CN113563222B - 一种基于静默区报告分子的表面增强拉曼散射检测过氧化氢的方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于静默区报告分子的表面增强拉曼散射检测过氧化氢的方法与应用。本发明中以4‑乙炔基苯胺作为底物，与亚硝酸在低温下发生重氮化反应，生成新的静默区报告分子—4‑重氮苯炔(4‑DP)，该分子可在拉曼静默区2100‑2200cm^‑1范围内产生由炔烃拉伸振动产生的特征峰，静默区特征峰的引入，可以降低背景信号的干扰和提升检测的灵敏度。另外，本发明中将4‑巯基苯硼酸修饰在金微米颗粒CLMP的表面，构成SERS探针分子CLMP@4‑MPBA，而H₂O₂可与4‑巯基苯硼酸反应生成4‑羟基苯硫酚，因此可以通过静默区炔烃特征峰的强度变化实现对H₂O₂的浓度的检测。

Description

一种基于静默区报告分子的表面增强拉曼散射检测过氧化氢 的方法与应用

技术领域

本发明属于生命科学研究生物分子的检测技术领域，特别涉及一种基于静默区报告分子的表面增强拉曼散射检测过氧化氢的方法与应用。

背景技术

表面增强拉曼散射(Surface-enhanced Raman Scattering,SERS)光谱是近几十年的研究热点，它既能检测拉曼光谱的指纹特性，又能对原有的拉曼信号进行3～10个数量级的放大，可极大地提升检测的精确度和灵敏度。此外，拉曼光谱是散射光谱，对样品本身没有任何损伤，不影响后续的使用。随着技术的发展和检测仪器的进步，SERS检测被广泛应用于传感和生命科学检测等领域。

SERS增强效果主要取决于两个方面：高增强的SERS基底和具有高信噪比的拉曼报告分子。经过多年的发展，多种基于贵重金属的SERS基底已被广泛报道，优良的SERS增强基底可将检测信号提高到10⁸以上。但是大多数纳米级别的SERS基底由于结构不均匀，存在稳定性和重现性差等问题。所以开发一种高重现性、结构均匀的SERS增强基底是高灵敏SERS检测的前提。纳米粒子合成的过程中通常都会使用有机配体，其自身的SERS信号会导致较大的背景干扰信号，而一些待测生物分子自身产生的SERS信号也会显著影响检测的灵敏度。因此，如何提高SERS检测的信噪比是另一个要解决的关键问题。

常见拉曼分子的特征峰分布在500～1800cm^-1范围内，这一区域又被称为指纹区域。而生物内源性分子，如蛋白质和磷脂，也在此区间产生特征峰，二者相互重叠难以分离，为后续实验的分析鉴定造成了一定的困扰。1800～2800cm^-1区间内，生物分子不会产生拉曼信号，被称为生物样品的“拉曼静默区”。因此诞生了一种静默区拉曼报告分子，它们能够在拉曼静默区产生特征峰，可以有效避免细胞内源性物质的背景信号干扰。无干扰、信噪比高、灵敏性强，甚至可以实现痕量检测，这些都是静默区报告分子的优势。目前研究较多的包括炔烃、叠氮化物、腈、氘和羰基金属等几个化学基团，但是有关拉曼静默区的专利少有发表。如专利CN106248648A，制备了一种新型静默区报告分子——(E)-2-((4-(苯乙炔基)亚苄基)氨基)乙硫醇)，利用炔烃在静默区产生的特征峰，进行细胞拉曼成像，使成像结果更加便捷且高效；专利CN110376379A，以静默区的两个特征峰强度比值，来推算癌胚抗原的浓度，实现高精度、特异性的检测。在SERS检测中引入高性能的表面增强基底和具有静默区特征峰的特异性报告分子，可以极大提升检测的灵敏性和准确性，具有重要的临床及治疗价值。

过氧化氢(Hydrogen Peroxide,H₂O₂)是体内常见的活性氧分子，参与多种生理进程。对于H₂O₂的检测方法众多，较为常见的如电化学检测法(CN112305050A)，荧光探针检测法(如CN109021000A)，荧光发光检测法(CN109060739A)等。但以上方法存在各种缺陷，要么不利于样品保存，要么检出限较高。SERS检测是一种高灵敏度的检测手段，专利CN110779907A即使用SERS芯片对H₂O₂进行检测，该专利中应用指纹区的特征峰面积的变化来反映相应的H₂O₂浓度变化。但指纹区干扰较大，若应用在生物样品中，不利于定性及定量分析。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种4-重氮苯炔(4-DP)。

