CN106732474B - 一种磁性纳米材料及其制备方法和在富集分析糖基化肽段中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术与纳米材料技术领域，具体为半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米材料及其制备方法和在富集分析糖基化肽段中的应用。本发明将半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米材料与糖基化肽段溶液在乙腈/水/三氟乙酸混合液中混合，在酶解仪中孵育；在外磁场作用下分离纳米材料除去上清液，用乙腈/水/三氟乙酸混合液洗涤纳米材料；再用乙腈/水/甲酸混合液洗脱材料上富集的糖基化肽段，结合质谱分析鉴定。本发明操作简单迅速，材料可重复利用成本低廉，具有较高灵敏度和较好选择性，十分适用于糖基化肽段的富集分析，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术与纳米材料技术领域，具体涉及一种磁性纳米材料及其制备方法和在糖基化肽段富集与鉴定中应用。
背景技术
蛋白质的糖基化是生命过程中最重要的翻译后修饰之一，大约有超过50%的人类蛋白质发生了糖基化修饰，在细胞信号传导、分子识别、免疫反应等生命活动中起到了重要的作用。因此，蛋白质糖基化的全面研究对于理解人类的生命过程和疾病机理非常关键。但是目前的糖蛋白研究仍然遇到许多困难。由于发生糖基化修饰的蛋白质是低丰度蛋白，而且离子化效率很低，所以极易受到丰度高、离子化效率高的非糖蛋白的干扰，使得糖蛋白质谱检测困难、灵敏度很低。因此，在进行质谱分析鉴定之前，对于样品中的糖蛋白或糖基化肽段进行预富集处理非常必要。
近年来发展了不少分离富集糖蛋白或糖肽的方法，其中亲水相互作用色谱法（HILIC）由于广泛的糖链特异性、富集条件简便温和、重现性高、质谱兼容性好而得到广泛应用。半胱胺盐酸盐具有亲水性氨基和巯基，对于糖肽有亲水相互作用，可以用于HILIC材料的修饰。磁性微球由于快速分离、良好的生物相容性等特点在蛋白质富集分离领域有广泛应用。
通过文献调研可知，目前还没有半胱胺盐酸盐直接修饰的四氧化三铁磁性纳米材料应用在糖肽的富集研究中。结合四氧化三铁磁性纳米材料快速分离的特点和半胱胺对糖肽亲水相互作用的特点，本发明首次设计合成了半胱胺盐酸盐直接修饰的四氧化三铁磁性纳米材料，应用于糖基化肽段的分离富集。首先用传统水热法合成四氧化三铁磁性纳米颗粒，再利用铁-硫相互作用在磁球表面充分修饰了亲水性的半胱胺盐酸盐，形成了亲水性磁性纳米材料，合成方法十分简便。所合成的材料对于糖基化肽段具有选择性富集作用，大大提高了糖肽的质谱检测灵敏度，对于糖基化肽段的检测限可达0.25 fmol/μL，检测绝对量达到1ng。
发明内容
本发明目的在于提供一种磁性纳米材料及其制备方法和在富集分析糖基化肽段中的应用。
本发明所提出的磁性纳米材料，是一种半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米材料，具有快速磁性分离能力以及优异的亲水性，制备的具体步骤如下：
（1）称取六水合氯化铁分散于乙二醇中，磁力搅拌混匀，往该混合液中加入无水醋酸钠，继续搅拌混均，超声分散0.5-1小时后，把混合液转移至聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，180-220℃条件下反应14-16小时，随后用去离子水和无水乙醇充分洗涤，在40-60℃下真空干燥，得到四氧化三铁磁性纳米颗粒；
（2）称取步骤（1）所得四氧化三铁磁性纳米颗粒，分散到磷酸盐缓冲液中，再加入半胱胺盐酸盐，超声分散1-10分钟，30-60℃水浴下机械搅拌1-5小时，在外磁场作用下将产物从反应溶液中磁性分离，用去离子水充分洗涤，在40-60℃下真空干燥，得到半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米材料。
本发明中，步骤（1）中六水合氯化铁、乙二醇和无水醋酸钠的比为（1-5）g：（50-300）mL：（2.5-15）g。
