CN106268649A - 一种磁性纳米材料及其在磷酸肽富集中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种磁性纳米材料及其在磷酸肽富集中的应用，经过氨基修饰的磁性纳米材料通过乙二胺将4‑羧基苯基卟啉（TCPP）和1，4，7，10‑四氮杂环十二烷‑N，N，N，N‑四乙酸（DOTA）共价连接到材料表面，镧系金属离子固载在材料表面合成新型的磁性纳米材料。该金属离子修饰磁性纳米材料在磷酸肽富集过程中具有更高的选择性、灵敏度及富集效率；与传统的TiO2方法相比，该金属离子修饰磁性纳米材料具有较高的磷酸肽富集特异性和选择性。

Description

一种磁性纳米材料及其在磷酸肽富集中的应用
技术领域
本发明涉及分析化学领域，具体是一种磁性纳米材料及其在磷酸肽富集中的应用。
背景技术
磷酸化蛋白质来源于动态可逆的蛋白质磷酸化修饰过程，其涉及几乎所有的生理生化过程，包括细胞凋亡、信号转导、转录调控、翻译调控等。磷酸化蛋白质组学与人们对生命活动的认知和重大疾病的诊断治疗有着极为密切的关系，一直以来都是研究的热点。蛋白质磷酸化过程异常与一些严重疾病的发生发展相关。近年来，伴随着生物质谱技术的迅猛发展，具有高灵敏度的质谱仪已经成为磷酸化蛋白质组学研究的重要工具。然而，由于磷酸肽具有较低的化学计量数、自身的负电行导致在正离子模式的质谱鉴定中存在困难以及大量非磷酸肽的信号抑制作用，使得磷酸肽的直接分析和鉴定存在困难。因此，在质谱鉴定前发展有效的磷酸肽富集和分离方法对磷酸肽的鉴定是十分必要的。目前，用于磷酸肽的富集分离方法主要有离子交换色谱法（IEC）、金属氧化物亲和色谱法（MOAC）、固定金属离子亲和色谱法（IMAC）等。
离子交换色谱法包括强阳离子交换色谱法(SCX) 和强阴离子交换色谱法(SAX)，这两种方法均是根据磷酸肽和非磷酸肽在酸性溶液中所带电荷的差异实现分离的。在酸性溶液下，经过胰蛋白酶酶切的肽段大部分带有两个正电荷，而磷酸肽由于带一个负电荷，固大部分磷酸肽在酸性溶液中带一个正电荷。当胰蛋白酶酶切样品经过强阳离子交换色谱时，磷酸肽比非磷酸肽流出时间早，从而实现磷酸肽的富集分离。而经过阴离子交换色谱时，磷酸肽由于有较强的保留行为而较晚流出。Hennrich等将SAX作为SCX和反相液相色谱联用的补充，用于复杂磷酸肽样本的分析，经结果分析得出多一维的分离操作对磷酸肽的深度鉴定是十分必要的，特异性磷酸肽的鉴定数目约增加40%。Dong等制备了杂化SAX毛细管整体柱用于磷酸肽的富集和MALDI-TOF MS的鉴定分析。当溶液pH为8.0时，磷酸肽可以保留在SAX毛细管整体柱上，经过非磷酸肽的洗涤后，结合的磷酸肽可以直接洗脱在MALDI靶盘上进行质谱分析。
由于离子交换色谱法特异性较差，单一的SCX或SAX对磷酸肽的富集效果有限，一般只适合对简单的磷酸肽样品进行富集分离。而对于较为复杂的生物样本，目前多数团队将SCX或SAX用于样品的预分离，而后使用IMAC或TiO2方法对不同馏分进行磷酸肽富集。Mann[11]等将SAX分离、SCX分离和TiO2富集方法结合，在单一人类癌细胞系中鉴定到50000磷酸肽，其中鉴定到的超过75%的细胞内蛋白质均发生了磷酸化修饰。
固相金属离子亲和色谱法（immobilized metal affinity chromatography，IMAC）是目前使用最为广泛的磷酸肽富集方法之一。该方法是1975年由Porath等人最先提出的，一般将金属阳离子如Al3+，Fe3+， Zr4+， Ti4+等通过适当的配体固定在基质材料上。当在酸性溶液条件下，磷酸化肽段可与固载在IMAC材料上的金属离子发生配位作用而保留在材料上，然后用洗涤溶液清洗吸附的非特异性肽段，最后用碱性溶液洗脱富集出的磷酸肽用于质谱鉴定。因此，在磷酸肽富集过程中，影响磷酸肽富集效果的材料因素包括了选择的金属离子的属性、连接臂的性质以及基质材料的特征。目前，用于IMAC材料的基质材料有有机基质、纳米材料、聚合物材料、毛细管柱等。而连接臂的选择也由传统的亚胺基二乙酸、次氮基三乙酸等发展到目前的磷酸根基团、三磷酸腺苷等，解决了传统IMAC材料连接臂与金属离子相互作用不稳定的问题，进一步提高了材料的稳定性同时也提高了磷酸肽富集的效率。而固载在材料表面的金属离子的选择也在不断变化，从传统的过渡金属离子Zr4+， Ti4+等到多种镧系金属的固载，由于不同金属离子具有不同的空轨道和电荷数，对磷酸肽的富集效果也产生了不同的影响。例如，固载Ti4+的IMAC材料更倾向于富集碱性磷酸肽，固载Fe3 +的IMAC材料更易于吸附多磷酸肽，固载镧系金属的IMAC材料具有更高的富集特异性[16]。此外，为了提高磷酸肽的富集效率，一些研究团队将不同的金属离子同时固载在一种IMAC材料表面或者使用不同金属固载的IMAC材料（Ga3+-IMAC和Fe3+-IMAC）顺序富集磷酸肽，富集到的磷酸肽数目均有显著提高。
