CN103866010A - 一种基因测序的方法 - Google Patents

一种基因测序的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103866010A
CN103866010A CN201410069473.7A CN201410069473A CN103866010A CN 103866010 A CN103866010 A CN 103866010A CN 201410069473 A CN201410069473 A CN 201410069473A CN 103866010 A CN103866010 A CN 103866010A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
kinds
acid molecule
dna
fluorescence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201410069473.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103866010B (zh
Inventor
郭诚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Boke Biomedical Technology Wuxi Co ltd
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201410069473.7A priority Critical patent/CN103866010B/zh
Publication of CN103866010A publication Critical patent/CN103866010A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103866010B publication Critical patent/CN103866010B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基因测序的方法，利用三种不同波长的激光激发三种荧光标记的核苷酸分子，所述的核苷酸分子为A、C、G和T四种核苷酸分子中的任意三种，剩余一种核苷酸分子无荧光核酸标记，该方法以无荧光激发为标志重新定义了测序仪，是一种采用三色荧光边合成边测序的方法。该方法简化了合成步骤，且成像装置较为简单，成本低；而且采用的荧光标记核酸荧光分子只有3种，每个测序周期都不会在DNA链上留下多余的残留分子，不会影响DNA聚合酶与待测的DNA链的结合，可以大幅度地提高测序准确率和读长。

Description

一种基因测序的方法
技术领域
本发明属于基因测序技术领域，具体涉及一种基因测序的方法。 
背景技术
DNA测序（DNA sequencing）是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）和鸟嘌呤（G）的排列方式。快速，准确和低廉的DNA测序方法将极大地推动生物学和医学的研究和发现。现在，已经可以测定了包括人类基因组和其他许多动物、植物和微生物物种的完整基因序列，有助于更深入地了解生命的本质。临床上，许多和疾病有关的基因测定则让医护人员更好地诊断和治疗病患，逐渐体现基因测序的巨大应用前景。 
早在1977年， Sanger等发明双脱氧链末端终止法。同时的Maxam和 Gilbert则发明了化学降解法进行碱基序列的测定。第一代DNA测序仪器使用的是Sanger的方案。后来经过改进成为四色荧光，利用毛细管电泳的高度自动化测序系统。第一代DNA测序仪的产生具有划时代的意义，90年代美国的人类基因组计划就是利用大规模的Sanger测序仪获得第一个完整的人类基因组。由于其准确性高，所以作为基因组的"参照"序列而被采用。 
但是第一代DNA测序仪器的消耗成本巨大，样品通量小，导致测序花费时间长。要花数十亿美元的资金，上万的科研人员和超过十年的时间才能获得一个人的完整基因，所以在应用上受到很大的限制。 
进入21世纪后，陆续出现了更为强大的第二代基因测序技术。主要是Roche公司的焦磷酸测序法，Illumina公司的DNA合成终止法测序以及Life Technologies公司的DNA连接测序法。这些公司利用商业化提供的仪器，以短的连续性的片段序列和测序阅读长度的形式，可以将获得一个人的基因组的时间缩小到数周，成本只需要数十万美元左右。 
但是现有的基因测序技术存在如下问题：（1）Roche公司的方法对连续相同序列的DNA测序准确率差，因为其方法没有采用合成终止技术，而且需要利用多种酶，效率低，成本高，已逐渐被市场淘汰；（2）Life Tech公司的DNA连接测序缺点是使用连接酶而不是聚合酶，所以准确率不好，而且成本很高；（3）Illumina公司比上述两个公司的方法更好，其主要缺点是利用４种荧光分子，成本高，装置复杂，而且每个测序周期都会在DNA链上留下多余的残留分子。 
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于基因测序的方法，该方法简化了合成步骤，且成像装置较为简单，成本低；而且采用的荧光标记核酸荧光分子只有3种，每个测序周期都不会在DNA链上留下多余的残留分子，不会影响DNA聚合酶与待测的DNA链的结合，可以大幅度地提高测序准确率和读长。 
本发明的上述目的是通过如下技术方案来实现的：一种基因测序的方法，利用三种不同波长的激光激发三种荧光标记的核苷酸分子，所述的核苷酸分子为A、C、G和T四种核苷酸分子中的任意三种，剩余一种核苷酸分子无荧光核酸标记，以该方法为基础重新定义了基因测序仪，是一种采用三色荧光边合成边测序的方法。 
该方法采用三色荧光边合成边测序，与目前市场主流的四色荧光测序仪有本质的区别。 
作为本发明的一种优选的实施方案，本发明提供的基因测序的方法，具体含以下步骤： 
（1）合成一套基因测序用核酸分子，包括三种荧光标记核酸分子和一种无荧光标记核酸分子，所述的三种荧光标记核酸分子为A、C、G和T四种核苷酸分子中的任意三种，剩余一种即为无荧光标记的核酸分子；
（2）将待测的单链DNA连接到通用的DNA序列上，然后固定在玻璃基底表面； 
（3）将互补的DNA引物与连接有待测DNA的通用的DNA序列配对，并且引物上设有3’-OH官能团； 
（4）利用DNA聚合酶，将上述荧光标记核酸加入到引物的3’-OH上，获得待测样品； 
（5）使用3种不同波长的激光分别先后照射待测样品，每种激光会激发相应的荧光基团，并且产生相应的荧光，通过显微镜成像系统，信号通过3种不同的滤波片，读出每段DNA上带有的不同荧光信号，其中3种不同波长的激光为波长之间差别在30nm以上的激光；
（6）化学切除保护基团，引物3’-OH上的-N3，以及荧光分子和碱基之间的-N3；
（7）进行下一轮的测序，测得引物的DNA序列，从而测得待测DNA的序列。
本发明步骤（1）中采用的一套基因测序用核酸分子，包括三种荧光标记的核酸分子A，C和G，以及一种无荧光标记的核酸分子T，各核酸分子的结构式如下： 
Figure 536022DEST_PATH_IMAGE001
    (A)
Figure 781059DEST_PATH_IMAGE002
(G)
  