本发明的另一个目的在于提供所述4-重氮苯炔(4-DP)的制备方法。

本发明的又一个目的在于提供所述4-重氮苯炔(4-DP)的应用。

本发明的再一个目的在于提供所述一种基于静默区报告分子的表面增强拉曼散射检测过氧化氢的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种4-重氮苯炔(4-DP)，其化学结构式如式I所示：

所述的4-重氮苯炔(4-DP)的制备方法，包括如下步骤：将2～8℃的NaNO₂溶液逐滴加入到冰浴条件下的4-乙炔基苯胺溶液中，于2～8℃条件下进行反应，待反应结束后洗涤，得到4-重氮苯炔(4-DP)。

所述的反应的时间1～3h；优选为2h。

所述的NaNO₂与4-乙炔基苯胺的摩尔比1：0.5～2；优选为1：0.91。

所述的洗涤为依次用饱和BF₄Na溶液和去离子水进行洗涤。

所述的4-重氮苯炔的保存方式为：避光保存于4℃下。

所述的4-重氮苯炔(4-DP)在制备静默区拉曼报告分子中的应用。

所述的静默区拉曼报告分子为用于表面增强拉曼散射(SERS)方面的静默区拉曼报告分子。

所述的4-重氮苯炔(4-DP)在检测过氧化氢中的应用。

一种基于静默区报告分子的表面增强拉曼散射检测过氧化氢的方法，包括如下步骤：

(1)将金微米粒子(CLMP)加入到4-巯基苯硼酸(4-MPBA)的乙醇溶液中振荡反应，待反应结束后洗涤，得到SERS探针(CLMP@4-MPBA)；

(2)配制至少5个浓度梯度的过氧化氢(H₂O₂)水溶液；

(3)将步骤(1)中得到的SERS探针分别加入到步骤(2)中配制的不同浓度的过氧化氢水溶液中，振荡反应，得到反应后的SERS探针；然后将反应后的SERS探针洗涤后再分别加入上述4-重氮苯炔(4-DP)继续振荡反应，待反应结束后洗涤、干燥，得到连接静默区报告分子的SERS探针；接着将连接静默区报告分子的SERS探针进行SERS表征，获得2125与1071cm^-1两处的峰强度，并计算其比值；最后根据2125与1071cm^-1两处峰强度的比值和过氧化氢水溶液的浓度绘制标准曲线；

(4)将步骤(1)中得到的SERS探针分别加入到待测样品溶液中振荡反应，得到反应后的SERS探针；然后将反应后的SERS探针洗涤后加入上述4-重氮苯炔(4-DP)继续振荡反应，待反应结束后洗涤、干燥，得到连接静默区报告分子的SERS探针；接着将连接静默区报告分子的SERS探针进行SERS表征，获得2125与1071cm^-1两处峰强度，并计算其比值；最后根据2125与1071cm^-1两处峰强度的比值和步骤(3)中绘制的标准曲线，获得待测样品溶液中过氧化氢的浓度，或进一步计算得到其含量(根据其浓度和体积)。

步骤(1)中所述金微米粒子(CLMP)优选为通过如下方法制备得到的：将氯金酸水溶液溶于盐酸溶液中，然后加入聚乙烯吡咯烷酮并置于冰上冷却至0～4℃，然后加入3-脒基-苯胺，于2～8℃(优选为4℃)下静置反应，待反应结束后离心洗涤，得到金微米粒子(CLMP)。

