JP2003532898A

JP2003532898A - 生体標識としてのドープ処理されたナノ粒子

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Publication number: JP2003532898A
Application number: JP2001583192A
Authority: JP
Inventors: ホーアイゼルヴェルナー; ペトリクリストフ; ハーゼマルクス; リヴォツキーカーステン; ボーマンケルスティン
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 2000-05-05
Filing date: 2001-04-23
Publication date: 2003-11-05
Also published as: CA2407899A1; DE50109214D1; WO2001086299A3; AU5835801A; CA2407899C; EP1282824B1; WO2001086299A2; AU2001258358B2; EP1282824A2; ATE320605T1; ES2258527T3; US20040014060A1

Abstract

(57)【要約】本発明の対象は、放射源を使用した励起後に、励起放射線の吸収及び／又は散乱及び／又は回折により又は蛍光の放出により検出することができ、かつ、アフィニティー分子が生物学的又はその他の有機基質を検出ために調製された表面に結合することができるように、表面が調製されている、発光性の、無機の、ドープ処理されたナノ粒子（ｌｉｄナノ粒子）を含有する単純検出プローブである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、発光性の、無機の、ドープ処理されたナノ粒子（luminescent inor
ganic doped nanoparticles：以下ｌｉｄナノ粒子と記載する）を含有する、生
物学的適用のための検出プローブに関する。

【０００２】特異的基質を標識又はモニターするための生物学的系においてマーカーを使用
することは、この１０年来医学的診断及びバイオテクノロジー研究における確立
されたツールになっている。このようなマーカーは、特にフローサイトメトリー
、組織学、イムノアッセイ又は蛍光顕微鏡において、後者においては生物学的及
び／又は非生物学的材料を調査するために適用される。

【０００３】生物学及び生化学において最も慣用のマーカー系は、ヨウ素、リン及びその他
の元素の放射性アイソトープ及びまた西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリ
ホスファターゼのような酵素であり、これらの検出のためには、特異的基質が必
要となる。さらに、ますます使用されているマーカーは、蛍光有機色素分子、例
えばフルオレセイン、テキサスレッド又はＣｙ５であり、これらは選択的に特異
的生物学的又はその他の有機基質に結合される。使用される系に基づき、大抵、
検出すべき基質を明白に識別するために特異的アフィニティーを有する、検出す
べき基質とマーカーの間の別のリンカー分子、又は別の複数リンカー分子又はア
フィニティー分子の組合せが必要である。このために要求される技術は、公知で
ありかつ例えば“Bioconjugate Techniques”, G. T. Hermanson, Academic Pre
ss, 1996又は“Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity
. A Practical Guide to Technology for Quantitative Real-Time Analysis”,
第２版、W.T. Mason, ed. Academic Press 1999に記載されている。マーカーの
外的、一般に電磁的励起後に、次いでマーカーは蛍光の放出を介して前記マーカ
ーに結合された生物学的及び／又はその他の有機基質の存在を表示する。

【０００４】今日の技術の水準を表す蛍光有機色素分子は、特に酸素又は遊離基の存在でか
つしばしば既に数百万回の光吸収／光放出サイクル後に不可逆的に損傷又は破壊
されるという欠点を有する。従って、これらの入射光に対する安定性は、しばし
ば多くの適用のためには不十分である。さらに、蛍光有機色素分子は、生物学的
環境に光毒性作用を及ぼすこともある。

【０００５】蛍光有機色素分子のその他の欠点は、しばしば蛍光スペクトルの長波長側への
付加的広がりを有する、それらの幅広い発光帯域である。これは、“マルチプレ
クシング（multiplexing）”、即ちこの場合には部分的オーバラップする発光帯
域に基づきそれぞれ異なった蛍光色素で標識された複数の基質の同時同定を妨害
しかつ平行して検出可能な異なった基質の数を著しく制限する。複数の有機蛍光
色素を同時に使用する際の別の欠点は、色素の励起を行うことができるスペクト
ル励起帯域が比較的狭いことにある。従って、全ての色素を有効に励起すること
が可能であるためには、複数の光源、一般にはレーザ、又は白色光源及びカラー
フィルタの適当な装置を使用した複雑な光学的設計を使用しなればならない。

【０００６】蛍光有機色素に対する選択的マーカーとして、蛍光無機半導体ナノ結晶が提案
された。特許明細書ＵＳ５,９９０,４７０並びにＰＣＴ出願ＷＯ００／１７６４
２及びＷＯ００／２９６１７は、ＩＩ−ＶＩ又はＩＩＩ−Ｖ半導体化合物のクラ
スの構成員に属しかつ特定の前提の下ではまた周期表の第４主族の元素からなる
蛍光無機半導体ナノ結晶を生物学的系で使用することができることを開示してい
る。半導体ナノ結晶の蛍光の放出波長は、いわゆる“量子サイズ効果（quantum
size effect）”を利用して前記半導体ナノ結晶のサイズを変更することにより
可視及び近赤外スペクトル領域に調節することができる。放出波長の正確な位置
は、選択された半導体材料の伝導帯と価電子帯の間の固体バンドギャップに依存
しかつ粒子寸法及び／又はその分布により決定される。さらに、半導体ナノ結晶
及びその生物学的マーカーとしての使用は、Warren C. W. Chan and Shuming Ni
e, Science, Vol. 281, p. 2016-2018及びMarcel Bruchez Jr., Mario Moronne,
Peter Gin, Shimon Weiss, A. Paul Alivisatos, Science, Vol. 281, 1998, p
. 2013-2016に記載されている。

【０００７】半導体ナノ結晶は、最高の精度をもって製造しなければならず、従って容易に
生産することができないという欠点を有する。蛍光の放出波長は半導体ナノ結晶
の寸法に依存するので、多数の個々の半導体ナノ結晶からの蛍光放出から構成さ
れる蛍光の狭い帯域幅は、前記半導体ナノ結晶の極めて狭い寸法分布を必要とす
る。マルチプレクシングのために必要とされる狭い蛍光帯域幅を保証するために
は、個々の半導体ナノ結晶は、寸法において数オングストロームだけ、即ち数個
の単層だけ異なることができる。このことは半導体ナノ結晶の合成に高い要求を
課する。さらに、半導体ナノ結晶においては、半導体ナノ結晶の表面上での無放
射の電子−正孔対再結合に起因する比較的低い量子収量が観察された。この理由
のために、複雑なコア−シェル構造が提案され、この場合にはコアは実際の半導
体材料からなりかつシェルは、可能であれば、シェル上でエピタキシャル成長し
た大きなバンドギャップを有する別の半導体材料（例えばＣｄＳ又はＺｎＳ）か
らなる。これらのコア−シェル粒子が検出すべき生物学的材料に結合できるよう
にするために、有利にはシリカガラス（ＳｉＯ_ｘ、ｘ＝１〜２）からなる別の薄
いシェルが付加的に被着された（ＵＳ５,９９０,４７９、ＷＯ９９／２１９３４
、ＥＰ１０３４２３４、Peng et al., Journal of the American Chemical Soci
ety, Vol. 119, 1997, p. 7019-7029）。さらに、この種の多重のコア−シェル
構造は、比較的に複雑な合成ステップを含む。もう１つの欠点は、文献から公知
の半導体ナノ結晶の大多数及び今日まで実地において使用されるものの殆ど全て
は、毒性として分類されねばならない元素、例えばカドミウム、セレン、テルル
、インジウム、ヒ素、ガリウム又は水銀を含有するという事実である。

【０００８】さらに、金又は銀のような貴金属のコロイドを特異的生物学的基質を検出する
ためのプローブとして使用することも可能である。前記コロイドの表面は、生体
分子との結合が可能であるように変性された。該コロイドは、白色光の放射後の
光吸収の又は弾性的散乱光の測定を介して検出される。従って、波長が材料及び
粒子寸法に対して特異的である金属粒子の表面プラズマ共鳴を励起することのよ
り、特異的に粒子の特定の部類を同定し、かつそれによってまた相応する結合を
同定することが可能である（S. Schultz, D. R. Smith, J. J. Mock, D. A. Moc
k, D. A. Schulz; Proceedings of the National Academy of Science, Vol. 97
, Issue 3, February 1, 2000, p. 996-1001）。大きな吸収断面積及び散乱断面
積により、該検出は極めて敏感である。しかしながら、この解決手段の欠点は、
尤も利用可能な有効波長の選択が比較的小さく、従って真のマルチプレクシング
は制限をもって可能であるにすぎないことにある。さらに、光散乱効率は、著し
く強度に材料及び粒子寸法に依存するので、検出すべき生体分子のための検出感
度は、材料に、但し大部分はレポーターとして作用する金属粒子の寸法、ひいて
は散乱カラーに依存する。

