CN106732408A - 一种亲水性磁性介孔硅材料的合成方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种亲水性磁性介孔硅材料的合成方法，首先通过水热法合成磁性微球，将磁性微球分散在含有硅源以及含有模板剂的乙醇/水的混合溶液中，反应后进一步在空气中进行高温煅烧获得具有介孔结构的磁性材料。然后将所得具有介孔结构的磁性材料分散于亲水性基团与硅烷偶联剂结合形成的亲水性复合物溶液中，制得亲水性功能基团修饰的磁性介孔硅材料。该材料能够利用亲水作用捕获糖基化肽段，使小分子的糖基化肽段进入孔道内而将大分子的蛋白排阻在孔道外，实现对低丰度糖基化肽段的富集。材料的高顺磁性极大简化了整个富集分离过程。本发明简单快捷，材料无生物毒性且具良好生物兼容性，结合生物质谱MALDI‑TOF MS或者LC‑MS/MS能生物学方面有广阔应用前景。

Description

一种亲水性磁性介孔硅材料的合成方法及其应用
技术领域
本发明属于先进纳米介孔吸附剂材料与纳米技术领域，具体涉及一种亲水性磁性介孔硅材料的合成方法及其应用，尤其涉及一种用于糖蛋白质组学分离富集与MALDI-TOFMS检测的亲水性的磁性介孔硅材料的合成方法及其应用。
背景技术
在哺乳动物中，糖基化是最普遍和最重要的蛋白质翻译后修饰之一。由于其在调节众多生物过程中扮演着重要角色，所以已被广泛关注和研究。糖组成、种类以及结构等方面的变化与很多疾病尤其是癌症的发生发展密切相关。为了洞悉糖基化与疾病之间的具体关系，鉴定出糖基化位点上的更多结构信息、相应的糖链的结构信息以及相关的肽段信息显得非常重要。但是由于实际样品中通常存在大量的非糖基化肽段，加之糖基化肽段自身存在丰度低以及离子化效率低等特点，基于质谱的糖基化肽段分析策略遭遇巨大挑战。解决这一难题的有效办法就是对实际样品进行纯化，以增加样品中糖基化肽段的丰度。
近年来，科学家做出巨大努力，发展了不同的技术用于糖基化肽段的分离富集，其中利用亲水相互作用是一重要策略。亲水相互作用与质谱相结合展现出很多的优势，比如说重复性好，富集性能高，而且此方法对于不同糖型肽段的富集展现同样的优异富集性能。目前已有不同的生物兼容纳米材料被选为载体负载亲水性功能基团用于糖基化肽段的富集，例如金硅球以及磁性粒子等等。但是这些材料通常比表面积较小，限制了功能基团的修饰，从而制约了对于糖基化肽段分离富集的应用。
介孔材料具有比表面积大、孔道大小均一以及孔道内壁可修饰等特性，在众多领域如存储、催化、载药以及分离纯化方面展现出巨大的应用前景。本发明首次合成具有强磁响应性的亲水性磁性介孔硅材料并应用于糖基化肽段的富集。在外加磁场的作用下，捕获了糖基化肽段的亲水性磁性介孔硅材料可以方便快速地从复杂样品溶液中分离开来，使整个分离富集、清洗以及洗脱过程所需时间大大缩短。同时，亲水性磁性介孔硅材料对目标糖基化肽段具有很强的亲和能力，复杂样品中的糖基化肽段经过亲水性磁性介孔硅材料的富集之后，其质谱信号强度显著增加。而介孔层的存在使材料具有不错的体积排阻能力，当目标糖基化肽段与蛋白质质量比达到1：200时，仍然展现出优异的糖基化肽段富集性能。
发明内容
本发明目的在于提供一种亲水性磁性介孔硅材料的合成方法及其在糖基化肽段分离富集以及MALDI-TOF MS检测中的应用。
本发明提供的一种亲水性磁性介孔硅材料的合成方法，具体步骤如下：
（1）将六水合三氯化铁置于乙二醇中磁力搅拌，至溶液澄清透明后加入醋酸钠，再经充分搅拌后转移至水热反应釜中，100-500℃下加热10-18小时，待反应釜冷却至室温后，用去离子水和乙醇充分洗涤所得产物，于30-80℃下真空干燥得到磁球；