本发明中，步骤（2）中四氧化三铁磁性纳米颗粒、磷酸盐缓冲液和半胱胺盐酸盐的比为（1-50）mg：（1-120）mL：（3-200）mg。
由上述制备方法得到的半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米材料，具有快速磁性分离能力以及优异的亲水性，可用于富集分析糖基化肽段，具体步骤为：
将上述磁性纳米材料与糖基化肽段溶液加入到一定比例的乙腈/水/三氟乙酸混合液中混合，在酶解仪中孵育；其中，乙腈/水/三氟乙酸的比例范围为(65-90)%/(34.5-10)%/(0-0.5)%。
在外磁场作用下分离磁性纳米材料；然后用一定比例的乙腈/水/三氟乙酸混合液洗涤纳米材料；再用一定比例的乙腈/水/甲酸混合液洗脱材料；其中，乙腈/水/三氟乙酸混合液中各种组分的比例范围为(65-90)%/(34.5-10)%/(0-0.5)%；乙腈/水/甲酸混合液中各种组分的比例范围为 (5-45)%/(54.5-95)%/(0-0.5)%。
取1-2.5μL洗脱液直接在MALDI-TOF MS的进样靶板上点样，干燥后再点加1-2μL浓度为20mg/mL的2，5-二羟基苯甲酸溶液，形成基质结晶，进行质谱分析。
本发明的有益效果在于：所提供的半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米材料合成方法十分简便，材料具有磁性方便快速分离，材料可以多次重复利用成本低廉，对于糖基化肽段具有较好的选择性富集作用，大大提高了糖基化肽段的质谱检测灵敏度，对于糖基化肽段的检测限可达0.25 fmol/μL，检测绝对量达到1ng。
本方法操作简单，灵敏迅速，成本低廉，被富集糖肽质谱检测信号大大提高，具有较好选择性和较高灵敏度，十分适用于复杂生物样品中的糖基化肽段的分析鉴定。
附图说明
图1为实施例1的透射电子显微镜照片，其中，(a)为四氧化三铁磁性纳米颗粒的照片，(b)为半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒的照片。
图2为实施例1的半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒的扫描电子显微镜照片。
图3为实施例1的半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒的元素分析EDX谱图。
图4为实施例1的红外光谱图，其中，(a)为四氧化三铁磁性纳米颗粒的红外光谱图，(b)为半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒的红外光谱图。
图5为实施例2中125fmol/μL的HRP酶解液经过半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米材料富集前后的MALDI-TOF MS质谱图。其中，(a)为125fmol/μL的HRP酶解液富集前原液的质谱图，(b)为125fmol/μL的HRP酶解液富集后洗脱液的质谱图。
图6为实施例2中更低浓度的HRP酶解液经过半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米材料富集前后的MALDI-TOF MS质谱图。其中，(a)为2.5fmol/μL的HRP酶解液富集前原液的质谱图，(b)为2.5fmol/μL的HRP酶解液富集后洗脱液的质谱图，(c)为0.25fmol/μL的HRP酶解液富集前原液的质谱图，(d)为0.25fmol/μL的HRP酶解液富集后洗脱液的质谱图。
图7为实施例3中半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米材料重复多次富集HRP酶解液的MALDI-TOF MS质谱图。其中，(a)为材料第一次富集125fmol/μL HRP酶解液的质谱图，(b)为材料经充分洗脱后第三次富集125fmol/μL HRP酶解液的质谱图，(c)为材料经充分洗脱后第五次富集125fmol/μL HRP酶解液的质谱图。
