CN117233377A - 时空分辨光学信号编码方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了多重检测技术领域的时空分辨光学信号编码方法，包括如下步骤：S1、Fe3O4磁性微球制备；S2、Fe3O4@mSiO2制备；S3、多重荧光编码微球制备；S4、连接抗体的多重荧光编码微球制备；S5、长余辉检测探针制备；S6、对靶标物质进行多重检测。本发明，以FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O为原料，制备Fe3O4磁性微球，以长余辉材料、表面活性剂和羧甲基纤维素等为原料制备长余辉检测探针，将靶标物质与连接抗体的多重荧光编码微球和长余辉检测探针结合，形成夹心复合物，基于xMAP技术原理对靶标物质进行检测，夹心复合物中的多重荧光编码微球被激发确定检测目标，长余辉检测探针被激发对检测目标进行余晖定量。
Description
技术领域
本发明属于多重检测技术领域，具体是时空分辨光学信号编码方法。
背景技术
多重检测通过构建基于编码策略的一组探针用于建立多种标志物检测的反应体系，为临床医生提供病人样本中多种标志物的检测信息来帮助其更好地监控病人所处的疾病状态以及提高疾病诊断的准确度，适合于临床常见靶标的联检。
随着技术的发展，Luminex公司推出了xMAP(multiple analyte profiling)技术，即液相芯片技术，液相芯片技术具有集成化、试剂和样本消耗量少且能同时检测数个指标的优势，Luminex公司推出的xMAP技术能够用于蛋白和核酸的高通量检测，其基本原理为：使用不同配比的两种(或三种)荧光染料染色微球制备多种基于颜色编码的荧光微球用于指示检测项目。荧光微球通过偶联待测分析物的捕获分子(抗体、抗原以及核酸等)构成一组捕获探针用于结合样本中对应的分析物，随后加入标记生物素的检测抗体或与含有生物素的扩增产物结合形成复合物，最后加入荧光素标记的链霉亲和素作为报告分子与检测抗体或扩增产物中的生物素结合形成夹心复合物。在鞘液作用下，微球依次通过，并分别被红色激光和绿色激光激发，红色激光用于激发微球中的荧光染料来区分颜色编码的微球以确定检测项目，绿色激光用于激发微球连接的报告分子实现对靶标物质的定量分析。
该技术使用的荧光染料斯托克斯位移小，荧光衰变时间短，反应体系信噪比不够高，且所用荧光材料成本较高，因此，我们提出了时空分辨光学信号编码方法。
发明内容
本发明的目的是提供时空分辨光学信号编码方法，解决现有技术中荧光染料的斯托克斯位移小，荧光衰变时间短，反应体系信噪比不够高，且所用荧光材料成本较高的问题。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：时空分辨光学信号编码方法，包括如下步骤：
S1、Fe3O4磁性微球制备：在惰性气体保护下，以FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O为原料制备Fe3O4磁性微球，并将Fe3O4磁性微球悬浮于氯仿中；
S2、Fe3O4@mSiO2制备：以悬浮于氯仿中的Fe3O4磁性微球为原料制备Fe3O4@mSiO2；
S3、多重荧光编码微球制备：使用两种荧光染料按照不同比例掺杂到磁性介孔二氧化硅负载层，制备不同荧光强度的荧光微球，并在Fe3O4@mSiO2上包被一层二氧化硅，形成多重荧光编码微球；
S4、连接抗体的多重荧光编码微球制备：以多重荧光编码微球为原料制备连接抗体的多重荧光编码微球；
S5、长余辉检测探针制备：使用包括长余辉材料、表面活性剂以及羧甲基纤维素为原料制备长余辉检测探针；
S6、对靶标物质进行多重检测：将靶标物质与连接抗体的多重荧光编码微球和长余辉检测探针结合，形成夹心复合物，在鞘液作用下，夹心复合物依次通过，多重荧光编码微球被激发确定检测目标，长余辉检测探针被激发对检测目标进行余晖定量。
进一步，S1、Fe3O4磁性微球制备，具体包括如下步骤：
