CN111157749B - 一种快速检测试纸及其制备方法和应用 - Google Patents

一种快速检测试纸及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速检测试纸，其包括层析膜(2)和结合垫(3)，所述层析膜(2)的一端连接结合垫(3)；所述结合垫(3)上喷涂有结合物(4)；所述结合物(4)中含有使用选自三原色微球标记的标记物；所述层析膜(2)上沿液体层析方向依次设有检测线(5)和质控线(6)。本发明的试纸使用不同种类和/或比例的微球产生不同的颜色标记，提高产品的灵敏度和特异性。

Description

一种快速检测试纸及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于免疫化学体外检测技术领域，具体地，涉及一种三原色标记的快速检测试纸及其制备方法和应用。
背景技术
使用微球作为标记的检测试剂/试纸已经广泛应用于生物学、化学、医学的各种研究、、检测、诊断中，在具体产品实现过程中，为了实现在同一试纸条/试剂体系中上对不同分析物的区分，会使用不同颜色的微球分别进行标记，如红色、蓝色、黑色、橙色、绿色、黄色、粉色等，实际使用中最常使用的颜色有：蓝色、红色、绿色和黑色。
镶嵌在微球内部的染料并不能长期稳定，随着储存时间的延长，彩色微球会不稳定；而且不同颜色染料之间的稳定性能也有差异。这种微球间/批次间的稳定性差异以及染料稳定性随时间的降低会导致在检测过程中，镶嵌在微球中染料会渗出，导致出现在检测线位置的非特异吸附，或者染料颜色的变化，以致出现异常的检测结果。
三原色指色彩中不能再分解的三种基本颜色，我们通常说的颜料三原色为：红色、黄色、蓝色，这三种颜料按一定比例混合,能调出各种不同的颜色。从颜色混合原理上讲，色彩三原色(遵循颜色减法原理)，即颜料的颜色叠加是越加越暗。如红和黄混合呈橙色，黄和蓝混合呈绿色，红和蓝混合呈紫色，红、黄和蓝三色混合呈黑色，故又称为红、黄和蓝为第一色，橙、绿和紫为第二色，黑为第三色，第二色、第三色统称为混合色或配合色。使用三原色微球实现检测试剂中不同颜色显色以解决上述问题本领域中尚无报道。
发明内容
本发明使用三原色的微球，通过混合实现在快速检测试剂/试纸中的不同颜色的显色，同时对产品的性能产生进行优化，解决了上述染料不稳定性导致的检测异常问题
一方面，本申请提供了一种快速检测试纸，其特征在于，包括层析膜(2)和结合垫(3)，所述层析膜(2)的一端连接结合垫(3)；所述结合垫(3)上喷涂有结合物(4)；所述结合物(4)中含有使用选自三原色微球标记的标记物；所述层析膜(2)上沿液体层析方向依次设有检测线(5)和质控线(6)。
进一步地，使用不同种类和/或比例的微球产生不同的颜色标记。
进一步地，微球为聚苯乙烯微球，或者聚苯乙烯与其他化合物组成的复合材料微球。
进一步地，所述其他化合物为二乙烯苯和/或丙烯酸。
进一步地，微球中镶嵌有三原色染料单体。
进一步地，微球可以为无修饰微球。
进一步地，微球可以为修饰微球。
进一步地，微球可以以选自-COOH、-NH2，-OH，-CH2Cl、-CONH2、-SO3H、-COOCH3的基团修饰。
进一步地，试纸中还包括单面胶带(11)，所述将单面胶带(11)将结合垫(3)和层析膜(2)的层压部位粘贴在一起。
进一步地，试纸中还包括样品垫(9)和吸水垫(10)，其中样品垫(9)、结合垫(3)、层析膜(2)、吸水垫(10)依次粘贴在一起，其中互相层压1-2毫米。
进一步地，所述标记物为抗体。
本发明中所述的三原色为红色、蓝色和黄色。
微球的粒径可以根据检测试剂/试纸/样品的需求以本领域常规首选确定，为了更好的适用于侧向层析，优选100nm到500nm范围。
为了实现本发明发明目的，本发明提供了使用三原色的微球分别标记分析物对应的抗原抗体，然后对每种分析物标记物按照不同比例混合，最后按照工作浓度稀释后，喷涂在结合垫(3)的一端；也可以先将三原色颜色的微球按照一定比例混合后，进行标记，最后按照工作浓度稀释后喷涂在结合垫(3)上。
