CN112924695B - 基于dna四面体的复合磁性纳米材料、制备及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及功能化磁性纳米材料技术领域，提供了一种基于DNA四面体的复合磁性纳米材料、制备及应用，所述制备方法包括：通过DNA单链的自组装反应合成DNA四面体，在二硫化钼颗粒表面负载磁性纳米颗粒，在二硫化钼颗粒裸露的活性硫原子上修饰金纳米颗粒，在金纳米颗粒上修饰DNA四面体，在DNA四面体上孵育连接蛋白质抗体。利用本发明的方法所制备的材料用于血清中低丰度蛋白富集和检测，可通过抗原‑抗体之间的特异性反应高效、高选择性的富集血清中的特定的低丰度蛋白，且该材料以磁性纳米材料为基质，因而具有使用简便快速的特点，大大缩短血清复杂基质的处理时间，能够实现对复杂基质中低丰度蛋白的高效、高选择性富集。

Description

基于DNA四面体的复合磁性纳米材料、制备及应用
技术领域
本发明涉及功能化磁性纳米材料技术领域，特别涉及一种基于DNA四面体的复合磁性纳米材料、制备及应用。
背景技术
恶性肿瘤已成为严重影响人类健康的高发病率和高死亡率疾病，在我国，恶性肿瘤发病率每年保持约3.9％的增幅，死亡率每年保持2.5％的增幅。相关数据显示，1/3的癌症可通过早期发现得到根治，然而我国很多癌症患者一经发现已处于中晚期，治疗难度较大。因此发展用于早期癌症诊断的肿瘤标志物对于癌症的诊断、治疗具有重要意义。
血清中的恶性肿瘤标志物通常属于低丰度蛋白(例如，肝癌标志物HSP90α在血液中的含量通常只有60ng/mL左右)，然而血清中蛋白质种类复杂多样，高丰度蛋白的存在会严重干扰低丰度蛋白的检测。利用抗体对血清中低丰度蛋白进行富集，是提高低丰度蛋白检测灵敏度的常用方法。固相萃取技术能够有效地从复杂基质中提取出目标物，因此在低丰度蛋白质检测上具有重大发展潜力。
DNA四面体(DNA TET)是一类具有丰富的修饰位点和良好生物兼容性的纳米材料，并且其正逐渐成为DNA纳米材料的研究热点。DNA TET材料只需进行一步热变性反应即可完成自组装，合成方法简单且产率高。利用DNA TET中丰富的修饰位点，可通过配体设计等化学手段，通过自组装策略将功能分子键合在DNA四面体材料的顶点、包裹在其笼状孔隙结构内、镶嵌或悬挂在双螺旋的边上、甚至可以通过引入发卡环结构等方式智能控制其结构变化。DNA四面体纳米材料可有效控制修饰基团或分子的朝向和间距，能够实现低丰度目标物的特异性捕集，尤其适用于复杂基质中低丰度物质的特异性相互作用。
发明内容
本发明的目的就在于克服现有技术的不足，提供了一种基于DNA四面体的复合磁性纳米材料、制备及应用，所述复合磁性纳米材料可通过抗原-抗体之间的特异性反应高效、高选择性的富集血清中的特定的低丰度蛋白，且该材料以磁性纳米材料为基质，因而具有使用简便快速的特点，大大缩短血清复杂基质的处理时间。
本发明采用如下技术方案：
一种基于DNA四面体的复合磁性纳米材料，所述复合磁性纳米材料包括二硫化钼颗粒、包覆在所述二硫化钼颗粒表面的磁性纳米颗粒、通过Au-S键的反应在所述二硫化钼颗粒上裸露的活性硫原子上修饰的金纳米颗粒、稳定固载在所述金纳米颗粒上的含有巯基的DNA四面体、与所述DNA四面体通过其顶点上的功能基团反应连接的蛋白质抗体。
进一步的，所述磁性纳米颗粒为四氧化三铁磁性纳米颗粒，粒径为20～800nm，例如40nm。所述金纳米颗粒的粒径无特殊要求。
进一步的，所述二硫化钼颗粒呈球状结构，粒径为5～50um，优选为5～10um。
进一步的，所述二硫化钼颗粒内部呈片层结构，片层的厚度为0.1～2nm，优选为0.2～1nm。
进一步的，所述DNA四面体的4条DNA单链通过自组装的方式合成，每一个DNA单链包含16～160个脱氧核糖核苷酸单体。
进一步的，所述DNA四面体由四条浓度均为1umol/L的DNA单链通过碱基互补配对形成。
