CN113136417A - 用于检测肺癌标志物的金纳米笼sers传感器及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于同时检测两种肺癌标志物miR‑21和miR‑196a‑5p的金纳米笼SERS传感器的制备方法，该方法包括1)采集和处理尿液样本；2)利用一锅法制备金纳米笼(GNCs)；3)步骤2)制备得到的金纳米笼的表面分别标记拉曼信号分子4‑MBA和DTNB，接着分别修饰生物素标记的发卡H1‑bio‑1和H1‑bio‑2，形成两种SERS标记；4)设计并构建了基于催化发卡自组装(CHA)信号放大的试纸条传感器。本发明具有灵敏度高、特异性强、组装过程简单、检测速度快等优点。

Description

用于检测肺癌标志物的金纳米笼SERS传感器及其制备方法
技术领域
本发明属于材料技术领域，涉及一种SERS传感器及其制备方法，尤其涉及一种用于检测肺癌标志物miR-21和miR-196a-5p的金纳米笼SERS传感器及其制备方法。
背景技术
肺癌的发病率及病死率近年来逐渐上升，肺癌已成为全球死亡率最高的恶性肿瘤之一。据报道，2018年肺癌占确诊癌症病例总数的11.6％，占癌症死亡总人数的18.4％，这也是男性癌症死亡的主要原因。肺癌发展到晚期才会表现出明显的临床症状，大部分肺癌通常在无法手术的疾病晚期才被发现，导致患者生存率普遍较差。因此，通过各种方法进行肺癌的早期筛查十分必要。此外，发展出一种肺癌生物标志物定量分析的新方法是肺癌早期诊断和有效治疗的关键。由于单一生物标志物检测在高度复杂的病理环境下的特异性和敏感性较低，采用多个生物标志物同时检测以提高检出的效率和准确性，已成为当前肺癌诊断的关键。
MicroRNAs(miRNAs)是一类非编码RNA，在多种生物过程的调控中发挥重要作用，包括肿瘤细胞的迁移、侵袭、转移和凋亡。最近有报道称miR-21在肺癌中是一种致癌miRNA，并且在肺癌中显著上调。在这种情况下，miR-21可以被视为检测肺癌的生物标志物。最近的一项研究表明，miR-196a-5p可能在肺癌进展中起到促进肿瘤的作用，并且miR-196a-5p在肺癌组织中显著上调。因此miR-196a-5p也可以作为肺癌检测的生物标志物。各种检测肿瘤相关miRNAs的策略和技术已经被开发出来，如实时聚合酶链反应(qRT-PCR)、Northern杂交法和DNA微阵列(基因芯片)。然而，由于以上这些方法操作复杂、设备成本高、需要专业的技术人员等原因，使其无法广泛应用于癌症诊断。因此，建立一种简便、快速、灵敏的检测miR-21和miR-196a-5p的方法在肺癌的早期筛选中具有重要意义。
在检测平台中，免疫层析(LFA)因其简单、灵活、快速和低成本的优点成为快速筛查的有力工具。迄今为止，LFA已成功用于检测病毒、抗原、蛋白质等物质。但这些LFA试纸灵敏度低，只能提供分析物浓度的定性或半定量结果，限制了其应用。更重要的是，它们通常受到血液成分敏感性差和严重干扰的影响。
为了解决这些问题，有必要寻找一种新的定量分析方法。基于SERS的LFA检测方法就是其中之一。表面增强拉曼光谱(SERS)是一种基于分子在粗糙金属表面吸附的光谱技术，与传统的免疫分析相比，SERS具有相当大的优势。首先，SERS由于其指纹特征，在复杂的样品系统中对分子具有较好的检测精度；其次，SERS具有良好的稳定性和便利性，可以对拉曼信号进行高强度的放大和量化。“热点”可以通过蛋白质和其他分子在纳米颗粒表面的积累而增加。由于电磁和化学的影响，SERS信号在“热点”处大大增强，使得SERS信号比传统的拉曼光谱高出10-14个数量级。因此，SERS被广泛应用于各种分析应用中。基于SERS技术的这些优势，SERS-LFA有望克服传统的SERS技术灵敏度低、测量精度低的问题。已有文献报道，利用SERS-LFA对缓冲液中的蛋白质和核酸进行检测，并取得了丰硕成果。SERS与LFA的结合，使检测条生物传感器能够进行定量检测，在一定程度上提高了检测灵敏度。但对于一些低浓度的靶点，仍不能满足超灵敏检测的要求，因此引入信号放大策略迫在眉睫。催化发卡自组装(CHA)是一种新型的miRNA信号放大手段，无需酶催化，在室温下无需扩增设备即可进行。在CHA反应中，两条发卡DNA互补，嵌入到茎环内的互补区域限制了其自发杂交，使它们在溶液中可以稳定存在。当有引发链存在时，支点会引发链置换反应，打开其中一条DNA链的发卡结构，进而引发两条发卡DNA链的组装，置换出来的miRNA继续引发下一轮杂交反应，从而使检测信号得到放大。
SERS检测miR-21和miR-196a-5p的技术真正走入临床应用还面临诸多需要解决的难题。首要问题是制备表面增强性能优异便于使用、易于制备、均一且可重复性好，具有较好的生物相容性的SERS基底。具有中空内部和多孔壁的金纳米笼(GNCs)是一种新型的、极有前景的等离子体共振材料。由于腔体的内壁和穿透墙，GNCs在内壁和外壁之间具有优越的耦合电磁场，这是由于内外表面场的耦合，导致强烈的光吸收，拉曼信号增强。另一方面，GNCs中空的内部可以容纳更多的信号分子。此外，GNCs具有巨大的比表面积，可以为更多的信号分子提供更多的附着位点，导致强烈的信号增强，从而提高SERS的灵敏度。目前合成金纳米笼的方法相对复杂、所需时间长、所需成本高，发展一种简单快速方法仍是一项具有挑战性的工作。将金纳米笼基底的SERS效应和LFA检测方法相结合，用于miR-21和miR-196a-5p的研究在国内尚无相关报道。既往SERS对肺癌的研究多数集中在CEA、NSE、CK-19等蛋白质类相关指标，涉及miRNA相关的研究也鲜有报道。
发明内容
为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种灵敏度高、特异性强、组装过程简单、检测速度快的用于检测肺癌标志物miR-21和miR-196a-5p的金纳米笼SERS传感器及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明首先提供了一种用于检测肺癌标志物miR-21和miR-196a-5p的金纳米笼SERS传感器，该传感器将金纳米笼基底的SERS效应和LFA检测方法相结合，用于miR-21和miR-196a-5p的检测。
