CN116794293A - 抗体荧光标记探针、免疫荧光层析试纸条、其制备方法和应用 - Google Patents
抗体荧光标记探针、免疫荧光层析试纸条、其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及抗体荧光标记探针、免疫荧光层析试纸条及其制备方法和应用。本发明提供的抗体荧光标记探针包括经活化处理后的荧光微球和与所述荧光微球偶联的抗体。本发明通过筛选高性能荧光微球，优化抗体荧光标记探针的制备方法，显著提高了免疫层析检测技术的灵敏度，本发明提供的免疫荧光层析试纸条则避免了现有试剂卡中过多的搭接结构导致样品溶液的迁移速度大幅降低的问题，可有效缩短样品溶液进入检测膜的时长，且该试纸条重复性好，抗干扰能力良好，展现出良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及抗体荧光标记探针、免疫荧光层析试纸条、其制备方法和应用。
背景技术
免疫层析技术(immunochromatography assay，ICA)，起源于20世纪80年代，是一种结合了免疫技术和色谱层析技术的检测诊断方法。免疫层析一般发生于免疫层析试纸条上。试纸条通常依次由样品垫、结合垫、检测膜、吸水纸和底板五部分组成，基本结构如图1和图2所示。在检测膜上指定位置包被有相应抗原或抗体的检测线(T线)和控制线(C线)，滴加样品溶液测试时，溶液受毛细作用沿着试纸条往前迁移，在结合垫处与带标记的抗体或抗原探针发生特异性结合，随后继续往前移动，在T线和C线上出现结合、滞留，依据T/C线上的标记信号的有无多少进行结果判定。
当前公安毒检部门在实际执法过程中使用传统免疫层析试纸条进行吸毒筛查时，常常最快都需要耗时5分钟甚至更长时间才能进行检测结果的判读，故极易出现交通堵塞、检测效率低等问题。因此，当前在公安毒检部门亟需一种可用于路面毒检快速筛查的试纸条，以加速执法筛查过程，同时也可帮助拓展现有检测试纸的应用场景。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了抗体荧光标记探针、免疫荧光层析试纸条、其制备方法和应用。本发明通过筛选高性能荧光微球，优化抗体荧光标记探针的制备方法，显著提高了免疫层析检测技术的灵敏度；本发明提供的免疫荧光层析试纸条则避免了现有试剂卡中过多的搭接结构导致样品溶液的迁移速度大幅降低的问题，可有效缩短样品溶液进入检测膜的时长，且该试纸条重复性，抗干扰能力良好，展现出良好的应用前景。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了抗体荧光标记探针，该抗体荧光标记探针包括经活化处理后的荧光微球和与所述荧光微球偶联的抗体。
在一些实施方案中，所述抗体包括单抗或多抗；所述荧光微球上还结合有封闭剂；所述活化处理包括：采用MES溶液、NHS溶液和EDC溶液处理所述荧光微球。
在一些实施方案中，上述抗体荧光标记探针中所述抗体包括甲基苯丙胺抗体、吗啡抗体和氯胺酮抗体中的一种或多种；和/或，所述封闭剂包括牛血清白蛋白或脱脂奶粉。
本发明还提供了免疫荧光层析试纸条，包括一体垫、检测膜和吸水垫；一体垫包括样品区和探针标记区；检测膜的一端与探针标记区搭接，另一端与吸水垫搭接；检测膜上设有检测线和控制线；探针标记区包括上述抗体荧光标记探针；检测线包被有抗原偶联蛋白溶液；控制线包被有二抗溶液。
在一些实施方案中，检测线为一条或多条，多条检测线的任意相邻两条之间的间距为1～3mm，该距离为两条检测线相互靠近的两个边缘之间的距离(下同)。
在一些实施方案中，一体垫与距离其最近的所述检测线的距离为2～12mm，进一步优选2～4mm(该距离为一体垫靠近检测膜方向的末端至检测线靠近一体垫一侧边缘的距离)；控制线与距离其最近的检测线的距离为1～3mm(该距离为相互靠近的两个边缘之间的距离，下同)；探针标记区与检测膜的搭接长度为1～2mm；吸水垫与检测膜的搭接长度为5～15mm。
在一些实施方案中，所述抗原偶联蛋白溶液中的抗原包括甲基苯丙胺、吗啡或氯胺酮中的一种或多种；所述一种或多种抗原与所述一条或多条检测线对应，每条检测线上包被一种单一抗原对应的抗原偶联蛋白溶液。
在一些实施方案中，在所述抗原偶联蛋白溶液中，甲基苯丙胺偶联蛋白的浓度为0.1～1.0mg/mL；和/或，在所述抗原偶联蛋白溶液中，吗啡偶联蛋白的浓度为0.3～0.9mg/mL；和/或，在所述抗原偶联蛋白溶液中，氯胺酮偶联蛋白的浓度为0.5～1.25mg/mL。
在一些实施方案中，上述免疫荧光层析试纸条还包括底板，所述检测膜一面完全贴装于所述底板，所述一体垫和所述吸水垫的一端贴装于所述底板，另一端搭接于所述检测膜上。
在一些实施方案中，底板的长度为20～50mm，宽度为1～5.5mm。
优选地，底板的长度为20～40mm，宽度为1～4mm；所述一体垫与所述检测线的距离为2～4mm，该距离为一体垫靠近检测膜方向的末端至检测线靠近一体垫一侧边缘的距离。
优选地，底板的长度为30mm，宽度为2.5mm；所述一体垫与所述检测线的距离为2mm。
优选地，一体垫、吸水垫、检测膜的宽度与底板的宽度相同。
在一些实施方案中，检测线和控制线的距离为1.2mm。
在一些实施方案中，一体垫的长度为13mm。
在一些实施方案中，检测膜的长度为10～25mm。
优选地，检测膜的长度为20mm。
在一些实施方案中，吸水垫的长度为11～13mm。
优选地，吸水垫的长度为12mm。
在一些实施方案中，吸水垫与所述检测膜的搭接长度为7mm。
在一些实施方案中，样品区的长度为4～12mm。
在一些实施方案中，探针标记区的长度为1～4mm。
在一些实施方案中，抗体荧光标记探针包括甲基苯丙胺抗体荧光标记探针、吗啡抗体荧光标记探针、氯胺酮抗体荧光标记探针中的一种或多种。
在一些实施方案中，检测线包被毒品抗原。
在一些实施方案中，检测线上包被包括甲基苯丙胺偶联牛血清白蛋白、吗啡偶联牛血清白蛋白或氯胺酮偶联牛血清白蛋白中的一种或多种。
在一些实施方案中，控制线上包被有羊抗鼠IgG。
在一些实施方案中，上述免疫荧光层析试纸条中从所述一体垫至所述吸水垫方向，依次为甲基苯丙胺检测线、吗啡检测线和氯胺酮检测线。
在一些实施方案中，甲基苯丙胺检测线与一体垫的距离为2mm。
在一些实施方案中，吗啡检测线与所述一体垫的距离为3.2mm。
在一些实施方案中，氯胺酮检测线与一体垫的距离为4.4mm。
在一些实施方案中，相邻T线间距为1.0～3.0mm。
优选地，相邻T线间距为1.0～2.0mm。
本发明还提供了上述免疫荧光层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
S1、一体垫处理：将一体垫置于一体垫处理液中进行浸泡处理后，取出干燥得到预处理后的一体垫；
S2、抗体荧光标记探针溶液制备：将荧光微球加入活化缓冲液中，加入NHS溶液混匀，再加入EDC溶液混合，进行活化处理，然后加入抗体溶液，混匀，震荡反应，加入封闭液，进行封闭处理，固液分离取沉淀，沉淀用复溶液复溶，得到所述抗体荧光标记探针溶液；
S3、一体垫喷涂抗体荧光标记探针溶液：将所述抗体荧光标记探针溶液喷涂在步骤S1中所述的预处理后的一体垫上，干燥后得到喷涂后的一体垫；
S4、划膜：将检测膜、吸水垫与底板连接，分别用抗原偶联蛋白溶液、二抗溶液在检测膜的检测线和控制线上划膜，干燥后得到待组装件；
S5、将步骤S2中所述的喷涂后的一体垫组装到步骤S3中所述的待组装件上，得到所述免疫荧光层析试纸条。
其中，步骤S1和步骤S2的标号“S1”、“S2”仅用于区别两个操作步骤，并不代表实际操作顺序，也就是说，可以是先进行步骤S1的一体垫处理，然后再进行步骤S2的抗体荧光标记探针制备；也可以先进行步骤S2的抗体荧光标记探针制备，然后再进行步骤S1的一体垫处理。同时，由于步骤S4与与步骤S1、步骤S2、步骤S3没有物质上的牵连关系，因此，步骤S4可以与前述三个步骤同步进行，不强调先后顺序。