所述的氯金酸、聚乙烯吡咯烷酮和3-脒基-苯胺的质量比为1：(0.05～3.2)：(0.3～10)；优选为1：0.05：0.625。

所述的氯金酸水溶液的质量浓度为5～25％；优选为10％。

所述的盐酸溶液为盐酸水溶液；优选为浓度1mmol/L的盐酸水溶液。

所述的氯金酸水溶液与盐酸的体积比为1：125。

所述的静置反应的时间为10min～120h；优选为24h。

所述的离心洗涤的条件为：在5000rpm下离心3～10min。

所述的金微米粒子(CLMP)的保存方式如下：将金微米粒子分散于水中，于4℃保存。

步骤(1)中所述的金微米粒子(CLMP)和4-巯基苯硼酸(4-MPBA)的摩尔比1：50～200；优选为1:62.5。

步骤(1)中所述的反应的时间1～3h；优选为2h。

步骤(1)中所述的洗涤为依次用乙醇和去离子水进行洗涤。

步骤(1)中所述的SERS探针的保存方式的保存方式如下：将SERS探针分散于水中，于4℃保存。

步骤(2)中所述的过氧化氢(H₂O₂)水溶液的用量为按其在所述反应体系的终浓度为0.0001～1500μM添加计算；优选为为按其在所述反应体系的终浓度为0.001～1500μM添加计算。

步骤(3)中所述的SERS探针和4-重氮苯炔(4-DP)的摩尔比的摩尔比1：50～200；优选为1:62.5。

步骤(3)和(4)中所述的振荡反应的时间1～3h；优选为1h。

步骤(3)和(4)中所述的继续振荡反应的时间1～3h；优选为2h。

步骤(3)和(4)中所述的洗涤为采用去离子水进行洗涤。

步骤(3)和(4)中所述的SERS表征为使用633nm激光激发，记录单个CLMP上的SERS光谱。

步骤(4)中所述的待测样品为已知或未知是否含有过氧化氢的样品，包括血清样品等。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明先制备出重现性良好、结构均一的SERS增强基底——CLMP。CLMP是一种具有卷心菜结构的金微米颗粒，由金纳米片自组装而成，纳米片层之间的间隙及自身的尖角结构，为单个CLMP提供了高密度的“热点”；纳米片也扩增了增强基底的表面积，为报告分子提供了更多的结合位点。因此与目前常用的纳米基底相比，以上两点都大大提升了拉曼信号强度。通过与商品化拉曼基底的增强效果对比，单个CLMP的信号强度可达其3～5倍，进一步提高了SERS检测的灵敏度。

(2)本发明使用常用的H₂O₂灵敏的报告分子——4-巯基苯硼酸(4-MPBA)，修饰在CLMP表面，构成SERS探针分子CLMP@4-MPBA；H₂O₂可与4-MPBA反应生成4-羟基苯硫酚，该产物可通过羟基的邻位与4-DP的重氮基团进行共价连接，从而在SERS探针表面引入炔烃基团，炔烃基团的数量与参与反应的H₂O₂浓度直接相关，因此可以通过静默区炔烃特征峰的强度变化实现对H₂O₂的浓度推算，达到定性及定量检测的目的；通过这种本发明提供的静默区SERS检测方法，对H₂O₂的最低检出限可达0.1nM，线性检测范围两个数量级，且在目前已发表的SERS检测H₂O₂的方法中，未发现使用静默区报告分子检测的先例。

(3)本发明制备了高重现性、结构均匀的SERS增强基底和新型静默区报告分子，将二者结合应用，能够提升SERS信号的信噪比，可以用于传感检测方面。

(4)本发明以4-乙炔基苯胺作为底物，与亚硝酸在低温下发生重氮化反应，生成新型静默区报告分子——4-重氮苯炔(4-DP)，该分子可在拉曼静默区2100-2200cm^-1范围内产生由炔烃拉伸振动产生的特征峰，而常见的拉曼报告分子及内源性生物分子仅在指纹区(即500-1800cm^-1)内产生特征峰，因此静默区特征峰的引入，既降低了背景信号的干扰，又极大提升了检测的灵敏度，有利于低浓度的定性及定量检测。

(5)本发明利用新型拉曼增强基底的构建和静默区拉曼信号分子的设计合成，基于表面增强拉曼检测技术建立超灵敏检测H₂O₂的新方法，为检测与疾病相关的氧化态分子或生理信号分子的灵敏检测提供新的思路，可为开发超灵敏生物医学体外检测传感器提供理论依据，可用于早期疾病预警、临床医学检测。

