CN110658177B - 一种苯酚识别sers探针及其制备、应用和基于sers通用超灵敏免疫分析方法 - Google Patents

一种苯酚识别sers探针及其制备、应用和基于sers通用超灵敏免疫分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种苯酚识别SERS探针及其制备、应用和基于SERS通用超灵敏免疫分析方法。先利用DTDBA还原氯金酸制备一种苯酚响应型SERS探针，然后将ELISA与SERS联用，用ALP标记生物分子，利用ALP水解其底物PPNa产生苯酚，通过苯酚引起的SERS探针信号从而达到灵敏检测生物分子的技术。该技术既能够克服常规酶联免疫分析灵敏度低的缺点，又能够解决SERS检测信号增强和重现性差的问题。本发明具有显著地普适性，可广泛应用于以ALP作为酶标记的免疫分析测定多种生物分子，为基于SERS检测的免疫技术发展打下坚实的基础，在生物、化学检测，医学诊断等领域都有很大的发展空间和广阔的应用前景。

Description

一种苯酚识别SERS探针及其制备、应用和基于SERS通用超灵 敏免疫分析方法
技术领域
本发明属于生物分子检测技术领域，具体涉及一种苯酚识别SERS探针及其制备、应用和基于SERS通用超灵敏免疫分析方法。
背景技术
传统的酶联免疫吸附测定(ELISA)是利用抗原抗体之间专一性键结特性，基于“三明治”策略，设计其键结机制，以酶标记第二抗体分子。利用酶的催化性能使其相应的底物发生颜色或荧光变化，即可显示特定抗原或抗体是否存在，通过测定相应的光学强度变化进行定量分析，对待测物进行检测。但是受限于这些光谱方法的灵敏度，ELISA免疫分析的灵敏度亟待提高，因此该技术较难应用于痕量或超痕量生物分子检测。表面增强拉曼散射(Surface Enhanced Raman Scattering，SERS)是将激光拉曼光谱应用于表面化学研究中发现的一种新的表面光学现象。SERS凭借其超高的灵敏度、独一无二的指纹谱、窄峰宽及无水干扰等特点，成为一种广泛采用的检测手段，可用于痕量分析乃至单分子检测。SERS探针是指单个纳米粒子上修饰拉曼分子，具有灵敏度高、抗光漂白、指纹识别能力强、稳定性好及多重检测等优点，为高灵敏生物分析检测提供了可能。然而，SERS光谱检测仍存在不足，譬如绝大多数采用的基于简单纳米结构的金银或其合金形成的基底，由于缺乏丰富的“热点”区域使得拉曼信号增强不够；此外，SERS基底具有较随机的结构，即便是同批制备的基底，彼此之间的SERS增强因子差别仍可能较大，使得SERS信号的均一性不佳；再者，溶液相中游离态的被检测物在SERS基底上的自发吸附较弱，也将造成拉曼信号较弱。此外，SERS检测时信号无规律波动的问题亟待解决，SERS信号重复性与可靠性有待于提高。
发明内容
为解决现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种苯酚响应型表面增强拉曼散射(SERS)探针的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述方法制得的一种苯酚响应型表面增强拉曼散射(SERS)探针。
本发明的再一目的在于提供上述一种苯酚响应型表面增强拉曼散射(SERS)探针的应用。
本发明的再一目的在于提供一种基于表面增强拉曼散射(SERS)的通用超灵敏ELISA免疫分析方法。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种苯酚响应型表面增强拉曼散射(SERS)探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)将氯金酸水溶液溶于盐酸中，然后加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，冰水浴条件下反应5～20min，加入3-脒基-苯胺(NAAN)，混合均匀，2～8℃下静置反应12～48h，离心洗涤，得到金微米粒子CLMPs；
(2)在冰水浴条件下，将亚硝酸钠加入到2,2'-二硫二苯胺(DTDBA)盐酸水溶液中，反应0.5～2h后，加入四氟硼酸钠，得到2,2'-二硫二苯氮四氟硼酸(DTDBD)，即为特异性识别苯酚的拉曼分子；
(3)将DTDBD溶于溶剂中，加入金微米粒子CLMPs水溶液，混合均匀，在2～8℃孵育0.5～4h后，洗涤，得到DTDBD-CLMPs，即为苯酚响应型表面增强拉曼散射(SERS)探针。
步骤(1)所述氯金酸水溶液的质量浓度为5～25％；所述盐酸的浓度为1mmol/L，所述氯金酸水溶液与盐酸的体积比为1：125；所述盐酸指盐酸水溶液。
