JP6003033B2 - 核酸の検出方法及びサンプルの光学観察方法並びに蛍光体 - Google Patents
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Description
特に、核酸と銅との複合体に由来する蛍光の強度及びスペクトルは、核酸の塩基配列及び長さに依存して変化し、二本鎖核酸中のミスマッチの有無にも依存して変化する。このため、この核酸検出方法では、検出手順において検出された蛍光の強度及び/又はスペクトルに基づいて、核酸の塩基配列を解析したり、核酸が形成する二本鎖中のミスマッチを解析したりすることができる。
また、核酸と銅との複合体に由来する蛍光の強度は、シトシンに比してウラシルで高い。このため、この核酸検出方法では、バイサルフェート処理によってサンプルに含まれる核酸中の非メチル化シトシンを選択的にウラシルに変換し、これに伴って検出手順において検出される蛍光の強度及び/又はスペクトルの変化量を調べることで、核酸におけるシトシンのメチル化あるいは脱メチル化の有無及び量、並びに塩基配列中におけるメチル化シトシンあるいは脱メチル化シトシンの位置などを解析することができる。
この核酸検出方法において、銅は、固形の銅とすることができる。
この核酸検出方法において、接触手順は、塩の共存下で核酸を含むサンプルと銅とを接触させる手順とされることが好ましい。また、検出手順は、波長300〜420nmの光を前記サンプルに照射することにより、該サンプルから発せられる蛍光を検出する手順とされることが好ましい。
この光学観察方法において、サンプルは細胞とすることができる。この場合、細胞の細胞核の分布、位置、数、大きさ、形状などに関する情報を得ることができる。
〈A〉核酸検出方法
1.接触手順
(1)銅(Cu)
(2)サンプル
(3)反応溶液
(4)接触条件
2.検出手順
(1)光照射
(2)蛍光検出
(3)蛍光スペクトル検出
(4)蛍光の空間分布の検出
3.塩基配列の解析
4.応用例
(1)微細な遺伝子配列の違いの検出
(2)DNA分子のメチル化の解析
(3)細胞核の観察及び計測
(4)微小粒子の解析
(5)Lab-On-Chipへの適用
〈B〉蛍光色素
本発明者は、実施例において詳しく後述するように、核酸(DNAもしくはRNA)と銅との複合体が蛍光を発することを新たに見出した。また、核酸の塩基配列及び長さに依存して蛍光のスペクトルや強度が変化すること、二本鎖核酸中のミスマッチの有無に依存して蛍光のスペクトルや強度が変化することを見出した。本技術は、これらの新規知見に基づきなされたものである。なお、前述したように、従来、銅との相互作用によりDNAの吸収スペクトルが変化することや、この吸収スペクトルの変化がDNAの塩基配列に応じて異なることが知られていた。しかしながら、核酸と銅との複合体が蛍光を発することはこれまで知られていなかった。また、核酸と銅との複合体が発する蛍光は、前述したCu-MTが発する蛍光と波長特性において類似したが、metallothioneinを含まない、精製合成オリゴヌクレオチドを用いた反応系においてみられることから、Cu-MTが発する蛍光とは全く異なるものである。以下、本技術に係る核酸検出方法とその応用例及び本技術に係る蛍光体について具体的に説明する。
接触手順では、核酸を含むサンプルを銅と接触させる。
本手順で用いる銅の形態は、銅を含む溶液か、もしくは銅を含む固形物が好ましい。操作の簡便性が求められる場合には、固形物を用いることが好ましい。また、マイクロチップに設けたマイクロスケールの流路内などで核酸検出を行う場合には、固形物を用いることで、マイクロチップへの銅の埋め込みが可能となり、チップ構造の簡素化のため好ましい。固形物は、溶液に比べて、形状や特性などが振動や衝撃、熱、光、時間経過などに対して安定的であり、チップの製造方法や保存条件などの影響を受け難く、取り扱いが容易である利点も有する。一方、反応時間の短縮化が必要な場合には、溶液を用いることが好ましい場合もある。銅の形態は、目的に応じて適宜選択することができる。
核酸を含むサンプルとしては、DNAやRNAなどの核酸を含み得るサンプルであれば、いかなるものでもよい。例えば、核酸抽出溶液や、核酸合成物を含む溶液、PCRなどの核酸増幅反応の産物、電気泳動サンプルなどが考えられる。あるいは、核酸溶液サンプルに限らず、細胞自体、組織切片などの細胞を含むものなどをサンプルとして用いることがでる。