（2）将步骤（1）中所得磁球与表面活性剂均匀分散于溶剂中，加入硅源，将所得混合溶液在10-80℃搅拌反应8-12小时；
（3）将步骤（2）中所得产物在空气中100-450℃下煅烧1-9小时，得到磁性介孔硅材料；
（4）将亚氨基二乙酸溶于碳酸钠溶液中，调节溶液pH为9-11，置于冰浴中搅拌10-60分钟；
（5） 滴加γ-(2,3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷于步骤（4）所得的溶液中后搅拌10-60分钟，升温至50-95℃继续搅拌2-10小时；
（6）将步骤（5）所得溶液置于冰浴中10-60分钟后滴加γ-(2,3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷并搅拌10-60分钟，升温至50-95℃继续搅拌2-10小时；
（7）待步骤（6）所得溶液冷却至室温后调节溶液pH为5-7，置于冰箱备用；
（8）将步骤（3）中所得的磁性介孔材料分散于步骤（7）所得的溶液中，超声分散均匀后，在65-100℃下搅拌反应1-8小时，所得产物水洗后于30-80℃下真空干燥，即得所述亲水性磁性介孔硅材料。
本发明中，步骤（2）中的表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基苯磺酸钠或硬脂酸中的一种或几种。
本发明中，步骤（2）中的溶剂为十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基苯磺酸钠或硬脂酸中的一种或几种。
本发明中，步骤（2）中的硅源为正硅酸乙酯的乙醇溶液，其中正硅酸乙酯与乙醇的体积比为1：4。
本发明中，步骤（2）中磁球与表面活性剂的质量比为：1：9-1：12。
本发明中，步骤（4）中调节溶液pH值为10。
本发明中，步骤（7）中调节pH值为6。
本发明得到的亲水性磁性介孔硅材料在糖基化蛋白质组学分离富集中的应用，将亲水性磁性介孔硅材料配置成分散液，将该分散液和目标糖基化肽段溶液加入含有体积比80%-100% 乙腈和体积比0.1-3% 三氟乙酸的缓冲溶液中，37℃下孵育，含体积比50-95% 乙腈和体积比0.1-5%的磷酸的缓冲液作为材料清洗液，体积比0.1-65% 乙腈作为洗脱液，点样和基质于MALDI-TOF MS靶板上自然干燥后进行质谱分析。
本发明的有益效果在于：合成的具有介孔结构、亲水基团修饰的磁性介孔硅材料，其介孔为柱型孔道，孔径约为2.54 nm，比表面积约为197.60 m2/g。具有良好磁响应性和亲水性，介孔大小以及功能基团易于控制，其大比表面积与数量众多、排列紧密的介孔结构有益于目标糖基化肽段的捕获，同时排阻大体积蛋白质在孔道外。此材料无生物毒性，对糖基化肽段具有很强的捕集能力，可作为分离富集糖基化肽段的固相吸附剂。结合大比表面积、介孔孔道以及内壁修饰的大量亲水性功能化基团，该材料对目标糖基化肽段展现了优异富集性能，富集灵敏度以及体积排阻能力。其合成方法简单低耗，在糖基化肽段分离富集以及MALDI-TOF MS检测分析中具有高灵敏度、高信噪比放大倍数和适合用于复杂生物样品分离分析等特点。
附图说明
图1为实施例1的亲水性磁性介孔硅材料的透射电子显微镜照片；
图2为实施例1的亲水性磁性介孔硅材料的扫描电子显微镜照片；
图3为实施例1的亲水性磁性介孔硅材料的氮气吸附等温线以及孔径分布图；
图4为实施例1的亲水性磁性介孔硅材料的元素分析图；