(一)有关步骤S1：
S1、一体垫处理：将一体垫置于一体垫处理液中进行浸泡处理后，取出干燥得到预处理后的一体垫。
在一些实施方案中，所述一体垫处理液包括缓冲液、蛋白和糖类。
在一些实施方案中，所述缓冲液包括：磷酸氢二钠和磷酸二氢钠。
在一些实施方案中，所述蛋白包括：牛血清白蛋白。
在一些实施方案中，所述糖类包括：蔗糖。
在一些实施方案中，所述一体垫处理液还包括无机盐和或表面活性剂。
在一些实施方案中，所述一体垫处理液包括：0～1.5％表面活性剂、0.5％～2.5％糖类和0.2％～1.5％蛋白。(％均指质量体积比，例如1.5％表示每100mL溶液中有1.5g该物质)
在一些实施方案中，所述表面活性剂的浓度可选为：0.1％、0.5％、1.0％、1.2％、1.5％。
在一些实施方案中，所述糖类的浓度可选为：0.2％、0.5％、0.7％、1.0％、1.2％、1.5％、2.0％、2.5％。
在一些实施方案中，所述蛋白的浓度可选为：0.2％、0.5％、0.7％、1.0％、1.2％、1.5％。
在一些实施方案中，所述表面活性剂包括吐温-20、表面活性剂S6或表面活性剂S9中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述无机盐包括氯化钠。
在一些实施方案中，所述一体垫处理液包括：磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、吐温-20、蔗糖和牛血清白蛋白。
在一些实施方案中，所述一体垫处理液包括：0～1.5％吐温-20、0.5％～2.5％蔗糖和0.2％～1.5％牛血清白蛋白。(％均指质量体积比，例如1.5％表示每100mL溶液中有1.5g该物质。)
在一些实施方案中，所述一体垫处理液包括：1.0％吐温-20、1.0％牛血清白蛋白和1.0％蔗糖。
在一些实施方案中，所述一体垫处理液包括：0.43％磷酸氢二钠，0.3％磷酸二氢钠，0.85％氯化钠，1.2％的吐温-20，2.0％的蔗糖，1.0％的牛血清白蛋白。
在一些实施方案中，步骤S1的处理时间为10min。
在一些实施方案中，步骤S1中所述干燥的温度为50℃，时间为2h。
(二)有关步骤S2：
抗体荧光标记探针溶液制备：将荧光微球加入活化缓冲液中，加入NHS溶液混匀，再加入EDC溶液混合，进行活化处理，然后加入抗体溶液，混匀，震荡反应，加入封闭液，进行封闭处理，离心取沉淀，沉淀用复溶液复溶，得到所述抗体荧光标记探针溶液。
在一些实施方案中，所述活化缓冲液为MES缓冲液(吗啉乙磺酸缓冲液)。
在一些实施方案中，所述封闭液为惰性蛋白或氨基小分子的Tris缓冲液，其中，Tris表示三(羟甲基)氨基甲烷。
在一些实施方案中，惰性蛋白可以是BSA、OVA、脱脂奶等，其中，BSA表示牛血清白蛋白，OVA表示鸡卵清白蛋白；氨基小分子可以是甘氨酸、乙醇胺等。
在一些实施方案中，所述封闭液为BSA-Tris缓冲液。
在一些实施方案中，所述荧光微球包括：稀土荧光微球和/或量子点荧光微球。
在一些实施方案中，所述荧光微球的粒径为100nm～200nm。
进一步优选所述荧光微球的粒径为200nm。
在一些实施方案中，所述MES缓冲液的浓度为0.01M，pH值为6.0。
在一些实施方案中，所述荧光微球与所述活化缓冲液的体积比为1:9。
在一些实施方案中，所述抗体溶液与所述活化缓冲液的体积比为500:450。
在一些实施方案中，所述EDC溶液与所述活化缓冲液的体积比为4:450。
在一些实施方案中，所述NHS溶液的制备方法包括以下步骤：取N-羟基琥珀酰酰亚胺与0.01M pH 6.0 MES缓冲液混合，获得5mg/mL的所述NHS溶液。
在一些实施方案中，所述NHS溶液与所述活化缓冲液的体积比为4.6:450。
在一些实施方案中，所述EDC溶液的制备方法包括以下步骤：取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与0.01M pH 6.0吗啉乙磺酸缓冲液配混合，获得5mg/mL的所述EDC溶液。
在一些实施方案中，加入所述EDC溶液混合的时间为10min，每30s振荡一次。
在一些实施方案中，所述抗体溶液的制备方法包括以下步骤：取抗体与偶联缓冲液混合，获得所述抗体溶液。
在一些实施方案中，所述抗体与偶联缓冲液的质量体积比为75μg:500μL。
在一些实施方案中，所述抗体包括甲基苯丙胺抗体、吗啡抗体或氯胺酮抗体中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述抗体包括鼠抗甲基苯丙胺抗体、鼠抗吗啡抗体或鼠抗氯胺酮抗体中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述抗体为甲基苯丙胺抗体时，所述甲基苯丙胺抗体与所述偶联缓冲液的质量体积比为1:10。
在一些实施方案中，所述抗体为吗啡抗体时，所述吗啡抗体与所述偶联缓冲液的质量体积比为1:10。
在一些实施方案中，所述抗体为氯胺酮抗体时，所述氯胺酮抗体与所述偶联缓冲液的质量体积比为7:50。
在一些实施方案中，所述偶联缓冲液为0.01M pH 9.6的碳酸盐溶液。
在一些实施方案中，所述偶联缓冲液的制备方法包括以下步骤：取碳酸钠和碳酸氢钠与水混合，获得所述偶联缓冲液。
在一些实施方案中，所述碳酸钠与水的质量体积比为0.318g:1000mL。
在一些实施方案中，所述碳酸氢钠与水的质量体积比为0.586g:1000mL。
在一些实施方案中，所述抗体溶液与活化处理后的荧光微球混合的时间为10min。
在一些实施方案中，所述封闭液的pH值为8.0。
在一些实施方案中，所述与封闭液混合的时间为3h。
在一些实施方案中，所述离心的转速为14000rpm，时间为10min。
在一些实施方案中，所述复溶液包括：三(羟甲基)氨基甲烷、牛血清白蛋白、蔗糖、海藻糖和聚乙二醇20000。
在一些实施方案中，所述复溶液包括：2.44g/L的三(羟甲基)氨基甲烷、10g/L的牛血清白蛋白、200g/L的蔗糖、50g/L的海藻糖和0.2g/L的聚乙二醇20000。
在一些实施方案中，所述复溶液与所述活化缓冲液的体积比为500:450。
在一些实施方案中，所述与EDC溶液混合后，还包括复溶的步骤；所述复溶的次数不少于2次，所述复溶采用所述活化缓冲液。
在一些实施方案中，所述离心的转速为14000rpm，时间为10～15min。
(三)有关步骤S3：
S3、一体垫喷涂抗体荧光标记探针溶液：将所述抗体荧光标记探针溶液喷涂在步骤S1中所述的预处理后的一体垫上，干燥后得到喷涂后的一体垫。
在一些实施方案中，上述步骤S3中所述喷涂的量为2μL/cm。
(四)有关步骤S4：
S4、划膜：将检测膜、吸水垫与底板连接，分别用抗原偶联蛋白溶液、二抗溶液在检测膜的检测线和控制线上划膜，干燥后得到待组装件。
在一些实施方案中，存在多条检测线时，每条检测线对应用一种包含单一抗原的所述抗原偶联蛋白溶液进行划膜。
在一些实施方案中，步骤S4中所述抗原偶联蛋白溶液中抗原包括甲基苯丙胺、吗啡或氯胺酮中的一种或多种；在所述抗原偶联蛋白溶液中，以偶联蛋白计，所述甲基苯丙胺偶联蛋白的浓度为0.1～1.0mg/mL；和/或，在所述抗原偶联蛋白溶液中，所述吗啡偶联蛋白的浓度为0.3～0.9mg/mL；和/或，在所述抗原偶联蛋白溶液中，所述氯胺酮偶联蛋白的浓度为0.5～1.25mg/mL。
在一些实施方案中，步骤S4中所述抗原偶联蛋白溶液中抗原包括甲基苯丙胺、吗啡或氯胺酮中的一种或多种；在所述抗原偶联蛋白溶液中，以偶联蛋白计，所述甲基苯丙胺偶联蛋白的浓度为0.8mg/mL；和/或，所述吗啡偶联蛋白的浓度为0.5mg/mL；和/或，所述氯胺酮偶联蛋白的浓度为0.8mg/mL。
