CN113358862A - 一种三联毒品荧光免疫层析试剂纸、检测试剂盒和检测方法 - Google Patents

一种三联毒品荧光免疫层析试剂纸、检测试剂盒和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种三联毒品荧光免疫层析试剂纸、检测试剂盒和检测方法。所述的三联毒品荧光免疫层析试纸条，是由样品垫、NC膜和吸水垫组成；所述的NC膜，从靠近样品垫的一端依次设有MET检测线、MOR检测线、KET检测线和质控线。检测时，将污水待测样品与磁性荧光探针冻干粉孵化反应，回收，加入检测卡点样孔中，层析后将检测卡观察孔用荧光读取仪扫描；通过标准曲线，以及各检测线与质控线电信号的比值计算三种毒品代谢物的浓度。本发明检测样本时先利用磁性荧光探针的磁响应功能捕获并富集待检物质，降低其他物质干扰；然后利用多联检测试纸条定量检测样品中多种待检物质。灵敏度可达ng/L，满足对污水中毒品代谢物的各级溯源要求。

Description

一种三联毒品荧光免疫层析试剂纸、检测试剂盒和检测方法
技术领域
本发明属于毒品分析检测领域，具体涉及一种三联毒品(甲基苯丙胺MET、吗啡MOR、氯胺酮KET)荧光免疫层析试剂纸、检测试剂盒和检测方法。
背景技术
目前，甲基苯丙胺MET、吗啡MOR、氯胺酮KET是滥用最为广泛的三种毒品。
非法药物滥用量的监控一般是通过社会流行病学调查进行，该方法具有很大的局限性和不确定性。
自2001年污水流行病学的概念被提出后，基于污水流行病学的毒情研判技术也逐步被应用到药物滥用的检测中。污水中毒品及其代谢物的主要来源为吸毒人员排泄物、突击缉查时吸毒人员为毁灭证据经下水道冲走的毒品、及制毒场所排放的废水等。通过对城市地下道污水系统中毒品及其代谢物的含量监测能够推算出某种毒品在当地的使用情况。污水中毒品代谢物的监测不仅有助于对吸毒、贩毒分子进行有效抓捕，还能通过逐级定点检测对制毒窝点进行精准溯源定位。
但污水中毒品及其代谢物的含量较低，毒品及其代谢物的种类比较复杂。如何针对污水中最常见的多种毒品作出高效、快速、准确、稳定的检测成为了亟待解决的问题。常规的分析手段很难满足同时对污水中多种微量毒品快速检测的需求，有效的前处理手段和高效、灵敏的分析方法是监测环境中多种滥用药物的关键。
目前甲基苯丙胺、吗啡和氯胺酮等毒品的定量检测和监控方法主要依赖于大型仪器，如高效液相色谱、气相色谱、液质或气质连用等。这些方法灵敏度高、重复性好，但操作复杂，仪器设备昂贵，分析效率低。
酶联免疫吸附测定(ELISA)以及胶体金免疫层析法是目前国际上较为认可的主流检测技术，这两种方法检测速度快，价格便宜，操作简便。但ELISA检测仍需专业人员操作，且结果显示时间长；胶体金免疫层析技术也只能对尿液、血液或唾液等毒品代谢物含量高的样本进行定性分析，存在灵敏度低、批间差异大、分析效率低等问题。
发明内容
本发明提供了一种三联毒品(甲基苯丙胺MET、吗啡MOR、氯胺酮KET)荧光免疫层析试剂纸、检测试剂盒和检测方法，检测灵敏度可达ng/L(目前多数荧光免疫层析试纸条检毒品的灵敏度在ng/mL范围内)，分析效率高、线性范围好，可以较好地对城市污水中多种毒品代谢物进行现场溯源处理，帮助公安缉毒人员对城市中的毒品产业链进行即时的监测和治理。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
磁性荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)标记抗体：将磁性荧光微球活化后，用MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)缓冲液超声重悬，分别加入MET抗体、MOR抗体、KET抗体、羊抗鸡IgY抗体，室温下低速混旋反应至少1h；
