CN101053827A - 一种表面固定金属离子的磁性微球及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于无机材料和生化分析技术领域，具体为一种表面固定金属离子的磁性微球及其制备方法和应用。该磁性微球是在Fe₃O₄微球表面以溶胶凝胶法包覆二氧化硅，然后采用(2，3－环氧丙氧基)丙基三乙氧基硅烷和亚氨基二乙酸对其进行表面化学修饰，进而固定金属子而获得。该固定金属离子的磁性微球作为微吸附剂，可进行复杂肽段混合物中痕量磷酸化肽段的选择性富集，方法简单有效。本发明可对低至20fmol/μL级的复杂肽段混合物中的磷酸化肽实现高选择性富集，富集效率提高一个数量级以上；采用富集到的磷酸化肽样品可进而实现磷酸化位点的鉴定。该材料在蛋白质组学翻译后修饰研究等领域有良好的实用价值和应用前景。

Description

一种表面固定金属离子的磁性微球及其制备方法和应用

技术领域

本发明属无机材料合成及生化分析技术领域，具体涉及一种具有超顺磁性的表面固定金属离子的磁性微球及其制备方法和应用。

并以其作为微吸附剂，可对复杂肽段混合物中的磷酸化肽段实现高选择性富集，并对富集的样品直接进行基质辅助激光解析离子化质谱的分析和鉴定，进而实现磷酸化位点的鉴定。可使用于该类磁性微球的合成及适用于复杂肽段混合物中磷酸化肽段的有效富集及磷酸化位点的鉴定。

背景技术

蛋白质的磷酸化是蛋白质翻译后修饰研究领域的热点之一。蛋白质的磷酸化和去磷酸化过程调节着细胞信号转导，细胞分化和细胞生长等几乎所有的生命过程。细胞中所有的蛋白质有大约三分之一是磷酸化的，因此发展磷酸化蛋白的研究方法对于认识生命活动过程具有重要的意义。近年来，基于基质辅助激光解析的飞行时间质谱成为磷酸化蛋白结构解析的强大辅助工具。但在质谱分析中，由于磷酸化肽段离子化效率低，因此其信号往往被非磷酸化肽段所抑制，这对磷酸化肽段的鉴定提出了挑战。在质谱分析前先对磷酸化蛋白或肽段进行专一的分离富集为磷酸化蛋白的结构解析提供了有效的解决方法。固定金属离子螯合色谱(IMAC)是该方面目前研究的热点。通过固定在多孔树脂上的金属离子和磷酸化肽段或蛋白的磷酸根离子之间的静电相互作用实现分离富集。但是该富集过程中，从树脂上洗脱样品时会造成的样品损失以及操作方法相对繁琐，因此对其进行改进是十分必要的。

磁性聚合物微球以其本身特有的物理、化学性质以及在细胞分离、磁辅助给药和酶固定等众多领域中的潜在应用前景而得到了广泛的关注。磁性聚合物微球融合了磁性材料的磁响应特性和微球聚合物材料的高分散性等优点，使得其对痕量肽段的富集成为可能。现有研究表明：由于聚合物材料的包覆造成材料的磁感应强度大大下降，从而限制了该类材料在痕量物质的分离富集领域的发展应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单、效率高、效果好，能对痕量磷酸化肽段进行高选择性富集及直接进行质谱分析的表面固定有金属离子的磁性微球及其制备方法和应用。

本发明提供的表面固定有金属离子的磁性微球，是在超顺磁性Fe₃O₄微球表面以溶胶凝胶法包覆二氧化硅，然后采用(2，3-环氧丙氧基)丙基三乙氧基硅烷、亚氨基二乙酸对其表面进行化学修饰，进而固定金属离子而获得，其结构如下式所示：

式中，F1表示四氧化三铁磁性微球，Si2表示磁球外面包覆的二氧化硅层；M表示表面固定的金属离子；

这些金属离子M可以是Fe³⁺、Al³⁺、Ga³⁺、In³⁺、Ce³⁺、Zr⁴⁺、Ni²⁺或Cu²⁺等。用于磷酸化肽段富集的磁球外部固定的金属离子可以是Fe³⁺、Al³⁺、Ga³⁺、In³⁺、Ce³⁺或Zr⁴⁺等。