图8为实施例4中不同质量比HRP和牛血清蛋白BSA酶解液的混合溶液经过半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米材料富集前后的MALDI-TOF MS质谱图。其中，(a)为HRP和BSA酶解液质量比为1：2的混合液富集前的质谱图，(b)为HRP和BSA酶解液质量比为1：2的混合液富集后洗脱液的质谱图，(c)为HRP和BSA酶解液质量比为1：100的混合液富集前的质谱图，(d)为HRP和BSA酶解液质量比为1：100的混合液富集后洗脱液的质谱图。
表1为MALDI-TOF MS鉴定到的标准蛋白HRP的胰蛋白酶酶解肽段中糖基化肽段的具体信息列表。
具体实施方式
下面的实施实例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。
实施例1：一种半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米材料的合成。
（1）称取2.6g六水合氯化铁分散于145mL乙二醇中，磁力搅拌混匀，往该混合液中加入7.3g无水醋酸钠，继续搅拌混均，再用超声分散0.5小时后，把混合液转移至聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，200℃条件下反应16小时，随后用去离子水和无水乙醇充分洗涤，在50℃下真空干燥，得到四氧化三铁磁性纳米颗粒。
（2）称取22mg步骤（1）所得四氧化三铁磁性纳米颗粒，分散到30mL 0.01M的磷酸盐缓冲液中，再加入88mg半胱胺盐酸盐，超声分散5分钟，60℃水浴下机械搅拌3小时，在外磁场作用下将产物从反应溶液中磁性分离，用去离子水充分洗涤，在50℃下真空干燥，得到半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米材料。
图1为透射电子显微镜照片，透射电镜型号为JEOL-1400，将纯化后的磁性纳米颗粒的乙醇分散液滴在覆有碳膜的铜网上，干燥后进行透射电子显微镜观察并拍照。其中(a)为四氧化三铁磁性纳米颗粒的照片，(b)为半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒的照片，可以看到磁球尺寸在200nm左右，分散均匀，大小比较均一，小分子半胱胺盐酸盐修饰前后磁球形貌没有明显变化。
图2为半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒的扫描电子显微镜照片，扫描电镜型号为Phenom Prox，将材料固定在载物台的导电胶上，喷金后进行观察并拍照。由图片可以看出所合成的材料形貌为微球颗粒，分散均匀，大小均一。
图3为半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒的元素分析EDX谱图，可以看出材料表面有铁、氧、碳、硫元素的分布，表明半胱胺盐酸盐成功修饰在材料表面。
图4为红外光谱图，红外光谱仪为Thermo Fisher公司的Nicolet傅里叶光谱仪，将样品干燥粉末与少量溴化钾粉末混合研磨压片，将样品放入样品槽中进行测试。其中(a)为四氧化三铁磁性纳米颗粒的红外光谱图，(b)为半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米颗粒的红外光谱图。可以看到，570cm-1的峰是Fe-O-Fe的特征峰，表明磁球四氧化三铁的成功合成。（b）与（a）相比，570 cm-1的峰明显减弱，表明有一部分Fe-O-Fe中的Fe与S发生相互作用，（b）中3418 cm-1 、1632cm-1的峰是NH2的吸收峰，2923 cm-1 、2852cm-1的峰是CH2对称和不对称伸缩振动峰，这些都表明半胱胺盐酸盐通过Fe-S相互作用成功修饰在材料表面，合成了亲水性目标材料。
实施例2：将实施例1得到的半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米材料应用于低浓度辣根过氧化物酶HRP酶解液的富集与MALDI-TOF MS检测。
（1）准备标准蛋白酶解液：准确称取1mg HRP标准蛋白，用25 mM碳酸氢铵溶液配成浓度为10mg/mL的标准蛋白溶液，煮沸5分钟；再用25mM碳酸氢铵溶液稀释使HRP终浓度为1mg/mL，按照质量比为1:40的胰蛋白酶与标准蛋白的比例，加入胰蛋白酶(trypsin)，37°C孵育16小时，可以得到1mg/mL的HRP胰蛋白酶解液。
