CN101168773B - 一种基于荧光淬灭的核酸测序方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于荧光淬灭的核酸测序方法为：1)制备测序模板：把待测序的核酸片段，这里的核酸片段包括脱氧核糖核酸、核糖核酸或它们的核酸序列扩增产物、克隆产物，并将产物固定到载体上，2)在片延伸：用反应缓冲液、聚合酶以及荧光标记的dNTP混合液进行延伸，3)荧光淬灭：运用荧光淬灭剂，使荧光淬灭，4)在片延伸：用反应缓冲液、聚合酶以及荧光标记的dNTP混合液进行延伸，5)图象识别：对得到的延伸图象用Matlab进行特征点提取，清除噪声点处理实现对芯片的分析或者其他商业化的软件直接处理图像。本发明结合了核酸微阵列芯片技术，能高通量、快速、低成本对核酸进行大规模测序。
Description
技术领域
本发明是一种基于荧光淬灭的核酸测序方法，属于生物医学领域中的基因组测序方法。
背景技术
目前完成一个哺乳动物全基因组的测序大约需要上千万美元和半年时间的工作。DNA测序成本正在以每二年降低一半的速度递减，但是目前通用的DNA测序方法仍然成本很高和耗时长，远远满足不了生命科学和医学发展的要求，同时也极大地制约了DNA测序市场的发展。人们急需发展出快速、廉价的个体化基因信息检测技术。
陆祖宏等提出通过单分子多拷贝的全基因组扩增，制备全基因组的高密度的单分子多拷贝的随机全基因组DNA测序模板阵列[1]，通过固定滚环产物到载体上，在这基础上进行在片延伸测序，每延伸一个碱基有一定荧光强度，当荧光强度积累到一定程度，需要将荧光素淬灭后再进一步延伸，而且不需要光照情况下为最合适，国外有文献报道用激光照射氯化二苯碘(DPI)来进行荧光淬灭后再延伸[2]，但对DNA的损伤比较大、DPI药品昂贵、有毒而且光照的方式对高通量的基因芯片测序有一定的局限性。
[1]New consideration on uitra-low-cost sequencing for the human wholegenome.Proceeding of the 4th Internaitonal Forum of Post-genomeTechnologies.ZuhongLu，2006，46-48.
[2]Multiplexed DNA sequencing-by-synthesis.Serfei A.Aksyonov，Michael Bittner，Linda B.Bloom et al.Analytical Biochemistry348(2006)127-138.
[3]Szemes M，Bonants P，Weerdt M，et al.Diagnostic application ofpadlock probes-multiplex detection of plant pathogens using universalmicroarrays[J].Nucl Acid Res，2005，33(8)：70.
发明内容
技术问题：本发明的目的是提供一种基于荧光淬灭的核酸测序方法，能高通量、快速、低成本对核酸进行测序。
技术方案：本发明基于荧光淬灭的核酸测序方法为：
1)制备测序模板：把待测序的核酸片段，这里的核酸片段包括DNA(脱氧核糖核酸)、RNA(核糖核酸)或它们的核酸序列扩增(PCR(聚合酶链式反应)、RCA(滚环扩增)、固相扩增以及桥式扩增等)产物、克隆产物，并将产物固定到载体上。
2)在片延伸：用反应缓冲液(reaction buffer)，聚合酶以及荧光标记的dNTP混合液进行延伸。
3)荧光淬灭：运用荧光淬灭剂，使荧光淬灭。本发明几种核酸测序中的荧光淬灭剂，是指能够产生氧化还原反应、自由基等基团的化合物，包括过氧化氢(H2O2)、硫酸铜(CuSO4)和4′-(4′-二甲基氨基叠氮苯)苯甲酸(DABCYL)，这些化合物能够有效淬灭荧光并能使延伸高效率地进行。
