CN110779789A - 一种亲水基团修饰二维磁性纳米材料的制备及其在糖肽规模化富集中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种亲水基团修饰二维磁性纳米材料及其制备方法与应用。该材料由二维二硫化钼纳米材料、通过金属共价键连接在二维二硫化钼纳米材料表面的磁性纳米颗粒、通过“Au‑S”键方式聚合在二维二硫化钼纳米材料表面的纳米金线、通过“Au‑S”键方式聚合在所述纳米金线表面的亲水性基团试剂组成。通过该材料中的基团试剂与糖基化肽段的亲水相互作用及静电相互作用，实现对糖肽高效地选择性富集；糖基化肽段富集效果好，可以实现低浓度人血清白蛋白(如IgG)与人尿液外泌体蛋白中糖肽的富集检测。

Description

一种亲水基团修饰二维磁性纳米材料的制备及其在糖肽规模 化富集中的应用
技术领域
本发明属于功能化磁性纳米材料技术领域，具体涉及一种亲水基团修饰二维磁性纳米材料的制备及其在糖肽规模化富集中的应用。
背景技术
蛋白质糖基化在许多生物学过程中都起着至关重要的作用，并且与各种癌症的发生和发展密切相关。因此，分析复杂生物样品中糖基化肽段的异常变化是至关重要的。目前针对糖蛋白的研究策略主要是将糖蛋白酶解成肽段，之后通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)或液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)进行分析。但是，胰蛋白酶消化的肽段混合物中糖肽的丰度低以及压倒性非糖肽的信号抑制导致基于质谱(MS)的大规模糖肽鉴定面临重大挑战。因此，对于复杂的蛋白质组学研究，从复杂的生物样品中对糖肽的选择性富集策略是必要的。
目前针对糖肽富集的方法按原理可以分为：凝集素亲和层析法，化学酰肼法，硼酸亲和层析和亲水相互作用法(HILIC)。其中，凝集素亲和色谱法具有很高的特异性，但后续不易分离，不利于进一步分析；酰肼化学法的富集策略会对糖链造成不同程度的破坏，无法得到完成的糖链信息；硼酸亲和层析与糖链的相互作用力小，对复杂样品中糖基化肽段选择性有限。但是，基于HILIC的糖肽富集具有操作简单，可重复性高和与MS相容性好的优点，因此受到了越来越多的研究关注。尽管许多工作中都采用了基于HILIC的方法，但是市售的微米级HILIC材料仍然存在较低的富集效率，特异性和选择性差等问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种亲水基团修饰二维磁性纳米材料及其制备方法。
本发明所提供的亲水基团修饰二维磁性纳米材料，由二维纳米材料，磁性纳米颗粒，修饰在所述二维纳米材料表面的纳米金线和通过“Au-S”键方式聚合在所述纳米金线表面的亲水性基团试剂组成。
上述的材料中，所述二维纳米材料可为二硫化钼；所述二维纳米材料是指层状结构的纳米材料，粒径为20～400nm。
上述的材料中，所述磁性纳米颗粒可为四氧化三铁纳米颗粒，具体可为γ-Fe3O4磁性纳米颗粒。所述磁性纳米颗粒的粒径可为20～200nm。
上述的材料中，所述亲水性基团试剂可为还原型谷胱甘肽(GSH)。
上述的材料中，所述亲水基团修饰二维磁性纳米结构示意式可如下：
Figure BDA0002273074420000021
式Ⅰ中，
Figure BDA0002273074420000022
表示钼原子，
Figure BDA0002273074420000023
表示硫原子，
Figure BDA0002273074420000024
表示在二硫化钼表面的磁性纳米颗粒，
Figure BDA0002273074420000025
表示纳米金线，
Figure BDA0002273074420000026
表示还原型谷胱甘肽。
本发明还提供了所述亲水基团修饰二维磁性纳米材料的制备方法。
本发明所提供的亲水基团修饰二维磁性纳米材料的制备方法，包括下述步骤：
(1)通过水热法合成二维二硫化钼纳米材料，得到产物Ⅰ；
(2)通过水热法在产物Ⅰ的表面负载磁性纳米颗粒，得到产物Ⅱ；
(3)在所述产物Ⅱ中二维二硫化钼纳米材料表面通过“Au-S”键修饰纳米金线，得到表面修饰有纳米金线的产物Ⅲ；
