶液中有机酸的体积浓度为0.1-0.5％。
9.如权利要求7所述的应用方法，其特征在于，所述糖基化蛋白为牛胎球蛋白。
10.如权利要求7所述的应用方法，其特征在于，所述步骤1)中的孵化时间为0.5分钟-12小时。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109225084A (zh) * 2018-10-18 2019-01-18 郑州安图生物工程股份有限公司 能大量富集糖蛋白的核壳式硼基化磁性微球的制备方法
CN109666063A (zh) * 2018-12-28 2019-04-23 陕西师范大学 基于离子互补型肽自组装的麦芽糖功能化纳米复合材料及其制备方法和应用
CN110330069A (zh) * 2019-08-01 2019-10-15 南京中医药大学 一种高效便捷去除水相溶液中内毒素的清除剂及其制备
CN114667130A (zh) * 2019-07-26 2022-06-24 比奥尼克莱公司 杂化无机-有机复合物及其用于维持皮肤和/或化妆品和/或皮肤药物组合物的微生物平衡的用途
WO2023274252A1 (zh) * 2021-06-30 2023-01-05 同济大学 一种聚合物修饰的磁性纳米材料、其制备方法及应用
WO2023077608A1 (zh) * 2021-11-04 2023-05-11 飞潮（无锡）过滤技术有限公司 一种带有磁性粒子的流化床净化系统及其应用方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100400660C (zh) * 2002-12-26 2008-07-09 协和发酵工业株式会社 生产二肽的方法
CN103310935A (zh) * 2013-06-05 2013-09-18 中国科学院上海硅酸盐研究所 二氧化硅纳米磁性微球及其制备方法
CN105199101A (zh) * 2015-10-21 2015-12-30 武汉理工大学 一种二肽聚乙烯亚胺聚合物及其制备方法与应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100400660C (zh) * 2002-12-26 2008-07-09 协和发酵工业株式会社 生产二肽的方法
CN103310935A (zh) * 2013-06-05 2013-09-18 中国科学院上海硅酸盐研究所 二氧化硅纳米磁性微球及其制备方法
CN105199101A (zh) * 2015-10-21 2015-12-30 武汉理工大学 一种二肽聚乙烯亚胺聚合物及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
晁文彪等: "单分散Fe3O4@SiO2@mSiO2复合微球的制备及磁性的研究", 《化工时刊》 *
绍兵等: "《食品中《非食用物质检测技术及应用》", 31 May 2014, 中国质检出版社 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109225084A (zh) * 2018-10-18 2019-01-18 郑州安图生物工程股份有限公司 能大量富集糖蛋白的核壳式硼基化磁性微球的制备方法
CN109225084B (zh) * 2018-10-18 2021-08-06 郑州安图生物工程股份有限公司 能大量富集糖蛋白的核壳式硼基化磁性微球的制备方法
CN109666063A (zh) * 2018-12-28 2019-04-23 陕西师范大学 基于离子互补型肽自组装的麦芽糖功能化纳米复合材料及其制备方法和应用
CN109666063B (zh) * 2018-12-28 2022-02-25 陕西师范大学 基于离子互补型肽自组装的麦芽糖功能化纳米复合材料及其制备方法和应用
CN114667130A (zh) * 2019-07-26 2022-06-24 比奥尼克莱公司 杂化无机-有机复合物及其用于维持皮肤和/或化妆品和/或皮肤药物组合物的微生物平衡的用途
CN110330069A (zh) * 2019-08-01 2019-10-15 南京中医药大学 一种高效便捷去除水相溶液中内毒素的清除剂及其制备
WO2023274252A1 (zh) * 2021-06-30 2023-01-05 同济大学 一种聚合物修饰的磁性纳米材料、其制备方法及应用
WO2023077608A1 (zh) * 2021-11-04 2023-05-11 飞潮（无锡）过滤技术有限公司 一种带有磁性粒子的流化床净化系统及其应用方法

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