CN110215901B - 一种提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠及其制备方法,该提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠,包括纳米四氧化三铁磁核;所述纳米四氧化三铁磁核的表面包裹有二氧化硅;所述二氧化硅的表面修饰有用于螯合金属离子的配体;所述配体由硅烷偶联剂和氯乙酸钠通过亲核取代反应键合形成。本发明的提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠以超顺磁性的纳米四氧化三铁为内核,在其表面包裹一层二氧化硅,然后,采用由硅烷偶联剂和氯乙酸钠形成的配体对二氧化硅的表面进行修饰,使之可以螯合金属离子,通过重组蛋白表面组氨酸残基与金属离子之间强烈的配位作用高效率提取目标蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域,特别涉及一种提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠及其制备方法。
背景技术
蛋白质作为一类重要的生物大分子,实现蛋白质的高效分离纯化是对其结构与功能研究以及实现其应用的基础。为获得大量具有活性的天然蛋白,常常通过转基因技术改造微生物,使其高表达目标蛋白,与此同时,从成分复杂的细胞裂解液中高效精确的实现对目标蛋白的分离纯化始终是生命学科的重要技术。
常规蛋白质的分离提取技术通常建立在蛋白质在溶解性、表面所带电荷、分子大小以及疏水性上的差异。从而发展出包括盐析法、等电点沉淀法和有机溶剂沉淀法在内的粗分离方法以及包括凝胶层析、亲和层析、离子交换层析和吸附层析在内的精细分离方法。前者操作简便,处理量大,但往往存在分辨率过低,无法有效分离目标蛋白以及杂蛋白的问题。后者则是价格昂贵,对仪器的要求较高,处理量少,无法大规模应用。因此发展出具有较高选择性以及可大规模应用的分离技术是极具前景的。
基于金属螯合层析技术和功能化修饰磁珠发展起来的金属螯合磁珠兼具两者的特点,通过在磁珠表面修饰功能化基团使其能和金属离子通过强烈的配位作用结合在一起,再利用重组蛋白表面所带的标签蛋白与金属离子之间的配位作用即可高选择性的提取到目标蛋白。目前已有上市的商业化金属螯合磁珠,但大多蛋白质选择性和蛋白质提取效率较低。
发明内容
有鉴于此,本发明旨在提出一种提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠,以解决现有金属螯合磁珠的蛋白质选择性和蛋白质提取效率较低的问题。
为达到上述目的,本发明的技术方案是这样实现的:
一种提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠,包括纳米四氧化三铁磁核;所述纳米四氧化三铁磁核的表面包裹有二氧化硅;所述二氧化硅的表面修饰有用于螯合金属离子的配体;所述配体由硅烷偶联剂和氯乙酸钠通过亲核取代反应键合形成。
可选地,所述纳米四氧化三铁磁珠的平均粒径为50-200nm;所述提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠的平均粒径为150-250nm。
可选地,所述金属离子为Cu2+、Ni2+、Zn2+、Fe3+中的一种。
可选地,所述硅烷偶联剂为γ-氨丙基三乙氧基硅烷、N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷中的一种。
可选地,所述氯乙酸钠与所述硅烷偶联剂的摩尔比为2∶1~4∶1。
本发明的第二目的在于提供一种制备上述提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠的方法,该制备方法,包括以下步骤:
1)纳米四氧化三铁磁核的制备:将Fe(NH4)2·(SO4)2·6H2O、FeCl3·6H2O溶于除氧的去离子水,在氮气保护下,水浴加热、搅拌并用氨水调节pH至11,然后,升温陈化,磁分离,得到纳米四氧化三铁磁核;
2)二氧化硅磁珠的制备:将所述纳米四氧化三铁磁核配制成纳米四氧化三铁磁核溶液,向所述纳米四氧化三铁磁核溶液中加入乙醇和去离子水,混合均匀,然后,加入浓氨水,搅拌并滴加正硅酸乙酯,随后,加热、搅拌,进行二氧化硅包裹反应,待所述二氧化硅包裹反应结束后,磁分离,得到二氧化硅磁珠;