(4)在适当的溶液中，所述表面修饰有纳米金线的产物Ⅲ与亲水性基团试剂进一步通过“Au-S”键聚合，即可得到所述亲水基团修饰二维磁性纳米材料。
上述的制备方法中，步骤(1)中，可采用水热法合成二维二硫化钼纳米材料；步骤(2)中，可继续采用水热法利用金属共价键在所述二维纳米材料表面负载磁性纳米颗粒。
在本发明的具体实施例中，通过如下步骤合成二维二硫化钼：将钼酸钠，硫脲，聚乙二醇-20,000加入超纯水中,超声涡旋获得均一透明的溶液。将所得溶液转移至不锈钢高压反应釜中，放置在电烘箱下进行水热反应，即可得到产物Ⅰ。
其中，所述水热反应的温度为190～240℃，具体可为220℃；所述水热反应的时间为6～24h，具体可为20h。
所述钼酸钠、硫脲、聚乙二醇-20,000的质量比为40:51:1。
在本发明的具体实施例中，以二硫化钼为例，在二维二硫化钼纳米材料表面负载磁性纳米颗粒：将二硫化钼、三氯化铁和柠檬酸三钠分散在乙二醇中，超声处理，然后向均一的混合物中加入无水乙酸钠和氨水，再将所得溶液转移至高压反应釜中放置在电烘箱下进行水热反应，即可得到产物Ⅱ。
所述水热反应的温度可为190～220℃，具体可为200℃；所述水热反应的时间可为6～12h小时，具体可为9小时。
所述二硫化钼、所述三氯化铁的质量比可为1:1～1:5，具体可为3:4。
所述二硫化钼、所述柠檬酸三钠的质量比可为1:1～1:1.5，具体可为1:1。
所述二硫化钼、所述无水乙酸钠的质量比可为1:20～1:40，具体可为3:70。
上述的制备方法中，步骤(3)中，可采用常规的方法在所述二维纳米材料的表面修饰纳米金线。
在本发明的具体实施例中，通过以下步骤在二维磁性纳米材料的表面修饰纳米金线：将产物Ⅱ，三水合四氯化金和油胺，三异丙基硅烷混合于的正己烷中，室温静置4 小时，即可得产物Ⅲ。
上述的制备方法中，步骤(4)中，所述基团试剂为还原型谷胱甘肽。
所述溶液可为水乙醇混合溶液，其中水与乙醇的体积比可为3:1。
本发明还提供了上述亲水基团修饰二维磁性纳米材料的应用。
所述应用为上述亲水基团修饰二维磁性纳米材料在糖肽规模化富集中的应用。
本发明提供了利用上述亲水基团修饰二维磁性纳米材料对糖肽富集的方法。
所述方法包括如下步骤：
1)利用亲水基团修饰二维磁性纳米材料吸附糖肽样品中的糖肽；2)采用外加磁场分离含有糖肽的二维磁性金属硫化物材料，即可实现对所述糖肽的富集。
上述的方法步骤1)中，所述亲水基团修饰二维磁性纳米材料与所述糖肽样品的质量比为15：1～25：1。
上述的方法步骤1)中，所述吸附的步骤具体如下：将所述糖肽样品和所述亲水基团修饰二维磁性纳米材料置于富集缓冲溶液中进行震荡孵育。
所述糖肽样品以糖肽样品溶液的形式进行添加；所述糖肽样品溶液中糖液样品的浓度可为0.5pmol/mL～1mmol/mL，具体可为10pmol/mL～1mmol/mL、10pmol/mL、 50pmol/mL或1mmol/mL；所述糖肽样品溶液的溶剂可为无水乙腈、水和三氟乙酸按照体积比依次为88：11.9：0.1得到的混合溶剂。
所述亲水基团修饰二维磁性纳米材料的质量和所述富集缓冲溶液的体积比可为20μg：(50～200)μL，具体可为20μg：200μL。
上述的方法中，所述富集缓冲溶液具体可为无水乙腈、水和三氟乙酸按照体积比依次为88：11.9：0.1得到的混合溶液。
上述的方法中，所述震荡孵育的频率可为1200～1500rpm，时间可为30～45分钟。
上述的方法中，所述方法在所述吸附之前还包括用富集缓冲液洗涤所述亲水基团修饰二维磁性纳米材料的步骤。
上述的方法中，所述方法在所述磁性分离之后还包括：用洗脱液洗脱吸附有糖肽的亲水基团修饰二维磁性纳米材料并收集洗脱液的步骤。
所述洗脱液可为无水乙腈、水和三氟乙酸按照体积比30：69.9：0.1得到的混合溶液。
本发明还进一步提供了一种糖肽的分析方法。
该方法包括：
a1)采用上述的方法对所述糖肽进行富集。
b1)对富集得到的糖肽进行MALDI-TOF MS分析或LC-MS/MS分析。。
所述糖肽可为人血清白蛋白(如IgG)中的糖肽或人尿液外泌体蛋白中的糖肽。
本发明具有如下有益效果：