サンプルと銅との接触は、塩を含む反応溶液中で行うことが好ましい。塩の種類は、本技術の効果を損なわなければ特に限定されず、公知の塩を自由に選択して用いることができる。例えば、塩化ナトリウム(NaCl)、塩化カリウム(KCl)、塩化マグネシウム(MgCl2)などから1種又は2種以上自由に選択して用いることができる(実施例参照)。
サンプルと銅との接触時間は、特に限定されず、用いるサンプルや銅の形態に合わせて自由に設定することができる。例えば、液状のサンプルと粉末銅を用いる場合には、十分に攪拌することで、接触時間を短縮することができる。また、銅を含む固形物の薄膜を形成した基板や容器などを用いる場合には、基板や容器の構造を工夫してサンプルとの接触面積を大きくすることで、接触時間を短縮することができる。また、サンプルと銅との接触の際には、反応液と酸素を含む空気との接触面積及び接触時間が極力限定されていることが望ましい。
検出手順では、接触手順後のサンプルから発せられる蛍光を検出する。
サンプルからの蛍光を検出するため、サンプルに対して照射される光(励起光)としては、核酸を含むサンプルと銅とを接触させた後に、サンプルから発せられる蛍光が検出できれば特に限定されない。
サンプルから発せられる蛍光の検出は、特に限定されず、従来公知の手段によって行うことができる。検出手段としては、例えば、フォトディテクター、フォトダイオード、フォトマルチプライヤー、CCDカメラ、CMOSカメラなど、光信号を電気信号に変換する素子が用いられる。また、検出手段としては、フィルムなどを用いた撮影や、肉眼による観察なども採用できる。サンプルから発せられる蛍光は、サンプルに近接する蛍光分子に対するFRETなどのエネルギー移動を誘発し、蛍光分子から発せられる蛍光を受光することにより、間接的に検出することもできる。
サンプルから発せられる蛍光のスペクトル(エキサイテーション・スペクトルもしくはエミッション・スペクトル)を計測する場合においては、光照射及び蛍光検出においてスペクトル計測に適した手段を採用する。
サンプル中に含まれる核酸の空間的な分布や形状などの情報を得る場合、一定の広がりをもつ領域に対して光照射及び蛍光検出をまとめて行い、一度に空間的情報を得る方法が考えられる。また、別法として、検出対象とする部位を時間ごとに変化させ、一定の広がりをもつ領域の内部を順次スキャンしていくことで空間的情報を得る方法も考えられる。
次に、検出手順において検出された蛍光についての情報に基づいて、核酸の塩基配列を解析したり、核酸が形成する二本鎖中のミスマッチを解析する方法について説明する。
本技術に係る核酸検出方法は、上述の接触手順及び検出手順に、必要に応じて塩基配列の解析を組み合わせることで、様々な分野で利用することができる。以下に、本技術に係る核酸検出方法の応用例について説明する。
本技術では蛍光スペクトル及び/又は強度を計測することによって、サンプルに含まれる核酸の塩基配列について情報を得ることが可能である。しかしながらサンプルに多数の核酸が含まれると、検出される蛍光スペクトル及び/又は強度が平均化され、微細な遺伝子配列の違いを識別できなくなる可能性があることから、必要に応じて以下に例示するような、検出対象とする核酸の範囲を限定するための方法を組み合わせることが好ましい。
DNA分子のうちシトシン(C)は、細胞内のゲノム中においてメチル化されることが知られている。シトシン(C)のメチル化の有無は、バイサルフェート反応においてウラシル(U)に置換されるかどうかで検出することが可能である。すなわち、適切な条件下で核酸のバイサルフェート(亜硫酸水素塩)処理を行うと、メチル化されていないシトシン(C)のみを選択的にウラシル(U)に変換できる。このため、ウラシル(U)の検出により、非メチル化シトシンの存在を検出できる。
有核細胞を含むサンプルについて本技術に係る核酸検出方法を行い、核酸の空間分布の検出を行って、その分布及び形状を解析することによって、組織切片や細胞などの中に含まれる細胞核の分布、位置、数、大きさ、形状などに関する情報を得ることができる。
細胞やビーズなどの微小粒子を含む液状サンプルを用いて、これら細胞やビーズなどの粒子に内包あるいは固定化された核酸を検出する場合、粒子は静止した状態であってもよいが、マイクロ流路中に通流させた状態であってもよい。例えば、液状サンプルをシース流とともにフローセル内に導入して、液体サンプルをシース流で挟み込みラミナフローを形成し、そのフローセル中を流れる粒子が発する蛍光を検出できる。このようなフローセルの構造としては、フローサイトメトリー技術として広く研究開発及び実用化がなされているものを用いることができる。
