CN104849251A - 一种快速检测地沟油的时间分辨荧光免疫方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测地沟油的时间分辨荧光免疫方法及试剂盒，本发明方法从地沟油中大量繁殖的细菌种类入手，分析污染地沟油的优势细菌，再确定其特异成分，来达到鉴别地沟油的目的，研究方法非常独特，利用地沟油中优势菌体的脂多糖，筛选单克隆抗体，建立脂多糖的TRFIA检测方法。本发明所述的方法具有对地沟油特异性强和检测灵敏度高的优点，在地沟油的鉴别检测中具有非常重要的意义。

Description

一种快速检测地沟油的时间分辨荧光免疫方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及食品安全和生化监测领域，特别涉及一种快速检测地沟油的时间分辨荧光免疫方法及试剂盒。

背景技术

地沟油是质量、卫生极差，过氧化值、酸价、水分、羰基价、丙二醛、AFBI(黄曲霉毒素Aflatoxin Bl(AFBI))等指标严重超标的非食用油。餐饮业废弃油脂中含有大量的有毒有害物质，人类食用后会产生头晕、恶心、呕吐、腹泻、失眠、乏力、消化不良、肝区不适和剧烈腹绞痛等中毒症状，长期食用会出现贫血、营养不良，内脏受损，导致人体体重减轻和儿童发育障碍，严重者还可能出现中毒性肝病，诱发胃腺癌、肾癌及乳腺、卵巢、小肠等部位癌肿，长期食用对人体健康造成极大危害甚至致癌。有学者对泔水油进行了毒理学研究。研究表明，饲喂泔水油的小白鼠120天后出现死亡现象，到180天死亡率达到60％以上，而对照组的小白鼠没有出现死亡现象；实验组中小白鼠行动缓慢，有病状，肝脏表面有一个黄色脂肪球，肝脏发黄，肝脏细胞变多，呈椭圆形，并有很多细胞处于分裂状态。地沟油中的重金属、毒素(如丙烯醛)严重超标，过氧化值高于0.4％，远远超过国家标准0.15％。长期摄入会使细胞功能衰竭，诱发多种疾病，甚至致癌。日本曾发生食用过氧化值为7.5％的劣质油脂而造成集体急性中毒事件。

我国饮食业发达，是全世界消耗食用油最大的国家。在我国，地沟油的原料获得比较容易，并且工艺简单，几个简单的设备就可以加工，每年产生至少500万吨地沟油。由于执法取证困难及违法成本低，在利益的驱动下一些不法投机者将地沟油用在食品中，对社会和食品安全造成非常大的危害。目前国内尚无可靠的检测地沟油的方法，这使得执法部门无法对市场进行有效的监控。要减少不法投机者将地沟油用在食品中，除提高违法者的违法成本和建立市场准入制度外，还需要建立一套快速鉴别地沟油的检测系统，为执法者执法时提供技术支持。

目前国内尚未有检测地沟油的统一标准。现行的国家强制性标准《食用植物油卫生标准》(2716-2005)中，关于食用油的理化指标检测包括酸价、过氧化值、浸出油溶剂残留、游离酚(棉籽油)、总砷、铅、黄曲霉毒素、苯并芘、农药残留共9项指标，分别对植物原油和植物食用油进行不同的标准检测。市场上已经有几种类型的快速检测技术或方法，分别为：电导率检测法、胆固醇检测法、薄层层析技术等快速检测方法，这些方法在应用上各有优势，但都存在缺陷，如下所述：

电导率检测法：因为油脂在烹饪过程中接触了洗涤剂、金属器皿，或长期停留在重金属环境中，因此地沟油的电导率值明显高于普通食用油。武汉工业学院曾经找到一种30分钟内检测地沟油的方法。通过检测油的电导率，得出地沟油电导率是一级食用油的5～7倍的结论。这种方法对于“泔水油”的检测相对有效。然而它的缺陷在于仅仅适用于地沟油添加量在20％以上的食品油检测；另外只适用于物理压榨法制备的油品，化学浸出法制备的油品电解质高容易造成假阳性。

