CN106366182B - pH响应型磁性复合纳米球及其制备方法与应用 - Google Patents

pH响应型磁性复合纳米球及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种pH响应型的磁性复合纳米球及其制备方法与应用，该磁性复合纳米球由Fe3O4纳米粒子，包覆在Fe3O4纳米粒子表面的亲水性氨基聚合物以及接枝于亲水性氨基聚合物表面的含双键的苯硼酸衍生物的聚合物构成。本发明提供的pH响应型的磁性复合纳米球，以Fe3O4纳米粒子作为核，具有高的磁饱和强度，从而提供较好的磁响应性能，可以在较短的时间内完成磁分离；由于表面接枝的苯硼酸衍生物的聚合物高分子刷的存在，可以在酸性/碱性环境下可逆的、高效的、高选择性的捕获和释放糖蛋白，对糖蛋白的回收率接近100％，且可重复使用，能潜在应用于高特异性糖蛋白捕获和分离。

Description

pH响应型磁性复合纳米球及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于磁性复合纳米材料领域，特别涉及pH响应型磁性复合纳米球、其制备方法以及在糖蛋白捕获和释放方面的应用。
背景技术
蛋白糖基化，即在糖基转移酶作用下将糖转移至蛋白质，与蛋白质上的氨基酸形成糖苷键，是蛋白最普遍的翻译后修饰的一种形式，在许多生物学活动中扮演了重要角色，比如细胞粘附和识别、信号传导、免疫环节和蛋白折叠等。不正常的糖基化也与许多疾病有关，例如糖尿病、癌症、神经退行性疾病、心血管疾病等。所以，发现和分析特定的糖基化的蛋白具有重要的意义。但是将靶向糖蛋白从复杂的生物流体中分离出来是比较困难的；开发有效的材料或/和方法来高选择性的分离糖蛋白对开发其在蛋白组学和诊断学中潜在的临床应用是十分重要的。
在过去十年内，根据不同的机理，已有一些方法提出来特异性的识别或分离糖蛋白/糖肽，比如凝集素亲和色谱、酰肼化学、亲水相互作用色谱：(1)凝集素亲和色谱，在材料表面修饰上作为功能分子的凝集素，用于靶向糖蛋白中的糖分子，每一种凝集素可以特异性的识别一类糖分子(参见文献Wu,J.；Zhu,J.；Yin,H.；Buckanovich,R.J.；Lubman,D.M.Analysis of glycan variation on glycoproteins from serum by the reverselectin-based ELISA assay.J.Proteome Res.2014,13,2197-2204)，但凝集素与糖分子的相互作用比较强，使得之后的洗脱难度增加、且步骤繁琐；(2)酰肼化学，是先将材料表面功能化酰肼键；然后将糖蛋白预处理，使糖蛋白中的羟基氧化成醛基；最后，使材料表面的酰肼键和预处理后糖蛋白的醛基发生特异性反应，从而实现特异性的捕获糖蛋白(参见文献Liu,L.；Yu,M.；Zhang,Y.；Wang,C.；Lu,H.Hydrazide functionalized core-shellmagnetic nanocomposites for highly specific enrichment of N-glycopeptides.ACSAppl.Mater.Interfaces 2014,6,823-7832)；此方法中，对糖蛋白的预处理过程比较繁琐，从而使得整个酰肼化学过程的周期较长，难以普及应用；(3)亲水相互作用色谱，首先制备出具有合适亲疏水性的材料，使材料通过亲水作用选择性的分类糖蛋白(参见文献Zhu,J.；Sun,Z.；Cheng,K.；Chen,R.；Ye,M.；Xu,B.；Sun,D.；Wang,L.；Liu,J.；Wang,F.；Zou,H.Comprehensive mapping of protein N-glycosylation in human liver bycombining hydrophilic interaction chromatography and hydrazidechemistry.J.Proteome Res.2014,13,1713-1721)，但该方法的糖蛋白选择性和糖蛋白回收率较低。
近几年，苯硼酸亲和色谱因为其独特的pH开关性质而被广泛应用；在碱性环境下，苯硼酸亲和色谱能和糖蛋白的顺式二醇共价形成环醚，而当pH转变到酸性环境下，就能够可逆的释放糖蛋白(参加文献Li,D.；Chen,Y.；Liu,Z.Boronate affinity materials forseparation and molecular recognition:structure,properties andapplications.Chem.Soc.Rev.2015,44,8097-8123)。目前，已有许多硼酸功能化的材料来选择性的富集或分离糖蛋白和糖肽，例如石墨烯、硅、量子点等。然而苯硼酸亲和色谱方法，后处理繁琐(比如离心操作等)。硼酸功能化的磁性纳米材料因其独特的磁性能已作为一种苯硼酸亲和色谱的替代品被广泛应用，其能显著提高分离速率，且操作简便(参见文献Li,Y.；Zhang,X.；Deng,C.Functionalized magnetic nanoparticles for samplepreparation in proteomics and peptidomics analysis.Chem.Soc.Rev.2013,42,8517-8539)；硼酸功能化的磁性纳米材料一般是由磁性纳米材料被小分子的硼酸配体修饰得到，首先，磁性纳米材料通过多步操作被预功能化活性基团(如羧基、氨基、叠氮基等)，然后这些活性基团再与小分子硼酸配体的活性基团(如氨基、炔基等)反应，从而嫁接上小分子硼酸配体(参见文献hang,L.；Xu,Y.；Yao,H.；Xie,L.；Yao,J.；Lu,H.；Yang,P.Boronic acidfunctionalized core-satellite composite nanoparticles for advanced enrichmentof glycopeptides and glycoproteins.Chem.Eur.J.2009,15,10158-10166)；硼酸功能化的磁性纳米材料的预功能化操作比较繁琐，极大增加了制造成本，而且小分子硼酸配体嫁接策略因为其较大的空间位阻是的硼酸嫁接率较低，从而限制其进一步在生物医学方面的应用(参见文献Lin,Z.A.；Zheng,J.N.；Lin,F.；Zhang,L.；Cai,Z.；Chen,G.N.Synthesis ofmagnetic nanoparticles with immobilized aminophenylboronic acid for selectivecapture of glycoproteins.J.Mater.Chem.2011,21,518-524)。
为了改善小分子硼酸配体修饰制备硼酸功能化磁性纳米材料方面的不足，Zhang等人使用蒸馏-沉淀聚合技术制备含苯硼酸的共聚物的多功能磁性纳米粒子，即在磁性材料表面接枝硼酸高分子来替代小分子硼酸配体，从而提高硼酸单元的嫁接率(参见文献Zhang,X.；Wang,J.；He,X.；Chen,L.；Zhang,Y.Tailor-Made Boronic AcidFunctionalized Magnetic Nanoparticles with a Tunable Polymer Shell-Assistedfor the Selective Enrichment of Glycoproteins/Glycopeptides.ACSAppl.Mater.Interfaces 2015,7,24576-24584)；但是，这种蒸馏-沉淀聚合技术需要高温操作，具有一定的安全隐患，且需要特定的实验装置(如烧瓶、分馏柱、李比希冷凝器、接收器、油浴等)，使得操作过于繁琐，同时也增加了制造成本；此外，虽然Zhang制备的磁性粒子在蛋白体系中对糖蛋白的吸附量较高，但是其在混合蛋白体系中对糖蛋白的选择性较低。Pan等人使用种子乳液聚合技术制备了核-壳-壳结构的硼酸功能化的磁性复合微球(参见文献Pan,M.；Sun,Y.；Zheng,J.；Yang,W.Boronic acid-functionalized core-shell-shell magnetic composite microspheres for the selective enrichment ofglycoprotein.ACS Appl.Mater.Interfaces 2013,5,8351-8358)，其对糖蛋白富集的选择性得到了改善，但其富集效率并不理想，仅仅只有77.5％，仍有大量的糖蛋白残余在上清液中。