Figure 91955DEST_PATH_IMAGE003
          (C)
                                (T)。
一般来说，本发明可以采用各种各样的荧光分子，都可以达到测序的目的。 
但本发明也可以优选采用如下列举的荧光分子，本发明所述的荧光分子1优选为rhodamine X或Alexa Fluor 594，所述的荧光分子2优选为Cy5或Alexa Fluor 647，所述的荧光分子3优选为BOIDIPY-FL或Alexa Fluor 488。 
实际上，本发明该方法所用的激光和荧光分子包括但不局限于上述的几种。只需要每个激光器的波长处于相应的一种荧光分子的最大激发波长附近即可。 
且本发明中采用的三种修饰的核苷酸分子组合也不局限于上述所列的组合（A，C，G），也可以是其他组合如（C，G，T）、(G，T，A)或(T，A，C)，此处不再一一列举。 
本发明所述的核酸分子C优选通过以下合成工艺制得： 
 在上述合成工艺中，各步骤代表的反应过程如下：
（1）选取起始原料1胞嘧啶，其5’-OH被硅保护，3’-OH被叠氮甲基保护，将原料与条件（i）中的三乙胺TEA、二氯甲烷DCM以及酰氯化合物反应，形成碱基被修饰的产物2；
（2）将产物2与条件（ii）中的四正丁基氟化铵TBAF反应，5’-OH的硅保护被去掉，形成碱基被修饰的产物3；
（3）将产物3与条件（iii）中的三氯氧磷POCl3、磷酸三甲酯(MeO)3PO、丁基胺二氢焦磷酸BuNH2H2P2O7、三乙胺碳酸氢盐TEAB和三丁胺Bu3N反应，形成5’-OH的三磷酸产物4；
（4）将产物4与条件（iv）中的哌啶piperidine、二甲基甲酰胺DMF反应，脱掉芴基保护集团，形成含有氨基的产物5；
（5）将产物5与条件（v）中的荧光分子3 BODIPY-FL-NHS（Life Technologies公司），在浓度为0.1mol/L、pH为8~9的碳酸氢钠/碳酸钠缓冲溶液中反应，形成含有荧光基团的最终产物6，即为所述的核酸分子C。
本发明所述的核酸分子A和核酸分子G的合成过程同核酸分子C。 
核酸分子A合成的起始原料为2’-deoxyadenosine monohydrate，从Berry and Associates公司购买， 产品编号是PR-3445；核酸分子G合成起始原料为2’-deoxyguanosine monohydrate，从Berry and Associates公司购买， 产品编号是PR-3452。除了核酸分子A和核酸分子G的合成过程中所采用的起始原料与核酸分子C的不同之外，核酸分子A和核酸分子G的合成过程中的其他步骤皆同荧光标记核酸分子C的合成过程相同。 
本发明中采用的无荧光标记的核酸分子T为市售产品，可以从如Sigma Aldrich公司可以购买，www.sigmaaldrich.com，产品编号是T0251-50MG。 
其中，显微镜成像系统采用TIRF，TIRF是total internal reflection fluorescent microscope的简称，即“全内反射荧光显微镜”的缩写，本发明所述3种不同波长的激光可以是任意三种可见光波段的、与荧光分子对应的、彼此相差30纳米以上的激光组合；优选波长分别为488nm，568nm和643nm的激光；或波长为512nm，568nm和633nm的激光。 
3种激光的波长必须分别在3种荧光的最大吸收波长附近，并且使用3种不同的滤波片，必须分别在3种荧光的最大发射波长附近，以便达到最大的荧光产生效率，而且3种荧光信号不至于互相干扰。 
读出信号后，通过化学还原反应切除保护基团，3’-OH上的-N3终止基团，以及荧光分子和碱基之间的-N3，该基团被还原成为氨基，之后3’-OH上发生水解脱落，而荧光分子和碱基之间的氨基甲酸酯键受氨基进攻断裂，从而恢复为天然碱基。 
上述切除保护基团原理和过程如下： 
读出信号后，必须通过化学还原反应切除保护基团，3’-OH上的-N3终止基团，以及荧光分子和碱基之间的-N3。从而恢复为天然碱基，进入下一个测序循环。