(1)通过两步的水热法，“Au-S”键，亲水相互作用，在二维纳米材料表面聚合基团试剂；材料合成方法简单、快捷。
(2)通过基团试剂与糖基化肽段的亲水相互作用及静电相互作用，实现对糖肽高效地选择性富集；糖基化肽段富集效果好，可以实现低浓度人血清白蛋白(如IgG)，复杂生物样本(人尿液外泌体)中糖肽的富集检测。
附图说明
图1为实施例1中亲水基团修饰二维磁性纳米材料的合成路线示意图。
图2为亲水基团修饰二维磁性纳米材料应用于糖肽的高效富集流程图。
图3为实施例1中亲水基团修饰二维磁性纳米材料富集人免疫球蛋白酶解液前后的MALDI-TOF质谱图，其中，图3(a)为富集前的人免疫球蛋白酶解液(1pmol)；图 3(b)亲水基团修饰二维磁性纳米材料富集后的人免疫球蛋白酶解液(1pmol)。
图4为实施例2中亲水基团修饰二维磁性纳米材料富集不同浓度的人免疫球蛋白酶解液后的MALDI-TOF质谱图，其中，图4(a)为50fmol，图4(b)为1fmol。
图5为实施例3中亲水基团修饰二维磁性纳米材料富集人免疫球蛋白酶解液与牛血清白蛋白酶解液混合液前后的MALDI-TOF质谱图，其中，图5(a)为人免疫球蛋白酶解液与牛血清白蛋白酶解液混合液(1μg)；图5(b)为亲水基团修饰二维磁性纳米材料富集后的人免疫球蛋白酶解液与牛血清白蛋白酶解液混合液(1μg)。
图6为实施例4中亲水基团修饰二维磁性纳米材料富集人尿液外泌体蛋白酶解液中糖肽所获数据图。在三个重复的测试中，从314、339和359个N-糖蛋白中获得了 534、590和649个N-糖肽，其中在至少三个测试中两次至少鉴定了近80％的N-糖肽 (图6)。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的二维纳米材料二硫化钼(MoS2)通过如下步骤制备：称取1.21g Na2MoO4·2H2O、1.52g(NH2)2CS、和30mg PEG-20,000加入30mL超纯水中,机械搅拌30分钟，超声涡旋获得均一透明的溶液。将所得溶液转移至50mL不锈钢高压反应釜中后密封，在电烘箱中220℃下加热反应20小时后冷却至室温。将反应产物在1,500g条件下离心15分钟取沉淀。依次使用30mL超纯水洗涤沉淀两次，30mL乙醇洗涤沉淀两次，30mL去基团水洗涤沉淀三次后，每次洗涤后在1,500 g条件下离心15分钟取沉淀。最后将所得黑色粉末在60℃真空条件下干燥6小时后保存备用。
下述实施例中所用的二维磁性纳米材料(MoS2-Fe3O4)通过如下步骤制备：将30 mgMoS2，40mg FeCl3·6H2O和30mg柠檬酸三钠分散在30mL乙二醇中，超声30 min，然后向均一的混合物中加入700mg无水NaAc，机械搅拌30min，加入0.3mL 氨水，继续机械搅拌10min。将所得溶液转移至不锈钢高压反应釜中放置在电烘箱 200℃下进行反应9h。使用磁铁吸附分离所得混合物，依次使用乙醇和正己烷清洗三次并60℃干燥备用。
下述实施例中所用的亲水基团修饰二维磁性纳米材料(MoS2-Fe3O4-Au/NWs-GSH)通过如下步骤制备：
将20mg MoS2-Fe3O4黑色粉末，3mg三水合四氯化金(III)和100μL油胺，150 μL三异丙基硅烷混合于3mL的正己烷中，室温静置4小时，使用磁性分离，依次使用正己烷和乙醇清洗，向所得沉淀中加入4mL含40mg谷胱甘肽的乙醇水混合溶液(乙醇：超纯水，1:3,v/v)，在室温条件下混合8小时。使用磁性分离将所得沉淀依次使用5mL去基团水洗涤两次，5mL乙醇洗涤两次，5mL去基团水洗涤三次，取沉淀在60℃真空条件下干燥6小时后得灰色粉末，保存备用。
人免疫球蛋白及牛血清白蛋白酶解液的配制过程如下：称取1mg人免疫球蛋白或牛血清白蛋白，溶解于1mL 50mM碳酸氢铵溶液中，加入20μL 1mol L-1二硫苏糖醇，37℃变性4h。加入7.2mg碘代乙酰胺，遮光烷基化反应1h后，按照酶与蛋白质质量比1:50加入胰蛋白酶，37℃酶切12h。酶切结束后，C18 SPE柱脱盐，冻干， -20℃保存。