步骤(1)所述氯金酸水溶液中的氯金酸、聚乙烯吡咯烷酮和3-脒基-苯胺的质量比为1：(1～3.2)：(2～10)。
步骤(1)所述冰水浴的温度为0～4℃，所述混合均匀的条件为震荡混合10～30min。
步骤(1)所述离心洗涤的条件为：在5000rpm下离心3～10min，离心所用的离心液为N-甲基吡咯烷酮(NMP)。
步骤(1)所述金微米粒子CLMPs分散于水中，并于4℃保存。
步骤(2)所述冰水浴的温度为0～4℃。
步骤(2)所述亚硝酸钠、2,2'-二硫二苯胺盐酸水溶液中2,2'-二硫二苯胺和四氟硼酸钠的摩尔比为1：(0.2～1)：(20～30)。
步骤(2)所述2,2'-二硫二苯胺盐酸水溶液由以下方法制得：将2,2'-二硫二苯胺溶于盐酸中，得到2,2'-二硫二苯胺盐酸水溶液，其中2,2'-二硫二苯胺在盐酸中的浓度为0.03～1.5mol/L，盐酸的浓度为0.5～2mol/L。
步骤(2)所述四氟硼酸钠以饱和四氟硼酸钠水溶液的形式加入。所述饱和四氟硼酸钠水溶液先降温至0～4℃后再加入。
步骤(3)所述DTDBD在溶剂中的浓度为5～30mmol/L；所述金微米粒子CLMPs水溶液中金微米粒子CLMPs的含量为50～200个/mL。
步骤(3)所述溶剂为二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、乙醇、甲醇中的至少一种。
步骤(3)所述DTDBD摩尔量和金微米粒子CLMPs水溶液中金微米粒子CLMPs的个数比为(2.5×10-3～6×10-2)mmol：1个。
步骤(3)所述洗涤采用二甲基甲酰胺(DMF)进行。
步骤(3)所述苯酚响应型表面增强拉曼散射(SERS)探针分散于水中得到SERS探针水溶液，并于4℃保存。
上述方法制得的一种苯酚响应型表面增强拉曼散射(SERS)探针。
上述一种苯酚响应型表面增强拉曼散射(SERS)探针在生物分析与传感检测领域中的应用。
一种基于苯酚响应型表面增强拉曼散射(SERS)探针检测苯酚的方法，包括以下步骤：
将上述SERS探针分散于水溶液中得到SERS探针水溶液，再加入到含苯酚的Na2CO3溶液中，混合均匀，2～8℃静置反应5～30min，离心，洗涤，得到沉淀物，分散于水中，得到待测样品，然后进行SERS检测。
所述SERS探针个数与含苯酚的Na2CO3水溶液中苯酚的质量比为1个：(4.7×10-11～1.88×10-6)g；所述SERS探针水溶液中SERS探针的含量为50～200个/mL；所述含苯酚的Na2CO3水溶液中苯酚的浓度为1×10-10～1×10-3mol/L，Na2CO3的质量浓度为1～20％；所述待测样品中SERS探针的含量为50～200个/mL。
所述离心的转速为1000rpm，时间为15min；所述洗涤指用水洗涤。
所述SERS检测为：取待测样品干燥后进行SERS检测，其条件为：用785nm激光激发，记录单个SERS探针上SERS光谱变化，功率为1mW，累计时间为5～60秒。
一种基于苯酚响应型表面增强拉曼散射(SERS)探针检测碱性磷酸酶(ALP)的方法，包括以下步骤：
将苯基磷酸二钠(PPNa)溶于Tris-HCl缓冲液中，加入ALP溶液，室温下孵育10～30min，加入上述SERS探针，再孵育10～30min，洗涤，得到沉淀物，将其分散于水中得到待测样品，将待测样品滴加在硅片上，干燥，进行SERS检测；
其中，所述PPNa、ALP溶液中的ALP和SERS探针的比例为9.5×10-4mmol：(5×10-6～2.5×10-3)mU：(0.5～2)个；所述PPNa在Tris-HCl缓冲液中的浓度为1mmol/L；所述ALP溶液的浓度为0.1～50mU/L；所述SERS探针以水溶液的形式加入，其中SERS探针的含量为50～200个/mL；所述待测样品中SERS探针的含量为50～200个/mL。
所述Tris-HCl缓冲液的pH为9.8；所述洗涤为用水洗涤；所述干燥的条件为室温下干燥1～3h。
所述SERS检测的条件为：用785nm激光激发，记录单个SERS探针上SERS光谱变化，功率为1mW，累计时间为5～60秒。
一种基于表面增强拉曼散射(SERS)的通用超灵敏ELISA免疫分析方法，包括以下步骤：
(1)将特异性识别抗原分子的第一抗体分子通过孵育固定于孔板基底，由于结合孔板基底的第一抗体分子仍具有免疫活性，加入相应的抗原分子进行免疫反应，然后再加入ALP标记的第二抗体分子，与抗原分子通过免疫反应形成抗原抗体分子键结的免疫反应结构；