在氮气保护下，将FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O按比例添加到去离子水中搅拌均匀，通入氮气30min去除挥发性杂质，加热至80-90℃再依次加入氢氧化铵溶液和油酸，在80-90℃条件下反应2-3h；
在室温条件下冷却后，用磁铁吸附黑色沉淀物后用乙醇清洗，将形成的油酸包封的Fe3O4磁性微球悬浮于氯仿中。
进一步，S2、Fe3O4@mSiO2制备，具体包括如下步骤：
首先，在40℃剧烈搅拌1小时的条件下，将S1制备的悬浮于氯仿中的Fe3O4磁性微球缓慢添加到CTAB溶液中；
随后，在60℃条件下，加热上述混合物10分钟，持续搅拌使氯仿蒸发，得到Fe3O4/CTAB溶液；
随后，使用去离子水将Fe3O4/CTAB溶液稀释，保持溶液温度于45℃，向其中加入氢氧化钠溶液将Fe3O4/CTAB溶液pH值调整为12；
最后，加入TEOS,并在45℃条件下搅拌6小时；通过离心收集Fe3O4@mSiO2纳米颗粒，并用水和乙醇清洗若干次。
进一步，S2、Fe3O4@mSiO2制备，还包括如下步骤：将离心收集的Fe3O4@mSiO2纳米颗粒分散到硝酸铵的乙醇溶液中，在50℃下回流5h，然后用乙醇洗涤若干次，去除Fe3O4@mSiO2纳米颗粒中的CTAB。
进一步，硝酸铵的浓度为10mg/mL。
进一步，S4、连接抗体的多重荧光编码微球制备，具体包括如下步骤：
首先，向多重荧光编码微球中加入MES溶液，在4℃条件下离心，弃去上清液，加入MES溶液，通过超声细胞粉碎机超声处理；
随后，向其中加入EDC和NHS溶液置于混匀仪器上混合1小时，在4℃条件下离心，弃去上清液；
随后，向其中加入PBS溶液，通过超声细胞粉碎机超声处理；
随后，向其中加入待连接的抗体，置于混匀仪器上混合2小时，在4℃条件下离心，弃去上清液，向其中加入PBS溶液，通过超声细胞粉碎机超声处理，再加入含有10％的牛血清白蛋白，置于混匀仪器上混合1小时；
混合结束后，在4℃条件下离心，弃去上清液，加入含1％的牛血清白蛋白，通过超声细胞粉碎机超声处理。
进一步，S5、长余辉检测探针制备，具体包括如下步骤：
首先，将长余辉材料、表面活性剂以及羧甲基纤维素混合；
随后，向其中加入水与四氢呋喃的混合溶液，其中水体积分数为85％，通过超声细胞粉碎机超声处理，将得到的溶液反复清洗后重悬于适量的去离子水中，再次通过细胞破碎仪超声处理30分钟；
随后，取一定量的上述制得的溶液并向其中加入适量的MES溶液，在4℃条件下离心，弃去上清液加入MES溶液，通过超声细胞粉碎机超声处理，向其中加入EDC和NHS溶液置于混匀仪器上混合1小时，在4℃条件下离心，弃去上清液，向其中加入PBS溶液，通过超声细胞粉碎机超声处理；
随后，加入待连接的抗体，置于混匀仪器上混合2小时，在4℃条件下离心，弃去上清液后，向其中加入PBS溶液，通过超声细胞粉碎机超声处理，再加入含有10％的牛血清白蛋白，置于混匀仪器上混合1小时；
混合结束后，在4℃条件下离心，弃去上清液，加入含1％的牛血清白蛋白，通过超声细胞粉碎机超声处理。
进一步，长余辉材料、表面活性剂以及羧甲基纤维素的比例为10∶2∶1。
采用上述方案有以下有益效果：
1、本发明，以FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O为原料，制备Fe3O4磁性微球，以长余辉材料、表面活性剂和羧甲基纤维素为原料制备长余辉检测探针，将靶标物质与连接抗体的多重荧光编码微球和长余辉检测探针结合，形成夹心复合物，基于xMAP技术原理对靶标物质进行检测，夹心复合物中的多重荧光编码微球被激发确定检测目标，长余辉检测探针被激发对检测目标进行余晖定量。
本方法所制备的多重荧光编码微球相对于现有技术中的藻红蛋白荧光材料，成本低，制备流程简化，能够适用于批量生产。
2、本发明，制备的长余辉检测探针磷光衰变时间长、斯托克斯位移大、允许合成不同衰变时间的长余辉纳米颗粒实现时间编码，且不受背景荧光的干扰，大的斯托克斯位移减少了激发光源对发射光源的干扰，使得检测具有高的信噪比，提高了检测的灵敏度。
同时，基于两个维度的编码策略，能最大限度实现靶标物质的多重检测，为临床医生提供同一患者同类型靶标物质或不同类型靶标物质的诊断信息，从而辅助医生对病人的状态进行全面分析以及促进药物的合理使用。