胆固醇检测法：因为地沟油是多种动、植物油脂的混合物，其中动物脂肪中普遍含有胆固醇，而在人们食用的正规植物油中一般不含或只含有极少量的胆固醇。利用这一特性可以鉴别出某些地沟油，但同样要求地沟油的添加量在10％以上。当有些食用油由于添加了棕榈油，比较容易在低温条件下形成结晶造成假阳性。

薄层层析方法：由于地沟油和深度油炸油中含有大部分食用油所不含的醛、酮类极性化合物，在展开剂作用下油样中的各种成分在硅胶板上扩散分离，经过显色剂显色后可观察到色谱板上不同的薄层斑点，记下原点至主斑点中心及展开剂前沿的距离，计算比移值(RF)。拖尾斑中主要是醛、酮类极性化合物。但是薄层层析法对于一些未经纯化的油(比如芝麻油、花椒油等)和加入其他成分的油(如辣椒油)，容易出现假阳性。

综上所述，现有的方法准确度不高，特异性不强。2011年10月12日我国卫生部新闻发言人邓海华透露，目前征集到的5种地沟油检测方法特异性不强，有关部门将再向社会公开征集方法。因此，开发灵敏度高、特异性强的用于地沟油的检测技术迫在眉睫。

时间分辨荧光免疫分析(Time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)是标记免疫分析方法的一种。是在荧光分析的基础上发展起来的一种特殊的荧光分析。它利用具有长效荧光的稀土金属(Eu、Tb、Sm、Dy)作标记物，充分利用激发光与发射光之间的降移与发射光较长的半寿期，在激发光后延时测量发射光的强度。从而所测的荧光不受激发光和被检物中的非特异荧光干扰，提高了检测的特异性与灵敏度。在激发光后延时400微秒，测量400微秒，间歇200微秒后进入下一个测量周期，每一个周期为1000微秒。对每一个样品实施1秒钟的测量，意味着完成了1000个周期的测量，测量精确度极高TRFIA方法学研究和临床应用的发展十分迅速，成为继RIA之后标记免疫分析发展的一个新的里程碑，已广泛运用于蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针、细菌毒素和生物活性细胞的定量分析。TRFIA技术已成为现代临床微量检验、分子生物学、细胞学和生物化学等生物医学研究中非常有发展前景的分析手段。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种快速检测地沟油的时间分辨荧光免疫方法和试剂盒，本发明方法从地沟油中所大量繁殖的细菌种类入手，分析地沟油的优势细菌，再确定其特异成分，来达到鉴别地沟油的目的，研究方法非常独特，目前国内没有前例。利用地沟油中优势菌体的脂多糖，建立单克隆抗体的检测试剂，能够更特异、更经济，方便操作和使用。本发明提供的时间分辨免疫荧光学检测方法，操作简单、检测时间短、灵敏度高的特点，能够弥补上述电导率检测法、胆固醇检测法、薄层层析技术等灵敏度低、特异性差的缺点。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

一种快速检测地沟油的时间分辨荧光免疫方法，

包括如下步骤：优势菌鉴定技术：本项目通过传统细菌分离培养技术、生化鉴定技术、细菌数测定可以确认泔水中优势菌的种类；单克隆抗体制备技术；时间分辨免疫技术

步骤一：优势菌筛选鉴定：

(1)地沟油生产原料样品前处理：选取四份泔水样品，对每份泔水样品进行4个梯度的稀释，其中加入石蜡和吐温80的目的是将油样乳化为水溶性溶液，具体方法如下:将泔水样品原液每2ml与1ml石蜡，2ml吐温80及15ml生理盐水混合，40℃～44℃持续震荡至混合均匀，之后每毫升样品加入9毫升生理盐水，混合均匀后再每毫升样品加入9毫升生理盐水至混合均匀，备用；