(2)将步骤(1)具有免疫反应结构的抗体抗原分子与PPNa溶液混合均匀，室温下孵育5～30min，使第二抗体分子上的ALP分解PPNa产生苯酚，然后加入SERS探针，继续孵育10～30min，最后进行SERS检测；
其中第二抗体分子、抗原分子和特异性识别抗原分子的第一抗体分子均属同一种生物分子，所述生物分子为细菌、细胞、病毒、DNA和RNA中的一种；
所述SERS探针为上述一种苯酚响应型表面增强拉曼散射(SERS)探针。
步骤(2)所述PPNa溶液的浓度为0.5～3mmol/L，溶剂为水。所述PPNa溶液中的PPNa与具有免疫反应结构的抗体抗原分子中的第二抗体分子的质量比为1：(2～10)。所述SERS探针数量和PPNa溶液中PPNa的摩尔量比为1个：(4.5×10-5～1.8×10-4)mmol。
步骤(2)所述SERS探针以SERS探针水溶液的形式加入，所述SERS探针水溶液中SERS探针的含量为50～200个/mL。
步骤(2)所述SERS检测的条件为：用785nm激光激发，记录单个SERS探针上SERS光谱变化，功率为1mW，累计时间为5～60秒。所述用PBS缓冲液洗涤的次数为2～3次。
一种基于苯酚响应型表面增强拉曼散射(SERS)探针的霍乱毒素(CT)酶联免疫检测方法，包括以下步骤：
(1)将CT第一抗体分子加入到孔板中，加入含有0.05mol/L碳酸钠的PBS缓冲液，在37℃孵育1～3h后，用PBS缓冲液洗涤，然后加入明胶封闭CT第一抗体分子未覆盖的位点，用PBS缓冲液洗涤，再加入CT抗原溶液，在37℃孵育0.5～2小时，除去未反应的CT抗原溶液并用PBS缓冲液洗涤，再加入ALP标记的CT第二抗体分子，在37℃孵育1～3h后，用PBS缓冲液洗涤，得到具有酶联免疫典型结构的CT抗原抗体键结结构；
(2)将步骤(1)具有酶联免疫典型结构的CT抗原抗体分子和PPNa溶液混合均匀，室温下孵育5～30min后，加入上述SERS探针，继续孵育10～30min，最后进行SERS检测。
步骤(1)所述CT第一抗体分子在含有0.05mol/L碳酸钠的PBS缓冲液中的浓度为1～50μg/mL；所述CT抗原溶液的溶剂为水，浓度为0.1～100pg/mL。
步骤(1)所述CT第一抗体分子与明胶的质量比1：100～500。所述CT抗原溶液中的CT抗原与CT第一抗体分子的质量比为1：1；所述ALP标记的CT第二抗体分子与CT第一抗体分子的质量比为1：1。
步骤(1)所述用PBS缓冲液洗涤的次数均为2～3次。
步骤(2)所述PPNa溶液中的PPNa与具有酶联免疫典型结构的CT抗原抗体分子中的第二抗体分子的质量比为1：(2～10)。
步骤(2)所述SERS探针个数和PPNa溶液中PPNa的摩尔量比为1个：(4.5×10-5～1.8×10-4)mmol。所述PPNa溶液的浓度为0.5～3mmol/L，溶剂为水。所述SERS探针以SERS探针水溶液的形式加入，所述SERS探针水溶液中SERS探针的含量为50～200个/mL。
步骤(2)所述SERS检测的条件为：用785nm激光激发，记录单个SERS探针上SERS光谱变化，功率为1mW，累计时间为5～60秒。所述用PBS缓冲液洗涤的次数为2～3次。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
1、本申请制备具有“卷心菜”状结构的金颗粒自组装体(SERS基底)，其拥有大量拉曼增强“热点”，可显著增强SERS信号，又可实现单个SERS探针检测，解决了传统SERS基底不均匀所造成的测量信号不均一的问题，极大提高检测重现性。
2、本申请合成高特异性苯酚识别的拉曼分子，该分子中含有叠氮基团，可与苯酚形成偶氮类化合物，通过拉曼指纹在1141cm-1处的峰强度信息，能体现准确地获得生成偶氮苯的含量数量，从而获得苯酚的浓度，且DTDBD分子中的二硫键可和金基底形成Au-S键，从而保证DTDBD的稳定性，可实现苯酚类物质的高灵敏SERS检测。
3、本申请将制得的苯酚响应性SERS探针用于ALP的高灵敏检测，ALP能高效地催化其底物PPNa水解导致其磷酸基团的失去，从而生成苯酚。因此通过SERS技术对所产生的苯酚的浓度测定可灵敏检测ALP。
4、本申请将ELISA与SERS联用用于CT的高灵敏检测，基于ELISA中的“三明治”检测策略，采用ALP作为抗体标记物，将抗体固定于孔板表面，捕获溶液中抗原，再结合ALP标记的第二抗体分子，利用ALP水解其底物PPNa产生苯酚，通过苯酚引起的SERS探针信号的改变，可灵敏检测抗原-霍乱毒素CT。由于临床上测定ALP主要用于骨骼、肝胆系统疾病的诊断，且CT检测是霍乱病因诊断的重要依据，本发明具有巨大的临床应用潜力。
