CN102928600A

CN102928600A - 一种地沟油快速检测试纸的制备方法

Info

Publication number: CN102928600A
Application number: CN2012104403163A
Authority: CN
Inventors: 李攀; 谈宇清
Original assignee: Shenzhen Biochemilogic Technology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Biochemilogic Technology Co ltd
Priority date: 2012-11-07
Filing date: 2012-11-07
Publication date: 2013-02-13
Anticipated expiration: 2032-11-07
Also published as: CN102928600B

Abstract

本发明提供一种地沟油快速检测试纸的制备方法，包括如下步骤：A）免疫彩色乳胶微球的制备；B）免疫彩色胶乳反应垫的制备；C）NC膜的制备；D）彩色胶乳试纸条的的组装。利用本发明制备的地沟油检测试纸检测灵敏度高，可以同时检测多个指标，为地沟油检测提供更全面、系统的检测方法，相对缩小检测成本；该检测试纸在常温下可保质两年，有效延长保质期并降低保存条件；非专业人士用该检测试纸即可完成全程检测，操作简单，有利于该法的推广和普及；整个检测过程最快可以在10min内完成，更适合于现场快速筛选。

Description

一种地沟油快速检测试纸的制备方法

技术领域

本发明涉及地沟油检测技术领域，尤其涉及一种地沟油快速检测试纸的制备方法。

背景技术

地沟油也被称为潲水油、泔水油或餐桌回收油脂，是人们对于各种劣质油脂的总称；地沟油经历了多次高温反复油炸与下水道的氧化腐败过程，质量、卫生极差，成分发生变化，产生了如黄曲霉毒素、苯并芘等多种有毒物质，并含有洗涤剂成分等后期污染物，如长期食用必然会引发身体的疾病。轻则引起消化不良、腹泻，严重的会引发贫血、中毒性肝病等症状，长期食用有诱发癌症的危险，危害极大；近年来地沟油事件屡见不鲜据统计，每年有200-300万吨地沟油回流市场，其中大部分并没有用于炼制生物柴油等合法途径，而是回流到餐桌，地沟油占据的食用油市场份额比例高达10%，而且现在的“地沟油”精炼程度已经很高，一些肉眼可见污染物，完全可以通过精炼去掉。

目前，根据地沟油的特征成分，地沟油的检测方法主要有水分含量测定法、酸价测定法、胆固醇含量测定法、近红外光谱法、电导率与极性物质测定法、重金属含量测定法；上述方法在应用上各有优势，一定程度上都能进行地沟油的定性定量检测，但也存在缺陷：如食用油中掺入地沟油的比例普遍需要达到相对较高的程度才能被检出；电导率法的检出下限为地沟油添加量达20%以上，胆固醇法的缺陷在于其检出下限为地沟油的添加量在10%以上，而且在检测中出现假阳性的可能性比较大；薄层层析法对于一些未经纯化油和加入其他成分的油，容易出现假阳性；对于一些检测精度相对于上述方法比较高的，如：深圳药检所，HPLC检测胆固醇含量，最低检测限20μg/ml；深圳药检所，LC-MS法检测DBS( 十二烷基苯磺酸钠)，检出限为20μg/ml；清华大学，顺磁共振波谱法，检测自由基等，需要大型贵重检测仪器，并且耗时较长，更适用于实验室的确证检验而不适于现场快速筛查的使用；上海之江生物医药科技有限公司利用实时荧光定量PCR扩增动物特有基因片段定性检测地沟油，灵敏度高（可检测出最低1‰的含量），但是整个操作过程繁琐，需要非常专业的人员去操作；广州市疾病预防控制中心利用免疫荧光学检测方法检测细菌脂溶性蛋白和脂多糖，但此法仅能从泔水中含有大量细菌方面对地沟油作出判断；因此，开发新的快速检测技术，用于食用油中地沟油的定性、定量检测迫在眉睫。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种地沟油快速检测试纸的制备方法，包括如下步骤：A）免疫彩色乳胶微球的制备：（a）彩色乳胶微球的预处理：分别取红色、黄色、蓝色、绿色四色乳胶微球溶液，用超声波处理后，用超纯水调节浓度，离心，取沉淀用MES缓冲液清洗两次，得到洗好的乳胶，用预冷的MES缓冲液分别将EDC和NHS配置成溶液加入到所述洗好的乳胶中，在室温下缓慢混匀，孵育结束后离心，取沉淀用MES缓冲液清洗两次，得到乳胶微球溶液；（b）抗体标记：用MES缓冲液将鼠抗黄曲霉毒素单克隆抗体、鼠抗苯并芘单克隆抗体、鼠抗茴香胺单克隆抗体和鼠抗DBS单克隆抗体稀释，之后分别缓慢加入到用磁力搅拌器搅拌的红色、黄色、蓝色和绿色的所述乳胶微球溶液中，室温轻柔搅拌后用PBS离心洗涤，沉淀用PBS-TBN溶解，超声波处理后，加入PBS-TBN至标记前体积，置4℃保存备用；B）免疫彩色胶乳反应垫的制备：将玻璃纤维膜浸泡于反应垫处理液中，水浴处理后平铺于纱网上干燥3-4h，将标记后的彩色乳胶微球按照效价实验匹配的结果，以体积比为红：黄：蓝：绿=2：2：4：5混合均匀，按照每毫升乳胶溶液铺50cm²涂覆玻璃纤维膜，干燥16h后置4℃密封保存备用；C）NC膜的制备：将抗原黄曲霉毒素-OVA，苯并芘-OVA，茴香胺-OVA和DBS-OVA用包被缓冲液分别稀释至0.3、0.4、0.4和0.2mg/ml，用喷膜仪按1.0、0.8、0.8和1.5μl/cm分别喷涂于同一条NC膜上的不同区域作为检测线，每条检测线相距4-10mm，将浓度为2.0mg/ml的兔抗鼠IgG用喷膜仪按0.5μl/cm喷涂于质控区作为质控线，用封闭液封闭NC反应膜，再用PBST洗脱，然后室温晾干备用；D）彩色胶乳试纸条的的组装：将样品垫放入处理液中处理后干燥备用，将干燥后的样品垫、反应垫、NC反应膜和吸水滤纸按顺序装配在PVC底板上，用带mark胶带绕背板覆盖在样品垫、反应垫及吸水滤纸上，然后用切条机切割成2-10mm宽的试纸条，制成地沟油彩色胶乳微球免疫层析检测试纸条。