【０００９】特許ＵＳ４,６３７,９８８及びＵＳ５,８９１,６５６は、蛍光マーカーとして
ランタニド系列の金属イオンを有する金属キレートの使用の可能性を開示してい
る。この系の利点は、光吸収によって励起された状態が、ミリ秒まで達する長い
寿命を有することにある。このことは、リポーター蛍光を時間分解方式で検出す
ることを可能にするので、自動蛍光（autofluorescent light）を実質的に完全
に抑制することができる。しかしながら、これらのキレート系は、そのルミネセ
ンスが、しばしば大抵の生物学的適用にために必要とされる水性媒体中で濡らさ
れるという欠点を有する。従って、しばじばキレートを付加的なステップで実際
に検出すべき基質から分離しかつそれらを無水の環境に移すことが必要である（
I. Hemmilae, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 48, 1988, p. 389-400）。しかし
ながら、結果として、標識の空間情報が分離ステップで失われるので、免疫組織
化学的調査は不可能である。

【００１０】特許ＵＳ４,２８３,３８２及びＵＳ４,２５９,３１３は、ランタニド系列の金
属イオンを有する金属キレートが埋め込まれたポリマー（ラテックス）粒子を同
様に蛍光マーカーとして使用することができることをを開示している。

【００１１】長期間にわたり蛍光ランプ又は陰極線管における被覆材料として使用されてき
た発光リンも、同様に生物学的系においてレポーター粒子として使用された。Ｕ
Ｓ５,０４３,２６５は、蛍光測定により発光リン粒子に結合された生物学的巨大
分子を検出する可能性を開示している。それによれば、リン粒子は５μｍ未満、
有利には１μｍ未満であるべきである記載されている。しかしながら、また、粒
子の蛍光強度は直径が小さくになるに伴い急速に低下する、従って粒子は２０ｎ
ｍより大きい、有利にはその上１００ｎｍよりも大きいべきであると記載されて
いる。この理由は、明白に就中前記粒子の製造方法にある。寸法が約５μｍの市
場で入手可能なリンから出発する場合には、これらをボールミル内で１μｍ未満
の寸法に縮小させる。不利なことに、この作業手順は、幅広い粒子寸法分布及び
一般に比較的高度の凝集をもたらす。さらに、蛍光放射の量子効率をかなり低下
させるであろう大多数の欠陥が、恐らく粒子の結晶構造内に導入される。もう１
つの欠点は、前記発明に記載された粒子は、それらの一般に数１００ナノメータ
の寸法及び広い寸法分布に基づき、例えば細胞成分を染色する場合又は基質をモ
ニターする場合におけるようなマーカー質量及びマーカー寸法が重要であるよう
な多くの適用から排除されるという事実にある。

【００１２】生物学的適用のためにも有効であるという１ｎｍ〜１００ｎｍの寸法を有する
一定の発光リンの特殊な製造方法が、ＵＳ５,８９３,９９９に特許請求されてい
る。この明細書中には、該粒子は、気相合成（蒸発及び凝縮、ＲＦ熱プラズマ法
、プラズマスプレーイング、スパッタリング）及び熱水合成により製造すること
ができると記載されている。これらの粒子の、特に生物学及び生化学の分野にお
ける適用のための欠点は、一次粒子の高度の凝集、ひいては実際に使用可能な凝
集物の大きな全体的寸法並びに使用される粒子の幅広い寸法分布であり、これら
の全ては元来記載された製造方法に基づく。さらに、凝集の度合いもまた広い寸
法分布も、該特許明細書に添付されている電子顕微鏡写真で明らかに見ることが
できる。

【００１３】ＵＳ５,６７４,６９８には、生物学的標識として使用するための特殊なタイプ
の発光リンが記載されている。これらは、吸収される光よりも短い波長を有する
光を、２つのフォトンプロセスを介して放出する特性を有するアップコンバーテ
ィングリン（upconverting phosphors）である。これらの粒子を使用すれば、そ
のような自動蛍光が極めて十分に抑制されるので、基本的にはバックグラウンド
不在で作業することができる。該粒子は、ミリング、引き続いての熱処理により
製造される。粒子寸法は、１０ｎｍ〜３μｍ、有利には３００ｎｍ〜１μｍであ
る。この場合の欠点もまた、製造方法に起因する大きな粒子寸法及び幅広い寸法
分布である。

【００１４】ＵＳ５,８９１,３６１及びＵＳ６,０３９,８９４は、ミリングを含まない前記
の“アップコンバーティング”発光リンの製造方法を開示している。これらは気
相内で部分的反応性高温後処理による寸法が１００ｎｍ〜１μｍの蛍光リンに変
換された沈降生成物である。この場合もまた、欠点は再び、合成中の高温によっ
て惹起される大きな粒子寸法及び幅広い寸法分布にある。

【００１５】学問的刊行物には、選択された発光する、無機の、ドープ処理されたナノ粒子
の製造及びその発光特性の研究が扱われている。公開された発光する、無機の、
ドープ処理されたナノ粒子は、ランタニド、又はさらにＭｎ、Ａｌ、Ａｇ又はＣ
ｕでドープ処理された酸化物、硫化物、リン酸塩又はバナジン酸塩からなる。こ
れらの発光する、無機の、ドープ処理されたナノ粒子は、それらのドープ処理に
基づき狭いスペクトル範囲内で蛍光を発する。適用可能性は、それらの陰極線管
におけるリンとして又はランプ内の発光物質としての使用に見られる。就中、以
下の発光する、無機の、ドープ処理されたナノ粒子の製造が公表されている：

【００１６】

【外１】

【００１７】数ミクロンの寸法を有する公知の発光する、無機の、ドープ処理されたナノ粒
子及びそれらの工業的リンとしての使用に関する概要は、Ullmann's Encycloped
ia of Industrial Chemistry, WILEY-VCH, 第６版、１９９９, Electronic Rele
ase, Chapter “Luminescent Materials: 1. Inorganic Phosphors”に見ること
ができる。該刊行文献に記載された概要は、専らそこに記載された適用のために
使用可能な材料部類に関し、ナノ粒子の形のこれらの材料の特殊な特性には言及
していない。

【００１８】本発明の課題は、寸法が数ナノメートルの無機の発光粒子からなりかつ従来の
技術において公知のマーカーの前記の欠点を有しない、生物学的適用のための検
出プローブを提供することである。

【００１９】本発明の課題は、発光性の、無機の、ドープ処理されたナノ粒子（luminescen
t inorganic doped nanoparticles：ｌｉｄナノ粒子）からなる、生物学的適用
のためのを検出プローブによって解決される。

【００２０】ｌｉｄナノ粒子には、異種イオンが、それらを放射源を使用した励起後に前記
放射線の吸収及び／又は散乱及び／又は回折を介して又は蛍光の放出を介して検
出することができるようにドープされている。該ｌｉｄナノ粒子は、狭帯域又は
広帯域電磁放射線により又は粒子ビームにより励起することができる。該粒子は
、前記放射線の吸収及び／又は散乱及び／又は回折のおける変化の測定により，
又は材料特異性蛍光又はその変化の測定により定性的及び／又は定量的に検出す
ることができる。

【００２１】該ｌｉｄナノ粒子は、１ｎｍ〜１μｍの範囲内、有利には２ｎｍ〜１００ｎｍ
の範囲内、特に有利には２ｎｍから２０ｎｍ未満の範囲内、極めて特に有利には
２ｎｍ〜１０ｎｍの大きさ（expansions）を有するほぼ球形の形態を有する。“
大きさ”とは、ｌｉｄ粒子の表面に存在する２つの点の最大間隔を意味する。ｌ
ｉｄナノ粒子はまた楕円体状の形態を有していてもよく又はカットされていても
よく、その際大きさは前記限界内にある。さらに、ｌｉｄナノ粒子はまた、３ｎ
ｍ〜５０ｎｍ、有利には３ｎｍから２０ｎｍ未満の幅及び２０ｎｍ〜５μｍ、有
利には２０ｎｍ〜５００ｎｍの長さを有する特有の針状の形態を有することもで
きる。粒子寸法は、超遠心分離法又はゲルパーミエーションクロマトグラフィー
法を使用して又は電子顕微鏡を用いて決定することができる。

【００２２】ｌｉｄナノ粒子のための本発明に基づき適当な材料は、その結晶格子（ホスト
材料）に異種イオンがドープされた無機ナノ結晶である。これには、特に、例え
ばUllmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, WILEY-VCH, 第６版、199
9, Electronic Release, Chapter “Luminescent Material: 1. Inorganic Phos
phors”に挙げられているような、例えば発光スクリーン（例えば電子線管のた
め）においていわゆるリンとして又は蛍光ランプ（例えばガス放電ランプのため
の）において被覆材料として使用される全ての材料及び材料部類、並びに前記に
引用した従来の技術から公知の発光する、無機の、ドープ処理されたナノ粒子が
挙げられる。これらの材料において、異種イオンは、ＵＶ光、可視光又はＩＲ線
、Ｘ線又はガンマ線又は電子線により励起した後に蛍光放出の活性剤として働く
。さらに、若干の材料の場合にはまた、一方では放出のための活性剤を発生させ
るために、他方では粒子系を一層有効に励起するため、又は所定の励起光源の波
長へのシフトによって吸収波長を調整する（いわゆる増感剤）ために、複数のタ
イプの異種イオンをホスト格子内に導入する。複数のタイプの異種イオンの導入
は、意図的に、粒子から放出されるべき蛍光帯域の特定の組合せを設定するため
に利用することもできる。