3)配体的制备:在冰浴条件下,向去离子水中滴加硅烷偶联剂,混合均匀,然后,加入氯乙酸钠溶液,升温并用NaOH调节pH至8-9,进行亲核取代反应,得到配体;
4)配体的修饰:用浓盐酸调节所述配体的pH至3,然后,加入所述二氧化硅磁珠,混合均匀,随后,加热,进行配体修饰反应,待所述配体修饰反应结束后,提纯,得到提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠。
可选地,所述步骤1)中所述水浴加热的加热温度为50-70℃,加热时间为0.5-2h,所述搅拌的搅拌速率为200-300r/min,所述升温陈化的陈化温度为70-90℃,陈化时间为1-2h。
可选地,所述步骤2)中所述二氧化硅包裹反应的加热反应温度为40-50℃,加热反应时间为12h。
可选地,所述步骤3)中所述亲核取代反应的升温温度为70-90℃,升温反应时间为6-8h。
可选地,所述步骤4)中所述配体修饰反应的加热反应温度为90-100℃,加热反应时间为2-3h。
相对于现有技术,本发明所述的提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠具有以下优势:
1、本发明的提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠以超顺磁性的纳米四氧化三铁为内核,在其表面包裹一层二氧化硅,然后,采用由硅烷偶联剂和氯乙酸钠形成的配体对二氧化硅的表面进行修饰,一方面,因二氧化硅的保护,有利于本发明提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠的重复使用,另一方面,因硅烷偶联剂和氯乙酸钠组成的具有较长长度的配体,使蛋白质与磁珠结合的空间位阻以及杂蛋白与磁核的结合降低,进而使其具有较高的蛋白质提取效率和提取选择性,同时配体中的硅烷偶联剂可通过硅氧键与二氧化硅结合,氯乙酸钠可通过氯乙酸钠中氧原子与金属离子形成稳定的配位键,使得蛋白质可以稳定的与本发明磁珠结合,从而进一步提高本发明磁珠的蛋白质提取效率。
2、本发明可采用逐步向外合成,依次包裹二氧化硅,连接硅烷偶联剂以及氯乙酸钠的方法制备提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠,也可采用先将硅烷偶联剂与氯乙酸钠反应形成配体,再连接到包裹有二氧化硅的四氧化三铁磁珠上的方法制备提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠,两种制备方法的反应条件温和,制备过程简单,可在一定程度上降低了制备成本,适用于大规模推广和应用。且后者将前者中的某些固液反应转化为液液反应,降低了本发明磁珠制备过程中反应的损耗,进而有利于进一步提高本发明磁珠的制备效率。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1为本发明实施例1和实施例2的提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠螯合镍离子后的粒径分布图;
图2为本发明实施例1的提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠螯合镍离子后分离纯化分蛋白的电泳图;
图3为本发明实施例2的提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠螯合镍离子后分离纯化分蛋白的电泳图;
图4为本发明实施例1的提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠螯合镍离子后纯化蛋白的电泳图;
图5为本发明实施例2的提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠螯合镍离子后纯化蛋白的电泳图;
图6为本发明对比例1的上市商业化磁珠纯化蛋白的电泳图;
图7为本发明实施例1、实施例2的提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠螯合镍离子后的XRD图谱;
图8为本发明实施例1、实施例2的提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠螯合镍离子后的磁滞回线。