此外，上述提到的一系列硼酸功能的磁性纳米材料制备方法，磁性纳米粒子在嫁接小分子配体或硼酸高分子之前，都需要使用硅烷偶联剂进行预处理，硅是一种反磁性材料，将大大降低磁性材料的磁饱和强度，从而降低其进一步应用的效率。
发明内容
本发明的目的旨在针对上述现有糖蛋白分离材料分离效率低、富集效率不理想的问题，提供一种pH响应型磁性复合纳米球，以便可逆的、高效的、高选择性的捕获或释放糖蛋白。
本发明另一目的旨在提供一种反应条件温和、制备成本低的制备方法，用于制备上述pH响应型磁性复合纳米球。
本发明再一目的旨在提供上述pH响应型磁性复合纳米球在糖蛋白捕获或释放中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术方案来实现。
本发明提供了一种pH响应型磁性复合纳米球，由Fe3O4纳米粒子，包覆在Fe3O4纳米粒子表面的亲水性氨基聚合物以及接枝于亲水性氨基聚合物表面的含双键的苯硼酸衍生物的聚合物构成。
上述pH响应型磁性复合纳米球，亲水性氨基聚合物为羧甲基壳聚糖或者聚醚酰亚胺；含有双键的苯硼酸衍生物为2-乙烯基苯硼酸、3-乙烯基苯硼酸或3-丙烯酰胺苯硼酸。
上述磁性复合纳米球呈均匀的球形，平均粒径分布窄(约为300nm～500nm)。该磁性复合纳米球由Fe3O4纳米粒子作为核，具有高的磁饱和强度，从而提供较好的磁响应性能；薄的亲水性氨基聚合物作为中间层，为接枝苯硼酸衍生物提供氨基；最外层的含双键的苯硼酸衍生物的聚合物高分子刷为进一步高效捕获和分离提供苯硼酸基团；因为含双键的苯硼酸衍生物的聚合物的存在，磁性复合纳米球可以在酸性/碱性环境下可逆的、高效的、高选择性的捕获和释放糖蛋白，且在较短的时间内即可完成磁分离(10s内)；磁性复合纳米球对糖蛋白的回收率接近100％，且可重复使用，能应用于高特异性糖蛋白分离。
本发明进一步提供了上述pH响应型磁性复合纳米球的制备方法，该制备方法的基本原理是首先利用溶剂热法制备Fe3O4纳米粒子；再在制得的Fe3O4纳米粒子表面包覆一层亲水性氨基聚合物，制得亲水性氨基聚合物包覆的Fe3O4纳米球；然后通过催化剂再生电子转移自由基聚合技术(ARGET-ATRP)将含双键的苯硼酸衍生物的聚合物高分子刷嫁接到亲水性氨基聚合物包覆的Fe3O4纳米球表面，即得到磁性复合纳米球。
基于上述原理，本发明提供的pH响应型磁性复合纳米球的制备方法，步骤如下：
(1)配制Fe3O4纳米粒子悬浮液和亲水性氨基聚合物水溶液
将Fe3O4纳米粒子分散到去离子水中，配制Fe3O4纳米粒子浓度为100～150mg/mL的Fe3O4纳米粒子悬浮液；将亲水性氨基聚合物溶于去离子水中，配制亲水性氨基聚合物浓度为20～60mg/mL的亲水性氨基聚合物水溶液；
(2)制备亲水性氨基聚合物包覆的Fe3O4纳米球
将步骤(1)配制的Fe3O4纳米粒子悬浮液和亲水性氨基聚合物水溶液按照Fe3O4纳米粒子与亲水性氨基聚合物的质量比为25:(16～48)计量并加入到反应容器中，在搅拌下于室温反应至少8小时得含第一产物的第一反应液，所述第一产物为亲水性氨基聚合物包覆的Fe3O4纳米球；用磁铁收集第一反应液中的第一产物，再依次用去离子水、乙醇和溶剂A对第一产物进行洗涤除去游离的亲水性氨基聚合物；
(3)制备pH响应型磁性复合纳米球
①将步骤(2)所得洗涤后的第一产物分散到溶剂A中，得到第一产物浓度为100～120mg/mL的第一产物悬浮液，将三乙胺溶于溶剂A得到碱性有机溶剂；将第一产物悬浮液和碱性有机溶剂按第一产物与三乙胺的质量比为1:(4～13.3)计量并加入反应容器中混合均匀得到碱性混合液，然后在搅拌下将碱性混合液的温度降至-20～0℃，再向碱性混合液中滴入引发剂2-溴异丁酰溴，2-溴异丁酰溴的量为碱性混合液中所含第一产物质量的8.55～50.7倍，2-溴异丁酰溴滴加完后在搅拌下使2-溴异丁酰溴分散均匀，然后将含2-溴异丁酰溴的碱性混合液的温度升至室温进行至少8小时的接枝反应，得含第二产物的第二反应液，所述第二产物为接枝有引发剂的亲水性氨基聚合物包覆的Fe3O4纳米球；用磁铁收集第二反应液中的第二产物，再用N,N-二甲基甲酰胺、乙腈、二甲基亚砜、氯仿、二氯甲烷、乙醇中的至少一种溶剂对第二产物进行洗涤除去未接枝的引发剂；
②将步骤①所得洗涤后的第二产物分散到溶剂A中，得到第二产物浓度为35～65mg/mL第二产物悬浮液，将催化剂和还原剂放入反应容器中进行无氧处理，然后在氮气保护、搅拌条件下向反应容器中加入溶剂A、螯合剂、第二产物悬浮液和含双键的苯硼酸衍生物并混合均匀，所得混合液在氮气或氩气保护、搅拌下于室温进行至少20小时的引发聚合反应，得含第三产物的第三反应液，所述第三产物为pH响应型的磁性复合纳米球；用磁铁收集第三反应液中的第三产物，然后依次用乙醇和去离子水对第三产物进行洗涤除去溶剂A、催化剂、还原剂、螯合剂以及未反应的含双键的苯硼酸衍生物；所述第二产物悬浮液中的第二产物、含双键的苯硼酸衍生物、催化剂、还原剂和螯合剂的质量比为2:(0.5～8):(2.0～2.2):1:(1.5～2.3)；
上述各步骤中的溶剂A为N,N-二甲基甲酰胺、乙腈或者二甲基亚砜；所述亲水性氨基聚合物为羧甲基壳聚糖或者聚醚酰亚胺；所述含有双键的苯硼酸衍生物为2-乙烯基苯硼酸、3-乙烯基苯硼酸或3-丙烯酰胺苯硼酸。
上述pH响应型磁性复合纳米球的制备方法，Fe3O4纳米粒子可以参考现有技术中已经披露的常规制备方法得到，参见Zhao,M.；Zhang,X.；Deng,C.Rational synthesis ofnovel recyclable Fe3O4@MOF nanocomposites for enzymaticdigestion.Chem.Commun.2015,51,8116-8119和Zhang,Y.；Yang,Y.；Ma,W.；Guo,J.；Lin,Y.；Wang,C.Uniform Magnetic Core/Shell Microspheres Functionalized with Ni2+-Iminodiacetic Acid for One Step Purification and Immobilization of His-TaggedEnzymes.ACS Appl.Mater.Interfaces 2013,5,2626-2633。本发明中采用的制备方法为：将原料氯化铁、柠檬酸钠和醋酸铵，按摩尔比1：(0.33～0.79)：10加入到盛有氯化铁质量(33～36)倍的乙二醇溶剂的反应容器中，在搅拌下使原料溶解并混合均匀；然后将反应温度升至180～220℃，反应不少于15小时；反应结束后再将反应温度冷却至室温，用磁铁收集反应液中的Fe3O4纳米粒子；然后依次用乙醇和去离子水对Fe3O4纳米粒子进行洗涤除去未反应的原料。
上述pH响应型磁性复合纳米球的制备方法，步骤(2)的目的是利用亲水性氨基聚合物将Fe3O4纳米粒子包覆完全，以便在Fe3O4纳米球表面能接枝较多的含双键的苯硼酸衍生物的聚合物，经研究发现，当按照Fe3O4纳米粒子与亲水性氨基聚合物质量比25：(16～48)进行配比时，亲水性氨基聚合物能够较好的包覆Fe3O4纳米粒子；当按照Fe3O4与亲水性氨基聚合物质量比25：(40～48)进行配比时，包覆效果更好；上述Fe3O4纳米粒子与亲水性氨基聚合物反应时间可根据具体情况进行调整，一般不少于8小时，当反应时间为8～12小时时，即可认为Fe3O4纳米粒子已被包覆完全。待Fe3O4纳米粒子与亲水性氨基聚合物反应结束后，需要用磁铁收集反应所得第一产物亲水性氨基聚合物包覆的Fe3O4纳米球，然后依次用去离子水、乙醇和溶剂A对产物进行洗涤除去未反应的亲水性氨基聚合物，一般每种洗液洗涤三至五次即可。溶剂A为步骤S3中所使用的反应溶剂，可以为N,N-二甲基甲酰胺、乙腈或者二甲基亚砜。