【００２３】ｌｉｄナノ粒子のホスト材料は、有利にはＸＹタイプの化合物からなる。この
場合、Ｘは周期表の主族１ａ、２ａ、３ａ、４ａ、遷移族２ｂ、３ｂ、４ｂ、５
ｂ、６ｂ、７ｂ又はランタノイドの元素のカチオンである。若干の場合には、Ｘ
は前記元素の組合せ又は混合物であってもよい。Ｙは、周期表の主族３ａ、４ａ
、５ａ、遷移族３ｂ、４ｂ、５ｂ、６ｂ、７ｂ及び／又は８ｂの１種以上の元素
及びまた主族６ａ及び／又は７ａの複数の元素からなる多原子のアニオンであっ
てよい。しかしながら、Ｙは周期表の主族５ａ、６ａ又は７ａの単原子のアニオ
ンであってもよい。ｌｉｄナノ粒子のホスト材料は、周期表の主族４ａの元素か
らなっていてもよい。また、主族１ａ、２ａ又はＡｌ、Ｃｒ、Ｔｌ、Ｍｎ、Ａｇ
、Ｃｕ、Ａｓ、Ｎｂ、Ｎｄ、Ｎｉ、Ｔｉ、Ｉｎ、Ｓｂ、Ｇａ、Ｓｉ、Ｐｂ、Ｂｉ
、Ｚｎ、Ｃｏからなる群の元素及び／又はランタニドの元素の１種以上の元素を
ドーピング剤として使用することができる。互いに異なった相対濃度での前記元
素の２種以上の組合せをドーピング材料として使用することもできる。ホスト格
子内のドーピング材料濃度は、１０^- ^５ｍｏｌ％〜５０ｍｏｌ％、有利には０．
０１ｍｏｌ％〜３０ｍｏｌ％、特に有利には０．１ｍｏｌ％〜２０ｍｏｌ％であ
る。

【００２４】ｌｉｄナノ粒子のホスト材料としては、硫化物、セレン化物、スルホセレン化
物、オキシ硫化物、ホウ酸塩、アルミン酸塩、没食子酸塩、ケイ酸塩、ゲルマニ
ウム酸塩、リン酸塩、ハロゲンリン酸塩、酸化物、ヒ酸塩、バナジン酸塩、ニオ
ブ酸塩、タンタル酸塩、硫酸塩、タングステン酸塩、モリブデン酸塩、アルカリ
金属ハロゲン化物及びその他のハロゲン化物又は窒化物を使用するのが有利であ
る。これらの材料部類の例は、相応するドーピング剤と一緒に、以下のリストに
示されている（タイプＢ材料：Ａ＋Ｂ＝ホスト材料及びＡ＝ドーピング材料）：

【００２５】

【化５】

【００２６】

【化６】

【００２７】ｌｉｄナノ粒子としては以下の材料を使用するのが特に有利である：

【００２８】

【化７】

【００２９】特に有利な材料のうちで、特にホスト格子の立方体構造を有するものが選択され
る。それというのも、これらの材料においては個々の蛍光帯域の数が最小になる
からである。これらの例は、以下のものである：

【００３０】

【化８】

【００３１】単純検出プローブは、放射源を使用して励起した後に、励起放射線の吸収及び
／又は散乱及び／又は回折により、又は蛍光の放出により検出することができ、
かつ、その表面が、アフィニティー分子が生物学的及び／又はその他の有機基質
を検出ために前記の調製された表面に結合することができるように調製されてい
る、蛍光性の、無機の、ドープ処理されたナノ結晶（ｌｉｄナノ粒子）を含有す
る。

【００３２】表面調製は、ｌｉｄナノ粒子の表面が化学的に変性されておりかつ／又は反応
性基及び／又は共有又は非供給結合されたリンカー分子を有することにある。

【００３３】挙げることができるｌｉｄナノ粒子の表面の化学的変性の例は、ｌｉｄナノ粒
子のシリカでの被覆である：シリカは、極めて急速に例えばトリエトキシシラン
又はクロロシランのような有機リンカーと反応するので、有機分子の単純な化学
的結合（simple chemical conjugation）を可能にする。

【００３４】ｌｉｄナノ粒子の表面を調製するための別の可能性は、ナノ粒子を構成してい
る酸化物の遷移金属化合物を塩素ガス又は有機塩素化剤を使用して相応するオキ
シクロリドに変換することである。これらのオキシクロリドは、次いで例えばア
ミノ基のような求核基と反応して、遷移金属窒素化合物を生成する。このように
して、例えばリジン側鎖のアミノ基を介してタンパク質の直接結合を達成するこ
とが可能である。オキシクロライドでの表面変性の後に、タンパク質をマレイン
イミドプロピオン酸ヒドラジドのような二官能価リンカーを使用することにより
結合させることもできる。

【００３５】この場合、非共有結合のために特に有用な分子は、ｌｉｄナノ粒子表面とは反
対の極性又は電荷を有する鎖状分子である。ｌｉｄナノ粒子に非共有結合される
リンカー分子の例としては、アニオン性、カチオン性又は両性イオン性デタージ
ェント、酸性又は塩基性タンパク質、ポリアミン、ポリアミド及びポリスルホン
酸又はポリカルボン酸である。前記分子は、簡単なコインキュベーションにより
ｌｉｄナノ粒子の表面に吸着させることができる。次いで、これらの非共有結合
したリンカー分子へのアフィニティー分子の結合を、有機化学の標準的方法、例
えば吸着される又は吸着可能な材料の酸化、ハロゲン化、アルキル化、アシル化
、付加、置換又はアミド化を使用して実施することができる。非共有結合したリ
ンカー分子にアフィニティー分子を結合させるための前記方法は、ｌｉｄナノ粒
子への吸着の前又は前記リンカー分子がｌｉｄナノ粒子に既に吸着された後のい
ずれかにリンカー分子に適用することができる。

【００３６】ｌｉｄナノ粒子の表面だけが反応性基を有することができるだけでなく、結合
されるリンカー分子もそれらの部分として、ｌｉｄナノ粒子の表面への又は別の
リンカー分子又はアフィニティー分子への結合点として働くことができる反応性
基を有することもできる。荷電されていてもよく又は荷電されていなくてもよい
、又は部分的電荷を有していてもよい前記のような反応性基は、ｌｉｄナノ粒子
の表面に位置していてもよくまかつまたリンカー分子の一部であってもよい。可
能な反応性の官能基は、アミノ基、カルボン酸基、チオール、チオエーテル、ジ
スルフィド、イミダゾール、グアニジン、ヒドロキシル基、インドール、ビシナ
ルジオール、アルデヒド、アルファ−ハロアセチル基、Ｎ−マレインイミド、水
銀オルガニル、アリールハロゲン化物、酸無水物、イソシアネート、イソチオシ
アネート、スルホニルハロゲン化物、イミドエステル、ジアゾアセテート、ジア
ゾニウム塩、１，２−ジケトン、アルファ−ベータ−不飽和カルボニル化合物、
ホスホン酸、リン酸エステル、スルホン酸、アゾリド又は前記基の誘導体であっ
てよい。

【００３７】核酸分子もリンカー分子として利用することができる。これらは、リンカー分
子に対して相補的配列を有する核酸分子を含有するアフィニティー分子に対する
結合を形成する。

【００３８】さらに、本発明の対象は、単純検出プローブと、１種以上のアフィニティー分
子又は互いに結合された複数のアフィニティー分子との組合せからなる拡張検出
プローブである。これらのアフィニティー分子又は異なるアフィニティー分子の
組合せは、生物学的基質に対するそれらの特異的アフィニティーを基礎として選
択され、それらの存在又は不在を検出することができる。この場合、一方では単
純検出プローブに結合することができ、かつ他方では検出すべき生物学的又はそ
の他の有機基質に特異的に結合することができる任意の分子又は分子の任意の組
合せをアフィニティー分子として使用することができる。分子の組合せの個々の
成分は、同時に又は順次に単純検出プローブに施すことができる。