具体实施方式
需要说明的是,在不冲突的情况下,本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面将结合附图和实施例来详细说明本发明。
实施例1
一种提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠,包括纳米四氧化三铁磁核;纳米四氧化三铁磁核的表面包裹有二氧化硅;二氧化硅的表面修饰有用于螯合金属离子的配体;配体由硅烷偶联剂和氯乙酸钠通过亲核取代反应键合形成,以下简称IDA磁珠。
其中,纳米四氧化三铁磁珠的平均粒径为111.8nm;硅烷偶联剂为γ-氨丙基三乙氧基硅烷(KH550)。
上述提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠的制备方法,具体包括以下步骤:
1)纳米四氧化三铁磁核的制备:将1.90g的Fe(NH4)2·(SO4)2·6H2O、2.33g的FeCl3·6H2O至三口烧瓶中,加入50mL除氧去离子水充分溶解,在氮气保护下,以60℃的加热温度水浴加热30min,水浴加热过程中以200-300r/min的搅拌速率搅拌并用45ml氨水调节pH至11,然后,升温至80℃陈化1h,磁吸附,除去多余反应液,用除氧去离子水洗至中性,再次磁吸附,除去多余水分,得到纳米四氧化三铁磁核,其中,除氧去离子水是通过将去离子水用微波炉煮沸10min后,密封冷却至室温制得,且为了保证所制纳米四氧化三铁磁核不被污染,向上述纳米四氧化三铁磁核中加入100mL除氧去离子水,配制成浓度为10mg/mL的纳米四氧化三铁磁核溶液,室温保存;
2)二氧化硅磁珠的制备:向20ml纳米四氧化三铁磁核溶液中加入160mL乙醇和40mL去离子水,其中,20ml纳米四氧化三铁磁核溶液中含有200mg纳米四氧化三铁磁核,超声分散15min,使其混合均匀,然后,加入6mL浓氨水,搅拌并滴加0.6mL正硅酸乙酯,随后,在40℃下加热并强力搅拌反应12h,使二氧化硅包裹反应充分进行,待二氧化硅包裹反应结束后,磁分离,除去多余反应液,待磁分离结束后,用乙醇洗涤2次,去离子水洗涤4次,再次磁吸附,除去多余水分,得到二氧化硅磁珠;
3)配体的制备:在冰浴条件下,向15mL去离子水中滴加0.842mL KH550(3.6mM,1eq),冰浴搅拌1h,使其混合均匀,然后,加入氯乙酸钠溶液,升温至80℃搅拌反应6h,使亲核取代反应充分进行,亲核取代反应过程中用5MNaOH调节pH至8-9,得到配体,其中,氯乙酸钠溶液是通过将1.26g氯乙酸钠(10.8mM,3eq)溶于10mL去离子水制得;
4)配体的修饰:用浓盐酸调节配体的pH至3,然后,加入200mg二氧化硅磁珠,超声分散10min,使其混合均匀,随后,在95℃下加热并搅拌反应2h,使配体修饰反应充分进行,待配体修饰反应结束后,磁吸附,除去多余反应液,用乙醇洗2遍,去离子水洗涤6遍,再次磁吸附,除去多余水分,得到平均粒径为203.5~205.7nm的提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠。
实施例2
一种提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠,包括纳米四氧化三铁磁核;纳米四氧化三铁磁核的表面包裹有二氧化硅;二氧化硅的表面修饰有用于螯合金属离子的配体;配体由硅烷偶联剂和氯乙酸钠通过亲核取代反应键合形成,以下简称TED磁珠。
其中,纳米四氧化三铁磁珠的平均粒径为111.8nm;硅烷偶联剂为N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷(KH900)。
上述提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠的制备方法,具体包括以下步骤:
1)纳米四氧化三铁磁核的制备:将1.90g的Fe(NH4)2·(SO4)2·6H2O、2.33g的FeCl3·6H2O至三口烧瓶中,加入50mL除氧去离子水充分溶解,在氮气保护下,以60℃的加热温度水浴加热30min,水浴加热过程中以200-300r/min的搅拌速率搅拌并用45ml氨水调节pH至11,然后,升温至80℃陈化1h,磁吸附,除去多余反应液,用除氧去离子水洗至中性,再次磁吸附,除去多余水分,得到纳米四氧化三铁磁核,其中,除氧去离子水是通过将去离子水用微波炉煮沸10min后,密封冷却至室温制得,且为了保证所制纳米四氧化三铁磁核不被污染,向上述纳米四氧化三铁磁核中加入100mL除氧去离子水,配制成浓度为10mg/mL的纳米四氧化三铁磁核溶液,室温保存;
2)二氧化硅磁珠的制备:向20ml纳米四氧化三铁磁核溶液中加入160mL乙醇和40mL去离子水,其中,20ml纳米四氧化三铁磁核溶液中含有200mg纳米四氧化三铁磁核,超声分散15min,使其混合均匀,然后,加入6mL浓氨水,搅拌并滴加0.6mL正硅酸乙酯,随后,在40℃下加热并强力搅拌反应12h,使二氧化硅包裹反应充分进行,待二氧化硅包裹反应结束后,磁分离,除去多余反应液,待磁分离结束后,用乙醇洗涤2次,去离子水洗涤4次,再次磁吸附,除去多余水分,得到二氧化硅磁珠;
3)配体的制备:在冰浴条件下,向15mL去离子水中滴加0.822mL KH900(3.6mM,1eq),冰浴搅拌1h,使其混合均匀,然后,加入氯乙酸钠溶液,升温至80℃搅拌反应6h,使亲核取代反应充分进行,亲核取代反应过程中用5MNaOH调节pH至8-9,得到配体,其中,氯乙酸钠溶液是通过将1.68g氯乙酸钠(10.8mM,3eq)溶于10mL去离子水制得;
4)配体的修饰:用浓盐酸调节配体的pH至3,然后,加入200mg二氧化硅磁珠,超声分散10min,使其混合均匀,随后,在95℃下加热并搅拌反应2h,使配体修饰反应充分进行,待配体修饰反应结束后,磁吸附,除去多余反应液,用乙醇洗2遍,去离子水洗涤6遍,再次磁吸附,除去多余水分,得到平均粒径为203.5~205.7nm的提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠。
实施例3
一种提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠,包括纳米四氧化三铁磁核;纳米四氧化三铁磁核的表面包裹有二氧化硅;二氧化硅的表面修饰有用于螯合金属离子的配体;配体由硅烷偶联剂和氯乙酸钠通过亲核取代反应键合形成。
其中,纳米四氧化三铁磁珠的平均粒径为111.8nm;硅烷偶联剂为γ-氨丙基三乙氧基硅烷(KH550)。
上述提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠的制备方法,具体包括以下步骤:
1)纳米四氧化三铁磁核的制备:将1.90g的Fe(NH4)2·(SO4)2·6H2O、2.33g的FeCl3·6H2O至三口烧瓶中,加入50mL除氧去离子水充分溶解,在氮气保护下,以60℃的加热温度水浴加热30min,水浴加热过程中以200-300r/min的搅拌速率搅拌并用45ml氨水调节pH至11,然后,升温至80℃陈化1h,磁吸附,除去多余反应液,用除氧去离子水洗至中性,再次磁吸附,除去多余水分,得到纳米四氧化三铁磁核,其中,除氧去离子水是通过将去离子水用微波炉煮沸10min后,密封冷却至室温制得,且为了保证所制纳米四氧化三铁磁核不被污染,向上述纳米四氧化三铁磁核中加入100mL除氧去离子水,配制成浓度为10mg/mL的纳米四氧化三铁磁核溶液,室温保存;
2)二氧化硅磁珠的制备:向20ml纳米四氧化三铁磁核溶液中加入160mL乙醇和40mL去离子水,其中,20ml纳米四氧化三铁磁核溶液中含有200mg纳米四氧化三铁磁核,超声分散15min,使其混合均匀,然后,加入6mL浓氨水,搅拌并滴加0.6mL正硅酸乙酯,随后,在40℃下加热并强力搅拌反应12h,使二氧化硅包裹反应充分进行,待二氧化硅包裹反应结束后,磁分离,除去多余反应液,待磁分离结束后,用乙醇洗涤2次,去离子水洗涤4次,再次磁吸附,除去多余水分,得到二氧化硅磁珠;
3)氨基修饰:将200mg二氧化硅磁珠置于甲苯中超声分散30min,加入2mmolKH550,升温至110℃,加热回流24h,使氨基修饰反应充分进行,其中,氨基修饰反应过程,即加热回流过程中需持续搅拌,待氨基修饰反应结束后,磁吸附,除去多余反应液,再用无水乙醇洗涤,烘干,得到氨基修饰的二氧化硅磁珠;