人免疫球蛋白酶解液和牛血清白蛋白酶解液混合液的配制过程如下：将酶切所得的人免疫球蛋白酶解液和牛血清白蛋白酶解液分别用富集缓冲液(无水乙腈/水/三氟乙酸,88:11.9:0.1,v/v/v)溶解成浓度为1μg/μL的溶液，按体积比1：100配置成人免疫球蛋白酶解液和牛血清白蛋白酶解液混合液(IgG:BSA1:100,w/w,1μg/μL)。
人尿液外泌体提取过程如下：取健康成年男性晨尿50mL以300g离心10分钟、2000g 10分钟和10000g 30分钟；将上清转移至超速离心机110000g，70分钟进行超高速离心得到沉淀为外泌体的粗提取物；重复使用新鲜1×PBS超高速离心110000g， 70分钟洗涤2次，得到外泌体。
人尿液外泌体蛋白酶解液的配制过程如下：将所收集的尿液外泌体使用8M尿素重悬后于冰水浴中，在200W超声波细胞破碎仪中破碎30分钟以提取蛋白。使用FASP酶切，将提取的外泌体超声破碎后的溶液加入30kDa超滤管，14000g离心 12分钟，使用8M UA洗涤2次，加入10mM DTT在37℃下还原4小时，14000g 离心12分钟，使用8M UA离心清洗2遍，去除DTT，随后加入终浓度为50mM IAA 于室温、暗处烷基化反应1小时。同上条件离心去除IAA，依次使用UA清洗2遍，使用50mM碳酸氢铵清洗3遍，使用nanodrop检测蛋白浓度，以蛋白质与胰蛋白酶质量比为50:1的比例加入胰蛋白酶，于37℃下恒温孵育过夜酶切。14000g离心 12分钟，加入100μL超纯水再次清洗离心，留超滤液测量肽段浓度，于45℃真空热干后于-20℃保存。
实施例1、制备亲水基团修饰二维磁性纳米材料并对糖肽进行富集和检测
一、制备亲水基团修饰二维磁性纳米材料
按照图1所示合成路线示意图制备亲水基团修饰二维磁性纳米材料，具体步骤如下：
步骤1：制备二维纳米材料二硫化钼
将1.21g Na2MoO4·2H2O、1.52g(NH2)2CS、和30mg PEG-20,000加入30mL超纯水中,机械搅拌30分钟，超声涡旋获得均一透明的溶液。将所得溶液转移至50mL 不锈钢高压反应釜中后密封，在电烘箱中220℃下加热反应20小时后冷却至室温。将反应产物在1500g条件下离心15分钟取沉淀。依次使用30mL超纯水洗涤沉淀两次，30mL乙醇洗涤沉淀两次，30mL去基团水洗涤沉淀三次后，每次洗涤后在 1,500g条件下离心15分钟取沉淀。最后将所得黑色粉末在60℃真空条件下干燥6小时后保存备用。
步骤2：二硫化钼表面负载磁性纳米颗粒
将30mg MoS2(步骤1制备)，40mg FeCl3·6H2O和30mg柠檬酸三钠分散在30 mL乙二醇中，超声30min，然后向均一的混合物中加入700mg无水NaAc，机械搅拌30min，加入0.3mL氨水，继续机械搅拌10min。将所得溶液转移至不锈钢高压反应釜中放置在电烘箱200℃下进行反应9h。使用磁铁吸附分离所得混合物，依次使用乙醇和正己烷清洗三次并60℃干燥备用。
步骤3：利用“Au-S”键在二维纳米材料表面修饰纳米金线和制备表面亲水基团从而制备亲水基团修饰二维磁性纳米材料
将20mg MoS2-Fe3O4黑色粉末，3mg三水合四氯化金(III)和100μL油胺，150 μL三异丙基硅烷混合于3mL的正己烷中，室温静置4小时，使用磁性分离，依次使用正己烷和乙醇清洗，向所得沉淀中加入4mL含40mg谷胱甘肽的乙醇水混合溶液(乙醇：超纯水，1:3,v/v)，在室温条件下混合8小时。使用磁性分离将所得沉淀依次使用5mL去基团水洗涤两次，5mL乙醇洗涤两次，5mL去基团水洗涤三次，取沉淀在60℃真空条件下干燥6小时后得灰色粉末，保存备用。
二、采用上述亲水基团修饰二维磁性纳米材料对糖肽进行富集和检测
(1)亲水基团修饰二维磁性纳米材料对糖肽富集
按照图2所示流程图对糖肽进行富集和检测，具体步骤如下：
步骤1：称取亲水基团修饰二维磁性纳米材料1mg，超声分散于1mL富集缓冲液(无水乙腈/水/三氟乙酸,88:11.9:0.1,v/v/v)中，然后吸取40μL上述悬浊液，通过外加磁场分离磁性纳米颗粒，并用富集缓冲液(无水乙腈/水/三氟乙酸,88:11.9:0.1,v/v/v)清洗3次。