【００３９】一般に、従来の技術に記載された蛍光を発する有機色素分子においても利用さ
れるようなアフィニティー分子を、これらを検出すべき生物学的及び／又はその
他の有機基質に特異的に結合させるために使用することができる。アフィニティ
ー分子は、モノクローナル又はポリクローナル抗体、その他のタンパク質、ペプ
チド、オリゴヌクレオチド、プラスミド又はその他の核酸分子、オリゴ糖又は多
糖、ヘプタン、例えばビオチン又はジゴキシン又は低分子量合成又は自然抗原で
あってよい。このような分子のリストは、一般に入手可能な文献、例えばR. P.
Hauglund, Molecular Probes, Inc.による“Handbook of Fluorescent Probes a
nd Research Chemicals”（第７版、ＣＤ−ＲＯＭ）に公表されている。

【００４０】検出すべき生物学的試薬のための拡張検出プローブのアフィニティーは、一般
に、検出すべき試薬に対して所望のアフィニティーを有する、通常有機アフィニ
ティー分子に単純検出プローブが結合されていることより生じる。この場合、ア
フィニティー分子及び単純検出プローブの表面上の反応性基が、これらの２つの
分子を共有又は非共有結合させるために利用される。アフィニティー分子表面上
の反応性基は、アミノ基、カルボン酸基、チオール、チオエーテル、ジスルフィ
ド、イミダゾール、グアニジン、ヒドロキシル基、インドール、ビシナルジオー
ル、アルデヒド、アルファ−ハロアセチル基、Ｎ−マレインイミド、水銀オルガ
ニル、アリールハロゲン化物、酸無水物、イソシアネート、イソチオシアネート
、スルホニルハロゲン化物、イミドエステル、ジアゾアセテート、ジアゾニウム
塩、１，２−ジケトン、アルファ−ベータ−不飽和カルボニル化合物、又はアゾ
リドである。単純検出プローブの表面上で、別の前記の基をアフィニティー分子
を結合させるために使用することができる。

【００４１】単純検出プローブをアフィニティー分子としてのタンパク質に結合させるため
の多くの可能性の１つとして、以下の反応が挙げられる。シリカ被覆ｌｉｄナノ
粒子を３−アミノプロピルトリエトキシシラン（Pierce, Rockfold, IL, USA）
と反応させ、引き続きＳＭＣＣ活性化（スクシンイミジル４−［Ｎ−マレインイ
ミドメチル］シクロヘキサン１−カルボキシレート）（Pierce）を行う。この活
性化したｌｉｄナノ粒子の対する反応のために必要なタンパク質結合したチオー
ル基は、リジン含有タンパク質を２−イミノチオラン（Pierce）と反応させるこ
とにより形成することができる。この反応において、結合すべきタンパク質のリ
ジン側鎖は、２−イミノチオランと、開環及びチオアミジンの形成を伴って反応
する。この際に形成され、タンパク質と共有結合したチオール基は、次いで、ヘ
テロ−ミカエル付加（hetero-Michael addition）で単純検出プローブの表面に
結合したマレインイミド基と反応し、アフィニティー分子としてのタンパク質と
単純検出プローブの間の共有結合を形成することができる。

【００４２】アフィニティー分子と単純検出プローブから結合により拡張検出プローブを形
成する前記可能性の他に、多数の市販のリンカー分子の公知の反応性から誘導す
ることができる無数の別の方法が存在する。

【００４３】単純検出プローブとアフィニティー分子の間の共有結合の他に、非共有セルフ
−オルガナイズド（self-organized）結合が実現可能である。この場合、１つの
可能性として、リンカー分子としてのビオチンを有する単純検出プローブの、ア
ビジン又はストレプトアビジン結合したアフィニティー分子に対する結合が挙げ
られる。

【００４４】単純検出プローブとアフィニティー分子の間のもう１つの非共有セルフ−オル
ガナイズド結合は、核酸分子を含有する単純検出プローブと、アフィニティー分
子の表面に結合された相補的配列との相互作用にある。

【００４５】拡張検出プローブは、核酸を直接単純検出プローブの調製された表面に結合せ
るか、又はアフィニティー分子の反応性基を形成することにより形成することが
できる。この種の拡張検出プローブは、相補的配列を有する核酸分子を検出する
ために使用される。

【００４６】さらに、本発明は、単純検出プローブを製造する方法、拡張検出プローブを製
造する方法及び生物学的材料内の特異的基質を検出する方法に関する。

【００４７】単純検出プローブを製造するための本発明による方法は、以下のステップ：ａ）ｌｉｄナノ粒子を製造する、ｂ）前記ｌｉｄナノ粒子の表面を化学的に変性させる及び／又はｃ）前記ｌｉｄナノ粒子の表面上に反応性基を調製する及び／又はｄ）１種以上のリンカー分子をｌｉｄナノ粒子の表面に共有又は非共有結合によ
り結合させるからなる。

【００４８】ステップａ）で製造されたｌｉｄナノ粒子の大きさの分布範囲は、平均大きさ
の＋／−２０％の範囲に制限するのが有利である。

【００４９】拡張検出プローブを製造する本発明による方法は、以下のステップ：ｅ）単純検出プローブを準備する、ｆ）リンカー分子への結合を可能にする反応性基を導入するために、アフィニテ
ィー分子の表面を変性させる、ｇ）活性化されたアフィニティー分子と単純検出プローブを結合させるからなる。

【００５０】生物学的材料内の特異的基質を検出するための本発明による方法は、以下のス
テップ：ｈ）拡張検出プローブと、生物学的及び／又は有機材料を一緒にする、ｉ）結合しなかって拡張検出プローブを除去する、ｊ）材料を電磁放射線又は粒子ビームに曝す、ｋ）蛍光を測定するか又は放射線の吸収及び／又は散乱及び／又は回折又はそれ
らの変化を測定するからなる。

【００５１】調査すべき生物学的材料内の分析物を検出ためには、拡張検出プローブを調査
すべき材料と接触させる。調査すべき生物学的材料は、血清、細胞、組織切片、
脳脊髄液、痰、血漿、尿又はその他の、ヒト、動物又は植物起源のサンプルであ
ってもよい。

【００５２】この場合、調査すべき分析物は、有利には既に固定されているか又は超分子集
合体の同時の又は連続した形成で固定することができるべきである。これらの固
定の１例は、検出すべき抗原を吸着された又は別の何らかの方法で結合された一
次抗体を介して固相に特異的に結合させるＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫検定法）で
ある。検出すべき抗原は、組織切片のような生存している細胞集合体又は支持体
に固定された個々の細胞内に含まれていれば、容易に固定することができる。

【００５３】このようにして固定された分析物を拡張検出プローブと接触させると、拡張検
出プローブはそれらに含まれたアフィニティー分子を介して前記分析物に特異的
に結合する。過剰の拡張検出プローブは、容易に洗い流すことができ、かつ特異
的に結合された拡張検出プローブのみが調査すべきサンプル内に残る。このよう
にして調製したサンプルに適当なエネルギー源を使用して照射すると、ｌｉｄナ
ノ粒子を含有する拡張検出プローブの存在を、放出された蛍光を検出するか又は
吸収、散乱、又は回折された放射線における変化を検出することにより検出する
ことができる。それによって、拡張検出プローブに対して適当なアフィニティー
を有する前記の生物学的及び／又は有機基質の存在が検出される。このようにし
て、検定における基質を、それらに対して十分に高いアフィニティーを有する別
の分子が存在する限り、それらの化学的性質とは無関係に定性的及び定量的に検
出することができる。拡張検出プローブは、検出すべき生物学的基質に対して高
い特異的結合定数を有するような分子が、前記拡張検出プローブ内に含まれる単
純検出プローブの表面に結合されている際に特異的である。このようにして、特
殊なタイプの細胞（例えば癌細胞）を検出することも可能である。この関係にお
いて、細胞タイプ特異的生体分子を、細胞表面上のあるいはまた細胞の内部の検
出プローブで標識しかつ光学的に顕微鏡を介して又はフローサイトメータを介し
て検出することができる。

【００５４】前記の検出原理に基づき、生物学的及び／又は有機材料内で同時に複数の異な
った分析物を同時に検出することも可能である（マルチプレクシング）。これは
調査すべき生物学的及び／又は有機材料を同時に異なった検出プローブと接触さ
せることにより実施される。異なった検出プローブは、それらのアフィニティー
分子が異なった分析物に結合しかつ前記検出プローブ内に含有されたｌｉｄナノ
粒子が異なった波長で吸収、散乱、回折するか又は蛍光を放出することにより互
いに異なる。