3、本发明，制备的多重荧光编码微球够对同一患者不同类型靶标物质或者不同患者同一类型靶标物质进行检测，加强了样本混检时对病人的溯源能力，减轻检验人员的工作负担，提高检测效率。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明时空分辨光学信号编码方法实施例的流程框图；
图2为本发明时空分辨光学信号编码方法实施例的流程示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
实施例如附图1-2所示：时空分辨光学信号编码方法，包括如下步骤：
S1、Fe3O4磁性微球制备：
在惰性气体保护下，以FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O为原料制备Fe3O4磁性微球，并将Fe3O4磁性微球悬浮于氯仿中。
具体的，在氮气保护下，将FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O按1∶2的比例添加到去离子水中搅拌均匀，通入氮气30min去除挥发性杂质，加热至80-90℃再依次加入氢氧化铵溶液和油酸，在80-90℃条件下反应2-3h。
在室温条件下冷却后，用磁铁吸附黑色沉淀物后用乙醇清洗，将形成的油酸包封的Fe3O4磁性微球悬浮于氯仿中。
S2、磁性介孔二氧化硅纳米颗粒(Fe3O4@mSiO2)制备：
以悬浮于氯仿中的Fe3O4磁性微球为原料制备Fe3O4@mSiO2。
具体的，首先，在40℃剧烈搅拌1小时的条件下，将S1制备的悬浮于氯仿中的Fe3O4磁性微球缓慢添加到十六烷基三甲基溴化铵(cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)溶液中；
随后，在60℃条件下，加热上述混合物10分钟，持续搅拌使氯仿蒸发，得到Fe3O4/CTAB溶液；
随后，使用去离子水将Fe3O4/CTAB溶液稀释，保持溶液温度于45℃，向其中加入氢氧化钠溶液将Fe3O4/CTAB溶液pH值调整为12；
最后，加入四乙氧基硅烷(Tetraethylorthosilicate,TEOS),并在45℃条件下搅拌6小时；通过离心收集Fe3O4@mSiO2纳米颗粒，并用水和乙醇清洗3次。
为了去除离心收集的Fe3O4@mSiO2纳米颗粒中的CTAB，将离心收集的Fe3O4@mSiO2纳米颗粒分散到硝酸铵的乙醇溶液中，在50℃下回流5h，然后用乙醇洗涤3次，从而去除离心收集的Fe3O4@mSiO2纳米颗粒中的CTAB。
上述的硝酸铵浓度为10mg/mL。
S3、多重荧光编码微球制备：
使用两种荧光染料按照不同比例掺杂到磁性介孔二氧化硅负载层，制备不同荧光强度的荧光微球，并在Fe3O4@mSiO2上包被一层二氧化硅，形成多重荧光编码微球。其中，两种荧光染料的比例根据多重检测的指标数确定。
S4、连接抗体的多重荧光编码微球制备：
以多重荧光编码微球为原料制备连接抗体的多重荧光编码微球。
具体的，首先，向多重荧光编码微球中加入4-吗啉乙磺酸(Morpholinoethanesulfonic Acid,MES)溶液，在4℃条件下离心，弃去上清液，加入MES溶液，通过超声细胞粉碎机超声处理；
随后，向其中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide,EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide,NHS)溶液置于混匀仪器上混合1小时，在4℃条件下离心，弃去上清液；
随后，向其中加入磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)，通过超声细胞粉碎机超声处理；
随后，向其中加入待连接的抗体，置于混匀仪器上混合2小时，在4℃条件下离心，弃去上清液，向其中加入PBS溶液，通过超声细胞粉碎机超声处理，再加入含有10％的牛血清白蛋白，置于混匀仪器上混合1小时；
混合结束后，在4℃条件下离心，弃去上清液，加入含1％的牛血清白蛋白，通过超声细胞粉碎机超声处理。