在一些实施方案中，上述步骤S4中所述抗原偶联蛋白溶液的制备方法包括以下步骤：取抗原偶联蛋白与划膜液混合，获得所述抗原偶联蛋白溶液。
在一些实施方案中，上述制备方法中所述抗原偶联蛋白包括抗原偶联牛血清白蛋白。
在一些实施方案中，上述制备方法中所述划膜液包括：氯化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、无水甲醇和海藻糖。
在一些实施方案中，上述制备方法中所述划膜液包括：8.76g/L的氯化钠、0.32g/L的碳酸钠、0.6g/L的碳酸氢钠、50g/L的无水甲醇和50g/L的海藻糖。
在一些实施方案中，上述步骤S4中所述取抗原偶联蛋白溶液包被所述检测线中所述包被划膜速率为0.4μL/cm。
在一些实施方案中，二抗溶液为划膜液稀释二抗后形成的溶液；在一些优选的实施方案中，所述二抗为羊抗鼠免疫球蛋白G。
在一些实施方案中，上述步骤S4中所述二抗溶液的制备方法包括以下步骤：取所述划膜液将二抗稀释至0.1mg/mL，获得所述二抗溶液；所述二抗为羊抗鼠免疫球蛋白G。
在一些实施方案中，上述步骤S4中所述二抗溶液包被所述控制线中所述包被的速率为0.4μL/cm。
在一些实施方案中，上述步骤S4中所述二抗溶液包被所述控制线后，还包括干燥的步骤；所述干燥的温度为50℃，时间为2h。
在一些实施方案中，所述检测膜包括苏州伊索伦斯生物技术有限公司生产的伊索伦斯NC膜CN140、颇尔中国生命科学部生产的颇尔NC膜Pall90、德国赛多利斯生物科技公司生产的赛多利斯NC膜CN140或润和生物医药科技(汕头)有限公司生产的伊能NC膜中的一种或多种。
本发明还提供了一种微型免疫荧光试剂卡，其包括上述的免疫荧光层析试纸条和/或上述的制备方法获得的免疫荧光层析试纸条。
本发明还提供了上述微型免疫荧光试剂卡在毒品检测中的应用。
本发明还提供了上述免疫荧光层析试纸条和/或上述制备方法获得的免疫荧光层析试纸条的使用方法，包括：取样品置于所述样品区，基于所述检测线和所述控制线的显色结果，确定所述样品是否含待测物，进一步地，可以确定样品中待测物的含量。
本发明提供了抗体荧光标记探针、免疫荧光层析试纸条、其制备方法和微型免疫荧光试剂卡。本发明的有益效果包括：
通过筛选高性能荧光微球，优化抗体荧光标记探针的制备方法，显著提高了免疫层析检测技术的灵敏度；
(2)提供的免疫荧光层析试纸条则避免了现有试剂卡中过多的搭接结构导致样品溶液的迁移速度大幅降低的问题，可有效缩短样品溶液进入检测膜的时长，且该试纸条重复性，抗干扰能力良好，展现出良好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1表示免疫层析试纸条的基本结构；
图2表示现有技术中的试纸条结构图；
图3表示本发明免疫荧光层析试纸条的示意图；
图4表示一体垫对不同规格试纸条层析时间的影响；
图5表示不同因素水平对层析时间的影响；
图6表示不同因素水平对检测限的影响；
图7表示不同厂家NC膜的层析时间比较；
图8表示不同厂家一体垫对应层析时间与T线信号；
图9表示不同表面活性剂对T线信号值的影响；
图10表示BSA用量与T线信号值的关系；
图11表示蔗糖用量与T线信号值的关系；
图12表示不同荧光微球T/C值随60℃处理时间关系；其中：①表示100nm量子点荧光微球、②表示100nm稀土荧光微球、③表示200nm量子点荧光微球、④表示200nm稀土荧光微球、⑤表示300nm量子点荧光微球、⑥表示300nm稀土荧光微球；
图13表示不同荧光微球T线信号值随60℃处理时间关系；其中：①表示100nm量子点荧光微球，②表示100nm稀土荧光微球，③表示200nm量子点荧光微球，④表示200nm稀土荧光微球，⑤表示300nm量子点荧光微球，⑥表示300nm稀土荧光微球；
图14表示不同标记方案的T/C值随60℃处理时间关系；
图15表示不同标记方案的T/C值随60℃处理时间关系；
图16表示不同甲基苯丙胺抗体标记量对应梯度标准品的抑制率；
图17表示不同吗啡抗体标记量对应梯度标准品的抑制率；
图18表示不同氯胺酮抗体标记量对应梯度标准品的抑制率；
图19表示不同划膜顺序对MET、MOP抑制率的影响；
图20表示MET标准品系列浓度溶液标准曲线；
图21表示MET标准品系列浓度溶液点样实物图；其中：从左至右依次为MET的浓度为0ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL；
图22表示MOP标准品系列浓度溶液标准曲线；
图23表示MOP标准品系列浓度溶液点样实物图；从左至右依次为MOP的浓度为0ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL；
图24表示KET标准品系列浓度溶液标准曲线；
图25表示KET标准品系列浓度溶液点样实物图；从左至右依次为KET的浓度为0ng/mL、10ng/mL、18ng/mL、25ng/mL、38ng/mL、50ng/mL、65ng/mL。
具体实施方式
本发明公开了抗体荧光标记探针、免疫荧光层析试纸条及其制备方法和应用。
应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。
本发明提供了一种一分钟快速检测甲基苯丙胺、吗啡和氯胺酮的免疫荧光层析试纸条，包括：一体垫、检测膜、吸水垫、底板；
检测膜铺设在底板上；
一体垫的一端与底板连接，另一端搭设在检测膜的第一端上；
吸水垫的一端与底板连接，另一端搭设在检测膜的第二端上；
所述检测膜上设有检测线和控制线；
所述检测线设置在靠近一体垫的一端，所述的控制线设置在靠近吸水垫的一端；
所述检测线包括甲基苯丙胺检测线、吗啡检测线和氯胺酮检测线。
进一步地，所述免疫荧光层析试纸条的长度为30mm(可选的长度范围在20-40mm)；所述免疫荧光层析试纸条的宽度为2.5mm(可选的宽度范围在1-4mm)；所述检测线距离一体垫与检测膜结合处2.0mm(距离一体垫与检测膜结合处最近的检测线可选的距离范围为2-4mm)。
进一步地，所述控制线距离检测线1.2mm(控制线距其最近的检测线的可选距离范围为1-3mm)。
进一步地，一体垫的长度为13mm(一体垫的长度可选为8-13mm)。
进一步地，一体垫与检测膜衔接处的长度为1-2mm。
进一步地，检测膜的长度为20mm(检测膜的长度可选范围为10-25mm)。
进一步地，吸水垫的长度为12mm(吸水垫的长度可选范围为11-13mm)。
进一步地，吸水垫与检测膜衔接处的长度为7mm(吸水垫与检测膜衔接处的可选长度范围为5-15mm)。
进一步地，所述一体垫如图3所示包括样品区和探针标记区。
进一步地，所述样品区的长度为9mm(样品区长度可选4-12mm)。
进一步地，所述探针标记区的长度为4mm(探针标记区长度可选1-4mm)。
进一步地，所述探针标记区上包被有相应的毒品抗体荧光标记探针，即甲基苯丙胺抗体荧光标记探针、吗啡抗体荧光标记探针、氯胺酮抗体荧光标记探针。
进一步优选地，所述探针标记区覆盖一体垫与检测膜的衔接处。
进一步地，所述甲基苯丙胺检测线上包被有甲基苯丙胺偶联牛血清白蛋白；所述吗啡检测线上包被有吗啡偶联牛血清白蛋白；所述氯胺酮检测线上包被有氯胺酮偶联牛血清白蛋白；所述控制线上包被有羊抗鼠IgG。
进一步地，从一体垫至吸水垫的方向上看，所述甲基苯丙胺检测线、吗啡检测线和氯胺酮检测线依次排列。
进一步优选地，所述甲基苯丙胺检测线、吗啡检测线和氯胺酮检测线离一体垫的距离分别为2mm、3.2mm、4.4mm。