本技術に係る核酸検出方法は、マイクロ流路チップなどの容器内においてサンプルの処理や検出などを行う、Lab-On-Chipの中に組み込むことが可能である。この場合、当該容器中に、使用目的に応じてサンプル前処理工程を導入し組み合わせることによって、より利便性を高めることができる。
次に、本技術に係る蛍光体について具体的に説明する。
(1)核酸を含むサンプルを銅と接触させる接触手順と、前記サンプルから発せられる蛍光を検出する検出手順と、を含む前記核酸の検出方法。
(2)前記検出手順において検出された蛍光の強度及び/又はスペクトルに基づいて、前記核酸の塩基配列を解析する上記(1)記載の検出方法。
(3)前記検出手順において検出された蛍光の強度及び/又はスペクトルに基づいて、前記核酸が形成する二本鎖中のミスマッチを解析する上記(1)記載の検出方法。
(4)前記サンプルをバイサルフェート処理する手順を含み、前記検出手順においてバイサルフェート処理前のサンプルから検出された蛍光の強度及び/又はスペクトルと、バイサルフェート処理後のサンプルから検出された蛍光の強度及び/又はスペクトルと、の差分に基づいて、前記核酸におけるシトシンのメチル化あるいは脱メチル化を解析する上記(1)記載の検出方法。
(5)前記銅は、固形の銅である上記(1)〜(4)のいずれかに記載の検出方法。
(6)前記接触手順は、塩の共存下で前記サンプルと銅とを接触させる手順である上記(1)〜(5)のいずれかに記載の検出方法。
(7)前記検出手順は、波長300〜420nmの光を前記サンプルに照射することにより、サンプルから発せられる蛍光を検出する手順である上記(1)〜(6)のいずれかに記載の検出方法。
銅:CuSO4水溶液と(+)-Sodium L-ascorbate(以下、「S.A.」と表記する)は、Sigma-Aldrichより購入した。
核酸:BioDynamics laboratory Inc. (Tokyo, Japan)より購入したSonicated Salmon Sperm DNA(以下、「ssDNA」と表記する)を用いた。また、オリゴDNAには、Invitrogen社より購入したカスタムオリゴを用いた。
緩衝液(バッファー):DOJINDO Laboratories(Kumamoto, Japan)より購入したHEPPSOを、メーカー提供のプロトコルに準じてpH8.5に調製して用いた。
蛍光測定器:NanoDrop 3300(Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA)又はF-4500形分光蛍光光度計(株式会社日立ハイテクノロジーズ)を用いた。NanoDrop 3300の励起光にはUV LED光源を用い、励起光で励起した際の蛍光スペクトルを計測した。付属のソフトウェアを用いて、スペクトル強度が最大となる波長でのRelative Fluorescence Units(RFU)をピークRFU値として取得した。F-4500形分光蛍光光度計には、Helix Biomedical Accessories, Inc.社製の石英キャピラリーと専用アダプターセルを使用した。なお以下で特に断りがない場合は、NanoDrop3300を使用した。
吸光測定器:NanoDrop 1000 Spectrophotometerを用いて吸収スペクトルを計測した。
サンプル調製と蛍光測定:50mMのHEPPSOバッファーに、塩化ナトリウム(250mM)、CuSO4(0〜4mM)、S.A.(4, 50mM)、ssDNA(1mg/ml)あるいはオリゴDNA(50, 250, 500μM)を混合してサンプル20μlとした。なお、S.A.は混合液中においてCuSO4から生じるCu(II)イオンをCu(I)イオンに還元する作用を有することが知られている(非特許文献31参照)。
ssDNAについて、S.A.濃度50mMの条件下でCuSO4の濃度を変化させて取得された蛍光スペクトル及びRFU値を、図1及び図2にそれぞれ示す。(A)は蛍光スペクトルを示し、(B)はピークRFU値を示す。