(2)封闭：向各抗体标记的磁性荧光微球中分别加入BSA(牛血清白蛋白)，旋转反应至少30min，离心后取沉淀，得到三种检测探针(MET抗体标记磁性荧光探针、MOR抗体标记磁性荧光探针、KET抗体标记磁性荧光探针)和一种质控探针(羊抗鸡IgY抗体标记磁性荧光探针)；
步骤(1)所述的活化，是将磁性荧光微球用MES缓冲液清洗并重悬，再加入EDC(碳二亚胺)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，室温下混旋反应至少30min，离心后取沉淀；
优选地，所述的MES缓冲液，浓度0.1M，pH值6.0；
优选地，所述的离心是15000rpm离心30min。
一种磁性荧光探针冻干粉，是将上述方法制得的三种检测探针(MET抗体标记磁性荧光探针、MOR抗体标记磁性荧光探针、KET抗体标记磁性荧光探针)和质控探针(羊抗鸡IgY抗体标记磁性荧光探针)分别以等量的标记保存液重悬，然后将三种检测探针以体积比1:1:1混匀，最后将三种检测探针的混合溶液与质控探针以9:1的体积比混合，等体积(2uL，0.4ug)分装入各冻存管中，进行冷冻干燥(最终为淡黄色冻干粉)，即得磁性荧光探针冻干粉；
所述标记保存液的配方如下：在0.1M的Gly-NaOH缓冲液中分别加入质量比为5％蔗糖、5％海藻糖、1％BSA、0.5％酪蛋白钠、0.02％Proclin300。
一种三联毒品荧光免疫层析试纸条，由样品垫、NC膜(硝酸纤维素膜)和吸水垫组成；
所述的NC膜，从靠近样品垫的一端依次设有MET检测线、MOR检测线、KET检测线和质控线；
优选地，所述各检测线、质控线的间距为3.5mm，KET检测线与吸水垫的距离为11mm；如此设计，一是为了观察孔不遮挡检测线便于检测，二是为了使联检试纸条检测结果更准确。
所述试剂纸的制法包括以下步骤：
(1)将MET-BSA、MOR-BSA、KET-BSA和鸡IgY分别包被于NC膜上，干燥后依次形成MET检测线、MOR检测线、KET检测线和质控线，作为处理后的NC膜；
步骤(1)的操作优选采用X、Y、Z三维点膜喷金仪操作，MET-BSA浓度为0.25mg/mL，MOR-BSA浓度为0.5mg/mL，KET-BSA浓度为2mg/mL，鸡IgY浓度为1mg/mL，在NC膜上的包被量优选1μL/cm；
(2)将玻璃纤维素膜用缓冲液处理(浸泡或涂抹)，然后干燥，作为样品垫；取吸水纸充分干燥后，作为吸水垫；将样品垫、NC膜和吸水垫依次铺于PVC底板上，经剪切后得到试剂纸，结构如图1所示；
所述缓冲液的配方是，在0.015M、pH值7.4的PBS缓冲液中分别加入质量比为0.5％S-9表面活性剂、0.1％酪蛋白钠盐和1％蔗糖。
一种三联毒品荧光免疫检测卡，包括上、下卡壳；
上卡壳上设有点样孔和观察孔；
下卡壳上依次铺有PVC底板和前述的三联毒品荧光免疫层析试纸条；
所述试剂纸的样品垫在位置上与上卡壳的点样孔重叠，方便操作人员点样；
所述试剂纸的NC膜各检测线及质控线在位置上与上卡壳的观察孔重叠，方便观察检测结果。
一种三联毒品荧光免疫检测试剂盒，包括所述的磁性荧光探针冻干粉和/或三联毒品荧光免疫检测卡。
基于所述试剂盒对污水中的三种毒品进行荧光免疫检测的方法，包括以下步骤：
(1)每1mL的污水待测样品与0.4μg磁性荧光探针冻干粉混合，25-37℃共孵育至少10min，磁力架磁回收MFB-MET-mAbs、MFB-MOR-mAbs、MFBs-KET-mAbs和对应毒品代谢物形成的免疫复合物及未结合毒品代谢物的磁性荧光探针；去上清液后将回收沉淀重悬于PBS缓冲液中，得到待测样本液；
(2)取待测样本液滴加到三联毒品荧光免疫检测卡点样孔中，层析10-15min后将检测卡观察孔用荧光读取仪扫描；