S5、长余辉检测探针制备：
以长余辉材料、表面活性剂以及羧甲基纤维素等为原料制备长余辉检测探针。
具体的，首先，将长余辉材料、表面活性剂以及羧甲基纤维素混合；
随后，向其中加入水与四氢呋喃的混合溶液，其中水体积分数为85％，通过超声细胞粉碎机超声处理，将得到的溶液反复清洗后重悬于适量的去离子水中，再次通过细胞破碎仪超声处理30分钟；
随后，取一定量的上述制得的溶液并向其中加入适量的MES溶液，在4℃条件下离心，弃去上清液加入MES溶液，通过超声细胞粉碎机超声处理，向其中加入EDC和NHS溶液置于混匀仪器上混合1小时，在4℃条件下离心，弃去上清液，向其中加入PBS溶液，通过超声细胞粉碎机超声处理；
随后，加入待连接的抗体，置于混匀仪器上混合2小时，在4℃条件下离心，弃去上清液后，向其中加入PBS溶液，通过超声细胞粉碎机超声处理，再加入含有10％的牛血清白蛋白，置于混匀仪器上混合1小时；
混合结束后，在4℃条件下离心，弃去上清液，加入含1％的牛血清白蛋白，通过超声细胞粉碎机超声处理。
其中，长余辉材料、表面活性剂以及羧甲基纤维素的比例为10∶2∶1。
S6、对靶标物质进行多重检测：
将靶标物质与连接抗体的多重荧光编码微球和长余辉检测探针结合，形成夹心复合物，在鞘液作用下，夹心复合物依次通过，多重荧光编码微球被激发确定检测目标，长余辉检测探针被激发对检测目标进行余晖定量。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (8)
1.时空分辨光学信号编码方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、Fe3O4磁性微球制备：在惰性气体保护下，以FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O为原料制备Fe3O4磁性微球，并将Fe3O4磁性微球悬浮于氯仿中；
S2、Fe3O4@mSiO2制备：以悬浮于氯仿中的Fe3O4磁性微球为原料制备Fe3O4@mSiO2；
S3、多重荧光编码微球制备：使用两种荧光染料按照不同比例掺杂到磁性介孔二氧化硅负载层，制备不同荧光强度的荧光微球，并在Fe3O4@mSiO2上包被一层二氧化硅，形成多重荧光编码微球；
S4、连接抗体的多重荧光编码微球制备：以多重荧光编码微球为原料制备连接抗体的多重荧光编码微球；
S5、长余辉检测探针制备：使用包括长余辉材料、表面活性剂以及羧甲基纤维素为原料制备长余辉检测探针；
S6、对靶标物质进行多重检测：将靶标物质与连接抗体的多重荧光编码微球和长余辉检测探针结合，形成夹心复合物，在鞘液作用下，夹心复合物依次通过，多重荧光编码微球被激发确定检测目标，长余辉检测探针被激发对检测目标进行余晖定量。
2.根据权利要求1所述的时空分辨光学信号编码方法，其特征在于：S1、Fe3O4磁性微球制备，具体包括如下步骤：
在氮气保护下，将FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O按比例添加到去离子水中搅拌均匀，通入氮气30min去除挥发性杂质，加热至80-90℃再依次加入氢氧化铵溶液和油酸，在80-90℃条件下反应2-3h；
在室温条件下冷却后，用磁铁吸附黑色沉淀物后用乙醇清洗，将形成的油酸包封的Fe3O4磁性微球悬浮于氯仿中。
3.根据权利要求2所述的时空分辨光学信号编码方法，其特征在于：S2、Fe3O4@mSiO2制备，具体包括如下步骤：
首先，在40℃剧烈搅拌1小时的条件下，将S1制备的悬浮于氯仿中的Fe3O4磁性微球缓慢添加到CTAB溶液中；
随后，在60℃条件下，加热上述混合物10分钟，持续搅拌使氯仿蒸发，得到Fe3O4/CTAB溶液；
随后，使用去离子水将Fe3O4/CTAB溶液稀释，保持溶液温度于45℃，向其中加入氢氧化钠溶液将Fe3O4/CTAB溶液pH值调整为12；
最后，加入TEOS,并在45℃条件下搅拌6小时；通过离心收集Fe3O4@mSiO2纳米颗粒，并用水和乙醇清洗若干次。
