CN104667899A - 一种金属离子固定化亲和磁球的制备方法及应用 - Google Patents

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张磊
陈雅静
高小迪
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本发明涉及一种金属离子固定化亲和磁球的制备方法及应用，以磁性无机物四氧化三铁为核制备的双层有机聚合物包裹的核-壳-壳结构的核壳材料，及其利用其与金属离子作用对特异性多肽或者蛋白的富集检测方法。利用高温水热反应制备得到磁性四氧化三铁，采用硅烷基化试剂3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯对磁球进行包裹，形成单层聚合物包裹的核壳结构磁球，进一步利用沉淀聚合反应得到含有双层有机聚合物包裹的核-壳-壳结构的磁球。对磁球表面进行修饰，得到以亚氨基乙二酸进行结构修饰的核-壳-壳结构磁球，进一步固定金属离子，形成亲和磁球。在本发明的制备材料中，具有很好的重复使用性，再生后对特异性多肽或蛋白依然具有较高的富集能力。

Description

一种金属离子固定化亲和磁球的制备方法及应用
【技术领域】
本发明涉及亲和磁球技术领域，具体地说，是一种金属离子固定化亲和磁球的制备方法及应用。
【背景技术】
1975年，Porath等利用亚氨基乙二酸(IDA)作为配体固定在以琼脂糖为基质的填料上利用IDA与过渡金属铜、镍、钴或锌离子的螯合作用，发展了一种IMAC(Immobilized Metal-ion affinity chromatography)方法，对表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白进行吸附纯化。这种利用螯合金属与特殊蛋白相互作用而对蛋白进行富集纯化的方法称为固定金属离子亲和色谱(IMAC)。
固定金属离子亲和色谱法对蛋白的富集能力的强弱与基体，配体和金属离子的种类有着重要的关系，配体中与金属离子作用位点及和特异性蛋白的结合能力直接影响着多肽或蛋白的富集效果。常用的基质有大孔硅胶，交联琼脂糖和交联葡聚糖以及有机聚合物TSK-gel G500PW。硅胶载体刚性好，分离效率高，但在高pH下易溶解，低pH下易产生硅羟基。TSK的机械强度介于硅胶和琼脂糖或葡聚糖之间，但与金属螯合配体结合不牢固，使用时金属离子易泄露。配体的作用是将金属离子固定在基质上，为此配体既含能与基质共价键合的活性基团如-N、-OH、-Cl等，又有能与金属离子配位的多个配位原子。常用的配体主要是亚氨基二乙酸，氮基三乙酸，N，N，N′-三(羧甲基)乙烯二胺等。固定金属离子通常为具有d层空价电子轨道的过渡金属如Cu2+、Ni2+、Co2+、Zn2+、Fe3+等，它们与配体形成可与蛋白质结合的金属螯合配体。
【发明内容】
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种以磁性无机物四氧化三铁为核，双层有机聚合物包裹的核-壳-壳结构的核壳材料，以及将其应用于对特异性多肽或蛋白进行富集检测的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种金属离子固定化亲和磁球的制备方法，其特征在于，其具体步骤为：
第一、2.0～3.0g的三氯化铁和90～110mL的乙二醇和7.0～7.5g的无水乙酸钠进行均匀混合，在150～250℃进行高温水解反应，得到四氧化三铁磁球；
第二、将200～250mg四氧化三铁磁球分散在体积比为1∶4～1∶6的乙醇和水的混合溶液中，逐滴加入0.3～0.5mL的3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯机械搅拌1～2天，得到聚合物包裹的磁球；
第三、将步骤二中得的聚合物包裹的磁球分散在40～50mL的乙腈中，加入200μL的烯丙基氯单体和300～350μL二甲基丙烯酸乙二醇酯的交联剂及10～15mg偶氮二异丁腈引发剂于90～100℃进行回流反应，得到以具有以四氧化三铁为核，双层有机聚合物包裹的核-壳-壳结构的磁球；
第四、将步骤三中得的双层有机聚合物包裹的核-壳-壳结构的磁球分散在40～50mL的1∶1～1∶5的三氯甲烷与三乙胺的混合溶液中，加入200～300mg的亚氨基乙二酸于70～90℃进行回流反应，得到以亚氨基乙二酸进行结构修饰的磁球；
