CN1940088A - 基于引物延伸的dna测序方法 - Google Patents

Abstract

核酸序列测定方法：在被测的DNA模板中引入一段已知的DNA序列，使之固定于固相基质上；设计1－15个寡核苷酸DNA引物组合，使其含有一段与上述加入的DNA序列互补的序列，使该1－15个寡核苷酸DNA引物的3’端分别含有0、1、2、……、14个简并性核苷酸；根据待测核苷酸位点的位置，从上述引物组合中选择一种引物，将其与固定DNA模板杂交，使待测核苷酸位点挨着引物3’末端；用DNA聚合酶及用四种可分辨的标记物标记的双脱氧核苷酸底物或分别用一种或几种标记物标记的四种脱氧核苷酸或双脱氧核苷酸，在杂交到模板上的引物上进行核苷酸延伸；检测被延伸核苷酸种类，DNA模板被测碱基的种类与延伸核苷酸种类互补。

Description

基于引物延伸的DNA测序方法

技术领域

本发明涉及一种DNA序列测定方法，尤其涉及一种基于引物延伸的DNA测序方法.

背景技术

目前两个最常用的DNA测序方法是Sanger的双脱氧链终止法及Maxam和Gilbert的化学切割测序法，但二者都依赖于电泳分离大小不同的DNA片段。Sanger测序法应用了双脱氧核苷酸随机终止聚合反应，这样产生了各种长度的延伸链，通过电泳来分离。由于终止处的核苷酸可以被确认，而每一处都有终止处，因此可以读出序列。虽然电泳技术特别是毛细管电泳的应用使得测序的自动化程度得到了很大提高，但其通量仍受到一定程度的限制，因此对于需要高额费用和高通量的大规模基因组计划或诊疗测序来说不是最适宜的方法。近年来随着基因芯片在生命科学领域中迅速发展，其高通量检测的优点被引用到DNA测序中，并发展或提出了一些非电泳的测序方法，例如芯片杂交测序法，焦磷酸测序法，光切割荧光核苷酸法。

芯片杂交测序法利用芯片上高密度的寡核苷酸序列点阵和靶序列杂交，然后拼接出靶DNA的序列，需要合成非常高密度的点阵才能有效测出靶DNA序列，而高密度点阵的制作目前仍很困难。

焦磷酸测序法和光切割荧光核苷酸测序法的共同点是采用DNA聚合酶进行逐步延伸引物链，属于合成法测序(sequencing by synthesis)。因此先对合成法测序过程作一般概述：首先制得单链模板DNA，引物和模板DNA链退火得到杂交的DNA分子，然后在DNA聚合酶存在下加入核苷酸底物，每次只加入一种核苷酸底物或四种带标记的双脱氧核苷酸底物，如果加入的核苷酸和模板上对应的碱基互补，则聚合酶会将之整合到引物链。核苷酸的整合事件可以通过各种方法检测，例如焦磷酸测序是通过检测焦磷酸的释放；也可以将容易检测的标记物如发荧光的物质连接到核苷酸上，然后检测。

焦磷酸测序法(pyrosequencing)是通过生物催化发光来确定是否有核苷酸掺入，其原理是加入的核苷酸底物和模板碱基互补时，DNA聚合酶催化其聚合，同时会释放出焦磷酸，焦磷酸被酶转化为ATP，ATP在荧光素酶的作用下会产生光子而被高灵敏光电探测器检测到。它通过底物加入顺序来确定核苷酸种类，是一种即时(real-time)测序法。该方法多个酶促反应和生物芯片的高通量检测结合起来对于基因组测序有一定的优势。但其存在测序长度受限(50bp左右)和对多个连续同样的核苷酸不能准确测序，而且需要特定的仪器装备。