(2)培养细菌：前处理后，将每个样品的稀释前后不同浓度液体分别接种到麦康凯(Mac Conkey)和伊红亚甲蓝(EMB)两种培养基，具体方法是取液体100μl加入到培养基中央，然后用L型玻璃棒将液体均匀涂布到平板上，做好标记，置于电热恒温箱37℃培养，18h～24h后观察菌落生长情况，将形态相近的菌落归类计数，然后挑选出有代表性的不同形态的菌落接种到血平板，编号并标记来源，置37℃18h～24h做纯化培养；

(3)细菌鉴定：将纯化培养的菌落，对应每个菌落取相应数量的试管，每管加3.5ml生理盐水，用棉签在血平板上蘸取适量菌溶于管内，控制菌悬液麦氏单位在0.5～0.63的范围内，标记后备用，然后将提前半小时从冰箱取出的GN卡插到管内，即可放入VITKE2全自动微生物鉴定系统，完成装载和菌种鉴定；

(4)针对菌种制备特定脂多糖抗体。

步骤二、脂多糖单克隆抗体制备及纯化

(1)、样品收集：将地沟油样品加入试管中，加入蒸馏水，强烈震荡，待水油分离时取水相备用；

(2)、间接竞争免疫分析检测步骤：取脂多糖-BSA板条，每孔加入50ul脂多糖标准或上述步骤(1)处理好的样品到各自的微孔中，加缓冲液稀释的抗脂多糖单克隆抗体50ul，25℃振荡0.5h，洗涤液洗3次，没有连接到固相抗原上的脂多糖抗体在洗涤步骤中被除去，再加分析缓冲液稀释的Eu3+-羊抗鼠抗体100ul，25℃振荡0.5h，用洗涤液洗6次，加200ul增强液振荡5min后测量，从标准曲线计算样品中的脂多糖含量。

进一步的，所述步骤二的全部过程可在A uto D ELFIA 1235上自动完成。

一种快速检测地沟油的时间分辨荧光免疫试剂盒，该试剂盒是由1、包被有LPS-BSA的96或48孔包被板，2、缓冲液，3、FB1标准，4、LPS单克隆抗体冻干品，5、铕标记的羊抗鼠抗体，6、洗涤液，7、增强液所组成；

其中，缓冲液：含8mmol/L NaCl、0.1％BSA、0.2％牛IgG、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸、0.1mL/L Tween-80和0.1％NaN3的pH7.8、50mmol/L Tris-HCl溶液；

6×LPS标准液：1.0mL/瓶，标准液浓度为：0，1.0，10，100，500，1000ng/mL；

洗涤液：含14.5mmol/L NaCl、0.2mL/L Tween-80和0.2％NaN3的pH7.8、50mmol/L Tris-HCl溶液；

增强液：每升pH3.2邻苯二甲酸氢钾缓冲液含15μmolβ-萘甲酰三氟丙酮，50μmol三正辛基氧化膦和1mL曲拉通X-100。

进一步的，所述LPS-BSA活性包被板的制备方法为：包被板包被固相抗原：用pH 9.6、50mmol/LNa2CO3-NaHCO3缓冲液将OTA-BSA稀释至10mg/L做为包被液，96或48孔微孔板各孔加100μL，4℃放置过夜，弃去包被液，冲洗三次，加150μL含3g/L BSA的上述缓冲液封闭，4℃放置过夜，弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存。

进一步的，所述铕标记的羊抗鼠抗体的制备方法为：取溶解于pH 7.0、50mmol/L PBS的5g/L羊抗鼠抗体1mL，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为pH 8.5-9.0、含0.155mol/LNaCl的50mmol/LNa2CO3-NaHCO3缓冲液，收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量，用上述洗脱液稀释羊抗鼠抗体至2mg/mL，取500-1000μL稀释后的羊抗鼠抗体加入含0.2-0.4mg的Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸的小瓶中，28-30℃磁力搅拌反应16h，反应液经用pH7.6、80mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡的1×20cm的Sephadex-G50柱层析，收集蛋白峰，稀释、分装备用。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