5、本申请将制得的SERS探针用于检测免疫分析，具有极高的普适性，基于ELISA原理，通过改变酶标记物，利用高灵敏的SERS技术检测其相应的抗原分子，实现多样性，使得该技术具有通用性，可广泛用于检测多种生物分子，如细菌、细胞、病毒、DNA和RNA等临床应用潜力。
6、本申请所述表面增强拉曼光谱谱峰较窄，具有较强的分辨率及高灵敏度，将酶联免疫分析方法与SERS检测技术相结合，使得二者互补，既极大地提高了ELISA的灵敏度，又有效解决了SERS信号强度和重现性问题，开发出一种基于SERS的通用超灵敏的免疫分析技术，为两种技术的发展都提供了新的机遇。
7、本申请将SERS检测技术和ELISA检测技术相结合，在生物、化学检测，医学诊断等领域都有很大的发展空间和广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例1制得的金微米粒子CLMP的扫描电镜图。
图2为实施例1制得的SERS探针颗粒的光学显微镜图。
图3为本申请DTDBD的合成路线以及检测反应机理路线图，其中(a)为特异性识别苯酚的DTDBD的合成路线图，(b)为DTDBD与苯酚通过偶氮偶联反应机理线路图，(c)为DTDBD在CLMP表面上自组装形成DTDBD-CLMP以及其与苯酚反应示意图。
图4为实施例1制得的DTDBD-CLMP的SERS光谱以及实施例2中DTDBD-CLMP和与苯酚反应后生成的偶氮苯-CLAMP的SERS光谱。
图5为实施例2中DTDBD-CLMP与不同浓度的苯酚孵育后的SERS光谱。
图6为实施例2中偶氮苯-CLMP在1141cm-1处的SERS峰强度与苯酚浓度的关系。
图7为实施例3中ALP催化PPNa生成苯酚及其与DTDBD反应生成偶氮苯的机理示意图。
图8为实施例3中DTDBD-CLMP与不同浓度的ALP孵育后的SERS光谱。
图9为实施例3中在1141cm-1处的偶氮苯-CLMP的SERS峰强度与ALP浓度的关系。
图10为实施例4中基于苯酚识别的SERS传感用于CT免疫分析的检测原理示意图。
图11为实施例4中DTDBD-CLMP对不同CT浓度的SERS响应。
图12为实施例4中在1141cm-1处的偶氮苯-CLMP的SERS峰强度与CT浓度的关系。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本申请实施例中未注明的工艺参数，均可见常规方法进行，所用原料均可通过商业渠道获得。
本申请实施例所述SERS测试的条件为：使用785nm激光激发，记录单个CLMP上的SERS光谱，功率为1mW，总累计时间为10秒。每个样品，测量时分别获得10个CLMP的SERS光谱用于标准偏差计算。
本申请实施例中所述CLMP水溶液、探针水溶液的浓度均指1mL水中含有CLMP或探针的个数(数量)。
实施例1
(1)“卷心菜”结构金微米颗粒的合成
将8μL质量浓度为10％的氯金酸水溶液溶于1mL浓度为1mmol/L的盐酸中，加入1.6mg PVP，放置在冰水中10分钟，再加入40μL 100mg/mL NAAN盐酸水溶液，震荡20分钟后在4℃下静置反应24小时；在5000rpm下离心10min，离心后用NMP洗涤，得到金微米粒子CLMP，然后分散于水中得到浓度为100个/mL的CLMP水溶液，4℃保存备用。所制备的“卷心菜”结构金微米颗粒CLMP的形貌如图1所示。
(2)特异性识别苯酚的拉曼分子的合成
将2.82mmol(700mg)DTDBA溶于40mL浓度为1mol/L的HCl中，在冰水(0℃)浴中冷却，然后边搅拌边加入2mL浓度为3.1mmol/mL的亚硝酸钠水溶液，冰水浴中持续搅拌1小时后，在搅拌状态下向上述混合液中加入15mL冷却的饱和四氟硼酸钠水溶液(即浓度为108g/100mL)，反应10分钟得到的沉淀即为DTDBD；过滤后用乙腈/二乙基乙基重结晶，将最终产物在50℃真空干燥24h并储存在冰箱中备用。
DTDBD的分子结构及其合成路线如图3所示，制得的DTDBD具有两个官能团：1)重氮离子可通过偶氮偶合反应与苯酚特异反应形成偶氮苯(见图3b)；2)二硫化物基团有利于在CLMP中形成过程中DTDBD与Au纳米片形成稳固的Au-S共价键。
(3)苯酚响应的SERS探针的合成
将3.7mg步骤(2)中生成的DTDBD溶于1mL DMF中，加入10μL步骤(1)的CLMP水溶液，混合均匀得到混合液，将混合溶液在冰箱(4℃)中静置反应2小时，反应产物用DMF洗涤后分散于水中形成DTDBD-CLMP水溶液，该水溶液中DTDBD-CLMP的含量为100个/mL，即为SERS探针水溶液。DTDBD-CLMP在二氧化硅晶片上的光学显微镜图如图2所示，DTDBD-CLMP的SERS光谱(见图4中曲线1)显示分别位于1078cm-1和1590cm-1的苯基的两个强拉曼峰，表明CLMP携带大量DTDBD分子。