(3)未结合毒品代谢物的磁性荧光探针截留在各检测线和质控线上，在激发光激发下发出荧光；荧光读取仪检测各检测线和质控线的荧光信号，并将荧光信号转化为电信号，然后通过标准曲线，以及各检测线与质控线电信号的比值计算三种毒品代谢物的浓度；
所述步骤(3)中，激发光的波长范围为300～400nm，优选365nm。
本发明对三联毒品进行荧光免疫检测的原理如下：
人体摄入毒品后，药物及其代谢产物经肝脏代谢后，通过尿液、汗液或其他体液等排除体外，制毒、贩毒所存在的毒品也以相应的方式形成生活污水被排入下水道污水中。
本发明的多联检测试纸条由处理过的样品垫，磁性荧光探针冻干粉，NC膜和吸水垫组成。NC膜上依次有由MET-BSA，MOR-BSA，KET-BSA包被形成的检测线(T线)和包被鸡IgY形成的质控线(C线)。
检测时，将一定量的污水加入固定量的MFBs-MET-mAb、MFBs-MOR-mAb、MFBs-KET-mAb、MFBs-羊抗鸡IgY组成的磁性荧光探针冻干粉中。反应充分后利用钕磁铁富集，再通过PBS缓冲液复溶加入多联试纸条点样孔中。
如果污水中包含低浓度的某种毒品代谢物成分，则冻干粉中相应的检测探针结合完这种毒品代谢物被富集后，大部分将由于未结合对应的毒品代谢物而与检测线上相应的完全抗原结合；如果污水中含有高浓度的某种毒品代谢物成分，则冻干粉中相应的检测探针将由于大多数结合了污水中的此毒品代谢物被富集后，只有剩下的少量未结合检测探针与T线上相应的完全抗原结合。
污水中残留的毒品浓度越高，相应的检测探针与T线上相应抗原的结合越少，从而导致荧光信号变弱。但是，无论污水中各种毒品代谢物的浓度如何变化，C线的荧光信号都将基本保持不变。相应的T线荧光信号与C线荧光信号之比与污水中对应的毒品代谢物浓度成反比。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)灵敏度高：本发明所采用的磁性荧光微球由磁性材料四氧化三铁纳米粒子及油胺化CdSe/ZnS量子点合成，兼具磁响应和荧光特性的双重功能。检测样本时先利用磁性荧光探针的磁响应功能捕获并富集待检物质，降低其他物质干扰；然后利用量子点的荧光特性结合多联检测试纸条定量检测样品中多种待检物质。优化后的试纸条灵敏度可达ng/L，满足对各级污水中毒品代谢物的溯源要求。
(2)检测便捷：目前对甲基苯丙胺、吗啡和氯胺酮等毒品的定量检测和监控方法主要依赖于大型仪器，如高效液相色谱、气相色谱、液质或气质连用等。这些方法需对样品进行复杂的前处理，分析成本高，检测时间长。而利用本发明的多联磁性荧光免疫层析试纸条检测污水中的毒品代谢物，无需复杂的样本前处理过程，检测总时长约20min左右，且可同时检测单个样本内三中痕量毒品的浓度。
(3)检测通量高：本发明多联磁性荧光免疫层析试纸条可实现单次点样同时检测污水中MET、MOR、KET的浓度情况，既可节省检测总耗时、分析成本，又能节约样本用量，防止污水中毒品代谢物的漏检。
(4)应用场景广：本发明多联磁性荧光免疫层析试纸条不仅可用于对污水中多种毒品代谢物的快速检测，经进一步优化后还可用于对环境、毛发、汗液等痕量样本中多种毒品代谢物的定量检测。对禁毒局、戒毒所及海关等毒品检测相关机构快速监测毒情具有较大的帮助。
附图说明
图1是本发明三联毒品荧光免疫检测卡的结构组成示意图；其中：1-PVC底板，2-样品垫，3-NC膜，4-吸水垫，5-MET检测线，6-MOR检测线，7-KET检测线，8-质控线，9-下卡壳，10-上卡壳，11-观察孔，12-点样孔。
图2是MET、MOR、KET浓度与对应检测线与质控线荧光强度比值(FT/FC)的标准曲线。