4.根据权利要求3所述的时空分辨光学信号编码方法，其特征在于：S2、Fe3O4@mSiO2制备，还包括如下步骤：将离心收集的Fe3O4@mSiO2纳米颗粒分散到硝酸铵的乙醇溶液中，在50℃下回流5h，然后用乙醇洗涤若干次，去除Fe3O4@mSiO2纳米颗粒中的CTAB。
5.根据权利要求4所述的时空分辨光学信号编码方法，其特征在于：硝酸铵的浓度为10mg/mL。
6.根据权利要求1所述的时空分辨光学信号编码方法，其特征在于：S4、连接抗体的多重荧光编码微球制备，具体包括如下步骤：
首先，向多重荧光编码微球中加入MES溶液，在4℃条件下离心，弃去上清液，加入MES溶液，通过超声细胞粉碎机超声处理；
随后，向其中加入EDC和NHS溶液置于混匀仪器上混合1小时，在4℃条件下离心，弃去上清液；
随后，向其中加入PBS溶液，通过超声细胞粉碎机超声处理；
随后，向其中加入待连接的抗体，置于混匀仪器上混合2小时，在4℃条件下离心，弃去上清液，向其中加入PBS溶液，通过超声细胞粉碎机超声处理，再加入含有10％的牛血清白蛋白，置于混匀仪器上混合1小时；
混合结束后，在4℃条件下离心，弃去上清液，加入含1％的牛血清白蛋白，通过超声细胞粉碎机超声处理。
7.根据权利要求1所述的时空分辨光学信号编码方法，其特征在于：S5、长余辉检测探针制备，具体包括如下步骤：
首先，将长余辉材料、表面活性剂以及羧甲基纤维素混合；
随后，向其中加入水与四氢呋喃的混合溶液，其中水体积分数为85％，通过超声细胞粉碎机超声处理，将得到的溶液反复清洗后重悬于适量的去离子水中，再次通过细胞破碎仪超声处理30分钟；
随后，取一定量的上述制得的溶液并向其中加入适量的MES溶液，在4℃条件下离心，弃去上清液加入MES溶液，通过超声细胞粉碎机超声处理，向其中加入EDC和NHS溶液置于混匀仪器上混合1小时，在4℃条件下离心，弃去上清液，向其中加入PBS溶液，通过超声细胞粉碎机超声处理；
随后，加入待连接的抗体，置于混匀仪器上混合2小时，在4℃条件下离心，弃去上清液后，向其中加入PBS溶液，通过超声细胞粉碎机超声处理，再加入含有10％的牛血清白蛋白，置于混匀仪器上混合1小时；
混合结束后，在4℃条件下离心，弃去上清液，加入含1％的牛血清白蛋白，通过超声细胞粉碎机超声处理。
8.根据权利要求7所述的时空分辨光学信号编码方法，其特征在于：长余辉材料、表面活性剂以及羧甲基纤维素的比例为10∶2∶1。
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|---|---|---|---|
| CN202311202477.3A CN117233377A (zh) | 2023-09-18 | 2023-09-18 | 时空分辨光学信号编码方法 |
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| CN117233377A true CN117233377A (zh) | 2023-12-15 |
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| CN (1) | CN117233377A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117969483A (zh) * | 2024-03-29 | 2024-05-03 | 之江实验室 | 一种三维荧光组织光学仿体 |
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2023
- 2023-09-18 CN CN202311202477.3A patent/CN117233377A/zh active Pending
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| CN117969483A (zh) * | 2024-03-29 | 2024-05-03 | 之江实验室 | 一种三维荧光组织光学仿体 |
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