其次，本发明还提供了一种用于检测肺癌标志物miR-21和miR-196a-5p的金纳米笼SERS传感器的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)采集和处理尿液样本；
(2)利用一锅法制备金纳米笼；
(3)将步骤(2)制备得到的金纳米笼的表面分别标记拉曼信号分子4-MBA和DTNB，接着分别修饰生物素标记的发卡H1-bio-1和H1-bio-2，形成两种SERS标记；
(4)设计并构建基于催化发卡自组装(CHA)信号放大的试纸条传感器；
其中，步骤(1)的具体实现方式为：
将尿液样本分为健康人群和NSCLC患者组，在早餐前采集3-10mL新鲜尿液，将获得的尿液样本立即冷冻保存；
其中，步骤(2)的具体实现方式为：
将1-5mLHAuCl4溶液(0.5-1M)一次性加到不断搅拌的1-5mLHMT溶液(0.01-0.05M)中，接着将1-5mL PVP溶液(0.10-0.50M)和5-15μLAgNO3溶液(0.005-0.02M)加入混合溶液中，直到溶液变为无色透明，在持续搅拌10-60s后，加入5-20μLAA溶液(0.05-0.1M)继续搅拌约10-30min，上述混合溶液在室温下保存5-20h，最后将金纳米笼分别用乙醇和超纯水离心后分散在超纯水中，将金纳米笼溶液存放在4℃冰箱中待用，用于后续SERS标记的制备；
其中，步骤(3)的具体实现方式为：
(3)-1)在SERS标记合成过程中，使用4-MBA和DTNB作为拉曼信号分子，4-MBA和DTNB可以通过Au-S键偶联到金纳米笼表面，将30-80μL 1mM的4-MBA乙醇溶液加入到0.5-3mL步骤1)所合成的金纳米笼溶液中，搅拌10-50min后得到GNCs@4-MBA溶液溶液，然后用同样的方法获得DTNB标记的GNCs(GNCs@DTNB)；
(3)-2)将10-30μL 0.5mM的H1-bio-1(或者是H1-bio-2)与20-50μL新鲜制备的0.5-2mM的TCEP缓冲液混合1-3h，用于活化H1-bio-1(或者是H1-bio-2)；然后，将活化后的H1-bio-1(或者是H1-bio-2)与0.5-2mL GNCs@4-MBA溶液(或者是GNCs@DTNB溶液)混合10-18h，得到了GNCs@4-MBA@H1-bio-1溶液(或者是GNCs@4-MBA@H1-bio-1溶液)；同时利用EDC和NHS作为偶联剂激活4-MBA和DTNB表面的-COOH，活化后的-COOH会与MIgG表面的-NH2结合；向上述溶液里加入20-50μL EDC溶液(150mM)和20-50μLNHS溶液(20-50mM)，接着加入50-200μLMIgG溶液(5-10μg/μL)，接着在37℃下搅拌1-8h，最终制备得到GNCs@4-MBA@H1-bio-1@MIgG溶液(或GNCs@DTNB@H1-bio-2@MIgG溶液)；
(3)-3)接着加入2-20μL牛血清白蛋白溶液(30-80μg/mL)，孵育0.5-3h，阻断羧基多余的结合位点，然后离心5-20min，加入用0.01M PBS缓冲液溶解的2-20μLNaCl溶液(2-8M)，使NaCl溶液在混合溶液中的浓度逐渐变为0.2-1M，将沉淀溶解在PBS溶液中供进一步使用,最终得到两种SERS标记；
其中，步骤(4)的具体实现方式为：
(4)-1)本发明中使用的试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜(NC膜)、吸水垫和底板，在组装试纸条之前，样品垫需要预处理，在含0.1-0.4％Triton X-100的Tris HCl溶液(40-60mM)和NaCl溶液(100-200mM)中浸泡，然后在37℃的烘箱中干燥1-3h，然后，把上述样品垫切条带；
(4)-2)将2-5μL的SERS标记(GNCs@4-MBA@H1-bio-1@MIgG和GNCs@DTNB@H1-bio-2@MIgG，比例为1:1)滴在共轭垫上，37℃烘干1-3h；
(4)-3)将2-6μLH2-bio-1溶液(0.01mM)，2-6μLH2-bio-2溶液(0.01mM)和5-20μLSA溶液(0.3mg/mL)喷点于测试线上形成T线，同样在NC膜控制线喷上1-3μL GMIgG(1:50稀释比例)形成C线，接着将NC膜在37℃干燥10-60min；
(4)-4)最后将样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫依次粘贴到底板上，为了确保实验过程中缓冲液可以连续流动，每个相邻的部分都有1-3mm的重叠，制备好的试纸条放于4℃干燥处避光保存；
优选地，步骤(1)的具体实现方式为：
尿液样本分为健康人群和NSCLC患者组，在早餐前采集5mL新鲜尿液，将获得的尿液样本立即冷冻并保存在-80℃冰箱里；
优选地，步骤(2)的具体实现方式为：
将3mLHAuCl4溶液(0.75M)一次性加到不断搅拌的3mLHMT溶液(0.03M)中；接着将3mLPVP溶液(0.30M)和10μLAgNO3溶液(0.01M)加入混合溶液中，直到溶液变为无色透明，在持续搅拌30s后，加入10μLAA溶液(0.08M)继续搅拌约20min，上述混合溶液在室温下保存12h，最后将金纳米笼分别用乙醇和超纯水离心洗涤3次后分散在超纯水中，将金纳米笼溶液存放在4℃冰箱中待用，用于后续SERS标记的制备；
优选地，步骤(3)的具体实现方式为：
(3)-1)在SERS标记合成过程中，使用4-MBA和DTNB作为拉曼信号分子；4-MBA和DTNB可以通过Au-S键偶联到金纳米笼表面；将50μL 1mM的4-MBA乙醇溶液加入到1mL步骤1)所合成的金纳米笼溶液中，搅拌30min后得到GNCs@4-MBA溶液溶液；然后用同样的方法获得DTNB标记的GNCs(GNCs@DTNB)；