另有研究表明，IMAC材料在磷酸肽富集过程中更易富集多磷酸肽。Thingholm等发展了一种“SIMAC”的磷酸肽富集策略，在磷酸肽洗涤过程中采取不同的洗脱方法分别收集单磷酸肽和多磷酸肽，使得单磷酸肽对多磷酸肽的鉴定干扰显著降低，最终富集到的多磷酸肽数目显著上升。然而，也有报道表明传统的IMAC材料富集磷酸肽的特异性比较差，因此提高IMAC材料富集磷酸肽的特异性无疑可以使该方法得到更广泛的应用。
金属氧化物亲和色谱法（Metal oxide affinity chromatography，MOAC）也是一种应用较为广泛的磷酸肽富集方法。金属氧化物是两性物质，在酸性溶液中可以作为表面带有正电荷的路易斯酸，而在碱性溶液中可以作为表面带负电荷的路易斯碱。因此，基于路易斯酸碱理论，在酸性溶液中可以进行磷酸肽的富集，然后在碱性溶液中进行磷酸肽的洗脱。由于金属氧化物中的金属离子具有更稳定的化学性质，因此该方法可以克服IMAC材料上金属阳离子脱落的问题，具有化学重复性好、特异性高等优势。目前应用比较广泛的有二氧化钛（TiO2）、二氧化锆（ZrO2）、三氧化二铝（Al2O3）、二氧化铈（CeO2）等材料。其中TiO2法由于富集效率高、成本低等特点得到了快速的发展。为了提高磷酸肽的富集效率和特异性，在磷酸肽富集过程中加入柠檬酸、EDTA、乳酸等均可以提高磷酸肽的鉴定效果。另外，介孔结构的MOAC由于具备较大的比表面积、更多的活性位点以及尺寸排阻效应，对磷酸肽具有更好的捕获能力。例如，TiO2的纳米晶簇可通过自组装方法获得，由于该材料具有较大的比表面积，因而获得了优于固体TiO2颗粒的磷酸肽富集性能。具有八面体结构的SnO2材料由于具有较多的暴露的不饱和原子Sn被证明具有良好的磷酸肽富集效率。但是传统的TiO2材料在富集过程中需要更多的洗脱液对材料进行洗脱，然后通过离心步骤对磷酸肽进行收集，而离心过程即浪费时间，又容易引起磷酸化肽段的丢失。
发明内容
本发明的目的在于提供一种磁性纳米材料及其在磷酸肽富集中的应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种磁性纳米材料及其在磷酸肽富集中的应用，经过氨基修饰的磁性纳米材料通过乙二胺将4-羧基苯基卟啉（TCPP）和1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N，N，N-四乙酸（DOTA）共价连接到材料表面，镧系金属离子固载在材料表面合成新型的磁性纳米材料。
一种磁性纳米材料的合成方法，具体步骤为：（1）称取10mgTCPP溶解于10mL乙醇溶液中，超声30min。将EDC/NHS以10：3比例加入反应容器中活化TCPP的部分羧基基团，室温反应1h后，加入4mLNH2-MNPs悬浮液，室温反应2h；用乙醇和去离子水分别漂洗三次后，将经TCPP修饰的磁性纳米材料重悬于10mL乙醇溶液；（2）EDC/NHS以2：1比例加入反应容器中活化TCPP其余的羧基基团，室温反应30min后，加入6μL乙二胺，室温反应10h。用去离子水漂洗三次后将其重悬于含有20mgDOTA的乙腈溶液中，室温反应4h，然后用去离子水漂洗三次；（3）将磁性纳米材料重悬于含有4mMTbCl3，TmCl3，HoCl3和LuCl3的25%乙醇（v/v）溶液中，70℃水浴反应6h，用去离子水漂洗三次后重悬于乙醇溶液中备用。
作为本发明再进一步的方案：所述镧系金属离子为Tb3+，Tm3+，Ho3+和Lu3+。
