CN111735941A - 一种稀土钒酸盐纳米荧光标记材料及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种稀土钒酸盐纳米荧光标记材料及其制备方法和应用。所述的制备方法合成条件温和，易于控制。制备所得的水溶性稀土钒酸盐纳米荧光标记材料为四方相的纳米颗粒，尺寸约为100～500纳米且形貌均一，发光性能好。本发明制备得到的稀土钒酸盐纳米荧光标记材料可用于标记时间分辨荧光定量检测cTnI免疫层析试纸条，由于稀土钒酸盐纳米材料具有背景低，荧光信号强，信噪比高等优势，使用本发明稀土钒酸盐纳米荧光标记材料标记的试纸条检测灵敏度高，精密度好，快捷简便，在生物医学领域具有重要意义。

Description

一种稀土钒酸盐纳米荧光标记材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于纳米发光技术领域，具体涉及一种稀土钒酸盐纳米荧光标记材料及其制备方法和应用。

背景技术

急性心肌梗死(AMI)是心肌的缺血性坏死，是由于冠状动脉病变，血供突然减少或中断导致的心肌坏死。它常发生心律失常、心力衰竭和心源性休克等并发症，是严重的冠心病类型。AMI因早期发病诊断困难成为目前人类死亡的主要原因之一，因此早期诊断AMI具有重要的意义。心肌肌钙蛋白I(cTnI)是心脏特异性抗原，对心肌坏死和损伤有高度的敏感性和特异性，由于在血中的含量极低，因此只要有少量的心肌坏死，血中的浓度会相对地快速升高。当AMI发作时，cTnI会在4～8小时内从损伤的心肌细胞释放到血液中，并超出正常浓度范围。通常，AMI发病12～18小时后,达到最高浓度，在5～10天内维持高值。由于对心肌的高特异性和诊断效率等原因，cTnI对AMI诊断，预后和疗效判断具有重要意义。

目前临床中cTnI的测定方法主要包括酶联免疫分析法(ELISA)、化学发光法(CLIA)、胶体金免疫层析等方法。其中，酶联免疫分析法的操作繁琐，测定周期偏长、灵敏度相对较低、需要配备特殊的仪器以及专业的操作人员等，不适合即时检测。化学发光法测定需昂贵的仪器设备，不适合单人份和较小批量检测用,而胶体金免疫层析法虽然快速，便捷，但是缺点是只能实现半定量，只能指示一个大概范围，无法实现精确定量。因此，这些方法都不适宜大面积推广使用。

时间分辨荧光免疫分析是在传统荧光分析的基础上创立的一种新型非放射性免疫分析技术。根据镧系金属鳌合物荧光持续时间长且位移大的特点，用时间分辨技术测量荧光，同时对检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高分析灵敏度。因此，与传统标记物相比，稀土掺杂纳米荧光标记材料具有稳定的物理化学性质，窄带发射，长寿命，背景荧光低等优点，在生物标记过程中不容易受环境影响。钒酸盐在深紫外的吸收截面较大，并且具有有效的基质敏化带，被认为是优良的基体材料，稀土离子掺杂的钒酸盐发光材料可作为荧光标记物应用于生物检测领域。但是，生物荧光标记对纳米材料有形貌尺寸均一，分散性好的要求。因此，寻求一种具有调控能力且条件温和、操作简单、成本低廉、环境友好的合成路线，以实现对纳米稀土发光材料的尺寸和形貌控制也是重点关注的课题。

发明内容

本发明提供一种稀土钒酸盐纳米荧光标记材料，所述稀土钒酸盐纳米荧光标记材料的化学组成为LnVO₄:xEu，其中，LnVO₄为基质，铕(Eu³⁺)为掺杂离子，x为掺杂离子的摩尔百分数。

根据本发明的实施方案，所述Ln为稀土元素，优选为镧、钇、钆、钐、铽中的一种或多种，更优选为钆。

根据本发明的实施方案，所述x可以为5％～50％，优选20％～40％，例如30％。

根据本发明示例性的实施方案，所述稀土钒酸盐纳米荧光标记材料的化学组成可以为GdVO₄:30％Eu。

根据本发明的实施方案，所述稀土钒酸盐纳米荧光标记材料为纳米颗粒。

根据本发明的实施方案，所述纳米颗粒为晶体，其晶相结构为纯四方相。

根据本发明的实施方案，所述纳米颗粒的尺寸为100～500nm，优选为200～300nm，例如约250nm。

根据本发明的实施方案，所述稀土钒酸盐纳米荧光标记材料为水溶性材料。

本发明还提供上述稀土钒酸盐纳米荧光标记材料的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：将含有Ln³⁺的无机盐、含有Eu³⁺的无机盐、含有VO₄ ^3-的无机盐、表面活性剂在溶剂中反应，反应结束后进行固液分离得到所述材料。