实施例2
一种苯酚的SERS检测方法。
将10μL实施例1制得的SERS探针水溶液分别加入到1mL含有不同浓度苯酚的Na2CO3水溶液中，所述Na2CO3水溶液中苯酚的浓度分别为1×10-9mol/L、5×10-9mol/L、1×10-8mol/L、5×10-8mol/L、1×10-7mol/L、5×10-7mol/L、1×10-6mol/L、1×10-5mol/L、1×10-3mol/L，所述Na2CO3水溶液的质量浓度为5％，然后均在4℃下孵育15min，收集探针并用水洗涤，得到沉淀物再分散于水中(其中SERS探针的含量为100个/mL)，得到待测样品，吸取一滴待测样品在室温下干燥2h后进行SERS测量。
DTDBD-CLMP与Na2CO3水溶液中的苯酚(浓度为1mmol/L)孵育后，DTDBD与苯酚反应生成偶氮苯，在1141cm-1、1391cm-1和1438cm-1处均产生新拉曼峰(见图4中的曲线2)。不同浓度的苯酚Na2CO3水溶液与DTDBD-CLMP反应后所得SERS光谱显示，与1078cm-1处基本不变的SERS峰强度相比，位于1141cm-1处的峰强度随着苯酚浓度的增加而增强，表现出特征的被测物浓度依赖性特征(见图5)。结果表明该SERS探针对于苯酚浓度线性响应从1×10-9mol/L增加到5×10-7mol/L，基于LOD＝3×δ/m，理论检测限(LOD)计算为0.4×10-9mol/L，其中δ是最低测试浓度(此处为1nmol/L)的响应的标准偏差，m为浓度依赖性响应的斜率(见图6)。
本实施例所提出的苯酚响应型SERS传感器可高灵敏度检测苯酚，其性能优于现有技术所述苯酚的检测方法(见表1)。
表1 本实施例所述方法与其他苯酚检测方法的对比
Figure BDA0002213917090000111
电化学/酪氨酸酶N.Li,M.H.Xue,H.Yao,J.J.Zhu,Anal.Bioanaly.Chem.,2005,383,1127.
聚丙烯酰胺微凝胶/电化学J.P.Hervás Pérez,M.Sánchez-Paniagua López,E.López-Cabarcos,B.López-Ruiz,Biosens.Bioelectron.,2006,22,429.
氧化石墨烯–氧化锌/电化学T.Arfin,S.N.Rangari,Anal.Methods,2018,10,347.
碳纳米管/聚乙烯亚胺/电化学A.S.Arribas,E.Bermejo,M.Chicharro,A.Zapardiel,G.L.Luque,N.F.Ferreyra,G.A.Rivas,Anal.Chim.Acta,2007,596,183.
光学/酪氨酸酶J.Abdullah,M.Ahmad,N.Karuppiah,L.Y.Heng,H.Sidek,Sensor.Actuat.B:Chem.,2006,114,604.
实施例3
一种ALP的SERS检测方法
分别向950μL含浓度为1mmol/L PPNa的Tris-HCl缓冲液(pH 9.8)中，加入50μL不同浓度(分别为0.1mU/L、0.5mU/L、1mU/L、5mU/L、10mU/L、50mU/L)的ALP水溶液。室温下孵育20分钟，分别加入10μL实施例1制得的SERS探针水溶液，在室温下孵育15min。用水洗涤后，所得沉淀物分散于水中，得到待测样品(其中SERS探针的含量为100个/mL)，吸取一滴待测样品滴加在硅晶片上，在室温下干燥2h后进行SERS测量。
本实施例反应机理及检测结果如图7、8、9所示。1141cm-1处SERS峰强度明显随ALP浓度的增加而持续增强(见图8)。根据本实施例的方法，ALP的检出限为0.04mU/L，线性范围为0.1～50mU/L(见图9)。
本实施例所提出的SERS检测方法可高灵敏度检测ALP，其性能优于现有技术所述ALP的检测方法(见表2)。
表2本实施例所述方法与其他ALP检测方法的比较
Figure BDA0002213917090000121
电化学发光H.Jiang,X.Wang,Anal.Chem.,2012,84,6986.
比色/有机金属骨架C.Wang,J.Gao,Y.Cao,H.Tan,Anal.Chim.Acta,2018,1004,74.
SERS J.Zhang,L.He,X.Zhang,J.Wang,L.Yang,B.Liu,C.Jiang,Z.Zhang,SensorActuat.B Chem.,2017,253,839.