作为本发明再进一步的方案：磷酸肽富集的具体步骤为：（1）取150μL磁性纳米材料于1.5mL离心管中，上样缓冲液（50%乙腈，1%TFA）清洗三次；（2）向离心管中加入150μL上样缓冲液重悬磁性纳米材料，加入蛋白酶切产物，室温涡旋15min；（3）在外加磁场作用下，吸去上清液，用上样缓冲液和去离子水漂洗材料各三次；（4）用1μL0.1M氨水洗脱磷酸肽，重复五次。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
该金属离子修饰磁性纳米材料在磷酸肽富集过程中具有更高的选择性、灵敏度及富集效率；与传统的TiO2方法相比，该金属离子修饰磁性纳米材料具有较高的磷酸肽富集特异性和选择性。
附图说明
图1为磁性纳米材料Fe3O4@TCPP-DOTA-M3+ 合成流程图。
图2为磁性纳米材料Fe3O4@TCPP-DOTA-M3+ 富集磷酸肽示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
请参阅图1-2，一种磁性纳米材料及其在磷酸肽富集中的应用，包括：
（1）固载混合镧系金属的磁性纳米材料的制备
NH2-MNPs作为Fe3O4@TCPP-DOTA-M3+合成的前体，首先通过乙二胺将4-羧基苯基卟啉（TCPP）和1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N，N，N-四乙酸（DOTA）共价修饰到材料表面，然后多种镧系金属离子通过与DOTA螯合作用固载在磁性纳米材料表面。
具体操作过程如下：（1）称取10mgTCPP溶解于10mL乙醇溶液中，超声30min。将EDC/NHS以10：3比例加入反应容器中活化TCPP的部分羧基基团，室温反应1h后，加入4mLNH2-MNPs悬浮液，室温反应2h；用乙醇和去离子水分别漂洗三次后，将经TCPP修饰的磁性纳米材料重悬于10mL乙醇溶液；（2）EDC/NHS以2：1比例加入反应容器中活化TCPP其余的羧基基团，室温反应30min后，加入6μL乙二胺，室温反应10h。用去离子水漂洗三次后将其重悬于含有20mgDOTA的乙腈溶液中，室温反应4h，然后用去离子水漂洗三次；（3）将磁性纳米材料重悬于含有4mMTbCl3，TmCl3，HoCl3和LuCl3的25%乙醇（v/v）溶液中，70℃水浴反应6h，用去离子水漂洗三次后重悬于乙醇溶液中备用。
（2）标准蛋白酶切产物的制备
将500μg牛α-酪蛋白溶解于50mM碳酸氢铵溶液，沸水中变性10min；按50:1（蛋白质/酶）的质量比加入Trypsin，在37℃水浴中孵育16h，收集的酶切肽段保存在-20℃备用；将1mg牛血清白蛋白（BSA）溶解于50mM碳酸氢铵溶液，经过DTT还原变性和IAA烷基化处理后，按上述步骤进行酶切，收集的肽段在-20℃条件下保存，备用。
（3）Hela细胞蛋白酶切产物的制备
将Hela细胞转移至含有10%胎牛血清的DMEM培养液中，置于培养箱中培养（37℃，5%CO2，饱和湿度）；收集培养的约107个Hela细胞置于细胞裂解液中（8M尿素，50mMTris-HCL缓冲液，1%二硫苏糖醇，1mM氟化钠，0.2mM钒酸钠，2mM焦磷酸钠），冰上裂解30min后，样品在4℃条件下以14000g转速离心10min；收集上清液，在沸水中变性5min。变性蛋白酶切根据FASP(filteraidedsamplepreparation)方法去除尿素。
具体操作如下：200μL蛋白质水化液（8M尿素，20mMTris-HCL，pH=8，简称UA）平衡30kD超滤管；向超滤管中加入300μLUA和20μL蛋白提取液，在4℃条件下以14000g转速离心15min；向超滤管中加入200μLUA，在4℃条件下以14000g转速离心15min；向超滤管中加入200μLIAA，置于暗处30min，在4℃以14000g转速离心15min；向超滤管中加入50mM碳酸氢铵溶液清洗超滤管；换一个新套管，按50:1的（蛋白质/酶）的质量比加入Trypsin，37℃条件下反应过夜16h；50mM碳酸氢铵溶液收集超滤下来的肽段，用NanoDrop测肽段含量。
（4）高pH反相色谱分离肽段混合物