进一步的，所述DNA单链的3’端或5’端具有功能基团，所述功能基团可以为巯基、羧基、醛基、环氧基或氨基；其中巯基用于DNA四面体与磁性纳米材料中的反应，羧基、醛基、环氧基或氨基用于DNA四面体与抗体之间的键合。
进一步的，所述蛋白质抗体可以为血清中低丰度蛋白的单抗或多抗。
一种基于DNA四面体的复合磁性纳米材料的制备方法，包括如下步骤：
S1、在二硫化钼颗粒表面负载四氧化三铁磁性纳米颗粒，得到产物I:MoS2@Fe3O4；
S2、利用“Au-S”键的相互作用，在所述产物I上裸露的活性硫原子上修饰金纳米颗粒，得到产物II:MoS2@Fe3O4@AuNPs；
S3、利用“Au-S”键的相互作用，在所述产物II中的金纳米颗粒上修饰三个顶点含有巯基的DNA四面体，得到产物III:MoS2@Fe3O4@AuNPs@DNA TET；
S4、活化所述产物III中的DNA四面体上修饰的羧基，将活化后的产物III与蛋白质抗体溶液孵育反应，使蛋白质抗体连接到所述复合磁性纳米材料。
进一步的，步骤S1中，所述二硫化钼可按照如下常规方法制备得到：将Na2MoO4·2H2O，(NH2)2CS和PEG-20,000溶解在去离子水中，加入到不锈钢反应釜中通过高温反应制得。
进一步的，磁性纳米颗粒可为Fe3O4磁性纳米颗粒，所述Fe3O4磁性纳米颗粒可按照常规方法制备得到，如在六水合三氯化铁的乙二醇溶液中加入无水乙酸钠，得混合液；对所述混合液进行加热，冷却后干燥即可得到所述Fe3O4磁性纳米颗粒。所述加热的温度可为220℃，时间可为8～12小时，具体可为8小时。
进一步的，步骤S1中，通过如下步骤在所述二硫化钼的表面负载上磁性纳米颗粒：将MoS2纳米材料，FeCl3.6H2O和柠檬酸三钠置于离心管中，向其中加入乙二醇。超声分散后加入乙酸钠，边搅拌边逐滴加入氨水，将反应后的混合溶液转移至不锈钢反应釜中通过高温反应，即可的产物I。
进一步的，步骤S2中，可采用如下方法在所述产物I的表面修饰金纳米颗粒：向MoS2@Fe3O4复合材料中加入去离子水，加入HAuCl4溶液和柠檬酸钠溶液。伴随着剧烈的搅拌，向其中快速加入新配的NaBH4溶液。继续机械搅拌30min后，把混合溶液静置于黑暗环境中16h。即可得产物II。
进一步的，步骤S3中，所述DNA四面体由4条浓度为1umol/L DNA单链通过碱基互补配对自组装制得；加入DTT活化所述DNA四面体的巯基；向步骤S2中制得的产物II中加入活化后的DNA四面体，反应后得到产物III。
进一步的，加入DTT的量，其摩尔浓度与DNA的摩尔浓度比值可为(10～100):1，具体可优先为50:1。所述反应的时间可为16h。
进一步的，步骤S4中，在活化后的产物III与蛋白质抗体溶液中加入一定比例的EDC和NHS活化DNA四面体上修饰的羧基；EDC和NHS的比例为1：(1～5)。具体可优选为1:2。孵育反应温度可为37℃，时间可为1h。其中，EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，NHS为N-羟基丁二酰亚胺。
一种基于DNA四面体的复合磁性纳米材料的应用，所述复合磁性纳米材料用于蛋白质特异性富集检测。
进一步的，所述的富集检测步骤为：将合成的所述复合磁性纳米材料与含有目标蛋白的样品混合孵育一段时间后，磁分离并移除上清液，将富集到目标蛋白的所述复合磁性纳米材料进行酶切处理后，进行质谱检测。
本发明的有益效果为：通过简单的两步“Au-S”键的反应，将具有良好生物相容性和易于稳定固定在纳米材料表面的DNA四面体负载在纳米材料表面，材料合成方法清洁、快速；通过复合磁性纳米材料上负载的蛋白质抗体能够实现对复杂基质中低丰度蛋白的高效、高选择性富集。
附图说明
图1所示为基于DNA四面体修饰的磁性纳米材料的合成路线示意图。
图2所示为实施例1中合成过程中产物MoS2和MoS2@Fe3O4的扫描电镜照片和透射电镜照片，其中：A为MoS2的扫描电镜图，B为MoS2@Fe3O4的扫描电镜图，C为MoS2的透射电镜图，D为MoS2@Fe3O4的透射电镜图。