(3)-2)将20μL 0.5mM的H1-bio-1(或者是H1-bio-2)与30μL新鲜制备的1.5mM的TCEP缓冲液混合1.5h，用于活化H1-bio-1(或者是H1-bio-2)，然后将活化后的H1-bio-1(或者是H1-bio-2)与1mL GNCs@4-MBA溶液(或者是GNCs@DTNB溶液)混合12h，得到了GNCs@4-MBA@H1-bio-1溶液(或者是GNCs@4-MBA@H1-bio-1溶液)，同时利用EDC和NHS作为偶联剂激活4-MBA和DTNB表面的-COOH，活化后的-COOH会与MIgG表面的-NH2结合，向上述溶液里加入30μL EDC溶液(150mM)和30μLNHS溶液(30mM)，接着加入100μLMIgG溶液(8μg/μL)，接着在37℃下搅拌大约4h，最终制备得到GNCs@4-MBA@H1-bio-1@MIgG溶液(或者是GNCs@DTNB@H1-bio-2@MIgG溶液)；
(3)-3)接着加入10μL牛血清白蛋白溶液(50μg/mL)，孵育1h，阻断羧基多余的结合位点；然后以10000r的转速离心15min；加入用0.01M PBS缓冲液溶解的10μLNaCl溶液(5M)，使NaCl溶液在混合溶液中的浓度逐渐变为0.4M，将沉淀溶解在PBS溶液中供进一步使用，最终得到两种SERS标记；
优选地，步骤(4)的具体实现方式为：
(4)-1)本发明中使用的试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜(NC膜)、吸水垫和底板，在组装试纸条之前，样品垫需要预处理，在含0.25％Triton X-100的Tris HCl溶液(50mM)和NaCl溶液(150mM)中浸泡，然后在37℃的烘箱中干燥2h，然后，用切纸机把上述样品垫切成4mm宽的条带；
(4)-2)将4μL的SERS标记(GNCs@4-MBA@H1-bio-1@MIgG和GNCs@DTNB@H1-bio-2@MIgG，比例为1:1)滴在共轭垫上，37℃烘干2h；
(4)-3)将4μLH2-bio-1溶液(0.01mM)，4μLH2-bio-2溶液(0.01mM)和10μL SA溶液(0.3mg/mL)喷点于测试线上形成T线，同样在NC膜控制线喷上2μL GMIgG(1:50稀释比例)形成C线，接着将NC膜在37℃干燥30min；
(4)-4)最后将样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫依次粘贴到底板上，为了确保实验过程中缓冲液可以连续流动，每个相邻的部分都有约2mm的重叠，制备好的试纸条放于4℃干燥处避光保存。
再次，本发明还提供了一种利用上述检测肺癌标志物miR-21和miR-196a-5p的金纳米笼SERS传感器检测待检测样本中miR-21和miR-196a-5p的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
(1)试纸条实验在PBS缓冲溶液中进行，将稀释后的样品溶液滴在条带的样品垫上，H1-bio-1(或H1-bio-2)修饰后的GNCs@4-MBA(或GNCs@DTNB)被预先固定在T线上的SA捕获，用SERS技术对T线上的SERS标记进行检测，通过颜色和SERS信号强度的变化来定性和定量地检测T线上的miR-21和miR-196a-5p；
(2)将miR-21和miR-196a-5p溶解于不同体积的PBS缓冲液或者人类尿液中，配置得到不同浓度的miR-21和miR-196a-5p标准样的混合溶液；将不同浓度的待检测物溶液点样到用于检测肺癌标志物miR-21和miR-196a-5p的金纳米笼SERS传感器上，在37℃恒温箱进行层析作用，取出用于检测肺癌标志物miR-21和miR-196a-5p的金纳米笼SERS传感器进行SERS测试，检测得到4-MBA和DTNB的信号，根据在1594cm-1(4-MBA)和1337cm-1(DTNB)的特征信号，分别做出miR-21和miR-196a-5p浓度的对数和SERS信号强度变化量的工作曲线；
(3)采集正常人和肺癌患者的临床尿液，形成待检测样本，将待检测样本点样到用于检测肺癌标志物miR-21和miR-196a-5p的金纳米笼SERS传感器上，在37℃恒温箱进行反应，取出用于检测肺癌标志物miR-21和miR-196a-5p的金纳米笼SERS传感器进行SERS测试，检测得到待检测样本的4-MBA和DTNB的信号；
(4)将步骤3)检测得到的待检测样本的4-MBA和DTNB的信号代入步骤(2)所确定的工作曲线中，测定待检测样本中miR-21和miR-196a-5p的浓度；
优选地，步骤(1)中稀释后的样品溶液为100μL。
本发明的有益效果
(1)本发明提供的金纳米笼合成方法只需将所有化学试剂混合，在1h左右时间内即可完成金纳米笼合成。
(2)本发明的金纳米笼具有成本低，制备简单和生物相容性高的优点，适用于后续SERS-LFA试纸的组装。
(3)本发明涉及的SERS-LFA试纸条生物传感器具有操作简单、价格低廉、反应时间短、便于携带且检测过程不需要大型仪器的辅助等优势。
(4)本发明制备的SERS-LFA试纸条生物传感器的重复性良好，能够实现规模化的制备。
(5)本发明中催化发卡自组装(CHA)是一种新型的miRNA信号放大手段，无需酶催化，在室温下无需扩增设备即可进行。在CHA反应中，两条发卡DNA互补，嵌入到茎环内的互补区域限制了其自发杂交，使它们在溶液中可以稳定存在。引发链存在时可以引发两条发卡DNA杂交形成双链产物，同时释放并且循环利用引发链进行信号放大。由此，少量的引发链即可触发大量的发卡DNA自组装，产生几百倍的催化信号放大且背景信号较低，结合SERS信号输出，可以被应用于诸多目标物的灵敏检测。具有检测简单快速、用量少、高通量等优点。