使用RIGOLL-3000高效液相色谱系统，Agela公司的C18色谱柱，规格为4.6*250mm，直径5μm，150Å。色谱分离条件为：流动相A含2%乙腈，0.01%氨水（pH=10.0）；流动相B含98%乙腈，0.01%氨水（pH=10.0）。流速为1mL/min。梯度设置：0to4min，5%B；4to6min，5%to8%B；6to17min，8%to13%B；17to36min，13%to32%B；36to37min，32%to95%B；37to40min，95%to5%B。每隔1mins收集一个馏分，冻干后保存于-80℃条件下，备用。
（5）磷酸肽富集
取150μL磁性纳米材料于1.5mL离心管中，上样缓冲液（50%乙腈，1%TFA）清洗三次；向离心管中加入150μL上样缓冲液重悬磁性纳米材料，加入蛋白酶切产物，室温涡旋15min；在外加磁场作用下，吸去上清液，用上样缓冲液和去离子水漂洗材料各三次；用1μL0.1M氨水洗脱磷酸肽，重复五次。将洗脱下来的磷酸肽与1μLDHB基质（50%ACN，0.1%H3PO4）混合点于4800MALDI-TOF/TOFMS靶上，自然风干后上质谱检测。
一、固载混合镧系金属的磁性纳米材料的表征
采用扫描电镜和透射电镜观察合成的磁性纳米材料的形态和大小，合成的磁性纳米材料形态一致，表面粗糙，平均直径约为30nm。未经修饰的Fe3O4和负载混合镧系金属离子的磁性纳米材料的红外分析图谱结果说明Fe3O4@SiO2合成成功。
二、固载混合镧系金属离子的磁性纳米材料富集磷酸肽效果考察
实验组处理：使用50%乙腈含1%TFA溶液作为上样缓冲液，5pmolα-酪蛋白酶切后肽段与150uL材料室温混合15mins，通过磁场分离后磁性纳米材料经上样缓冲液和去离子水各洗涤三次，最后用0.1M氨水洗脱富集的磷酸肽进行质谱分析。
对照组处理：未经材料富集的5pmolα-酪蛋白酶切后肽段直接进行质谱分析
磷酸肽信号被大量非磷酸化肽段信号干扰，仅能鉴定到7条信号较低的磷酸化肽段；5pmol标准蛋白酶切产物经过混合镧系金属离子固载的磁性纳米材料富集后进行质谱分析，结果显示非磷酸化肽段除去，谱图中选择性富集到19条磷酸化肽段且信号显著提高，其中包含了7条单磷酸化肽段和12条多磷酸化肽段，几乎覆盖了α-酪蛋白大部分理论磷酸化位点。
实验结果表明：固载混合镧系金属离子的磁性纳米材料的富集效果明显优于固载单镧系金属离子的材料，混合镧系金属离子的应用有效提高了α-酪蛋白磷酸化肽段的富集效果。
三、固载混合镧系金属离子的磁性纳米材料富集磷酸肽的灵敏度考察
实验处理：（1）降低样品上样量至100fmol和50fmol，进行磷酸肽富集实验后进行质谱分析。（2）制备Fe3O4@DOTA-M3+，并将其用于5pmolα-酪蛋白酶切肽段的特异性富集。
实验结果：（1）降低样品上样量至100fmol时，经磁性纳米材料富集后可以仍可检测到6条磷酸化肽段；当上样量降至50fmol时，经富集后仍可以检测到5条磷酸化肽段.（2）质谱可鉴定到6条磷酸肽和1条非磷酸肽，说明亲水连接臂TCPP确实可以影响磷酸肽的富集特异性。
实验结果表明：制备的Fe3O4@TCPP-DOTA-M3+可对磷酸化肽段进行高效、高灵敏度的富集。
三、固载混合镧系金属离子的磁性纳米材料富集磷酸肽选择性考察
将α-酪蛋白酶切产物与非磷酸化蛋白牛血清白蛋白酶切产物按1：100比例混合，进行磷酸肽富集实验。
实验结果：由于大量非磷酸肽的干扰，未经富集的混合物样品中检测不到磷酸化肽段。然而，经固载混合镧系金属的磁性纳米材料Fe3O4@TCPP-DOTA-M3+富集后，可以检测到16条信号强度显著增强的磷酸肽峰，非磷酸肽大部分已除去。
实验结果表明：即使存在大量非磷酸肽干扰的条件下，固载混合镧系金属离子的磁性纳米材料对磷酸肽仍然有较高的富集选择性。
四、固载混合镧系金属离子的磁性纳米材料使用重复性考察
实验处理：用洗脱液将使用过的磁性纳米材料进行充分洗涤，所得材料对5pmolα-酪蛋白酶切产物进行再次磷酸肽富集，重复5次。
实验结果：经过5次的重复富集后，仍可以检测到17条磷酸肽，富集效果与第一次富集效果相没有明显差别。
实验结果表明：固载混合镧系金属的磁性纳米材料对磷酸肽富集具有良好的使用重复性，同时也证明镧系金属与DOTA之间较强的螯合作用。
五、固载混合镧系金属离子的磁性纳米材料用于Hela细胞蛋白酶切产物磷酸肽的富集
实验处理：首先，将1.0mgHela细胞蛋白提取液进行胰蛋白酶酶切；然后，将收集的肽段直接经过高pH反相色谱分馏；收集的不同馏分冻干后，用混合镧系金属固载的磁性纳米材料进行磷酸肽富集；最后，收集的磷酸肽经除盐处理后进行质谱分析。