为了实现本发明发明目的，检测线对应的标记抗原或抗体，应同步使用三原色微球进行标记后使用。在这里，优选使用三原色微球分别标记后，再对结合物按照一定的比例进行混合后，喷涂在结合垫上；也可以将三原色微球按照一定的比例混合后，再进行标记结合物的制备，最后按照一定的比例稀释后，喷涂在结合垫上。
本发明中，如微球表面无任何功能基团修饰，抗原和/或抗体通过被动吸附作用固定在微球的表面；对于带有相关功能基团修饰的微球，则通过共价结合到微球的表面。
与现有多种颜色微球分别标记不同分析物对应的抗原或抗体相比，本发明只是选择三原色微球的混合比例，是结合产品的对灵敏度和特异性的要求，选择相应的混合比例，实现所需要颜色的检测结果的呈现。
本发明的试纸可用于各种具体的免疫化学体外检测，包括但不限于医学检测、环境检测、生物学研究、化学研究等。
附图说明
图1为本发明实施例1中所提供一种早早孕检测试纸条的结构示意图，其中1为底板、2为层析膜、3为结合垫、4为结合物、5为检测线、6为质控线、11为单面胶带；
图2为本发明实施例2中所提供一种排卵检测试纸条的结构示意图，其中1为底板、2为层析膜、3为结合垫、4为结合物、5为检测线、6为质控线、9为样品垫、10为吸水垫。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“固定”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，也可以是互相接触连接。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”、“远端”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
以下通过具体实施例来说明本发明的实施方式，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法均采用本技术领域常规技术，实施例中所用到的试剂和原料均可由市场购得。
实施例1
本实施例提供一种早早孕检测试纸条，包括底板1、层析膜2和结合垫3，以及单面胶带11，其中层析膜上有2条线：检测线5和质控线6。
本试剂主要是由固相有鼠抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体A(检测线5)和羊抗鼠IgG多克隆抗体(质控线6)的硝酸纤维素膜(层析膜2)、预先吸附有微球标记的鼠抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体B的玻璃纤维(结合垫3)
1.1制备结合垫3
在本实施例中，我们选择三原色微球进行分别标记，它们是：红色、蓝色和黄色。
1.1.1微球的清洗
将三原色微球摇匀后，分别取1毫升(1％浓度w/v)微球，经10000rpm离心10分钟，吸取上清，沉淀中加入0.05M PH6.0吗啉乙磺酸(MES)反应溶液并充分混匀，重复处理2次。
在第2次清洗后，将三原色微球分别重悬于500微升上述相同的反应液中，并务必确保微球呈单分散态。
对于不同粒径的微球选择合适的离心条件离心。一般粒径越小，离心转速越高，离心时间越长，通常为5-10分钟。
1.1.2微球活化
1.1.2.1活化试剂即配即用。
在室温下向干净的离心管中加入2毫克1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)和1000微升的0.05M PH6.0 MES反应溶液。
向干净的离心管中加入4毫克N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1000微升的0.05M PH6.0MES反应溶液。
1.1.2.2分别向三原色洗涤后的微球中快速加入250微升EDC和250微升NHS。
1.1.2.3室温旋涡震荡后用转盘式混合器孵育30分钟。