一些研究者合成了许多光切基团或化学试剂切割基团用于DNA测序研究。采取的路线基本是用DNA合成酶掺入荧光标记物后检测，然后用激光或其他化学试剂去除荧光基团。之后加入下一个标记底物。也有研究将光切割和核苷酸3’-OH用化学基团保护结合起来，这样可以实现每次只掺入一个核苷酸进入引物链。光切割荧光核苷酸法借鉴了DNA和多肽化学合成的思想，但采用的催化剂是高度特异性酶，由于3’-OH端被保护，每次只能掺入一个核苷酸，每次延伸的核苷酸的种类由模板来决定，但我们可以通过其荧光颜色来得知每次掺入的是何种核苷酸，因此序列可以得知。但由于3’-OH涉及磷酸二酯键的形成，核苷酸的3’-OH非常靠近DNA聚合酶的活性位点，因此对3’-OH的修饰非常敏感，很少DNA聚合酶能够催化该底物的聚合。这些路线的缺点一是需要合成复杂的切割基团；二是荧光基团不一定会完全切掉和脱掉，当延伸到一定长度会产生背景干扰。光切割荧光核苷酸法是最近新发展起的新技术，还在起步阶段，其光切割荧光核苷酸还没有商品化，且其准确度和长度还待进一步确定。

单碱基延伸反应(single base extension，SBE)，又名微测序法(minisequencing)。根据待检测样品的SNP位点序列设计引物(不包括SNP位点)并将其直接固定在芯片上，以待测样品的PCR产物作为模板，则寡核苷酸引物的3’端碱基紧挨于模板多态性碱基位点，当模板和引物杂交后，加以用各色荧光或者其他标记物标记的4种ddNTP，在DNA多聚酶的催化下与模板配对的引物直接在芯片上进行固相单碱基延伸反应，通过检测荧光的种类得知掺入SNP位点的核苷酸底物的种类。DNA多聚酶的特异性使该方法的敏感度和分辨率均较高，但其缺点是必须使用多色荧光系统以及相应的检测系统，而且多种染料的激发光和发射荧光的光谱往往会有较大部分的重叠，从而干扰对荧光强度的测量精度。

发明内容

本发明的目的在于克服上述所提到的核酸测序方法中的不足，提出一种基于生物芯片的高通量基于引物延伸的DNA测序方法，具有测序价格低、准确性高和可操作性强的优点。

本发明采用如下技术方案：

一种用于确定未知核酸序列的核酸序列测定方法：A)在被测的DNA模板中引入一段已知的通用DNA序列，并使之固定于固相基质上；B)设计1-15个寡核苷酸DNA引物组合，使其含有一段与上述加入的通用DNA序列互补的序列，并使该1-15个寡核苷酸DNA引物的3’端分别含有0、1、2、……、14个简并性核苷酸；C)根据待测核苷酸位点的位置，从上述引物组合中选择一种引物，并将其与A中所述的固定DNA模板杂交，使待测核苷酸位点紧接着引物3’末端；D)用DNA聚合酶及用四种可分辨的标记物标记的双脱氧核苷酸底物或分别用一种或几种标记物标记的四种脱氧核苷酸或双脱氧核苷酸，在杂交到模板上的引物上进行一种核苷酸延伸；E)检测D中被延伸核苷酸种类，A中DNA模板被测碱基的种类与延伸核苷酸种类互补。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、高通量。本发明将DNA测序技术和生物芯片相结合，可以同时在芯片上固定数千到数十万个样品，可以对数千个样品进行测序。

2、便宜。本发明只需要数套测序引物组合，引物组合的套数与测序长度相同，可以对大量的样品进行测序。

3、方便。本发明采取简并性引物延伸法测序，可以方便地测出引物一侧8-9个碱基的序列。如果和特异性限制内切酶结合使用可以测得更长的序列。

4、准确性高。

附图说明

图1是本发明的用含0个简并性核苷酸的引物延伸示意图。X行代表引物链，和引物结合的区域为引物结合区(在模板链中)；Y行代表模板链，？代表待测得序列，B*代表掺入的标记核苷酸。

图2是本发明的用含1个简并性核苷酸的引物延伸示意图。引物链中3’端有1个兼并性核苷酸(N)；经过DNA聚合酶的聚合，和模板中第二位置的碱基(待测的碱基)互补的标记核苷酸B*被共价掺入引物链。与B*互补的核苷酸即为模板中第二位置？的核苷酸。

图3是本发明的用含2个简并性核苷酸的引物延伸示意图。物链中3’端有2个兼并性核苷酸(NN)；经过DNA聚合酶的聚合，和模板中第三位置的碱基(待测的碱基)互补的标记核苷酸B*被共价掺入引物链。与B*互补的核苷酸即为模板中第三位置？的核苷酸。