4)配体的形成:向200mg氨基修饰的二氧化硅磁珠中加入由10ml三乙胺和15ml无水乙醇组成的溶液体系,然后,加入1.26g氯乙酸钠,在90℃下回流搅拌48h,使亲核取代反应充分进行,待亲核取代反应结束后,磁吸附,除去多余反应液,再用乙醇与去离子水洗涤数次,待洗涤结束后,再次磁吸附,除去多余水分,得到平均粒径为203.5~205.7nm的提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠。
实施例4
一种提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠,包括纳米四氧化三铁磁核;纳米四氧化三铁磁核的表面包裹有二氧化硅;二氧化硅的表面修饰有用于螯合金属离子的配体;配体由硅烷偶联剂和氯乙酸钠通过亲核取代反应键合形成。
其中,纳米四氧化三铁磁珠的平均粒径为111.8nm;硅烷偶联剂为N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷(KH900)。
上述提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠的制备方法,具体包括以下步骤:
1)纳米四氧化三铁磁核的制备:将1.90g的Fe(NH4)2·(SO4)2·6H2O、2.33g的FeCl3·6H2O至三口烧瓶中,加入50mL除氧去离子水充分溶解,在氮气保护下,以60℃的加热温度水浴加热30min,水浴加热过程中以200-300r/min的搅拌速率搅拌并用45ml氨水调节pH至11,然后,升温至80℃陈化1h,磁吸附,除去多余反应液,用除氧去离子水洗至中性,再次磁吸附,除去多余水分,得到纳米四氧化三铁磁核,其中,除氧去离子水是通过将去离子水用微波炉煮沸10min后,密封冷却至室温制得,且为了保证所制纳米四氧化三铁磁核不被污染,向上述纳米四氧化三铁磁核中加入100mL除氧去离子水,配制成浓度为10mg/mL的纳米四氧化三铁磁核溶液,室温保存;
2)二氧化硅磁珠的制备:向20ml纳米四氧化三铁磁核溶液中加入160mL乙醇和40mL去离子水,其中,20ml纳米四氧化三铁磁核溶液中含有200mg纳米四氧化三铁磁核,超声分散15min,使其混合均匀,然后,加入6mL浓氨水,搅拌并滴加0.6mL正硅酸乙酯,随后,在40℃下加热并强力搅拌反应12h,使二氧化硅包裹反应充分进行,待二氧化硅包裹反应结束后,磁分离,除去多余反应液,待磁分离结束后,用乙醇洗涤2次,去离子水洗涤4次,再次磁吸附,除去多余水分,得到二氧化硅磁珠;
3)氨基修饰:将200mg二氧化硅磁珠置于甲苯中超声分散30min,加入2mmolKH900,升温至110℃,加热回流24h,使氨基修饰反应充分进行,其中,氨基修饰反应过程,即加热回流过程中需持续搅拌,待氨基修饰反应结束后,磁吸附,除去多余反应液,再用无水乙醇洗涤,烘干,得到氨基修饰的二氧化硅磁珠;
4)配体的形成:向200mg氨基修饰的二氧化硅磁珠中加入由10ml三乙胺和15ml无水乙醇组成的溶液体系,然后,加入1.68g氯乙酸钠,在90℃下回流搅拌48h,使亲核取代反应充分进行,待亲核取代反应结束后,磁吸附,除去多余反应液,再用乙醇与去离子水洗涤数次,待洗涤结束后,再次磁吸附,除去多余水分,得到平均粒径为203.5~205.7nm的提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠。
需要说明的是,本发明实施例1~实施例4的提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠中由硅烷偶联剂和氯乙酸钠通过亲核取代反应键合形成的配体可以螯合Cu2+、Ni2+、Zn2+、Fe3+等金属离子,使蛋白质可以稳定的与本发明磁珠结合。
实施例5
将本发明实施例1的提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠用于提取蛋白质,其用于提取蛋白质时的具体提取方法如下:
1)将5mg实施例1的提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠加入至4ml离心管中,磁吸附后,取1ml浓度为1mol/L的硫酸镍溶液混合,在37℃、220rpm的条件下孵育30-60min,得到混合液A;
2)将混合液A磁吸附后加入3ml去离子水,摇晃混匀,继续磁吸附后,除去上清,再次加入3ml去离子水,如此重复洗涤三次,除去多余的硫酸镍,得到螯合有镍离子的二氧化硅羧基磁珠,简称为镍-IDA磁珠;