1.1.2.4离心使微球沉降，去除上清，分别加入1毫升0.05M PH6.0 MES反应溶液洗涤微球并充分混匀。经10000rpm离心10分钟，重复洗涤2次。
1.1.2.5将微球分别重悬于700微升0.05M PH6.0 MES反应溶液中，微球在抗体偶联前应保持充分单分散状态。
1.1.3微球与抗体偶联
用0.01M PH7.4 PB溶液透析偶联抗体(过夜)。
在三原色微球中分别加入透析后的抗体2毫克，搅拌状态缓慢加入复溶好的微球中，加完继续搅拌结合2分钟，分别使用0.05M PH6.0 MES反应溶液经体积补充至1毫升，37℃摇床避光反应3小时。离心12000rpm，10分钟，去上清，留沉淀。
1.1.4微球上未结合表面基团的封闭
取终止液(2％BSA,100mM乙醇胺溶液，0.02M PH8.0 TB)1毫升，将沉淀进行复溶反复吹打微球，涡旋振荡，使微球充分重悬溶解，超声10秒，37℃摇床避光反应1小时。
1.1.5偶联完成胶微球的清洗与保存
12000rpm离心20分钟，去上清，留沉淀。取0.02M PH8.0 TB+2％BSA 1毫升，将沉淀进行复溶反复吹打微球，涡旋振荡，使微球充分重悬溶解，超声10秒，37℃摇床避光反应10分钟。
12000rpm离心20分钟，去上清，留沉淀。取0.05M PH8.0 BB+0.2％BSA+0.02％NaN3溶液1毫升，将沉淀进行溶解涡旋振荡，使微球充分重悬溶解，超声10秒，保存。
1.1.6稀释喷涂
1.1.6.1对玻璃纤维或无纺布进行预处理，其中组成成分(质量比)包括0.1MPH9.0TB+0.5％PVPK30+1％诺蛋白+0.5％EDTA.Na2+0.5％S7+0.5％S16+0.1％叠氮钠。
1.1.6.2将预处理后的玻璃纤维或无纺布，裁切成6厘米宽的长条，作为稀释后结合物的载体。
1.1.6.3按照下列不同的方式对标记后的微球进行混合，它们是：(1)单纯的红色、(2)单纯蓝色、(3)单纯黄色、(4)红色和蓝色、(5)红色和黄色、(6)蓝色和黄色、(7)红色、蓝色和黄色。
其中结合物稀释液的成分有：0.05M PH8.0 TB+1％诺蛋白+0.5％PVP K 30+0.5％PEG20000+1％氯化钠+5％海藻糖+1％Tween20+0.1％NaN3。
不论使用几种结合物进行混合，均按照预稀释结合物工作液总体积的1/8加入微球结合物，且所加入的微球等比例加入，总量不变。同时按照所预稀释体积的1/2加入结合物稀释液，剩余的补加纯化水至给定的体积。将混合后的结合物4喷涂在“上述预处理后的结合垫膜”，经37℃干燥过夜。
1.2层析膜1制备
1.2.1分别使用检测线5和质控线6稀释液对鼠抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体B、羊抗鼠IgG多克隆抗体进稀释至0.5mg/mL、1.0毫克/毫升。
其中检测线稀释液为：0.05M PH8.0 TB、0.3％牛血清白蛋白；质控线稀释液为：0.02M PH7.4PB、5％海藻糖。
1.2.2调整包被机的参数，在层析膜上喷涂检测线5和质控线6，放置室温干燥过夜。
1.3组装
将固相有检测线(5)(鼠抗HCG单克隆抗体A)和质控线(6)(羊抗兔IgG多克隆抗体)的硝酸纤维素膜层析膜(2)、预先吸附有微球标记兔IgG(蓝色)和鼠抗HCG单克隆抗体B(红色微球)的玻璃纤维结合垫(3)粘贴在底板1上，且结合垫3上结合物4端压在层析膜2的检测线5的远端约1-2毫米，使用单面胶带(11)将结合垫(3)和层析膜(2)的层压部位粘贴在一起，确保样本移行的均匀。
1.4检测
1.4.1检测样本
1.4.1.1稀释样本
使用正常男人的尿液稀释的人绒毛膜促性腺激素国家标准品至一定浓度，它们是：基质男人尿液(HCG 0mIU/mL)、HCG1.25mIU/mL、HCG2.5mIU/mL、HCG5mIU/mL、HCG10mIU/mL、HCG20mIU/mL、HCG50mIU/mL、HCG100mIU/mL、HCG200mIU/mL、HCG1IU/mL、HCG10IU/mL、HCG20IU/mL、HCG50IU/mL、HCG100IU/mL、HCG200IU/mL、HCG500IU/mL、HCG1000IU/mL。