上述pH响应型磁性复合纳米球的制备方法，步骤(3)的目的是在步骤S2得到的第一产物的亲水性氨基聚合物表面接枝苯硼酸衍生物的聚合物从而形成高分子刷，用于捕获糖蛋白。这里采用的苯硼酸衍生物为含双键的苯硼酸衍生物以便使苯硼酸衍生物发生聚合形成聚合物。本发明中采用的含双键的苯硼酸衍生物为2-乙烯基苯硼酸、3-乙烯基苯硼酸和3-丙烯酰胺苯硼酸中的一种。该步骤首先在亲水性氨基聚合物表面接枝用于引发苯硼酸衍生物发生聚合反应的引发剂。碱性有机溶剂用于提供碱性反应环境，通常采用三乙胺来调节有机溶剂的碱性。为了使2-溴异丁酰溴分散均匀，需要在低温、搅拌条件下加入，然后再升至室温继续搅拌，发生接枝反应，反应时间一般8-10小时即可；这里的低温条件为不高于0℃，优选-20～0℃，可以通过冰浴或干冰浴来实现。为了避免Fe3O4局部接枝过多的引发剂而影响后序糖蛋白的分离，2-溴异丁酰溴的用量为第一产物质量的8.55～50.7倍；优选实施方式中，2-溴异丁酰溴的用量为第一产物质量的8.55～17.00倍。反应得到的第二产物接枝有引发剂的亲水性氨基聚合物包覆的Fe3O4纳米球，再用N,N-二甲基甲酰胺、乙腈、二甲基亚砜、氯仿、二氯甲烷和乙醇中的至少一种溶剂对产物进行洗涤除去未接枝的引发剂，优选的洗涤方式是先采用N,N-二甲基甲酰胺、乙腈或二甲基亚砜等有机溶剂洗涤除去未接枝的引发剂，再采用氯仿或二氯甲烷洗涤去除残留的N,N-二甲基甲酰胺、乙腈或二甲基亚砜，再用乙醇洗涤去除残留的氯仿或二氯甲烷，最后用下一步骤中采用的溶剂A洗涤，每种洗液一般洗涤三至五次即可。
上述pH响应型磁性复合纳米球的制备方法，在第一产物的亲水性氨基聚合物表面接枝引发剂得到第二产物后，接着在催化体系下，引发含双键的苯硼酸衍生物发生聚合反应，在亲水性氨基聚合物表面形成高分子刷。当第二产物和含双键的苯硼酸衍生物的质量比为2：(0.5～8)时，在第二产物亲水性氨基聚合物表面接枝的苯硼酸衍生物的聚合物高分子刷即可满足高效捕获糖蛋白的要求，但为了保证后期糖蛋白的分离效率，第二产物和含双键的苯硼酸衍生物的质量比优选为1：(0.5～1.0)。由催化剂、还原剂和螯合剂构成的催化体系为本领域聚合反应常规选择，催化剂可以为溴化铜或氯化铜；还原剂为抗坏血酸；螯合剂为联吡啶、三(2-二甲氨基乙基)胺或N,N,N’,N”,N”-五甲基二亚乙基三胺中的一种。
上述pH响应型磁性复合纳米球的制备方法，步骤②中无氧化处理可以采用本领域中已经披露的常规操作方法，本发明中无氧化处理的具体操作为首先将反应容器内真空抽5～10min，然后再通入氮气至常压，如此反复操作三至五次。
上述pH响应型磁性复合纳米球的制备方法，步骤②中溶剂A的用量为使催化剂、还原剂、螯合剂和含双键的苯硼酸衍生物溶解完全，且满足引发聚合反应持续进行即可。
本发明进一步提供了一种上述pH响应型磁性复合纳米球在糖蛋白捕获或糖蛋白释放中的应用；在酸性环境下，磁性复合纳米球表面的苯硼酸能和糖蛋白的顺式二醇共价形成环醚，而实现对糖蛋白的捕获；而当环境pH转变到碱性时，就能够可逆的释放糖蛋白。
上述应用中，糖蛋白捕获的步骤如下：
(1)将含有糖蛋白的混合蛋白体系溶于酸性缓冲溶液中获得蛋白浓度为300～600μg/mL的蛋白混合液；将所述pH响应型磁性复合纳米球分散到去离子水中，配制磁性复合纳米球浓度为12～24mg/mL的磁性复合纳米球悬浮液；
(2)按照磁性复合纳米球与蛋白质量比不低于110:3取步骤(1)配制的蛋白混合液和磁性复合纳米球悬浮液，将两者混合后在震荡条件下于室温孵育至磁性复合纳米球对糖蛋白的吸附达到平衡，然后用磁铁收集孵育得到的混合液中的产物，再将收集的产物用酸性缓冲液洗涤除去未被吸附的蛋白，即得到键合了糖蛋白的磁性复合纳米球，完成糖蛋白的捕获。
上述应用中，糖蛋白释放的步骤如下：将键合了糖蛋白的磁性复合纳米球分散到碱性缓冲溶液中，在震荡条件下于室温下洗脱至磁性复合纳米球对糖蛋白的脱附达到平衡，使糖蛋白与磁性复合纳米球分离，即完成了糖蛋白的释放，然后用磁铁收集洗脱得到的混合液中的磁性复合纳米球；所述碱性缓冲液的用量为至少将键合了糖蛋白的磁性复合纳米球淹没。
上述糖蛋白释放方法中，碱性缓冲液的用量为至少将键合了糖蛋白的磁性复合纳米球淹没，得到均匀悬浮液；但碱性缓冲液的用量不宜过多，以免因洗脱后的蛋白在碱性缓冲液中的浓度过低，影响进一步的SDS-PAGE电泳分析。
上述糖蛋白的捕获和释放方法中，对于孵育时间和洗脱时间没有严格的限定，只要磁性复合纳米球对糖蛋白的吸附或者脱附达到平衡即可，当孵育和洗脱时间较短时，磁性复合纳米球对糖蛋白的吸附量或脱附量较低；在本发明实施条件下，当孵育时间或洗脱时间不小于60min时，磁性复合纳米球对糖蛋白的吸附或者脱附基本达到平衡。
上述糖蛋白的捕获和释放方法中，所用的酸性缓冲溶液和碱性缓冲溶液只是用于提供酸性环境和碱性环境，本发明对其没有特殊的要求；本发明采用的酸性缓冲溶液的pH＝3～5，本发明采用的碱性缓冲溶液的pH＝9～11。
上述糖蛋白的捕获和释放方法，可以用于捕获和释放任何一种类型的糖蛋白，例如转铁蛋白、辣根过氧化物酶、甲胎蛋白等。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供的pH响应型磁性复合纳米球，以Fe3O4纳米粒子作为核，具有高的磁饱和强度，从而提供较好的磁响应性能，可以在较短的时间内完成磁分离；
2、本发明提供的pH响应型磁性复合纳米球，由于表面接枝的苯硼酸衍生物的聚合物高分子刷的存在，可以在酸性/碱性环境下可逆的、高效的、高选择性的捕获和释放糖蛋白，对糖蛋白的回收率接近100％，且可重复使用，能应用于高特异性糖蛋白捕获和分离；
3、本发明提供的pH响应型磁性复合纳米球的制备方法，操作简单、反应条件温和，特别利用ARGET-ATRP技术引发苯硼酸衍生物的聚合反应，在室温条件即可进行，对氧环境的要求没有现有技术中的制备方法条件苛刻，易于在生物医药行业领域内推广；
4、本发明采用ARGET-ATRP技术将含双键的苯硼酸衍生物的聚合物高分子刷嫁接到亲水性氨基聚合物包覆的Fe3O4纳米球表面，相对于传统接枝聚合反应，减少了催化剂用量，特别是溴化铜的用量减少，从而减轻了对生物以及环境的污染。
附图说明
图1为本发明实施例Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球的制备流程图。
图2为本发明实施例使用Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球对蛋白混合体系中糖蛋白的捕获和分离流程图。
图3为本发明实施例Fe3O4纳米粒子、Fe3O4/CMCS纳米球、Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球的结构表征示意图，其中(A)、(D)和(G)为Fe3O4纳米粒子的扫描电镜(SEM)图、透射电镜(TEM)图和尺寸分布图(DLS)，(B)、(E)和(H)为Fe3O4/CMCS纳米球的扫描电镜(SEM)图、透射电镜(TEM)图和粒径分布图(DLS)，(C)、(F)和(I)为Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球的扫描电镜(SEM)图、透射电镜(TEM)图和尺寸分布图(DLS)。
图4为本发明实施例Fe3O4纳米粒子、Fe3O4/CMCS纳米球、Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球的Zeta电位图。