步骤2：亲水基团修饰二维磁性二硫化钼材料(40μg)重悬于50μL富集缓冲液(无水乙腈/水/三氟乙酸,88:11.9:0.1,v/v/v)中，向其中加入1μL(1mmol/mL)人免疫球蛋白酶解液，室温下震荡混合45min，然后在外加磁场作用下，分离磁性纳米颗粒，并用 200μL富集缓冲液(无水乙腈/水/三氟乙酸,88:11.9:0.1,v/v/v)充分洗涤3次，将所得磁性纳米颗粒分散于20μL洗脱液(无水乙腈/水/三氟乙酸,30:69.9:0.1,v/v/v)中，室温下震荡孵育(1500rpm)15min，通过外加磁场分离磁性纳米颗粒，取适量(1μL)收集的洗脱液滴加于MALDI靶盘上，待其充分挥发后，滴加适量DHB基质(2,5-二羟基苯甲酸，含1％磷酸，溶于80％乙腈中)，挥发结晶后，进行MALDI-TOF MS分析。
通过对比富集前人免疫球蛋白酶解液与富集后洗脱液的MS结果，表明该材料对人免疫球蛋白酶解液中糖基化肽段有特异性的富集效果。未富集时，在人免疫球蛋白酶解液的MALDI质谱图上，仅能鉴定到2条糖基化肽段，并且在分子量范围1000～2000 内有大量的高丰度非糖基化肽段信号，而经过材料富集人免疫球蛋白酶解液的MALDI 质谱图中，可以鉴定出32条糖基化肽段，同时1000～2000分子量范围内的非糖基化肽段被去除。此结果表明所制备的磁性纳米颗粒对于糖基化肽段有良好的富集作用(图3)。
实施例2、亲水基团修饰二维磁性纳米材料对糖肽富集灵敏度检测
称取亲水基团修饰二维磁性纳米材料1mg，超声分散于1mL富集缓冲液(无水乙腈/水/三氟乙酸,88:11.9:0.1,v/v/v)中，然后吸取40μL上述悬浊液，通过外加磁场分离磁性纳米颗粒，并用富集缓冲液(无水乙腈/水/三氟乙酸,88:11.9:0.1,v/v/v)清洗3次。
将上述二维磁性纳米材料(40μg)重悬于50μL富集缓冲液(无水乙腈/水/三氟乙酸, 88:11.9:0.1,v/v/v)中，向其中加入1μL(50pmol/mL或10pmol/mL)人免疫球蛋白酶解液，室温下震荡混合30min，然后在外加磁场作用下，分离磁性纳米材料，并用200μL 富集缓冲液(无水乙腈/水/三氟乙酸,88:11.9:0.1,v/v/v)充分洗涤3次，将所得磁性纳米材料分散于20μL洗脱液(无水乙腈/水/三氟乙酸,30:69.9:0.1,v/v/v)中，室温下震荡孵育15min，通过外加磁场分离磁性纳米材料，取适量(1μL)收集的洗脱液滴加于MALDI 靶盘上，待其充分挥发后，滴加适量DHB基质(2,5-二羟基苯甲酸，含1％磷酸，溶于 80％乙腈中)，挥发结晶后，进行MALDI-TOF MS分析。
通过对低丰度人免疫球蛋白酶解液进行富集，结果表明该材料对人免疫球蛋白酶解液中糖基化肽段有高灵敏度的富集效果。经过材料富集后，50fmol人免疫球蛋白酶解液的MALDI质谱图中可以鉴定出24条糖基化肽段，当人免疫球蛋白酶解液浓度进一步降低至5fmol时，仍可以从其MALDI质谱图中鉴定到10条糖基化肽段。结果如图4所示，表明所制备的二维磁性纳米材料可以对于糖基化肽段实现高灵敏度富集。
实施例3、亲水基团修饰二维磁性纳米材料对糖肽富集选择性检测
称取亲水基团修饰二维磁性纳米材料1mg，超声分散于1mL富集缓冲液(无水乙腈/水/三氟乙酸,88:11.9:0.1,v/v/v)中，然后吸取40μL上述悬浊液，通过外加磁场分离磁性纳米颗粒，并用富集缓冲液(无水乙腈/水/三氟乙酸,88:11.9:0.1,v/v/v)清洗3次。
将上述二维磁性纳米材料(40μg)重悬于50μL富集缓冲液(无水乙腈/水/三氟乙酸, 88:11.9:0.1,v/v/v)中，向其中加入1μL人免疫球蛋白酶解液和牛血清白蛋白酶解液混合液(IgG:BSA 1:200,w/w,1μg/μL)，室温下震荡混合40min，然后在外加磁场作用下，分离磁性纳米材料，并用200μL富集缓冲液(无水乙腈/水/三氟乙酸,88:11.9:0.1,v/v/v) 充分洗涤3次，将所得磁性纳米材料分散于20μL洗脱液(无水乙腈/水/三氟乙酸, 30:69.9:0.1,v/v/v)中，室温下震荡孵育15min，通过外加磁场分离磁性纳米材料，取适量(1μL)收集的洗脱液滴加于MALDI靶盘上，待其充分挥发后，滴加适量DHB基质 (2,5-二羟基苯甲酸，含1％磷酸，溶于80％乙腈中)，挥发结晶后，进行MALDI-TOF MS 分析。