切除保护基团的原理如下所示（其中Base代表碱基，是腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤中的任何一种。Fluorophore代表任何一种荧光分子）： 
（1）叠氮基团与三价的磷发生还原反应，形成活性中间体；
（2）活性中间体自身反应，形成四元环状的产物；
（3）四元环状的产物不稳定，脱掉一个氮气分子，形成新的中间体；
（4）新的中间体和水分子发生水解反应，被还原成为氨基；
（5）氨基上的孤对电子进攻附近的羰基碳，之后形成环状的中间体；
（6）环状的中间体不稳定，断裂形成氨基，从而恢复为天然碱基。而含有荧光分子的部分与碱基脱离，可以被清洗除去。而恢复的天然碱基是存在于连接在玻璃表面的DNA分子上，不被清洗，可以进行下一个测序循环。
以上6个步骤对应以下6个箭头表示的化学反应。 
Figure 747167DEST_PATH_IMAGE006
。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：该方法简化了合成步骤，且成像装置较为简单，成本低；而且采用的荧光标记核酸荧光分子只有3种，每个测序周期都不会在DNA链上留下多余的残留分子，不会影响DNA聚合酶与待测的DNA链的结合，可以大幅度地提高测序准确率和读长。 
附图说明
图1是显微镜成像系统的示意图；其中1是样品台，2是CCD电荷耦合器件Charge Coupled Device，3是TIRF； 
图2是加入单个碱基后，引物链的分子量； 
图3是实施例2实施例2中一轮测序所得的颜色图谱，为100×150个点的测序大图；
图4是图3的局部放大图； 
图5是实例2中由收集荧光信号而确定的待测样品DNA的序列。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供的一种基因测序的方法，主要是利用三种不同波长的激光激发三种荧光标记的核苷酸分子，所述的核苷酸分子为A、C、G和T四种核苷酸分子中的任意三种，剩余一种核苷酸分子无荧光核酸标记，该方法以无荧光激发为标志重新定义了测序仪，是一种采用三色荧光边合成边测序的方法。
具体的，本实施例提供的一种基因测序的方法，包含以下步骤： 
（1）合成一套基因测序用核酸分子，包括三种荧光标记核酸分子和一种无荧光标记核酸分子，所述的三种荧光标记核酸分子为A、C、G和T四种核苷酸分子中的任意三种，剩余一种即为无荧光标记的核酸分子；
（2）将待测的单链DNA例如人的基因片段，大概100~500核苷酸长度左右连接到通用的DNA序列上，然后固定在玻璃基底表面； 
（3）将互补的DNA引物与连接有待测DNA的通用的DNA序列（一般是10个左右连续的T胸腺嘧啶组成的序列）配对，并且引物上设有3’-OH官能团； 
（4）利用DNA聚合酶，将上述荧光标记核酸加入到引物的3’-OH上，获得待测样品（采用New England Biolabs公司生产的Therminator II DNA polymerase，获得的待测样品是聚合酶反应之后，带有荧光的引物)； 
（5）使用3种不同波长的激光分别先后照射待测样品，每种激光会激发相应的荧光基团，并且产生相应的荧光，通过显微镜成像系统，信号通过3种不同的滤波片，读出每段DNA上带有的不同荧光信号，其中3种不同波长的激光为波长之间差别在30nm以上的激光；
（6）化学切除保护基团，引物3’-OH上的-N3，以及荧光分子和碱基之间的-N3；
（7）进行下一轮的测序，测得引物的DNA序列，从而测得待测DNA的序列。
步骤（1）中采用的一套基因测序用核酸分子，包括三种荧光标记的核酸分子A，C和G，以及一种无荧光标记的核酸分子T，各核酸分子的结构式如下： 
Figure 545359DEST_PATH_IMAGE007
    (A)
Figure 9839DEST_PATH_IMAGE008
(G)
  