第五、将步骤四中得到的亚氨基乙二酸进行结构修饰的磁球加入含有0.05～2mol/L的可溶性铜、镍、钛及其他重金属离子的溶液中，用氢氧化钠溶液将溶液pH值调整为6～9，在室温下实现金属离子的固定化，得到螯合金属离子的磁性微球。
一种特异性多肽或者蛋白的富集检测方法，其具体步骤为：
(1)将制得的螯合金属离子的磁球用水溶液进行清洗1～3次，去除游离的金属离子；
(2)将步骤(1)清洗后的螯合金属离子的磁球与0.4～0.6mg/L蛋白溶液例如牛血清白蛋白(BSA)和牛血红蛋白(BHb)进行混合1～2h，利用磁分离对含有组氨酸的多肽或者蛋白进行选择性富集和快速分离，实现对高丰度的多肽或蛋白进行去除和低丰度的多肽或蛋白的富集；
(3)将步骤(2)中吸附多肽或蛋白的磁球用0.2～0.4g/mL的咪唑溶液进行洗脱，用于检测或其他应用目的；
(4)可以利用紫外光谱进行检测，并计算磁球对特异性多肽或蛋白的吸附容量。
与现有技术相比，本发明的积极效果是：
本发明的制备的以四氧化三铁为核，双层有机聚合物包裹的核-壳-壳结构的核壳材料可以实现对牛血清白蛋白(BSA)和牛血红蛋白(BHb)的选择性富集，富集容量可以达到1000mg/g，而且可以利用材料的超顺磁性在5min内进行快速的分离。同时，利用此方法制备的材料具有很好的重复使用性，经过再生后对特异性多肽或蛋白依然具有较高的富集能力。
【附图说明】
图1是具有以磁性无机物四氧化三铁为核，双层有机聚合物包裹的核-壳-壳结构的核壳材料的傅里叶红外表征图(a，单层聚合物包裹的磁球；b，双层聚合物包裹的核-壳-壳结构的磁球)。
图2是具有以磁性无机物四氧化三铁为核，双层有机聚合物包裹的核-壳-壳结构的核壳材料形貌图；
图2a为SEM图；
图2b为TEM图；
图3是具有以磁性无机物四氧化三铁为核，双层有机聚合物包裹的核-壳-壳结构的核壳材料的热解重量分析表征图(a，四氧化三铁磁球；b，双层聚合物包裹的核-壳-壳结构的磁球)。
【具体实施方式】
以下提供本发明一种金属离子固定化亲和磁球的制备方法及应用的具体实施方式。
实施例1
取2.7g的六水合三氯化铁溶于100mL的乙二醇溶液，同时加入7.2g的无水乙酸钠搅拌混合均匀，将混合溶液转入高压反应釜中于200℃进行高温水热反应8h，得到四氧化三铁磁球。
将200mg的磁球超声分散在10mL的水，40mL的乙醇和1.5mL的氨水混合溶液中，加入0.3mL的3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯与60℃下机械搅拌24h，得到聚合物包裹的磁球。
将50mg聚合物包裹的磁球分散在40mL的乙腈中，加入200μL的二甲基丙烯酸乙二醇酯和10mg的偶氮二异丁腈混合均匀，逐滴加入300μL的烯丙基氯单体，于90℃进行回流反应，得到以具有以四氧化三铁为核，双层有机聚合物包裹的核-壳-壳结构的磁球。
将200mg双层有机聚合物包裹的磁球分散在50mL的三氯甲烷和50mL的三乙胺的混合溶液中，加入200mg的亚氨基乙二酸于90℃进行回流反应，得到以亚氨基乙二酸进行结构修饰的磁球。
将亚氨基乙二酸修饰的磁球加入含有2mol/L的硫酸镍溶液中，用氢氧化钠溶液将溶液pH值调整为7，在室温下实现金属离子的固定化，得到螯合金属离子的磁性微球。
将螯合有金属Ni离子的磁球与0.4mg/L牛血红蛋白(BHb)溶液进行混合1h，利用永久磁铁将吸附有BHb的磁球进行分离，去除上清液，移去磁铁，用0.2g/mL的咪唑溶液进行洗脱，利用磁铁进行磁分离，得到洗脱液，利用紫外分光光度计在406nm处检测，计算吸附容量。
图1是具有以磁性无机物四氧化三铁为核，双层有机聚合物包裹的核-壳-壳结构的核壳材料的傅里叶红外表征图。(a，单层聚合物包裹的磁球；b，双层聚合物包裹的核-壳-壳结构的磁球。)
图2是具有以磁性无机物四氧化三铁为核，双层有机聚合物包裹的核-壳-壳结构的核壳材料形貌图(a(SEM)和b(TEM))。
图3是具有以磁性无机物四氧化三铁为核，双层有机聚合物包裹的核-壳-壳结构的核壳材料的热解重量分析表征图。(a，四氧化三铁磁球；b，双层聚合物包裹的核-壳-壳结构的磁球)。
本方法制备的双层聚合物包裹的磁球基质为有机无机杂化材料，由于被有机高分子包裹，因此，具有较好的化学稳定性，耐酸碱能力强。由于其粒径小，具有较大的比表面积，因此，有较多的活性位点与亚氨基二乙酸配体结合，对金属螯合离子有很强的作用能力，能很好的与特异性蛋白相结合，具有较高的富集容量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。