图3所示为实施例1中的合成DNA四面体的四条单链DNA序列。
图4所示为实施例1中合成过程中产物MoS2@Fe3O4@AuNPs磁性表征图。
图5所示为实施例1中合成过程中产物MoS2@Fe3O4@AuNPs和MoS2@Fe3O4@AuNPs@DNATET的紫外吸收光谱图。
图6所示为考察材料灵敏性的MALDI-TOF MS质谱图，其中HSP90α溶液浓度为10ng/mL。
具体实施方式
下文将结合具体附图详细描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明实施例一种基于DNA四面体的复合磁性纳米材料，包括二硫化钼颗粒、包覆在所述二硫化钼颗粒表面的磁性纳米颗粒、通过Au-S健的反应在所述二硫化钼颗粒上裸露的活性硫原子上修饰的金纳米颗粒、稳定固载在所述金纳米颗粒上的3个顶点含有巯基的DNA四面体、与所述DNA四面体通过剩余1个顶点上的羧基反应连接的蛋白质抗体。
如图1所示，本发明实施例一种基于DNA四面体的复合磁性纳米材料的制备方法，包括如下步骤：
S1、在二硫化钼颗粒表面负载四氧化三铁磁性纳米颗粒，得到产物I:MoS2@Fe3O4；
S2、利用“Au-S”键的相互作用，在所述产物I上的裸露的活性硫原子上修饰金纳米颗粒，得到产物II:MoS2@Fe3O4@AuNPs；
S3、利用“Au-S”键的相互作用，在所述产物II中的金纳米颗粒上修饰三个顶点含有巯基的DNA四面体，得到产物III:MoS2@Fe3O4@AuNPs@DNA TET；
S4、活化所述产物III中的DNA四面体上修饰的羧基，将活化后的产物III与蛋白质抗体溶液孵育反应，使蛋白质抗体连接到所述复合磁性纳米材料。
下述实施例中的所用的二硫化钼(MoS2)通过如下步骤制备得到：将1.210gNa2MoO4·2H2O，1.520g(NH2)2CS和0.030g PEG-20,000溶解在30mL去离子水中。搅拌30min，超声处理30min直至获得均一透明的溶液。将其转移至50mL不锈钢反应釜中，在鼓风干燥箱中加热至220℃后反应24h。反应完毕冷却至室温后，1500r/min离心15min分离出沉淀。依次使用30mL去离子水洗涤2次，30mL无水乙醇洗涤2次，30mL去离子水洗涤3次后离心取沉淀于60℃真空干燥箱中干燥6小时后保存备用。如图2所示，二硫化钼呈球状结构，表面光滑，粒径为7.5～8um，内部呈片层结构，片层的厚度为0.02um。
下述实施例中所用的产物I：MoS2@Fe3O4通过如下步骤制备得到：称取30mg MoS2，100mg FeCl3.6H2O和30mg柠檬酸三钠置于50mL离心管中，向其中加入30mL乙二醇。超声分散2h后，向其中加入700mg乙酸钠，机械搅拌30min后使之充分溶解。继续边搅拌边逐滴加入300ul氨水，然后继续机械搅拌10min。将反应后的混合溶液转移至50mL不锈钢反应釜中，在鼓风干燥箱中加热至220℃后反应9h。反应完毕冷却至室温后，使用磁铁分离得到的产物即为MoS2@Fe3O4。依次用无水乙醇、去离子水各洗涤沉淀两次，每次洗涤后均用磁铁进行分离。充分洗涤后的沉淀于60℃真空干燥箱中干燥10小时。如图2所示，在固定磁性纳米颗粒后，可以观察到表面有大量直径约为0.08um左右的微球分布在超薄二维二硫化钼纳米材料表面。
下述实施例中所用的产物II：MoS2@Fe3O4@AuNPs通过如下步骤制备得到：配制0.01mol/L的HAuCl4溶液和0.01mol/L的柠檬酸钠溶液。称取19mg NaBH4，向其中加入5mL去离子水(冰水)，配制成0.1mol/L的NaBH4溶液(现配现用)。称取65mg MoS2@Fe3O4复合材料于圆底烧瓶中，向其中加入40mL去离子水，进行机械搅拌使材料均匀悬浮在去离子水中。边搅拌边向其中加入2mL的0.01mol/L的HAuCl4溶液和2mL的0.01mol/L的柠檬酸钠溶液。加入上述溶液继续搅拌10min后，伴随着剧烈的搅拌，向其中快速加入2mL新配的0.1mol/L的NaBH4溶液。继续机械搅拌30min后，把混合溶液静置于黑暗环境中16h。将静置后的样品使用磁铁分离得到的产物即为MoS2@Fe3O4@AuNPs。依次用无水乙醇、去离子水各洗涤沉淀两次，每次洗涤后均用磁铁进行分离。