根据本发明的实施方案，所述含有Ln³⁺无机盐可以为Ln³⁺的硝酸盐、醋酸盐、氯化物中的任一种，优选Ln³⁺的硝酸盐；

所述含有Eu³⁺的无机盐可以为Eu³⁺的硝酸盐、醋酸盐、氯化物中的任一种，优选Eu³⁺的硝酸盐；

所述含有VO₄ ^3-的无机盐可以为VO₄ ^3-的碱金属盐，优选为原钒酸钠；

所述表面活性剂可以为柠檬酸、柠檬酸钠中的任一种；

所述溶剂为水。

根据本发明的实施方案，所述含有VO₄ ^3-的无机盐与所述含有Ln³⁺无机盐、所述表面活性剂的摩尔比为1:(0.5～0.95):(1～10)，优选为1:(0.5～0.95):(1～5)，例如1:0.7:4；

所述含有Ln³⁺的无机盐与所述含有Eu³⁺的无机盐的摩尔数之和等于所述含有VO₄ ^3-的无机盐的摩尔数。

根据本发明的实施方案，所述含有VO₄ ^3-的无机盐在所述溶剂中的浓度为0.01～0.05mol/L，优选为0.02～0.03mol/L，例如0.025mol/L。

根据本发明的实施方案，所述反应开始前，可加入无机碱调节pH至6～8，所述无机碱可以为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾中的任一种，优选氢氧化钠。

根据本发明的实施方案，所述反应在惰性气氛中进行，所述惰性气氛可以为氦气、氮气、氩气中的任一种，优选为氮气。

根据本发明的实施方案，所述反应的温度可以为50℃～100℃，优选为70℃～90℃，例如85℃；

反应时间可以为12～48h，例如24h。

根据本发明的实施方案，所述固液分离结束后，可以对得到的固体进行洗涤、干燥，得到所述纳米荧光标记材料，所述洗涤可以使用水为洗涤剂。

进一步地，本发明还提供所述稀土钒酸盐纳米荧光标记材料的应用，其可作为生物荧光标记物应用于生物检测领域，例如应用于标记时间分辨荧光定量检测cTnI免疫层析试纸条。

本发明还提供一种使用所述稀土钒酸盐纳米荧光标记材料标记的时间分辨荧光定量检测cTnI免疫层析试纸条，所述试纸条包括底板和底板上依次紧密连接的样品结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸；其中，所述样品结合垫、所述吸水纸分别交叠压在所述硝酸纤维素膜的两端后在所述硝酸纤维素膜的表面形成检测区；所述样品结合垫上包被有所述稀土钒酸盐纳米荧光标记材料标记的cTnI单克隆抗体1，所述硝酸纤维素膜上设有检测线(T线)和质控线(C线)；所述检测线上包被有另外一个表位的cTnI单克隆抗体2，所述质控线上包被有羊抗鼠IgG抗体。

根据本发明的实施方案，所述试纸条检测cTnI的检测线性范围为0.02-200ng/mL，检测限可达16pg/mL，检测时间为5～20min，例如15min，批内变异系数<10％。

根据本发明的实施方案，所述试纸条的宽度为3～5mm，例如4mm。

本发明还提供所述试纸条的使用方法，其利用双抗体夹心检测抗原的原理检测cTnI标本，所述方法包括如下步骤：

(1)建立标准曲线：配置不同cTnI浓度的标准品溶液，将标准品溶液滴加到样品结合垫上，所述标准品溶液中的cTnI抗原会先与所述样品结合垫上所述稀土钒酸盐纳米荧光标记材料标记的cTnI单克隆抗体1结合形成结合物A，随着层析作用的进行，所述结合物A向前移动，与所述检测线处包被的所述另一个表位的cTnI单克隆抗体2形成双抗体夹心复合物，多余的所述标记材料标记的cTnI单克隆抗体1继续向前移动，再与所述质控线处的羊抗鼠IgG抗体结合形成结合物B，层析作用结束后，在时间荧光分辨仪的激发光激发下，所述检测线处的所述双抗体夹心复合物、所述质控线处的所述结合物B均显示荧光，通过信号转化得到检测线和质控线处荧光强度的强弱及其比值，并制定以cTnI浓度的对数值(log[cTnI])为x轴，所述检测线和所述质控线处荧光强度比值的对数值(log(T/C))为y轴进行线性回归，得到标准曲线；