利用本发明制备的地沟油检测试纸在常温下可保质两年，有效延长保质期并降低保存条件；非专业人士用该检测试纸即可完成全程检测，操作简单，有利于该法的推广和普及；整个检测过程最快可以在10min内完成，更适合于现场快速筛选。

作为本发明的进一步改进，所述步骤A）中乳胶微球的直径为100nm，变异系数＜10%，此时乳胶迁移速度及灵敏度均为最佳，且粒径接近，重现性好。

作为本发明的进一步改进，所述超声波的频率为80Hz，经过超声波脱气处理后的乳胶颗粒会增加实验的准确度。

作为本发明的进一步改进，所述地沟油彩色胶乳微球免疫层析检测试纸条各组分的尺寸为：吸水滤纸2.5cm，NC膜3.5cm，反应垫1cm，样品垫3cm，PVC底板9cm，各部件比例适中，结果判读更可靠、清晰。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：利用本发明制备的地沟油检测试纸检测灵敏度高，可以同时检测多个指标，为地沟油检测提供更全面、系统的检测方法，相对缩小检测成本；该检测试纸在常温下可保质两年，有效延长保质期并降低保存条件；非专业人士用该检测试纸即可完成全程检测，操作简单，有利于该法的推广和普及；整个检测过程最快可以在10min内完成，更适合于现场快速筛选。

附图说明

图1为地沟油彩色胶乳微球免疫层析检测试纸条的组装示意图；

图2为地沟油预处理装置示意图；

图3为四条检测线均显色示意图；

图4为黄曲霉毒素超标示意图；

图5为试纸失效示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例一免疫彩色乳胶微球的制备。

1、彩色乳胶微球的预处理。

分别取直径在100nm左右，颗粒大小均匀，变异系数＜10%的红色、黄色、蓝色、绿色四色乳胶微球溶液，用80Hz超声波处理5min后，用超纯水调节浓度为1%，10000g×10min离心，取沉淀用25mM，pH6.0 MES缓冲液清洗两次备用。分别用预冷的25mM，pH6.0 MES缓冲液将EDC和NHS均配置成50mg/ml的溶液备用，按每毫升乳胶加入165μl DEC溶液和165μl NHS溶液将EDC和NHS加入到洗好的乳胶中。在室温下缓慢混匀30min；孵育结束后10000g×10min离心，取沉淀用等体积的25mM，pH6.0 MES缓冲液清洗两次。