下述实施例中所用的DNA四面体通过如下步骤制备得到：设计如图3所示的4条DNA单链，每条单链DNA配制成浓度为100umol/L。每条单链取1uL加入到96uL TE缓冲液中，配制成每条单链的终浓度为1umol/L。95℃保持10min后，在4℃保持30min，即可自组装形成DNA四面体。应当指出，图3中P4所示意的DNA序列5'端的羧基为本实施例中所优选的功能基团，该功能基团可根据实际需要替换为环氧基、醛基或者氨基等。在本实施例所设计的DNA单链的基础上所进行的适当修饰也应当属于本专利申请的权利保护范围。
下述实施例中所用的产物III：MoS2@Fe3O4@AuNPs@DNA TET四面体通过如下步骤制备得到：称取MoS2@Fe3O4@AuNPs复合材料18mg，向其中加入100ul上述配制成的DNA四面体、200ul TE缓冲液和10ul 50mmol/L NaCl溶液后进行反应，每隔1h向其中递增加入5ul的50mmol/L NaCl溶液，一共加入4次。在4℃环境中反应12h后，将样品储存于4℃冰箱中备用。如图5所示，在230～280nm波长范围内，MoS2@Fe3O4@AuNPs没有明显的吸收峰，MoS2@Fe3O4@AuNPs@DNA TET复合材料相较于MoS2@Fe3O4@AuNPs材料，在259nm处表现出较强吸收峰，与DNA紫外吸收值260nm一致，表明DNA四面体已成功负载到复合材料MoS2@Fe3O4@AuNPs上。
下述实施例中所用的MoS2@Fe3O4@AuNPs@DNA TET@Ab通过如下步骤制备得到：配制0.1mol/L MES buffer溶液(pH＝6)用以溶解EDC和NHS，吸取材料1mg，向材料中加入物质的量比为2:1的EDC和NHS溶液，活化材料30min后，吸净上清液并用TE缓冲液洗涤材料3次。吸取抗体溶液100ul加入到材料中，再加入300ul TE缓冲液。将材料置于4℃冰箱中孵育12h。如图4所示，所得产物的磁滞回曲线表明材料具有良好的顺磁能力，可以利用磁铁实现快速分离。应当指出，本步骤中所列举的羧基活化方案是本实施例所优选的方案，在实践中，DNA单链中的P4链的5'端若采用其他功能基团，本实验步骤也应当做出相应的调整。例如，当羧基被替换为环氧基或者醛基时，不需要进行采用EDC和NHS进行活化的反应步骤。
以HSP90α蛋白为例，考察磁性复合纳米材料在实际样品中富集复杂基质中低丰度蛋白的性能。将所合成的材料应用于癌症病人血浆中HSP90α的富集。吸取100ul癌症病人血浆加入到900ul PBS缓冲液中。将1ml溶液加入到1mg磁性复合材料中进行特异性富集反应。吸净反应后的上清液，将材料用洗涤液洗涤后进行酶解反应，吸取反应后的酶切液2ul进行MALDI-TOF检测。图6为癌症病人血浆中富集HSP90α后酶切的MALDI-TOF MS质谱图，可以检测到HSP90α的10条特异性肽段。此结果表明，制备的磁性复合材料在实际血清样品中具有特异性富集HSP90α的功能，为下一步质谱检测前的分离富集提供了一种较好的方法。
本发明所制备的磁性复合纳米材料由二硫化钼颗粒、包覆在所述二硫化钼颗粒表面的磁性纳米颗粒和利用两步“Au-S”键的反应，在二硫化钼材料上裸露的活性硫原子修饰上金纳米颗粒，再将三个顶点含有巯基的DNA四面体稳定固载在金纳米颗粒表面。通过DNA四面体剩余一个顶点上的羧基与抗体上的氨基反应连接，将蛋白质抗体负载到材料上。本发明合成的材料方法简单、清洁；通过磁性复合纳米材料上负载的蛋白质抗体能够实现对复杂基质中低丰度蛋白的高效、高选择性富集。