(2)定量检测待测样品中cTnI的浓度：将所述待测样品滴加到新的试纸条上，层析作用结束后，重复(1)中获得试纸条中所述检测线和所述质控线处荧光强度比值(T/C)的步骤，得到待测样品的T/C值，再根据所述标准曲线得到所述待测样品中cTnI的浓度。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种稀土钒酸盐纳米荧光标记材料LnVO₄:xEu及其制备方法，所述方法条件温和，易于控制，可批量控制合成所述纳米荧光标记材料，得到的所述材料尺寸形貌均一，有水溶性好、易于表面修饰、单颗粒发光强、荧光寿命长等优异性能，可用作生物荧光标记物。由于所述材料中含有大量的稀土离子，大大提高了标记率，有效地提高了灵敏度。本发明将时间分辨荧光和免疫层析两大技术结合起来，以所述稀土钒酸盐纳米荧光标记材料为生物荧光标记物，开发了一种新型的、能快速定量检测的时间分辨荧光免疫层析检测试纸条，操作简便，检测时间短，与进口荧光微球相比，具有背景低，荧光信号强，信噪比高等优势，显著地提高了cTnI检测的灵敏度。目前国际上cTnI快速检测试剂盒的检测限均大于100pg/mL，而本发明的试纸条最低检出限可达到16pg/mL，对急性心梗的快速检测具有重要的临床意义。

附图说明

图1为实施例1制备得到的GdVO₄:30％Eu纳米颗粒的X射线粉末衍射图。

图2为实施例1制备得到的GdVO₄:30％Eu纳米颗粒的扫描电镜图，左上角插图为GdVO₄:30％Eu纳米颗粒的水溶液分别在白光和紫外光激发下的照片。

图3为实施例1制备得到的GdVO₄:30％Eu纳米颗粒的荧光激发和发射光谱图。

图4为实施例1制备得到的GdVO₄:30％Eu纳米颗粒的发光衰减曲线。

图5为实施例2得到的时间分辨荧光定量检测cTnI免疫层析试纸条的结构示意图，图中的附图标记如下所述：1-样品结合垫；2-GdVO₄:30％Eu标记的cTnI单克隆抗体1；3-硝酸纤维素膜；4-检测线；5-质控线；6-吸水纸；7-底板。

图6为实施例2制备的试纸条的标准曲线。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

1.稀土钒酸盐纳米荧光标记材料GdVO₄:30％Eu的制备：

在50mL圆底烧瓶中，加入20mL水，0.35mmol硝酸钆，0.15mmol硝酸铕，2mmol柠檬酸钠，0.5mmol原钒酸钠，通入氮气，85℃反应24小时，10000rpm离心，用蒸馏水洗涤3次，干燥得到分散性好的水溶性GdVO₄:30％Eu纳米荧光标记材料。其中，GdVO₄为基质，Eu³⁺为掺杂离子，其摩尔百分数为30％。

对制备得到的GdVO₄:30％Eu纳米颗粒分别进行了X射线粉末衍射测试(MiniFlex2,Rigaku)、扫描电镜测试(JSM6700，SEM)、荧光激发和发射测试(FLS920,Edinburgh Instruments)、发光衰减特性测试(FLS920,Edinburgh Instruments)。

图1为实施例1制备得到的GdVO₄:30％Eu纳米颗粒的X射线粉末衍射谱图，从图中可以看出所制备的纳米颗粒为纯四方相结构，无杂相，对应为PDF卡片号JCPDS:#17-0760。

图2为实施例1制备得到的GdVO₄:30％Eu纳米颗粒的扫描电镜图，左上角插图为GdVO₄:30％Eu纳米颗粒的水溶液分别在白光和紫外光激发下的照片。从图中可以看出所制备的纳米颗粒为中间凹陷的圆环状纳米粒子，尺寸为250nm左右，形貌尺寸非常均一。

图3为实施例1制备得到的GdVO₄:30％Eu纳米颗粒的荧光激发和发射光谱图，显示其激发波长的中心为285nm，发射波长中心为618nm，具有高效的红光发射。其中，基质GdVO₄与掺杂离子Eu³⁺之间的能量传递效率(发射段与激发段的积分比值)为11.9％。

图4为实施例1制备得到的GdVO₄:30％Eu纳米颗粒的发光衰减曲线。从图中可以看出所制备的纳米颗粒的荧光寿命为0.583ms，通过测定时间差可以实现高信噪比。

2.GdVO₄:30％Eu标记的cTnI单克隆抗体1的制备：

(1)将固含量为1％(质量分数)的GdVO₄:30％Eu纳米颗粒水溶液超声2min(250W)并摇匀，取200μL至圆底离心管中，以14000rpm，4℃离心15min；