上述表面固定金属离子的磁性微球的制备方法如下：

(1)用水热法合成Fe₃O₄超顺磁性微球，其步骤为：采用2.0-5.0克FeCl₃·6H₂O为原料，以40-100mL乙二醇为分散体系，添加5-10克无水乙酸钠，反应温度为190-210℃，反应时间为8-24小时，生成四氧化三铁磁性Fe₃O₄微球，其粒径是100-300nm。

(2)采用溶胶凝胶法在上述微球表面包覆二氧化硅，其步骤为：首先对水热法合成好的磁性微球进行表面活化，取10-100mg；加入1-3M的稀盐酸溶液超声分散5-15分钟；磁分离后加入10-40mL去离子水、50-250mL乙醇、1-3mL氨水，超声分散5-15分钟；机械搅拌同时加入0.05-3mL正硅酸乙酯，温度20-40℃，搅拌8-18小时。磁分离收集，水和乙醇清洗，40-60摄氏度真空干燥12-24，得磁性硅微球，其二氧化硅包覆层厚度为20-100nm；

(3)在磁性硅球表面进行化学修饰固定金属离子，其步骤为：在100mL的圆底烧瓶中加入3-5g亚氨基二乙酸(iminodiacetic acid，IDA)，加入浓度为9-11 M的NaOH水溶液溶解，最终溶液体积为40-60mL且pH值为9-12。将该反应器置于冰水浴中，磁力搅拌0.5-2h。在磁力搅拌的同时，在0.5-2h内，逐滴往反应器中加入1-3g GLYMO((2，3-环氧丙氧基)丙基三乙氧基硅烷)，然后将混合溶液加热至50-70，反应4-8h，再将反应体系冷却。用浓盐酸将得到的IDA衍生的硅烷偶联试剂溶液的PH值调节为4-6。将0.01-0.03g磁性硅球超声分散在30-60mL无水乙醇中，然后加入5.0-15.0mL上述实验制备的硅烷偶联试剂溶液，反应体系在30-50℃反应16-24h；最终将得到的产物用乙醇清洗干净。将得到的产物分散在10-20mL浓度为0.1-0.2M的FeCl₃溶液中，振荡分散2-4h；然后用去离子水反复清洗材料。

对包覆好二氧化硅磁性微球进行表面化学修饰，其过程是先合成GLYMO-IDA分子，

       GLYMO                               IDA                                        GLYMO-IDA

然后将其键合在硅球表面，进而螯合固定金属离子。其反应路线如下：

本发明中，水热法合成的四氧化三铁磁性微球和包覆好二氧化硅的磁性微球皆具有很好的超顺磁性，其饱和磁化强度分别为70-100emu/g和50-80emu/g。

本发明合成的具有超顺磁性表面固定金属离子的磁性微球可直接放入含有磷酸化肽的复杂肽段混合物中，无需特殊处理；富集好后，采用简单磁场作用即可实现磷酸化肽和其他样品的分离，无需离心，所以可以克服传统离心造成的非磷酸化肽的共离心沉淀问题；富集后样品无需洗脱，克服了样品洗脱过程造成的样品损失问题，并且该材料不存在传统材料的“孔洞效应”，可直接用于基质辅助激光解析离子化质谱分析，进而实现磷酸化位点的鉴定，方法简单实用有效。

本发明中，上述富集体系的pH值为1-6，样品浓度为0.05-5ng/μL，超顺磁性微球量是10-1000μg/1mL样品，富集时间在15-90分钟，富集温度在20-45摄氏度，本发明可用任何一种合成的表面固定不同金属离子的磁性微球，其溶液分散性非常好，体系均匀稳定，有利于溶液中的磷酸化肽在材料上的富集。

本发明的固定金属离子磁性微球合成方法简单有效并具有很好的磁场感应性；可对磷酸化肽进行有效选择性富集；富集过程无需离心分离，采用磁场作用就可实现材料和样品的分离；与基质辅助激光解析离子化质谱有很好的相容性，被固定金属离子磁性微球吸附后的样品无需样品洗脱步骤可直接进行基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱分析，避免了洗脱过程造成的样品损失；方法简单有效。本发明可对低至20fmol/μL级的复杂肽段混合物中的磷酸化肽实现高选择性富集，富集效率提高一个数量级以上；采用富集到的磷酸化肽样品可进而实现磷酸化位点的鉴定。该材料的合成及应用方法在蛋白质组学翻译后修饰研究等领域有良好的实用价值和应用前景。