图4是本发明的用含7个简并性核苷酸的引物延伸示意图。引物链中3’端有7个兼并性核苷酸(NNNNNNN)；经过DNA聚合酶的聚合，和模板中第八位置的碱基(待测的碱基)互补的标记核苷酸B*被共价掺入引物链。与B*互补的核苷酸即为模板中第八位置？的核苷酸。

图5是本发明实施例2的芯片扫描结果图。每个方阵有4行，从上至下分别为seq1，seq2，seq3和seq4。每个序列重复4次。A，C，G，T分别代表所加的标记核苷酸，P1-P7代表seq5-seq11引物(和seq1-seq4杂交后延伸)。

图6是本发明实施例2的荧光强度柱状图。图中seq1、seq2、seq3和seq4分别为4个合成的模板，与材料方法中所列序列相对应。X轴的数字1-7分别和所加入的测序引物seq5-seq11相对应；Y轴为扫描后所得到的荧光强度。通过比较荧光强度可以在seq1中读出序列：CTACCTG；在seq2中读出序列为：GACGCAC；在seq3中读出序列为：TCGTCTG；在seq4中读出：AGGACTA。

图7是本发明实施例3的PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果图。

图8是本发明实施例3的芯片扫描结果图。

图9是本发明实施例3用Sanger法测序测序部分结果图。

具体实施方式

实施例1

一种用于确定未知核酸序列的核酸序列测定方法：

A)在被测的DNA模板中引入一段已知的通用DNA序列，并使之固定于固相基质上；B)设计1-15个寡核苷酸DNA引物组合，使其含有一段与上述加入的通用DNA序列互补的序列，并使该1-15个寡核苷酸DNA引物的3’端分别含有0、1、2、……、14个简并性核苷酸；C)根据待测核苷酸位点的位置，从上述引物组合中选择一种引物，并将其与A中所述的固定DNA模板杂交，使待测核苷酸位点紧接着引物3’末端；D)用DNA聚合酶及用四种可分辨的标记物标记的双脱氧核苷酸底物或分别用一种或几种标记物标记的四种脱氧核苷酸或双脱氧核苷酸，在杂交到模板上的引物上进行一种核苷酸延伸；E)检测D中被延伸核苷酸种类，A中DNA模板被测碱基的种类与延伸核苷酸种类互补。

本实施例可以依次用含不同个数的简并性核苷酸的引物重复A-E操作，检测不同位置核苷酸。

上述步骤D)所述的标记的核苷酸为用于聚合酶延伸的标记有荧光化学基团的核苷酸。

标记核苷酸的方法是通过生物素、地高辛连接，用于显色反应的酶或纳米金颗粒标记的抗体或亲和素来标记核苷酸。

上述步骤A)所述的固体基质是指平板基质、微孔板或微球。

上述步骤A)所述的被测的DNA模板为PCR产物，滚环扩增产物，DNA质粒或酶加工后的DNA片断。

上述步骤A)所述的引入一段已知的通用DNA序列的方法可以是下列之一：(1)通过DNA连接酶在待测的序列两端加入接头，该接头为和引物杂交的已知序列；(2)将待测的DNA连接到载体中，然后转化大肠杆菌，得到单菌落克隆后进行以插入DNA序列两端的载体序列作为引物进行PCR，从而使载体的一部分已知序列引入待测DNA序列；(3)对已知部分序列信息的待测DNA进行测序，可直接以已知序列部分作为引物结合区，待测部分紧接着引物结合区。

下面结合图1-图4，对本发明的具体实施方式作出更为详细的描述：

首先将待测的DNA样品固定在生物芯片基片上，通过变性产生DNA单链模板。模板上有已知序列的引物结合区。待测的DNA序列为紧接着引物结合区5’方向一侧的序列，如图1中所示的标有“？”的区域。

为了测得模板中紧接着引物结合区5’方向后第一个位置的碱基的种类，用3’端紧接着待测位点的引物和模板杂交，然后用DNA聚合酶、标记的双脱氧核苷酸或脱氧核苷酸及反应缓冲液延伸(见图1)。延伸时可用四种不同标记信号的双脱氧核苷酸底物同时延伸；也可用一种标记信号标记的四种双脱氧核苷酸或脱氧核苷酸分别进行四次延伸。延伸后检测，根据标记信号及碱基互补配对原则(即A和T，C和G互补配对)，则第一个位置的碱基种类可以确定。