图5为实施例2的亲水性磁性介孔硅材料富集HRP酶解液中糖基化肽段富集条件优化图，其中图A为在80%乙腈与3%三氟乙酸溶液条件下富集得到的糖基化肽段的质谱图，图B为在89%乙腈与3%三氟乙酸溶液条件下富集得到的糖基化肽段的质谱图，图C为在95%乙腈与3%三氟乙酸溶液条件下富集得到的糖基化肽段的质谱图。
图6为实施例3的亲水性磁性介孔硅材料排阻大分子蛋白并富集HRP酶解液中糖基化肽段的质谱图；图A为HRP与BSA摩尔比1:0时富集得到的糖基化肽段的质谱图 ，图B为HRP与BSA摩尔比1:100时富集得到的糖基化肽段的质谱图，图C为HRP与BSA摩尔比1:200时富集得到的糖基化肽段的质谱图。
图7为实施例4的亲水性磁性介孔硅材料富集具另一糖型的Ig G酶解液中糖基化肽段的质谱图。图A为未经富集的IgG糖基化肽段的质谱图，图B为本材料富集后IgG糖基化肽段的质谱图。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。
实施例1：一种亲水性磁性介孔硅材料的合成
（1）将1.35 g FeCl3·6H2O分散于75 mL乙二醇中磁力搅拌，待溶液至澄清后，加入3.6g NaAc，再经充分搅拌后转移至水热反应釜中，200℃下加热16小时，待反应釜冷却至室温后，用去离子水和乙醇充分洗涤所得产物，于50℃下真空干燥；
（2）将（1）中所得产物磁球50 mg与表面活性剂CTAB 500 mg超声分散于50 ml去离子水中，加入400 mL去离子水以及50 mL NaOH （0.01 M），将所得混合溶液在60℃反应30min后加入2.5 mL正硅酸乙酯/乙醇（v/v,1:4）,60℃过夜搅拌反应；
（3）将（2）中所得产物在空气中350℃下煅烧4h，得到磁性介孔硅材料；
（4）将2.5 g亚氨基二乙酸溶于50 mL（2 M）碳酸钠溶液中，NaOH调节溶液pH为10，置于冰浴中搅拌10min；
（5） 滴加1.6 mLγ-(2,3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷（GLYMO）于（4）中后继续搅拌30min；
（6）将（5）中溶液反应温度升至65 ℃继续搅拌6h；
（7） 将（6）中反应液再次置于冰浴中10 min后再次滴加与（5）中1.6 mL GLYMO并搅拌30 min；
（8）将（7）中反应温度再次升至65 ℃继续搅拌6 h；
（9）待（8）中反应液冷却至室温后Hcl调节溶液pH为6，置于冰箱备用；
（10）将（3）中所得产物50 mg分散于（9）中所得溶液中，超声分散均匀后，在95℃下搅拌反应2 h，所得产物水洗后于50℃下真空干燥。
将制得的亲水性磁性介孔硅材料用透射电子显微镜检测，检测条件是：200kV工作电压下，将干燥的材料取少量均匀分散在无水乙醇中并用混合液将微栅网浸润，干燥后插入仪器抽真空，在100纳米比例尺下投射电子显微镜观察，检测结果如图1所示。
将制得的亲水性磁性介孔硅材料用扫描电子显微镜检测，检测条件是：20kV工作电压下，将干燥的材料取少量黏贴在绝缘胶带上，经喷金、抽真空后，8微米比例尺下扫描电子显微镜观察，检测结果如图2所示。
图3为亲水性磁性介孔硅材料的氮气吸附等温线以及孔径分布图；
图4为的亲水性磁性介孔硅材料的元素分析图；
元素 原子百分比 质量百分比
O 51.0 35.4
Fe 17.8 43.2
Si 5.8 7.1
N 13.6 8.3
C 11.7 6.1
实施例2：将实施例1得到的亲水性磁性介孔硅材料作为固相吸附剂用于HRP酶解液中糖基化肽段的分离富集时的富集条件优化。
（1）试样的制备：HRP在50 mM NH4HCO3溶液中37℃酶解16 h。