通过比对富集前后人免疫球蛋白酶解液与牛血清白蛋白酶解液混合液结果，表明该材料对糖基化肽段有高选择性的富集效果。由于牛血清白蛋白中不含糖基化位点，未富集时，受高丰度的牛血清白蛋白酶解产物的信号干扰，在混合酶解液的MALDI 质谱图上，无法鉴定到糖基化肽段，并且在分子量范围1000～2000内有大量的高丰度非糖基化肽段信号，而经过材料富集混合酶解液的MALDI质谱图中，可以鉴定出7 条糖基化肽段，同时1000～2000分子量范围内的非糖基化肽段被去除。此结果(图5) 表明所制备的磁性纳米颗粒对于糖基化肽段有着高选择性的富集效果。
实施例4、亲水基团修饰二维磁性纳米材料对尿液外泌体蛋白糖肽富集检测：
称取亲水基团修饰二维磁性纳米材料1mg，超声分散于1mL富集缓冲液(无水乙腈/水/三氟乙酸,88:11.9:0.1,v/v/v)中，然后吸取40μL上述悬浊液，通过外加磁场分离磁性纳米材料，并用富集缓冲液(无水乙腈/水/三氟乙酸,88:11.9:0.1,v/v/v)清洗3次。
将上述二维磁性纳米材料(40μg)重悬于50μL富集缓冲液(无水乙腈/水/三氟乙酸, 88:11.9:0.1,v/v/v)中，向其中加入50μg尿液外泌体蛋白酶解液进行混合，室温下震荡混合30min，然后在外加磁场作用下，分离磁性纳米材料，并用200μL富集缓冲液(无水乙腈/水/三氟乙酸,88:11.9:0.1,v/v/v)充分洗涤3次，将所得磁性纳米材料分散于20 μL洗脱液(无水乙腈/水/三氟乙酸,30:69.9:0.1,v/v/v)中，室温下震荡孵育15min，通过外加磁场分离磁性纳米材料，将洗脱液进行热干处理，使用25mM碳酸氢铵(H2O18配制)重新溶解，按照50U：100ug加入PNGase F酶37℃进行切糖，使用小型C18 脱盐柱对PNGase F处理的肽段进行脱盐，获得的洗脱液热干处理后使用A液(0.1％ FA)重新溶解，测量肽段浓度后进行质谱上样。
通过对人尿液外泌体蛋白酶解液进行富集，结果表明该材料对人尿液外泌体酶解液中糖基化肽段有高选择性的富集效果。经过材料富集后，三次重复实验中，20μg人尿液外泌体蛋白酶解液的LC-MS质谱数据中可以鉴定出314、339和359个N-糖蛋白中获得了534、590和649个N-糖肽。结果如图6所示，表明所制备的磁性纳米材料对复杂生物样本中糖基化肽段实可以现高灵敏度富集。

Claims (10)

1.一种亲水基团修饰二维磁性纳米材料，由二维纳米材料、负载在所述二维纳米材料表面的磁性纳米颗粒、修饰在所述二维纳米材料表面的纳米金线、以及通过“Au-S”键方式聚合在所述纳米金线表面的亲水性基团试剂组成；
所述二维纳米材料为二维二硫化钼纳米材料。
2.根据权利要求1所述的亲水基团修饰二维磁性纳米材料，其特征在于：
所述二维纳米材料为层状的二硫化钼纳米材料；
所述二维纳米材料粒径为20～400nm；
所述磁性纳米颗粒为四氧化三铁纳米颗粒，具体为γ-Fe3O4磁性纳米颗粒；
所述磁性纳米颗粒的粒径为20～200nm；
所述亲水性基团试剂为还原型谷胱甘肽。
3.根据权利要求2所述的亲水基团修饰二维磁性纳米材料，其特征在于：
所述亲水基团修饰二维磁性纳米材料的结构示意式，如式I所示：
Figure FDA0002273074410000011
式Ⅰ中，
Figure FDA0002273074410000012
表示钼原子，
Figure FDA0002273074410000013
表示硫原子，
Figure FDA0002273074410000014
表示在二硫化钼表面的磁性纳米颗粒，
Figure FDA0002273074410000015
表示纳米金线，
Figure FDA0002273074410000016
表示还原型谷胱甘肽。
4.权利要求1-3中任一项所述亲水基团修饰二维磁性纳米材料的制备方法，包括下述步骤：
(1)通过水热法合成二维纳米材料，得到产物Ⅰ；
(2)在二维纳米材料的表面负载磁性纳米颗粒，得到产物Ⅱ；
(3)在所述产物Ⅱ中二维纳米材料表面通过“Au-S”键修饰纳米金线，得到表面修饰有纳米金线的产物Ⅲ；
