CN112924669B - 基于光学三原色的多色测流免疫层析试纸条及其制备和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于光学三原色的多色测流免疫层析试纸条及制备方法，通过将竞争免疫分析和非竞争免疫分析分别标记不同示踪物，并集成在一张试纸条上，基于相加和相减三原色的原理实现随着分析物浓度的变化，在检测线（T线）上呈现出不同颜色，提高半定量分析的准确性和直观性，试纸条的控制线（C线）会随着T线结合标记物量的不同也呈现出不同颜色，可用于校正检测结果，在定量分析中，多色信号可互为内在参比，提高了多色试纸条定量检测的准确性。
Description
技术领域
本发明属于分析技术领域，具体地涉及一种基于光学三原色的多色测流免疫层析试纸条及其制备和检测方法。
背景技术
免疫快速检测具有快速、简便、低成本及可实现现场检测等特点。在免疫分析方法中，免疫层析分析(试纸条)可以在短时间内完成对目标物的筛查，是最实用的免疫快速检测方法。目前，试纸条已在广泛应用在食品安全和环境安全的监测、动植物病原物的鉴定和检疫，以及医学诊断等。然而，试纸条在检测时，通常根据其检测线(T线)的颜色深浅或有无进行判定，使检测结果的呈现不够直观、易产生误判，同时降低了检测的敏感性。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一种新颖、快速、灵敏、准确的基于光学三原色的多色测流免疫层析试纸条、其制备方法和检测方法。
为实现上述目的，本发明提出了一种基于光学三原色的多色测流免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，样品垫的右端搭设在结合垫的左端，所述结合垫的右端搭设在层析膜的左端，所述层析膜上从左至右依次设置有检测线和控制线，所述吸水垫的左端搭设在层析膜的右端，
所述结合垫上涂覆有标记的示踪物，其中，所述示踪物包括第一示踪物和第二示踪物，第一示踪物和第二示踪物分别与待检测物的竞争免疫分析试剂和非竞争免疫分析试剂进行标记，所述第一示踪物和第二示踪物为具有不同发光颜色的发光材料，且两种颜色混合后能形成第三种颜色；或所述第一示踪物和第二示踪物分别为具有不同颜色的颜色材料，且两种颜色混合后能形成第三种颜色；所述检测线包被捕获待检测物的抗体，所述控制线包被捕获标记示踪物的试剂。例如，使用链霉亲和素-生物素系统完成示踪物标记时为，所述检测线为羊抗鼠抗体，控制线为兔抗链霉素亲和素抗体，而当示踪物直接标记于竞争免疫分析试剂或非竞争免疫分析试剂时，所述控制线包被二抗、protein G等。
本发明所述的发光材料是指能够以某种方式吸收能量，将其转化成光辐射(非平衡辐射)的物质材料；本发明所述的颜色材料为具有特定的分光反射率分布，能给出特定固有色色感的物质。
对于发光材料和颜色材料的类型不做限制，如发光材料可以选用发光量子点，荧光材料等，颜色材料为具有一些颜色的材料，如纳米金材料，蓝色的普鲁士蓝，具有颜色的乳胶微球等。
本发明利用的是光学的三原色原理，具体地，加法混合是指色光的混合，两种以上的光混合在一起，光亮度会提高，混合色的光的总亮度等于相混各色光亮度之和。色光混合中，三原色是红、绿、蓝。这三色光是不能用其它别的色光相混而产生的，而红光+绿光＝黄光，绿光+蓝光＝青光，蓝光+红光＝紫光，即产生了第三种颜色。减法混合主要是指的色料的混合。减法混合的三原色是加法混合的三原色的补色，例如，红色+蓝色＝紫色，黄色+红色＝橙色，黄色+蓝色＝绿色。具体地，当待分析为小分子时，所述竞争免疫分析试剂为待分析物的模拟表位多肽或竞争抗原，所述非竞争试剂为待分析物的抗免疫复合体多肽或抗体。
当待分析物为大分子时，所述竞争免疫分析试剂为待分析物的模拟表位，所述非竞争免疫分析试剂为待分析物的检测抗体。