综上，本发明提供了一种用于检测肺癌标志物miR-21和miR-196a-5p的金纳米笼SERS传感器及其制备方法。本发明首先利用一锅法制备金纳米笼，然后将制备得到的金纳米笼的表面分别标记拉曼信号分子4-MBA和DTNB，接着分别修饰生物素标记的发卡H1-bio-1和H1-bio-2，形成两种SERS标记，由于生物素与链霉亲和素(SA)相互作用，H1-bio-1(或H1-bio-2)修饰后的GNCs@4-MBA(或GNCs@DTNB)可被预先固定在T线上的SA捕获，生物素-SERS标记复合物集中在检测线，在纳米颗粒之间形成更多的热点，通过优化制备条件，构建SERS传感器。该传感器具有组装过程简单、特异性强、均一性好、重复性优和灵敏度高等优点，通过测定PBS缓冲液和人类尿液中不同浓度miR-21和miR-196a-5p对应的SERS信号强度，建立miR-21和miR-196a-5p的浓度和SERS信号强度之间的定量关系，根据定量关系检测了肺癌患者尿液中miR-21和miR-196a-5p的浓度，准确性非常高，结果表明本发明的SERS传感器可用于临床样本样品中低丰度肿瘤核酸标志物的快速、定量、高灵敏检测，为拓展SERS在肺癌早期检测中的广泛应用提供了技术支持。
附图说明
图1是催化发卡自组装辅助的信号放大试纸条用于肿瘤标志物miR-21和miR-196a-5p的SERS检测示意图；
图2A是实施例1中所制备的金纳米笼的SEM照片；
图2B是实施例1中所制备的金纳米笼的TEM照片；
图2C是实施例1中所制备的金纳米笼的高分辨TEM照片；
图2D是实施例1中所制备的金纳米笼的SAED衍射图照片；
图2E是实施例1中所制备的金纳米笼中金元素的EDX成像图；
图2F是实施例1中所制备的金纳米笼中银元素的EDX成像图；
图2G是实施例1中所制备的金纳米笼的UV-vis-NIR光谱；
图2H是实施例1中拉曼信号分子4-MBA、DTNB、GNCs@4-MBA、GNCs@DTNB的拉曼光谱图；
图3A是实施例2中单个金纳米笼的TEM照片；
图3B是实施例2中两个金纳米笼的TEM照片；
图3C和3E是实施例2中模拟单个金纳米笼的电磁场分布；
图3D和3F是实施例2中模拟两个金纳米笼的电磁场分布；
图4A是实施例3中miR-21和miR-196a-5p存在的情况下，为SERS-LFA试纸条检测线的SERS光谱图、典型照片图像和SEM图像；
图4B是实施例3中miR-196a-5p和miR-125a-5p不存在的情况下，为SERS-LFA试纸条检测线的SERS光谱图、典型照片图像和SEM图像；
图5是实施例4中使用样品溶液后，检测线上(miR-21和miR-196a-5p)在1594cm-1和1337cm-1处对应的SERS强度折线图：(1)10μM miR-21+10pM miR-196a-5p；(2)10μM miR-21+100pM miR-196a-5p；(3)10μM miR-21+1nM miR-196a-5p；(4)10μM miR-21+10nM miR-196a-5p；(5)10μM miR-21+10μM miR-196a-5p；
图6A是实施例5中miR-21的SERS标记体积的优化；
图6B是实施例5中miR-196a-5p的SERS标记体积的优化；
图6C是实施例5中反应缓冲剂种类的优化；
图6D是实施例5中添加靶miRNAs后的条带孵育时间的优化；
图7A是实施例6中本发明所制备的SERS传感器检测目标miR-21和miR-196a-5p、两种单碱基错配miRNA、两种三碱基错配miRNA、随机错配miRNA以及空白对照的典型照片图像；
图7B是实施例6中所制备的SERS传感器检测目标miR-21和miR-196a-5p、两种单碱基错配miRNA、两种三碱基错配miRNA、随机错配miRNA以及空白对照测试线上的SERS光谱图；
图7C是实施例6中所制备的SERS传感器检测目标miR-21和miR-196a-5p、两种单碱基错配miRNA、两种三碱基错配miRNA、随机错配miRNA以及空白对照在1594cm-1和1337cm-1特征峰处强度直方图；
图8A是实施例6中所制备的SERS传感器的重现性图；
图8B是实施例6中所制备的SERS传感器检测目标miR-21和miR-196a-5p在1594cm-1和1337cm-1特征峰处强度与时间之间的关系图；
图9A是实施例6中测试线上的DTNB和4-MBA在SERS-LFA试纸条上的SERS成像图；
图9B是实施例6中在测试线上随机选取的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ五个点的SERS光谱图；
图9C是实施例6中对应图9B的DTNB特征峰在1337cm-1处的SERS强度直方图；
图9D是实施例6中对应图9B的4-MBA特征峰在1594cm-1处的SERS强度直方图；
图10A是实施例7所制备的SERS-LFA试纸条传感器用于检测分散在PBS缓冲液中不同浓度miR-21和miR-196a-5p的SERS光谱图；
图10B是实施例7PBS缓冲液中不同浓度的miR-21在1594cm-1特征峰处的SERS信号强度和miR-21浓度的对数的线性拟合图；
图10C是实施例7PBS缓冲液中不同浓度的miR-196a-5p在1337cm-1特征峰处的SERS信号强度和miR-196a-5p浓度的对数的线性拟合图；
图11A是实施例7所制备的SERS-LFA试纸条传感器用于检测分散在人类尿液中不同浓度miR-21和miR-196a-5p的SERS光谱图；
图11B是实施例7中人类尿液中不同浓度的miR-21在1594cm-1特征峰处的SERS信号强度和miR-21浓度的对数的线性拟合图；
图11C是实施例7中人类尿液中不同浓度的miR-196a-5p在1337cm-1特征峰处的SERS信号强度和miR-196a-5p浓度的对数的线性拟合图；
图12A是实施例7中两组临床样本的平均SERS光谱图；
图12B是实施例7所制备的SERS传感器对应测试线1337cm-1和1594cm-1处SERS强度的柱状图。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解，将结合实施例和附图对本发明做进一步详述。
本发明所用的仪器设备以及测试条件如下：
扫描电子显微镜(TEM)照片是由日本日立公司生产的S-4800II型场发射扫描电子显微镜测得。
透射电子显微镜(SEM)照片是由荷兰飞利浦公司生产的TECNAI 10型投射电子显微镜测得。
拉曼光谱是由英国雷尼绍公司生产的Invia Reflex型激光显微拉曼光谱仪测得。测试条件为激光波长785nm，曝光时间为10s，激光强度为50mW，50×物镜。