为了测得模板中紧接着引物结合区5’方向后第二个位置的碱基的种类，所用的引物包括两个部分，一部分为和引物结合区的已知序列，一部分为和未知序列结合的区。因为引物结合区5’方向后第一个位置的为未知序列，其种类的可能性有四种。因此引物中和其对应的碱基也有四种。在合成引物时该位置为简并性核苷酸，即该位置为含核苷酸A，G，C和T的混合物，如图2所示用N来表示。当该引物和待测模板杂交后，用标记的核苷酸及DNA聚合酶延伸，由于DNA聚合酶的特异性选择，当标记底物核苷酸和第二个位点的碱基互补时，标记底物会掺入引物链(在图2中用B*表示)，之后用检测仪器检测，根据标记物性质或标记核苷酸加入顺序，就可以确定是何种碱基掺入引物链。

为了测得模板中紧接着引物结合区5’方向后第三个位置的碱基的种类，用3’端有两个简并性核苷酸的引物杂交，即有两个N的引物和模板杂交。见图3。之后用DNA聚合酶及标记底物延伸，然后检测。

如此类推，当测第四个碱基是用用3’端有三个简并性核苷酸的引物杂交，测第八个碱基时用3’端有七个简并性核苷酸的引物杂交(见图4)。

由以上方法可知，本发明可以测得引物结合区一侧特定位置碱基的种类。为了测得待测位点的碱基种类，可用方案一：将待测模板分成若干份，固定在芯片的不同位置上，或几张重复制作的芯片上。每个位置分别用含有不同个数的简并性引物杂交后延伸，可以同时获得待测的不同位置的碱基种类的信息。也可以用方案二：先用其中的一种引物和固定的模板杂交后延伸，待检测后通过变性处理使引物链和模板链分离，然后加入第二种引物杂交后延伸，如此反复进行多次。以上提供的方法可以非常方便的测出引物结合区一侧10个左右的碱基序列的信息。为了测出更长的碱基序列，可以结合限制性内切酶的酶切位点进行测序。也就是测定特定酶切位点一侧的序列，酶切位点一般具有4-6个特定碱基组成的序列，因此可以有效地增加测序的长度。

本发明提供的测序方法是将待测的双链DNA样品共价固定到生物芯片基质上。生物芯片基质是指平板基质(如玻璃片、硅片、凝胶层、塑料、橡胶、陶瓷、硝酸纤维素膜、尼龙膜等)、微孔板(如塑料板、金属板、橡胶板、玻璃板等)、和微球(如亲和素包被的磁珠)。有多种方法可以将DNA样品固定至生物芯片的片基表面。首先，将生物芯片基片进行修饰，使其表面带有醛基、氨基、巯基、羧基、环氧基等或其他活性基团，或用链霉亲和素、亲和素等包被，然后将用氨基、生物素、磷酸基或巯基等修饰DNA分子点至基片上，将其连接到修饰过的芯片基片上；如醛基修饰的基片可以和氨基修饰的DNA反应，羧基修饰的基片在催化剂如EDC存在下和氨基修饰得DNA反应；对于微球来说常用的为链霉亲和素包被的磁珠，将修饰有生物素的DNA和微球在小离心管中混合，放置一段时间后DNA会结合到磁珠表面。

被测得DNA序列含有一段已知序列用于和测序引物杂交。该序列的引入有多种方法：例如通过DNA连接酶在待测的序列两端加入接头，接头可作为和引物杂交的序列；将待测的DNA连接到载体中，然后转化大肠杆菌，得到单菌落克隆后进行以插入DNA序列两端的载体序列作为引物进行PCR，从而使载体的一部分已知序列引入待测DNA序列。对已知序列信息的待测DNA进行再测序，可直接以已知序列部分作为引物结合区，待测部分紧接着引物结合区。

被测的DNA模板为PCR产物，如PCR产物固定至芯片基质后，通过高温或加入变性剂如NaOH，甲酰胺，尿素等变性DNA双连，使没有连接到基质的链分离。被测的DNA模板也可为滚环扩增产物，如将DNA模板用DNA连接酶成环，然后用5’端修饰的引物和模板环杂交，杂交后通过引物将杂交产物固定在芯片基质上，然后加入持续合成能力很强的DNA合成酶如phi29 DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶及dNTP底物进行滚环扩增，也可以先将引物固定后再和模板形成的环杂交，然后延伸或将滚环扩增产物直接固定在基质上。被测的DNA模板也可以为DNA质粒，酶加工后的DNA片断等。