示踪物可以用现有技术中常见的标记方法进行标记，如利用链霉亲和素-生物素系统，或者使用共价键、弱作用力直接标记。具体地，可以通过活泼酯法将普鲁士蓝或者蓝色乳胶微球直接标记在模拟表位上，静电作用的方法将纳米金或活泼酯法将红色乳胶微球直接标记在检测抗体上。在本发明的一种实施方式中，所述示踪物首先标记在链霉亲和素上，然后通过链霉亲和素-生物素系统完成示踪物对生物素化的竞争免疫分析试剂和非竞争免疫分析试剂的标记。
在本发明的一种实施方式中，所述发光材料为发光量子点或发光碳点，所述颜色材料为红色的纳米金和蓝色的普鲁士蓝或红色的乳胶微球和蓝色的乳胶微球。
在一种实施方式中，所述发光量子点为红色量子点和绿色量子点，发光碳点为红色碳点和绿色碳点，所述红色量子点和绿色量子点或红色碳点和绿色碳点分别使用活泼酯法标记在链霉亲和素上；所述纳米金通过静电作用标记在链霉亲和素上，所述普鲁士蓝或乳胶微球通过活泼酯法标记在链霉亲和素上。
当使用红色量子点和绿色量子点或红色碳点和绿色碳点时，两种颜色混合可以得到黄色，即利用相加三原色原理来实现对分析物的定量，当用红色的纳米金和蓝色的普鲁士蓝或红色的乳胶微球和蓝色的乳胶微球，两者混合得到紫色，即利用相减三原色原理来实现对分析物的定量。
所述样品垫为玻璃纤维垫，所述层析膜为醋酸纤维素膜。
本发明进一步提出了上述多色测流免疫层析试纸条的制备方法，包括如下步骤：
(1)将第一示踪物和第二示踪物分别与待分析物的竞争免疫分析试剂和非竞争免疫分析试剂进行标记；
(2)层析膜预处理：用PBS稀释捕获待检测物的抗体和捕获标记示踪物的试剂，分别作为T线和C线，喷在NC膜上，两条线的间距为3-10mm，将层析膜在37℃下干燥1～2小时；
(3)结合垫的处理：将4％BSA喷在结合垫上，并进行干燥，之后将标记后的第一示踪物和标记后的第二示踪物喷在结合垫上，并进行干燥；
(4)将层析膜、结合垫、样品垫和吸水垫组装成整条，将组装好的膜切成3-5mm宽，装入暗盒中，在室温下储存备用。
更进一步地，本发明提出了上述多色测流免疫层析试纸条的检测方法，其特征在于，将待分析物溶于含5％BSA和5‰吐温20的PBS中，然后滴加到样品垫的上样孔中，层析10-15min，通过观察T线颜色进行半定量，或拍摄T线图像，通过图像分析方法进行定量分析。优选地，将拍摄图片导入ImageJ 1.51j8软件中，将拍摄图像进行颜色通道分离，测量不同颜色通道下的T线光密度，而后扣除背景信号得到校正后的T线光密度，以校正后的不同颜色光密度比值为纵坐标，分析物标准溶液浓度的对数为横坐标建立标准曲线，获得线性方程，将检测结果带入线性方程中计算出样品中分析物的含量。
试纸条的检测信号是由标记物在T线上的富集产生的。基于竞争模式下的试纸条，由于分析物的竞争反应，标记物会与T线解离，导致T线的信号强度随着分析物浓度的增加而降低。相反，基于非竞争模式下的试纸条的标记物会由于分析物的存在与T线结合，导致T线的信号强度随着分析物浓度的增加而减增强。将竞争模式和非竞争模式集成到一个免疫检测方法中，T线在没有/低浓度分析物时产生竞争模式的信号；T线在高浓度分析物时产生非竞争模式的信号；T线在中间浓度分析物时产生竞争和非竞争的混合信号。因此，可根据试纸条T线颜色的不同对分析物浓度进行判定。
为了更详细的说明本发明，分别对基于相加三原色的多色测流免疫层析方法和基于相减三原色的多色测流免疫层析方法分别进行阐述，其中，相加三原色采用红色和绿色混合形成黄色来阐述，相减三原色采用红色和蓝色混合产生紫色来阐述。
(一)基于相加三原色的多色测流免疫层析方法：
第一步：不同发光材料或试剂与免疫分析试剂的标记