图5为本发明实施例CMCS、Fe3O4纳米粒子、Fe3O4/CMCS纳米球、Fe3O4/CMCS-Br纳米球、Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球的红外图谱；其中，A为CMCS(a)、Fe3O4纳米粒子(b)、Fe3O4/CMCS纳米球(c)、Fe3O4/CMCS-Br纳米球(d)、Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球(e)在波数(cm-1)4000～500之间的红外图谱，B为CMCS(a)、Fe3O4纳米粒子(b)、Fe3O4/CMCS纳米球(c)、Fe3O4/CMCS-Br纳米球(d)、Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球(e)在波数(cm-1)1700～1000之间的红外图谱。
图6为本发明实施例Fe3O4/CMCS-Br纳米球的能量弥散X射线(EDX)能谱图。
图7为本发明实施例Fe3O4纳米粒子、Fe3O4/CMCS纳米球、Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球的X射线光电子能谱图；其中(A)为Fe3O4纳米粒子的X射线光电子能谱图，(B)为Fe3O4/CMCS纳米球的X射线光电子能谱图，(C)为Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球的X射线光电子能谱图，(D)为Fe3O4纳米粒子(a)、Fe3O4/CMCS纳米球(b)、Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球(c)的高分辨X射线光电子能谱图。
图8为本发明实施例CMCS(a)、Fe3O4纳米粒子(b)、Fe3O4/CMCS纳米球(c)、Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球(d)的热重分析(TGA)图。
图9为本发明实施例Fe3O4纳米粒子(a)、Fe3O4/CMCS纳米球(b)、Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球(c)的磁滞回线图(A)以及所得磁滞回线在磁场-100～100Oe之间的放大图(B)。
图10为本发明实施例分子量标样(marker)、转铁蛋白溶液(TRF)与Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球在pH为4的BR缓冲溶液孵育前后的标准蛋白样品(TRF)、上层清液(S)、键合了TRF的磁性复合纳米球(C)，以及在pH为4的BR缓冲溶液或pH为10的BR缓冲溶液洗脱后的洗脱液(E)、洗脱后的材料(C)的SDS-PAGE分析图；其中，孵育过程用I表示，洗脱过程用E表示。
图11为本发明实施例分子量标样(marker)、标准转铁蛋白样品(TRF)、转铁蛋白溶液(TRF)与Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球在pH为4的BR缓冲溶液孵育和pH为10的BR缓冲溶液洗脱重复循环5次(E1、E2、E3、E4、E5)后的洗脱液的SDS-PAGE分析图(A)以及吸附率随循环次数的变化柱状图。
图12为本发明实施例Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球(材料)、转铁蛋白样品(TRF)、被Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球吸附的转铁蛋白样品(材料+TRF)分别在pH为4的BR缓冲溶液(A)及pH为10的BR缓冲溶液(B)下的荧光光谱图。
图13为本发明实施例分子量标样(marker)，蛋白混合液(Mix)与Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球在pH为4的BR缓冲溶液孵育前后的蛋白混合液的标样(Mix)、上层清液(S)、键合蛋白的材料(C)，以及在pH为4的BR缓冲溶液或pH为10的BR缓冲溶液洗脱后的洗脱液(E)、洗脱后的材料(C)的SDS-PAGE分析图；其中，孵育过程用I表示，洗脱过程用E表示。
图14为分子量标样(marker)、蛋白混合样品(Mix)、蛋白混合样品(Mix)与Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球在pH为4的BR缓冲溶液孵育和pH为10的BR缓冲溶液洗脱重复循环5次(E1、E2、E3、E4、E5)后的洗脱液的SDS-PAGE分析图(A)以及吸附率随循环次数的变化柱状图。
图15为分子量标样(marker)，胎牛血清(FBS)与Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球在pH为4的BR缓冲溶液孵育前后的蛋胎牛血清(FBS)，上层清液(S)，键合蛋白的材料(C)，以及在pH为4的BR缓冲溶液或pH为10的BR缓冲溶液洗脱后的洗脱液(E)，洗脱后的材料(C)的SDS-PAGE分析；其中，孵育过程用I表示，洗脱过程用E表示。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明各实施例的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。
实施例1-3制备的是pH响应型磁性复合纳米球为Fe3O4/CMCS/PAAPBA，其中Fe3O4作为核，以羧甲基壳聚糖(CMCS)作为中间层，以3-丙烯酰胺苯硼酸(AAPBA)的聚合物(PAAPBA)高分子刷接枝到CMCS表面、提供苯硼酸基团。
图1给出了Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球的制备流程图，首先利用溶剂热法制备表面显负电性的Fe3O4纳米粒子；再依据静电效应，在制得的Fe3O4纳米粒子表面包覆一层亲水性氨基聚合物CMCS，得到亲水性氨基聚合物包覆的Fe3O4纳米球(Fe3O4/CMCS纳米球)；然后通过催化剂再生电子转移自由基聚合技术(ARGET-ATRP)将PAAPBA高分子刷嫁接到CMCS表面，即得到磁性复合纳米球(Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球)。
实施例1制备Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球
(1)制备Fe3O4纳米粒子
将原料1.157g六水合氯化铁、1.0g柠檬酸钠和3.303g醋酸铵加入到盛有57mL乙二醇溶剂的聚四氟乙烯不锈钢反应釜中，磁力搅拌1小时使上述原料溶解；然后移除搅拌子，将反应釜温度升至180℃，反应15小时；再将反应釜冷却至室温，用磁铁收集反应得到的反应液中产物；然后依次用乙醇对产物重复洗涤五次(10mL×5)、用去离子水对产物重复洗涤五次(10mL×5)得到Fe3O4纳米粒子；
(2)配制Fe3O4纳米粒子悬浮液和CMCS水溶液
将步骤(1)所得洗涤后的Fe3O4纳米粒子分散到7.5mL去离子水中得到Fe3O4纳米粒子浓度为100mg/mL的悬浮液；将CMCS溶于去离子水中，配制CMCS浓度为20mg/mL的CMCS水溶液；
(3)制备Fe3O4/CMCS纳米球
取步骤(2)所得2.5mL Fe3O4纳米粒子悬浮液与8mLCMCS水溶液加入到反应容器中，在磁力搅拌下于室温反应8小时；然后移除搅拌子，用磁铁收集反应得到的反应液中产物；然后依次用去离子水对产物重复洗涤五次(10mL×5)、用乙醇对产物重复洗涤五次(10mL×5)、用乙腈对产物重复洗涤五次(10mL×5)得到Fe3O4/CMCS纳米球；
(4)制备Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球
