CN104001481A

CN104001481A - 一种用于富集糖基化肽段的亲水磁性纳米材料的制备方法

Info

Publication number: CN104001481A
Application number: CN201410246132.2A
Authority: CN
Inventors: 封顺; 方春丽; 徐世美; 王吉德
Original assignee: Xinjiang University
Current assignee: Xinjiang University
Priority date: 2014-06-05
Filing date: 2014-06-05
Publication date: 2014-08-27

Abstract

本发明涉及一种用于富集糖基化肽段的亲水磁性纳米材料的制备方法，属于纳米材料和生物分离领域，其目的在于用于糖基化肽段的选择性富集。其特征在于：采用“一锅法”合成壳聚糖、纤维素、琼脂糖等糖类化合物与四氧化三铁配伍的亲水磁性纳米材料，由于材料中糖类化合物分子中-NH₂和-OH极性基团的存在，该材料具有一定的亲水性，可以从复杂的蛋白酶解液中特异地富集和纯化糖基化肽段。本发明制得的富集材料在保证其良好吸附效果的同时，制备方法具有省时、低成本和操作简便等优点，可大量制备，特别适用于大规模的糖基化肽段的富集。

Description

一种用于富集糖基化肽段的亲水磁性纳米材料的制备方法

技术领域

本发明涉及糖基化肽段的分离纯化，具体涉及一种用于富集糖基化肽段的亲水磁性纳米材料的制备方法。

背景技术

蛋白质翻译后修饰位点的鉴定是目前蛋白质组学研究中重要挑战之一，糖基化修饰是蛋白质翻译后最重要的修饰之一。糖基化蛋白质参与了细胞信号传导、细胞粘附、分子清除、受体激活等许多重要的生命活动过程。糖基化的异常与众多疾病的发生发展密切相关，目前发现的疾病标志物很多是糖基化蛋白质，糖基化蛋白质研究对于生物医药和疾病的诊断、治疗有着很重要的意义。最近，质谱技术在蛋白糖基化的定性中，已经发展成为重要的工具之一。在糖基化蛋白酶解产物的糖基化肽段质谱分析中，由于酶解产物中存在大量的非糖基化肽段，这些肽段在离子化过程中产生的离子信号会淹没糖基化肽段的离子信号，另一方面糖基化肽段在质谱检测中的离子化效率相对较低，这些因素导致了糖基化肽段在质谱中很难被检测到。从糖基化蛋白的酶解混合物中分离和富集糖基化肽段是目前进行糖基化研究的比较理想的方法，也是成功实现质谱分析最关键的一步。

由于糖基化肽段的糖链上含有大量的羟基，使得糖基化肽段具有较强的亲水性，相对而言，非糖基化肽段的疏水性较强，因此可以采用亲水作用色谱法（HILIC）实现糖基化肽段的分离富集。亲水作用色谱法能富集各种类型的糖基化肽段，操作简单方便，并且不破坏糖链结构（Yeh, C. H. 等，Magnetic bead-based hydrophilic interaction liquid chromatography for glycopeptide enrichments，Journal of Chromatography A，1224（2012），P70-78）。四氧化三铁磁性纳米材料是一类非常重要的无机功能材料，具有易于修饰的表面、优良的磁响应能力和巨大的比表面积。将磁性纳米材料与亲水作用色谱法结合得到的亲水磁性纳米材料因兼具两者的优点而受到青睐。目前，常用的亲水磁性纳米材料的合成需要经过合成Fe₃O₄纳米粒子后包覆SiO₂，然后在SiO₂表面进行官能团化后嫁接亲水性分子等多步反应，操作较为繁琐耗时（Xiong Z. C.等，Synthesis of branched PEG brushes hybrid hydrophilic magnetic nanoparticles for the selective enrichment of N-linked glycopeptides，Chemical Communications，48（2012），P8138-8140）。本发明提供了一种更为简单的制备这类材料的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于糖基化肽段富集的亲水磁性纳米材料的制备方法。该方法采用“一锅法”合成了亲水磁性纳米材料，该材料具有很好的亲水性，另外良好的磁响应能力可以实现快速分离。和现有技术相比，本发明在保证材料良好的亲水性和富集效果的同时，制备方法具有省时、低成本和操作简便等优点，可大量制备，特别适用于大规模的糖基化蛋白质组学研究。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种用于糖基化肽段富集材料的制备方法，采用“一锅法”合成了亲水磁性纳米材料，包括以下步骤：