本测序过程涉及到引物和模板的退火、聚合酶延伸反应来检测核苷酸是否掺入。在本发明中待测的DNA样品作为引物、聚合酶延伸的模板。任何已知的或适用的DNA聚合酶可以被用；在模板为RNA时，聚合酶为反转录聚合酶。底物核苷酸为任何可以用于聚合酶延伸的核苷酸，例如脱氧核苷酸dATP，dCTP，dGTP，dTTP，双脱氧核苷酸；双脱氧核苷酸是指3’-OH不存在或被修饰，它可以被聚合酶掺入到引物链中但不能继续延长，如ddATP，ddCTP，ddGTP，ddTTP。核苷酸被标记以方便核苷酸掺入的检测；一种或多种核苷酸被用，如Cy3，Cy5，TexasRed，FRET，FITC等标记的核苷酸。核苷酸的标记及检测方法如一些文献所示，主要是一些荧光染料，如荧光素、花青素、罗丹明等，也可以通过生物素、地高辛等连接纳米金颗粒标记的抗体或亲和素等来标记核苷酸。因为荧光标记和荧光检测是研究最为成熟的方法，为了方便起见，荧光为本发明主要标记及检测方法，但不排除其他标记和检测方法。将引物和固定在基质的模板杂交是将引物溶解在溶液如2XSSC或TE溶液中，使终浓度为1微摩尔到100微摩尔都可。溶有引物的溶液加到已固定有模板的基质上，在湿盒或微量离心管中孵育5分钟至数小时，孵育温度一般在37℃或其它温度。之后用洗涤液洗涤，以洗掉未杂交上的引物。延伸反应体系包括：DNA聚合酶及酶缓冲液如klenow DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶等，标记的核苷酸，有时还加入BSA，单链结合蛋白等。延伸温度在37℃-72℃都可，延伸时间可以为半分钟至数分钟。延伸反应可通过将芯片放入洗涤液或加入50mM EDTA溶液终止，洗涤后用芯片扫描仪或其它检测仪器检测。

实施例2：对人工合成的DNA模板进行测序

以下DNA序列由invitrogen公司合成：

Seq1：5’NH2-(T)25 TT CT C AGG TAG AGT TGG AGC TCA GGA CAT GGC AT

Seq2：5’NH2-(T)25 TT AC G TGC GTC AGT TGG AGC TCA GGA CTG GGC TG

Seq3：5’NH2-(T)25 TT GT C AGA CGA AGT TGG AGC TCA GGA ATA CTT AT

Seq4：5’NH2-(T)25 T T AGT CCT AGT TGG AGC TCA GGA TCC TTG GA

Seq5：5’-CTGAGCTCCAACT 3’

Seq6：5’-TGAGCTCCAACTN 3’

Seq7：5’-GAGCTCCAACTNN 3’

Seq8：5’-GAGCTCCAACTNNN3’

Seq9：5’-AGCTCCAACTNNNN3’

Seq10：5’-GCTCCAACTNNNNN 3’

Sequ11：5’-CTCCAACTNNNNNN 3’

Seq1-seq4作为DNA模板，seq5-seq11为测序引物。模板序列中倾斜加粗的部分为引物结合区，下划线部分为待测序列，NH2表示为氨基修饰。N为简并性核苷酸，在化学合成DNA模板时该位置同时加入四种合成DNA的底物。Cy5-dATP，Cy5-dCTP，Cy5-dGTP and Cy5-dUTP购自Perkin Elmer公司。Therminator DNA聚合酶购自NEB公司。聚丙烯酸(Poly(acrylic acid，sodiumsalt))购自Sigma公司。

1、基片的制备

(1)玻片的清洁：用1M的NaOH浸泡玻片1小时，双蒸水冲洗干净，再用重铬酸(重铬酸钾+浓硫酸)浸泡12小时，双蒸水多次冲洗去净残酸。

(2)氨基片的处理：先用95％乙醇洗涤玻片，吹干；用3％的硅烷乙醇溶液(3ml氨基硅烷加95％乙醇至终体积100ml)浸泡玻片30分钟或超声波浸泡15分钟；用95％乙醇洗净，再用双蒸水洗净，吹干，110℃烘30分钟。