(2)加入1mL初洗缓冲液(50mM MES，pH5.0～6.0)，超声2min以重悬沉淀，加入50μL碳二亚胺(EDC,100mg/mL)混匀反应5min，超声1min，再加入150μL N-羟基巯代琥珀亚胺(100mg/mL，lsulfo-NHS)混匀反应15min，超声1min；

(3)向圆底离心管中加入1mL对应偶联缓冲液(50mM MES,pH5.0～6.0)，超声2min重悬(可两次)，加入cTnI单克隆抗体100～200μg，偶联2h，超声2min；

(4)加入500μL封闭缓冲液(50mM Tris-HCl+0.5％BSA+0.1％proclin)，混匀反应1h，超声2min后14000rpm，4℃离心15min，用1mL终洗缓冲液(pH 8.0，1％NaCl+0.5％BSA+0.1％Tween20+0.1％proclin的50mM、pH8.0的Tris-HCl)超声2min以重悬沉淀，14000rpm，4℃离心15min(洗两次)，再用200μL终洗缓冲液，重悬沉淀。

实施例2

试纸条的制备

A、样品结合垫1处理：玻璃纤维素膜用含有表面活性剂的缓冲液(配方：100mLPBS,pH7.4，含有2％NaCl，2％BSA，0.5％酪蛋白，0.1％吐温-0.5％S9和5％蔗糖)浸泡进行预封闭后，50℃干燥过夜，通过Biodot仪器的airjet喷头将GdVO₄:30％Eu标记的cTnI单克隆抗体1按照8μL/cm的量超声喷雾至宽为1cm的玻璃纤维素膜上，50℃干燥过夜，制备得到样品结合垫。

B、硝酸纤维素膜3的制备：取50mM的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液将另一表位的cTnI单克隆抗体2稀释到1mg/mL，用于制备T线；用0.05 M的MES缓冲溶液将羊抗鼠IgG抗体稀释至1mg/mL，用于制备C线；通过Biodot划膜仪将两种稀释后的抗体均匀平行划于硝酸纤维素膜上进行包被，后置于烘箱中50℃烘干过夜。

C、试纸条的组装：在白色底板7上依次相互交错地贴上样品垫1、硝酸纤维素膜3、吸水纸6，检测线4和质控线5相互平行，切割后即得到4mm宽度的时间分辨荧光定量检测cTnI免疫层析试纸条。

实施例3样品的定量检测

1.标准曲线的建立

检测方法：配制cTnI浓度分别为500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.25pg/mL、15.625pg/mL的标准品溶液，分别取各浓度的校准品溶液80μL，各自加入实施例2制备的试纸条中，15min后用时间分辨荧光定量分析仪定量检测T线与C线的荧光值，每个浓度的校准品溶液检测三次，取T/C值的平均值，具体结果见表1。

表1

cTnI(pg/mL)	T/C	log[cTnI]	Log(T/C)
				500	4.915	2.698	0.691
250	2.726	2.397	0.435
				125	1.113	2.096	0.046
62.5	0.515	1.795	-0.288
				31.25	0.226	1.494	-0.645
15.625	0.121	1.193	-0.917

根据以上检测结果，以cTnI浓度的对数值log[cTnI]为x轴，T/C值对数值Log(T/C)为y轴进行线性回归，得到线性方程y＝1.1031x-2.26，r＝0.9966，如图6所示。

2.最低检出限

用零值样本进行重复测定20次，计算20次结果的均值M与标准差SD，以空白均值加三倍标准差报告方法的检测限(M+3SD)，结果显示本发明的试纸条最低检出限为16pg/mL。

3.精密度

取20个参照实施例2的步骤制备的全新试纸条，分别检测cTnI浓度为147.9mg/L和58.2mg/L的质控品，平行检测10次，浓度为147.9mg/L和58.2mg/L的质控品的批内CV分别为6.25％和8.15％，均在10％以内，说明本发明的荧光免疫层析试纸条的精密度良好。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种稀土钒酸盐纳米荧光标记材料，其特征在于，所述稀土钒酸盐纳米荧光标记材料的化学组成为LnVO₄:xEu，其中，LnVO₄为基质，Eu³⁺为掺杂离子，x为掺杂离子的摩尔百分数；