（2）样品的富集：配制体积分数为85%乙腈/14.9%水/0.1%三氟乙酸的上样液，用上样液配制10 mg/mL半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米材料的分散液。在0.6mL的离心管内加入0.25μg HRP酶解液和90μL上样液，混匀后加入10μL的10 mg/mL的材料溶液，37℃下震荡富集15分钟；在磁铁作用下分离材料，吸去上清液，用上样液洗涤材料三遍，然后加入10μL体积分数为30%乙腈/69.9%水/0.1%甲酸的洗脱液，37℃震荡洗脱30分钟，磁性分离材料，吸出洗脱液备用。
用上样液逐步稀释HRP酶解液至更低浓度，按照以上步骤加入材料富集洗脱，洗脱液备用。
（3）点靶：取1μL步骤（2）所述的洗脱液点到MALDI-TOF MS进样靶板上，干燥后再点加1 μL浓度为20mg/mL的2,5-二羟基苯甲酸（DHB）溶液于该液滴上，形成基质结晶，干燥后再进行质谱分析。
（4）利用质谱分析以半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米材料富集得到的糖基化肽段并与富集前的原液质谱图作对比。
1mg/mL的HRP酶解液在材料富集的反应体系中终浓度为125fmol/μL，经过半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米材料富集后，用Applied Biosystems公司的5800MALDI-TOF MS质谱仪进行检测。图5为125fmol/μL的HRP酶解液在材料富集前后的质谱图，(a)为富集前原液的质谱图，(b)为富集后洗脱液的质谱图；表1为MALDI-TOF MS鉴定到的标准蛋白HRP的胰蛋白酶酶解肽段中糖基化肽段的具体信息列表。从质谱图(a)中可以看出，富集前的HRP酶解液原液中只检测到8条糖基化肽段（峰标号分别为1，2，6，11，14，17，19，21），并且肽段信号的强度很弱。经过材料富集之后，洗脱液中检测出21条糖基化肽段（具体信息见图5(b)和表1），与富集前原液相比，不仅糖肽数量显著增加而且肽段信号的强度大大增强。可以证明，所合成的半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米材料对于糖基化肽段的确有显著的富集效果。
图6为更低浓度的HRP酶解液在材料富集前后的质谱图，(a)为2.5fmol/μL的HRP酶解液富集前原液的质谱图，(b)为2.5fmol/μL的HRP酶解液富集后洗脱液的质谱图，(c)为0.25fmol/μL的HRP酶解液富集前原液的质谱图，(d)为0.25fmol/μL的HRP酶解液富集后洗脱液的质谱图。2.5fmol/μL的HRP酶解液在富集前没有检测出糖基化肽段，经材料富集后检测出9条糖肽（峰标号为6，10，11，12，14，17，18，19，21）而且糖肽峰的信号强度大大增加；当HRP酶解液稀释到0.25fmol/μL时，富集前检测不到糖基化肽段，经材料富集后依然可以检测出2条糖肽（峰标号为14，21）。因此，所合成的磁性纳米材料对于糖基化肽段的检测限可达到0.25fmol/μL，检测绝对量达到1ng。
实施例3：将实施例1得到的半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米材料经多次富集洗脱，再次应用于低浓度辣根过氧化物酶HRP酶解液的富集与MALDI-TOF MS检测。
（1）准备标准蛋白酶解液：准确称取1mg HRP标准蛋白，用25 mM碳酸氢铵溶液配成浓度为10mg/mL的标准蛋白溶液，煮沸5分钟；再用25mM碳酸氢铵溶液稀释使HRP终浓度为1mg/mL，按照质量比为1:40的胰蛋白酶与标准蛋白的比例，加入胰蛋白酶(trypsin)，37°C孵育16小时，可以得到1mg/mL的HRP胰蛋白酶解液。