【００５５】本発明による検出プローブは、入射エネルギーに対して安定でありかつ酸素又
は遊離基に対して安定である。本発明による検出プローブを構成する材料は、非
毒性又は僅かに毒性であるにすぎない。ｌｉｄナノ粒子の極めて狭い寸法分布幅
は、不必要である。それというのも、蛍光帯域のスペクトル位置及びその帯域幅
がドーピングに依存しかつｌｉｄナノ粒子の寸法に実質的に依存しないからであ
る。同様に、蛍光収率を安定化するために、粒子の周りの無機シェルを必要とし
ない。しかしながら、結合化学（conjugation chemistry）を容易にするために
、それを使用することもできる。もう１つの利点は、励起する放射線の吸収波長
もしくは粒子の励起波長が放出波長と相互関係を示さないので、唯一の広帯域又
は狭帯域放射源を使用して実施することができるという事実にある。さらに、時
間分解方式の蛍光測定は、非特異的バックグラウンド蛍光からの特異的蛍光の分
離を可能にする。それというのも、外部放射源により励起されかつ次いで光の放
出に導かれるｌｉｄナノ粒子状態の寿命は、バックグラウンド蛍光よりも一般に
著しく長いからである。

【００５６】本発明による検出プローブ及び本発明による方法は、医療診断においてかつス
クリーニング技術において、特に特異的物質の検出、位置決定及び／又は量子化
の目的のために特的基質を標識することが特殊な部分を演じる分野において有利
に使用される。このことは血液又はその他の身体材料のために実施される診断検
定における特異的抗体の検出を含む。しかしながら、本発明による検出プローブ
は、細胞分析において、即ち癌細胞のような特異的細胞を検出するために使用す
ることもできる。本発明による検出プローブは、前記の可能な使用のために特殊
な利点を提供する。それというのも、この場合マルチプレクシングの可能性、即
ち１回の検定において又はその上単一の細胞において異なる抗原の同時検出を利
用することができるからである。

【００５７】実施例例１：ＹＶＯ_４：Ｌｎからなるｌｉｄナノ粒子の製造第１ステップは、ＹＶＯ_４：Ｌｎを準備することである。ＹＶＯ_４：Ｌｎは、
K. Riwotzki, M. Haase; Jounal of Physical Chemistry B; Vol. 102, 1998, p
. 10130の左欄に記載されている方法により製造することができる。Ｙ（ＮＯ_３
）_３・６Ｈ_２Ｏ３．４１２ｇ（８．９ｍｍｏｌ）及びＥｕ（ＮＯ_３）_３・６Ｈ_２０．２０９ｇ（０．４７ｍｍｏｌ）を、テフロン（登録商標）容器内の蒸留水３
０ｍｌ中に溶かす。蒸留水３０ｍｌ中に溶かしたＮａ_３（ＶＯ_４）・１０Ｈ_２Ｏ
２．７３ｇを撹拌しながら加える。さらに２０分間撹拌した後に、テフロン容器
をオートクレーブに入れかつ撹拌しながら２００℃に加熱する。１時間後に、分
散液をオートクレーブから取り出しかつ３０００Ｇで１０分間遠心分離する。固
体分を抽出しかつ蒸留水４０ｍｌ中にとる。該分散液に１−ヒドロキシエタン−
１，１−ジホスホン酸水溶液（６０質量％）３２２０ｇ（９．３８ｍｍｏｌ）を
加える。過剰のイットリウムイオンから形成されたＹ（ＯＨ_３）をｐＨ値をＨＮ
Ｏ_３で０．３に調整しかつ１時間撹拌することにより除去する。その際、コロイ
ド状Ｖ_２Ｏ_５が形成され、これは溶液の赤みを帯びた着色により認識可能である
。次いで、ｐＨ値をＮａＯＨで１２．５に調整しかつ該溶液を密閉した容器内で
一晩中撹拌する。生じた白色の分散液を、次いで３０００Ｇで１０分間遠心分離
しかつその副生成物を含有する上澄みを除去する。沈殿物は、ＹＶＯ_４：Ｅｕか
らなりかつ蒸留水４０ｍｌ中にとることができる。

【００５８】ほぼ３０ｎｍ未満であるナノ粒子を、分散液を３０００Ｇで１０分間遠心分離
し、上澄みをデカントしかつそれを脇に置くことにより単離する。次いで、再び
沈殿物を蒸留水４０ｍｌ中にとり、３０００Ｇで１０分間遠心分離しかつ上澄み
をデカントする。この上澄みと脇に置いた上澄みを、次いで一緒にしかつ６００
０Ｇで１０分間遠心分離する。これから生じる上澄みは、所望の粒子を含有する
。さらなる透析ステップ（透析チューブＳｅｒｖａ、ＭＷＣＯ１２−１４ＫＤ）
後に、コロイド溶液が得られ、この溶液から回転乾燥器を使用した乾燥（５０℃
）することにより、再分散可能な粉末を得ることができる。

【００５９】例２：ＬａＰＯ_４：Ｅｕからなるｌｉｄナノ粒子の製造第１ステップは、ＬａＰＯ_４：Ｅｕを準備することである。ＬａＰＯ_４：Ｅｕ
は、H. Meyssamy, K. Riwotzki, A. Kornowski, S. Naused, M. Haase; Advance
d Materials, Vol. 11, Issue 10, 1999, p. 839の右欄下からp. 844の左欄上に
記載されている方法により製造することができる。Ｌａ（ＮＯ_３）_３・６Ｈ_２Ｏ
１２．３４ｇ（２８．５ｍｍｏｌ）及びＥｕ（ＮＯ_３）_３・５Ｈ_２０．６４２ｇ
（１．５ｍｍｏｌ）を、テフロン容器内の蒸留水５０ｍｌ中に溶かしかつＮａＯ
Ｈ（１Ｍ）１００ｍｌに加える。蒸留水１００ｍｌ中の（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４３
．５６ｇ（２７ｍｍｏｌ）の溶液を撹拌しながら加える。該溶液をＮａＯＨ（４
Ｍ）でｐＨ１２．５に調整しかつオートクレーブ中で２時間激しく撹拌しながら
２００℃に加熱する。次いで、該分散液を３１５０Ｇで１０分間遠心分離しかつ
上澄みを除去する。不所望のＬａ（ＯＨ）_３を除去するために、沈殿物をＨＮＯ_３（１Ｍ）中に分散させかつ３日間撹拌する（ｐＨ１）。次いで、該分散液を遠
心分離し（３１５０Ｇ、５分間）かつ上澄みを除去する。遠心分離物に蒸留水４
０ｍｌを撹拌しながら加える。

【００６０】ミルク状の分散液は、なお広い寸法分布を有している。約３０ｎｍ未満である
ナノ粒子を単離するために、引き続き完全に例１に類似して適当な遠心分離及び
デカンティングステップを実施する。

【００６１】例３：ＬａＰＯ_４：Ｃｅ，Ｔｂからなるｌｉｄナノ粒子の製造第１ステップは、ＬａＰＯ_４：Ｃｅ，Ｔｂを準備することである。トリス（エ
チルヘキシル）ホスフェート３００ｍｌを、乾燥窒素ガス流内でフラッシングす
る。引き続き、ＬａＣｌ_３・７Ｈ_２Ｏ７．４３ｇ（２０ｍｍｏｌ）、ＣｅＣｌ_３・７Ｈ_２Ｏ８．３８ｇ（２２．５ｍｍｏｌ）及びＴｂＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ２．８ｇ
（７．５ｍｍｏｌ）をメタノール１００ｍｌ中に溶かしかつ加える。次いで、水
及びメタノールを、溶液を減圧下で３０℃〜４０℃に加熱することにより留去す
る。引き続き、トリオクチルアミン６５．５ｍｌ（１５０ｍｍｏｌ）及びトリス
（エチルヘキシル）ホスフェート１５０ｍｌの混合物中に溶かした結晶リン酸４
．９ｇ（５０ｍｍｏｌ）からなる新たに製造した溶液を加える。温度が上昇する
際のＣｅ^３＋の酸化を最小にするために、清澄な溶液を迅速に真空化される容器
に入れ、かつ窒素ガス流でフラッシングしなければならない。次いで、該溶液を
２００℃に加熱する。加熱段階中に、リン酸エステル基の幾分かは分離され、沸
点の漸進的低下を生じる。加熱段階は、温度が１７５℃の低下した際（ほぼ３０
〜４０時間）に終了する。該溶液を室温に冷却した後に、４倍過剰のメタノール
を加え、ナノ粒子を沈殿させる。沈殿物を分離し、メタノールで洗浄しかつ乾燥
する。