将不同发光材料或试剂分别与分析物的竞争和非竞争免疫分析试剂进行标记。发射光为红色和绿色的量子点或红色和绿色碳点标记在链霉亲和素上，再通过链霉亲和素-生物素系统分别完成量子点或碳点对生物素化竞争和非竞争免疫分析试剂的标记。标记的组合为：发射光为525nm的绿色量子点或绿色碳点与竞争免疫分析试剂标记(如模拟表位多肽、竞争抗原)；发射光为623nm的红色量子点或红色碳点与非竞争免疫分析试剂标记(如抗免疫复合体多肽和抗体)。
第二步：多色检测试纸条的组装
硝酸纤维素(NC)膜的处理：用PBS(0.01M,pH＝7.4)稀释捕获抗体(1mg mL-1)和兔抗链霉亲和素抗体(1.0mg mL-1)，分别作为T线和C线，喷在NC膜上，两条线的间距为5mm，将NC膜在37℃下干燥1小时。
结合垫的处理：将4％BSA喷在结合垫上，并进行干燥，之后将标记后的绿色量子点和红色量子点或绿色碳点和红色碳点喷在结合垫上，并进行干燥。
试纸条的组装：将NC膜、结合垫与样品垫(玻璃纤维垫)和吸水垫组装成整条，将组装好的膜切成4mm宽，装入暗盒中，在室温下储存备用。
加样：将100μL标准品或者样品待测液(含5％BSA和5‰吐温20)加入到上样孔并层析10分钟。肉眼观察T线的颜色进行半定量，或手机拍摄记录图像，用软件计算进行定量分析。
第三步：检测结果的判定与分析
方法1：在紫外光(365nm)的照射下，用肉眼直接判定检测结果，若T线显示绿色荧光则表示无或低含量的分析物，若T线显示黄色荧光为中等含量的分析物，若T线显示红色为高含量的分析物，通过颜色观察直接实现准确、直观的半定量；
方法2：将图片导入ImageJ 1.51j8软件中，将记录图像进行颜色通道分离，测量红色和绿色通道下的T线光密度，而后扣除背景信号得到校正后的T线光密度，以校正后的红色和绿色光密度比值为纵坐标，分析物标准溶液浓度的对数为横坐标建立标准曲线，获得线性方程，将检测结果带入线性方程中计算出样品中分析物的含量。
(二)基于相减三原色的多色测流免疫层析方法：
第一步：不同颜色材料或试剂与免疫分析试剂的标记
将不同颜色材料或试剂分别与分析物的竞争和非竞争免疫分析试剂进行标记。红色的纳米金和蓝色的普鲁士蓝或红色的乳胶微球和蓝色的乳胶微球标记在链霉亲和素上，再通过链霉亲和素-生物素系统分别完成生物素化竞争和非竞争免疫分析试剂的标记。标记的组合为：红色的纳米金或红色的乳胶微球与竞争免疫分析试剂标记(如模拟表位多肽、竞争抗原)；蓝色的普鲁士蓝或蓝色的乳胶微球与非竞争免疫分析试剂标记(如抗免疫复合体多肽和抗体)。
第二步：多色检测试纸条的组装
NC膜的处理：用PBS(0.01M,pH＝7.4)稀释捕获抗体(1.0mg mL-1)和兔抗链霉亲和素抗体(1.0mg mL-1)，分别作为T线和C线，喷在NC膜上，两条线的间距为5mm，将NC膜在37℃下干燥1小时。
结合垫的处理：将4％BSA喷在结合垫上，并进行干燥，之后将标记后的胶体金和普鲁士蓝喷在结合垫上，并进行干燥。
试纸条的组装：将NC膜、结合垫与样品垫(玻璃纤维垫)和吸水垫组装成整条，将组装好的膜切成4mm宽，装入暗盒中，在室温下储存备用。
加样：将100μL标准品或者样品待测液(含5％BSA和5‰吐温20的PBS)加入到上样孔并层析10分钟。肉眼观察T线的颜色进行半定量，或手机拍摄记录图像，用软件计算进行定量分析。
第三步：检测结果的判定与分析
方法1：在可见光下，用肉眼直接判定检测结果，若T线显示红色则表示无或低含量的分析物，若T线显示紫色为中等含量的分析物，若T线显示蓝色为高含量的分析物，通过颜色观察直接实现准确、直观的半定量；
方法2：将图片导入ImageJ 1.51j8软件中，将记录图像进行光饱和度拆分，测量红色和蓝色通道下的T线灰度，而后扣除背景信号得到校正后的T线灰度值，以校正后蓝色和红色灰度比值为纵坐标，分析物标准溶液浓度的对数为横坐标建立标准曲线，获得线性方程，将检测结果带入线性方程中计算出样品中分析物的含量。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点:
(1)新颖度高：将竞争和非竞争免疫分析集成在一个试纸条上，基于三原色原理，使试纸条的T线可根据分析物的含量呈现出不同颜色；
(2)直观易懂：基于相加三原色的多色试纸条的结果呈现为绿色、黄色或红色，与人们日常生活中交通信号灯的色彩一致，基于相减三原色的多色试纸条无需激发光源，直接肉眼观察结果，T线显色为红色、紫色或蓝色，均可直观的通过T线的颜色对检测结果进行判定；
(3)准确性高：试纸条的控制线(C线)会随着T线结合不同标记物量的不同呈现出不同颜色，可用于校正检测结果，在定量分析中，多色信号可互为内在参比，提高了多色试纸条定量检测的准确性。
附图说明
图1为本发明技术方案的检测小分子的原理示意图；
图2为本发明使用智能手机所拍摄的基于加法三原色的不同浓度苯噻菌酯标准品溶液的检测图像，以及通过软件检测计算苯噻菌酯含量的标准曲线；
图3为本发明使用智能手机所拍摄的基于减法三原色的不同浓度苯噻菌酯标准品溶液的检测图像，以及通过软件检测计算苯噻菌酯含量的标准曲线；
图4为本发明使用智能手机所拍摄的添加苯噻菌酯样品的检测图像；
图5为本发明技术方案的检测大分子的原理示意图；
图6为本发明使用智能手机所拍摄的基于加法三原色的不同浓度PSA标准品溶液的检测图像，以及通过软件计算检测PSA含量的标准曲线；
图7为本发明使用智能手机所拍摄的基于减法三原色的不同浓度PSA标准品溶液的检测图像，以及通过软件检测计算检测PSA含量的标准曲线；
图8为本发明使用智能手机所拍摄的血清中添加PSA样品的检测图像。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
在下述实施例中，我们利用红色和绿色相混得到黄色作为相加三原色的基础，而红色和蓝色相混得到紫色作为相减三原色的基础，然而本领域技术人员应当知晓的是，只要是两色相混得到第三种颜色都可以实现本发明的目的，且颜色相差越大越好。
实施例1：用于检测小分子苯噻菌酯的基于三原色的多色测流免疫层析方法。
使用活泼酯法将发射光为红色和绿色的量子点(或发射光为红色和绿色的碳点)分别标记在链霉亲和素上，再通过链霉亲和素-生物素系统完成量子点(或碳点)对多肽的标记。标记的组合为：发射光为525nm的绿色量子点(或绿色碳点)标记在苯噻菌酯模拟表位多肽上；发射光为623nm的红色量子点(或红色碳点)标记在抗苯噻菌酯-抗体免疫复合物的多肽上。
分别通过活泼酯法将普鲁士蓝(或蓝色乳胶微球)标记在链霉亲和素上，静电作用的方法将纳米金(或活泼酯法将红色乳胶微球)标记在链霉亲和素上。再通过链霉亲和素-生物素系统完成普鲁士蓝和胶体金(或蓝色乳胶微球和红色乳胶微球)对多肽的标记。标记的组合为：纳米金(或红色乳胶微球)标记在苯噻菌酯模拟表位多肽上；普鲁士蓝(或蓝色乳胶微球)标记在抗苯噻菌酯-抗体免疫复合物的多肽上。
(1)基于加法三原色的多色试纸条：用PBS(0.01M,pH＝7.4)苯噻菌酯抗体(1.0mgmL-1)和兔抗链霉亲和素抗体(1.0mg mL-1)，分别作为T线和控制C线，喷在NC膜上，两条线的间距为5mm，将NC膜在37℃下干燥1小时；将4％BSA喷在结合垫上，并进行干燥，之后将标记后的绿色量子点和红色量子点(或绿色碳点和红色碳点)喷在结合垫上(5μL cm-1)，并进行干燥；将NC膜、结合垫与样品垫(玻璃纤维垫)和吸水垫组装成整条，将组装好的膜切成4mm宽，装入暗盒中，在室温下储存备用；将100μL标准品或者样品待测液(含5％BSA和5‰吐温20)加入到上样孔并层析10分钟。通过肉眼观察T线颜色进行半定量，若T线显示绿色荧光则无苯噻菌酯或低浓度农药残留，若T线显示黄色荧光为中等浓度农药残留，若T线显示红色为高浓度农药残留；将图片导入ImageJ 1.51j8软件中，将记录图像进行颜色通道分离，测量红色和绿色通道下的T线光密度，而后扣除背景信号得到校正后的T线光密度。以校正后的红色和绿色光密度比值为纵坐标，苯噻菌酯标准溶液浓度的对数为横坐标建立标准曲线，获得线性方程，将检测结果带入线性方程中计算出样品中苯噻菌酯的含量。