附图说明

图1为水热法合成的四氧化三铁磁性微球的透射电镜图。

图2为水热法合成的四氧化三铁磁性微球(a)和表面包覆二氧化硅的磁性微球(b)的扫描电镜图。

图3为水热法合成的四氧化三铁磁性微球(a)和表面包覆二氧化硅的磁性微球(b)的透射电镜图。可见磁球外部均匀包覆了二氧化硅层。

图4为水热法合成的四氧化三铁磁性微球(实线)和表面包覆二氧化硅的磁性微球(虚线)的磁滞回线图。可见化学修饰前后磁球都具有很好的超顺磁性。

图5为表面固定金属离子的修饰的磁性微球的合成路线图。

图6为表面包覆二氧化硅的磁性微球(a)和表面固定Fe³⁺离子磁性微球(b)的傅立叶变换红外谱图。证实了成功地采用GLYMO-IDA对硅球表面进行了修饰，并且Fe³⁺也已经固定到磁性硅球表面。

图7为表面包覆二氧化硅的磁性微球在水中(0.1wt.-％)，施加磁场(2000Gs)的连续的分离图，图片显示该材料具有很好的磁场相应性。

图8为10μg表面修饰的固定Fe³⁺离子磁性微球富集5ng/μL(a和b)和0.5ng/μL(d和e)β-casein的胰蛋白酶酶解混合肽段的前后的MALDI-TOF MS谱图以及富集后的MALDI-TOF MS/MS串级质谱图(c)，可见磷酸化肽中的磷酸化位点得到了鉴定。比较a和b图，c和d图，磷酸化肽富集效率均超过一个数量级以上。

具体实施方式

通过实施例是对本发明所提供的超顺磁性的表面固定金属离子的磁性微球材料进行样品富集和基质辅助激光解吸离子化/质谱直接分析过程的进一步说明。

实施例1表面固定金属离子磁性微球的合成

水热法合成磁性微球：采用2.7克FeCl₃·6H₂O分散在100mL乙二醇中，添加7.2克无水乙酸钠，200摄氏度反应8小时得四氧化三铁磁性微球，60摄氏度真空干燥12小时。

溶胶凝胶法在微球表面包覆二氧化硅：取10mg磁性微球，加入2M的稀盐酸溶液超声分散5分钟后，磁分离加入20mL去离子水，70mL乙醇分散，1mL氨水；超声分散5分钟；机械搅拌同时加入0.05mL正硅酸乙酯。室温搅拌12小时。磁分离收集，水和乙醇清洗，60摄氏度真空干燥24小时。

合成3-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷-亚氨基二乙酸硅烷偶联试剂：4.20g亚氨基二乙酸溶于10mol/L的NaOH水溶液，调节pH为11。在0摄氏度加入1.5g的3-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷，65摄氏度反应6小时。调节产物pH值为6。

表面固定金属离子的磁性微球的合成：20mg的磁性硅球分散在50mL乙醇中，加入10g 3-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷-亚氨基二乙酸硅烷偶联试剂，40摄氏度反应24小时。磁分离产物分散在20mL，浓度为0.2mol/L FeCl₃水溶液中，搅拌2小时，60摄氏度干燥24小时。

实施例2复杂肽段混合物中磷酸化肽的选择性富集和质谱测定

取200μL浓度为5ng/μL酪蛋白胰蛋白酶酶解的肽段混合物，加入10μL的1mg mL^-1的表面固定三价铁离子的磁性微球，用乙酸调节体系pH值为2，在37摄氏度下振荡90分钟；在磁场作用下分离上清液和富集了磷酸化肽段的材料。用50％(体积比)的乙腈水溶液清洗材料一次，在沉淀中加入10μL的50％(体积比)的乙腈水溶液，振荡使之悬浮。悬浮液0.4μL与等体积30mg mL^-1 2，5-DHB(50％乙腈水溶液，v/v)and 1％(v/v)H₃PO₄水溶液，1∶1(v/v)混合点至MALDI靶板上，在MALDI-TOF/TOF(4700 Proteomics Analyzer，Applied Biosystems)；激光器为Nd-YAG激光，波长355nm，激光脉冲频率200Hz；加速电压20KV；正离子模式，反射式TOF检测。由图8b所示，磷酸化肽段得到了有效选择性富集。