①将步骤(3)所得洗涤后的Fe3O4/CMCS纳米球分散到2.2mL乙腈中得到F e3O4/CMCS纳米球浓度为100mg/mL的悬浮液；取1.1mL所得Fe3O4/CMCS纳米球的悬浮液与20mL体积浓度3％三乙胺的乙腈溶液于反应容器混合均匀得到混合液；在磁力搅拌、冰浴0℃条件下，向混合液中滴入0.5mL的2-溴异丁酰溴，滴加完毕后于0℃继续磁力搅拌30min；然后将反应容器移至室温在搅拌条件下反应8h；反应结束后移除搅拌子、用磁铁收集反应得到的反应液中产物；再依次用用氯仿对产物重复洗涤五次(10mL×5)、用乙醇对产物重复洗涤五次(10mL×5)、用乙腈对产物重复洗涤五次(10mL×5)得到Fe3O4/CMCS-Br纳米球；
②将步骤①所得洗涤后的Fe3O4/CMCS-Br纳米球分散到3mL乙腈中得到Fe3O4/CMCS-Br纳米球浓度为33.3mg/mL的悬浮液；将22.4mg溴化铜、10mg抗坏血酸放入反应容器中进行无氧处理，无氧化处理操作为首先将反应容器内真空抽5min，然后再通入氮气至常压，如此反复操作五次；然后在氮气保护、磁力搅拌条件下，依次向反应容器内加入5mL乙腈、14μL联吡啶、0.6mL所得Fe3O4/CMCS-Br纳米球的悬浮液和5mg AAPBA，混合均匀后的混合液在氮气保护、搅拌条件下于室温反应20小时，反应结束后移除搅拌子、用磁铁收集反应得到的反应液中产物；然后依次用乙醇对产物重复洗涤五次(10mL×5)、用去离子水对产物重复洗涤五次(10mL×5)得到Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球。
实施例2制备Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球
(1)制备Fe3O4纳米粒子
将原料1.157g六水合氯化铁、0.4g柠檬酸钠和3.303g醋酸铵加入到盛有60mL乙二醇溶剂的聚四氟乙烯不锈钢反应釜中，磁力搅拌1小时使上述原料溶解；然后移除搅拌子，将反应釜温度升至200℃，反应16小时；再将反应釜冷却至室温，用磁铁收集反应得到的反应液中产物；然后依次用乙醇对产物重复洗涤三次(15mL×3)、用去离子水对产物重复洗涤三次(15mL×3)得到Fe3O4纳米粒子；
(2)配制Fe3O4纳米粒子悬浮液和CMCS水溶液
将步骤(1)所得洗涤后的Fe3O4纳米粒子分散到6mL去离子水中得到Fe3O4纳米粒子浓度为125mg/mL的悬浮液；将CMCS溶于去离子水中，配制CMCS浓度为50mg/mL的CMCS水溶液；
(3)制备Fe3O4/CMCS纳米球
取步骤(2)所得2mL Fe3O4纳米粒子悬浮液与8mL CMCS水溶液加入到反应容器中，在磁力搅拌下于室温反应10小时；然后移除搅拌子，用磁铁收集反应得到的反应液中产物；然后依次用去离子水对产物重复洗涤三次(15mL×3)、用乙醇对产物重复洗涤三次(15mL×3)、用DMF对产物重复洗涤三次(15mL×3)得到Fe3O4/CMCS纳米球；
(4)制备Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球
①将步骤(3)所得洗涤后的Fe3O4/CMCS纳米球分散到2mL DMF中得到F e3O4/CMCS纳米球浓度为110mg/mL的悬浮液；取1mL所得F e3O4/CMCS纳米球的悬浮液与20mL体积浓度5％三乙胺的DMF溶液于反应容器混合均匀得到混合液；在磁力搅拌、冰浴0℃条件下，向混合液中滴入1.0mL的2-溴异丁酰溴，滴加完毕后于0℃继续磁力搅拌40min；然后将反应容器移至室温在搅拌条件下反应10h；反应结束后移除搅拌子、用磁铁收集反应得到的反应液中产物；再依次用DMF对产物重复洗涤三次(15mL×3)、用氯仿对产物重复洗涤三次(15mL×3)、用乙醇对产物重复洗涤三次(15mL×3)、用DMF对产物重复洗涤三次(15mL×3)得到Fe3O4/CMCS-Br纳米球；
②将步骤①所得洗涤后的Fe3O4/CMCS-Br纳米球分散到2mL DMF中得到Fe3O4/CMCS-Br纳米球浓度为50mg/mL的悬浮液；将22.4mg溴化铜、10mg抗坏血酸放入反应容器中进行无氧处理，无氧化处理操作为首先将反应容器内真空抽10min，然后再通入氮气至常压，如此反复操作三次；然后在氮气保护、磁力搅拌条件下，依次向反应容器内加入5mLDMF、27μL三(2-二甲氨基乙基)胺、0.4mL所得Fe3O4/CMCS-Br纳米球的悬浮液和15mg AAPBA，混合均匀后的混合液在氮气保护、搅拌条件下于室温反应24小时，反应结束后移除搅拌子、用磁铁收集反应得到的反应液中产物；然后依次用乙醇对产物重复洗涤三次(15mL×3)、用去离子水对产物重复洗涤三次(15mL×3)得到Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球。
实施例3制备Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球
(1)制备Fe3O4纳米粒子
将原料1.157g六水合氯化铁、0.7g柠檬酸钠和3.303g醋酸铵加入到盛有60mL乙二醇溶剂的聚四氟乙烯不锈钢反应釜中，磁力搅拌1小时使上述原料溶解；然后移除搅拌子，将反应釜温度升至220℃，反应17小时；再将反应釜冷却至室温，用磁铁收集反应得到的反应液中产物；然后依次用乙醇对产物重复洗涤三次(20mL×3)、用去离子水对产物重复洗涤三次(20mL×3)得到Fe3O4纳米粒子；
(2)配制Fe3O4纳米粒子悬浮液和CMCS水溶液
将步骤(1)所得洗涤后的Fe3O4纳米粒子分散到5mL去离子水中得到Fe3O4纳米粒子浓度为150mg/mL的悬浮液；将CMCS溶于去离子水中，配制CMCS浓度为60mg/mL的CMCS水溶液；
(3)制备Fe3O4/CMCS纳米球
取步骤(2)所得1.67mL Fe3O4纳米粒子悬浮液与8mL CMCS水溶液加入到反应容器中，在磁力搅拌下于室温反应12小时；然后移除搅拌子，用磁铁收集反应得到的反应液中产物；然后依次用去离子水对产物重复洗涤三次(20mL×3)、用乙醇对产物重复洗涤三次(20mL×3)、用二甲基亚砜对产物重复洗涤三次(20mL×3)得到Fe3O4/CMCS纳米球；
(4)制备Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球
①将步骤(3)所得洗涤后的Fe3O4/CMCS纳米球分散到1.83mL二甲基亚砜中得到Fe3O4/CMCS纳米球浓度为120mg/mL的悬浮液；取0.92mL所得Fe3O4/CMCS纳米粒子的悬浮液与20mL体积浓度10％三乙胺的二甲基亚砜溶液于反应容器混合均匀得到混合液；在磁力搅拌、干冰浴-20℃条件下，向混合液中滴入3mL的2-溴异丁酰溴，滴加完毕后于-20℃继续磁力搅拌1h；然后将反应容器移至室温在搅拌条件下反应10h；反应结束后移除搅拌子、用磁铁收集反应得到的反应液中产物；再依次用二甲基亚砜对产物重复洗涤三次(20mL×3)、用乙醇对产物重复洗涤三次(20mL×3)、用二甲基亚砜对产物重复洗涤三次(20mL×3)得到Fe3O4/CMCS-Br纳米球；
②将步骤①所得洗涤后的Fe3O4/CMCS-Br纳米球分散到1.5mL二甲基亚砜中得到Fe3O4/CMCS-Br纳米球浓度为66.7mg/mL的悬浮液；将17.0mg氯化铜、10mg抗坏血酸放入反应容器中进行无氧处理，无氧化处理操作为首先将反应容器内真空抽10min，然后再通入氮气至常压，如此反复操作三次；然后在氮气保护、磁力搅拌条件下，依次向反应容器内加入5mL二甲基亚砜、21μLN,N,N’,N”,N”-五甲基二亚乙基三胺、0.3mL所得Fe3O4/CMCS-Br纳米球的悬浮液和80mg AAPBA，混合均匀后的混合液在搅拌条件下于室温反应26小时，反应结束后移除搅拌子、用磁铁收集反应得到的反应液中产物；然后依次用乙醇对产物重复洗涤三次(20mL×3)、用去离子水对产物重复洗涤三次(20mL×3)得到Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球。