1.4.1.2临床育龄妇女尿液样本
选择临床妇女尿液样本250份，她们的年龄分布为18-72岁，使用临床广泛使用的普遍认为质量较好的胶体金法试剂为对照试剂，由专业人员进行操作和结果判断，对测试结果进行统计。
1.4.2操作方法和结果判断
将检测试剂卡放在干净的台面，使用试剂配套的样本滴管分别滴加2滴待测试样本在试剂卡的加样孔中，开始计时，应在10分钟进行结果判断。阳性结果是检测线和质控线同时显色；阴性结果只有一条质控线显色；若检测线不显色，则为无效结果，应重复测试。
1.4.3结果
1.4.3.1显色线颜色的情况
在本发明中，不同的结合物混合方式不同，所呈现的检查结果线条颜色不同。
表1不同混合方式中显色线条颜色一览表
混合方式 显色情况
单纯红色 红色
红色和黄色 橙色
单纯黄色 黄色
蓝色和黄色 绿色
单纯蓝色 蓝色
红色和蓝色 紫色
红色、蓝色和黄色 黑色
1.4.3.2稀释样本测试结果
1.4.3.2.1稀释样本
对稀释后的样本使用三原色微球按照不同的方式进行混合，分别进行测试。
表2稀释样本测试结果一览表
Figure BDA0002364808460000071
从上表结果可以看出，其中2种方式的灵敏度最高，它们是：“红色+蓝色”、“红色+蓝色+黄色”，另外单纯的黄色、“黄色+蓝色”灵敏度偏低。另外，它们的显色情况下不同，若显色色度不同，使用者肉眼观察时，判断的差异很大。
1.4.3.2.2临床样本
本次临床样本共计250份，临床样本的测试结果应以“所选择的胶体金试剂”结果为准，其中阳性96份，阴性154份
表3临床样本测试结果
Figure BDA0002364808460000072
Figure BDA0002364808460000081
从上表结果可以看出，对照试剂为阳性的样本，有2种微球出现假阴性；另外，对照试剂为阴性的样本，显示为紫色和黑色的微球结果出现假阳性的结果。
实施例2
本实施例提供一种排卵检测试纸条，包括底板(1)、层析膜(2)和结合垫(3)，以及加样垫(9)和吸水垫(10)，其中层析膜上有2条线：检测线(5)和质控线(6)。检测试纸条的具体制备方法如下：
本试剂的层析膜2上有质控线6和检测线5，其中检测线的吸附物质为鼠抗人促黄体生成素(LH)单克隆抗体A、质控线上吸附物质为羊抗鼠IgG多抗。结合垫3上有微球标记的结合物4，其微球的标记抗体为鼠抗人促黄体生成素(LH)单克隆抗体B。
1.1层析膜2
分别将检测线5和质控线6的戏份抗体进行稀释，浓度为0.4mg/mL、1.0mg/mL，使用划线式包被机，在硝酸纤维素膜上进行划线固相，33℃干燥房过夜干燥。
其中检测线的稀释液为(质量比)：0.05M TB PH8.0、3％甲醇、5％海藻糖，质控线的稀释液为(质量比)：0.04M PH7.6 PB+5％海藻糖。
1.2结合物4制备
1.2.1微球准备
在本实施例中，是将微球先进行预混合后使用。
首先对三原色微球(红色、蓝色和黄色)分别摇匀后，预先选择3种微球的混合方式，它们是：红色：蓝色＝8:2、红色：黄色＝7:3、红色：蓝色＝5:5。
1.2.2微球清洗
将上述混合后的微球分别使用0.05M PH7.2 PB进行稀释，微球浓度1％(质量体积比10mg/mL)，体积为1毫升，12000转离心12分钟，重复清洗2次。第二次清洗后，将沉淀使用0.05M PH7.2 PB重悬至0.5毫升。
1.2.3微球活化
所使用的EDC和NHS分别使用0.05M PH7.2 PB现配，按照1毫克微球50微克EDC和100NHS的量加入，最后使用0.05M PH7.2 PB补充总体积至1毫升。反复摇动，反应30分钟。
12000转离心12分钟，反复2次，第2次离心后，沉淀使用0.5毫升0.05M PH7.2 PB进行重悬。
1.2.4微球和抗体结合
将结合抗体使用0.01M PH7.2 PB进行透析处理，备用。