SERS成像是由美国赛默飞公司生产的DXRxi显微拉曼成像光谱仪测得。
实施例1一种金纳米笼的合成及表征
1)将3mLHAuCl4溶液(0.75M)一次性加到不断搅拌的3mLHMT溶液(0.03M)中。接着将3mL PVP溶液(0.30M)和10μLAgNO3溶液(0.01M)加入混合溶液中，直到溶液变为无色透明。在持续搅拌30s后，加入10μLAA溶液(0.08M)继续搅拌约20min。上述混合溶液在室温下保存12h。最后将金纳米笼分别用乙醇和超纯水离心洗涤3次后分散在超纯水中。将金纳米笼溶液存放在4℃冰箱中待用，用于后续SERS标记的制备。
2)金纳米笼的形貌及SERS效应的表征。
通过SEM、TEM、高分辨TEM、SAED成像图检测金纳米笼的形貌和结构。
参见图2A以及图2B，分别是合成的金纳米笼的TEM照片和SEM照片。SEM图像清楚地表明，GNCs是具有多孔侧壁和中空腔的笼状纳米结构，具有均匀的大小和良好的分散性。TEM图像显示GNCs由平均边长约50±10nm的空心正方形组成。图2C和图2D是金纳米笼的高分辨TEM照片和SAED照片。GNCs尖端晶面间的平面距离为0.240nm，说明GNCs优先生长在{111}平面上。SAED照片中的{111}、{200}、{220}和{311}四个平面表明GNCs是多晶的。为了进一步证明金银元素在纳米笼内部分布的均一性，对合成的双金属纳米结构进行了金和银元素的成像分析。图2E和图2F是金和银元素在双金属纳米结构中的分布。从图中可以明显看出，金银元素的分布都很均匀，而且可以看出GNCs主要由金组成，并含有少量银，这是因为AgNO3中的银纳米粒子参与了GNCs的构建。图2G为GNCs的UV-vis-NIR光谱，GNCs在673nm左右具有相对较窄但很强的LSPR吸收峰。图2H中，在波长785nm，激光强度5mW条件下，4-MBA或DTNB标记的GNCs产生了很强的拉曼信号。从图中可以清楚地看到，在信号分子耦合到GNCs表面上后，拉曼信号被显著放大。以上结果表明GNCs可以作为理想的纳米结构用于SERS分析。
实施例2金纳米笼的电磁场模拟
为进一步探究GNCs的SERS增强效应，使用FDTD法对不同聚集状态GNCs的电磁场分布进行模拟。首先根据图3A和3B中的TEM图，构建了GNCs的结构模型。TEM图像显示GNCs由平均边长约50±10nm的空心正方形组成，具有多孔侧壁和中空腔的笼状纳米结构。图3C和3D所示，在785nm的激发波长下，单个GNC表面的热点主要分布在八个角和内外壁之间，而二聚体GNCs的热点主要集中在纳米粒子之间的间隙处。表明GNCs组装可引发电磁场强度的显著增强，纳米粒子彼此间的LSPR会形成间隙，等离子体使得热点区域的电磁场高度局域化，远远强于单个纳米粒子带来的电磁场增强效果。
实施例3两种目标miRNAs的定性分析
基于SERS-LFA平台对PBS缓冲液中的miR-21和miR-196a-5p进行定性分析。如图4A所示，当PBS缓冲液中存在miR-21和miR-196a-5p时，T线和C线出现灰色条带。SEM图显示在T线上出现了一簇SERS探针。当PBS缓冲液中不存在miR-21和miR-196a-5p时(图4B)，T线上没有出现灰色条带，也没有检测到SERS信号。在试纸条上的控制线上固定了GMIgG，验证了SERS-LFA生物传感器的准确性。无论测试样品中是否存在miR-21和miR-196a-5p，控制区都出现了灰色条带，表明控制线通过抗原抗体结合的原理捕获了两种MIgG修饰的SERS标记，条带工作正常。通过试纸条测试线上颜色的变化，可实现目标miRNA的定性检测；通过对试纸条测试线的SERS信号进行检测，可实现对目标miRNA的定量分析。因此，通过SERS-LFA条带可以对两种目标miRNAs进行定性检测和定量分析。
实施例4两种目标miRNAs之间的交叉反应性评价
为了研究miR-21和miR-196a-5p之间的交叉反应性，本实施例在10μM的miR-21中加入不同浓度的miR-196a-5p(10pM～10μM)。从图5可以看出，所有样本中对于10μM miR-21，SERS强度变化不明显。DTNB在1337cm-1处的SERS强度随miR-196a-5p浓度的增加而增加。结果表明miR-21和miR-196a-5p之间没有发生交叉反应。
实施例5 SERS传感器的优化制备
1)同实施例1制备SERS-LFA试纸条生物传感器。
2)本实验中使用的试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜(NC膜)、吸水垫和底板。在组装试纸条之前，样品垫需要预处理，在含0.25％Triton X-100的Tris HCl溶液(50mM)和NaCl溶液(150mM)中浸泡，然后在37℃的烘箱中干燥2h。然后，用切纸机把上述样品垫切成4mm宽的条带。将4μL的SERS标记(GNCs@4-MBA@H1-bio-1@MIgG和GNCs@DTNB@H1-bio-2@MIgG，比例为1:1)滴在共轭垫上，37℃烘干2h。将4μL H2-bio-1溶液(0.01mM)，4μLH2-bio-2溶液(0.01mM)和10μL SA溶液(0.3mg/mL)喷点于测试线上形成T线，同样在NC膜控制线喷上2μL GMIgG(1:50稀释比例)形成C线。接着将NC膜在37℃干燥30min。最后将样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫依次粘贴到底板上，为了确保实验过程中缓冲液可以连续流动，每个相邻的部分都有约2mm的重叠。制备好的试纸条放于4℃干燥处避光保存。