实验结果：在单次质谱分析中，可鉴定到9048条磷酸肽，对应2103个磷酸化蛋白，其中3825条为特异性磷酸肽。与DHB/TiO2方法相比（鉴定到2286条特异性磷酸肽），新发展的方法鉴定到的特异性磷酸肽是其1.7倍。在鉴定到的特异性磷酸肽中，73.85%为单磷酸化肽段，20.44%为具有两个磷酸化位点的肽段，5.69%为具有三个磷酸化位点的肽段，说明混合镧系金属离子固载的磁性纳米材料对实际样本中磷酸肽的富集没有偏性。并且，发展的新方法鉴定到的含多磷酸化位点的肽段所占比例为26.14%，明显高于DHB/TiO2方法鉴定到的多磷酸肽数目所占比例（13.39%）。
实验结果表明，固载混合镧系金属离子的磁性纳米材料在实际生物样本磷酸肽的富集中具有较高的选择性和灵敏度。
该金属离子修饰磁性纳米材料在磷酸肽富集过程中具有更高的选择性、灵敏度及富集效率；与传统的TiO2方法相比，该金属离子修饰磁性纳米材料具有较高的磷酸肽富集特异性和选择性。
上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下做出各种变化。

Claims (6)

1.一种磁性纳米材料的合成方法，其特征在于，经过氨基修饰的磁性纳米材料通过乙二胺将4-羧基苯基卟啉（TCPP）和1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N，N，N-四乙酸（DOTA）共价连接到材料表面，镧系金属离子固载在材料表面合成新型的磁性纳米材料。
2.根据权利要求1所述的磁性纳米材料的合成方法，其特征在于，具体步骤为：（1）称取10mgTCPP溶解于10mL乙醇溶液中，超声30min。
3.将EDC/NHS以10：3比例加入反应容器中活化TCPP的部分羧基基团，室温反应1h后，加入4mLNH2-MNPs悬浮液，室温反应2h；用乙醇和去离子水分别漂洗三次后，将经TCPP修饰的磁性纳米材料重悬于10mL乙醇溶液；（2）EDC/NHS以2：1比例加入反应容器中活化TCPP其余的羧基基团，室温反应30min后，加入6μL乙二胺，室温反应10h。
4.用去离子水漂洗三次后将其重悬于含有20mgDOTA的乙腈溶液中，室温反应4h，然后用去离子水漂洗三次；（3）将磁性纳米材料重悬于含有4mMTbCl3，TmCl3，HoCl3和LuCl3的25%乙醇（v/v）溶液中，70℃水浴反应6h，用去离子水漂洗三次后重悬于乙醇溶液中备用。
5.根据权利要求1所述的磁性纳米材料的合成方法，其特征在于，所述镧系金属离子为Tb3+，Tm3+，Ho3+和Lu3+。
6.根据权利要求1所述的磁性纳米材料及其在磷酸肽富集中的应用，其特征在于，磷酸肽富集的具体步骤为：（1）取150μL磁性纳米材料于1.5mL离心管中，上样缓冲液（50%乙腈，1%TFA）清洗三次；（2）向离心管中加入150μL上样缓冲液重悬磁性纳米材料，加入蛋白酶切产物，室温涡旋15min；（3）在外加磁场作用下，吸去上清液，用上样缓冲液和去离子水漂洗材料各三次；（4）用1μL0.1M氨水洗脱磷酸肽，重复五次。
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109897087A (zh) * 2017-12-08 2019-06-18 中国科学院大连化学物理研究所 一种磷酸化肽段和蛋白质富集方法和应用
CN109956992A (zh) * 2017-12-14 2019-07-02 复旦大学 一种表面固定双金属离子的磁性纳米材料的制备及应用
CN110314704A (zh) * 2018-03-30 2019-10-11 长春理工大学 复合型光催化剂Fe3O4@SiO2@TiO2-TPAPP及其制备方法
CN110343664A (zh) * 2018-04-03 2019-10-18 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 提取外泌体及外泌体蛋白的方法
CN111351876A (zh) * 2020-04-01 2020-06-30 上海中科新生命生物科技有限公司 一种抗体药中宿主细胞蛋白半绝对定量检测方法