1本发明方法从地沟油中所大量繁殖的细菌种类入手，分析地沟油的优势细菌，再确定其特异成分—脂多糖，在地沟油生产过程中没办法去除，来达到鉴别地沟油的目的，研究方法非常独特，目前国内没有前例。

2利用地沟油中优势菌体的脂多糖，建立单克隆抗体的检测试剂，能够更特异、更经济，方便操作和使用。

3本发明提供的时间分辨免疫学检测方法，操作简单、检测时间短(15分钟以内)、灵敏度高的特点，能够弥补上述电导率检测法、胆固醇检测法、薄层层析技术等灵敏度低、特异性差的缺点。

4脂多糖-TRFIA灵敏度高，检测范围宽，重复性、稳定性好，是一种简便、快速、经济、稳定、可进行大批量地沟油筛查的检测方法。

附图说明

图1为根据标准浓度和荧光值建立的标准曲线。

图2为不同样品编号所得菌落数量图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施方式对本发明方案做进一步详细描述，

试验例：

相关试剂：

a.用脂多糖纯品制备脂多糖标准溶液，浓度分别为0.1ug/L，0.5ug/L，1ug/L，5ug/L，10ug/L，100ug/L，1000ug/L，稀释液为甲醇：水＝7：3的溶液，它也是0ug/L的标准溶液。

b.分析缓冲液为含8mmol/L NaCl、0.1％BSA、0.2％牛IgG、50umol/L二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、0.1ml/L Tween-80和0.1％NaN3的pH 7.8Tris-H Cl缓冲液。

c.洗涤液为14.5mmol/L NaCl、0.2ml/L TWeen-80和0.2％NaN 3的50mmol/L pH 7.8的Tris-HCl缓冲液。

d.增强液的配制：1L pH 3.2邻苯二甲酸氢钾缓冲液含15umol"-萘甲酰三氟丙酮("β-NTA)，50umol三正辛基氧化膦(TO PO)，1mlTriton X-100。

1优势菌鉴定技术：本项目通过传统细菌分离培养技术、生化鉴定技术、细菌数测定可以确认泔水中优势菌的种类见附图2。根据优势菌的种类，确定细菌的脂多糖内毒素。

2脂多糖单克隆抗体制备及纯化

(1)细菌脂多糖和脂溶性蛋白人工免疫抗原的合成

把甲基化的牛血清白蛋白(BSA)、戊二醛、细菌(肺炎克莱伯菌等)脂多糖和细菌脂溶性蛋白按摩尔比1:25:80的比例混合后，用0.01M碳酸钠溶液调节混合物溶液pH到9.0，40℃反应6小时，使细菌脂多糖和脂溶性蛋白连接到载体蛋白上，得到细菌脂多糖和脂溶性蛋白人工免疫抗原。

小鼠免疫及细胞融合取制备所得脂多糖完全抗原偶联物与弗氏完全佐剂等体积混合均匀。取0.3mL混合液(含100μg脂多糖-BSA)皮下注射7周龄的BALB/c小鼠。每隔2周用弗氏不完全佐剂与脂多糖-BSA混匀重复免疫，加强免疫7天。3.4.1.4眼眶取血，用酶联免疫吸附测定间接法(ELISA,Enzyme-Linked ImmunosorbnentAssay)测定其效价。将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按5:1～10:1的比例混合，用PEG快速融合。加入含有次黄嘌呤(hypoxanthine，H)、氨基喋呤(aminopterin，A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine，T)的培养基(HAT)进行细胞筛选并铺于有准备好的饲养细胞的96孔细胞培养板，置37℃，6％CO2培养箱内培养。

(2)阳性杂交瘤细胞株的筛选及单克隆抗体的生产

单克隆抗体批量生产最普遍的是采用小鼠腹腔接种法。小鼠腹腔具有营养丰富的环境。腹腔接种之后，阳性杂交瘤细胞株可快速生长并大量分泌本项目所需的单克隆抗体，一般每只小鼠可收集5～10毫升的腹水，多时甚至超过30毫升，每毫升单克隆抗体浓度可达数毫克甚至数十毫克水平。此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。