1）将1～5 g FeCl₃ · 6H₂O加入25～100 mL乙二醇中，超声溶解10～30min，形成黄色透明溶液；

2）加入1～10 g NH₄Ac和0.5～4 g壳聚糖或纤维素或琼脂糖，在氮气保护下130～180^oC加热搅拌1～4 h；

3）转入100 mL反应釜中150～250^oC水热反应14～24 h；

4）反应完毕后，对冷却的黑色溶液进行磁分离，将产物用高纯水和无水乙醇分别进行洗涤，50-80^oC真空干燥。

附图说明

图1是合成的亲水磁性纳米材料的表征。(a) 磁性亲水纳米材料的透射电镜图；(b) 磁性亲水纳米材料的磁滞回线。

图2 是标准人血清IgG酶解物富集前后的MALDI-TOF MS质谱图。(a) 人血清IgG酶解物富集前的MALDI-TOF MS质谱图；(b) 人血清IgG酶解物富集后的MALDI-TOF MS质谱图，*代表糖肽。

图3是HeLa细胞蛋白酶解物富集后的HPLC-MS/MS基峰图。

具体实施方式

实施例1

将3 g FeCl₃·6H₂O加入70 mL乙二醇中，超声溶解20 min，形成黄色透明溶液，加入5 g NH₄Ac和1.5 g壳聚糖，在氮气保护下150^oC加热搅拌2.4 h后转入100 mL反应釜中190^oC水热反应18 h。反应完毕后，对冷却的黑色溶液进行磁分离，将产物用高纯水和无水乙醇分别进行洗涤，65^oC真空干燥。材料的透射电镜和磁滞回线见图1：其尺寸约为140 nm，并且材料保持了良好的磁性。

实施例2

将1 g FeCl₃·6H₂O加入25 mL乙二醇中，超声溶解10 min，形成黄色透明溶液，加入1 g NH₄Ac和0.5 g 纤维素，在氮气保护下180^oC加热搅拌4 h后转入100 mL反应釜中250^oC水热反应14 h。反应完毕后，对冷却的黑色溶液进行磁分离，将产物用高纯水和无水乙醇分别进行洗涤，50^oC真空干燥。

实施例3

将5 g FeCl₃·6H₂O加入100 mL乙二醇中，超声溶解30 min，形成黄色透明溶液，加入10 g NH₄Ac和4 g 琼脂糖，在氮气保护下130^oC加热搅拌1 h后转入100 mL反应釜中150^oC水热反应24 h。反应完毕后，对冷却的黑色溶液进行磁分离，将产物用高纯水和无水乙醇分别进行洗涤，80^oC真空干燥。

应用例1

本实例以采用上述制备方法制得的亲水磁性纳米材料对标准糖基化蛋白进行富集，对富集效果进行评价，其具体步骤如下：

1、样品溶液的制备

人血清IgG溶于50 mM NH₄HCO₃（pH 8.2）形成终浓度为1 mg/mL的蛋白溶液，沸水浴中加热10 min，加入1 M 二硫苏糖醇（DTT）溶液，使DTT终浓度为10 mM，在60^oC下变性1 h，还原蛋白质中的二硫键，接着加入碘代乙酰胺（IAA），使IAA终浓度为20 mM，于室温在暗处震荡反应30 min，按照酶/蛋白=1:25的比例加入胰蛋白酶，37^oC酶解20 h，酶解液置于-20^oC冰箱中保存备用。

2、样品吸附与洗涤

对人血清IgG蛋白酶解物的富集：500 ug材料经上样液（乙腈/水/三氟乙酸 = 88:11.5:0.5, v/v/v）洗涤后分散于200 uL上样液中，加入1 ug人血清IgG蛋白酶解物，于室温下轻微震荡吸附30 min后，磁分离，弃上清液，将材料用上样液洗涤三次，每次200 uL。

3、样品的洗脱与检测

向吸附后的材料中加入10 uL洗脱液（乙腈/水/三氟乙酸= 30:69.9:0.1, v/v/v），室温震荡洗脱10 min后磁分离，取上清液直接用基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析。MALDI-TOF MS分析步骤：取0.5 uL富集后的糖基化肽段点靶，待干燥后，点0.5 uL 2,5-二羟基苯甲酸（DHB）基质（含70% 乙腈和0.1% H₃PO₄的12.5 mg/mL DHB溶液），待干燥后送入AB Sciex 5800 MALDI-TOF/TOF质谱仪（AB Sciex, CA）中进行分析，质谱数据在正离子模式下采集（激光脉冲波长为355 nm）。