实施例4
一种CT的SERS检测方法
先将100μL含有0.05mol/L碳酸钠的CT第一抗体分子PBS缓冲液加入到96孔板中，其中CT第一抗体分子(Anti-Cholera Toxin antibody(ab123129)，购买于艾博抗(上海)贸易公司)的浓度为10μg/mL，在37℃孵育2小时，随后用PBS缓冲液洗涤3次，并加入过量明胶封闭抗体未覆盖的位点(CT第一抗体分子与明胶的质量比1：200)，然后再用PBS缓冲液洗涤除去过量的明胶，随后分别在不同的孔板中注入不同浓度的CT抗原(Cholera Toxin fromVibrio cholera(c8052)购买自西格玛奥德里奇公司)水溶液各100μL，浓度分别为0.1pg/mL、0.5pg/mL、1pg/mL、5pg/mL、10pg/mL、50pg/mL、100pg/mL，37℃反应1小时后，用PBS缓冲液洗涤3次移去未反应的CT抗原溶液；再加入100μL浓度为1mg/mL ALP标记的CT第二抗体分子(Anti-Cholera Toxin antibody(ALP)，购买于艾博抗(上海)贸易公司)水溶液，并在37℃温育1小时后用PBS缓冲液洗涤以清除过量的CT第二抗体分子；然后分别将90μL浓度为1mmol/L的PPNa水溶液注入上述含CT第一抗体分子、抗原和第二抗体分子的孔板中，室温下孵育20分钟后分别加入实施例1制得的SERS探针水溶液10μL，混合均匀得到混合液，室温下孵育15分钟后，取反应产物进行测量SERS光谱，通过测定单个SERS光谱上的拉曼信号变化计算检测线性范围和检出限。ELISA CT传感检测机制如图10所示。
CT检测结果如图11、12所示。结果表明SERS探针可灵敏响应CT的存在(见图11)，且1141cm-1处的SERS峰强度随着CT浓度的增加而逐渐增加，CT浓度线性响应从8.3×10-14mol/L(0.1pg/mL)增加到8.3×10-12mol/L(10pg/mL)(见图12)。此外，采用标准加入法对血清样品中CT回收率进行测定，以评估本实施例提供的CT测定方法的可靠性。向空白血清样品中分别加入不同浓度的标准CT样品(使其在血清样品中的最终浓度分别为0.5pg/mL、1pg/mL和5pg/mL，其溶剂为水)，进行SERS测试。SERS测量结果表明CT回收率在98.8～103.3％范围内，相对标准偏差(RSD)小于5.6％(n＝3)(见表3)。这表明本实施例提供的基于SERS的免疫分析技术可高灵敏检测CT，且将ALP标记物替换为其他抗原，该技术均可应用于多种生物待测物的检测，在生物分析和疾病诊断中具有广阔的应用前景。
表3 基于SERS的免疫分析技术检测血清样本中CT含量
Figure BDA0002213917090000141
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于表面增强拉曼散射的通用超灵敏ELISA免疫分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将特异性识别抗原分子的第一抗体分子通过孵育固定于孔板基底，由于结合孔板基底的第一抗体分子仍具有免疫活性，加入相应的抗原分子进行免疫反应，然后再加入ALP标记的第二抗体分子，与抗原分子通过免疫反应形成抗原抗体分子键结的免疫反应结构；
（2）将步骤（1）具有免疫反应结构的抗体抗原分子与PPNa溶液混合均匀，室温下孵育5～30min，使第二抗体分子上的ALP分解PPNa产生苯酚，然后加入SERS探针，继续孵育10～30min，最后进行SERS检测；
其中第二抗体分子、抗原分子和特异性识别抗原分子的第一抗体分子均属同一种生物分子，所述生物分子为细菌、细胞、病毒、DNA和RNA中的一种；
所述SERS探针为苯酚响应型表面增强拉曼散射探针，由以下方法制备得到：
a、将氯金酸水溶液溶于盐酸中，然后加入聚乙烯吡咯烷酮，冰水浴条件下反应5～20min，加入3-脒基-苯胺，混合均匀，2～8℃下静置反应12～48h，离心洗涤，得到金微米粒子CLMPs；
b、在冰水浴条件下，将亚硝酸钠加入到2,2'-二硫二苯胺盐酸水溶液中，反应0.5～2h后，加入四氟硼酸钠，得到2,2'-二硫二苯氮四氟硼酸，即为特异性识别苯酚的拉曼分子；
c、将DTDBD溶于溶剂中，加入金微米粒子CLMPs水溶液，混合均匀，在2～8℃孵育0.5～4h后，洗涤，得到DTDBD-CLMPs，即为苯酚响应型表面增强拉曼散射探针。
2.根据权利要求1所述一种基于表面增强拉曼散射的通用超灵敏ELISA免疫分析方法，其特征在于，步骤（2）所述PPNa溶液的浓度为0.5～3mmol/L，溶剂为水；所述PPNa溶液中的PPNa与具有免疫反应结构的抗体抗原分子中的第二抗体分子的质量比为1：（2～10）；所述SERS探针数量和PPNa溶液中PPNa的摩尔量比为1个：（4.5×10-5～1.8×10-4）mmol；