用含20％血清的HAT培养基稀释筛选出来的杂交瘤细胞至每毫升含2.5、15、和50个细胞三种不同的稀释度，分别分装到96孔板，每个稀释度32孔，每孔0.1mL，然后在每孔中加入0.1mL的饲养细胞，置37℃，5％CO2培养箱内培养。3次克隆化后的结果均为阳性的为能稳定分泌抗毒素抗体的杂交瘤细胞，采用小鼠腹腔接种法生产单克隆抗体腹水。选用标准BALB/c小鼠，先用降植烷进行小鼠腹腔注射，一周后每只老鼠按照5X106杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。1周后采集腹水，可以连续采集2-3次。

将腹水置于37℃静置2小时后，13000rpm离心10min，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清。过玻璃纤维柱，收集到澄清的腹水。

单克隆抗体的纯化首先经过辛酸-硫酸铵沉淀法粗提纯小鼠腹水，可除去白蛋白等绝大部分杂蛋白。

用葡萄球菌G蛋白与萄聚糖(Sepharose CL-4B)交联，制备亲和层析柱将粗提抗体上样结合后洗脱。葡萄球菌G蛋白可与IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3结合，以达到纯化的目的。

洗脱液中的抗体浓度可用紫外光吸收法粗测，毒素单克隆抗体溶液在A280nm时，1.44(吸光单位)相当于1mg/ml。经低pH洗脱后，在收集管内预置中和液可保持纯化抗体的活性。亲和层析法具有特异性高、纯度高的特点。通过上述整套工艺，腹水纯化后的单抗抗体纯度超过95％，且具有稳定效价。

4Eu3+-羊抗鼠抗体的制备

取溶解于50mmol/L PBS pH 7.0的10g/L羊抗鼠抗体2ml，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol/L NaCl的50mmol/LNa2CO3-NaHCO3pH 8.5缓冲液。收集蛋白质峰，经紫外吸收分析定量(1.46A280-0.74A260)，用上述洗脱液稀释羊抗鼠抗体至2g/L.取1ml已转换缓冲液的羊抗鼠抗体，加入Eu3+标记盒中的含0.5m gEu3+-N 2-[p-异氰酸-主要试剂的配制苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-D TTA)的小瓶中，30℃磁力搅拌反应20h.反应液经用80mmol/L Tris-HClpH 7.8缓冲液平衡的Sepharose C L-6B柱(1cm*40cm)层析，A280监测收集蛋白质峰，稀释分装备用。

3固相抗原的制备

将脂多糖-BSA用50mmol/L Na2CO3-NaHCO3pH 9.6缓冲液稀释至2mg/L，96孔微孔板各孔加100ul，4℃放置过夜.弃去包被液，冲洗3次，加150ul含3g/L BSA的上述缓冲液封闭，4℃放置过夜.弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存。

4检测步骤

样品处理：将地沟油样品5ml加入试管中，再取2ml蒸馏水加入，强烈震荡，待水油分离时取1ml水备用

间接竞争免疫分析检测步骤：取脂多糖-BSA板条，每孔加入50ul脂多糖标准或处理好的样品到各自的微孔中，加缓冲液稀释的抗脂多糖小鼠腹水50ul，25℃振荡0.5h，洗涤液洗3次，没有连接到固相抗原上的脂多糖抗体在洗涤步骤中被除去，再加分析缓冲液稀释的Eu3+-羊抗鼠抗体100ul，25℃振荡0.5h，用洗涤液洗6次，加200ul增强液振荡5min后测量，从标准曲线计算样品中的脂多糖含量。全部过程可在A uto D ELFIA 1235上自动完成。见表1、图1.