4)在片延伸：用反应缓冲液(reaction buffer)，聚合酶以及荧光标记的dNTP混合液进行延伸。
5)图象识别：对得到的延伸图象用Matlab进行特征点提取，清除噪声点处理实现对芯片的分析或者其他商业化的软件直接处理图像。
所述的荧光淬灭剂，是指能够产生氧化还原反应、自由基基团的化合物，即：是过氧化氢、硫酸铜和4′-(4′-二甲基氨基叠氮苯)苯甲酸。
测序的程序如下：
制备测序模板-----在片延伸--------荧光淬灭--------在片延伸…….-------图象识别。
有益效果：本发明具有以下优点：
1.本发明结合了核酸微阵列芯片技术，能高通量、快速、低成本对核酸进行大规模测序。
2.本发明运用荧光淬灭进行核酸测序，实施简单而且有效。
3.本发明对得到的延伸图象用Matlab软件进行特征点提取，清除噪声点等处理，实现了对芯片的分析。
附图说明
图1是本发明的流程示意图。
具体实施方式
1.模板制备：通过对滚环成环序列
5’-P-TAGCTAGAATCAAAAATGTTGAGTACGACGAATCTGTATGCTAATGCGGCGTGATGTATTATGCGTATAGAAATAATACAGA-3’和
5’-ACCTTTATGTCAACATTTTTGATTCTAGCTATCTGTATTATTTCACCTAGCTT-3’
浓度均为10um各4ul混合后通过变性，自然复性后成环。通过用T4连接酶进行连接。加入探针Acry-probe(100um)0.3ul(E3：5’-Acry-(T)10ATTAGCATACAGATTCGTCGTACT-3’)，通过变性，自然复性后杂交上。然后分别加入100×BSA，dNTP，Bst酶，40度30小时滚环。
对滚环产物用丙烯酰胺胶溶解并固定在丙烯酰胺胶修饰的玻片上。
2.检测：用1uM Cy5-probe(5’-Cy5-GCGGCGTGATGTA)与固定的产物杂交[3]。经扫描后，能获得清晰以及荧光强度较高的图像。
3.淬灭：对杂交后的滚环产物用淬灭剂(H2O2)5分钟后，荧光完全淬灭。
4.延伸：对淬灭后的滚环产物进行延伸，用1×reactionbuffer，0.1U/ul Therminator DNA聚合酶以及0.1uMCy 5-dNTP混合液在65度10分钟下进行延伸。延伸碱基分别为TTAT、GCGT，延伸TTAT后能获得清晰的荧光图像，在这个基础上继续延伸GCGT，能获得比较强的荧光图像，为了进一步延伸，需要对荧光淬灭。
5.淬灭：用淬灭剂(H2O2)5分钟后，荧光完全淬灭。
6.延伸：加入1×reaction buffer，0.1U/ul Therminator DNA聚合酶以及0.1uMCy5-dNTP混合液在65度10分钟下进行延伸。延伸碱基分别为ATA、GAAA，延伸ATA后能获的清晰的荧光图像，继续延伸GAAA后，获得较强的荧光图像。
7.通过Matlab软件编程、特征点提取、清除噪声点等处理、计算灰度值，根据灰度值能分析出本次实验共延伸15个碱基。
Claims (1)
1.一种基于荧光淬灭的核酸测序方法，其特征在于测序的方法为：
1)制备测序模板：把待测序的核酸片段，这里的核酸片段包括脱氧核糖核酸、核糖核酸或它们的核酸序列扩增产物、克隆产物，并将产物固定到载体上，
2)在片延伸：用反应缓冲液reaction buffer、Therminator DNA聚合酶以及荧光标记的dNTP混合液进行延伸，
3)荧光淬灭：运用荧光淬灭剂，使荧光淬灭，
4)在片延伸：用反应缓冲液reaction buffer、Therminator DNA聚合酶以及荧光标记的dNTP混合液进行延伸，
5)图象识别：对得到的延伸图象用Matlab进行特征点提取，清除噪声点处理实现对芯片的分析或者其他商业化的软件直接处理图像；所述的荧光淬灭剂是硫酸铜和4′-(4′-二甲基氨基叠氮苯)苯甲酸。
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