Figure 209876DEST_PATH_IMAGE009
          (C)
        
Figure 734398DEST_PATH_IMAGE010
                        (T)。
其中荧光分子1为rhodamine X或Alexa Fluor 594，荧光分子2为Cy5或Alexa Fluor 647，荧光分子3为BOIDIPY-FL或Alexa Fluor 488。 
其中核酸分子C通过以下合成工艺制得： 
（1）选取起始原料1胞嘧啶，其5’-OH被硅保护，3’-OH被叠氮甲基保护，将原料与条件（i）中的三乙胺TEA、二氯甲烷DCM以及酰氯化合物反应，形成碱基被修饰的产物2；
其中起始原料1胞嘧啶（N4-Benzoyl-5'-O-tert-butyldimethylsilyl-2'-deoxycytidine，从CNH technologies公司购买，http://www.cnhtechnologies.com，产品编号Y-1123，合成路线可参考文献J. Milton, X. Wu, M. Smith, J. Brennan, C. Barnes, X. Liu, S. Ruediger, WOPatent, 2004, 2004018497，；S. G. Zavgorodny, M. Polianski, E. Besidsky, V. Kriukov, A. Sanin, M.Pokrovskaya, G. Gurskaya, H. Lonnberg, A. Azhayev, Tetrahedron Lett., 1991, 32:7593-7596；A. Semenyuk, A. Foldesi, T. Johansson, C. Estmer-Nilsson, P. Blomgren, M Brannvall, L. A. Kirsebom, M. Kwiatkowski, J. Am. Chem. Soc., 2006, 128: 12356-12357.等）
（2）将产物2与条件（ii）中的四正丁基氟化铵TBAF反应，5’-OH的硅保护被去掉，形成碱基被修饰的产物3；
（3）将产物3与条件（iii）中的三氯氧磷POCl3、磷酸三甲酯(MeO)3PO、丁基胺二氢焦磷酸BuNH2H2P2O7、三乙胺碳酸氢盐TEAB和三丁胺Bu3N反应，形成5’-OH的三磷酸产物4；
（4）将产物4与条件（iv）中的哌啶piperidine、二甲基甲酰胺DMF反应，脱掉芴基保护集团，形成含有氨基的产物5；
（5）将产物5与条件（v）中的荧光分子3，在浓度为0.1mol/L、pH为8~9的碳酸氢钠/碳酸钠缓冲溶液中反应，形成含有荧光基团的最终产物6，即为所述的核酸分子C；
具体反应过程如下：
Figure 816624DEST_PATH_IMAGE012
 其中核酸分子A和核酸分子G的合成过程同核酸分子C。无荧光标记的核酸分子T为市售产品，可以从如Sigma Aldrich公司可以购买，www.sigmaaldrich.com，产品编号是T0251-50MG。
3种不同波长的激光的波长为488nm，568nm和643nm；或3种不同波长的激光的波长为512nm，568nm和633nm。 
其中化学切除保护基团的过程如下： 
切除保护基团的原理如下所示（其中Base代表碱基，是腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤中的任何一种。Fluorophore代表任何一种荧光分子）：
（1）叠氮基团与三价的磷发生还原反应，形成活性中间体；
（2）活性中间体自身反应，形成四元环状的产物；
（3）四元环状的产物不稳定，脱掉一个氮气分子，形成新的中间体；
（4）新的中间体和水分子发生水解反应，被还原成为氨基；
（5）氨基上的孤对电子进攻附近的羰基碳，之后形成环状的中间体；
（6）环状的中间体不稳定，断裂形成氨基，从而恢复为天然碱基。而含有荧光分子的部分与碱基脱离，可以被清洗除去。而恢复的天然碱基是存在于连接在玻璃表面的DNA分子上，不被清洗，可以进行下一个测序循环。
以上6个步骤对应以下6个箭头表示的化学反应： 
实施例2
（1）利用上述荧光标记核酸分子测定单核苷酸多态性SNP(Single Nucleotide Polymorphism)，并用质谱鉴定结果：
SNP是基因序列只在一个核苷酸中发生的变异。在很多应用中，比如确定病毒的类型，或者基因缺陷时，需要进行SNP的测定。