附图说明

图1是CLMP分别在组装时间为10分钟、1.5小时、4小时以及24小时的扫描电镜图；其中，a为10分钟；b为1.5小时；c为4小时；d为24小时。

图2是CLMP的自组装原理图。

图3是CLMP的扫描电镜及光学显微镜图；其中，a为CLMP的扫描电镜图；b为CLMP的光学显微镜图。

图4是CLMP@4-MBA的拉曼光谱图以及商品化SERS基底的扫描电镜图；其中，A为4-MBA粉末、商品化SERS基底@4-MBA以及单个CLMP@4-MBA的拉曼光谱图(a：4-MBA粉末；b:商品化SERS基底@4-MBA；c:单个CLMP@4-MBA)；B为商品化SERS基底的扫描电镜图。

图5是静默区报告分子4-重氮苯炔的合成路线及特异性连接示意图。

图6是静默区报告分子4-DP的红外光谱图。

图7是SERS探针的制备及SERS检测过氧化氢的示意图。

图8是与不同氧化性干扰物反应后，静默区1800～2200cm^-1范围内的光谱图及不同干扰物在静默区2125cm^-1处相对于0.6mM H₂O₂的特征峰强度柱状图；其中，a为与不同氧化性干扰物反应后，静默区1800-2200cm^-1范围内的光谱图；b为不同干扰物在静默区2125cm^-1处相对于0.6mM H₂O₂的特征峰强度柱状图。

图9是与不同浓度的过氧化氢反应后连接4-DP后的SERS光谱图以及2125与1071cm^-1两处峰强度的比值与过氧化氢浓度的关系示意图；其中，a为与不同浓度的过氧化氢反应后连接4-DP后的SERS光谱；b为2125与1071cm^-1两处峰强度的比值与过氧化氢浓度的关系示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。

实施例1具“卷心菜”结构的金微米粒子的制备

本发明中的具“卷心菜”结构的金微米粒子可以参考中国专利申请(申请号为：201910908238.7、名称为：一种苯酚识别SERS探针及其制备、应用和基于SERS通用超灵敏免疫分析方法)中的方法制备得到，其具体制备方法如下：

取8μL质量浓度为10％的HAuCl₄，溶于1mL浓度为1mM盐酸中，先加入1.6mg聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(Mw＝40000Da)并置于冰上冷却至4℃，再加入5mg/mL 3-脒基-苯胺(NAAN；用量为5mg)，振荡20秒后于4℃静置反应24h。将反应后的溶液离心(5000rpm下离心10min)，沉淀即为高信号强度的SERS基底——具“卷心菜”特征结构的金微米颗粒(Cabbage-likeMicroparticles，CLMP)，将沉淀用N-甲基吡咯烷酮和去离子水先后洗涤，最后分散在去离子水中，保存在4℃下备用。

不同组装时间(10分钟、1.5小时、4小时、24小时)下CLMP的扫描电镜图如图1所示；CLMP的组装原理图如图2所示；CLMP在扫描电镜下和光镜下的观察结果如图3所示。

实施例2CLMP与商品化SERS基底的增强效果对比

将1.6×10^-8mol实施例1中制备的CLMP、一片商品化SERS基底(商品名：SERS基底拉曼芯片，购于厦门谱识科仪有限公司)分别与100mM的对巯基苯甲酸(4-MBA)溶液混合振荡2h，洗涤后进行拉曼表征(使用633nm激光激发，记录单个CLMP上的SERS光谱)，对比它们对4-MBA的增强效果，以4-MBA粉末为对照。

拉曼光谱图如图4A所示：从图中可以看出，单个CLMP的增强效果为商品化SERS基底的3～5倍。图4B为商品化SERS基底的扫描电镜图片。

实施例3能识别过氧化氢的SERS探针的合成

将10μL 100mM 4-巯基苯硼酸(4-MPBA)(1×10^-6mol)的乙醇溶液与10μL实施例1中制备的CLMP溶液(50～200个/mL)混匀后振荡2h。将反应后的基底用乙醇和去离子水先后进行洗涤，所得沉淀即为SERS探针CLMP@4-MPBA，最后分散在去离子水中，保存于4℃下备用(SERS探针的制备的示意图如图7所示)。

实施例4新型静默区拉曼报告分子的制备

将0.25mL 2.6M冷却至2～8℃的NaNO₂溶液，逐滴加入在冰浴条件下的4-乙炔基苯胺溶液(浓度为0.59M，用量为1mL)中，2～8℃反应1h。将反应后得到的混合物用饱和四氟硼酸钠(BF₄Na)溶液和去离子水先后进行洗涤，得到的红棕色沉淀即为静默区报告分子——4-重氮苯炔(4-DP)。干燥后避光保存于4℃下备用。4-DP的合成原理示意图如图5所示，红外光谱如图6所示。