步骤（2）所述SERS探针以SERS探针水溶液的形式加入，所述SERS探针水溶液中SERS探针的含量为50～200个/mL。
3.根据权利要求1所述一种基于表面增强拉曼散射的通用超灵敏ELISA免疫分析方法，其特征在于，步骤a所述氯金酸水溶液的质量浓度为5～25%；所述盐酸的浓度为1 mmol/L，所述氯金酸水溶液与盐酸的体积比为1：125；
步骤a所述氯金酸水溶液中的氯金酸、聚乙烯吡咯烷酮和3-脒基-苯胺的质量比为1：（1～3.2）：（2～10）；
步骤b所述亚硝酸钠、2,2'-二硫二苯胺盐酸水溶液中2,2'-二硫二苯胺和四氟硼酸钠的摩尔比为1：（0.2～1）：（20～30）；
步骤c所述DTDBD摩尔量和金微米粒子CLMPs水溶液中金微米粒子CLMPs的个数比为（2.5×10-3～6×10-2）mmol：1个。
4.根据权利要求1所述一种基于表面增强拉曼散射的通用超灵敏ELISA免疫分析方法，其特征在于，步骤b所述2,2'-二硫二苯胺盐酸水溶液由以下方法制得：将2,2'-二硫二苯胺溶于盐酸中，得到2,2'-二硫二苯胺盐酸水溶液，其中2,2'-二硫二苯胺在盐酸中的浓度为0.03～1.5 mol/L，盐酸的浓度为0.5～2 mol/L；
步骤b所述四氟硼酸钠以饱和四氟硼酸钠水溶液的形式加入；
步骤c所述DTDBD在溶剂中的浓度为5～30 mmol/L；所述金微米粒子CLMPs水溶液中金微米粒子CLMPs的含量为50～200个/mL；
步骤c所述溶剂为二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙醇、甲醇中的至少一种。
5.一种基于苯酚响应型表面增强拉曼散射探针检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将苯基磷酸二钠溶于Tris-HCl缓冲液中，加入ALP溶液，室温下孵育10～30 min，加入SERS探针，再孵育10～30 min，洗涤，得到沉淀物，将其分散于水中得到待测样品，将待测样品滴加在硅片上，干燥，进行SERS检测；
所述PPNa、ALP溶液中的ALP和SERS探针的比例为9.5×10-4mmol：（5×10-6～2.5×10-3）mU：（0.5～2）个；所述PPNa在Tris-HCl缓冲液中的浓度为1 mmol/L；所述ALP溶液的浓度为0.1～50mU/L；所述SERS探针以水溶液的形式加入，其中SERS探针的含量为50～200个/mL；所述待测样品中SERS探针的含量为50～200个/mL；
所述SERS探针为苯酚响应型表面增强拉曼散射探针，由以下方法制备得到：
a、将氯金酸水溶液溶于盐酸中，然后加入聚乙烯吡咯烷酮，冰水浴条件下反应5～20min，加入3-脒基-苯胺，混合均匀，2～8℃下静置反应12～48h，离心洗涤，得到金微米粒子CLMPs；
b、在冰水浴条件下，将亚硝酸钠加入到2,2'-二硫二苯胺盐酸水溶液中，反应0.5～2h后，加入四氟硼酸钠，得到2,2'-二硫二苯氮四氟硼酸，即为特异性识别苯酚的拉曼分子；
c、将DTDBD溶于溶剂中，加入金微米粒子CLMPs水溶液，混合均匀，在2～8℃孵育0.5～4h后，洗涤，得到DTDBD-CLMPs，即为苯酚响应型表面增强拉曼散射探针。
6.根据权利要求5所述一种基于苯酚响应型表面增强拉曼散射探针检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，步骤a所述氯金酸水溶液的质量浓度为5～25%；所述盐酸的浓度为1mmol/L，所述氯金酸水溶液与盐酸的体积比为1：125；
步骤a所述氯金酸水溶液中的氯金酸、聚乙烯吡咯烷酮和3-脒基-苯胺的质量比为1：（1～3.2）：（2～10）；
步骤b所述亚硝酸钠、2,2'-二硫二苯胺盐酸水溶液中2,2'-二硫二苯胺和四氟硼酸钠的摩尔比为1：（0.2～1）：（20～30）；
步骤c所述DTDBD摩尔量和金微米粒子CLMPs水溶液中金微米粒子CLMPs的个数比为（2.5×10-3～6×10-2）mmol：1个。
7.根据权利要求5所述一种基于苯酚响应型表面增强拉曼散射探针检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于，步骤b所述2,2'-二硫二苯胺盐酸水溶液由以下方法制得：将2,2'-二硫二苯胺溶于盐酸中，得到2,2'-二硫二苯胺盐酸水溶液，其中2,2'-二硫二苯胺在盐酸中的浓度为0.03～1.5 mol/L，盐酸的浓度为0.5～2 mol/L；
步骤b所述四氟硼酸钠以饱和四氟硼酸钠水溶液的形式加入；