实施例4制备磁性复合纳米球(Fe3O4/PEI/P(2-VPBA)纳米球)
本实施例采用的制备方法与实施例2给出的相同，与实施例2不同的是，本实施例配制的亲水性氨基聚合物水溶液为浓度50mg/mL的聚醚酰亚胺(PEI)水溶液，在制备亲水性氨基聚合物包覆的Fe3O4纳米球(Fe3O4/PEI)过程中，采用8ml所得聚醚酰亚胺(PEI)水溶液；在制备pH响应型磁性复合纳米球(Fe3O4/PEI/P(2-VPBA)纳米球)过程中苯硼酸衍生物采用2-乙烯基苯硼酸(2-VPBA)，用量为20mg。
实施例5制备Fe3O4/PEI/P(3-VPBA)纳米球
本实施例采用的制备方法与实施例2给出的相同，与实施例2不同的是，本实施例配制的亲水性氨基聚合物水溶液为浓度50mg/mL的聚醚酰亚胺(PEI)水溶液，在制备亲水性氨基聚合物包覆的Fe3O4纳米球(Fe3O4/PEI)过程中，采用8ml所得聚醚酰亚胺(PEI)水溶液；在制备pH响应型磁性复合纳米球(Fe3O4/PEI/P(3-VPBA)纳米球)过程中苯硼酸衍生物采用3-乙烯基苯硼酸(3-VPBA)，用量为10mg。
实验例1结构表征
为了探究CMCS层以及PAAPBA高分子刷已经成功复合到Fe3O4纳米粒子上，本实验例对实施例2给出的Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球制备过程中得到的Fe3O4纳米粒子、Fe3O4/CMCS纳米球、Fe3O4/CMCS-Br纳米球和Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球的形貌尺寸和微观结构进行了表征如图3至图7所示。
(1)形貌与尺寸分布
从图3(A)-(F)可以看出，Fe3O4纳米粒子、Fe3O4/CMCS纳米球、Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球均为球形，大小均一，且平均粒径约为300nm～500nm；从图3(D)-(F)可以看出，Fe3O4纳米粒子包覆CMCS壳层和接枝PAAPBA高分子刷后，在Fe3O4纳米粒子和Fe3O4/CMCS纳米球周围具有明显的高分子晕，说明CMCS层及PAAPBA高分子刷已成功分别复合到Fe3O4纳米粒子和Fe3O4/CMCS纳米球上；通过动态光散射检测得到Fe3O4纳米粒子、Fe3O4/CMCS纳米球、Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球的平均粒径峰值分别为293±26nm,321±13nm，384±3nm(图3G-I)，此结果与扫描电镜和透射电镜结果一致。
如图4所示，Fe3O4纳米粒子、Fe3O4/CMCS纳米球、Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球在去离子水中的zeta电位分别为-15mV、+14mV和-18mV；这种电荷翻转进一步证明了CMCS层及PAAPBA高分子刷已成功分别复合到Fe3O4纳米粒子和Fe3O4/CMCS纳米球上。
(2)微结构研究
本实验例采用PE spectrometer型傅里叶转换红外光谱仪(FTIR)分别检测CMCS、Fe3O4纳米粒子、Fe3O4/CMCS纳米球、Fe3O4/CMCS-Br纳米球、Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球在500-4000cm-1波数范围内的红外吸收光谱，检测步长为4cm-1，检测结果如图5(A)所示，Fe3O4/CMCS纳米球的吸收峰含有Fe-O(580cm-1)和CMCS(CH、CO、CN、NH、OH)的特征吸收峰，说明CMCS和Fe3O4已经成功复合。如图5(B)所示，1389cm-1和1372cm-1吸收峰是-溴代异丁酸残基的两个甲基的变形振动特征峰，且通过能量弥散X射线(EDX)检测得出(见图6)，C、O、Fe、Br元素的含量分别为27.26％、50.44％、21.12％、1.18％，说明溴引发剂已经成功接到Fe3O4/CMCS纳米球表面。如图5(B)中(e)所示，1389cm-1和1372cm-1吸收峰消失，且出现了两个B-O键的吸收峰(1407cm-1和1262cm-1)，证明PAAPBA高分子刷已成功在Fe3O4/CMCS-Br纳米球表面形成。
本实验例采用Kratos XSAM 800型X射线光电子能谱仪(XPS)分别检测Fe3O4纳米粒子、Fe3O4/CMCS纳米球和Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球的X射线光电子能谱，如图7(C)所示，Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球的X射线光电子能谱图中在191.5eV出现了B 1s的特征峰；如图7(D)所示，Fe 2p3/2和Fe 2p1/2的710.6eV及723.5eV的键能峰随着化学环境的改变，键能逐渐增加，说明CMCS层及PAAPBA高分子刷已成功合成。
实验例2磁性能研究
为了探究Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球的磁性能，本实验例采用STA 449C Jupiter型热重分析(TGA)仪对实施例2给出的Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球制备过程中使用的CMCS以及得到的Fe3O4纳米粒子、Fe3O4/CMCS纳米球和Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球在氮气保护下从35℃升温到850℃的重量损失，结果如图8所示；通过热重分析数据计算得出Fe3O4纳米粒子、Fe3O4/CMCS纳米球和Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球的质量百分含量(磁含量)分别约为83％，81％，79％，说明Fe3O4纳米粒子、Fe3O4/CMCS纳米球和Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球均具有较好的磁性能，有助于提高后续蛋白分离速率。
进一步的，本实验例采用Model BHV-525型振动样品磁强计(VSM)分别检测了Fe3O4纳米粒子、Fe3O4/CMCS纳米球和Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球在-18000到18000Oe范围内的磁滞回线(见图9(A))和所得磁滞回线在磁场-100～100Oe之间的放大图(见图9(B))，所有样品的磁滞回线均经过原点，无剩磁和矫顽力，说明Fe3O4纳米粒子、Fe3O4/CMCS纳米球和Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球都具有超顺磁性，且所制备的Fe3O4纳米粒子、Fe3O4/CMCS纳米球和Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球磁饱和强度分别为63emu/g，61emu/g，59emu/g，因此Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球具有较好的磁响应性，10s内即可完成磁分离。
应用例1至应用例3所使用的Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球按照以下方法处理备用：将实施例2得到的Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球分散到1.0mL去离子水中得到Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球浓度为18mg/mL的悬浮液，备用。