T线(检测线)位置对相应项目的灵敏度也存在影响，T线位置越高(距离一体垫越远)，则检测限越低，初步分析，原因是T线越高时，待测溶液中相应抗原有更多时间与抗体探针反应，因此更加灵敏。因此需要对甲基苯丙胺检测线、吗啡检测线和氯胺酮检测线进行合适的排序，以获得最佳的检测效果。甲基苯丙胺、吗啡对低浓度标准品的响应更灵敏，而氯胺酮则性能较差，因此在抗原包被顺序中，氯胺酮抗原需要被放在最后端即设计在T线最高位置(距离一体垫最远)，而甲基苯丙胺、吗啡的先后顺序通过制相应卡比较后，发现由于吗啡检测线位置靠前时，其对应的抑制率较吗啡检测线位置靠后要低许多，因此吗啡抗原不适合包被到最前端。所以从一体垫至吸水垫的方向上看，所述甲基苯丙胺检测线、吗啡检测线和氯胺酮检测线依次排列。
本发明还提供了一种一分钟快速检测甲基苯丙胺、吗啡和氯胺酮的免疫荧光层析试纸条的制备方法，包括如下步骤：
S1、一体垫处理：将一体垫置于一体垫处理液中进行浸泡处理后，取出烘干得到预处理后的一体垫；
S2、抗体荧光标记探针溶液制备：将荧光微球加入活化缓冲液中，加入NHS溶液混匀，再加入EDC溶液混合，进行活化处理，然后加入抗体溶液，混匀，震荡反应，加入封闭液，进行封闭处理，固液分离取沉淀，沉淀用复溶液复溶，得到所述抗体荧光标记探针溶液；
S3、一体垫喷涂抗体荧光标记探针溶液：将所述抗体荧光标记探针溶液喷涂在步骤S1中所述的预处理后的一体垫上，烘干，得到喷涂后的一体垫；
S4、划膜：将检测膜、吸水垫与底板连接，分别用抗原偶联蛋白溶液、二抗溶液在检测膜的检测线和控制线上划膜，烘干，得到待组装件；
S5、将步骤S2中所述的喷涂后的一体垫组装到步骤S3中所述的待组装件上，得到所述免疫荧光层析试纸条。
不同于现有技术中的试纸条的制备过程需要分别对样品垫和结合垫采用不同的浸泡液进行处理。由于本发明的试纸条是将样品区与探针标记区一体化设置于一体垫上，结构相对现有技术发生较大变化，因此，需要根据该新型的结构重新试验得到合适的一体垫处理液组成及浓度，以使一体垫既具备负载抗体荧光标记探针并保证其活性，又具备有效过滤待测样品中杂质，还具备及时复溶抗体荧光标记探针并释放的三大功能。
经过一系列试验，本发明的发明人得到的一体垫处理液包括缓冲液、糖类和蛋白，在一些更优选的实施例中，还包括表面活性剂和无机盐。
在优选的一些实施例中，一体垫处理液包括：0.43％磷酸氢二钠，0.3％磷酸二氢钠，0.85％氯化钠，1.2％的吐温-20，2.0％的蔗糖，1.0％的牛血清白蛋白。
抗体荧光标记探针溶液的制备，包括：
将荧光微球加入活化缓冲液中，加入NHS溶液混匀，再加入EDC溶液混合，进行活化处理，然后加入抗体溶液，混匀，震荡反应，加入封闭液，进行封闭处理，离心取沉淀，沉淀用复溶液复溶，得到所述抗体荧光标记探针溶液。
其中，荧光微球与活化缓冲液的体积比为1:9。
抗体溶液的制备，包括：将抗体加入偶联缓冲液中，混合均匀，得到所述抗体溶液。
偶联缓冲液的制备，包括：将碳酸钠、碳酸氢钠加入水中，混合均匀，得到所述偶联缓冲液。
碳酸钠与水的质量体积比为0.318g:1000mL；碳酸氢钠与水的质量体积比为0.586g:1000mL。
所述封闭液为BSA-Tris缓冲液，pH为8.0，封闭处理3h。
所述离心的速率为14000rpm，离心的时间为10min。
复溶液包括：2.44g/L的三(羟甲基)氨基甲烷，10g/L的牛血清白蛋白，200g/L的蔗糖，50g/L的海藻糖，0.2g/L的聚乙二醇20000。
进一步地，所述抗体荧光标记探针溶液喷涂量为2μL/cm。
进一步地，步骤S3中的烘干的温度为50℃，烘干的时间为2小时。
进一步地，所述抗原偶联蛋白溶液的制备，包括：将抗原偶联蛋白加入划膜液中，混合均匀，得到抗原偶联蛋白溶液。
进一步地，所述抗原偶联蛋白为抗原偶联牛血清白蛋白。所述抗原包括甲基苯丙胺、吗啡、氯胺酮。
进一步地，所述划膜液包括：8.76g/L的氯化钠、0.32g/L的碳酸钠、0.6g/L的碳酸氢钠、50g/L的无水甲醇、50g/L的海藻糖。
进一步优选地，当所述抗原为甲基苯丙胺时，在所述抗原偶联蛋白溶液中，抗原偶联蛋白的浓度为0.8mg/mL。当所述抗原为吗啡时，在所述抗原偶联蛋白溶液中，抗原偶联蛋白的浓度为0.5mg/mL。当所述抗原为氯胺酮时，在所述抗原偶联蛋白溶液中，抗原偶联蛋白的浓度为0.8mg/mL。
二抗溶液的制备，包括：将二抗使用划膜液稀释至0.1mg/mL，得到所述二抗溶液。所述二抗为羊抗鼠免疫球蛋白G。
本发明实施例1～实施例9、验证例1～验证例11和效果例中，溶液的配制如下：
甲基苯丙胺、吗啡系列标准溶液的配制：取适量1mg/mL的MET/MOP标准品溶液，用人工唾液稀释，配制成0、5、10、20、30、40、50ng/mL的标准品溶液。
氯胺酮系列标准溶液的配制：取适量1mg/mL的KET标准品溶液，用人工唾液稀释，配置成0、25、50、60、70、80、90、100ng/mL的KET标准品溶液。
0.2M碳酸钾溶液的配制：准确称取27.6g碳酸钾，取适量超纯水溶解，最终定容至1000mL。
10％氯化钠溶液的配制：准确称取10.0g氯化钠，取适量超纯水溶解，最终定容至100mL。
0.01M pH 6.0吗啉乙磺酸缓冲液的配制：准确称取0.390g吗啉乙磺酸(MES),取160mL超纯水溶解后，使用1.0M氢氧化钠溶液调pH至6.0，最后定容至200mL，4℃保存。
0.01M pH 9.0碳酸盐缓冲液的配制：准确称取0.318g碳酸钠，0.586g碳酸氢钠，取适量超纯水溶解，再用超纯水定容至1000mL，4℃保存。
NHS溶液的配制：称取约3mgN-羟基琥珀酰酰亚胺，使用0.01M pH 6.0吗啉乙磺酸缓冲液配制成5mg/mL的工作液，现配现用，不可久置。
EDC盐酸盐溶液的配制：称取约3mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，使用0.01M pH 6.0吗啉乙磺酸缓冲液配制成5mg/mL的工作液，现配现用，不可久置。
0.05M pH 8.0 Tris缓冲液的配制：准确称取6.057g三(羟甲基)氨基甲烷，取800mL超纯水溶解，用1.0M盐酸调pH至8.0，4℃保存。
10％BSA-Tris溶液的配制：准确称取1.0g牛血清白蛋白，取适量0.05M pH 8.0Tris缓冲液溶解，最终定容至10mL。所用原料及试剂均可由市场购得。本发明实施例采用的荧光检测仪器来源于申请人自售的手持式智能终端毒品检测仪，产品型号为：BH101Go。
化学物质/材料及其英文缩写：
羟基琥珀酰酰亚胺——NHS；
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺——EDC；
吗啉乙磺酸——MES；
三(羟甲基)氨基甲烷——Tris；
牛血清白蛋白——BSA；
硝酸纤维素膜——NC；
甲基苯丙胺——MET；
吗啡——MOP；
氯胺酮——KET。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1结合垫去留的验证实验
传统免疫层析试纸条常将抗体标记探针喷涂在结合垫上，在其后端覆盖样品垫，同时试纸条上T、C线距离结合垫端较远(5-10mm)，试纸条的尺寸较大(宽度3-4mm，长度50-65mm)，本实施例以这些因素作为考察量，以层析时间作为主要衡量标准，通过设计单因素试验和正交试验，筛选出最佳结构参数，作为免疫层析的快检试纸条的方案。
单因素试验：针对结合垫去留这一调整进行实验，将抗体标记探针直接喷涂在一体垫上制成试纸条(该试纸条除了无结合垫，且抗体标记探针喷涂在一体垫上这两点与现有试纸条不同，其余均相同)与传统方案试纸条对比层析时间。本发明的试纸条选用四种规格，卡Ⅰ规格为长度30.0mm，宽度2.5mm，T线位置2.0mm；卡Ⅱ规格为长度40.0mm，宽度4.0mm，T线位置7.0mm；卡Ⅲ规格为长度50.0mm，宽度5.5mm，T线位置12.0mm；卡Ⅳ规格为长度25.0mm，宽度3.0mm，T线位置3.5mm；卡Ⅳ规格为长度25.0mm，宽度3.0mm，T线位置3.5mm；对比例取对应尺寸，实施例和对比例区别在于有无结合垫。