表1标准浓度及荧光值

5所需试剂

a.用脂多糖纯品制备脂多糖标准溶液，浓度分别为0.1ug/L，0.5ug/L，1ug/L，5ug/L，10ug/L，100ug/L，1000ug/L，稀释液为甲醇：水＝7：3的溶液，它也是0ug/L的标准溶液。

b.分析缓冲液为含8mmol/L NaCl、0.1％BSA、0.2％牛IgG、50umol/L二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、0.1ml/L Tween-80和0.1％NaN3的pH 7.8Tris-H Cl缓冲液。

c.洗涤液为14.5mmol/L NaCl、0.2ml/L TWeen-80和0.2％NaN 3的50mmol/L pH 7.8的Tris-HCl缓冲液。

d.增强液的配制：1L pH 3.2邻苯二甲酸氢钾缓冲液含15umol"-萘甲酰三氟丙酮("β-NTA)，50umol三正辛基氧化膦(TO PO)，1mlTriton X-100。

一种检测地沟油内毒素(LPS)的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，该试剂盒是由1、包被有LPS-BSA的96或48孔包被板，2、缓冲液，3、FB1标准，4、LPS单克隆抗体冻干品，5、铕标记的羊抗鼠抗体，6、洗涤液，7、增强液所组成。

缓冲液：含8mmol/L NaCl、0.1％BSA、0.2％牛IgG、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸、0.1mL/L Tween-80和0.1％NaN3的pH7.8、50mmol/L Tris-HCl溶液；

6×LPS标准液：1.0mL/瓶，标准液浓度为：0，1.0，10，100，500，1000ng/mL。

洗涤液：含14.5mmol/L NaCl、0.2mL/L Tween-80和0.2％NaN3的pH7.8、50mmol/L Tris-HCl溶液。

增强液：每升pH3.2邻苯二甲酸氢钾缓冲液含15μmolβ-萘甲酰三氟丙酮，50μmol三正辛基氧化膦和1mL曲拉通X-100。

本发明主要采用时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)来检测地沟油LPS。采用TRFIA的技术有：抗LPS单克隆抗体制备、LPS-BSA活性包被板的制备、Eu3+标记抗体的制备、LPS标准品的制备、增强液的制备。

LPS-BSA活性包被板的制备：包被板包被固相抗原：用pH 9.6、50mmol/LNa2CO3-NaHCO3缓冲液将OTA-BSA稀释至10mg/L做为包被液，96或48孔微孔板各孔加100μL，4℃放置过夜，弃去包被液，冲洗三次，加150μL含3g/L BSA的上述缓冲液封闭，4℃放置过夜，弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存。

铕标记的羊抗鼠抗体的制备：取溶解于pH 7.0、50mmol/L PBS的5g/L羊抗鼠抗体1mL，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为pH8.5-9.0、含0.155mol/LNaCl的50mmol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液，收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量，用上述洗脱液稀释羊抗鼠抗体至2mg/mL，取500-1000μL稀释后的羊抗鼠抗体加入含0.2-0.4mg的Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸的小瓶中，28-30℃磁力搅拌反应16h，反应液经用pH7.6、80mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡的1×20cm的Sephadex-G50柱层析，收集蛋白峰，稀释、分装备用。

测定方法：测定的基础是标记免疫反应。包被有LPS-BSA的微孔板，加入LPS标准或已处理好的样品到各自的微孔中、再加入抗LPS单克隆抗体，振荡反应，游离的LPS与微孔板上的LPS-BSA竞争抗LPS单克隆抗体，洗涤液洗涤，没有连接的抗LPS单克隆抗体在洗涤步骤中被除去。加入Eu3+-羊抗鼠抗体，进行标记免疫反应，再用洗涤液洗涤，反应后没有连接的Eu3+-羊抗鼠抗体在洗涤步骤中被除去。加增强液振荡后，在紫外光的激发下发射很强的荧光，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，荧光强度与样品中的FB1浓度成反比，对照标准曲线即可确定样品中LPS的量。