实施例3

调整β-酪蛋白胰蛋白酶酶解的肽段混合物的浓度为0.5ng/μL，其他条件不变，重复上述选择性富集浓缩和质谱实验。结果如图8d和8e，对比两图可见，富集后磷酸化肽段得到了有效的选择性富集。

实施例4-6

调整吸附时间为15，30，60分钟，其他条件同实施例2，进行选择性富集浓缩和质谱实验。

实施例7-8

调整吸附温度为20，45度，其他条件同实施例2，进行选择性富集浓缩和质谱实验。

实施例9-10

调整吸附体系pH值为4，6，其他条件同实施例2，进行选择性富集浓缩和质谱实验。

实施例11-12

调整采用的材料表面固定的金属离子分别是Fe³⁺、Al³⁺、Ga³⁺、In³⁺、Ce³⁺、Zr⁴⁺，其他条件同实施例2，进行选择性富集浓缩和质谱实验。

实施例4-12所得结果与实施例2和3相似。

Claims (3)

1、一种表面固定金属离子的磁性微球，其特征在于

是在超顺磁性Fe₃O₄微球表面以溶胶凝胶法包覆二氧化硅，然后采用(2，3-环氧丙氧基)丙基三乙氧基硅烷、亚氨基二乙酸对其表面进行化学修饰，进而固定金属离子而获得，其结构如下式所示：

式中，F1表示四氧化三铁磁性微球，Si2表示磁球外面包覆的二氧化硅层；M表示表面固定的金属离子；这里金属离子M为Fe³⁺、Al³⁺、Ga³⁺、In³⁺、Ce³⁺、Zr⁴⁺、Ni²⁺或Cu²⁺。

2、一种如权利要求1所述的表面固定金属离子的磁性微球的制备方法，其特征在于具体步骤如下：

(1)用水热法合成Fe₃O₄超顺磁性微球；采用2.0-5.0克FeCl₃·6H₂O为原料，以40-100mL乙二醇为分散体系，添加5-10克无水乙酸钠，反应温度为190-210℃，反应时间为8-24小时，生成四氧化三铁磁性微球，其粒径是100-300nm；

(2)采用溶胶凝胶法在微球表面包覆二氧化硅：首先对水热法合成好的磁性微球进行表面活化：取10-100mg，加入1-3M的稀盐酸溶液超声分散5-15分钟；磁分离后加入10-40mL去离子水，50-250mL乙醇，1-3mL氨水，超声分散5-15分钟；机械搅拌同时加入0.05-3mL正硅酸乙酯，温度20-40摄氏度下搅拌8-18小时；磁分离收集，水和乙醇清洗，40-60摄氏度真空干燥12-24，得磁性微球，其二氧化硅包覆硅层厚度为20-100nm；

(3)在磁性硅球表面进行化学修饰固定金属离子：在100mL的反应器中加入3-5g亚氨基二乙酸，加入浓度为9-11M的NaOH水溶液溶解，最终溶液体积为40-60mL且pH值为9-12；将该反应器置于冰水浴中，磁力搅拌0.5-2h，其间逐滴往反应器中加入1-3g(2，3-环氧丙氧基)丙基三乙氧基硅烷，然后将混合溶液加热至50-70，反应4-8h，再将反应体系冷却；用浓盐酸将得到的亚氨基二乙酸衍生的硅烷偶联试剂溶液的PH值调节为4-6；将0.01-0.03g磁性硅球超声分散在30-60mL无水乙醇中，然后加入5.0-15.0mL上述过程制备的硅烷偶联试剂溶液，反应体系在30-50℃反应16-24h；最终将得到的产物用乙醇清洗干净；将得到的产物分散在10-20mL，浓度为0.1-0.2M的FeCl₃溶液中，振荡分散2-4h；然后用去离子水反复清洗材料。

3、如权利要求1所述的表面固定金属离子的四氧化三铁磁性微球作为微吸附剂的应用，其特征在于直接将所述磁性微球加入含有磷化肽的复合肽段混合物中，进行痕量磷酸化肽选择性富集，富集体系pH值为1-6，样品浓度为0.5-5ng/μL，富集时间为15-90分钟；富集温度为20-45℃，超顺磁性微球量是10-1000μg/mL样品。

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