所述Ln为稀土元素，所述x为5％～50％。

2.根据权利要求1所述的稀土钒酸盐纳米荧光标记材料，其特征在于，所述Ln为镧、钇、钆、钐、铽中的一种或多种；

所述x为20％～40％；

所述稀土钒酸盐纳米荧光标记材料为纳米颗粒，所述稀土钒酸盐纳米荧光标记材料为水溶性材料。

3.根据权利要求2所述的稀土钒酸盐纳米荧光标记材料，其特征在于，所述纳米颗粒为晶体，其晶相结构为纯四方相；

所述纳米颗粒的尺寸为100～500nm，优选为200～300nm。

4.权利要求1-3任一项所述稀土钒酸盐纳米荧光标记材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：将含有Ln³⁺的无机盐、含有Eu³⁺的无机盐、含有VO₄ ^3-的无机盐、表面活性剂在溶剂中反应，反应结束后进行固液分离得到所述材料。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述含有Ln³⁺无机盐为Ln³⁺的硝酸盐、醋酸盐、氯化物中的任一种，优选Ln³⁺的硝酸盐；

所述含有Eu³⁺的无机盐为Eu³⁺的硝酸盐、醋酸盐、氯化物中的任一种，优选Eu³⁺的硝酸盐；

所述表面活性剂为柠檬酸、柠檬酸钠中的任一种；

所述含有VO₄ ^3-的无机盐为VO₄ ^3-的碱金属盐，优选为原钒酸钠；

所述溶剂为水。

6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述含有VO₄ ^3-的无机盐与所述含有Ln³⁺无机盐、所述表面活性剂的摩尔比为1:(0.5～0.95):(1～10)，优选为1:(0.5～0.95):(1～5)；

所述含有Ln³⁺无机盐与所述含有Eu³⁺的无机盐的摩尔数之和等于所述含有VO₄ ^3-的无机盐的摩尔数；

所述含有VO₄ ^3-的无机盐在所述溶剂中的浓度为0.01～0.05mol/L，优选为0.02～0.03mol/L；

所述反应开始前，加入无机碱调节pH至6～8；

所述反应在惰性气氛中进行，反应温度为50℃～100℃，反应时间为12～48h。

7.权利要求1-3任一项所述稀土钒酸盐纳米荧光标记材料的应用，其作为生物荧光标记物应用于生物检测领域。

8.一种使用权利要求1-3任一项所述稀土钒酸盐纳米荧光标记材料标记的时间分辨荧光定量检测cTnI免疫层析试纸条，所述试纸条包括底板和底板上依次紧密连接的样品结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸；其中，所述样品结合垫、所述吸水纸分别交叠压在所述硝酸纤维素膜的两端后在所述硝酸纤维素膜的表面形成检测区；所述样品结合垫上包被有所述稀土钒酸盐纳米荧光标记材料标记的cTnI单克隆抗体1，所述硝酸纤维素膜上设有检测线(T线)和质控线(C线)；所述检测线上包被有另外一个表位的cTnI单克隆抗体2，所述质控线上包被有羊抗鼠IgG抗体。

9.根据权利要求8所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条检测cTnI的检测线性范围为0.02-200ng/mL，检测限为16pg/mL，检测时间为5～20min，批内变异系数<10％，所述试纸条的宽度为3～5mm。

10.权利要求8或9所述试纸条的使用方法，所述方法包括如下步骤：

(1)建立标准曲线：配置不同cTnI浓度的标准品溶液，将所述标准品溶液滴加到所述样品结合垫上，所述标准品溶液中的cTnI抗原会先与所述样品结合垫上所述稀土钒酸盐纳米荧光标记材料标记的cTnI单克隆抗体1结合形成结合物A，随着层析作用的进行，所述结合物A向前移动，与所述检测线处包被的所述另一个表位的cTnI单克隆抗体2形成双抗体夹心复合物，多余的所述标记材料标记的cTnI单克隆抗体1继续向前移动，再与所述质控线处的羊抗鼠IgG抗体结合形成结合物B，层析作用结束后，在时间荧光分辨仪的激发光激发下，所述检测线处的所述双抗体夹心复合物、所述质控线处的所述结合物B均显示荧光，通过信号转化得到检测线和质控线处荧光强度的强弱及其比值(T/C)，并制定以cTnI浓度的对数值(log[cTnI])为x轴，所述检测线和所述质控线处荧光强度比值的对数值(log(T/C))为y轴进行线性回归，得到标准曲线；

(2)定量检测待测样品中cTnI的浓度：将所述待测样品滴加到新的试纸条上，层析作用结束后，重复(1)中获得试纸条中所述检测线和所述质控线处荧光强度比值(T/C)的步骤，得到待测样品的T/C值，再根据所述标准曲线得到所述待测样品中cTnI的浓度。

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