【００６２】例４：ＬａＰＯ_４：Ｅｕからなるｌｉｄナノ粒子の製造結晶リン酸４９０ｇ（５．０ｍｍｏｌ）及びトリオクリルアミン６．５ｍｌ（
１５ｍｍｏｌ）を、トリス（エチルヘキシル）ホスフェート３０ｍｌ中に溶かす
。引き続き、Ｌａ（ＮＯ_３）_３・７Ｈ_２Ｏ１．７６ｇ（４．７５ｍｍｏｌ）及び
ＥｕＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ９２ｇ（０．２５ｍｍｏｌ）を、トリス（エチルヘキシル
）ホスフェート５０ｍｌ中に溶かしかつ第１の溶液と一緒にする。生じた溶液を
減圧下でガス抜きしかつ引き続き窒素雰囲気下で１６時間２００℃に加熱する。
加熱段階中に、リン酸エステル基の幾分かは分離され、沸点の漸進的低下を生じ
る。加熱段階は、温度が１８０℃の低下した際に終了する。該溶液を室温に冷却
した後に、メタノールを加え、ナノ粒子を沈殿させる。沈殿物を遠心分離機を用
いて分離し、メタノールで洗浄しかつ乾燥する。

【００６３】例５：例２で製造したナノ粒子のＳｉＯ_２被膜での被覆例２で製造したＬａＰＯ_４：Ｅｕナノ粒子１ｇを、磁気攪拌機を使用して９０
０ｒｐｍで激しく撹拌しながら水１００ｍｌ中に装入し、かつ該混合物を水酸化
テトラブチルアンモニウムでｐＨ１２に調整する。次いで、該分散液にナトリウ
ム水ガラス（ＳｉＯ_２２６．９％：Ｎａ_２Ｏ８．１％）５００ｍｇを、激しく撹
拌しながら加える。引き続き、同様に激しく撹拌しながらエタノール５０ｍｌを
滴加する。生じた沈殿物を遠心分離により除去しかつ残留物を超音波浴内の脱イ
オン水５０ｍｌ中に再分散させる。次いで、分散液を分散しなかった分からデカ
ンティングにより分離しかつ回転蒸発器を用いて圧力１０ミリバール及び温度８
０℃で乾燥する。

【００６４】例６：例５で製造したナノ粒子の抗α−アクチン抗体との結合例５で合成したシリカ被覆ナノ粒子１００ｍｇを、乾燥テトラヒドロフラン（
ＴＨＦ）１０ｍｌに分散させ、かつＮ−メチルモルホリン１００μｌと混合する
。該溶液にＴＨＦ中の３−アミノプロピルトリエトキシシランの１０％の溶液０
．５ｍｌを加える。該溶液を、堅く密閉した容器内で４０℃で一晩中撹拌する。
該溶液を水５ｍｌと混合し、室温でさらに１時間撹拌しかつ場合により沈殿した
材料をガラスフリット（４Ｇ、Schott）を使用して濾別する。炉液を、限外濾過
チューブ（Centricon, Amicon, カットオフ１０ｋＤ）内でＴＳＥ７緩衝液（Ｔ
ＳＥ７：水中のトリエタノールアミン１００ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム５０ｍｍ
ｏｌ、ＥＤＴＡ１ｍｍｏｌ、ｐＨ７．３）中で緩衝させる。目標容量は２ｍｌで
あり、交換ファクタは１０００である。ＴＳＥ７緩衝液２ｍｌ中の限外濾過膜に
よって保留されたアミノ活性化ナノ粒子を、ｓＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジ
ル４−［Ｎ−マレインイミドメチル］シクロヘキサンカルボキシレート：Pierce
, Rockwell, ＩＬ，ＵＳＡ）２０ｍｍｏｌの溶液と混合しかつ２５℃で６０分間
撹拌する。得られた混合物を、前記のような１０ｋＤ Centriconチューブ内のＴ
ＳＥ７緩衝液中で緩衝させ、かつ容量を２ｍｌに減少させる。このステップは、
５℃で実施する。得られた溶液は、冷蔵庫内で１２時間安定である。モノクロー
ナル抗アクチン抗体（Sigma）１０ｍｇを、Centricon限外濾過チューブ（カット
オフ５０ｋＤ）を用いてＴＳＥ８緩衝液（交換ファクタ１０００，ＴＳＥ８：水
中のトリエタノールアミン１００ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム５０ｍｍｏｌ、ＥＤ
ＴＡ１ｍｍｏｌ、ｐＨ８．５）に移す。タンパク質濃度を、７〜８ｍｇ／ｍｌに
調整する。該抗体溶液に、ＴＳＥ８緩衝液中の２−イミノチオランの１０ｍＭ溶
液１５０μｌを加えかつ該混合物を１５分間反応させる。このようにしてチオー
ル活性化した抗体を、未反応活性剤分子を除去するために、前記のようなＴＳＥ
８緩衝液で４℃で緩衝させかつ容量を２ｍｌに減少させる。活性化したナノ粒子
及び活性化したナノ粒子を含有する溶液を一緒にしかつ室温で一晩中撹拌する。
こうして得られた拡張検出粒子の分散液から、Superdex ２００（Phamacia）で
ゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより未反応抗体を除去する。使用す
るランニング緩衝液は、ＴＳＥ７である。結合されなかった拡張ｌｉｄナノ粒子
の保持時間は、ほぼ２時間である。

【００６５】例７：例１で製造したｌｉｄナノ粒子と抗ミオグロビン抗体との結合例１で製造したバナジン酸塩ナノ粒子１００ｍｇを、ガラス管内で加熱テープ
を使用してアルゴン流内で加熱する。該粒子をほぼ１時間加熱した後に、該ガス
流に塩素ガス３〜５体積％をほぼ３分間計量供給する。必要な反応時間は、大体
において粒子寸法に依存する、従って必要な場合にはナノ粒子の同じバッチを使
用して滴定により決定すべきである。粒子をアルゴン流内で冷却させかつ部分的
に塩素化したナノ粒子をＮ−マレインイミドプロピオン酸ヒドラジド（Pierce）
の５０ｍＭ溶液５ｍｌに加え、かつ該溶液を２０℃で一晩中撹拌する。このよう
にして得られた溶液を回転蒸発器内で室温で濃縮しかつ例６に記載されているよ
うに、限外濾過チューブを使用してＴＳＥ７内で緩衝させる。得られた溶液は、
５℃で１２時間安定である。ポリクローナルウサギ抗ミオグロビン抗体（Dako）
１０ｍｇを、Centricon限外濾過チューブ（カットオフ５０ｋＤ）を用いてＴＳ
Ｅ８緩衝液（交換ファクタ１０００，ＴＳＥ８：水中のトリエタノールアミン１
００ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム５０ｍｍｏｌ、ＥＤＴＡ１ｍｍｏｌ、ｐＨ８．５
）に移す。タンパク質濃度を、７〜８ｍｇ／ｍｌに調整する。該抗体溶液に、Ｔ
ＳＥ８緩衝液中の２−イミノチオランの１０ｍＭ溶液１５０μｌを加えかつ該混
合物を１５分間反応させる。このようにしてチオール活性化した抗体を、未反応
活性剤分子を除去するために、前記のようなＴＳＥ８緩衝液で４℃で緩衝させか
つ容量を２ｍｌに減少させる。活性化したナノ粒子及び活性化したナノ粒子を含
有する溶液を一緒にしかつ室温で一晩中撹拌する。こうして得られた拡張検出粒
子の分散液から、Superdex ２００（Phamacia）でゲルパーミエーションクロマ
トグラフィーにより未反応抗体を除去する。使用するランニング緩衝液は、ＴＳ
Ｅ７である。拡張ｌｉｄナノ粒子の保持時間は、ほぼ２時間である。

【００６６】例８：ナノ粒子蛍光を介するウサギ筋細胞内のアクチンフィラメントの可視化凍結ミクロトームを使用して切断したウサギ筋の薄い切片をスライドに載せか
つ氷冷エタノール内で３分間固定する。スライドに載せた薄い切片を、次いで２
回ＰＢＳツィーン（Tween）緩衝液（ＮａＣｌ１３７ｍＭ、ＫＣｌ２．７ｍＭ、
Ｎａ_２ＨＰＯ_４１０．１ｍＭ、ＫＨ_２ＨＰＯ_４１．８ｍＭ、ツィーン２００．
１％）で洗浄しかつそれぞれ５分間洗浄緩衝液内に放置する。薄い切片をＰＢＳ
ツィーン緩衝液内の１．５％ヒツジ血清の溶液内で２０℃で３０分間インキュベ
ートすることにより、非特異的結合を減少させ、かつ薄い切片を前記のようにし
て２回洗浄する。例６に記載した拡張検出粒子の溶液を、ＰＢＳ−Ｓ（ＮａＣｌ
１３７ｍＭ、ＫＣｌ２．７ｍＭ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４１０．１ｍＭ、ＫＨ_２ＨＰＯ_４１．８ｍＭ、ツィーン２００．１％、ヒツジ血清１．５％）で１：１００に希
釈し、かつ薄い切片をこの溶液内で２０℃で１時間インキュベートする。インキ
ュベートの終了後に、薄い切片を前記のように洗浄する。検出は、アルゴンイオ
ンレーザを使用して３３３ｎｍ〜３６４ｎｍの波長で励起した後に、５９１ｎｍ
の波長で蛍光を測定することにより実施する。このためには、ライカ社（Leica
）からの共焦点走査顕微鏡、タイプＴＣＳＮＴを使用した。