应用例1糖蛋白分离研究-单蛋白体系
转铁蛋白(transferrin，TRF)是血浆中主要的含铁蛋白质，负责运载由消化管吸收的铁和由红细胞降解释放的铁，为单链糖蛋白，含糖量约6％。在血液中不正常的转铁蛋白含量与许多疾病相关，如，心脏衰竭，缺铁性贫血，营养不良，转铁蛋白缺乏症等。所以，本应用例以转铁蛋白为模型蛋白研究材料对糖蛋白的分离进行研究。
将转铁蛋白(TRF)溶于pH＝4的Britton-Robinson(BR)缓冲溶液中，制得浓度为600μg/mL的TRF溶液；取所得30μL Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球的悬浮液和25μL TRF溶液，将两者于反应容器中混合并在震荡条件下于室温孵育60min，然后用磁铁进行分离，分别收集上层清液及沉淀，再将沉淀用pH＝4的BR缓冲溶液洗涤三次(每次100μL)，即得到键合了TRF的Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球。
将得到的键合了TRF的Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球分散到20μLpH＝4的BR缓冲溶液中得到沉淀悬浮液，分别取12μL孵育前的TRF溶液、上层清液和沉淀悬浮液进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析，结果如图10所示。
将上述键合了TRF的Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球分别分散到40μL pH＝4和pH＝10的BR缓冲溶液中在震荡条件下于室温洗脱60min，然后用磁铁进行分离，分别收集洗脱液和洗脱后得到的材料，并对洗脱液和洗脱后得到的材料进行SDS-PAGE分析，结果如图10所示。
从图10可以看出，上层清液中并无TRF残余，且键合了TRF的Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球展示了明显的TRF条带，说明溶液中所有的TRF都已吸附到材料表面；由此，可以估算，其吸附量高达27mg/g，吸附率高达100％。用pH＝4的BR缓冲溶液洗脱TRF，被吸附到材料表面的蛋白质并不能被洗脱下来，说明TRF和Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球的结合作用是比较强的特异性结合作用。然而，当pH调至10时，蛋白质很容易地从Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球表面洗脱下来，说明Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球能够pH响应性地可逆得捕获和释放糖蛋白。
为了证明Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球可以多次重复利用，该应用例对依据上述捕获和释放TRF条件进行重复试验，重复循环五次的结果如图11所示，可以看出经过五次循环后，TRF与Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球分离效率仍高达94％，说明该Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球在糖蛋白分离中具有较大的应用潜力。
蛋白质的结构和活性息息相关。该应用例通过荧光测试表征在TRF吸附和TRF解吸附过程中TRF的二级结构，如图12所示，可以看出在pH＝4和pH＝10的BR缓冲溶液中，检测激发波长为280nm时，未作任何处理的TRF样品(TRF-pH4或TRF-pH10)、被Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球吸附的TRF样品(材料+TRF-pH4)以及洗脱后的TRF样品(材料+TRF-pH10)的荧光发射波长都约为330nm，没有明显移动，说明吸附过程和脱附过程对TRF的构象没有明显影响。然而，TRF和Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球共孵育之后得到的TRF样品(材料+TRF-pH4)，发射强度会下降，这是因为蛋白质与Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球发生了相互作用，也说明Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球已成功捕获TRF。
上述pH＝4的BR缓冲溶液可以采用pH＝5的磷酸盐缓冲溶液替代；上述pH＝10的BR缓冲溶液可以采用pH＝9.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液替代。经测试，缓冲液的的替换不会使Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球对糖蛋白的捕获和释放性能产生影响。
上述蛋白捕获和释放过程也同样适用于辣根过氧化物酶(HRP)、甲胎蛋白(AFP)等其它糖蛋白的捕获与释放。
应用例2糖蛋白分离研究-模拟混合蛋白体系
利用Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球在pH＝4的BR缓冲溶液中捕获混合蛋白体系中的TRF和在pH＝10的BR缓冲溶液中释放TRF的过程参见图2操作过程为：分别将转铁蛋白(TRF)、溶菌酶(LYZ)和糜蛋白酶(CTP)分别溶于pH＝4的BR缓冲溶液中，制得三种浓度为500μg/mL的相应蛋白溶液，并把每种蛋白溶液等体积混匀得到蛋白混合液(TRF+LYZ+CTP)；取所得30μL Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球的悬浮液和30μL蛋白混合液，将两者于反应容器中混合并在震荡条件下于室温孵育60min，然后用磁铁进行分离，分别收集上层清液及沉淀，再将沉淀用pH＝4的BR缓冲溶液洗涤三次(每次100μL)，得到沉淀材料。
将沉淀材料分散到20μLpH＝4的BR缓冲溶液中得到沉淀悬浮液，分别取12μL孵育前的蛋白混合液、上层清液和沉淀悬浮液进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析，结果如图13所示。
将上述沉淀材料分别分散到40μL pH＝4和pH＝10的BR缓冲溶液中在震荡条件下于室温洗脱60min，然后用磁铁进行分离，分别收集洗脱液和洗脱后得到的沉淀材料，并对洗脱液和洗脱后得到的沉淀材料进行SDS-PAGE分析，结果如图13所示。
如图13所示，上层清液中只有LYZ和CTP残余，且键合了蛋白的材料只展示了TRF条带，说明溶液中的TRF已被选择性吸附到Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球表面。用pH＝4的孵育液洗脱蛋白质，被吸附到材料表面的糖蛋白TRF并不能被洗脱下来，说明TRF和Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球的结合作用是比较强的特异性结合作用。然而，当pH调至10时，蛋白质很容易地从材料表面洗脱下来，说明Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球材料能够pH响应性地可逆得捕获和释放TRF。
为了证明Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球可以多次重复利用，该应用例对依据上述混合蛋白体系中TRF捕获和释放条件进行重复试验，重复循环五次的结果如图14所示，可以看出经过五次循环后，TRF与Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球分离效率仍有75％，说明该Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球在糖蛋白分离中具有较大的应用潜力。