（2）200 μg 亲水性磁性介孔硅材料分散在100μL含有1 pmol/μL步骤（1）的糖基化肽段的不同富集缓冲液中，ACN /H2O/TFA (80/17/3, v/v/v), ACN/H2O/TFA (89/8/3, v/v/v) 和ACN/H2O/TFA (95/2/3, v/v/v)。 37℃孵育20 min。用200 μL 清洗液（ACN/H2O/H3PO4=85/14.5/0.5, v/v/v ）冲洗样品三次。用6μL 50% ACN洗脱30 min。
（3）质谱分析：取1μL步骤（2）中洗脱液点靶，进行质谱分析，质谱图如图5所示。
对比图5中的不同质谱图，选择ACN/H2O/TFA (89/8/3, v/v/v)作为富集缓冲液。
实施例3：将实施例1得到的亲水性磁性介孔硅材料作为固相吸附剂用于糖基化肽段的分离富集时对大分子蛋白的体积排阻能力。
（1）试样的制备：HRP在50 mM NH4HCO3溶液中37℃酶解16 h。配制HRP酶解液与BSA蛋白质量比分别为1：100以及1：200的混合溶液。
（2）200 μg 亲水性磁性介孔硅材料加入步骤（1）配制的不同混合溶液中。37℃孵育20 min。用200 μL 清洗液（ACN/H2O/H3PO4=85/14.5/0.5, v/v/v ）冲洗样品三次。用6μL50% CAN洗脱30 min。
（3）质谱分析：取1μL步骤（2）中洗脱液点靶，进行质谱分析，质谱图如图6所示。
对比质谱图，选择ACN/H2O/TFA (89/8/3, v/v/v)作为富集缓冲液。
对比图6中的质谱图，可以发现随着HRP酶解液与BSA蛋白比例的增大，亲水性磁性介孔硅材料分离富集糖基化肽段后的质谱图中，糖基化肽段的条数以及信号强度持稳定状态，说明亲水性磁性介孔硅材料具有从混有大分子蛋白的混合液中捕获糖基化肽段的能力
实施例4：将实施例1得到的亲水性磁性介孔硅材料作为固相吸附剂用于Ig G酶解液中糖基化肽段的分离富集时的富集条件优化。
（1） 试样的制备：Ig G在50 mM NH4HCO3溶液中37℃酶解16 h。
（2） 200 μg 亲水性磁性介孔硅材料分散在100μL含有1 pmol/μL步骤（1）的糖基化肽段的ACN/H2O/TFA (89/8/3, v/v/v)缓冲溶液中。 37℃孵育20 min。用200 μL 清洗液（ACN/H2O/H3PO4=85/14.5/0.5, v/v/v ）冲洗样品三次。用6μL 50% ACN洗脱30 min。
（3） 质谱分析：取1μL步骤（2）中洗脱液点靶，进行质谱分析，质谱图如图7所示。
HRP与Ig G具有不同的糖型，如图7所示，亲水性磁性介孔硅材料对Ig G酶解液中糖基化肽段也展现出优异的富集性能，说明材料对于不同糖型的糖基化肽段均具有富集性能。
实施例5：将实施例1得到的亲水性磁性介孔硅材料作为固相吸附剂用于人血清酶解液中糖基化肽段的分离富集。
（1） 试样的制备：2μL人血清和16μL 25 mM NH4HCO3溶液混合后在12000 rpm下离心2 min，所获得的上清液经DTT在37℃下还原30 min，再经IAA在37℃下烷基化1 h。然后加入69μL25 mM NH4HCO3和trypsin，酶解16 h。冻干备用。
（2） 步骤（1）中冻干血清重溶在200μL ACN/H2O/TFA (90/8/2, v/v/v)中，加入400μg亲水性磁性介孔硅材料。37℃下孵育30 min。用200 μL 清洗液（ACN/H2O/H3PO4=85/14.5/0.5, v/v/v ）冲洗样品三次。用30μL 50% ACN洗脱2次。