制备试剂盒和检测地沟油样品

试剂盒提供的试剂足够进行96个测量，盒中的材料如下：

(1).1×96孔板(8条×12孔，可以拆分为单孔)包被有LPS-BSA。

(2).6×LPS标准液，1.0mL/瓶，标准液浓度为：0，1.0，10，100，500，1000ng/mL。

(3).1×LPS单克隆抗体冻干品，用时0.5mL蒸馏水溶解。

(4).1×Eu3+-羊抗鼠抗体冻干品，用时0.5mL蒸馏水溶解。

(5).1×增强液：15mL。

(6).1×洗涤液：30mL，用时以蒸馏水1：25稀释。

(7).1×缓冲液：30mL。

用户应自备的试剂

70％甲醇溶液：30mL蒸馏水或去离子水和70mL纯甲醇混合制备70％甲醇溶液。

蒸馏水或去离子水。

测定之前注意事项

1.所使用试剂应在室温(18-30℃)进行使用。

2.使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。

3.如果样品量大建议使用多通道移液器。

4.在所有恒温孵育过程中避免光线照射，用深色盖子盖住微孔。

5.取出需用数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2-8℃。

先将样品进行处理：将地沟油样品5ml加入试管中，再取2ml蒸馏水加入，强烈震荡，待水油分离时取1ml水备用。

取LPS-BSA板条，加入50μL的LPS标准或处理好的样品到各自的微孔中，加缓冲液1：20稀释的LPS单克隆抗体50μL，25℃振荡0.5小时，洗涤液洗3次，加缓冲液1：20稀释的Eu3+-羊抗鼠抗体100μL，25℃振荡1小时，用洗涤液洗6次，加200μL增强液振荡5分钟后测量。从标准曲线计算样品中的FB1含量，见表2，该例的样品浓度为4.7ng/mL(7585ng/g)。

表2

实施例2检测市售低档食用油样品

先将样品进行处理：将地沟油样品5ml加入试管中，再取2ml蒸馏水加入，强烈震荡，待水油分离时取1ml水备用。

取LPS-BSA板条，加入50μL的LPS标准或处理好的样品到各自的微孔中，加缓冲液1：20稀释的LPS单克隆抗体50μL，25℃振荡0.5小时，洗涤液洗3次，加缓冲液1：20稀释的Eu3+-羊抗鼠抗体100μL，25℃振荡1小时，用洗涤液洗6次，加200μL增强液振荡5分钟后测量。从标准曲线计算样品中的FB1含量，见表1，该例的样品浓度为31.7ng/mL(5241ng/g)。见表3

表3

本发明的时间分辨免疫学检测方法，既满足4S原则，又能精确定量，具体而言:

1、特异性，利用抗原与抗体特异反应原理检测地沟油中的脂多糖，其相对特异性可达到98.0％以上；

2、敏感性，灵敏度为0.01μg/kg，测量范围为0.01～100μg/kg；

3、快速性，使用该方法检测地沟油时间可以缩短至数小时，弥补了传统检验方法耗时长、特异性差的不足，特别适合大量样本快速筛查；

4、简便性，本发明所得试剂检测方法操作简便，不需要专业人员操作；

5、定量性，本发明的试剂盒可实现地沟油细菌脂多糖成分的定量检测。因此本项目开发产品符合现代诊断试剂的标准和发展趋势，具有十分明显的先进性。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (5)

1.一种快速检测地沟油的时间分辨荧光免疫方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：优势菌筛选鉴定：

(1)地沟油生产原料样品前处理：选取四份泔水样品，对每份泔水样品进行4个梯度的稀释，其中加入石蜡和吐温80的目的是将油样乳化为水溶性溶液，具体方法如下:将泔水样品原液每2ml与1ml石蜡，2ml吐温80及15ml生理盐水混合，40℃～44℃持续震荡至混合均匀，之后每毫升样品加入9毫升生理盐水，混合均匀后再每毫升样品加入9毫升生理盐水至混合均匀，备用；