本実施例では、CuSO4とS.A.を混合した、塩化ナトリウムを含むHEPPSOバッファー溶液中にDNAを混合すると、紫外線照射によって波長500nm〜700nm程度のオレンジ色の蛍光が観察されることを示した。また、蛍光の強度はCuSO4濃度に依存し、蛍光強度及びスペクトルは核酸の塩基配列による影響も受けることが確認された。
核酸に接触させる銅として、和光純薬工業株式会社製の銅粉末(Copper, Powder, -75um, 99.9% / Cat.No.030-18352 / Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan)を用いた。
RNAとしては、Rat Brain Total RNA (Cat.No.636622, Takara Bio Inc., Otsu, Japan)を使用し、これをDEPC treated water (Cat.No.312-90201/Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan)に溶解したものを用いた。
PIPES, ACES, BES, TAPSO, HEPPSO, EPPS, TAPS, CAPS, TES, Tricine及びPOPSOはDOJINDO Laboratories(Kumamoto, Japan)より購入したものを用い、メーカー提供のプロトコルに準じてpHを調整して用いた。その他の試薬は実施例1と同じものを用いた。
1.5 mg/mlのssDNAを加えた反応溶液について、蛍光測定を3回行った結果を図12に示す(横軸:波長、縦軸:RFU)。図に示されるように、核酸を含むサンプルを固形の銅と接触させた後にUV励起すると、サンプルから600nm付近をピークとする蛍光が検出できた。
本実施例の結果から、核酸を固形の銅粉末と接触させた場合にも、適切な塩濃度などの条件下において、核酸をCu(I)イオンと接触させた場合と同様に、蛍光を検出できることが示された。イオンによる場合と固形の銅による場合では、波長特性や配列依存性などの性質がほぼ同一であることから、これらで観察されている蛍光は同じメカニズムによるものと考えられた。また、核酸としてRNAを用いても蛍光が観察された。さらに、二本鎖DNAにおいては、特にチミン(T)にミスマッチが存在している場合に強い蛍光が観察された。このことから、相補配列との結合は、核酸の銅との結合による蛍光体の形成に対して阻害要因となる可能性が示唆された。また、ミスマッチ部位での蛍光強度の上昇は、核酸の塩基配列に含まれる変異を検出する方法への応用が可能と考えられた。
DNAは実施例1に記載のssDNAを、RNAは実施例2に記載のものを用いた。
ガラス表面への銅スパッタリングは、装置にULVAC, Inc. (Kanagawa, Tokyo)のSH-350を用い、Cu Target, 99.99% (Kojundo Chemical Laboratory Co., Ltd, Saitama, Japan)を装着して実施した。スパッタリングの厚みは40 nmとし、事前に計測した堆積速度をもとに適切なスパッタ時間を定めた。銀スパッタガラスとしては、株式会社協同インターナショナル (Kyodo International, Inc., Kanagawa, Japan)に作製のものを用いた。
5 mg/mlのDNA及び0.5MのNaClを含むサンプルを、銅スパッタガラス上に5分間静置した後に撮影した画像を図22に示す。また、5 mg/mlのRNA及び0.5MのNaClを含むサンプルを、銅スパッタガラス上に5分間静置した後に撮影した画像を図23に示す。
PBSには、Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, Ca/Mg free (Invitrogen Corporation, CA, USA)を用いた。
タマネギ薄皮の実験では、市販のタマネギの薄皮を、ピンセットを用いて丁寧に剥がして、蒸留水中に浸してすすいで用いた。タマネギの薄皮をCuスパッタガラス上に載せ、PBSに浸した状態で上からカバーガラスを被せて観察した。