本实施例中，选用人类P53基因中编号为Exon8的一段DNA序列进行测单个碱基的测定，该序5’-TGCCTCTTGCTTCTCTTTTCCTATCCTGAGTAGTGGTAATCTACTGGGACGGAACAGCTTGAGGTGCGTGTTTGTGCCTGTCCTGGGAGAGACCGGCGCACAGAGGAAG-3’，该序列一共100多个碱基，与其对应的引物使用17个碱基，分子量为 5144的DNA，序列是 5’- TCTCTGGCCGCGTGTCT-3’，引物的序列与模板序列中的黑体部分互补。 
测序使用3种不同波长的荧光的波长修饰三种核酸A，C和G，如下式（A）、（C）和（G）中所示。 
Figure 375223DEST_PATH_IMAGE013
(A) 
Figure 336226DEST_PATH_IMAGE014
(C) 
Figure 905747DEST_PATH_IMAGE015
(G)
加上没有荧光的核酸T，如下式（T）所示：
Figure 712029DEST_PATH_IMAGE016
（T）
其中，荧光标记核酸分子A中采用的荧光分子1为rhodamine X；荧光标记核酸分子C中采用的荧光分子2为Cy5，荧光标记核酸分子G中采用的荧光分子3为Bodipy-FL-NHS。
测定单核苷酸步骤： 
将3种不同波长的rhodamine X，BOIDIPY-FL和Cy5的荧光分子修饰的三种核酸A、C和G(各120pmol)加上没有荧光的核酸T(1nmol)混合，加入DNA聚合酶Thermonator III(1单位)，加入上述的模板(40pmol)和引物(60pmol)以及MnCl240nmol，混合物用1X Thermopol I 缓冲液(含20 mM Tris-HCl/10 mM (NH4)2SO4/10 mM KCl/ 2 mM MgSO4/0.1 % Triton X-100, pH 8.8, 从New England Biolabs订购)20微升溶解。
混合物在恒温65摄氏度，反应30分钟。 
反应结束后，混合物使用Zip Tip TM 分离出引物，然后用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱（MALDI-TOF-Mass Spectroscopy）进行分子量的测定。 
由于使用的4种碱基分子量各不同，所以通过反应后引物链的分子量变化，可以确定加入的一个碱基是那一个，从而得知模板链上对应位置的碱基序列。 
实验结果如图2中所示：加入单个碱基后，引物链的分子量为5969；对应的碱基是C, 可以确定加入的一个碱基是C，从而得知模板链上对应位置的碱基是G。 
（2）在玻璃表面固定DNA阵列进行测序： 
利用3种不同波长的荧光的波长修饰三种碱基C，A和G，3种不同波长的荧光的激发波长为488nm，594nm和633nm；测序结果图由红、绿和紫色三种点，分别代表C，A和G，加上黑色表示没有荧光的碱基，代表T。
如图3和4中所示，为一轮测序所得的颜色图谱，由图3和4中可见玻璃表面的DNA阵列由于加上了荧光分子，得到不同的信号，从而可以得到阵列中各个点的碱基序列，其中图3是大约100X150个点的测序图，图4是图3的局部放大的图。 
（3）在玻璃表面固定DNA进行多读长的测序： 
利用3种不同波长的荧光的波长修饰三种碱基C，A和G，3种不同波长的荧光的波长为488nm，594nm和633nm，测序结果如图3和4中所示，由红、绿和紫色三种点，分别代表C，A和G，加上黑色表示没有荧光的碱基，代表T。
切除化学切除保护基团，包括引物3’-OH上的-N3，以及荧光分子和碱基之间的-N3，切除方式同实施例1，然后进行下一轮测序，结果如图5所示，对玻片12轮测序所得的颜色图谱，每个测序周期中，用三种激光依次照射玻璃表面，表面固定的DNA如果被DNA聚合酶加上了荧光分子，就得到相应的信号，CCD测定的荧光强度比较高，从信号最强的荧光可以推断加入的荧光碱基；如果没有荧光，CCD测定的荧光强度非常低，则表示加入的是没有荧光的碱基，代表T。 
12轮测序所得的碱基连接起来，就是引物的序列GGCATGCATGAC。与其互补的序列就是模板链，即样品DNA的序列CCGTACGTACTG，该结果与实际符合。 
表1是12轮测序结果 
表1中每行数值是每种荧光标记的碱基的信号发光强度，数值在几千左右的代表有信号，而数值在几百左右的代表没有信号，从数值大小可以确定每轮测定的碱基。
从本实施例中可以看出，采用三色荧光测序方法与预期相符，可以给出准确的DNA序列。 
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。 