(3)羧基片的处理：氨基硅烷化的玻片用Poly(acrylic acid，sodium salt)2mg/ml水溶液(配制：Poly(acrylic acid，sodium salt)35wt％solutionin water 572ul加双蒸水至100ml)浸泡20分钟，双蒸水洗涤三次，吹干。

2、模板的固定：5’端氨基修饰的模板溶解在0.1M Mes缓冲液(2-(N-吗啉代)乙磺酸)，pH5.1，溶液中含有5mM EDC(1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺)，使模板的终浓度为5微摩尔。通过点样仪将氨基修饰的模板点至羧基处理的玻片上，每个模板重复点四次，四个模板为一方阵，共点28个方阵。在室温下放置于封闭的湿盒中三个小时。然后用去离子水洗涤5分钟，然后用2×SSC/0.2％SDS溶液洗涤5分钟，再用0.2×SSC洗涤5分钟，最后用蒸馏水洗涤5分钟后用氮气吹干。

3、聚合酶介导的引物延伸反应：终浓度为50uM的引物(溶于2×SSC/0.2％SDS)加到含有测序模板的点阵上，每4个方阵加一种引物，分别加入seq5-seq11和模板退火。退火反应在42℃反应30分钟。然后用2×SSC/0.2％SDS洗液洗涤后吹干。四个加有相同引物的方阵分别加入含有0.4uM Cy5-dATP，Cy5-dCTP，Cy5-dGTP and Cy5-dUTP延伸反应液。延伸反应液包括：Cy5修饰的核苷酸底物，0.5U Therminator DNA聚合酶，聚合酶缓冲液。反应在60℃反应2分钟。用50mM EDTA终止反应，洗涤后吹干。然后用芯片扫描仪扫描。

结果：以Seq1-seq4作为DNA模板，当用seq5作为测序引物和它们杂交后，用DNA聚合酶延伸标记的核苷酸，在seq1中可以被聚合酶掺入的碱基为C；seq2为G；seq3为T；seq4为A；从扫描后结果如图6可以看出，在seq1中X轴为1的A、C、G、T四个荧光强度中C的强度最高。在seq2中X轴为1的A、C、G、T四个荧光强度中G的强度最高。在seq3中X轴为1的A、C、G、T四个荧光强度中T的强度最高。在seq4中X轴为1的A、C、G、T四个荧光强度中A的强度最高。

当seq6作为测序引物和Seq1-seq4杂交后，X轴为2中荧光强度最强的分别为：

seq1：T；seq2：A；seq3：C；seq4：G。

当seq7作为测序引物和Seq1-seq4杂交后，X轴为3中荧光强度最强的分别为：

seq1：A；seq2：C；seq3：G；seq4：G。

当seq8作为测序引物和Seq1-seq4杂交后，X轴为4中荧光强度最强的分别为：

seq1：C；seq2：G；seq3：T；seq4：A。

当seq9作为测序引物和Seq1-seq4杂交后，X轴为5中荧光强度最强的分别为：

seq1：C；seq2：C；seq3：C；seq4：C。

当seq10作为测序引物和Seq1-seq4杂交后，X轴为6中荧光强度最强的分别为：

seq1：T；seq2：A；seq3：T；seq4：T。

当seq11作为测序引物和Seq1-seq4杂交后，X轴为7中荧光强度最强的分别为：

seq1：G；seq2：C；seq3：G；seq4：A。

由结果可知本方法可以准确地测出引物一侧数个碱基的种类。

实施例3：对T7噬菌体DNA文库克隆进行测序

材料：T7噬菌体DNA购自上海生物工程公司；Tsp509 I购自NEB公司；pUC118载体、感受态细菌及转化试剂盒、T4DNA连接酶购自大连宝生物公司；klenow DNA聚合酶购自fermentas公司；以下序列订购自invitrogen公司：M13前引物：NH-CAGGAAACAGCTATGAC(seq12)；M13后引物：GTAAAACGACGGCCAGT(seq13)；测序引物：GCATGCCTGCAGGTCAATT(seq14)；CATGCCTGCAGGTCAATTN(seq15)；ATGCCTGCAGGTCAATTNN(seq16)；ATGCCTGCAGGTCAATTNNN(seq17)；TGCCTGCAGGTCAATTNNNN(seq18)；