ヒト白血球サンプルの実験では、IMMUNO-TROL Cells (Cat.No.6607077, Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA) を次の手順で処理したものを用いた。まず、IMMUNO-TROL Cellsを、500マイクロリットル取り分けてPBSで洗浄し、遠心分離機で細胞を沈殿させた(1200rpm,5min)。その後、上清を捨ててペレットをほぐし、水溶血処理を2回繰り返して得られたサンプルをPBSに希釈し、白血球サンプルを調製した。水溶血処理は、遠心分離の結果得られたペレットを良くほぐした後に、脱イオン水を9ミリリットル添加して30秒間転倒混和し、さらに1ミリリットルの10x PBS Buffer (Nippon Gene Co., Ltd., Tokyo, Japan)を添加してよく攪拌し、遠心分離 (1200rpm, 5min)で細胞を沈殿させて上清を除去することにより行った。白血球サンプルをCuスパッタガラス上に撒き、上からカバーガラスを被せて観察した。
図27に、銅スパッタガラス上でタマネギ薄皮を蛍光観察して撮像した画像を示す。(a)及び(b)はCuスパッタガラス上での観察像を示し、(c)及び(d)はCuをスパッタしていないスライドガラス上での観察像を示す。(a)及び(c)は明視野の観察像、(b)及び(d)は蛍光像である。なお、(a)〜(d)は10倍の対物レンズを用いて撮像した画像であり、(e)は40倍の対物レンズを用いて撮像した画像である。
本実施例の結果から、細胞核についても銅との接触によって蛍光検出が可能となることが示された。この現象は、銅をスパッタリングしたガラス基板上でのみみられたこと、細胞核と銅との作用による結果であることは明らかである。
Invitrogen社より購入した7種類のオリゴDNAについて、実施例1と同様の材料と方法を用いて蛍光計測実験を行った。使用したオリゴDNAの配列は、T(20)(配列番号1)、T(10)(配列番号19)、T(6)(配列番号10)、T(5)(配列番号27)、T(4)(配列番号28)、T(3)(配列番号12)、T(2)(配列番号29)である。ここではCuSO4濃度は0.4mM、S.A.濃度は4mMとし、計測にはNanoDrop3300を使用した。
図31に、T(20)についての測定結果を示す。オリゴDNAの濃度は、(a)100μM、(b)50μM、(c)50μM、(d)25μM、(e)12.5μM、(f)6.25μMである。各グラフは横軸が波長(nm)、縦軸が蛍光強度(RFU値)を示す。図32〜図37に、T(10), T(6), T(5), T(4), T(3), T(2)の各オリゴDNAについての測定結果を示す。各図のグラフ中に表記の数値は、オリゴDNAの濃度条件を示す。
本実施例の結果から、チミン2塩基からなる塩基配列のオリゴDNAでも、蛍光が観察されることが明らかとなった。蛍光スペクトルの形状は、オリゴDNAの濃度が変わってもほとんど変化しないが、塩基長が短くなるほど蛍光ピークが短波長側にシフトする傾向があることが見出された(図38参照)。また、蛍光スペクトルの強度は、オリゴDNAの濃度に依存する傾向が認められたが、一定濃度以上ではプラトーに達し、逆に減少する場合も観察された(図39参照)。なお、DNA濃度が高すぎる場合に蛍光強度が低下する現象は、実施例2の銅粉末を用いた実験でも観察されていた(図15参照)。
Invitrogen社より購入したオリゴDNAについて、実施例1と同様の材料と方法を用いて蛍光計測実験を行った。使用したオリゴDNAの配列は、TTT(配列番号12)、TTC、TCT、CTT、TCC、CTC、CCT、CCC、TTG、TGT、GTT、TGG、GTG、GGT、GGGである。CuSO4濃度は0.4mM、S.A.濃度は4mM、オリゴDNA濃度は0.5mMとし、計測にはNanoDrop3300を使用した。
結果を図40及び図41に示す。図40の(a)がTTT(配列番号12)、(b)がTTC、(c)がTCT、(d)がCTT、(e)がTCC、(f)がCTC、(g)がCCT、(h)がCCCの結果を示す。図41の(a)がTTT(配列番号12)、(b)がTTG、(c)がTGT、(d)がGTT、(e)がTGG、(f)がGTG、(g)がGGT、(h)がGGGの結果を示す。横軸は波長(nm)を示し、縦軸は蛍光強度(RFU値)の対数値を示す。
TとCの混合配列のオリゴDNAでは、2番目及び3番目にTが存在するCTTが、TCT及びTTCに比較して高い蛍光強度を示した。また、3番目にTが存在するTCT及びCCTが、2番目にTが存在するTTC及びCTCに比較して高い蛍光強度を示した。これらのことから、TとCの混合配列のオリゴDNAでは、3塩基目のTが最も蛍光への寄与が高く、次に2塩基目のTが寄与していると考えられた。