(4)在适当的溶液中，所述表面修饰有纳米金线的产物Ⅲ与亲水性基团试剂进一步通过“Au-S”键聚合，得到所述亲水基团修饰二维磁性纳米材料。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，采用水热法在合成二维二硫化钼纳米材料，包括下述步骤：将钼酸钠，硫脲，聚乙二醇-20,000加入超纯水中，超声涡旋获得均一透明的溶液，将所得溶液转移至不锈钢高压反应釜中，放置在电烘箱下进行水热反应，得到产物Ⅰ；
其中，所述水热反应的温度为190～240℃；所述水热反应的时间为6～24h；
所述钼酸钠、硫脲、聚乙二醇-20,000的质量比为40:51:1。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，采用水热法在二维二硫化钼纳米材料表面负载磁性纳米颗粒，包括下述步骤：将二维二硫化钼纳米材料、三氯化铁和柠檬酸三钠分散在乙二醇中，超声处理，然后向均一的混合物中加入无水乙酸钠和氨水，再将所得溶液转移至高压反应釜中放置在电烘箱下进行水热反应，得到产物Ⅱ；
所述水热反应的温度为190～240℃；所述水热反应的时间为6～24h；
所述二硫化钼、所述三氯化铁的质量比为1:1～1:5；
所述二硫化钼、所述柠檬酸三钠的质量比为1:1～1:1.5；
所述二硫化钼、所述无水乙酸钠的质量比为1:20～1:40；
所述步骤(4)中，所述基团试剂为还原型谷胱甘肽；
所述溶液液为水乙醇混合溶液，其中水与乙醇的体积比为3:1。
7.权利要求1-3任一项所述的亲水基团修饰二维纳米材料在糖肽规模化富集中的应用。
8.一种利用权利要求1-3任一项所述亲水基团修饰二维磁性纳米材料对糖肽进行富集的方法，包括如下步骤：
1)利用权利要求1-3任一项所述的亲水基团修饰二维磁性纳米材料吸附糖肽样品中的糖肽；
2)采用外加磁场分离含有糖肽的二维磁性纳米材料，实现对所述糖肽的富集。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述亲水基团修饰二维磁性纳米材料与所述糖肽样品的质量比为15：1～25：1；
所述步骤1)中，所述吸附的步骤具体如下：将所述糖肽样品和所述亲水基团修饰二维磁性纳米材料置于富集缓冲溶液中进行震荡孵育；
所述糖肽样品以糖肽样品溶液的形式进行添加；所述糖肽样品溶液中糖液样品的浓度为0.5pmol/mL～1mmol/mL；所述糖肽样品溶液的溶剂为无水乙腈、水和三氟乙酸按照体积比依次为88：11.9：0.1得到的混合溶剂；
所述亲水基团修饰二维磁性纳米材料的质量和所述富集缓冲溶液的体积比可为20μg：(50～200)μL；
所述富集缓冲溶液为无水乙腈、水和三氟乙酸按照体积比依次为88：11.9：0.1得到的混合溶液；
所述震荡孵育的频率为1200～1500rpm，时间为30～45分钟；
所述方法在所述吸附之前还包括用富集缓冲液洗涤所述亲水基团修饰二维磁性金属硫化物材料的步骤；
所述方法在所述磁性分离之后还包括：用洗脱液洗脱吸附有糖肽的亲水基团修饰二维磁性金属硫化物材料并收集洗脱液的步骤；
所述洗脱液为无水乙腈、水和三氟乙酸按照体积比30：69.9：0.1得到的混合溶液。
10.一种糖肽的分析方法，包括下述步骤：
a1)采用权利要求8或9所述的方法对所述糖肽进行富集；
b1)对富集得到的糖肽进行MALDI-TOF MS或LC-MS/MS分析。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113150062A (zh) * 2021-03-01 2021-07-23 复旦大学 一种特异性分离富集内源性糖基化肽的方法
CN113926497A (zh) * 2021-10-08 2022-01-14 浙江工商大学 基于核酸适配体修饰的MoS2复合材料的微流控阵列质谱芯片及其制备方法与应用
CN114200137A (zh) * 2020-09-16 2022-03-18 四川大学 一种以商品化磁珠为内标的比率免疫分析方法
WO2022156677A1 (zh) * 2021-01-19 2022-07-28 中国计量科学研究院 基于dna四面体的复合磁性纳米材料、制备及应用