实验结果如图4和表1所示，四种不同规格的试纸条去除结合垫前后进行检测所需的层析时间(信号稳定时间)。四种规格试纸条的检测结果表现出一致性，去除结合垫后，T/C线信号稳定所需时间明显减少，说明这一调整，有利于缩短免疫层析检测时间，提高检测效率。故后续试纸条均选择去除结合垫，将抗体标记探针喷涂到样品一体垫上。
初步分析主要原因如下，现有传统的试纸条是将标记物喷涂到结合垫上时，样品垫与结合垫存在叠合部分，检测液在两者交界处流动较全程在一体垫上慢，因此标记物在结合垫复溶释放要慢于标记物喷涂于一体垫上直接释放，导致T/C线信号稳定所需时间更长。
表1
实施例2试纸条长度、宽度和T线位置对检测结果的影响
正交试验：以试纸条长度、宽度、T线位置(距一体垫与检测膜结合处的距离)三项作为考察因素，各设置三个水平，制成相应试纸条，本验证例用的试纸条除了尺寸与现有常规试纸条不同以外，其余都相同，比较其所需层析时间及检测限，此处检测限指使T线完全消线最低标准品浓度。正交试验结果如表2所示。
表2正交试验结果数据
对于层析时间，结合表3及图5数据，可以直观地比较出此次试验的主次因素，并通过对比得到最优水平的搭配。RB≈RA＞RC，所以A、B是影响试验的主要因素，C为次要因素。另外，各因素均在最低水平时取得最小层析时间，故最佳搭配为A1B1C1，此方案所需层析时间最短。
表3正交试验结果极差分析-层析时间
注：表中的T表示所有试验次数的数据之和，Ti表示各因素的第i水平所做试验的数据之和，是Ti的平均数，即各因素的第i水平所做试验的数据的平均数，R表示各因素Ti的最大值和最小值之差，即Ti的极差。
对于检测限，结合表4及图6数据，RC＞RA＞RB，所以C为影响检测限的主要因素，B、C为次要因素。另外，各因素均在最高水平时取得最小检测限，故最佳搭配水平为A3B3C3。
表4正交试验结果极差分析-检测限
综合层析时间与检测限的极差分析来看，随着试纸条长度、试纸条宽度、T线、C线及其相互间距离的缩小，层析时间明显减少，可缩短至60秒以内，甚至可达48秒，相比常规试纸条提升非常大，十分符合毒驾路检背景需求，而检测限虽然有所下滑，但是下降幅度较小，在A1B1C1方案下检测限约60ppb，仍满足公安部门发行公共安全行业标准GA1333-2017所规定的毒品初步检测阈值，综上，选用A1B1C1方案，即试纸条长30mm，试纸条宽2.5mm，T线位置2mm作为试纸条的参数，后续在此基础上进行物料筛选和一体垫处理液筛选。
实施例3检测膜的筛选
检测膜(硝酸纤维素膜，NC膜)的孔径大小、孔隙率决定了水性样品在膜上的流速，进而决定了控制时间，而这些又与NC膜生产厂家息息相关。本小节选用市面常用NC膜厂家四例，参照实施例1的优化结果制备微型免疫荧光试剂卡微型荧光试剂卡，进行NC膜性能比较测试。对NC膜按照厂家依次编号，①颇尔NC膜Pall90，②伊索伦斯NC膜CN140，③赛多利斯NC膜CN140，④伊能NC膜YN100B。
不同厂家NC膜层析时间如图7和表5所示。层析时间：膜④＜膜①＜膜③＜膜②，其中膜④、膜①层析时间均在1分钟之内，但是膜①存在控制线线条缺损问题，故选用膜④即伊能NC膜YN100B作为免疫荧光层析试纸条微型免疫层析检测系统用膜。
表5
| 膜编号 | ① | ② | ③ | ④ |
| 层析时间(s) | 55 | 74 | 68 | 49 |
实施例4一体垫的筛选
由于本实施例的免疫荧光层析试纸条去除了常规结合垫，抗体荧光标记探针需要直接喷涂在一体垫上，一体垫的材质、参数直接关系到抗体荧光标记探针的复溶释放，进而影响最终层析时间与检测信号，试纸条参数选用实施例2的实验结果。本实施例选用市面常用的四类材料，依次编号为ⅠSB-08、ⅡGL0194、Ⅲ8980、Ⅳ8964。
实验结果如图8和表6所示，四类一体垫的层析时间基本都在60s左右，但是其T线信号则有很大差异(用手持式智能终端BH101Go检测)，这与抗体荧光标记探针在垫上复溶释放情况有关，综合选择一体垫Ⅰ即SB-08，已达到最短层析时间及最佳信号值。
表6
| 一体垫型号 | Ⅰ | Ⅱ | Ⅲ | Ⅳ |
| 层析时间(s) | 50 | 56 | 63 | 58 |
| T线信号值 | 35 | 27.5 | 14 | 22.5 |
实施例5一体垫处理液配方筛选
在本实施例的免疫荧光层析试纸条中，一体垫主要功能有①负载、保护抗体荧光标记探针，确保活性；②运输样品溶液，并过滤去除检测样品中的杂质等干扰因素；③在接收样品溶液后及时复溶抗体荧光标记探针并释放，完成免疫层析。因此需要对一体垫进行试剂浸泡处理，以改善其性能。一体垫处理液的组成可包括缓冲液、表面活性剂、无机盐、蛋白和糖类等，它们各自对一体垫起着不同作用。
其中缓冲液选取0.43％的磷酸氢二钠，0.3％的磷酸二氢钠；无机盐选用0.85％的氯化钠(％均指质量体积比，例如1.5％表示每100mL溶液中有1.5g该物质)。
(1)表面活性剂筛选
抗体荧光标记探针被施加到一体垫后，依靠静电吸附和疏水作用结合到一体垫上，而表面活性剂可以干扰疏水作用，从而有效影响抗体荧光标记探针的释放。本实施例选用3种常用的表面活性剂：吐温-20、表面活性剂S6和表面活性剂S9，参照经典工作浓度设置0.1％，0.5％，1.0％，1.2％，1.5％五个梯度，考察对T线信号值的影响。
详细结果如图9所示，随着表面活性剂浓度逐步升高，T线信号值逐步上升，并在到达极大值后出现下滑。说明在表面活性剂作用下，抗体荧光标记探针的复溶释放得到促进，而表面活性剂用量达到饱和后，对信号提升再无帮助，反而会导致上样过快，影响抗体荧光标记探针与抗原结合，进而影响信号值。最终选择吐温-20，用量1％作为最佳方案。
(2)牛血清白蛋白用量筛选
牛血清白蛋白(BSA)作为常见蛋白中非特异性吸附最小的材料，在免疫层析检测中常用作封闭试剂。使用BSA后，可显著降低非特异性背景信号，同时BSA用量不可过多，以免一体垫疏水性过高，影响抗体荧光标记探针的复溶释放。本实施例参照BSA经典工作浓度，设置0.2％，0.5％，0.7％，1.0％，1.2％，1.5％六个梯度进行探究，具体结果如图10所示，BSA用量在1.0％时，T线信号值取得极大值，故BSA用量选为1.0％。
(3)蔗糖用量筛选
目前没有详细研究阐明糖类对于抗体荧光标记探针在垫上的影响机理。一般认为，添加糖类有以下几点作用，①为蛋白提供空间支持，保护其结构；②降低NC膜疏水性；③遇样品后溶解导致液体粘稠，使爬膜更慢反应更充分。本实施例参照蔗糖经典工作浓度，设置0.5％，0.7％，1.0％，1.5％，2.0％，2.5％六个浓度梯度。详细实验结果见图11，在蔗糖用量为1.0％时，T线信号值取得极大值，故蔗糖用量选用1.0％。
验证例1
实施例1～实施例5筛选确立了免疫荧光层析试纸条的相应结构参数、物料选用、工艺。主要研究结果如下：
(1)通过设计不同规格试纸条探究结合垫对层析时间的影响，试验结果表明，去除结合垫后，层析时间明显缩短，可显著提高检测效率，故免疫荧光层析试纸条选择去除结合垫的一体垫。
(2)以试纸条长度，试纸条宽度，T线位置作为考察因素，以层析时间和检测限作为性能指标，设计正交试验筛选最佳结构参数，试验结果表明，层析时间与试纸条长度，试纸条宽度，T线位置大小呈正相关，在各因素取最小水平时，层析时间可缩短至60秒以内，相比常规试纸条提升非常大，符合毒驾路检背景需求，而检测限虽然基本呈负相关，但在A1B1C1方案下检测限约60ppb，仍满足公安部门规定的毒品检测阈值。故选用A1B1C1方案，即试纸条长30mm，试纸条宽2.5mm，T线位置2mm作为免疫荧光层析试纸条结构参数。
(3)对检测膜(硝酸纤维素膜，NC膜)、一体垫、表面活性剂、牛血清白蛋白用量、蔗糖用量进行详细筛选，最终确定伊能NC膜YN100B，一体垫SB-08，表面活性剂吐温-20用量1.0％，牛血清白蛋白用量1.0％，蔗糖用量1.0％为目前最佳方案。