3)将0.5~2ml含有组氨酸标签蛋白的细胞破碎液加入至含有镍-IDA磁珠的离心管中,置于摇床上并在220rpm、37℃的条件下孵育20min,磁吸附除去上清,再加入1ml浓度为10mM的咪唑溶液置于摇床上,在220rpm,37℃的条件下重复洗涤三次,再用250mM咪唑溶液重复洗涤五次,收集250mM咪唑溶液洗涤后得到的溶液上清,即为纯化后的含组氨酸标签目标蛋白溶液。
实施例6
将本发明实施例2的提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠用于提取蛋白质,其用于提取蛋白质时的具体提取方法如下:
1)将15mg实施例2的提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠加入至4ml离心管中,磁吸附后,取1ml浓度为1mol/L的硫酸镍溶液混合,在37℃、220rpm的条件下孵育30-60min,得到混合液A;
2)将混合液A磁吸附后加入3ml去离子水,摇晃混匀,继续磁吸附后,除去上清,再次加入3ml去离子水,如此重复洗涤三次,除去多余的硫酸镍,得到螯合有镍离子的二氧化硅羧基磁珠,简称为镍-TED磁珠;
3)将0.5~2ml含有组氨酸标签蛋白的细胞破碎液加入至含有镍-TED磁珠的离心管中,置于摇床上并在220rpm、37℃的条件下孵育20min,磁吸附除去上清,再加入1ml浓度为0mM的咪唑溶液置于摇床上,在220rpm,37℃的条件下重复洗涤三次,再用250mM咪唑溶液重复洗涤五次,收集250mM咪唑溶液洗涤后得到的溶液上清,即为纯化后的含组氨酸标签目标蛋白溶液。
对比例1
测试已上市商业化磁珠(简称NTA磁珠)对组氨酸标签蛋白的提取能力,以将其与本发明实施例1和实施例2的提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠对组氨酸标签蛋白的提取能力进行对比,其中,已上市商业化磁珠用于提取蛋白质时的具体提取方法如下:
1)将5mg NTA磁珠加入至4ml离心管中,磁吸附后,取1ml浓度为1mol/L的硫酸镍溶液混合,在37℃、220rpm的条件下孵育30-60min,得到混合液A;
2)将混合液A磁吸附后加入3ml去离子水,摇晃混匀,继续磁吸附后,除去上清,再次加入3ml去离子水,如此重复洗涤三次,除去多余的硫酸镍,得到螯合有镍离子的NTA磁珠,简称为镍-NTA磁珠;
3)将0.5~2ml含有组氨酸标签蛋白的细胞破碎液加入至含有镍-NTA磁珠的离心管中,置于摇床上并在220rpm、37℃的条件下孵育20min,磁吸附除去上清,再加入1ml浓度为10mM的咪唑溶液置于摇床上,在220rpm,37℃的条件下重复洗涤三次,再用250mM咪唑溶液重复洗涤五次,收集250mM咪唑溶液洗涤后得到的溶液上清,即为纯化后的含组氨酸标签目标蛋白溶液。
对本发明实施例1和实施例2的提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠螯合镍离子后的粒径分布进行测试,即实施例5的镍-IDA磁珠(Fe3O4-SiO2-IDA)和实施例6的镍-TED磁珠(Fe3O4-SiO2-TED),并将其与本发明实施例1和实施例2合成的纳米四氧化三铁磁核(Fe3O4)和二氧化硅磁珠(Fe3O4-SiO2)进行对比,测试结果如图1所示。
由图1可知,本发明实施例1和实施例2合成的纳米四氧化三铁磁核的粒径分布为134.47±55.67nm,平均粒径为111.8nm;本发明实施例1和实施例2合成的二氧化硅磁珠的粒径分布为223.85±118.14nm,平均粒径为198.4nm;本发明实施例5的Fe3O4-SiO2-IDA的粒径分布为250.88±145.17nm,平均粒径为203.5nm;本发明实施例6的Fe3O4-SiO2-TED的粒径分布为241.88±100.11nm,平均粒径为205.7nm,说明随着二氧化硅的包裹以及螯合配体的连接,磁珠粒径逐步增大,且均成正态分布,表明实验所合成磁珠粒径分布均匀、集中。
测定本发明实施例5和实施例6的镍-IDA磁珠和实施例6的镍-NTA磁珠对组氨酸标签蛋白的纯化能力,测试结果分别如图2和图3所示。