图3是三种抗体标记磁性荧光探针的特异性检测实验结果；其中，(a)(b)MET抗体标记磁性荧光探针交叉反应率图；(c)(d)MOR抗体标记磁性荧光探针交叉反应率图；(e)(f)KET抗体标记磁性荧光探针交叉反应率图。
图4是本发明检测方法检测结果与现有HPLC-MS/MS检测方法的比较；其中，(a)MET含量；(b)MOR含量；(c)KET含量。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一种磁性荧光探针冻干粉，由以下步骤制得：
(1)活化：将100μg的磁性荧光微球先用MES缓冲液(0.1M、pH值6.0)清洗3次后重悬于990μl MES缓冲溶液中，振荡混匀后再分别加入10μL10mg/mL的EDC(碳二亚胺)和10μL10mg/mL的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，室温下混旋旋转30min；15000rpm离心30min后弃上清；
所述的磁性荧光微球是按文献(Guo L,Shao Y N,Duan H,et al.MagneticQuantum Dot Nanobead-Based Fluorescent Immunochromatographic Assay for theHighly Sensitive Detection of Aflatoxin B-1in Dark Soy Sauce[J].AnalyticalChemistry,2019,91(7):4727-4734.)方法制得，荧光发射波长为600-620nm，优选618nm。
(2)抗体标记：向沉淀中加入1000μL MES缓冲液，超声重悬；加入MET抗体(mAb-MET)2μg，室温下低速混旋反应1h；
(3)封闭：加入10μL 10％BSA(牛血清白蛋白)旋转反应30min，15000rpm离心30min后弃上清，4℃条件下保存备用；
(4)磁性荧光微球标记MOR抗体：活化并重悬的磁性荧光微球加入MOR抗体(mAb-MOR)4μg，其余步骤同步骤(3)。
磁性荧光微球标记KET抗体：活化并重悬的磁性荧光微球加入KET抗体(mAb-KET)8μg，其余步骤同步骤(3)。
磁性荧光微球标记羊抗鸡IgY抗体：活化并重悬的磁性荧光微球加入羊抗鸡IgY抗体5μg，其余步骤同步骤(3)。
(5)将上述方法制得的三种检测探针(MET抗体标记磁性荧光探针、MOR抗体标记磁性荧光探针、KET抗体标记磁性荧光探针)和质控探针(羊抗鸡IgY抗体标记磁性荧光探针)分别以500μL标记保存液重悬，然后将三种检测探针以体积比1:1:1混匀，最后将三种检测探针的混合溶液与质控探针以9:1的体积比混合，等体积(2uL，0.4ug)分装入各冻存管中，进行冷冻干燥(最终为淡黄色冻干粉)，即得磁性荧光探针冻干粉；
所述标记保存液的配方如下：在0.1M的Gly-NaOH缓冲液中分别加入质量比为5％蔗糖、5％海藻糖、1％BSA、0.5％酪蛋白钠、0.02％Proclin300。
本发明所使用的三种检测抗体mAb-MET、mAb-MOR、mAb-KET均来自于EastCoastBio生物科技有限公司；
本发明所使用的鸡IgY及羊抗鸡IgY均来自于杭州启泰生物科技有限公司。
实施例2
一种三联毒品荧光免疫检测卡，其结构组成如图1所示，包括上10、下9卡壳；
上卡壳10上设有点样孔12和观察孔11；
下卡壳9上铺有PVC底板1，底板上是三联毒品荧光免疫层析试纸条；
所述试剂纸由样品垫2、NC膜3和吸水垫4组成；
所述的NC膜3，从靠近样品垫2的一端依次设有MET检测线5、MOR检测线6、KET检测线7和质控线8；所述各检测线、质控线的间距为3.5mm，KET检测线与吸水垫的距离为11mm；
所述试剂纸3的样品垫2在位置上与上卡壳10的点样孔12重叠，方便操作人员点样；