实施例6荧光微球的筛选
选用不同厂家规格荧光微球，参照厂家推荐标记方案，每50μL标记吗啡抗体50μg制成吗啡抗体荧光标记探针，用同一参数喷涂划膜，制卡检测，将试纸条使用铝箔袋密封，装入60℃烘箱，分别于第0，3，7，10，15天取出，点空白人工唾液进行检测，使用荧光检测仪器读取T/C比，记录数据，用于考察荧光微球信号稳定性。
实施例7甲基苯丙胺、吗啡和氯胺酮抗体荧光标记探针的制备
(1)抗体荧光标记方案优化
采用三种标记方案制备抗体荧光标记方案，通过比较不同方案抗体荧光标记探针所制备试纸条的稳定性，以确定最佳方案。为简化方案描述，记0.01M pH 6.0 MES缓冲液为活化缓冲液，0.01M pH 9.6碳酸盐缓冲液为偶联缓冲液，10％BSA的0.05M pH 8.0 Tris缓冲液为封闭液。
方案Ⅰ：取荧光微球50μL，分散于450μL活化缓冲液中混匀；先加入4.6μL NHS，混匀，再加入4μL EDC，立即混匀，室温(27.5℃)活化10min(计时，每30s间歇震荡)；14000rpm离心15min，去上清，沉淀用500μL活化缓冲液洗涤一次，离心去上清，沉淀用500μL活化缓冲液复溶分散；取抗体75μg，分散在500μL偶联缓冲液中，将抗体溶液一次性全部加入至活化的荧光微球溶液中，立即混匀，室温(27.5℃)摇震反应3h；加封闭液100μL，继续室温(27.5℃)反应1.5h；14000rpm离心10min，去上清后，沉淀用复溶液复溶，定容至500μL，4℃保存。
方案Ⅱ：取荧光微球50μL，分散于450μL活化缓冲液中混匀；加入4.6μL NHS混匀，再加入4μL EDC，立即混匀，室温(27.5℃)活化10min(计时，每30s间歇震荡)；在荧光微球活化期间，取抗体75μg和33μg BSA，分散在500μL偶联缓冲液中，待活化结束，将抗体BSA混合溶液一次性全部加入至荧光微球溶液中，立即混匀，室温(27.5℃)摇震反应3h；加封闭液100μL，室温(27.5℃)反应2h；14000rpm离心10min，去上清后，沉淀用复溶液复溶，定容至500μL，4℃保存。
方案Ⅲ：取荧光微球50μL，分散于450μL活化缓冲液中混匀；加入4.6μL NHS混匀，再加入4μL EDC，立即混匀，室温(27.5℃)活化10min(计时，每30s间歇震荡)；在荧光微球活化期间，取抗体75μg分散在500μL偶联缓冲液中，待活化结束，将抗体溶液一次性全部加入至荧光微球溶液中，立即混匀，室温(27.5℃)摇震反应10min；加封闭液50μL，室温(27.5℃)反应3h；14000rpm离心10min，去上清后，沉淀用复溶液复溶，定容至500μL，4℃保存。
(2)抗体最佳标记量的确定
由于抗体标记量将直接影响试纸条相应项目的检测灵敏度，因此在确定抗体荧光标记方案后，需对甲基苯丙胺、吗啡和氯胺酮抗体标记用量进行梯度试验探究，选用最佳标记方案，甲基苯丙胺、吗啡和氯胺酮抗体均分别选用20、30、40、50、60、70、80μg七个梯度进行抗体荧光标记探针制备，并制卡测试，以确定各项抗体最佳标记用量。
实施例8甲基苯丙胺、吗啡和氯胺酮抗原最佳划膜浓度的确定
(1)甲基苯丙胺抗原最佳划膜浓度的确定
将甲基苯丙胺偶联牛血清白蛋白(MET-BSA)用划膜液稀释成0.2、0.5、0.8、1.0mg/mL，将羊抗鼠免疫球蛋白G(GAM)用划膜液稀释成0.1mg/mL，取三张已经贴好NC膜YN-100B及吸水纸的PVC底板，使用BioDot喷金划膜一体机将不同浓度的MET-BSA溶液依次均匀包被到三张PVC底板的相应T线(距NC膜2.0mm)处，再将GAM溶液均匀包被到三张PVC底板的相应C线(距NC膜5.8mm)处，随后置于烘箱50℃烘干2小时，试纸条切成2.5mm宽，即可点样测试。
(2)吗啡抗原最佳划膜浓度的确定
与步骤(1)确定甲基苯丙胺抗原最佳划膜浓度的方法相同，不同之处是，吗啡偶联牛血清白蛋白(MOP-BSA)用划膜液稀释成0.3、0.5、0.7、0.9mg/mL，T线位置(距NC膜3.2mm)。
(3)氯胺酮抗原最佳划膜浓度的确定
与步骤(1)确定甲基苯丙胺抗原最佳划膜浓度的方法相同，不同之处是，氯胺酮偶联牛血清白蛋白(KET-BSA)用划膜液稀释成液稀释成0.5、0.75、1.0、1.25mg/mL，T线位置(距NC膜4.6mm)。
实施例9免疫荧光层析试纸条的制备与检测方法
试纸条的制备：
(1)用量筒取70mL一体垫处理液，对玻璃纤维素膜SB08进行浸泡处理，期间不时翻面，10分钟后将玻璃纤维素膜SB08转移至50℃烘箱烘干2小时，即得一体垫。
(2)取30mm×300mm规格PVC底板，揭去表面覆盖的保护膜，贴上规格为20mm×300mm的NC膜YN-100B(构成检测膜)，在上端贴12mm×300mm的吸水纸并覆盖NC膜约1.5mm(构成吸水垫)。
(3)参照实施例8的实验结果，用划膜液将MET-BSA、MOP-BSA、KET-BSA稀释至最适浓度，羊抗鼠免疫球蛋白G用划膜液稀释至0.1mg/mL，使用BioDot喷金划膜一体机在NC膜上划线，C线与各项T线位置与实施例8一致。划膜速率设置为0.4μL/cm，随后将其放入50℃烘箱烘干2小时。
(4)将烘干后的一体垫用微电脑自动斩切机裁成13mm×300mm的长条，随后组装到烘干的划膜PVC底板上并覆盖NC膜约1.5mm，用微电脑自动斩切机将它裁成所需宽度，即得免疫荧光层析试纸条(或称“试纸条”)。
微型免疫荧光试剂卡的制备及检测：
将上述免疫荧光层析试纸条，置于试剂卡的下卡壳中，组装形成微型免疫荧光试剂卡(或称“试剂卡”)。
检测方法：取待检测样本溶液20μL，滴加到试剂卡的加样孔处，在室温下水平放置层析1min，随后将试剂卡插入荧光检测装置，读取T、C线信号值及T/C值。
实施例10性能评价
(1)曲线方程与范围
选用人工唾液作为标曲确定基质，取用甲基苯丙胺、吗啡和氯胺酮系列标准溶液系列梯度标准品浓度溶液，按实施例9的检测方法进行检测操作，重复测定三组取其平均值，记录毒品标准品各浓度溶液对应的T/C值，以相应系列梯度标准品浓度(ppb，即ng/mL)为横坐标，该浓度对应的T/C值作为纵坐标，采用Origin 2022进行非线性曲线拟合(四参数拟合)，得到相应的拟合回归方程以及相关系数r。
(2)重复性试验
取一定浓度MET、MOP、KET标准品溶液，每项使用微型免疫荧光试剂卡重复检测十次，记录相应T/C值，计算其平均值及相对标准偏差。
(3)检出限
计算重复性试验中空白对照人工唾液重复检测十次所得T/C值的平均值(M)及标准差(SD)，算出M-2*SD值，将其带入曲线方程，所得对应浓度值即为该项检出限。
(4)加标回收率
取不同浓度的三项毒品标准品溶液加入到一定已知浓度的对应毒品标准品溶液中，按照实施例9的检测方法进行检测操作，重复测定三组取其平均值，将其带入曲线方程算出实测浓度，计算实测浓度与理论浓度的百分比，计算加标回收率。
(5)抗干扰试验
参照GA/T1456-2017标准中推荐的抗干扰试验药品推荐目录，配制50ng/mL的碳酸氢钠溶液，常见药品1000ng/mL的硝苯地平、盐酸金刚烷胺、布洛芬、青霉素、阿莫西林、维生素B2，非检测目标毒品1000ng/mL的芬太尼、甲卡西酮以及4,5-亚甲基二氧基苯丙胺溶液，每项使用微型免疫荧光试剂卡重复检测三次，记录相应T、C线信号值。
验证例2甲基苯丙胺、吗啡和氯胺酮抗体荧光标记探针的制备
(1)荧光微球筛选
实施例6中选用6种不同规格微球进行荧光性能比较，依次编号为①