Invitrogen社より購入したオリゴDNAであるT(10)(配列番号19)及び同オリゴDNAの3’末端にBlack Hole Quencher-2 (BHQ2)を修飾したオリゴDNA(T(10)BHQ2)(シグマ・アルドリッチ社)を用い、実施例1と同様の材料及び方法によって蛍光計測実験を行った。CuSO4濃度は0.4mM、S.A.濃度は4mM、オリゴDNA濃度は0.05mMとし、計測にはNanoDrop3300を使用した。
結果を図42に示す。横軸は波長(nm)を、縦軸は蛍光強度(RFU値)を示す。T(10)からは明白な蛍光が確認されたが、クエンチャーを修飾したT(10)BHQ2からは蛍光は検出されなかった。
BHQ2は560nm〜650nm程度の光を特に効果的に吸収することで知られるクエンチャーである。T(10)で観察されていた蛍光は、このBHQ2の効果によって、T(10)BHQ2では観察されなくなったものと考えられた。この結果から、銅の作用による蛍光とFRETとを組み合わせることが可能であることが示唆された。
各種のオリゴDNAについて、実施例1と同様の材料及び方法を用いて蛍光計測実験を行った。オリゴDNAには、Invitrogen社より購入したT(10)(配列番号19)、U(9)G(配列番号20)、A(10)(配列番号30)、I(9)G(配列番号31)を用いた。また、オリゴDNAとして、シグマ・アルドリッチ社より購入したC(10)(配列番号32)、C(4)MeC(6)(配列番号33、MeCは5-メチル2-デオキシシチジン)も用いた。CuSO4濃度は0.4mM、S.A.濃度は4mM、オリゴDNA濃度0.05mMとし、計測にはNanoDrop3300を使用した。
T(10)及びU(9)Gの測定を各々3回行った結果を図43に示す。(a)は横軸を波長(nm)、縦軸を蛍光強度(RFU)としたグラフであり、(b)は縦軸に蛍光強度(RFU値)の平均値を相対値(それぞれのオリゴDNAのピークRFU値を1)で表示したグラフである。U(9)Gは、T(10)に比較して、強度は劣るが、類似したスペクトル形状の蛍光を発することが確認された。
ウラシルからなる配列を有する核酸では、チミンからなる配列を有する核酸に比して、強度は劣るが、類似したスペクトル形状の蛍光を発した。この結果は、実施例1においても確認されている。また、シトシンからなる配列、あるいはシトシンとメチル化シトシンとからなる配列を有する核酸は、蛍光を発しないことが確認された。
に貢献できる。
Claims (6)
- 核酸を含むサンプルをバイサルフェート処理する手順と、
バイサルフェート処理前のサンプルとバイサルフェート処理後のサンプルを銅と接触させる接触手順と、
バイサルフェート処理前のサンプルとバイサルフェート処理後のサンプルから発せられる蛍光を検出する手順と、を含み、
前記検出手順においてバイサルフェート処理前のサンプルから検出された蛍光の強度及び/又はスペクトルと、バイサルフェート処理後のサンプルから検出された蛍光の強度及び/又はスペクトルと、の差分に基づいて、
前記核酸におけるシトシンのメチル化あるいは脱メチル化を解析する前記核酸の検出方法。 - 前記銅は、固形の銅である請求項1記載の検出方法。
- 前記接触手順は、塩の共存下で前記サンプルと銅とを接触させる手順である請求項1又は2に記載の検出方法。
- 前記検出手順は、波長300〜420nmの光を前記サンプルに照射することにより、
サンプルから発せられる蛍光を検出する手順である請求項1〜3のいずれか一項に記載の検出方法。 - 核酸を含むサンプルをバイサルフェート処理する手順と、
バイサルフェート処理前のサンプルとバイサルフェート処理後のサンプルを銅と接触させる接触手順と、
バイサルフェート処理前のサンプルとバイサルフェート処理後のサンプルから発せられる蛍光を検出する手順と、を含み、
前記検出手順においてバイサルフェート処理前のサンプルから検出された蛍光の強度及び/又はスペクトルと、バイサルフェート処理後のサンプルから検出された蛍光の強度及び/又はスペクトルと、の差分に基づいて、
前記核酸におけるシトシンのメチル化あるいは脱メチル化を解析する前記サンプルの光学観察方法。 - 前記サンプルが細胞である請求項5記載の光学観察方法。
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