所述NC膜3的各检测线5、6、7与质控线8在位置上与上卡壳10的观察孔11重叠，方便观察检测结果。
所述试剂纸的制法包括以下步骤：
(1)将硝酸纤维素膜(NC膜)(型号：Millipore CN140)粘贴到PVC底板上，先置于37℃烘箱平衡30min。采用X、Y、Z三维点膜喷金仪，将0.25mg/mLMET-BSA、0.5mg/mLMOR-BSA、2mg/mLKET-BSA和1mg/mL鸡IgY分别以1μL/cm包被于NC膜上，依次作为T1、T2、T3检测线和质控线，各包被线间距为3.5mm，其中T3检测线与吸水纸边缘的距离为11mm，与质控线的距离为3.5mm。37℃干燥过夜，保存于恒温恒湿储物柜备用，作为NC膜；
(2)将玻璃纤维素膜(型号：GL-b04)裁剪成2.5cm×30cm的规格，每张裁剪好的玻璃纤维膜加入5mL样品垫处理液。用推进器均匀涂抹样品垫处理液，室温铺展过夜后于37℃干燥箱中烘干，干燥完成后密封保存于恒温恒湿储物柜中备用(温度：20-25℃，相对湿度：<30％)，作为样品垫；
样品垫的缓冲液配方如下：在0.015M、pH值7.4的PBS缓冲液中分别加入质量比为0.5％S-9表面活性剂、0.1％酪蛋白钠盐和1％蔗糖。
(3)取吸收垫材料(滤纸，型号：H-6)剪成2.5cm×30cm小条，置于37℃烘箱干燥后放入铝箔袋中，加入干燥剂，密闭保存于恒温恒湿储物柜中以备后用作为吸水垫；
(4)将制备好的样品垫、NC膜和吸水垫依次按顺序粘贴到PVC底板上，每部分重叠1-2mm以确保样品滴加后试纸条能够顺利的完成整个流动过程，制得三联毒品荧光免疫层析试纸条。
实施例3
一种三联毒品荧光免疫检测试剂盒，包括实施例1所述的磁性荧光探针冻干粉和实施例3的三联毒品荧光免疫检测卡。
基于所述试剂盒对污水中的三联毒品进行荧光免疫检测的方法，包括以下步骤：
(1)将1mL的污水待测样品与0.4μg磁性荧光探针冻干粉混合，37℃共孵育至少10min，磁力架磁回收样品中MFB-MET-mAbs、MFB-MOR-mAbs、MFBs-KET-mAbs和相应毒品代谢物形成的免疫复合物及未结合的各磁性荧光探针；去上清液后将免疫复合物重悬于100μLPBS缓冲液中，得到待测样本液；
(2)取75μL待测样本液滴加到三联毒品荧光免疫检测卡点样孔中，反应10-15min后将检测卡观察孔用荧光读取仪扫描；
(3)未结合毒品代谢物的磁性荧光探针截留在各检测线和质控线上，在365nm激发光激发下发出荧光；荧光读取仪检测各检测线和质控线的荧光信号，并将荧光信号转化为电信号，然后通过标准曲线，以及各检测线与质控线电信号的比值计算三种毒品代谢物的浓度。
本发明中标准曲线的制作如下：
(1)配制高浓度的毒品参考品溶液，用阴性污水稀释至下列梯度浓度：
MET:10000ng/L、5000ng/L、2000ng/L、1000ng/L、500ng/L、200ng/L、100ng/L、50ng/L、20ng/L、10ng/L、5ng/L、2ng/L、0ng/L。
MOR:5000ng/L、1000ng/L、500ng/L、200ng/L、100ng/L、50ng/L、20ng/L、10ng/L、5ng/L、2ng/L、1ng/L、0.5ng/L、0ng/L。
KET:10000ng/L、5000ng/L、2000ng/L、1000ng/L、500ng/L、200ng/L、100ng/L、50ng/L、20ng/L、10ng/L、5ng/L、2ng/L、1ng/L、0.5ng/L、0ng/L。
(2)依次取1mL的各毒品参考品溶液与0.4μg磁性荧光探针冻干粉混合，37℃共孵育10min，磁力架磁回收样品中MFB-MET-mAbs、MFB-MOR-mAbs、MFBs-KET-mAbs和相应毒品代谢物形成的免疫复合物及未结合的各磁性荧光探针；去上清液后将免疫复合物重悬于100μLPBS缓冲液中，得到待测样本液；