100nm量子点荧光微球，②100nm稀土荧光微球，③200nm量子点荧光微球，④200nm稀土荧光微球，⑤300nm量子点荧光微球，⑥300nm稀土荧光微球，分别制备相应吗啡抗体荧光标记探针并制备试纸条后，试纸条在60℃条件下加速破坏0，3，7，10，15天取出，测得对应T线信号值与T/C值数据随时间变化如12和图13所示，微球①、②的T/C值与T线信号值随时间推移波动十分大，即试纸条性能不稳定，故不适合作免疫层析应用，而微球③、④、⑤、⑥的T/C值在15天60℃老化试验下数值波动较小，同时T线信号值在7天后也基本稳定，展现出良好应用前景，其中微球③200nm量子点荧光微球最佳。因此，荧光微球尺寸优选在200～300nm，进一步优选尺寸是200nm。验证例3抗体荧光标记方案优化
选定实施例6中200nm量子点荧光微球作为载体，进一步对原有方案进行优化，以探究最佳抗体探针标记方案。按照实施例6分别制备三种方案对应吗啡抗体荧光探针并制备试纸条后，试纸条在60℃条件下分别处理0，3，7，10，15天取出所测得T/C值数据及T线信号值数据如图14和图15所示，方案Ⅲ的T/C值在15天60℃老化试验下仅有小幅度波动，同时T线信号值在7天后也基本稳定，即选用方案Ⅲ作为抗体荧光标记探针最终方案。
验证例4抗体最佳标记量的确定
(1)甲基苯丙胺抗体最佳标记量的确定
依次使用20，30，40，50，60，70，80μg甲基苯丙胺抗体按照实施例7中的方案Ⅲ进行甲基苯丙胺抗体荧光标记探针的制备，并制卡滴加梯度浓度标准品比较其性能。20，30，40μg标记量方案所制卡由于抗体用量较少，导致点空白人工唾液时T线信号仍过低，出于试纸条稳定性考虑弃去不用，选用50，60，70，80μg抗体方案进行比较，为更直观地比较各方案性能差异，此处引入抑制率概念，抑制率可直接反映不同方案下试剂卡T/C在测试某浓度标准品时所产生反应的大小。
计算公式为：
详细数据如表7所示，各方案抑制率随标准品变化关系如图16所示，当甲基苯丙胺抗体标记用量为50μg时，该方案所制试纸条的抑制率比其他方案均要高且曲线平滑，性能更佳，故甲基苯丙胺抗体的标记量优选在50～80μg，最佳标记量为50μg。
表7不同甲基苯丙胺抗体标记量对应梯度标准品的抑制率
(2)吗啡抗体最佳标记量的确定
依次使用20，30，40，50，60，70，80μg吗啡抗体按照实施例7中的方案Ⅲ进行吗啡抗体荧光标记探针的制备，并制卡滴加梯度浓度标准品比较其性能。20μg标记量方案信号值太低弃去，60，70，80μg方案信号值基本一致，考虑到标记量越高会导致试纸条灵敏度越差，故仅选用30，40，50，60μg标记量方案进行比较，详细数据如表8所示，各方案抑制率随标准品变化关系如图17所示，可见抑制率大小基本与抗体标记量呈反比，30，40μg方案T线、C线不够清晰完整，易造成仪器误读，故选用50μg作为吗啡抗体最佳标记量。
表8不同吗啡抗体标记量对应梯度标准品的抑制率
/>
(3)氯胺酮抗体最佳标记量的确定
依次使用20，30，40，50，60，70，80μg氯胺酮抗体按照实施例7中的方案Ⅲ进行氯胺酮抗体荧光标记探针的制备，并制卡滴加梯度浓度标准品比较其性能。20，30，40，50μg标记量方案所制卡T线信号值过低弃去不用，选用60，70，80μg抗体方案进行比较，详细数据如表9所示，各方案抑制率随标准品变化关系如图18所示，70μg标记量方案抑制率随标准品浓度梯度变化关系最为规律，故氯胺酮抗体的标记量优选在60～80μg，选用70μg作为最佳标记量。
表9不同氯胺酮抗体标记量对应梯度标准品的抑制率
验证例5抗原最佳划膜浓度的确定
(1)甲基苯丙胺抗原最佳划膜浓度的确定
按照实施例8将甲基苯丙胺偶联牛血清白蛋白(MET-BSA)用划膜液稀释成0.2、0.5、0.8、1.0mg/mL分别划膜后，试纸条滴加空白人工唾液检测，使用BH101GO读数，结果如表10所示，随着MET-BSA浓度提升，T线信号出现逐步提升，但当浓度大于等于0.8mg/mL时，信号基本不再增加，说明此时甲基苯丙胺抗体荧光标记探针已经全部结合到T线处，无法通过提升MET-BSA浓度进一步提升T线信号，因此选择0.8mg/mL作为甲基苯丙胺抗原最佳划膜浓度，当然地，划膜浓度也可选择≥0.8mg/mL。
表10不同MET-BSA浓度对T、C线信号值的影响(n＝3)
(2)吗啡抗原最佳划膜浓度的确定
按照实施例8将吗啡偶联牛血清白蛋白(MOP-BSA)用划膜液稀释成0.3、0.5、0.7、0.9mg/mL分别划膜后，试纸条滴加空白人工唾液检测，使用BH101GO读数，结果如表11所示，随着MOP-BSA浓度提升，T线信号出现逐步提升，但当浓度大于等于0.5mg/mL时，信号基本不再增加，说明此时吗啡抗体荧光标记探针全部结合到T线处，无法通过提升MOP-BSA浓度进一步提升T线信号，因此选择0.5mg/mL作为吗啡抗原最佳划膜浓度，当然地，划膜浓度也可选择≥0.5mg/mL。
表11不同MOP-BSA浓度对T、C线信号值的影响(n＝3)
(3)氯胺酮抗原最佳划膜浓度的确定
按照实施例8将氯胺酮偶联牛血清白蛋白(KET-BSA)用划膜液稀释成0.5、0.75、1.0、1.25mg/mL分别划膜后，试纸条点空白人工唾液检测，使用BH101GO读数，结果如表12所示，随着KET-BSA浓度提升，T线信号出现逐步提升，但当浓度大于等于1.0mg/mL时，信号基本不再增加，说明此时氯胺酮抗体荧光标记探针已经全部结合到T线处，无法通过提升KET-BSA浓度进一步提升T线信号，因此选择1.0mg/mL作为氯胺酮抗原最佳划膜浓度，当然地，划膜浓度也可选择≥1.0mg/mL。
表12不同KET-BSA浓度对T、C线信号值的影响(n＝3)
验证例6抗原包被顺序对试剂卡性能的影响
结合实施例1的数据可知，T线位置对相应项目的灵敏度也存在影响，T线位置越高，则检测限越低，初步分析，原因是T线越高时，待测溶液中相应抗原有更多时间与抗体荧光标记探针反应，因此更加灵敏。由验证例4可知，甲基苯丙胺、吗啡对低浓度标准品的响应更灵敏，而氯胺酮则性能较差，因此在抗原包被顺序中，氯胺酮抗原需要被放在最后端即设计在T线最高位置，而甲基苯丙胺、吗啡的先后顺序则需通过制相应卡比较。方案一次序为吗啡、甲基苯丙胺、氯胺酮，方案二为甲基苯丙胺、吗啡、氯胺酮，测得相应浓度对应抑制率如表13～表15所示，显然，氯胺酮项目由于T线位置未变动，因此抑制率基本无变化；对于甲基苯丙胺，方案一、二的抑制率整体无大波动；对应吗啡，方案一中由于吗啡抗原T线位置靠前，导致抑制率较方案二要低许多，说明吗啡抗原不适合不适合包被到最前端，因此，试纸条检测膜的抗原包被最佳顺序为甲基苯丙胺最前，吗啡居中，氯胺酮最后。
表13不同划膜顺序对MET抑制率的影响
表14不同划膜顺序对MOP抑制率的影
表15不同划膜顺序对KET抑制率的影响
验证例7试剂卡性能评价
(1)曲线方程与范围
1)甲基苯丙胺曲线方程与范围
取梯度浓度标准品进行测试，不同浓度甲基苯丙胺标准品溶液所测得T/C值如表16所示，得到标准曲线和层析试纸条如图20和图21所示。使用Logistic曲线四参数拟合对数据进行拟合，拟合度r为0.9853，表明甲基苯丙胺项目T/C值与甲基苯丙胺标准品在浓度为0～40ng/mL的范围内具有良好的相关性。
表16梯度浓度MET标准品对应T/C值
2)吗啡曲线方程与范围
取梯度浓度标准品进行测试，不同浓度吗啡标准品溶液所测得T/C值如表17所示，得到标准曲线和层析试纸条如图22和图23所示。使用Logistic曲线四参数拟合对数据进行拟合，拟合度r为0.9959，表明吗啡项目T/C值与吗啡标准品在浓度为0～25ng/mL的范围内具有良好的相关性。
表17梯度浓度MOP标准品对应T/C值
3)氯胺酮曲线方程与范围
取梯度浓度标准品进行测试，不同浓度氯胺酮标准品溶液所测得T/C值如表18所示，得到标准曲线和层析试纸条如图24和图25所示。使用Logistic曲线四参数拟合对数据进行拟合，拟合度r为0.9568，表明氯胺酮项目T/C值与氯胺酮标准品在浓度为0-65ng/mL的范围内具有良好的相关性。