【００６７】例９：ヒト血清中のミオグロビンのナノ粒子蛍光を介する検出モノクローナル抗ミオグロビン抗体（Bios Pacific）をＣ緩衝液（水中の炭酸
ナトリウム１００ｍｍｏｌ、ｐＨ９．０）中に５ｍｇ／ｌの濃度で溶かす。この
溶液２００μｌを、標準ポリスチレンＥＬＩＳＡプレート（Greiner）の９６ウ
ェルのそれぞれにピペットで移し、該プレートをシールしかつ３７℃で２時間イ
ンキュベートする。該プレートをタップアウトしかつＴＳＥ７緩衝液（例６参照
）内の１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）２００μｌでブロックする。該プレー
トを、ＴＳＥＴ７緩衝液（水中のトリエタノールアミン１００ｍｍｏｌ、塩化ナ
トリウム５０ｍｍｏｌ、ＥＤＴＡ１ｍｍｏｌ、ツィーン２００．１％、ｐＨ７
．３）でそれぞれ２５０μｌで３回洗浄する。６レベルのミオグロビンキャリブ
レータ（Bayer Immuno １）及びヒト血清それぞれ１００μｌをマイクロタイタ
ープレートの異なったウェルにピペットで移しかつ室温で２時間インキュベート
する。分析物溶液をピペットでプレートから除去しかつ該プレートを前記のよう
にして３回洗浄する。例７で製造しかつＴＳＥ７１００μｌ中に分散させた拡張
抗ミオグロビン検出プローブ約１μｇをそれぞれのウェルに加える。引き続き、
室温で１時間インキュベートしかつＴＳＥＴ７で３回洗浄する。ＥＬＩＳＡを、
ｌｉｄナノ粒子蛍光をマイクロタイタープレートリーダー（Tecan）で測定する
ことにより読み出す。

【００６８】例１０：例３で製造したナノ粒子の、エチレングリコール又はプロピレングリコ
ールを反応させることによる水中での溶解例３で製造したＬａＰＯ_４：Ｃｅ，Ｔｂ１ｇ（〜５ｍｍｏｌ）をエチレングリ
コール１００ｍｌ（〜２ｍｏｌ）（選択的に、種々の鎖長のポリエチレングリコ
ール、ＨＯ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｎ−ＯＨ、（式中、ｎ＝２〜９である）を
使用することもできる）及びパラトルエンスルホン酸１００ｍｇと一緒に、撹拌
及び窒素雰囲気下で２００℃に加熱する。このプロセスで、粒子は溶解しかつ室
温に冷却した後でも溶液中に残る。引き続き、水に対して一晩中透析する（カッ
トオフＭＷ１０〜２０,０００）。

【００６９】例１１：例１０で製造したナノ粒子の酸化による機能化最初に、９６〜９８％の硫酸０．５ｍｌを撹拌しながら、例１０で製造したナ
ノ粒子１００ｍｇ（水２０ｍｌ中０．５ｍｍｏｌ）に加える。紫色がもはや消え
なくなるまで１ｍＭのＫＭｎＯ_４溶液を滴加する。引き続き、同じ量のＫＭｎＯ_４溶液を再び加えかつ室温で一晩中撹拌する（＞１２時間）。過剰の過マンガン
酸塩を、新たに製造した１ｍＭ亜硫酸ナトリウム溶液を滴加式に添加することに
より減少させる。引き続き、ＭＥＳ０．１Ｍ、ＮａＣｌ０．５Ｍ、ｐＨ６．０に
対して一晩中透析する。

【００７０】例１２：例１１で製造したナノ粒子の抗ビオチン抗体に対する結合ＥＤＣ０．４ｍｇ（〜２ｍＭ）及びスルホＮＨＳ１．１ｍｇ（〜５ｍＭ）（両
者ともPierce; Rockford, ILから）を、緩衝液（ＭＥＳ０．１Ｍ、ＮａＣｌ０．
５Ｍ、ｐＨ６）１ｍｌ中の例１１で製造したカルボキシ官能化ナノ粒子１ｍｇ（
５ｎｍｏｌ）に加えかつ該溶液を室温で１５分間撹拌する。未反応ＥＤＣを、２
−メルカプトエタノール（最終濃度２０ｍＭ）１．４μｌを添加することにより
不活性化する。活性化緩衝液（ＭＥＳ０．１Ｍ、ＮａＣｌ０．５Ｍ、ｐＨ６）中
の同じモル量（５ｎｍｏｌ）のポリクローナルヤギ抗ビオチン抗体（Sigma）を
加えかつ該混合物を室温で２時間撹拌する。ヒドロキシルアミン（最終濃度１０
ｍＭ）を添加することにより反応を停止させる。こうして得られた拡張検出粒子
の溶液を、Superdex ２００（Phamacia）でゲルパーミエーションクロマトグラ
フィーにより未反応抗体を除去する。ランニング緩衝液として、活性化緩衝液を
使用する。拡張ｌｉｄナノ粒子の保持時間は、ほぼ２時間である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者マルクスハーゼドイツ連邦共和国ハンブルククラウス −ナンネ−シュトラーセ 60 (72)発明者カーステンリヴォツキードイツ連邦共和国ハイデルベルクカール−ルートヴィヒ−シュトラーセ４ (72)発明者ケルスティンボーマンドイツ連邦共和国ケルンフローラシュトラーセ 140 Ｆターム(参考） 2G054 AA07 AA08 EA03 GA04