2、抗体标记。

用25mM，pH6.0 MES缓冲液将抗体A（鼠抗黄曲霉毒素单克隆抗体）稀释至0.6mg/ml，抗体B（鼠抗苯并芘单克隆抗体）稀释至0.8mg/ml，抗体C（鼠抗茴香胺单克隆抗体）稀释至1.0mg/ml，抗体D（鼠抗DBS单克隆抗体）稀释至0.5mg/ml；分别取上述四种颜色乳胶微球溶液用磁力搅拌器搅拌，在红色溶液中缓慢加入抗体A（每毫升乳胶加入0.33ml抗体）使抗体终浓度为0.6mg/ml，在黄色溶液中缓慢加入抗体B（每毫升乳胶加入0.33ml抗体）使抗体终浓度为0.8mg/ml，在蓝色溶液中缓慢加入抗体C（每毫升乳胶加入0.33ml抗体）使抗体终浓度为0.8mg/ml，在绿色溶液中缓慢加入抗体D（每毫升乳胶加入0.33ml抗体）使抗体终浓度为0.4mg/ml；室温轻柔搅拌2h后用0.1M pH7.0 PBS 4次离心洗涤，每次分别用10000g×10min离心；沉淀用PBS-TBN溶解，80Hz超声波5min处理后，加入PBS-TBN使达到标记前体积，置4℃保存备用。

实施例二彩色胶乳微球免疫层析检测试纸条的性能评价。

1、试纸条最低检出限的测定。

室温条件下，将黄曲霉毒素B1标准品、苯并芘标准品、茴香胺标准品和DBS标准品分别配成系列浓度（1-243ng/ml）的溶液，取100μl加入酶标板微孔中，用地沟油彩色胶乳微球免疫层析检测试纸条进行依次分析，重复3次；通过肉眼观察，检测条检测线颜色明显浅于阴性对照条检测线颜色时的最小标准品浓度，即为该试纸条的肉眼判定检测限；其中黄曲霉毒素检测限为7ppb，苯并芘检测限为9ppb，茴香胺检测限为9ppb，DBS检测限为5ppb。

结果如表一所示：+表示微显色，++表示显色，+++表示显著显色，－表示不显色。

Figure 2012104403163100002DEST_PATH_IMAGE001

2、试纸条特异性测定。

依次配制40ng/ml的AFB₂、AFG₁和AFG₂溶液，丁香酚、草蒿脑、大茴香脑溶液，取100μl加入酶标板微孔中，用该试纸进行分析，重复3次，15min后观察结果；该试纸对黄曲霉毒素和胆固醇、茴香胺类香辛料残留物和DBS的检测具有特异性。

结果如表二所示：－表示不显色，从表二中可以看出该试纸对地沟油中常见标志物黄曲霉毒素总量、苯并芘、茴香胺类香辛料和DBS具有特异性。

Figure 2012104403163100002DEST_PATH_IMAGE002

实施例三样品的检测及结果判定。

1、待测样品的处理。

利用图2所示装置1吸取食用油样品，轻轻挤捏，将油样挤出2滴至装置3的1号管中，用装置2a吸取装置3中2号管的重蒸石油醚并挤出4滴至1号管中，用装置1将管1中液体吹打混匀后，再用装置2a吸取装置3中3号管的80%甲醇水(v/v)溶液并挤出4滴至1号管中，同上操作混匀，静置至液体明显分层后，用装置2a小心吸取上层液体弃掉，用装置2b吸取装置3中4号管的纯水并挤出16滴至1号管中，混匀待检。

2、样品检测。

将一条试纸条有标志线的一端插入预处理后的待检样品中，样品液面不可超过标志线；当液体全部浸湿NC膜后，15-20min内判定结果。

3、结果判定。

试纸条的检测线显色分析：（1）四条检测线均显色，表明此油样中四种地沟油的标志物均为阴性，即为合格油样，如图3所示；（2）检测线中无黄色、蓝色或绿色中的任一种，即可判定该油样掺有地沟油或为地沟油；（3）无红色则说明该油样黄曲霉毒素超标，但并不能判断既是地沟油，如图4所示；（4）质控线不显色则说明试纸失效，如图5所示。