按照1毫克微球100微克的量，加入鼠抗人促黄体生成激素(LH)至上述重悬的微球中，最后使用0.05M PH7.2 PB补充总体积至1毫升。反复摇动，反应3小时。
1.2.5封闭
按照1毫升1％微球3微升的比例加入乙醇胺进行，继续反应30分钟。经12000转离心10分钟，将沉淀使用0.05M PH8.0 TB+0.5％Casein进行清洗2次，最后将微球重悬于0.05M PH8.0 TB+0.5％Casein中至微球终浓度1％(W/V)。
1.3结合垫3制备
使用含有1％Casein、5％海藻糖、10％蔗糖、0.25％PEG 20000、0.5％PVP K30的50mM TB PH8.0缓冲液分别稀释上述3组混合微球至终浓度为1/5。
将稀释后的微球结合物4喷涂在玻璃纤维上,33℃干燥房过夜干燥。
1.4样品垫9制备
对玻璃纤维或无纺布进行预处理，其中组成成分(质量比)包括0.1M PH9.0TB+0.5％PVPK30+1％诺蛋白+0.5％EDTA.Na2+0.5％S7+0.5％S16+0.1％叠氮钠。
1.5组装
将样品垫(9)、结合垫(3)、层析膜(2)、吸水垫(10)依次粘贴在底板(1)上。其中互相层压1-2毫米。
1.6检测
1.6.1检测样本
使用含有0.02M PB(PH7.4)、0.5％BSA的缓冲液，稀释促黄体生成素(LH)标准品至一定浓度，它们是：LH 0mIU/mL、LH 2.5mIU/mL、LH 5mIU/mL、LH 10mIU/mL、LH 15mIU/mL、LH20mIU/mL、LH 25mIU/mL、LH 40mIU/mL、LH 65mIU/mL、LH 80mIU/mL。
1.6.2操作方法和结果判断
持试纸条垂直插入到待测样本中至少10秒，等待结果观察区域有移行液体可见时，应取出平放在非西方材料的平面，开始计时。
应在10分钟时判断结果，应根据检测线和质控线的色度对比进行结果判断。阴性结果为检测线比质控线色度弱；阳性结果要给你检测线色度比质控线深；质控线不显色为无效结果，应重新测试。
1.7结果
每一样本重复测试3次，对每一种混合微球分别记录测试结果。
表4不同混合方式微球测试结果对比表
Figure BDA0002364808460000101
结果显示，“红色：蓝色＝5:5”灵敏度最高，“红色：黄色＝7:3”灵敏度最低，“红色：蓝色＝8:2”效果最好，同时符合产品的质量标准要求，同时梯度最为明显，相反“红色：黄色＝7:3”效果最差，不见灵测试LH25mIU/mL为阴性，主要是因为显示绿色，通过用户在使用时肉眼观察结果，显示梯度不明显，不能正确判断“LH峰值”。
显然，上述实施例仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (4)

1.一种快速检测试纸，其特征在于，包括层析膜(2)和结合垫(3)，所述层析膜(2)的一端连接结合垫(3)；所述结合垫(3)上喷涂有结合物(4)；所述结合物(4)中含有使用选自三原色微球标记的标记物；所述层析膜(2)上沿液体层析方向依次设有检测线(5)和质控线(6)；
所述试纸还包括单面胶带(11)、样品垫(9)和吸水垫(10)；所述单面胶带(11)将结合垫(3)和层析膜(2)的层压部位粘贴在一起；样品垫(9)、结合垫(3)、层析膜(2)、吸水垫(10)依次粘贴在一起，其中互相层压1-2毫米；
所述标记物为抗原和/或抗体；
其中微球为聚苯乙烯微球、或者聚苯乙烯与二乙烯苯和/或丙烯酸组成的复合材料微球；
微球中镶嵌有三原色染料单体；
其中使用红色和蓝色微球以8:2的比例预先混合后，再标记同一标记物并制备相应结合物(4)，按照一定的比例稀释后，喷涂在结合垫(3)上。
2.根据权利要求1所述的试纸，其中微球为无修饰微球。
3.根据权利要求1所述的试纸，其中微球为修饰微球。
4.根据权利要求3所述的试纸，其中微球以选自-COOH、-NH2，-OH，-CH2Cl、-CONH2、-SO3H、-COOCH3的基团修饰。
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