实验步骤：

1、将T7噬菌体DNA用Tsp509 I进行酶切，反应体系为：

T7噬菌体DNA 2μg

Tsp509 I(10U/μl)0.5μl

Tsp509 I反应缓冲液(10×)2μl

H2O  17.5μl

65℃，2小时；

酶切产物用天为公司的PCR纯化试剂盒纯化。

2、用klenow DNA聚合酶补齐粘性末端为平端，反应体系为：

纯化的T7噬菌体DNA酶切片断 20μl

klenow DNA聚合酶(10U/μl) 0.5μl

dNTP(10mM)                0.5μl

37℃，2小时；然后70℃，15分钟失活。

DNA聚合酶补齐的产物用天为公司的PCR纯化试剂盒纯化。

3、将T7 DNA平端片断和pUC118连接

纯化的T7噬菌体DNA酶切片断    20μl

T4 DNA连接酶                 1μl

T4 DNA连接酶反应缓冲液(10×) 2μl

16℃，2小时；然后70℃，15分钟失活。

(4)将连接的载体转化细菌：方法按大连宝生物转化试剂盒提供的步骤进行转化。

(5)将转化的细菌进行平板培养：将转化的细菌涂布在LB固体培养基(含50μg/ml氨苄青霉素)过夜培养。

(6)挑一单菌落进行菌液PCR：挑单个菌落在LB液体培养基(含50μg/ml氨苄青霉素)培养4个小时，取0.5μl加入PCR反应液中：

菌液0.5μl

dNTP(10mM)                    1μl

Taq DNA聚合酶反应缓冲液(10×) 5μl

Taq DNA聚合酶(5U/μl)         1μl

M13前引物(10μM)              2μl

M13后引物(10μM)              2μl

H2O    38.5μl

反应条件：94℃30秒，54℃30秒，72℃30秒，35个循环。反应完毕用天为公司的PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。在纯化的最后一步中用去离子水代替洗脱液。用1％的琼脂糖凝胶进行电泳进行检测。

(7)模板的固定：5’端氨基修饰的模板溶解在0.1M Mes缓冲液(2-(N-吗啉代)乙磺酸)，pH5.1，溶液中含有5mM EDC(1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺)。将模板点至羧基处理的玻片上，每个模板重复点4次，四个模板为一方阵，共点28个方阵。在室温下放置于封闭的湿盒中三个小时。然后用去离子水洗涤5分钟，然后用2×SSC/0.2％SDS溶液洗涤5分钟，再用0.2×SSC洗涤5分钟，最后用蒸馏水洗涤5分钟后用氮气吹干。将固定有PCR产物的基片浸入沸水中10分钟，变性DNA双链，从而单链模板。

(8)聚合酶介导的引物延伸反应：终浓度为50uM的引物(溶于2×SSC/0.2％SDS)加到含有测序模板的点阵上，每4个方阵加一种引物，分别加入测序模板seq14-seq18和模板退火。退火反应在42℃反应30分钟。然后用2×SSC/0.2％SDS洗液洗涤后吹干。四个加有相同引物的方阵分别加入含有0.4uM Cy5-dATP，Cy5-dCTP，Cy5-dGTP和Cy5-dUTP延伸反应液。延伸反应液包括：Cy5修饰的核苷酸底物，0.5U Therminator DNA聚合酶，聚合酶缓冲液。反应在60℃反应2分钟。用50mM EDTA终止反应，洗涤后吹干。然后用芯片扫描仪扫描。

结果：

1、PCR反应产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定结果：

T7噬菌体DNA用Tsp509 I进行酶切，产生AATT的粘性末端；然后插入pUC118载体中后转化并挑取克隆，然后用M13引物扩增插入载体中的序列。T7DNA插入的部位及插入两侧序列如下：

NH2- CAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTC↓AATTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN AAGCTTGGC ACTGGCCGTCGT TTTAC

划线部分为M13引物；箭头为T7DNA在载体中插入部位位；划框的部分为测序引物结合区；↓AATTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAATT↓为插入序列。