3)为了使SERS-LFA试纸条传感器达到最佳的分析性能，我们进一步优化了实验条件，包括两种SERS标记的用量、反应缓冲液的种类、以及添加目标miRNAs后条带的孵育时间。SERS标记的用量是影响背景信号的重要因素，我们对两种SERS标记的体积进行了优化(图6A和图6B)。随着miR-21的标记体积的增加，SERS信号出现先增加后又逐渐降低的现象，在4μL时出现最大值。这一结果归因于标记体积的增加增强了目标响应信号以及背景信号，当miR-21标记用量低于4μL时，目标响应信号逐渐增强，而进一步增加miR-21标记体积超过4μL时，背景信号贡献较多。因此，本发明中选用4μL的miR-21标记进行后续实验。同样，miR-196a-5p的最佳SERS标记的量为4μL。此外，缓冲液的类型会影响目标miRNAs及其互补链的杂交效率。为了提高SERS-LFA生物传感器的灵敏度，本发明分别采用HEPES、Tris-accetate和PBS作为反应缓冲液进行优化实验。从图6C的实验结果可以看出，在PBS缓冲液中杂交效率最高。因此，PBS缓冲液被选为最佳反应溶液。当H1的发夹结构被打开时，检测线上的SA可以捕获H1的3'端生物素分子，从而检测SERS标记的信号。两种SERS标记与目标miRNAs和H2的结合，与条带的孵育时间有关。在图6D中，选择的条带孵育时间分别为10min、20min、30min、40min、50min和60min，随着孵育时间的增加，SERS强度逐渐增大，但在30min后呈下降趋势，这可能是由于背景信号的增加造成的。因此，后续实验中采用的最佳反应时间为30min。
实施例6 SERS传感器的特异性、重复性及均一性
1)同实施例2制备SERS传感器；
2)为了验证传感器的特异性，选择了单碱基错配序列(MT1)、3个碱基错配的序列(MT3)、一段随机的RNA序列(Random)以及空白样品(Blank)进行试验。其中，miR-21和miR-196a-5p(T)的浓度均为10μM，MT1、MT3和Random的浓度也均为10μM。实验结束后比较1594cm-1和1337cm-1处的拉曼信号强度。为研究传感器的重现性，以相同的方式制备6个SERS传感器，然后用于检测10μM miR-21和miR-196a-5p。接着使用SERS传感器检测10μMmiR-21和miR-196a-5p，在测试区域检测10个不同位置，对比它们光谱差异，评估SERS传感器的均一性。
表1
名称 序列
H1-bio-1 5′-SH-CCCGAATCACAGTGAAACTTACTAATCUUAUACUUCUAAAUC-bio-3′
H1-bio-2 5′-SH-TCAACATCAGTCTGATAAGCTACGACATCTAACTAGCTTATCAGACT-bio-3′
H2-1 5′-TTACATTAGTAAGTTTCACTGTGATTCGGGAUG-3′
H2-2 5′-ATAAGCTAGTTAGATGTCGTAGCTTATCAGACTCGACATCTAAC-3′
MT1-1 5′-UAGUAAGUUUCACUGUGACUCGGG-3′
MT3-1 5′-UAUUAAGUUCCACUGUGAUUCGUG-3′
MT1-2 5′-UAGCUUAUCAGACUGAUGUAGA-3′
MT3-2 5′-UACCUUAUCUGACUGAUGUCGA-3′
Random 5′-CACACUUUCGGUUCCACUGGGUA-3′
miR-196a-5p 5′-UAGUAAGUUUCACUGUGAUUCGGG-3′
miR-21 5′-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3′
图7A为实验结果的典型照片图像。在miR-21和miR-196a-5p存在时，T线和C线均出现灰色条带，在混合溶液中不存在miR-21和miR-196a-5p时，只有C线出现灰色条带。图7B和图7C显示出互补的miR-21和miR-196a-5p、非互补的单碱基错配序列、3个碱基错配的序列、一段随机的RNA序列以及空白样品杂交后稳定的SERS光谱和相对应的特征峰强度柱状图。miR-21和miR-196a-5p的SERS-LFA条带峰值强度明显强于干扰物和空白对照。因此，SERS-LFA条带可以有效地将特异性生物标志物与其他干扰物区分开来，具有良好的特异性。图8A和图8B为SERS传感器的重复性。6个传感器的检测miR-21和miR-196a-5p的SERS光谱几乎没有差异。表明SERS传感器在miRNA检测中具有良好的可重复性。SERS-LFA条带表面SERS信号的均一性是检测的另一个重要因素。T线表面分别用4-MBA和DTNB标记。4-MBA和DTNB的SERS成像结果如图9A所示。虽然有些地方仍有聚合物存在，但SERS-LFA条带的SERS信号具有很好的均匀性。而且这些光谱的强度无明显差异(图9B和图9C)，表明SERS传感器有很好的均一性。
实施例7 SERS传感器检测样本中miR-21和miR-196a-5p
1)同实施例2制备SERS传感器。
2)将miR-21和miR-196a-5p分散到PBS缓冲液或人类尿液中，配置得到浓度10pM、100pM、1nM、10nM、100nM、1μM、10μM的miR-21和miR-196a-5p的混合溶液。将SERS传感器与不同浓度的miR-21和miR-196a-5p样品溶液，在37℃恒温箱杂交反应实施例3中的最佳孵育时间，取出传感器进行SERS测试，检测得到4-MBA和DTNB的信号。利用手持拉曼检测试纸条测试线上的拉曼信号，得出miR-21和miR-196a-5p不同浓度时4-MBA和DTNB在1594cm-1和1337cm-1处的拉曼信号强度的变化，每组实验至少重复3次，拟合出miR-21和miR-196a-5p的定量线性图。