应用例3分离胎牛血清(FBS)中的糖蛋白
用pH＝4的BR缓冲溶液稀释胎牛血清(FBS)得到体积分数为10％的FBS溶液；然后将30μL所得FBS溶液与30μL的Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球的悬浮液在震荡条件下于室温孵育120min，然后用磁铁进行分离，分别收集上层清液及沉淀，再将沉淀用pH＝4的BR缓冲溶液洗涤三次(每次200μL)，得到沉淀材料。
将沉淀材料分散到20μL pH＝4的BR缓冲溶液中得到沉淀悬浮液，分别取12μL孵育前的蛋白混合液、上层清液和沉淀悬浮液进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析，结果如图15所示，从图中可以看出，上清液中显示的蛋白质均为非特异性蛋白，通过Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球的选择性捕获已经使胎牛血清中非特异性吸附被大大降低。此外，用20μL pH＝4的BR缓冲溶液对键合了蛋白的材料进行洗脱时，被吸附在材料表面的蛋白质并不能被洗脱下来；相反，当用20μL pH＝10的BR缓冲溶液对键合了蛋白的材料进行洗脱时，蛋白质很容易从材料表面洗脱下来，说明Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球具有较好的pH响应性能。
为了研究Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球对糖蛋白的捕获能力，进一步对孵育前的FBS溶液以及键合了蛋白的材料(C)的SDS-PAGE条带进行质谱分析，可半定量得出在复杂蛋白体系中材料吸附的蛋白质情况，分析结果见表1。
表1在10％胎牛血清和键合到材料上的蛋白质中，通过质谱检测到的糖蛋白清单
从表1中可以看出，对孵育前的FBS溶液进行质谱分析，可明显检测到7种糖蛋白；而经Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球材料处理后，检测到的糖蛋白增加了7种，特别是作为一种潜在的肿瘤标志物的甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)也被大量富集，而在10％FBS中因其较低的含量而没有被检测出来。由此，证明了Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球材料对糖蛋白显著地富集性能。另外，尽管材料也吸附了一些其他蛋白质，但由质谱的半定量数据分析可知，被Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球材料吸附的糖蛋白总量约为13.9％，和吸附量最高的牛血清白蛋白约为15.5％，两者相差不大；而由质谱的半定量数据分析得到，在孵育前的FBS溶液中，牛血清白蛋白占37.3％，而糖蛋白的总量不足于其1/2(16.6％)，由此也同样说明胎牛血清中非特异性吸附已被大大降低，Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球的特异性选择是可以接受的。
总之，所制备的Fe3O4/CMCS/PAAPBA纳米球在生物样本中可以pH响应地对糖蛋白的选择性捕获，富集和释放，展示了其在诊断和蛋白组学中的应用潜力。
本领域的普通技术人员将会意识到，这里的实施例是为了帮助读者理解本发明的原理，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.pH响应型磁性复合纳米球，其特征在于由Fe3O4纳米粒子，包覆在Fe3O4纳米粒子表面的亲水性氨基聚合物以及接枝于亲水性氨基聚合物表面的含双键的苯硼酸衍生物形成的聚合物高分子刷构成；
所述pH响应型磁性复合纳米球的制备方法步骤如下：
(1)配制Fe3O4纳米粒子悬浮液和亲水性氨基聚合物水溶液
将Fe3O4纳米粒子分散到去离子水中，配制Fe3O4纳米粒子浓度为100～150mg/mL的Fe3O4纳米粒子悬浮液；将亲水性氨基聚合物溶于去离子水中，配制亲水性氨基聚合物浓度为20～60mg/mL的亲水性氨基聚合物水溶液；所述Fe3O4纳米粒子制备方法为：将原料氯化铁、柠檬酸钠和醋酸铵按摩尔比1：(0.33～0.79)：10加入到盛有氯化铁质量(33～36)倍的乙二醇溶剂的反应容器中，在搅拌下使原料溶解并混合均匀，然后在180～220℃反应至少15小时，反应结束后将反应液温度降至室温，用磁铁收集反应液中的Fe3O4纳米粒子，然后依次用乙醇、去离子水对Fe3O4纳米粒子进行洗涤除去未反应的原料；
(2)制备亲水性氨基聚合物包覆的Fe3O4纳米球
将步骤(1)配制的Fe3O4纳米粒子悬浮液和亲水性氨基聚合物水溶液按照Fe3O4纳米粒子与亲水性氨基聚合物的质量比为25:(16～48)计量并加入到反应容器中，在搅拌下于室温反应至少8小时得含第一产物的第一反应液，所述第一产物为亲水性氨基聚合物包覆的Fe3O4纳米球；用磁铁收集第一反应液中的第一产物，再依次用去离子水、乙醇和溶剂A对第一产物进行洗涤除去游离的亲水性氨基聚合物；
(3)制备pH响应型磁性复合纳米球
①将步骤(2)所得洗涤后的第一产物分散到溶剂A中，得到第一产物浓度为100～120mg/mL的第一产物悬浮液，将三乙胺溶于溶剂A得到碱性有机溶剂；将第一产物悬浮液和碱性有机溶剂按第一产物与三乙胺的质量比为1:(4～13.3)计量并加入反应容器中混合均匀得到碱性混合液，然后在搅拌下将碱性混合液的温度降至-20～0℃，再向碱性混合液中滴入引发剂2-溴异丁酰溴，2-溴异丁酰溴的滴入量为碱性混合液中所含第一产物质量的8.55～50.7倍，2-溴异丁酰溴滴加完后在搅拌下使2-溴异丁酰溴分散均匀，然后将含2-溴异丁酰溴的碱性混合液的温度升至室温进行至少8小时的接枝反应，得含第二产物的第二反应液，所述第二产物为接枝有2-溴异丁酰溴的亲水性氨基聚合物包覆的Fe3O4纳米球；用磁铁收集第二反应液中的第二产物，再用N,N-二甲基甲酰胺、乙腈、二甲基亚砜、氯仿、二氯甲烷、乙醇中的至少一种溶剂对第二产物进行洗涤除去未接枝的2-溴异丁酰溴；
②将步骤①所得洗涤后的第二产物分散到溶剂A中，得到第二产物浓度为35～65mg/mL第二产物悬浮液，将催化剂和还原剂放入反应容器中进行无氧处理，然后在氮气保护、搅拌条件下向反应容器中加入溶剂A、螯合剂、第二产物悬浮液和含双键的苯硼酸衍生物并混合均匀得混合液，将所得混合液在氮气或氩气保护、搅拌下于室温进行至少20小时的引发聚合反应，得含第三产物的第三反应液，所述第三产物为pH响应型磁性复合纳米球；用磁铁收集第三反应液中的第三产物，然后依次用乙醇和去离子水对第三产物进行洗涤除去溶剂A、催化剂、还原剂、螯合剂以及未反应的含双键的苯硼酸衍生物；所述第二产物悬浮液中的第二产物、含双键的苯硼酸衍生物、催化剂、还原剂和螯合剂的质量比为2:(0.5～8):(2.0～2.2):1:(1.5～2.3)；
上述各步骤中的溶剂A为N,N-二甲基甲酰胺、乙腈或者二甲基亚砜；所述亲水性氨基聚合物为羧甲基壳聚糖或者聚醚酰亚胺；所述含有双键的苯硼酸衍生物为2-乙烯基苯硼酸、3-乙烯基苯硼酸或3-丙烯酰胺苯硼酸。
2.根据权利要求1所述pH响应型磁性复合纳米球，其特征在于所述磁性复合纳米球平均粒径为300nm～500nm。
3.根据权利要求1所述pH响应型磁性复合纳米球，其特征在于所述催化剂为溴化铜或氯化铜，还原剂为抗坏血酸，螯合剂为联吡啶、三(2-二甲氨基乙基)胺或N,N,N’,N”,N”-五甲基二亚乙基三胺。
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