WO2022083799A1 (zh) * 2021-06-15 2022-04-28 广东省农业科学院农业生物基因研究中心 一种固定化金属离子亲和色谱填料、色谱柱及其制备方法
CN117343341A (zh) * 2023-11-03 2024-01-05 河南大学 一种空心纳米花形貌的mof基材料及其制备方法和应用
WO2023129040A3 (en) * 2022-01-01 2024-03-14 Akdeniz Universitesi A new phosphopeptide enrichment material containing magnetic nanoparticles and a production method thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0837871B1 (de) * 1995-06-08 2003-05-02 Roche Diagnostics GmbH Magnetisches pigment
CN102872810A (zh) * 2012-10-22 2013-01-16 武汉大学 一种固相吸附材料及在QuEChERS方法中应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0837871B1 (de) * 1995-06-08 2003-05-02 Roche Diagnostics GmbH Magnetisches pigment
CN102872810A (zh) * 2012-10-22 2013-01-16 武汉大学 一种固相吸附材料及在QuEChERS方法中应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RUI ZHAI等: "Metal ion-immobilized magnetic nanoparticles for global enrichment and identification of phosphopeptides by mass spectrometry", 《RSC ADV.》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109897087A (zh) * 2017-12-08 2019-06-18 中国科学院大连化学物理研究所 一种磷酸化肽段和蛋白质富集方法和应用
CN109956992A (zh) * 2017-12-14 2019-07-02 复旦大学 一种表面固定双金属离子的磁性纳米材料的制备及应用
CN110314704A (zh) * 2018-03-30 2019-10-11 长春理工大学 复合型光催化剂Fe3O4@SiO2@TiO2-TPAPP及其制备方法
CN110343664A (zh) * 2018-04-03 2019-10-18 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 提取外泌体及外泌体蛋白的方法
CN111351876A (zh) * 2020-04-01 2020-06-30 上海中科新生命生物科技有限公司 一种抗体药中宿主细胞蛋白半绝对定量检测方法
WO2022083799A1 (zh) * 2021-06-15 2022-04-28 广东省农业科学院农业生物基因研究中心 一种固定化金属离子亲和色谱填料、色谱柱及其制备方法
WO2023129040A3 (en) * 2022-01-01 2024-03-14 Akdeniz Universitesi A new phosphopeptide enrichment material containing magnetic nanoparticles and a production method thereof
CN117343341A (zh) * 2023-11-03 2024-01-05 河南大学 一种空心纳米花形貌的mof基材料及其制备方法和应用

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