实施例5SERS探针的抗干扰实验

将实施例3中合成的SERS探针(1.6×10^-8mol)与3种不同的氧化性干扰物质(Cu(NO₃)₂,FeCl₃，NaClO，其浓度均为10mM，用量均为100μL)进行反应，分别为NO₃ ^-、Fe³⁺、ClO^-，振荡反应1h，反应后的探针分子用去离子水洗涤后，再与10μL 100mM实施例4中合成的静默区报告分子4-DP振荡反应2h后进行SERS表征(使用633nm激光激发，记录单个CLMP上的SERS光谱)。空白对照(Blank)为不含H₂O₂的去离子水。

与不同干扰物及H₂O₂反应后，静默区1800～2200cm^-1范围内的拉曼光谱如图8a所示，可明显观察到，虽然干扰物的浓度为H₂O₂的17倍左右，但检测到的静默区峰强度远低于H₂O₂。图8b为不同干扰物相对于H₂O₂在2125cm^-1处的峰强度。

实施例6利用SERS探针检测过氧化氢

将实施例3中合成的SERS探针(CLMP@4-MPBA)与不同浓度的H₂O₂混合，振荡反应1h，反应后的探针分子用去离子水洗涤后，再与实施例4中合成的静默区报告分子4-DP振荡反应2h；然后将连接了静默区报告分子的SERS探针洗涤后滴加在载玻片上干燥后进行SERS表征(使用633nm激光激发，记录单个CLMP上的SERS光谱)；其中，H₂O₂的浓度分别为0，0.1nM，10nM，0.1μM，1μM，0.1mM，0.3mM，0.6mM，1.5mM，用量均为300μL；4-DP浓度为100mM，用量为10μL；SERS探针的用量为10μL。

SERS探针检测过氧化氢的示意图如图7所示。与不同浓度过氧化氢的SERS探针的拉曼光谱如图9a所示。2125与1071cm^-1两处峰强度的比值与过氧化氢浓度的线性拟合曲线(以科学计数法的过氧化氢浓度为x轴，以2125cm^-1/1071cm^-1的比值为y轴，将数据导入到origin软件中，使用“线性拟合”功能进行峰强度比值与浓度之间的线性拟合曲线，得到线性拟合方程为Y＝3.932E-4X+0.183)，线性范围为1μM～1.5mM，最低检出限可达0.1nM(图9b)。

实施例7利用SERS探针检测血清中的过氧化氢

用人血清(来源于暨南大学第一附属医院的健康志愿者的人全血，通过离心分离得到人血清，用去离子水稀释1000倍，作为过氧化氢的溶剂)配制三个浓度的H₂O₂溶液，1.2、0.5、0.01mM，与实施例3中合成的SERS探针(50～200个/mL，用量为200μL)，振荡反应1h。反应后的探针分子用去离子水洗涤后，再与10μL 100mM的静默区报告分子4-DP振荡反应2h。洗涤后滴加在载玻片上干燥后进行SERS表征(使用633nm激光激发，记录单个CLMP上的SERS光谱)。表1为血清中SERS检测的回收率和相对标准偏差(n＝3)。每个样品测量10种不同CLMP的SERS光谱用于标准偏差计算。其中，平均回收率和标准偏差通过如下方式获得：通过计算拉曼光谱得到2125与1071cm^-1两处峰强度的比值，代入实施例6中得到的线性拟合曲线，得到H₂O₂的检测浓度，与加标浓度(见表1)作比，得到相应的回收率；然后根据获得的回收率再计算其平均回收率(每组浓度做3组以上的数据)，得到平均回收率。另外，表1中的RSD是根据H₂O₂平均检测浓度，通过excel中的标准偏差函数，计算得出RSD值。

表1.SERS检测血清中H₂O₂

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种4-重氮苯炔，其特征在于，其化学结构式如式I所示：

2.权利要求1所述的4-重氮苯炔的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将2～8℃的NaNO₂溶液逐滴加入到冰浴条件下的4-乙炔基苯胺溶液中，于2～8℃条件下进行反应，待反应结束后洗涤，得到4-重氮苯炔；