(2)培养细菌：前处理后，将每个样品的稀释前后不同浓度液体分别接种到麦康凯(Mac Conkey)和伊红亚甲蓝(EMB)两种培养基，具体方法是取液体100μl加入到培养基中央，然后用L型玻璃棒将液体均匀涂布到平板上，做好标记，置于电热恒温箱37℃培养，18h～24h后观察菌落生长情况，将形态相近的菌落归类计数，然后挑选出有代表性的不同形态的菌落接种到血平板，编号并标记来源，置37℃18h～24h做纯化培养；

(3)细菌鉴定：将纯化培养的菌落，对应每个菌落取相应数量的试管，每管加3.5ml生理盐水，用棉签在血平板上蘸取适量菌溶于管内，控制菌悬液麦氏单位在0.5～0.63的范围内，标记后备用，然后将提前半小时从冰箱取出的GN卡插到管内，即可放入VITKE2全自动微生物鉴定系统，完成装载和菌种鉴定；

(4)针对菌种制备特定脂多糖抗体。

步骤二、脂多糖单克隆抗体制备及纯化

(1)、样品收集：将地沟油样品加入试管中，加入蒸馏水，强烈震荡，待水油分离时取水相备用；

(2)、间接竞争免疫分析检测步骤：取脂多糖-BSA板条，每孔加入50ul脂多糖标准或上述步骤(1)处理好的样品到各自的微孔中，加缓冲液稀释的抗脂多糖单克隆抗体50ul，25℃振荡0.5h，洗涤液洗3次，没有连接到固相抗原上的脂多糖抗体在洗涤步骤中被除去，再加分析缓冲液稀释的Eu3+-羊抗鼠抗体100ul，25℃振荡0.5h，用洗涤液洗6次，加200ul增强液振荡5min后测量，从标准曲线计算样品中的脂多糖含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤二的全部过程可在A uto D ELFIA 1235上自动完成。

3.一种快速检测地沟油的时间分辨荧光免疫试剂盒，其特征在于，该试剂盒是由1、包被有LPS-BSA的96或48孔包被板，2、缓冲液，3、FB1标准，4、LPS单克隆抗体冻干品，5、铕标记的羊抗鼠抗体，6、洗涤液，7、增强液所组成；

其中，缓冲液：含8mmol/L NaCl、0.1％BSA、0.2％牛IgG、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸、0.1mL/L Tween-80和0.1％NaN3的pH7.8、50mmol/L Tris-HCl溶液；

6×LPS标准液：1.0mL/瓶，标准液浓度为：0，1.0，10，100，500，1000ng/mL；

洗涤液：含14.5mmol/L NaCl、0.2mL/L Tween-80和0.2％NaN3的pH7.8、50mmol/L Tris-HCl溶液；

增强液：每升pH3.2邻苯二甲酸氢钾缓冲液含15μmolβ-萘甲酰三氟丙酮，50μmol三正辛基氧化膦和1mL曲拉通X-100。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述LPS-BSA活性包被板的制备方法为：包被板包被固相抗原：用pH 9.6、50mmol/LNa2CO3-NaHCO3缓冲液将OTA-BSA稀释至10mg/L做为包被液，96或48孔微孔板各孔加100μL，4℃放置过夜，弃去包被液，冲洗三次，加150μL含3g/L BSA的上述缓冲液封闭，4℃放置过夜，弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述铕标记的羊抗鼠抗体的制备方法为：取溶解于pH 7.0、50mmol/L PBS的5g/L羊抗鼠抗体1mL，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为pH 8.5-9.0、含0.155mol/LNaCl的50mmol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液，收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量，用上述洗脱液稀释羊抗鼠抗体至2mg/mL，取500-1000μL稀释后的羊抗鼠抗体加入含0.2-0.4mg的Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸的小瓶中，28-30℃磁力搅拌反应16h，反应液经用pH7.6、80mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡的1×20cm的Sephadex-G50柱层析，收集蛋白峰，稀释、分装备用。