步骤c所述DTDBD在溶剂中的浓度为5～30 mmol/L；所述金微米粒子CLMPs水溶液中金微米粒子CLMPs的含量为50～200个/mL；
步骤c所述溶剂为二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙醇、甲醇中的至少一种。
8.一种基于苯酚响应型表面增强拉曼散射探针的霍乱毒素酶联免疫检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将CT第一抗体分子加入到孔板中，加入含有0.05 mol/L碳酸钠的PBS缓冲液，在37℃孵育1～3 h后，用PBS缓冲液洗涤，然后加入明胶封闭CT第一抗体分子未覆盖的位点，用PBS缓冲液洗涤，再加入CT抗原溶液，在37℃孵育0.5～2小时，除去未反应的CT抗原溶液并用PBS缓冲液洗涤，再加入ALP标记的CT第二抗体分子，在37℃孵育1～3 h后，用PBS缓冲液洗涤，得到具有酶联免疫典型结构的CT抗原抗体键结结构；
（2）将步骤（1）具有酶联免疫典型结构的CT抗原抗体分子和PPNa溶液混合均匀，室温下孵育5～30min后，加入SERS探针，继续孵育10～30 min，最后进行SERS检测；
步骤（1）所述CT第一抗体分子在含有0.05 mol/L碳酸钠的PBS缓冲液中的浓度为1～50μg/mL；所述CT抗原溶液的溶剂为水，浓度为0.1～100pg/mL；
步骤（1）所述CT第一抗体分子与明胶的质量比1：100～500；所述CT抗原溶液中的CT抗原与CT第一抗体分子的质量比为1：1；所述ALP标记的CT第二抗体分子与CT第一抗体分子的质量比为1：1；
步骤（2）所述PPNa溶液中的PPNa与具有酶联免疫典型结构的CT抗原抗体分子中的第二抗体分子的质量比为1：（2～10）；所述SERS探针个数和PPNa溶液中PPNa的摩尔量比为1个：（4.5×10-5～1.8×10-4）mmol；所述PPNa溶液的浓度为0.5～3mmol/L，溶剂为水；所述SERS探针以SERS探针水溶液的形式加入，所述SERS探针水溶液中SERS探针的含量为50～200个/mL；
所述SERS探针为苯酚响应型表面增强拉曼散射探针，由以下方法制备得到：
a、将氯金酸水溶液溶于盐酸中，然后加入聚乙烯吡咯烷酮，冰水浴条件下反应5～20min，加入3-脒基-苯胺，混合均匀，2～8℃下静置反应12～48h，离心洗涤，得到金微米粒子CLMPs；
b、在冰水浴条件下，将亚硝酸钠加入到2,2'-二硫二苯胺盐酸水溶液中，反应0.5～2h后，加入四氟硼酸钠，得到2,2'-二硫二苯氮四氟硼酸，即为特异性识别苯酚的拉曼分子；
c、将DTDBD溶于溶剂中，加入金微米粒子CLMPs水溶液，混合均匀，在2～8℃孵育0.5～4h后，洗涤，得到DTDBD-CLMPs，即为苯酚响应型表面增强拉曼散射探针。
9.根据权利要求8所述一种基于苯酚响应型表面增强拉曼散射探针的霍乱毒素酶联免疫检测方法，其特征在于，步骤a所述氯金酸水溶液的质量浓度为5～25%；所述盐酸的浓度为1 mmol/L，所述氯金酸水溶液与盐酸的体积比为1：125；
步骤a所述氯金酸水溶液中的氯金酸、聚乙烯吡咯烷酮和3-脒基-苯胺的质量比为1：（1～3.2）：（2～10）；
步骤b所述亚硝酸钠、2,2'-二硫二苯胺盐酸水溶液中2,2'-二硫二苯胺和四氟硼酸钠的摩尔比为1：（0.2～1）：（20～30）；
步骤c所述DTDBD摩尔量和金微米粒子CLMPs水溶液中金微米粒子CLMPs的个数比为（2.5×10-3～6×10-2）mmol：1个。
10.根据权利要求8所述一种基于苯酚响应型表面增强拉曼散射探针的霍乱毒素酶联免疫检测方法，其特征在于，步骤b所述2,2'-二硫二苯胺盐酸水溶液由以下方法制得：将2,2'-二硫二苯胺溶于盐酸中，得到2,2'-二硫二苯胺盐酸水溶液，其中2,2'-二硫二苯胺在盐酸中的浓度为0.03～1.5 mol/L，盐酸的浓度为0.5～2 mol/L；
步骤b所述四氟硼酸钠以饱和四氟硼酸钠水溶液的形式加入；
步骤c所述DTDBD在溶剂中的浓度为5～30 mmol/L；所述金微米粒子CLMPs水溶液中金微米粒子CLMPs的含量为50～200个/mL；
步骤c所述溶剂为二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙醇、甲醇中的至少一种。
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Ge et al. Ultra-sensitive magnetic immunoassay of HE4 based on surface enhanced Raman spectroscopy

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