Claims (2)

1.一种金属离子固定化亲和磁球的制备方法，其特征在于，其具体步骤为：
第一、2.0～3.0g的三氯化铁和90～110mL的乙二醇和7.0～7.5g的无水乙酸钠进行均匀混合，在150～250℃进行高温水解反应，得到四氧化三铁磁球；
第二、将200～250mg四氧化三铁磁球分散在体积比为1∶4～1∶6的乙醇和水的混合溶液中，逐滴加入0.3～0.5mL的3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯机械搅拌1～2天，得到聚合物包裹的磁球；
第三、将步骤二中得的聚合物包裹的磁球分散在40～50mL的乙腈中，加入200μL的烯丙基氯单体和300～350μL二甲基丙烯酸乙二醇酯的交联剂及10～15mg偶氮二异丁腈引发剂于90～100℃进行回流反应，得到以具有以四氧化三铁为核，双层有机聚合物包裹的核-壳-壳结构的磁球；
第四、将步骤三中得的双层有机聚合物包裹的核-壳-壳结构的磁球分散在40～50mL的1∶1～1∶5的三氯甲烷与三乙胺的混合溶液中，加入200～300mg的亚氨基乙二酸于70～90℃进行回流反应，得到以亚氨基乙二酸进行结构修饰的磁球；
第五、将步骤四中得到的亚氨基乙二酸进行结构修饰的磁球加入含有0.05～2mol/L的可溶性铜、镍、钛离子溶液中，用氢氧化钠溶液将溶液pH值调整为6～9，在室温下实现金属离子的固定化，得到螯合金属离子的磁性微球。
2.一种特异性多肽或者蛋白的富集检测方法，其特征在于，其具体步骤为：
(1)将制得的螯合金属离子的磁球用水溶液进行清洗1～3次，去除游离的金属离子；
(2)将步骤(1)清洗后的螯合金属离子的磁球与0.4～0.6mg/L蛋白质溶液进行混合1～2h，利用磁分离对与金属离子特异性作用的多肽或者蛋白进行选择性富集和快速分离，实现对高丰度的多肽或蛋白进行去除和低丰度的多肽或蛋白的富集；
(3)将步骤(2)中吸附多肽或蛋白的磁球用0.2～0.4g/mL的咪唑溶液进行洗脱，用于检测。
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