表18梯度浓度KET标准品对应T/C值
验证例8重复性试验
按照实施例10取10ng/mL甲基苯丙胺、吗啡标准品溶液和18ng/mL氯胺酮标准品溶液，使用微型免疫荧光试剂卡连续测量十次，所得结果如表19所示，试纸条相对标准偏差(RSD)均低于10％，表现出良好的重复性。
表19微型免疫荧光试剂卡重复性试验(n＝10)
验证例9检出限
按照实施例10取阴性人工唾液连续测试十次，测得MET、MOP、KET对应T/C值平均值(M)及标准偏差(SD)如下表20所示，将M-2SD代入标准曲线，求得对应检出限，即MET检出限为0.20ng/mL，MOP检出限为0.40ng/mL，KET检出限为3.68ng/mL。
表20微型免疫荧光试剂卡检出限测试(n＝10)
/>
验证例10加标回收率
按照实施例10取200μL 5ng/mL的MET标准品溶液加入到200μL 20ng/mL的MET标准品溶液记为浓度1，取200μL 10ng/mL的MET标准品溶液加入到200μL 40ng/mL的MET标准品溶液记为浓度2，取200μL 5ng/mL的MOP标准品溶液加入到200μL 20ng/mL的MOP标准品溶液记为浓度3，取200μL 15ng/mL的MOP标准品溶液加入到200μL 20ng/mL的MET标准品溶液记为浓度4，取200μL 10ng/mL的KET标准品溶液加入到200μL 28ng/mL的KET标准品溶液记为浓度5，取200μL 38ng/mL的KET标准品溶液加入到200μL 50ng/mL的KET标准品溶液记为浓度6。依次测试上述浓度溶液，根据其T/C，带入标准曲线求得实测浓度如表21所示。各浓度标准品回收率基本均在90％-110％，表明该试纸条检测方法较为可靠。
表21微型免疫荧光试剂卡加标回收率测试(n＝3)
验证例11抗干扰试验
按照实施例10配制50ng/mL的碳酸氢钠溶液，常见药品1000ng/mL的硝苯地平、盐酸金刚烷胺、布洛芬、青霉素、阿莫西林、维生素B2，非检测目标毒品1000ng/mL的芬太尼、甲卡西酮以及4,5-亚甲基二氧基苯丙胺溶液，每项使用微型免疫荧光试剂卡重复检测三次，均未检出阳性(以T/C抑制率达到50％计)。表明该微型免疫荧光试剂卡对非目标检测物的抗干扰能力较强。
效果总结说明
本发明通过筛选高性能荧光微球，优化抗体荧光标记探针的制备方法，摸索毒品抗原划膜浓度，成功建立了联合检测甲基苯丙胺、吗啡和氯胺酮三项毒品的免疫荧光层析试纸条的制备方法，并展现出具有良好应用前景。主要研究结果如下：
(1)以毒品吗啡作为检测对象，对多种荧光微球进行标记筛选，其中200nm量子点荧光微球表现出良好的荧光稳定性和可修饰性，是当前制备免疫荧光层析试纸条的最佳选择。
(2)探究优化了抗体荧光标记探针制备的抗体用量：对于50μL微球原液，甲基苯丙胺抗体最佳标记量为50μg，吗啡抗体最佳标记量为50μg，氯胺酮抗体最佳标记量为70μg。
(3)探究了抗原包被顺序对免疫荧光层析试纸条性能的影响，并确定最佳方案为：T1检测线为0.8mg/mL MET-BSA，T2线为0.5mg/mL MOP-BSA，T3线为0.8mg/mL KET-BSA，甲基苯丙胺最前，吗啡居中，氯胺酮最后。
(4)基于免疫荧光层析试纸条的微型免疫荧光试剂卡，实现了三项毒品的高灵敏联合定量检测，为实现毒驾现场定量检测奠定了基础：对人工唾液中甲基苯丙胺检测范围为0～40ng/mL，检出限为0.20ng/mL；吗啡检测范围为0～25ng/mL，检出限为0.40ng/mL；氯胺酮检测范围为0～65ng/mL，检出限为3.68ng/mL；以上检测数据均优于公安部门规定相应毒品初步检测阈值，且该试纸条重复性，抗干扰能力良好，检测方法可靠，展现出良好的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (13)
1.抗体荧光标记探针，其特征在于，包括经活化处理后的荧光微球和与所述荧光微球偶联的抗体；所述抗体包括单抗或多抗；所述荧光微球上还结合有封闭剂；所述活化处理包括：采用MES溶液、NHS溶液和EDC溶液处理所述荧光微球。
2.如权利要求1所述的抗体荧光标记探针，其特征在于，所述抗体包括甲基苯丙胺抗体、吗啡抗体和氯胺酮抗体中的一种或多种；和/或，所述封闭剂包括牛血清白蛋白或脱脂奶粉。
3.免疫荧光层析试纸条，其特征在于，包括一体垫、检测膜和吸水垫；所述一体垫包括样品区和探针标记区；
所述检测膜的一端与所述探针标记区搭接，另一端与所述吸水垫搭接；所述检测膜上设有检测线和控制线；
所述探针标记区包括如权利要求1或2所述的抗体荧光标记探针；
所述检测线包被有抗原偶联蛋白溶液；
所述控制线包被有二抗溶液。
4.如权利要求3所述的免疫荧光层析试纸条，其特征在于，所述检测线为一条或多条，所述多条检测线的任意相邻两条之间的间距为1～3mm。
5.如权利要求4所述的免疫荧光层析试纸条，其特征在于，所述一体垫与距离其最近的所述检测线的距离为2～12mm；所述控制线与距离其最近的所述检测线的距离为1～3mm；所述探针标记区与所述检测膜的搭接长度为1～2mm；所述吸水垫与所述检测膜的搭接长度为5～15mm。
6.如权利要求3或4所述的免疫荧光层析试纸条，其特征在于，所述抗原偶联蛋白溶液中的抗原包括甲基苯丙胺、吗啡或氯胺酮中的一种或多种；所述一种或多种抗原与所述一条或多条检测线对应，每条所述检测线上包被一种含单一抗原的抗原偶联蛋白溶液。
7.如权利要求6所述的免疫荧光层析试纸条，其特征在于，在所述抗原偶联蛋白溶液中，所述甲基苯丙胺偶联蛋白的浓度为0.1～1.0mg/mL；和/或，在所述抗原偶联蛋白溶液中，所述吗啡偶联蛋白的浓度为0.3～0.9mg/mL；和/或，在所述抗原偶联蛋白溶液中，所述氯胺酮偶联蛋白的浓度为0.5～1.25mg/mL。
8.如权利要求3至7任一项所述的免疫荧光层析试纸条，其特征在于，还包括底板，所述检测膜一面完全贴装于所述底板，所述一体垫和所述吸水垫的一端贴装于所述底板，另一端搭接于所述检测膜上。
9.如权利要求3至8任一项所述的免疫荧光层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、一体垫处理：将一体垫置于一体垫处理液中进行浸泡处理后，取出干燥得到预处理后的一体垫；
S2、抗体荧光标记探针溶液制备：将荧光微球加入活化缓冲液中，加入NHS溶液混匀，再加入EDC溶液混合，进行活化处理，然后加入抗体溶液，反应，加入封闭液，进行封闭处理，固液分离取固相，所述固相用复溶液复溶，得到所述抗体荧光标记探针溶液；
S3、一体垫喷涂抗体荧光标记探针溶液：将所述抗体荧光标记探针溶液喷涂在步骤S1中所述的预处理后的一体垫上，干燥后得到喷涂后的一体垫；
S4、划膜：将检测膜、吸水垫与底板连接，分别用抗原偶联蛋白溶液、二抗溶液在检测膜的检测线和控制线上划膜，干燥后得到待组装件；
S5、将步骤S2中所述的喷涂后的一体垫组装到步骤S3中所述的待组装件上，得到所述免疫荧光层析试纸条。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述一体垫处理液包括缓冲液、蛋白和糖类。
11.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述一体垫处理液包括：磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、吐温-20、蔗糖和牛血清白蛋白。
12.微型免疫荧光试剂卡，包括如权利要求3至8任一项所述的免疫荧光层析试纸条和/或如权利要求9至11任一项所述的制备方法获得的免疫荧光层析试纸条。
13.如权利要求12所述的微型免疫荧光试剂卡在毒品检测中的应用。
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