检测结果参见图2，(a)是对300 fmol人血清IgG酶解物直接分析得到的质谱图，(b)是对人血清IgG酶解物富集后进行分析（约15 fmol）得到的质谱图。对人血清IgG酶解物进行直接分析，非糖基化肽段几乎占据了整张质谱图，由于非糖基化肽段的抑制，仅有两条糖基化肽段以极低的信噪比被检测到。用合成的材料进行富集后，几乎检测不到非糖基化肽段，而糖基化肽段在质谱图中占主要地位，并且信号有了极大的增强，一共有21个糖基化肽段峰（表1）被鉴定到。这是由于亲水性分子中大量的-NH₂和-OH亲水基团的存在，使材料具有良好的亲水性，在富集过程中，可以利用糖基化肽段和非糖基化肽段的亲水性差异实现糖基化肽段的分离富集。

表1

应用例2

本实例以采用上述制备方法制得的材料对复杂生物样品酶解物中的糖基化肽段进行富集，其具体步骤如下：

1、样品溶液的制备

HeLa细胞培养于RPMI-1640介质，当细胞密度达到80%时收集细胞进行后续蛋白质提取操作。细胞经胰酶消化，离心收集细胞沉淀；磷酸缓冲盐（PBS）清洗细胞3次；吸干残留的PBS后将细胞均匀分散于冰的裂解液（8 M urea, 50 mM Tris-HCl, 65 mM DTT, 1% Triton X-100 (v/v), 1% protease cocktail (v/v), 1 mM EDGA, 1 mM EDTA, and 1 mM PMSF, pH 7.4）中，冰浴超声、离心、取上清。向上清液中加入冰的蛋白沉淀液（丙酮/乙醇/乙酸 = 50/50/0.1，v/v/v），-20^oC过夜沉淀；15 000g离心30 min, 离心管中的蛋白分别用丙酮和75%乙醇进行洗涤后冷冻干燥。干燥后的蛋白提取物复溶于含8 M尿素和100 mM NH₄HCO₃的缓冲液中（pH 8.2），采用Bradford试剂盒测定蛋白浓度。蛋白经10 mM DTT于60^oC反应1 h打开二硫键，加入20 mM IAA在室温于暗处反应30 min后用100 mM NH₄HCO₃缓冲液（pH 8.2）将蛋白稀释至1 ug/uL。取上述浓度的蛋白溶液，按酶/蛋白=1:25的比例加入胰蛋白酶，37^oC酶解20 h，酶解液用C₁₈ SPE除盐，冻干后置于-20^oC冰箱中保存备用。

2、样品吸附与洗涤

取1 mg材料，用上样液（同实施例4）洗涤备用。将150 ug HeLa细胞提取蛋白酶解物溶于400 uL上样液后将其转入材料中，室温下轻微震荡吸附30 min后，磁分离，弃上清，将材料用上清液洗涤。

3、样品的洗脱与检测

向吸附后的材料中加入洗脱液，室温震荡洗脱10 min后磁分离，取上清。上清液冻干后复溶于150 uL 10 mM NH₄HCO₃（pH 7.5）溶液中，加入100 U糖苷酶，37^oC酶解16 h，冻干，复溶于0.1% FA后用于HPLC-MS/MS分析。

检测结果：共鉴定到283个N-糖基化位点（含N-X-T/S结构，X是除脯氨酸以外的任何氨基酸），对应于273条糖基化肽段，匹配于175个糖基化蛋白质。结果表明制备的亲水磁性纳米材料吸附性良好，对复杂生物样品中糖肽的富集具有较大的潜力。

Claims

1.一种用于富集糖基化肽段的亲水磁性纳米材料的制备方法，其特征在于采用“一锅法”制备了亲水磁性纳米材料，制备流程如下：

3）转入100 mL反应釜中150～250^oC水热反应14～24 h；

2.根据权利要求1所述的亲水磁性纳米材料的制备方法，其特征在于选择带有-NH₂或-OH等极性基团的亲水性糖类化合物壳聚糖、纤维素、琼脂糖等为原材料。

3.根据权利要求1所述的亲水磁性纳米材料制备方法，其特征在于亲水性糖类化合物与四氧化三铁配伍。