CN115283668A (zh) * 2022-07-14 2022-11-04 中山大学 一种二硫化锡-金复合材料及其制备方法和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104001481A (zh) * 2014-06-05 2014-08-27 新疆大学 一种用于富集糖基化肽段的亲水磁性纳米材料的制备方法
CN106770614A (zh) * 2016-12-30 2017-05-31 复旦大学 亲水性纳米复合材料结合质谱分析鉴定糖基化肽段的方法
CN106975467A (zh) * 2017-04-12 2017-07-25 北京蛋白质组研究中心 一种表面聚合离子液体修饰的磁性纳米材料及其制备方法与应用
CN107727480A (zh) * 2017-09-30 2018-02-23 北京蛋白质组研究中心 超薄片层状功能化二硫化钼纳米复合材料及其在糖肽富集中的应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104001481A (zh) * 2014-06-05 2014-08-27 新疆大学 一种用于富集糖基化肽段的亲水磁性纳米材料的制备方法
CN106770614A (zh) * 2016-12-30 2017-05-31 复旦大学 亲水性纳米复合材料结合质谱分析鉴定糖基化肽段的方法
CN106975467A (zh) * 2017-04-12 2017-07-25 北京蛋白质组研究中心 一种表面聚合离子液体修饰的磁性纳米材料及其制备方法与应用
CN107727480A (zh) * 2017-09-30 2018-02-23 北京蛋白质组研究中心 超薄片层状功能化二硫化钼纳米复合材料及其在糖肽富集中的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HANQING ZHANG, ET. AL.: "A GSH Functionalized Magnetic Ultra-thin 2D-MoS2 nanocomposite for HILIC-based enrichment of N-glycopeptides from urine exosome and serum proteins", 《ANALYTICAL CHIMICA ACTA》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114200137A (zh) * 2020-09-16 2022-03-18 四川大学 一种以商品化磁珠为内标的比率免疫分析方法
CN114200137B (zh) * 2020-09-16 2023-09-01 四川大学 一种以商品化磁珠为内标的比率免疫分析方法
WO2022156677A1 (zh) * 2021-01-19 2022-07-28 中国计量科学研究院 基于dna四面体的复合磁性纳米材料、制备及应用
CN113150062A (zh) * 2021-03-01 2021-07-23 复旦大学 一种特异性分离富集内源性糖基化肽的方法
CN113150062B (zh) * 2021-03-01 2022-09-16 复旦大学 一种特异性分离富集内源性糖基化肽的方法
CN113926497A (zh) * 2021-10-08 2022-01-14 浙江工商大学 基于核酸适配体修饰的MoS2复合材料的微流控阵列质谱芯片及其制备方法与应用
CN113926497B (zh) * 2021-10-08 2022-12-30 浙江工商大学 基于核酸适配体修饰的MoS2复合材料的微流控阵列质谱芯片及其制备方法与应用
CN115283668A (zh) * 2022-07-14 2022-11-04 中山大学 一种二硫化锡-金复合材料及其制备方法和应用
CN115283668B (zh) * 2022-07-14 2023-11-21 中山大学 一种二硫化锡-金复合材料及其制备方法和应用

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