(2)基于减法三原色的多色试纸条：用PBS(0.01M,pH＝7.4)稀释苯噻菌酯抗体(1.0mg mL-1)和兔抗链霉亲和素抗体(1.0mg mL-1)分别作为T线和C线，喷在NC膜上用，两条线的间距为5mm，将NC膜在37℃下干燥1小时；将4％BSA喷在结合垫上，并进行干燥，之后将标记后的胶体金和普鲁士蓝喷在结合垫上(15μL cm-1)，并进行干燥；将NC膜、结合垫与样品垫(玻璃纤维垫)和吸水垫组装成整条，将组装好的膜切成4mm宽，装入暗盒中，在室温下储存备用；将100μL标准品或者样品待测液(含5％BSA和5‰吐温20)加入到上样孔并层析10分钟。通过肉眼观察T线颜色进行半定量，若T线显示红色则无苯噻菌酯或者低浓度农药残留，若T线显示紫色为中等浓度农药残留，若T线显示蓝色为高浓度农药残留；将图片导入ImageJ1.51j8软件中，将记录图像进行光饱和度分离，测量红色和蓝色通道下的T线灰度值，而后扣除背景信号得到校正后的T线灰度。以校正后的蓝色和红色灰度比值为纵坐标，苯噻菌酯标准溶液浓度的对数为横坐标建立标准曲线，获得线性方程，将检测结果带入线性方程中计算出样品中苯噻菌酯的含量。
本实施例的同步反应方法中所涉及的各个过程和材料如图1所示。
用于检测小分子的基于三原色的多色测流免疫层析对苯噻菌酯标准品的检测。
(1)苯噻菌酯农药标准溶液的配制
用甲醇配制苯噻菌酯标准品母液(1mg mL-1)，用含有10％甲醇、含5％BSA，0.5％吐温20的PBS(0.01M,pH＝7.4)将母液稀释成250ng/mL至0.25ng/mL系列浓度用于侧流免疫层析检测。
(2)基于加法三原色的多色试纸条
将100μL标准品溶液加入到上样孔并层析10分钟。
(3)基于减法三原色的多色试纸条
将100μL标准品溶液加入到上样孔并层析10分钟。
(4)检测结果的分析及结果判定
基于加法三原色的多色试纸条：过肉眼观察T线颜色进行半定量分析。相对阴性对照的结果如图2所示，当苯噻菌酯的浓度≤0.5ng mL-1T线区域呈现出绿色；当苯噻菌酯的浓度介于1.0～5.0ng mL-1T线区域呈现出渐变的黄色；当苯噻菌酯的浓度≥10ng mL-1T线区域呈现红色。图片导入ImageJ 1.51j8软件中，将记录图像进行颜色通道分离，测量红色和绿色通道下的T线光密度，而后扣除背景信号得到校正后的T线光密度。以校正后的红色和绿色光密度比值为纵坐标，苯噻菌酯标准溶液浓度的对数为横坐标建立标准曲线如图2所示，根据标准曲线计算其信号饱和中浓度(SC50)为3.48ng mL-1，最低检测限(LOD)为0.54ngmL-1。
基于减法三原色的多色试纸条：过肉眼观察T线颜色进行半定量分析。相对阴性对照的结果如图3所示，当苯噻菌酯的浓度大于≤5.0ng mL-1T线区域呈现出红色；当苯噻菌酯的浓度为10ng mL-1T线区域呈现出渐变的紫色；当苯噻菌酯的浓度≥25ng mL-1T线区域呈现出蓝色。将图片导入ImageJ 1.51j8软件中，将记录图像进行光饱和度分离，测量红色和蓝色的T线灰度，而后扣除背景信号得到校正后的T线灰度。以校正后的蓝色和红的灰度比值为纵坐标，苯噻菌酯标准溶液浓度的对数为横坐标建立标准曲线如图3所示。根据标准曲线计算其饱和信号中浓度(SC50)为16.50ng/mL，最低检测限(LOD)为1.97ng/mL。
基于三原色的多色试纸条对添加样品进行检测.