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】放射源を使用した励起後に、励起放射線の吸収及び／又は散
乱及び／又は回折により又は蛍光の放出ににより検出することができ、かつアフ
ィニティー分子が生物学的又はその他の有機基質を検出するために調製された表
面に結合することができるように、表面が調製されている、発光性の、無機の、
ドープ処理されたナノ粒子（ｌｉｄナノ粒子）を含有することを特徴とする、単
純検出プローブ。
【請求項２】ｌｉｄナノ粒子の表面が化学的に変性されておりかつ／又は
共有又は非共有結合したリンカー分子及び／又は反応性基を有する、請求項１記
載の単純検出プローブ。
【請求項３】表面の化学的変性がｌｉｄナノ粒子の表面の周りのシリカの
被膜を含む、請求項２記載の単純検出プローブ。
【請求項４】化学的変性が、酸化物遷移金属化合物からなるｌｉｄナノ粒
子を塩素ガス又は有機塩素化剤で処理することにより生成したオキシ塩化物を含
む、請求項２記載の単純検出プローブ。
【請求項５】ｌｉｄナノ粒子表面とは反対の極性又は電荷を有する１種以
上の鎖状分子が、ｌｉｄナノ粒子の表面にリンカー分子として非共有結合されて
いる、請求項２から４までのいずれか１項記載の単純検出プローブ。
【請求項６】鎖状分子がアニオン性、カチオン性又は両性イオン性界面デ
タージェント、酸性又は塩基性タンパク質、ポリアミン、ポリアミド又はポリス
ルホン酸又はポリカルボン酸である、請求項５記載の単純検出プローブ。
【請求項７】表面及び／又はｌｉｄナノ粒子表面に結合したリンカー分子
が、反応性の中性、荷電された又は部分的に荷電された基、例えばアミノ基、カ
ルボン酸基、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、イミダゾール、グアニジ
ン、ヒドロキシル基、インドール、ビシナルジオール、アルデヒド、アルファ−
ハロアセチル基、Ｎ−マレインイミド、水銀オルガニル、アリールハロゲン化物
、酸無水物、イソシアネート、イソチオシアネート、スルホニルハロゲン化物、
イミドエステル、ジアゾアセテート、ジアゾニウム塩、１，２−ジケトン、アル
ファ−ベータ−不飽和カルボニル化合物、アゾリド、ホスホン酸、リン酸エステ
ル、前記基の誘導体を有し、その際これらの反応性基が別のリンカー分子又はア
フィニティー分子との化学結合を可能にする、請求項２、５又は６のいずれか１
項記載の単純検出プローブ。
【請求項８】核酸分子が、前記リンカー分子に対して相補性の配列を有す
る核酸分子を含有するアフィニティー分子のためのリンカー分子として働く、請
求項２から４までのいずれか１項記載の単純検出プローブ。
【請求項９】放射源が、赤外光、可視光、ＵＶ、Ｘ線光又はγ線の領域内
の波長を有する電磁線の源又は電子線のような粒子線の源である、請求項１から
８までのいずれか１項記載の単純検出プローブ。
【請求項１０】ｌｉｄナノ粒子が、１ｎｍ〜１μｍの範囲内、有利には２
ｎｍ〜１００ｎｍの範囲内、特に有利には２ｎｍから２０ｎｍ未満までの範囲内
及び極めて特に有利には２ｎｍ〜１０ｎｍの範囲内の直径を有する、請求項１か
ら９までのいずれか１項記載の単純検出プローブ。
【請求項１１】ｌｉｄナノ粒子が、３ｎｍ〜５０ｎｍ、有利には２ｎｍか
ら２０ｎｍ未満の幅及び２０ｎｍ〜５μｍ、有利には２０ｎｍ〜５００ｎｍの長
さを有する針状形態を有する、請求項１から９までのいずれか１項記載の単純検
出プローブ。
【請求項１２】ｌｉｄナノ粒子のホスト材料がＸＹタイプの化合物からな
り、その際Ｘは周期表の主族１ａ、２ａ、３ａ、４ａ、遷移族２ｂ、３ｂ、４ｂ
、５ｂ、６ｂ、７ｂ又はランタノイドの１種以上の元素のカチオンでありかつＹ
は周期表の主族３ａ、４ａ、５ａ、遷移族３ｂ、４ｂ、５ｂ、６ｂ、７ｂ及び／
又は８ｂの１種以上の元素及び主族６ａ及び／又は７の１種以上の元素の多原子
のアニオンか又は主族５ａ、６ａ又は７ａの単原子のアニオンのいずれかである
、請求項１から１１までのいずれか１項記載の単純検出プローブ。
【請求項１３】ｌｉｄナノ粒子のホスト材料が、硫化物、セレン化物、ス
ルホセレン化物、オキシ硫化物、ホウ酸塩、アルミン酸塩、没食子酸塩、ケイ酸
塩、ゲルマニウム酸塩、リン酸塩、ハロリン酸塩、酸化物、ヒ酸塩、バナジン酸
塩、ニオブ酸塩、タンタル酸塩、硫酸塩、タングステン酸塩、モリブデン酸塩、
アルカリ金属ハロゲン化物及びその他のハロゲン化物又は窒化物からなる群の化
合物からなる、請求項１２記載の単純検出プローブ。
【請求項１４】主族１ａ、２ａの元素又はＡｌ、Ｃｒ、Ｔｌ、Ｍｎ、Ａｇ
、Ｃｕ、Ａｓ、Ｎｂ、Ｎｄ、Ｎｉ、Ｔｉ、Ｉｎ、Ｓｂ、Ｇａ、Ｓｉ、Ｐｂ、Ｂｉ
、Ｚｎ、Ｃｏ及び／又はランタニドの元素からなる群の１種以上の元素をドーピ
ング剤として使用する、請求項１から１３までのいずれか１項記載の単純検出プ
ローブ。
【請求項１５】相互に異なった相対的濃度での前記元素の２種以上の組合
せもドーピング材料として利用する、請求項１４記載の単純検出プローブ。
【請求項１６】ホスト格子内のドーピング材料の濃度が、１０^- ^５ｍｏｌ
％〜５０ｍｏｌ％、有利には０．０１ｍｏｌ％〜３０ｍｏｌ％、特に有利には０
．１ｍｏｌ％〜２０ｍｏｌ％である、請求項１から１５までのいずれか１項記載
の単純検出プローブ。
【請求項１７】ｌｉｄナノ粒子のための材料として、【化１】【化２】（０≦ｘ≦２）を使用する、請求項１から１６までのいずれか１項記載の単純検
出プローブ。
【請求項１８】ｌｉｄナノ粒子のための材料として、【化３】を使用する、請求項１から１６までのいずれか１項記載の単純検出プローブ。
【請求項１９】ｌｉｄナノ粒子のために、立方体のホスト格子構造を有す
る材料を使用する、請求項１から１８までのいずれか１項記載の単純検出プロー
ブ。
【請求項２０】ｌｉｄナノ粒子のための材料として、【化４】を使用する、請求項１から１６までのいずれか１項記載の単純検出プローブ。
【請求項２１】請求項１から２０までのいずれか１項記載の単純検出プロ
ーブと、１種以上のアフィニティー分子又は互いに結合された複数のアフィニテ
ィー分子との組合せからなる、生物学的適用のための拡張検出プローブであって
、その際前記アフィニティー分子は一方では単純検出プローブの調製された表面
にかつ他方では生物学的又はその他の有機基質に結合することが可能であること
を特徴とする、拡張検出プローブ。
【請求項２２】アフィニティー分子が、モノクローナル又はポリクローナ
ル抗体、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、プラスミド、核酸分子、
オリゴ糖又は多糖、ヘプタン、例えばビオチン又はジゴキシン又は低分子量合成
又は自然抗原である、請求項２１記載の拡張検出プローブ。
【請求項２３】アフィニティー分子が、アフィニティー分子上及び単純検
出プローブ上の反応性基を介して単純検出プローブに共有又は非共有結合されて
いる、請求項２１又は２２記載の拡張検出プローブ。
【請求項２４】アフィニティー分子表面上の反応性基が、アミノ基、カル
ボン酸基、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、イミダゾール、グアニジン
、ヒドロキシル基、インドール、ビシナルジオール、アルデヒド、アルファ−ハ
ロアセチル基、Ｎ−マレインイミド、水銀オルガニル、アリールハロゲン化物、
酸無水物、イソシアネート、イソチオシアネート、スルホニルハロゲン化物、イ
ミドエステル、ジアゾアセテート、ジアゾニウム塩、１，２−ジケトン、アルフ
ァ−ベータ−不飽和カルボニル化合物、又はアゾリドである、請求項２３記載の
拡張検出プローブ。
【請求項２５】単純検出プローブとアフィニティー分子の間に非共有セル
フ−オルガナイズド結合が存在する、請求項２１から２３までのいずれか１項記
載の拡張検出プローブ。
【請求項２６】単純検出プローブのリンカー分子としてのビオチンと、ア
フィニティー分子の反応性基としてのアビジン又はストレプトアビジンとの間に
結合が存在する、請求項２５記載の拡張検出プローブ。
【請求項２７】単純検出プローブのリンカー分子としての核酸分子と、そ
れに対して相補的配列を有する、アフィニティー分子の反応性基としての核酸分
子との間に結合が存在する、請求項２６記載の拡張検出プローブ。
【請求項２８】アフィニティー分子として核酸配列が役立ち、かつ検出す
べき生物学的基質が、相補的配列を有する核酸分子である、請求項２２記載の拡
張検出プローブ。
【請求項２９】請求項１から２０までに記載の単純検出プローブを製造す
る方法において、以下のステップ：ａ）ｌｉｄナノ粒子を製造する、ｂ）前記ｌｉｄナノ粒子の表面を化学的に変性させる及び／又はｃ）前記ｌｉｄナノ粒子の表面上に反応性基を調製する及び／又はｄ）１種以上のリンカー分子を前記ｌｉｄナノ粒子の表面と共有又は非共有結合
により結合させるからなることを特徴とする、単純検出プローブの製造方法。
【請求項３０】ステップａ）で製造したｌｉｄナノ粒子の大きさの分布範
囲を、平均大きさの＋／−２０％の範囲に制限する、請求項２９記載の単純検出
プローブの製造方法。
【請求項３１】請求項２１から２８までに記載の拡張検出プローブを製造
する方法において、以下のステップ：ｅ）単純検出プローブを準備する、ｆ）単純検出プローブへの結合を可能にする反応性基を導入するために、アフィ
ニティー分子の表面を変性させる、ｇ）活性化したアフィニティー分子と単純検出プローブを結合させるからなることを特徴とする、拡張検出プローブの製造方法。
【請求項３２】生物学的又はその他の有機基質を検出する方法において、
以下のステップ：ｈ）請求項２１から２８までのいずれか１項記載の拡張検出プローブと、生物学
的及び／又は有機材料を一緒にする、ｉ）結合しなかって拡張検出プローブを除去する、ｊ）サンプルを電磁放射線又は粒子ビームに曝す、ｋ）蛍光を測定するか又は放射線の吸収及び／又は散乱及び／又は回折又はそれ
らの変化を測定するからなることを特徴とする、生物学的又はその他の有機基質の検出方法。
【請求項３３】調査すべき生物学的材料が、血清、細胞、組織切片、脳脊
髄液、痰、血漿、尿又はその他の、ヒト、動物又は植物起源のサンプルである、
請求項３２記載の方法。
【請求項３４】調査すべき分析物を調査すべき生物学的及び／又はその他
材料に固定する、請求項３２又は３３記載の方法。
【請求項３５】調査すべき生物学的及び／又は有機材料を同時に異なる拡
張検出プローブと一緒にし、かつ前記異なる拡張検出プローブが、それらのアフ
ィニティー分子が種々の分析物に結合しかつ前記拡張検出プローブに含まれたｌ
ｉｄナノ粒子が異なる波長で吸収、散乱又は回折し又は蛍光を放出することによ
り相互に異なる、請求項３２から３４までのいずれか１項記載の方法。