(3)依次吸取75μL待测样本液加入三联毒品荧光免疫检测卡点样孔中，于加样10min后检测，每个浓度3个重复。反应10min后利用荧光读取仪读取各浓度参考品溶液对应的多联试纸条检测线与质控线荧光强度的比值FT/FC，以参考品阴性样和其他阳性样的读取值FT/FC分别表示为B0和BX，以各组标准品相应浓度的对数为横坐标，其他阳性样的读取值BX代入公式Logit(Y)＝LN[(BX/B0)/(1-BX/B0)的结果为纵坐标，采用log-logit函数模型进行数据处理，即Logit(Y)＝A+B×Log(X)，绘制各毒品代谢物MET、MOR、KET浓度与对应检测线与质控线荧光强度比值(FT/FC)的标准曲线。
标准曲线如图2所示，在一定浓度范围内，多联检测荧光免疫层析定量检测试纸条有良好的剂量－反应线性关系，可得剂量－反应曲线方程为：
MET：Logit(Y)＝1.341-0.813Log(X)，其剂量－反应曲线相关系数R2为0.998，试纸条的线性范围为：10-5000ng/L；
MOR：Logit(Y)＝2.253-2.137Log(X)，其剂量－反应曲线相关系数R2为0.994，试纸条的线性范围为：2-500ng/L；
KET：Logit(Y)＝3.064-1.194Log(X)，其剂量－反应曲线相关系数R2为0.991，试纸条的线性范围为：2-5000ng/L。
联检试纸条线性范围满足检测污水中各毒品代谢物的需求。
实施例4
实施例1所得三种抗体标记磁性荧光探针的特异性检测
将实施例1制得的三种检测探针(MET抗体标记磁性荧光探针、MOR抗体标记磁性荧光探针、KET抗体标记磁性荧光探针)和质控探针(羊抗鸡IgY抗体标记磁性荧光探针)分别进行冷冻干燥，然后各取0.12μg三种检测抗体标记磁性荧光探针与0.04ug质控探针组合，分别加入以阴性污水配制的1mL 10ng/mL的各干扰物加标样；干扰物为四氢大麻酚、吗啡、甲基苯丙胺、氯胺酮、地西泮、美沙酮、奥沙西泮、可卡因、芬太尼、四氢大麻酸、3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺(MDMA)等11种毒品代谢物；
25-37℃孵育10min后，利用铷磁铁富集沉淀，最后用100μL PBS重悬，滴加75μL重悬液到实施例2三联毒品荧光免疫检测卡点样孔中，反应10min后利用荧光读取仪读取试纸条检测线与质控线荧光强度的比值(FT/FC)及样品检测值，利用公式：
交叉反应率＝(样品检测值/样品实际值)×100％
样品实际值即10ng/mL
计算各类似毒品的交叉反应率，结果如图3所示：MET抗体标记磁性荧光探针仅与其类似物MDMA(3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺)存在一定的交叉反应，与其他类似的毒品基本上不存在交叉反应。MOR、KET标记的两种磁性荧光探针特异性良好，基本不与其他类似毒品反应。
实施例5
本发明方法(实施例3方法)与其他方法的对比
收集21份污水实际样。以实施例3的方法检测出各样本中各毒品代谢物的浓度，将实施例3方法检测实际样计算出的结果与文献(Castiglioni S,Zuccato E,Chiabrando C,et al.Mass spectrometric analysis of illicit drugs in wastewater and surfacewater[J].Mass Spectrometry Reviews,2008,27(4):378-394.)方法(液相色谱-质谱串联检测技术LC-MS)的检测结果对比，并将两种检测方法的检测结果进行线性模拟计算，结果见图4，两种检测方法检测MET、MOR、KET三种物质，各检测结果的线性回归系数R2>0.99，说明两种方法的相关性良好，检测实际样的结果具有较强的一致性，如图4和表1。