(1)添加样品的制备及处理
将苯噻菌酯标准品分别添加到土壤、大米、黄瓜和小麦样品中进行添加回收试验。称取粉碎混匀后的土壤、土壤、大米、黄瓜和小麦样品10g，添加标准品至1000、200、20ng g-1的终浓度用于基于加法三原色的多色试纸条；40、200、1000ng g-1的终浓度用于基于减法三原色的多色试纸条。将样品混匀，暗处室温静置过夜后，加入5mL水润湿样品，同时再加入20mL甲醇、5g氯化钠、5g无水硫酸钠混匀，涡旋5min，超声15min，4000rpm离心5min，将上清全部转移至50mL离心管内，用含10％BSA、5％吐温20的PBS(0.01M,pH＝7.4)缓冲液稀释10倍用于检测。需要进一步稀释的样品稀释液为10％甲醇、5％BSA、5‰吐温20的PBS(0.01M,pH＝7.4)缓冲液。
(2)基于加法三原色的多色试纸条
将100μL样品溶液加入到上样孔并层析10分钟。
(3)基于减法三原色的多色试纸条
将100μL样品溶液加入到上样孔并层析10分钟。
(4)检测结果的分析及结果判定
基于加法三原色的多色试纸条：
方法1:过肉眼观察T线颜色进行半定量分析。3种不同添加浓度下样品提液的总稀释倍数为20、200、40倍。如图4所示，T显得染色分别为红、黄、绿，与标准品在该浓度下的检测结果一致。
方法2:图片导入ImageJ 1.51j8软件中，将记录图像进行颜色通道分离，测量红色和绿色通道下的T线光密度，而后扣除背景信号得到校正后的T线红色和绿色光密度比值。其带入标准曲线方程，计算获得样品溶液中苯噻菌酯的含量，并用样品前处理过程中的稀释倍数进行校正，获得样品中苯噻菌酯的残留量，结果见表1。
基于减法三原色的多色试纸条：
方法1:过肉眼观察T线颜色进行半定量分析。3种不同添加浓度下样品提液的总稀释倍数均为20倍。如图4所示，T显得染色分别为蓝、紫、红，与标准品在该浓度下的检测结果一致。
方法2将图片导入ImageJ 1.51j8软件中，将记录图像进行饱和度分离，测量红色和蓝色通道下的T线灰度，而后扣除背景信号得到校正后的T线蓝色和红色灰度比值。其带入标准曲线方程，计算获得样品溶液中苯噻菌酯的含量，并用样品前处理过程中的稀释倍数进行校正，获得样品中苯噻菌酯的残留量，结果见表1。
表1：基于三原色的多色试纸条对添加样品的检测结果
实施例2：用于检测大分子前列腺特异抗原(PSA)的基于三原色的多色测流免疫层析方法。
使用活泼酯法将发射光为红色和绿色的量子点(或发射光为红色和绿色碳点)分别标记在链霉亲和素上，再通过链霉亲和素-生物素系统完成量子点(或碳点)对模拟表位和抗体的标记。标记的组合为：发射光为525nm的绿色量子点(或绿色碳)点标记在PSA模拟表位上；发射光为623nm的红色量子点(或红色碳点)标记在PSA检测抗体上。
分别通过活泼酯法将普鲁士蓝(或乳胶微球)标记在链霉亲和素上，静电作用的方法将纳米金(或活泼酯法将红色乳胶微球)标记在链霉亲和素上。再通过链霉亲和素-生物素系统完成普鲁士蓝和胶体金(或红色乳胶微球和蓝色乳胶微球)对模拟表位和抗体的标记。标记的组合为：纳米金(或红色乳胶微球)标记在PSA模拟表位上；普鲁士蓝(或蓝色乳胶微球)标记在PSA检测抗体上。或者使用共价键、弱作用力直接标记，通过活泼酯法将普鲁士蓝(或蓝色乳胶微球)直接标记在模拟表位上，静电作用的方法(或活泼酯法)将纳米金(或红色乳胶微球)直接标记在检测抗体上。