图10显示随着目标物浓度的增加，测试线上灰色条带的颜色逐渐加深，原因是随着目标物浓度增加，在GNCs表面通过CHA信号放大产生的Bio分子暴露在外的H1-H2杂交条带越多，被试纸条测试线上的SA捕获的GNCs越多，因而信号越强。图10A是SERS传感器检测PBS缓冲液中不同浓度的miR-21和miR-196a-5p的SERS光谱。整体特征峰强度随着miR-21和miR-196a-5p浓度的增加而逐渐增大。对横坐标进行对数处理，可以看出：目标物浓度在10pM～10μM范围内时，T线上条带在1594cm-1和1337cm-1处的SERS信号强度与目标物浓度的对数之间分别存在良好的线性关系。图10B中，miR-21的线性回归方程为y＝1534.94x-503.74，其中y代表测试线上条带的SERS强度，x为目标物的浓度对数，R2＝0.988，检测限为2.08pM。图10C中，miR-196a-5p的线性回归方程为y＝1369.57x-348.763，R2＝0.9879，检测限为1.77pM。SERS传感器被用来进一步检测人类尿液中不同浓度的miR-21和miR-196a-5p。图11A显示整体特征峰强度随着miR-21、miR-196a-5p浓度的增加而逐渐增大。目标物浓度在10pM～10μM范围内时，T线上条带在1594cm-1和1337cm-1处的SERS信号强度与目标物浓度的对数之间分别存在良好的线性关系。图11B中，miR-21的线性回归方程为y＝2134.715x-1113.905，R2＝0.997，检测限为3.31pM。图11C中，miR-196a-5p的线性回归方程为y＝1483.2x-516.29，R2＝0.980，检测限为2.18pM。因此，我们提出的SERS-LFA试纸条传感器能够在pM水平上同时检测到两种肺癌生物标志物，具有很高的灵敏度，完全满足临床诊断的实际需要。图12A和图12B显示肺癌患者尿液中miR-21和miR-196a-5p的表达量高于正常人尿液中miR-21和miR-196a-5p的表达量，且SERS和RT-PCR检测结果一致。表明该SERS传感器在临床样品的核酸检测中具有良好的应用前景。

Claims (14)

1.一种用于检测肺癌标志物miR-21和miR-196a-5p的金纳米笼SERS传感器，其特征在于，该传感器将金纳米笼基底的SERS效应和LFA检测方法相结合，用于miR-21和miR-196a-5p的检测。
2.如权利要求1所述的金纳米笼SERS传感器的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)采集和处理尿液样本；
(2)利用一锅法制备金纳米笼；
(3)将步骤(2)制备得到的金纳米笼的表面分别标记拉曼信号分子4-MBA和DTNB，接着分别修饰生物素标记的发卡H1-bio-1和H1-bio-2，形成两种SERS标记；
(4)设计并构建基于催化发卡自组装(CHA)信号放大的试纸条传感器。
3.如权利要求2所述的金纳米笼SERS传感器的制备方法，其中步骤(1)具体包括如下步骤：
将尿液样本分为健康人群和NSCLC患者组，在早餐前采集3-10mL新鲜尿液，将获得的尿液样本立即冷冻保存。
4.如权利要求2所述的金纳米笼SERS传感器的制备方法，其中步骤(2)具体包括如下步骤：
将1-5mL 0.5-1M的HAuCl4溶液一次性加到不断搅拌的1-5mL 0.01-0.05M HMT溶液中，接着将1-5mL 0.10-0.50M PVP溶液和5-15μL的0.005-0.02M AgNO3溶液加入混合溶液中，直到溶液变为无色透明，在持续搅拌10-60s后，加入5-20μL的0.05-0.1MAA溶液继续搅拌约10-30min，将得到的混合溶液在室温下保存5-20h，最后将金纳米笼分别用乙醇和超纯水离心后分散在超纯水中，将金纳米笼溶液存放在4℃冰箱中待用，用于后续SERS标记的制备。
5.如权利要求2所述的金纳米笼SERS传感器的制备方法，其中步骤(3)具体包括如下步骤：
(3)-1)在SERS标记合成过程中，使用4-MBA和DTNB作为拉曼信号分子，4-MBA和DTNB可以通过Au-S键偶联到金纳米笼表面，将30-80μL 1mM的4-MBA乙醇溶液加入到0.5-3mL步骤1)所合成的金纳米笼溶液中，搅拌10-50min后得到GNCs@4-MBA溶液溶液，然后用同样的方法获得DTNB标记的GNCs；
(3)-2)将10-30μL 0.5mM的H1-bio-1与20-50μL新鲜制备的0.5-2mM的TCEP缓冲液混合1-3h，用于活化H1-bio-1；然后，将活化后的H1-bio-1与0.5-2mL GNCs@4-MBA溶液混合10-18h，得到了GNCs@4-MBA@H1-bio-1溶液；同时利用EDC和NHS作为偶联剂激活4-MBA和DTNB表面的-COOH，活化后的-COOH会与MIgG表面的-NH2结合；向上述溶液里加入20-50μL 150mM的EDC溶液和20-50μL 20-50mM的NHS溶液，接着加入50-200μL 5-10μg/μL的MIgG溶液，接着在37℃下搅拌1-8h，最终制备得到GNCs@4-MBA@H1-bio-1@MIgG溶液；
(3)-3)接着加入2-20μL 30-80μg/mL的牛血清白蛋白溶液，孵育0.5-3h，阻断羧基多余的结合位点，然后离心5-20min，加入用0.01M PBS缓冲液溶解的2-20μL的2-8M NaCl溶液，使NaCl溶液在混合溶液中的浓度逐渐变为0.2-1M，将沉淀溶解在PBS溶液中供进一步使用,最终得到两种SERS标记。
6.如权利要求5所述的金纳米笼SERS传感器的制备方法，其中H1-bio-1用H1-bio-2替代。
7.如权利要求2所述的金纳米笼SERS传感器的制备方法，其中步骤(4)具体包括如下步骤：
(4)-1)本发明中使用的试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板，在组装试纸条之前，样品垫需要预处理，在含0.1-0.4％Triton X-100的40-60mM Tris HCl溶液和100-200mM NaCl溶液中浸泡，然后在37℃的烘箱中干燥1-3h，然后，把上述样品垫切条带；
(4)-2)将2-5μL的SERS标记滴在共轭垫上，37℃烘干1-3h，其中，GNCs@4-MBA@H1-bio-1@MIgG和GNCs@DTNB@H1-bio-2@MIgG，比例为1:1；
(4)-3)将2-6μL 0.01mM的H2-bio-1溶液，2-6μL 0.01mM的H2-bio-2溶液和5-20μL0.3mg/mL的SA溶液喷点于测试线上形成T线，同样在NC膜控制线喷上1-3μL GMIgG形成C线，按照1:50稀释比例，接着将NC膜在37℃干燥10-60min；
(4)-4)最后将样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫依次粘贴到底板上，为了确保实验过程中缓冲液可以连续流动，每个相邻的部分都有1-3mm的重叠，制备好的试纸条放于4℃干燥处避光保存。