所述的NaNO₂与4-乙炔基苯胺的摩尔比1：0.5～2。

3.根据权利要求2所述的4-重氮苯炔的制备方法，其特征在于：

所述的反应的时间1～3h；

所述的洗涤为依次用饱和BF₄Na溶液和去离子水进行洗涤；

所述的4-重氮苯炔的保存方式为：避光保存于4℃下。

4.权利要求1所述的4-重氮苯炔在制备静默区拉曼报告分子中的应用。

5.权利要求1所述的4-重氮苯炔在检测过氧化氢中的应用。

6.一种基于静默区报告分子的表面增强拉曼散射检测过氧化氢的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将金微米粒子加入到4-巯基苯硼酸的乙醇溶液中振荡反应，待反应结束后洗涤，得到SERS探针；

(2)配制至少5个浓度梯度的过氧化氢水溶液；

(3)将步骤(1)中得到的SERS探针分别加入到步骤(2)中配制的不同浓度的过氧化氢水溶液中，振荡反应，得到反应后的SERS探针；然后将反应后的SERS探针洗涤后再加入权利要求1所述的4-重氮苯炔继续振荡反应，待反应结束后洗涤、干燥，得到连接静默区报告分子的SERS探针；接着将连接静默区报告分子的SERS探针进行SERS表征，获得2125与1071cm^-1两处的峰强度，并计算其比值；最后根据2125与1071cm^-1两处峰强度的比值和过氧化氢水溶液的浓度绘制标准曲线；

(4)将步骤(1)中得到的SERS探针分别加入到待测样品溶液中振荡反应，得到反应后的SERS探针；然后将反应后的SERS探针洗涤后加入权利要求1所述的4-重氮苯炔继续振荡反应，待反应结束后洗涤、干燥，得到连接静默区报告分子的SERS探针；接着将连接静默区报告分子的SERS探针进行SERS表征，获得2125与1071cm^-1两处峰强度，并计算其比值；最后根据2125与1071cm^-1两处峰强度的比值和步骤(3)中绘制的标准曲线，获得待测样品溶液中过氧化氢的浓度，或进一步计算得到其含量。

7.根据权利要求6所述的基于静默区报告分子的表面增强拉曼散射检测过氧化氢的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述金微米粒子通过如下方法制备得到的：将氯金酸水溶液溶于盐酸溶液中，然后加入聚乙烯吡咯烷酮并置于冰上冷却至0～4℃，然后加入3-脒基-苯胺，于2～8℃下静置反应，待反应结束后离心洗涤，得到金微米粒子；

所述的氯金酸、聚乙烯吡咯烷酮和3-脒基-苯胺的质量比为1：0.05～3.2：0.3～10。

8.根据权利要求7所述的基于静默区报告分子的表面增强拉曼散射检测过氧化氢的方法，其特征在于：

所述的氯金酸水溶液的质量浓度为5～25％；

所述的盐酸溶液为浓度1mmol/L的盐酸水溶液；

所述的氯金酸水溶液与盐酸的体积比为1：125；

所述的静置反应的时间为10min～120h；

所述的离心洗涤的条件为：在5000rpm下离心3～10min。

9.根据权利要求6所述的基于静默区报告分子的表面增强拉曼散射检测过氧化氢的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的金微米粒子和4-巯基苯硼酸的摩尔比1：50～200；

步骤(2)中所述的过氧化氢水溶液的用量为按其在所述反应体系的终浓度为0.0001～1500μM添加计算；

步骤(3)中所述的SERS探针和4-重氮苯炔的摩尔比的摩尔比1：50～200。

10.根据权利要求6所述的基于静默区报告分子的表面增强拉曼散射检测过氧化氢的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的反应的时间1～3h；

步骤(1)中所述的洗涤为依次用乙醇和去离子水进行洗涤；

步骤(3)和(4)中所述的振荡反应的时间1～3h；

步骤(3)和(4)中所述的继续振荡反应的时间1～3h；

步骤(3)和(4)中所述的洗涤为采用去离子水进行洗涤；

步骤(3)和(4)中所述的SERS表征为使用633nm激光激发，记录单个CLMP上的SERS光谱。

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