(1)基于加法三原色的多色试纸条：用PBS(0.01M,pH＝7.4)稀释PSA捕获抗体(1mgmL-1)和兔抗链霉亲和素抗体(1mg mL-1)(示踪物使用直接标记法时控制线为二抗、proteinG等)，分别作为T线和C线，喷在NC膜上，两条线的间距为5mm，将NC膜在37℃下干燥1小时；将4％BSA喷在结合垫上，并进行干燥，之后将标记后的绿色量子点和红色量子点(或绿色碳点和红色碳点)喷在结合垫上(5μL cm-1)，并进行干燥；将NC膜、结合垫与样品垫(玻璃纤维垫)和吸水垫组装成整条，将组装好的膜切成4mm宽，装入暗盒中，在室温下储存备用；将100μL标准品或者样品待测液(含5％BSA和5‰吐温20)加入到上样孔并层析10分钟。通过肉眼观察T线颜色进行半定量，若T线显示绿色荧光表示无PSA/低浓度PSA，若T线显示黄色荧光为中等浓度PSA，若T线显示红色为高浓度PSA；将图片导入ImageJ 1.51j8软件中，将记录图像进行颜色通道分离，测量红色和绿色通道下的T线光密度，而后扣除背景信号得到校正后的T线光密度。以校正后的红色和绿色光密度比值为纵坐标，PSA浓度的对数为横坐标建立标准曲线，获得线性方程，将检测结果带入线性方程中计算出样品中PSA的含量。
(2)基于减法三原色的多色试纸条：用PBS(0.01M,pH＝7.4)稀释PSA捕获抗体(1mgmL-1)和兔抗链霉亲和素抗体(1mg mL-1)分别作为T线和C线，喷在NC膜上用，两条线的间距为5mm，将NC膜在37℃下干燥1小时；将4％BSA喷在结合垫上，并进行干燥，之后将标记后的胶体金和普鲁士蓝喷在结合垫上(15μL cm-1)，并进行干燥；将NC膜、结合垫与样品垫(玻璃纤维垫)和吸水垫组装成整条，将组装好的膜切成4mm宽，装入暗盒中，在室温下储存备用；将100μL标准品或者样品待测液(含5％BSA和5‰吐温20)加入到上样孔并层析10分钟。通过肉眼观察T线颜色进行半定量，若T线显示红色表示无PSA/低浓度PSA，若T线显示紫色为中等浓度PSA，若T线显示蓝色为高浓度PSA；将图片导入ImageJ 1.51j8软件中，将记录图像进行饱和度分离，测量红色和蓝色通道下的T线灰度，而后扣除背景信号得到校正后的T线灰度。以校正后的蓝色和红色灰度比值为纵坐标，PSA浓度的对数为横坐标建立标准曲线，获得线性方程，将检测结果带入线性方程中计算出样品中PSA的含量。
本实施例的同步反应方法中所涉及的各个过程和材料如图5所示。
用于检测大分子的基于三原色的多色测流免疫层析对PSA标准品的检测。
(1)PSA的配制
用PBS(0.01M,pH＝7.4)配制PSA标准品母液(1mg mL-1)，用PBS(0.01M,pH＝7.4)将母液稀释成10ng mL-1至0.1ng mL-1系列浓度用于多色侧流免疫层析检测。
(2)基于加法三原色的多色试纸条
将100μL标准溶液加入到上样孔并层析10分钟。
(3)基于减法三原色的多色试纸条
将100μL标准溶液加入到上样孔并层析10分钟。
(4)检测结果的分析及结果判定
基于加法三原色的多色试纸条：过肉眼观察T线颜色进行半定量分析。相对阴性对照的结果如图6所示，≤0.25ng mL-1T线区域呈现出绿色；当PSA的浓度介于0.5～2.5ng mL-1T线区域呈现出渐变的黄色；当PSA的浓度≥5.0ng mL-1T线区域呈现出明红色。图片导入ImageJ 1.51j8软件中，将记录图像进行颜色通道分离，测量红色和绿色通道下的T线光密度，而后扣除背景信号得到校正后的T线光密度。以校正后的红色与绿色光密度比值为纵坐标，PSA标准溶液浓度的对数为横坐标建立标准曲线如图6所示，根据标准曲线计算其信号饱和中浓度(SC50)为0.81ng mL-1最低检测限(LOD)为0.35ng mL-1。
基于减法三原色的多色试纸条：过肉眼观察T线颜色进行半定量分析。相对阴性对照的结果如图7所示，≤0.25ng mL-1T线区域呈现出红色；当PSA的浓度介于0.5～1.0ng mL-1T线区域呈现出渐变的紫色；当PSA的浓度大于2.5ng mL-1T线区域呈现出蓝色。将图片导入ImageJ 1.51j8软件中，将记录图像进行饱和度分离，测量红色和蓝色通道下的T线灰度，而后扣除背景信号得到校正后的T线灰度。以校正后的蓝色和红色灰度比值为纵坐标，PSA标准溶液浓度的对数为横坐标建立标准曲线如图7所示。根据标准曲线计算其饱和信号中浓度(SC50)为2.26ng mL-1，最低检测限(LOD)为0.74ng mL-1。
3.基于三原色的多色试纸条对添加样品进行检测.