检测MET时两种方法的线性回归方程为：Y＝1.603+0.883X，R＝0.999，P<0.001；检测MOR时两种方法的线性回归方程为：Y＝1.713+0.854X，R＝0.999，P<0.001；检测KET时两种方法的线性回归方程为：Y＝3.484+0.983X，R＝0.999，P<0.001。
以上结果表明，本发明可以同时定量检测污水样本中的甲基苯丙胺、吗啡、氯胺酮3种毒品代谢物的含量，并且与传统方法LC-MS/MS具有良好的相关性，结果互不干扰，是判断城市毒情更便捷的检测方法。
表1.多联检测试纸条实际样检测结果与HPLC-MS/MS对比。
Figure BDA0003079761420000111
实施例6
三联毒品荧光免疫层析试纸条分析灵敏度的测定
利用实施例2的三联毒品荧光免疫层析试纸条重复测定MET、MOR、KET阴性样污水各20次，将其检测线与质控线的荧光值之比FT/FC的均值X减二倍标准差作为BX代入各试纸条的剂量－反应曲线(即实施例3的标准曲线)求出相对应的浓度值。
经测定，MET、MOR、KET磁性荧光免疫层析试纸条的分析灵敏度分别为8.32ng/L、1.47ng/L、1.62ng/L。对应的FT/FC值及CV值大小如表2、表3、表4所示：
表2.MET磁性荧光免疫层析试纸条的分析灵敏度
Figure BDA0003079761420000121
表3.MOR磁性荧光免疫层析试纸条的分析灵敏度
Figure BDA0003079761420000122
表4.KET磁性荧光免疫层析试纸条的分析灵敏度
Figure BDA0003079761420000123
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (16)

1.磁性荧光探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)标记抗体：将磁性荧光微球活化后，用MES缓冲液超声重悬，分别加入MET抗体、MOR抗体、KET抗体、羊抗鸡IgY抗体，室温下低速混旋反应至少1h；
(2)封闭：向各抗体标记的磁性荧光微球中分别加入牛血清白蛋白，旋转反应至少30min，离心后取沉淀，分别得到MET抗体标记磁性荧光探针、MOR抗体标记磁性荧光探针、KET抗体标记磁性荧光探针及羊抗鸡IgY抗体标记磁性荧光探针。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述的活化，是将磁性荧光微球用MES缓冲液清洗并重悬，再加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下混旋反应至少30min，离心后取沉淀。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
所述的MES缓冲液，浓度0.1M，pH值6.0；
所述的离心是15000rpm离心30min。
4.磁性荧光探针，其特征在于：是由权利要求1-3任一项所述的方法制得。
5.一种磁性荧光探针冻干粉，其特征在于：是将MET抗体标记磁性荧光探针、MOR抗体标记磁性荧光探针、KET抗体标记磁性荧光探针和羊抗鸡IgY抗体标记磁性荧光探针分别以等量的标记保存液重悬，然后将三种检测探针以体积比1:1:1混匀，最后将三种检测探针的混合溶液与羊抗鸡IgY抗体标记磁性荧光探针以9:1的体积比混合，装入冻存管中，进行冷冻干燥，即得磁性荧光探针冻干粉。