Claims (7)

1.一种基因测序的方法，其特征是：利用三种不同波长的激光激发三种荧光标记的核苷酸分子，所述的核苷酸分子为A、C、G和T四种核苷酸分子中的任意三种，剩余一种核苷酸分子无荧光核酸标记，以该方法为基础重新定义了基因测序仪，是一种采用三色荧光边合成边测序的方法。
2.根据权利要求1中的基因测序方法，其特征是包含以下步骤：
（1）合成一套基因测序用核酸分子，包括三种荧光标记核酸分子和一种无荧光标记核酸分子，所述的三种荧光标记核酸分子为A、C、G和T四种核苷酸分子中的任意三种，剩余一种即为无荧光标记的核酸分子；
（2）将待测的单链DNA连接到通用的DNA序列上，然后固定在玻璃基底表面； 
（3）将互补的DNA引物与连接有待测DNA的通用的DNA序列配对，并且引物上设有3’-OH官能团； 
（4）利用DNA聚合酶，将上述荧光标记核酸加入到引物的3’-OH上，获得待测样品； 
（5）使用3种不同波长的激光分别先后照射待测样品，每种激光会激发相应的荧光基团，并且产生相应的荧光，通过显微镜成像系统，信号通过3种不同的滤波片，读出每段DNA上带有的不同荧光信号，其中3种不同波长的激光为波长之间差别在30nm以上的激光；
（6）化学切除保护基团，包括引物3’-OH上的-N3，以及荧光分子和碱基之间的-N3；
（7）进行下一轮的测序，测得引物的DNA序列，从而测得待测DNA的序列。
3.根据权利要求2所述的基因测序方法，其特征是：步骤（1）中采用的一套基因测序用核酸分子，包括三种荧光标记的核酸分子A，G和C，以及一种无荧光标记的核酸分子T，各核酸分子的结构式如下：
Figure 193508DEST_PATH_IMAGE001
    (A)
Figure 796396DEST_PATH_IMAGE002
(G)
  
Figure 391326DEST_PATH_IMAGE003
          (C)
        
Figure 855805DEST_PATH_IMAGE004
                        (T)。
4.根据权利要求3所述的基因测序方法，其特征是：所述的荧光分子1为rhodamine X或Alexa Fluor 594，所述的荧光分子2为Cy5或Alexa Fluor 647，所述的荧光分子3为BOIDIPY-FL或Alexa Fluor 488。
5.根据权利要求3所述的基因测序方法，其特征是：所述的荧光标记核酸分子C通过以下合成工艺制得： 
Figure 337733DEST_PATH_IMAGE005
在上述合成工艺中，各步骤代表的反应过程如下：
（1）选取起始原料1胞嘧啶，其5’-OH被硅保护，3’-OH被叠氮甲基保护，将原料与条件（i）中的三乙胺TEA、二氯甲烷DCM以及酰氯化合物反应，形成碱基被修饰的产物2；
（2）将产物2与条件（ii）中的四正丁基氟化铵TBAF反应，5’-OH的硅保护被去掉，形成碱基被修饰的产物3；
（3）将产物3与条件（iii）中的三氯氧磷POCl3、磷酸三甲酯(MeO)3PO、丁基胺二氢焦磷酸BuNH2H2P2O7、三乙胺碳酸氢盐TEAB和三丁胺Bu3N反应，形成5’-OH的三磷酸产物4；
（4）将产物4与条件（iv）中的哌啶piperidine、二甲基甲酰胺DMF反应，脱掉芴基保护集团，形成含有氨基的产物5；
（5）将产物5与条件（v）中的荧光分子3，在浓度为0.1mol/L、pH为8~9的碳酸氢钠/碳酸钠缓冲溶液中反应，形成含有荧光基团的最终产物6，即为所述的核酸分子C；
所述的核酸分子A和核酸分子G的合成过程同核酸分子C。
6.根据权利要求1或2所述的基因测序方法，其特征是：所述3种不同波长的激光，激光波长为任意三种可见光波段的、与荧光分子对应的、彼此相差30纳米以上的激光组合。
7.根据权利要求6所述的基因测序方法，其特征是：所述3种不同波长的激光，所述激光的波长为488nm，568nm和643nm；或512nm，568nm和633nm。
CN201410069473.7A 2014-02-28 2014-02-28 一种基因测序的方法 Active CN103866010B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410069473.7A CN103866010B (zh) 2014-02-28 2014-02-28 一种基因测序的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410069473.7A CN103866010B (zh) 2014-02-28 2014-02-28 一种基因测序的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103866010A true CN103866010A (zh) 2014-06-18
CN103866010B CN103866010B (zh) 2016-04-20