本文虽然已经给出了本发明的几个实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。

Claims (8)

1.一种基于DNA四面体的复合磁性纳米材料，其特征在于，所述复合磁性纳米材料包括二硫化钼颗粒、包覆在所述二硫化钼颗粒表面的磁性纳米颗粒、通过Au-S键的反应在所述二硫化钼颗粒上裸露的活性硫原子上修饰的金纳米颗粒、稳定固载在所述金纳米颗粒上的含有巯基的DNA四面体、与所述DNA四面体通过顶点上的功能基团反应连接的蛋白质抗体；所述磁性纳米颗粒为四氧化三铁磁性纳米颗粒，粒径为20～800nm；所述二硫化钼颗粒呈球状结构，粒径为5～50um；所述DNA四面体的4条DNA单链通过自组装的方式合成，每一个DNA单链包含16～160个脱氧核糖核苷酸单体。
2.如权利要求1所述的基于DNA四面体的复合磁性纳米材料，其特征在于，所述二硫化钼颗粒为5～10um，所述二硫化钼颗粒内部呈片层结构，片层的厚度为0.1～2nm。
3.如权利要求1所述的基于DNA四面体的复合磁性纳米材料，其特征在于，所述DNA单链的3’端或5’端具有所述功能基团，所述功能基团为巯基，和羧基、醛基、环氧基、氨基中的一种；其中巯基用于所述DNA四面体与所述复合磁性纳米材料中金纳米颗粒的反应，羧基、醛基、环氧基或氨基用于所述DNA四面体与蛋白质抗体之间的键合。
4.如权利要求1所述的基于DNA四面体的复合磁性纳米材料，其特征在于，所述蛋白质抗体为血清中低丰度蛋白的单抗或多抗。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的基于DNA四面体的复合磁性纳米材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
S1、在二硫化钼颗粒表面负载四氧化三铁磁性纳米颗粒，得到产物I:
MoS2@Fe3O4；
S2、利用“Au-S”键的相互作用，在所述产物I的裸露的活性硫原子上修饰金纳米颗粒，得到产物II:MoS2@Fe3O4@AuNPs；
S3、利用“Au-S”键的相互作用，在所述产物II中的金纳米颗粒上修饰顶点含有巯基的DNA四面体，得到产物III:MoS2@Fe3O4@AuNPs@DNA TET；
S4、活化所述产物III中的DNA四面体上修饰的羧基，将活化后的产物III与蛋白质抗体溶液孵育反应，使蛋白质抗体连接到所述复合磁性纳米材料。
6.如权利要求5所述的基于DNA四面体的复合磁性纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述DNA四面体由4条DNA单链通过碱基互补配对自组装制得；加入DTT活化所述DNA四面体的巯基；向步骤S2中制得的产物II中加入活化后的DNA四面体，反应后得到产物III。
7.如权利要求5所述的基于DNA四面体的复合磁性纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤S4中，在产物III中加入一定比例的EDC和NHS活化DNA四面体上修饰的羧基；EDC和NHS的比例为1：(1～5)；其中，EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，NHS为N-羟基丁二酰亚胺。
8.一种如权利要求1-4任一项所述的基于DNA四面体的复合磁性纳米材料的应用，其特征在于，所述复合磁性纳米材料用于蛋白质特异性富集检测；所述的富集检测步骤为：将合成的所述复合磁性纳米材料与含有目标蛋白的样品混合孵育一段时间后，磁分离并移除上清液，将富集到目标蛋白的所述复合磁性纳米材料进行酶切处理后，进行质谱检测。
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