6.根据权利要求5所述的磁性荧光探针冻干粉，其特征在于：所述标记保存液的配方如下：在0.1M的Gly-NaOH缓冲液中分别加入质量比为5％蔗糖、5％海藻糖、1％BSA、0.5％酪蛋白钠、0.02％Proclin300。
7.一种三联毒品荧光免疫层析试纸条，其特征在于：是由样品垫、NC膜和吸水垫组成；
所述的NC膜，从靠近样品垫的一端依次设有MET检测线、MOR检测线、KET检测线和质控线。
8.根据权利要求7所述的试纸条，其特征在于：所述各检测线、质控线的间距为3.5mm，KET检测线与吸水垫的距离为11mm。
9.权利要求7或8所述的三联毒品荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将MET-BSA、MOR-BSA、KET-BSA和鸡IgY分别包被于NC膜上，干燥后依次形成MET检测线、MOR检测线、KET检测线和质控线，作为处理后的NC膜；
(2)将玻璃纤维素膜用缓冲液处理，然后干燥，作为样品垫；取吸水纸充分干燥后，作为吸水垫；将样品垫、NC膜和吸水垫依次铺于PVC底板上，经剪切后得到试剂纸。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)的操作采用X、Y、Z三维点膜喷金仪操作，MET-BSA浓度为0.25mg/mL，MOR-BSA浓度为0.5mg/mL，KET-BSA浓度为2mg/mL，鸡IgY浓度为1mg/mL，在NC膜上的包被量为1μL/cm。
11.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述缓冲液的配方是，在0.015M、pH值7.4的PBS缓冲液中分别加入质量比为0.5％S-9表面活性剂、0.1％酪蛋白钠盐和1％蔗糖。
12.一种三联毒品荧光免疫检测卡，其特征在于含有权利要求7或8所述的三联毒品荧光免疫层析试纸条。
13.根据权利要求12所述的检测卡，其特征在于：包括上、下卡壳；
上卡壳上设有点样孔和观察孔；
下卡壳上依次铺有PVC底板和权利要求7或8所述的三联毒品荧光免疫层析试纸条；
所述试剂纸的样品垫在位置上与上卡壳的点样孔重叠；
所述试剂纸的NC膜各检测线及质控线在位置上与上卡壳的观察孔重叠。
14.一种三联毒品荧光免疫检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求5或6所述的磁性荧光探针冻干粉和/或权利要求12或13所述的三联毒品荧光免疫检测卡。
15.基于权利要求14所述试剂盒对污水中的三种毒品进行荧光免疫检测的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)每1mL的污水待测样品与0.4μg磁性荧光探针冻干粉混合，25-37℃共孵育至少10min，磁力架磁回收MFB-MET-mAbs、MFB-MOR-mAbs、MFBs-KET-mAbs和对应毒品代谢物形成的免疫复合物及未结合毒品代谢物的磁性荧光探针；去上清液后将回收沉淀重悬于PBS缓冲液中，得到待测样本液；
(2)取待测样本液滴加到三联毒品荧光免疫检测卡点样孔中，层析10-15min后将检测卡观察孔用荧光读取仪扫描；
(3)未结合毒品代谢物的磁性荧光探针截留在各检测线和质控线上，在激发光激发下发出荧光；荧光读取仪检测各检测线和质控线的荧光信号，并将荧光信号转化为电信号，然后通过标准曲线，以及各检测线与质控线电信号的比值计算三种毒品代谢物的浓度。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，激发光的波长范围为300～400nm。
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