（2）样品的富集：配制体积分数为85%乙腈/14.9%水/0.1%三氟乙酸的上样液，用上样液配制10 mg/mL半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米材料的分散液。在0.6mL的离心管内加入0.25μg HRP酶解液和90μL上样液，混匀后加入10μL的10 mg/mL的材料溶液，37℃下震荡富集15分钟；在磁铁作用下分离材料，吸去上清液，用上样液洗涤材料三遍，然后加入10μL体积分数为30%乙腈/69.9%水/0.1%甲酸的洗脱液，37℃震荡洗脱30分钟，磁性分离材料，吸出洗脱液备用。
（3）材料充分洗脱再富集：步骤（2）中的材料再加入30ul体积分数为30%乙腈/69.9%水/0.1%甲酸的洗脱液充分洗脱，再次按照步骤（2）对HRP酶解液进行富集，洗脱液备用。
多次重复以上步骤，洗脱液备用。
（4）点靶：取1μL步骤（2）、步骤（3）所述的洗脱液点到MALDI-TOF MS进样靶板上，干燥后再点加1 μL浓度为20mg/mL的2,5-二羟基苯甲酸（DHB）溶液于该液滴上，形成基质结晶，干燥后再进行质谱分析。
（5）利用质谱分析半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米材料重复多次富集得到的糖基化肽段。
图7为半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米材料重复多次富集HRP酶解液的MALDI-TOF MS质谱图。其中，(a)为材料第一次富集125fmol/μL HRP酶解液的质谱图，(b)为材料经充分洗脱第三次富集125fmol/μL HRP酶解液的质谱图，(c)为材料经充分洗脱第五次富集125fmol/μL HRP酶解液的质谱图。由质谱图可以看出，材料第三次和第五次重复富集的HRP酶解液无论是糖肽数量还是信号强度都和第一次富集效果相似，材料经多次富集洗脱过程的重复性较好，合成一批材料可以多次重复利用，成本低廉。
实施例4：将实施例1得到的半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米材料用于HRP酶解液和牛血清白蛋白（BSA）酶解液的混合溶液的富集与MALDI-TOF MS检测。
（1）准备标准蛋白酶解液：准确称取1mg HRP标准蛋白，用25 mM碳酸氢铵溶液配成浓度为10mg/mL的标准蛋白溶液，煮沸5分钟；再用25mM碳酸氢铵溶液稀释使HRP终浓度为1mg/mL，按照质量比为1:40的胰蛋白酶与标准蛋白的比例，加入胰蛋白酶(trypsin)，37°C孵育16小时，可以得到1mg/mL的HRP胰蛋白酶解液。同样方法酶解得到5mg/mL的BSA胰蛋白酶解液。
（2）样品的富集：配制体积分数为85%乙腈/14.9%水/0.1%三氟乙酸的上样液，用上样液配制10 mg/mL半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米材料的分散液。在0.6mL的离心管内加入0.25μg HRP酶解液，分别按照HRP和BSA的质量比为1:2和1:100加入BSA酶解液，随后加入上样液使总体积为40μL，混匀后加入10μL的10 mg/mL的材料溶液，37℃下震荡富集15分钟；在磁铁作用下分离材料，吸去上清液，用上样液洗涤材料三遍，然后加入5μL体积分数为30%乙腈/69.9%水/0.1%甲酸的洗脱液，37℃震荡洗脱30分钟，磁性分离材料，吸出洗脱液备用。
（3）点靶：取1μL步骤（2）所述的洗脱液点到MALDI-TOF MS进样靶板上，干燥后再点加1 μL浓度为20mg/mL的2,5-二羟基苯甲酸（DHB）溶液于该液滴上，形成基质结晶，干燥后再进行质谱分析。
（4）利用质谱分析以半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米材料富集混合酶解液得到的糖基化肽段并与富集前的原液质谱图作对比。