参照图7，1-8道为PCR产物，分子量为330bp，第9道为分子量marker：从下至上依次为100，250，500，750，1000，2000bp。

2、用含简并性引物延伸测序结果

用测序引物seq14-seq18分别和模板杂交后分别用Cy5-dATP，Cy5-dCTP，Cy5-dGTPand Cy5-dUTP延伸，结果见图9。可以从图中读出序列：AACAC；加上已知的AATT酶切位点则序列为：AATTAACAC；模板链则为：GTGTTAATT。

参照图8，PCR产物被固定在基片上，每个点阵中重复点4次。P1-P5分别为测序引物，分别与seq14-seq18相对应。A，C，G，T分别代表所加的标记核苷酸。

3、用sanger法测序验证测序结果。

将PCR产物纯化后送至invitrogen公司用sanger法测序。该PCR产物序列如下：

CCGGGGATCCTCTAGAGTCAATTGGACAAAATGCCAGCACTTCCGGCTAAAGGTAACTTGAACCTCCGTGACATCTTAGAGTCGGACTTCGCGTTCGCGTAACGCCAAATCAATACGACTCACTATAGAGGGACAAACTCAAGGTCATTCGCAAGAGTGGCCTTTATGATTGACCTTCTTCCGGTTAATACGACTCACTATAGGAGAACCTTAAGGTTTAACTTTAAGACCCTTAA GTGTTAATTGACC(seq19)

可以查出末端部分序列为：GTGTTAATT。与用含简并性引物延伸测序结果一致。

由图10可以读出靠近末端的序列为：GTGTTAATTGACC。

Claims (9)

1、一种用于确定未知核酸序列的核酸序列测定方法，其特征在于：A)在被测的DNA模板中引入一段已知的通用DNA序列，并使之固定于固相基质上；B)设计1-15个寡核苷酸DNA引物组合，使其含有一段与上述加入的通用DNA序列互补的序列，并使该1-15个寡核苷酸DNA引物的3’端分别含有0、1、2、……、14个简并性核苷酸；C)根据待测核苷酸位点的位置，从上述引物组合中选择一种引物，并将其与A中所述的固定DNA模板杂交，使待测核苷酸位点紧接着引物3’末端；D)用DNA聚合酶及用四种可分辨的标记物标记的双脱氧核苷酸底物或分别用一种或几种标记物标记的四种脱氧核苷酸或双脱氧核苷酸，在杂交到模板上的引物上进行一种核苷酸延伸；E)检测D中被延伸核苷酸种类，A中DNA模板被测碱基的种类与延伸核苷酸种类互补。

2、根据权利要求1所述的核酸序列测定方法，其特征在于依次用含不同个数的简并性核苷酸的引物重复A-E操作，检测不同位置核苷酸。

3、根据权利要求1的核酸序列测定方法，其特征在于步骤D)所述的标记的核苷酸为用于聚合酶延伸的标记有荧光化学基团的核苷酸。

4、根据权利要求1所述的核酸序列测定方法，其特征在于通过生物素、地高辛连接，用于显色反应的酶或纳米金颗粒标记的抗体或亲和素来标记核苷酸。

5、如权利要求1所述的核酸序列测定方法，其特征在于步骤A)所述的固体基质是指平板基质、微孔板或微球。

6、如权利要求1的核酸序列测定方法，其特征在于步骤A)所述的被测的DNA模板为PCR产物，滚环扩增产物，DNA质粒或酶加工后的DNA片断。

7、如权利要求1的核酸序列测定方法，其特征在于步骤A)所述的引入一段已知的通用DNA序列的方法是：通过DNA连接酶在待测的序列两端加入接头，该接头为和引物杂交的已知序列。

8、如权利要求1的核酸序列测定方法，其特征在于步骤A)所述的引入一段已知的通用DNA序列的方法是：将待测的DNA连接到载体中，然后转化大肠杆菌，得到单菌落克隆后进行以插入DNA序列两端的载体序列作为引物进行PCR，从而使载体的一部分已知序列引入待测DNA序列；

9、如权利要求1的核酸序列测定方法，其特征在于步骤A)所述的引入一段已知的通用DNA序列的方法是：对已知部分序列信息的待测DNA进行测序，可直接以已知序列部分作为引物结合区，待测部分紧接着引物结合区。

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