Family

ID=50905013

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410069473.7A Active CN103866010B (zh) 2014-02-28 2014-02-28 一种基因测序的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103866010B (zh)

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105219865A (zh) * 2015-10-22 2016-01-06 东南大学 一种基于三色荧光标记的核酸测序方法
US10190162B2 (en) 2014-10-23 2019-01-29 Complete Genomics, Inc. Signal confinement sequencing (SCS) and nucleotide analogues for signal confinement sequencing
CN109328192A (zh) * 2016-05-20 2019-02-12 宽腾矽公司 经标记的核苷酸组合物及用于核酸测序的方法
CN110760574A (zh) * 2019-10-14 2020-02-07 芯盟科技有限公司 测定碱基的装置及方法
CN111094592A (zh) * 2018-03-09 2020-05-01 伊鲁米纳剑桥有限公司 广义随机超分辨率测序
CN112646703A (zh) * 2020-12-29 2021-04-13 中国科学院长春光学精密机械与物理研究所 一种单分子荧光基因测序光学系统
CN112969802A (zh) * 2019-03-01 2021-06-15 伊鲁米那股份有限公司 分析物的多重荧光检测
CN113341058A (zh) * 2021-06-09 2021-09-03 南京溯远基因科技有限公司 一种三色高通量测序试剂及测序方法
US11230734B2 (en) 2014-08-08 2022-01-25 Illumina Cambridge Limited Modified nucleotide linkers
CN114286867A (zh) * 2019-08-20 2022-04-05 深圳华大智造极创科技有限公司 一种基于发光标记物光信号动力学及二次发光信号对多核苷酸进行测序的方法
US11613772B2 (en) 2019-01-23 2023-03-28 Quantum-Si Incorporated High intensity labeled reactant compositions and methods for sequencing
US11655504B2 (en) 2017-07-24 2023-05-23 Quantum-Si Incorporated High intensity labeled reactant compositions and methods for sequencing

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1940088A (zh) * 2006-10-10 2007-04-04 东南大学 基于引物延伸的dna测序方法
CN101153338A (zh) * 2007-09-14 2008-04-02 东南大学 基于碱基修饰保护往复延伸的dna测序方法
CN103602719A (zh) * 2013-04-07 2014-02-26 北京迈基诺基因科技有限责任公司 一种基因测序方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1940088A (zh) * 2006-10-10 2007-04-04 东南大学 基于引物延伸的dna测序方法
CN101153338A (zh) * 2007-09-14 2008-04-02 东南大学 基于碱基修饰保护往复延伸的dna测序方法
CN103602719A (zh) * 2013-04-07 2014-02-26 北京迈基诺基因科技有限责任公司 一种基因测序方法

Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11773438B2 (en) 2014-08-08 2023-10-03 Illumina Cambridge Limited Modified nucleotide linkers
US11230734B2 (en) 2014-08-08 2022-01-25 Illumina Cambridge Limited Modified nucleotide linkers
US10190162B2 (en) 2014-10-23 2019-01-29 Complete Genomics, Inc. Signal confinement sequencing (SCS) and nucleotide analogues for signal confinement sequencing
CN105219865B (zh) * 2015-10-22 2018-08-21 东南大学 一种基于三色荧光标记的核酸测序方法
CN105219865A (zh) * 2015-10-22 2016-01-06 东南大学 一种基于三色荧光标记的核酸测序方法
CN109328192A (zh) * 2016-05-20 2019-02-12 宽腾矽公司 经标记的核苷酸组合物及用于核酸测序的方法
US11655504B2 (en) 2017-07-24 2023-05-23 Quantum-Si Incorporated High intensity labeled reactant compositions and methods for sequencing
CN111094592A (zh) * 2018-03-09 2020-05-01 伊鲁米纳剑桥有限公司 广义随机超分辨率测序
US11613772B2 (en) 2019-01-23 2023-03-28 Quantum-Si Incorporated High intensity labeled reactant compositions and methods for sequencing
CN112969802A (zh) * 2019-03-01 2021-06-15 伊鲁米那股份有限公司 分析物的多重荧光检测
CN114286867B (zh) * 2019-08-20 2024-04-16 青岛华大智造科技有限责任公司 一种基于发光标记物光信号动力学及二次发光信号对多核苷酸进行测序的方法
CN114286867A (zh) * 2019-08-20 2022-04-05 深圳华大智造极创科技有限公司 一种基于发光标记物光信号动力学及二次发光信号对多核苷酸进行测序的方法
CN110760574A (zh) * 2019-10-14 2020-02-07 芯盟科技有限公司 测定碱基的装置及方法
CN110760574B (zh) * 2019-10-14 2023-06-06 芯盟科技有限公司 测定碱基的装置及方法
CN112646703B (zh) * 2020-12-29 2023-01-24 中国科学院长春光学精密机械与物理研究所 一种单分子荧光基因测序光学系统
CN112646703A (zh) * 2020-12-29 2021-04-13 中国科学院长春光学精密机械与物理研究所 一种单分子荧光基因测序光学系统
CN113341058A (zh) * 2021-06-09 2021-09-03 南京溯远基因科技有限公司 一种三色高通量测序试剂及测序方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN103866010B (zh) 2016-04-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103866010B (zh) 一种基因测序的方法
EP2321429B1 (en) Methods and kits for nucleic acid sequencing
ES2770055T3 (es) Secuenciación sin enzima ni amplificación
US5804386A (en) Sets of labeled energy transfer fluorescent primers and their use in multi component analysis
CN105358709B (zh) 用于检测基因组拷贝数变化的系统和方法
JP6514364B2 (ja) 長ストークスシフトを有するポリメチン化合物と、蛍光標識としてのその使用
CA2902982C (en) Polymethine compounds and their use as fluorescent labels
CN100462433C (zh) 实时序列测定
US11274341B2 (en) Assay methods using DNA binding proteins
WO2017176677A1 (en) Flourescence energy transfer-based single molecule/ensemble dna sequencing by synthesis
EP2956550B1 (en) Enhanced probe binding
TWI622580B (zh) 多次甲基化合物及其作爲螢光標記之用途
CN111094315A (zh) 用于测序应用中的核苷酸的短悬垂臂连接基
ES2713653T3 (es) Análogos nucleotídicos para secuenciación
CN103602719A (zh) 一种基因测序方法
CN106471131A (zh) 荧光性标记单链核酸及其用途
Tong et al. Combinatorial fluorescence energy transfer tags: New molecular tools for genomics applications
CN115803457A (zh) 用于核酸测序的方法、系统和组合物
CN115323045A (zh) 一种基因测序试剂及基因测序方法
Ju Fluorescence Energy Transfer Reagents for DNA Sequencing and Analysis: High-throughput fluorescent DNA sequencing
Xie et al. Energy Transfer Fluorescent Labels for DNA Sequencing and Analysis

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20170330

Address after: 102629 Daxing District Zhongguancun science and Technology Park Daxing biomedical industry base, Yong Road, No. 6,, 38 105-6

Patentee after: BOKE BIOMEDICAL TECHNOLOGY (BEIJING) CO.,LTD.

Address before: 510080 Guangdong city of Guangzhou province Yuexiu District Pui Ching Street No. 25 Room 501

Patentee before: Guo Cheng

TR01 Transfer of patent right
CP03 Change of name, title or address

Address after: 214105 floor 5, block D, Xidong chuangrong building, No. 78, Danshan Road, anzhen street, Xishan District, Wuxi City, Jiangsu Province

Patentee after: Boke biomedical technology (Wuxi) Co.,Ltd.

Address before: Room 105-6, Building 6, No. 38 Yongda Road, Daxing Biomedical Industry Base, Zhongguancun Science and Technology Park, Daxing District, Beijing 102629

Patentee before: BOKE BIOMEDICAL TECHNOLOGY (BEIJING) CO.,LTD.

CP03 Change of name, title or address