图8为不同质量比HRP和牛血清蛋白BSA酶解液的混合溶液经过半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米材料富集前后的MALDI-TOF MS质谱图。其中，(a)为HRP和BSA酶解液质量比为1：2的混合液富集前的质谱图，(b)为HRP和BSA酶解液质量比为1：2的混合液富集后洗脱液的质谱图，(c)为HRP和BSA酶解液质量比为1：100的混合液富集前的质谱图，(d)为HRP和BSA酶解液质量比为1：100的混合液富集后洗脱液的质谱图。图(a)和图(c)的混合酶解液原液质谱图中，大量的非糖基化肽段的峰严重干扰了糖肽的检测，经材料富集分离之后，图(b)和图(d)中非糖基化肽段大大减少，糖肽被选择性富集出来。HRP和BSA酶解液质量比为1：2时，富集前的原液中仅检测出4条糖肽，而且被非糖肽的信号大大压制；经材料富集之后有17条糖肽被检测出来，信号大大增强，非糖肽信号相对很微弱。甚至在HRP和BSA酶解液质量比为1：100时，即使非糖肽的干扰大大增强，仍然可以检测出7条糖肽，大部分非糖肽被有效除去。以上可以证明所合成的亲水性磁性纳米材料对于糖肽具有较好的选择性富集效果，在背景复杂的实际样品中具有很好的应用前景。
表1MALDI-TOF MS鉴定到的标准蛋白HRP的胰蛋白酶酶解肽段中糖肽的具体信息
Fuc为α-L-岩藻糖，Xyl为α-D-木糖，Man为α-D-甘露糖，GlcNAc为N-乙酰氨基葡萄糖。
Claims (7)
1.一种半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米材料的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）称取六水合氯化铁分散于乙二醇中，磁力搅拌混匀，往该混合液中加入无水醋酸钠，继续搅拌混均，超声分散0.5-1小时后，把混合液转移至聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，180-220℃条件下反应14-16小时，随后用去离子水和无水乙醇充分洗涤，在40-60℃下真空干燥，得到四氧化三铁磁性纳米颗粒；
（2）称取步骤（1）所得的四氧化三铁磁性纳米颗粒，分散到磷酸盐缓冲液中，再加入半胱胺盐酸盐，超声分散1-10分钟，30-60℃水浴下机械搅拌1-5小时，在外磁场作用下将产物从反应溶液中磁性分离，用去离子水充分洗涤，在40-60℃下真空干燥，得到半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米材料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（1）中六水合氯化铁、乙二醇和无水醋酸钠的比为（1-5）g：（50-300）mL：（2.5-15）g。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（2）中四氧化三铁磁性纳米颗粒、磷酸盐缓冲液和半胱胺盐酸盐的比为（1-50）mg：（1-120）mL：（3-200）mg。
4.一种由权利要求1-3之一所述制备方法制备得到的半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米材料。
5.如权利要求4所述的半胱胺盐酸盐修饰的四氧化三铁磁性纳米材料在富集分析糖基化肽段中的应用，其特征在于，具体步骤如下：
（1）将磁性纳米材料与糖基化肽段溶液加入到乙腈/水/三氟乙酸混合液中混合，在酶解仪中孵育；
（2）在外磁场作用下分离纳米材料，然后用乙腈/水/三氟乙酸混合液洗涤纳米材料；再用乙腈/水/甲酸混合液洗脱材料；
（3）取1-2.5μL洗脱液直接在MALDI-TOF MS的进样靶板上点样，干燥后再点加1-2μL浓度为20mg/mL的2，5-二羟基苯甲酸溶液，形成基质结晶，进行质谱分析。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤（1）中所述的乙腈/水/三氟乙酸混合液中各种组分的体积分数范围为(65-90)%/( 10-34.5)%/(0-0.5)%。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤（2）中所述的乙腈/水/三氟乙酸混合液中各种组分的体积分数范围为(65-90)%/(10-34.5)%/(0-0.5)%；所述的乙腈/水/甲酸混合液中各种组分的体积分数范围为(5-45)%/(54.5-95)%/(0-0.5)%。
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