(1)添加样品的制备及处理
将PSA标准品分别添加到全血样品中进行添加回收试验。添加标准品至5.0、1.0、0.25ng mL-1的终浓度用于基于加法三原色的多色试纸条；10、2.0、0.25ng mL-1的终浓度用于基于减法三原色的多色试纸条。
(2)基于加法三原色的多色试纸条
将100μL添加样品溶液加入到上样孔并层析10分钟。
(3)基于减法三原色的多色试纸条
将100μL添加样品溶液加入到上样孔并层析10分钟。
(4)检测结果的分析及结果判定
基于加法三原色的多色试纸条：
方法1:过肉眼观察T线颜色进行半定量分析。如图8所示，3种不同添加浓度下T线的颜色分别为红、黄、绿，与标准品在该浓度下的检测结果一致。
方法2:图片导入ImageJ 1.51j8软件中，将记录图像进行颜色通道分离，测量红色和绿色通道下的T线光密度，而后扣除背景信号得到校正后的T线红色和绿色光密度比值。其带入标准曲线方程，计算获得样品溶液中PSA的含量，结果见表2。
基于减法三原色的多色试纸条：
方法1:过肉眼观察T线颜色进行半定量分析。如图8所示，3种不同添加浓度下样品T线颜色分别为红、紫、红，与标准品在该浓度下的检测结果一致。
方法2将图片导入ImageJ 1.51j8软件中，将记录图像进行光饱和度通道分离，测量红色和绿色通道下的T线灰度，而后扣除背景信号得到校正后的T线蓝色和红色灰度比值。其带入标准曲线方程，计算获得样品溶液中PSA的含量，结果见表2。
表2：基于三原色的多色试纸条对PSA添加样品的检测结果
本发明通过将竞争免疫分析和非竞争免疫分析分别标记不同示踪物，并集成在一张试纸条上，基于相加和相减三原色的原理实现随着分析物浓度的变化，在T线上呈现出不同颜色的侧流免疫层析技术。
本发明提供了一种基于三原色的多色免疫层析试纸条的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (7)
1.一种基于光学三原色的多色测流免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫，样品垫的右端搭设在结合垫的左端，所述结合垫的右端搭设在层析膜的左端，所述层析膜上从左至右依次设置有检测线和控制线，所述吸水垫的左端搭设在层析膜的右端，其特征在于，
所述结合垫上涂覆有标记的示踪物，其中，所述示踪物包括第一示踪物和第二示踪物，第一示踪物和第二示踪物分别与待检测物的竞争免疫分析试剂和非竞争免疫分析试剂进行标记，所述第一示踪物和第二示踪物为具有不同发光颜色的发光材料，且两种颜色混合后能形成第三种颜色；
或所述第一示踪物和第二示踪物为具有不同颜色的颜色材料，且两种颜色混合后能形成第三种颜色；所述检测线包被用于捕获待检测物的抗体，所述控制线包被用于捕获标记的示踪物的试剂，
其中，当待分析物为小分子时，所述小分子为苯噻菌酯，所述竞争性分析试剂为苯噻菌酯模拟表位多肽，所述非竞争性试剂为抗苯噻菌酯-抗体免疫复合物的多肽；当待分析物为大分子时，所述竞争免疫分析试剂为待分析物的模拟表位，所述非竞争免疫分析试剂为待分析物的检测抗体。
2.根据权利要求1所述的多色测流免疫层析试纸条，其特征在于，所述示踪物首先标记在链霉亲和素上，然后通过链霉亲和素-生物素系统完成示踪物对生物素化的竞争免疫分析试剂和非竞争免疫分析试剂的标记，或所述示踪物使用共价键、弱作用力直接标记于竞争免疫分析试剂或非竞争免疫分析试剂。
3.根据权利要求1所述的多色测流免疫层析试纸条，其特征在于，所述发光材料为发光量子点或发光碳点，所述颜色材料为纳米金、普鲁士蓝或乳胶微球。
4.根据权利要求3所述的多色测流免疫层析试纸条，其特征在于，所述发光量子点为红色量子点和绿色量子点，发光碳点为红色碳点和绿色碳点，所述红色量子点和绿色量子点或红色碳点和绿色碳点分别使用活泼酯法标记在链霉亲和素上；所述纳米金通过静电作用标记在链霉亲和素上，所述普鲁士蓝或乳胶微球通过活泼酯法标记在链霉亲和素上。
5.根据权利要求1所述的多色测流免疫层析试纸条，其特征在于，所述样品垫为玻璃纤维垫，所述层析膜为醋酸纤维素膜。
6.权利要求1-5任一项所述的多色测流免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将第一示踪物和第二示踪物分别与待分析物的竞争免疫分析试剂和非竞争免疫分析试剂进行标记；
（2）层析膜预处理：用PBS稀释捕获待检测物的抗体和捕获标记示踪物的试剂，分别作为T线和C线，喷在层析膜上，两条线的间距为3-10 mm，将层析膜在37 ℃下干燥1~2小时；
（3）结合垫的处理：将4% BSA喷在结合垫上，并进行干燥，之后将标记后的第一示踪物和标记后的第二示踪物喷在结合垫上，并进行干燥；
（4）将层析膜、结合垫、样品垫和吸水垫组装成整条，将组装好的膜切成3-5 mm宽，装入暗盒中，在室温下储存备用。
7.权利要求1-5任一项所述的多色测流免疫层析试纸条的检测方法，其特征在于，将待分析物溶于含5% BSA和5‰吐温20的PBS中，然后滴加到样品垫的上样孔中，层析10-15min，通过观察T线颜色进行半定量，或拍摄T线图像，通过图像分析方法进行定量分析。
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