由图2和图3可知,本发明实施例5和实施例6的两种磁珠在经低浓度咪唑溶液洗涤后,杂带减少,条带逐渐单一,再经高浓度咪唑溶液洗脱后,条带逐渐变窄,说明本发明磁珠对于组氨酸标签蛋白具有较高的选择性,能将目标蛋白进行纯化,且通过加大咪唑浓度,可将蛋白质洗脱下来,得到游离的纯化蛋白。
测定本发明实施例1和实施例2的提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠螯合镍离子后,即实施例5的镍-IDA磁珠和实施例6的镍-TED磁珠对组氨酸标签蛋白的洗脱能力和纯化效果,并将其与已上市商业化磁珠进行对比(对比例1),测试结果分别如图4、图5、图6和表1所示。
表1
实施例 | 洗脱(μg) | 洗脱(μg/g) | 纯度(%) |
实施例1 | 178.66±1.10 | 35.73±0.22 | 92.70 |
实施例2 | 123.00±3.31 | 8.20±0.22 | 94.33 |
对比例1 | 161.09±1.55 | 32.22±0.31 | 70.51 |
由图4、图5、图6和表1可知,在纯化方面,本发明实施例1和实施例2的提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠螯合镍离子后的镍-IDA磁珠和镍-TED磁珠明显优于已上市商业化磁珠,且在提取蛋白质能力方面,本发明实施例1的提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠螯合镍离子后的镍-IDA磁珠的洗脱量优于商业化载体。
对本发明实施例1与实施例2的提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠螯合镍离子后,即实施例5的Fe3O4-SiO2-IDA和实施例6的Fe3O4-SiO2-TED进行XRD分析,测试结果如图7所示。
由图7可知,本发明所制备的纳米四氧化三铁磁核检测到六组主要的衍射峰,2θ=30.7°、35.5°、42.1°、53.7°、57.5°、62.9°,分别对应于衍射晶面(220)(311)(400)(422)(511)(440)(参考自JCPDS-19-0629),属于典型的四氧化三铁面心立方晶体结构,说明本发明成功合成了结晶性较好的纳米四氧化三铁磁核;
本发明所制备的二氧化硅磁珠与Fe3O4衍射图谱相似,同时在2θ=15°-30°出现一较宽的衍射峰,这是由于在磁珠表面修饰上无定型二氧化硅,同时也说明本发明二氧化硅被成功修饰上四氧化三铁表面;
本发明所制备的Fe3O4-SiO2-IDA、Fe3O4-SiO2-TED两种磁珠XRD图谱与Fe3O4高度相似,表明在修饰上螯合配体后,内部磁核四氧化三铁仍保持较好的晶型。
测定本发明实施例1和实施例2的提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠螯合镍离子后,即实施例5的镍-IDA磁珠(Fe3O4-SiO2-IDA)和实施例6的镍-NTA磁珠(Fe3O4-SiO2-TED)的磁滞回线,并将其与本发明实施例1和实施例2合成的纳米四氧化三铁磁核(Fe3O4)和二氧化硅磁珠(Fe3O4-SiO2)进行对比,测试结果如图8所示。
由图8可知,饱和磁化强度反映了颗粒的磁响应能力,所制备Fe3O4饱和磁化强度为56.5emu/g,Fe3O4-SiO2为34.5emu/g,Fe3O4-SiO2-IDA为29.3emu/g,Fe3O4-SiO2-TED为28.0emu/g。在依次修饰二氧化硅以及螯合配体后,饱和磁化强度依次降低,但仍具有较好的磁响应性。同时磁滞回线图中,所制备Fe3O4、Fe3O4-SiO2、Fe3O4-SiO2-IDA、Fe3O4-SiO2-TED均过原点,即当外加磁场强度为0时,磁珠颗粒立即退磁,不存在磁滞现象,表明所合成磁珠具有超顺磁性。
以上仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠,其特征在于,包括纳米四氧化三铁磁核;所述纳米四氧化三铁磁核的表面包裹有二氧化硅;所述二氧化硅的表面修饰有用于螯合金属离子的配体;所述配体由硅烷偶联剂和氯乙酸钠通过亲核取代反应键合形成;
所述提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠通过以下方法制得:
1)纳米四氧化三铁磁核的制备:将Fe(NH4)2·(SO4)2·6H2O、FeCl3·6H2O溶于除氧去离子水,在氮气保护下,水浴加热、搅拌并用氨水调节pH至11,然后,升温陈化,提纯,得到纳米四氧化三铁磁核;
2)二氧化硅磁珠的制备:将所述纳米四氧化三铁磁核配制成纳米四氧化三铁磁核溶液,向所述纳米四氧化三铁磁核溶液中加入乙醇和去离子水,混合均匀,然后,加入浓氨水,搅拌并滴加正硅酸乙酯,随后,加热、搅拌,进行二氧化硅包裹反应,待所述二氧化硅包裹反应结束后,磁分离,得到二氧化硅磁珠;
3)配体的制备:在冰浴条件下,向去离子水中滴加硅烷偶联剂,混合均匀,然后,加入氯乙酸钠溶液,升温并用NaOH调节pH至8-9,进行亲核取代反应,得到配体;
4)配体的修饰:用浓盐酸调节所述配体的pH至3,然后,加入所述二氧化硅磁珠,混合均匀,随后加热,进行配体修饰反应,待所述配体修饰反应结束后,磁分离,得到提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠;
所述纳米四氧化三铁磁珠的平均粒径为50-200nm;所述提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠的平均粒径为150-250nm;
所述硅烷偶联剂为γ-氨丙基三乙氧基硅烷、N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷中的一种。
2.根据权利要求1所述的提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠,其特征在于,所述金属离子为Cu2+、Ni2+、Zn2+、Fe3+中的一种。
3.根据权利要求1所述的提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠,其特征在于,所述氯乙酸钠与所述硅烷偶联剂的摩尔比为2∶1~4∶1。
4.制备权利要求1至3任一项所述的提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)纳米四氧化三铁磁核的制备:将Fe(NH4)2·(SO4)2·6H2O、FeCl3·6H2O溶于除氧去离子水,在氮气保护下,水浴加热、搅拌并用氨水调节pH至11,然后,升温陈化,提纯,得到纳米四氧化三铁磁核;
2)二氧化硅磁珠的制备:将所述纳米四氧化三铁磁核配制成纳米四氧化三铁磁核溶液,向所述纳米四氧化三铁磁核溶液中加入乙醇和去离子水,混合均匀,然后,加入浓氨水,搅拌并滴加正硅酸乙酯,随后,加热、搅拌,进行二氧化硅包裹反应,待所述二氧化硅包裹反应结束后,磁分离,得到二氧化硅磁珠;
3)配体的制备:在冰浴条件下,向去离子水中滴加硅烷偶联剂,混合均匀,然后,加入氯乙酸钠溶液,升温并用NaOH调节pH至8-9,进行亲核取代反应,得到配体;
4)配体的修饰:用浓盐酸调节所述配体的pH至3,然后,加入所述二氧化硅磁珠,混合均匀,随后加热,进行配体修饰反应,待所述配体修饰反应结束后,磁分离,得到提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠。
5.根据权利要求4所述的提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠的制备方法,其特征在于,所述步骤1)中所述水浴加热的加热温度为50-70℃,加热时间为0.5-2h,所述搅拌的搅拌速率为200-300r/min,所述升温陈化的陈化温度为70-90℃,陈化时间为1-2h。
6.根据权利要求4所述的提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠的制备方法,其特征在于,所述步骤2)中所述二氧化硅包裹反应的加热反应温度为40-50℃,加热反应时间为12h。
7.根据权利要求4所述的提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠的制备方法,其特征在于,所述步骤3)中所述亲核取代反应的升温温度为70-90℃,升温反应时间为6-8h。
8.根据权利要求4所述的提取蛋白质用二氧化硅羧基磁珠的制备方法,其特征在于,所述步骤4)中所述配体修饰反应的加热反应温度为90-100℃,加热反应时间为2-3h。
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