实施例四相关溶液配制。

1、25mM，pH6.0 MES缓冲液。

0.53g MES溶于90ml纯水中，调节pH值至6.0，并用纯水定容至100ml。

2、0.1mol/l，pH7.0 PBS。

NaCl 9g，溶于去离子水中，1000mL容量瓶定容为0.9％的NaCl。

A液：Na₂HPO₄ ^.12H₂O 7.164g，加入0.9％NaCl溶解，100mL容量瓶定容。

B液：NaH₂PO₄ ^.2H₂O 3.12g，加入0.9％NaCl溶解，100mL容量瓶定容。

取上述A、B溶液混合，使pH为7.0，取出25mL，50mL容量瓶中用0.9％NaCl定容至50mL即得。

3、PBS-TBN（0.1mol/l PBS，含0.9‰NaCl，1%BSA，1‰Tween-20，0.2‰ NaN₃）。

取0.1mol/l，pH7.0 PBS 1000ml，加入10g BSA，1ml Tween-20和0.2g NaN₃。

4、0.01M pH7.4 PBS。

取3中A、B溶液混合，使pH为7.4，取出25mL，500mL容量瓶中用0.9％NaCl定容至500mL即得。

5、反应垫处理液。

0.01M pH7.4 PBS 1000ml，加入10g BSA，50g蔗糖，20g PVP，0.5g NaN₃。

6、包被缓冲液。

0.01M pH7.4 PBS 1000ml，加入20g BSA，0.2g NaN₃。

7、样品垫处理液。

0.05M pH7.4 Tris-HCl 1000ml，加入5g酪蛋白，5g PVA，0.2g NaN₃，0.4g TritonX-100,14.9g KCl，2.5g EDTA-2Na。

8、PBST。

0.01M pH7.4 PBS加入0.5ml Tween20。

9、封闭液。

0.01M pH7.4 PBS 1000ml，加入20g BSA，3g PVP K-30，25g蔗糖和0.2g NaN₃。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种地沟油快速检测试纸的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

A）免疫彩色乳胶微球的制备：（a）彩色乳胶微球的预处理：分别取红色、黄色、蓝色、绿色四色乳胶微球溶液，用超声波处理后，用超纯水调节浓度，离心，取沉淀用MES缓冲液清洗两次，得到洗好的乳胶，用预冷的MES缓冲液分别将EDC和NHS配置成溶液加入到所述洗好的乳胶中，在室温下缓慢混匀，孵育结束后离心，取沉淀用MES缓冲液清洗两次，得到乳胶微球溶液；（b）抗体标记：用MES缓冲液将鼠抗黄曲霉毒素单克隆抗体、鼠抗苯并芘单克隆抗体、鼠抗茴香胺单克隆抗体和鼠抗DBS单克隆抗体稀释，之后分别缓慢加入到用磁力搅拌器搅拌的红色、黄色、蓝色和绿色的所述乳胶微球溶液中，室温轻柔搅拌后用PBS离心洗涤，沉淀用PBS-TBN溶解，超声波处理后，加入PBS-TBN至标记前体积，置4℃保存备用；

B）免疫彩色胶乳反应垫的制备：将玻璃纤维膜浸泡于反应垫处理液中，水浴处理后平铺于纱网上干燥3~4h，将标记后的彩色乳胶微球按照效价实验匹配的结果，以体积比为红：黄：蓝：绿=2：2：4：5混合均匀，按照每毫升乳胶溶液铺50cm²涂覆玻璃纤维膜，干燥16h后置4℃密封保存备用；

C）NC膜的制备：将抗原黄曲霉毒素-OVA，苯并芘-OVA，茴香胺-OVA和DBS-OVA用包被缓冲液分别稀释至0.3、0.4、0.4和0.2mg/ml，用喷膜仪按1.0、0.8、0.8和1.5μl /cm分别喷涂于同一条NC膜上的不同区域作为检测线，每条检测线相距4-10mm，将浓度为2.0mg/ml的兔抗鼠IgG用喷膜仪按0.5μl/cm喷涂于质控区作为质控线，用封闭液封闭NC反应膜，再用PBST洗脱，然后室温晾干备用；

D）彩色胶乳试纸条的的组装：将样品垫放入处理液中处理后干燥备用，将干燥后的样品垫、反应垫、NC反应膜和吸水滤纸按顺序装配在PVC底板上，用带mark胶带绕背板覆盖在样品垫、反应垫及吸水滤纸上，然后用切条机切割成2-10mm宽的试纸条，制成地沟油彩色胶乳微球免疫层析检测试纸条。

2.根据权利要求1所述的一种地沟油快速检测试纸的制备方法，其特征在于：步骤A）中所述乳胶微球的直径为100nm，变异系数＜10%。

3.根据权利要求1所述的一种地沟油快速检测试纸的制备方法，其特征在于：步骤A）中所述超声波的频率为80Hz。

4.根据权利要求1所述的一种地沟油快速检测试纸的制备方法，其特征在于：步骤B）中所述水浴的温度为37℃，处理时间为30min。

5.根据权利要求1所述的一种地沟油快速检测试纸的制备方法，其特征在于：步骤D）中所述地沟油彩色胶乳微球免疫层析检测试纸条各组分的尺寸为：吸水滤纸2.5cm，NC膜3.5cm，反应垫1cm，样品垫3cm，PVC底板9cm。