（3）将500 units PNGase F酶和60 μL NH4HCO3于步骤（2）中所得混合洗脱液中,37℃下孵育16 h。冻干后重溶于5% ACN/0.1% TFA中，用于LC-MS/MS分析。

Claims (8)

1.一种亲水性磁性介孔硅材料的合成方法，其特征在于具体步骤如下：
（1）将六水合三氯化铁置于乙二醇中磁力搅拌，至溶液澄清透明后加入醋酸钠，再经充分搅拌后转移至水热反应釜中，100-500℃下加热10-18小时，待反应釜冷却至室温后，用去离子水和乙醇充分洗涤所得产物，于30-80℃下真空干燥得到磁球；
（2）将步骤（1）中所得磁球与表面活性剂均匀分散于溶剂中，加入硅源，将所得混合溶液在10-80℃搅拌反应8-12小时；
（3）将步骤（2）中所得产物在空气中100-450℃下煅烧1-9小时，得到磁性介孔硅材料；
（4）将亚氨基二乙酸溶于碳酸钠溶液中后，调节所得溶液pH为9-11，置于冰浴中搅拌10-60分钟；
（5） 滴加γ-(2,3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷于步骤（4）所得的溶液中后搅拌10-60分钟，升温至50-95℃继续搅拌2-10小时；
（6）将步骤（5）所得溶液置于冰浴中10-60分钟后滴加γ-(2,3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷并搅拌10-60分钟，升温至50-95℃继续搅拌2-10小时；
（7）待步骤（6）所得溶液冷却至室温后调节溶液pH值为5-7，置于冰箱备用；
（8）将步骤（3）中所得的磁性介孔材料分散于步骤（7）所得的溶液中，超声分散均匀后，在65-100℃下搅拌反应1-8小时，所得产物水洗后于30-80℃下真空干燥，即得所述亲水性磁性介孔硅材料。
2.根据权利要求1所述的一种亲水性磁性介孔硅材料的合成方法，其特征在于步骤（2）中的表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基苯磺酸钠或硬脂酸中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的一种亲水性磁性介孔硅材料的合成方法，其特征在于步骤（2）中的溶剂为乙醇/水混合溶液，去离子水或聚乙二醇溶液中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的一种亲水性磁性介孔硅材料的合成方法，其特征在于步骤（2）中的硅源为正硅酸乙酯的乙醇溶液，其中正硅酸乙酯与乙醇的体积比为1：4。
5.根据权利要求1所述的一种亲水性磁性介孔硅材料的合成方法，其特征在于步骤（2）中磁球与表面活性剂的质量比为：1：9-1：12。
6.根据权利要求1所述的一种亲水性磁性介孔硅材料的合成方法，其特征在于步骤（4）中调节溶液pH值为10。
7.根据权利要求1所述的一种亲水性磁性介孔硅材料的合成方法，其特征在于步骤（7）中调节pH值为6。
8.一种如权利要求1所述合成方法得到的亲水性磁性介孔硅材料的应用，其特征在于：将亲水性磁性介孔硅材料配置成分散液，将该分散液和目标糖基化肽段溶液加入含有体积比80%-100% 乙腈和体积比0.1-3% 三氟乙酸的缓冲溶液中，37℃下孵育，含体积比50-95%乙腈和体积比0.1-5% 磷酸的缓冲液作为材料清洗液，体积比0.1-65% 乙腈作为洗脱液，点样和基质于MALDI-TOF MS靶板上自然干燥后进行质谱分析。
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