8.如权利要求2所述的金纳米笼SERS传感器的制备方法，其中步骤(1)具体包括如下步骤：
尿液样本分为健康人群和NSCLC患者组，在早餐前采集5mL新鲜尿液，将获得的尿液样本立即冷冻并保存在-80℃冰箱里。
9.如权利要求2所述的金纳米笼SERS传感器的制备方法，其中步骤(2)具体包括如下步骤：
将3mL HAuCl4溶液(0.75M)一次性加到不断搅拌的3mLHMT溶液(0.03M)中；接着将3mLPVP溶液(0.30M)和10μL AgNO3溶液(0.01M)加入混合溶液中，直到溶液变为无色透明，在持续搅拌30s后，加入10μL AA溶液(0.08M)继续搅拌约20min，上述混合溶液在室温下保存12h，最后将金纳米笼分别用乙醇和超纯水离心洗涤3次后分散在超纯水中，将金纳米笼溶液存放在4℃冰箱中待用，用于后续SERS标记的制备。
10.如权利要求2所述的金纳米笼SERS传感器的制备方法，其中步骤(3)具体包括如下步骤：
(3)-1)在SERS标记合成过程中，使用4-MBA和DTNB作为拉曼信号分子；4-MBA和DTNB可以通过Au-S键偶联到金纳米笼表面；将50μL 1mM的4-MBA乙醇溶液加入到1mL步骤1)所合成的金纳米笼溶液中，搅拌30min后得到GNCs@4-MBA溶液溶液；然后用同样的方法获得DTNB标记的GNCs(GNCs@DTNB)；
(3)-2)将20μL 0.5mM的H1-bio-1与30μL新鲜制备的1.5mM的TCEP缓冲液混合1.5h，用于活化H1-bio-1，然后将活化后的H1-bio-1与1mL GNCs@4-MBA溶液混合12h，得到了GNCs@4-MBA@H1-bio-1溶液，同时利用EDC和NHS作为偶联剂激活4-MBA和DTNB表面的-COOH，活化后的-COOH会与MIgG表面的-NH2结合，向上述溶液里加入30μL 150mM的EDC溶液和30μL30mM的NHS溶液，接着加入100μL 8μg/μL的MIgG溶液，接着在37℃下搅拌大约4h，最终制备得到GNCs@4-MBA@H1-bio-1@MIgG溶液；
(3)-3)接着加入10μL 50μg/mL的牛血清白蛋白溶液，孵育1h，阻断羧基多余的结合位点；然后以10000r的转速离心15min；加入用0.01M PBS缓冲液溶解的10μL 5M的NaCl溶液，使NaCl溶液在混合溶液中的浓度逐渐变为0.4M，将沉淀溶解在PBS溶液中供进一步使用，最终得到两种SERS标记。
11.如权利要求2所述的金纳米笼SERS传感器的制备方法，其中步骤(4)具体包括如下步骤：
(4)-1)本发明中使用的试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板，在组装试纸条之前，样品垫需要预处理，在含0.25％Triton X-100的50mM Tris HCl溶液和150mM的NaCl溶液中浸泡，然后在37℃的烘箱中干燥2h，然后，用切纸机把上述样品垫切成4mm宽的条带；
(4)-2)将4μL的SERS标记，其中GNCs@4-MBA@H1-bio-1@MIgG和GNCs@DTNB@H1-bio-2@MIgG，比例为1:1，滴在共轭垫上，37℃烘干2h；
(4)-3)将4μL 0.01mM的H2-bio-1溶液，4μL H2-bio-20.01mM的溶液和10μL 0.3mg/mL的SA溶液喷点于测试线上形成T线，同样在NC膜控制线喷上2μL GMIgG，按照1:50稀释比例形成C线，接着将NC膜在37℃干燥30min；
(4)-4)最后将样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫依次粘贴到底板上，为了确保实验过程中缓冲液可以连续流动，每个相邻的部分都有约2mm的重叠，制备好的试纸条放于4℃干燥处避光保存。
12.一种用权利要求1所述的金纳米笼SERS传感器检测待检测样本中miR-21和miR-196a-5p的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
(1)试纸条实验在PBS缓冲溶液中进行，将稀释后的样品溶液滴在条带的样品垫上，H1-bio-1(或H1-bio-2)修饰后的GNCs@4-MBA被预先固定在T线上的SA捕获，用SERS技术对T线上的SERS标记进行检测，通过颜色和SERS信号强度的变化来定性和定量地检测T线上的miR-21和miR-196a-5p；
(2)将miR-21和miR-196a-5p溶解于不同体积的PBS缓冲液或者人类尿液中，配置得到不同浓度的miR-21和miR-196a-5p标准样的混合溶液；将不同浓度的待检测物溶液点样到用于检测肺癌标志物miR-21和miR-196a-5p的金纳米笼SERS传感器上，在37℃恒温箱进行层析作用，取出用于检测肺癌标志物miR-21和miR-196a-5p的金纳米笼SERS传感器进行SERS测试，检测得到4-MBA和DTNB的信号，根据在1594cm-1和1337cm-1的特征信号，分别做出miR-21和miR-196a-5p浓度的对数和SERS信号强度变化量的工作曲线；
(3)采集正常人和肺癌患者的临床尿液，形成待检测样本，将待检测样本点样到用于检测肺癌标志物miR-21和miR-196a-5p的金纳米笼SERS传感器上，在37℃恒温箱进行反应，取出用于检测肺癌标志物miR-21和miR-196a-5p的金纳米笼SERS传感器进行SERS测试，检测得到待检测样本的4-MBA和DTNB的信号；
(4)将步骤3)检测得到的待检测样本的4-MBA和DTNB的信号代入步骤(2)所确定的工作曲线中，测定待检测样本中miR-21和miR-196a-5p的浓度。
13.一种用权利要求1所述的金纳米笼SERS传感器检测待检测样本中miR-21和miR-196a-5p的检测方法，其中用H1-bio-2替代H1-bio-1。
14.如权利要求12所述的检测方法，其中，步骤(1)中稀释后的样品溶液为100μL。
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