JP3066984B2 - 汎用スペーサー／エネルギー遷移染料 - Google Patents

汎用スペーサー／エネルギー遷移染料

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JP3066984B2
JP3066984B2 JP9512692A JP51269297A JP3066984B2 JP 3066984 B2 JP3066984 B2 JP 3066984B2 JP 9512692 A JP9512692 A JP 9512692A JP 51269297 A JP51269297 A JP 51269297A JP 3066984 B2 JP3066984 B2 JP 3066984B2
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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明の技術分野は、蛍光標識である。
背景 混合成分を同定し、かつ、定量することができること
についての要求が増している。混合物が複雑になればな
る程、多数の存在する成分を同時に検出することができ
ることの重要性が増す。この状況の例として、DNA配列
決定があり、ここでは、多数の別個の波長における蛍光
シグナル発光を提供しながら、単一波長におけるレーザ
ー源を用いて１〜４の蛍光タグ付成分を効率的に励起さ
せることが望ましい。この状況において、異なる標識
は、それらが付着されるところの配列の電気泳動易動性
に悪影響を及ぼすべきではない。
最近、自動DNA配列決定のために使用される４つの方
法がある：（１）DNA断片を１の蛍光団（fluorophore）
で標識し、そして次にそれら断片を隣接配列決定レーン
内で走らせる（Ansorge et al.,Nacleic Acids Res.15:
4993−4602（1987））；（２）DNA断片を４つの異なる
蛍光団で標識し、そしてそれらの断片のすべてを電気泳
動により分離し、そして単一のレーン内で検出する（Sm
ith et al.,Nature 321:674−679（1986））；（３）終
結反応におけるジデオキシヌクレオチドの各々を異なる
蛍光団で標識し、そして４セットの断片を同一のレーン
内で走らせる（Prober et al.,Science 238:336−341
（1986））；又は（４）DNA断片のセットを２つの異な
る蛍光団で及びその染料比でコードされたDNA配列で標
識する（Huang et al.,Anal.Chem.64:2149−2154（199
2））。
これらの技術のすべてが、重大な欠点をもつ。方法１
は、易動性におけるレーン間の変動の潜在的問題並びに
低処理量の問題をもつ。方法2,3と４は、それらの染料
が、１のレーザー源によりよく励起されること、そして
それらが明確異なる発光スペクトルをもつことを要求す
る。実際、単一のレーザーで効率的に励起されることが
でき、そしてよく分離された蛍光シグナルを発光する２
以上の染色を見つけることはひじょうに難しい。明確に
赤にシフトした発光スペクトルをもつ染料を選んだと
き、それらの最大吸収も、赤に移動するであろうし、そ
して染色のすべてが、もはや同一のレーザー源により効
率的に励起されることはできない。また、より相違する
染料が選ばれるとき、それらが標識された分子の同の易
動性を引き起こすように全ての染料を選ぶことがより困
難になる。
それ故、多数の成分が同一システム及び単一ラン内で
測定されることができるように、サンプルの多重送信
（multiplexing）を許容する改良された方法を提供する
ことに実質的な興味がある。各標識が、共通波長におい
て強い吸収をもつこと、蛍光について高い量子収率（qu
antum yield）をもつこと、その励起の大きなStokesシ
フトをもつこと、各発光が明確に区別されること、そし
て標識が同一の移動シフトを導くことも望ましい。単一
染料で上記分子を単に標識付けすることにより上記相反
する目標を達成することは難しい。
関連文献 Ju et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:4347−4351
（1995）及びJu et al.,Anal.Biochem.,in Press（199
5）は、DNA配列決定のための蛍光エネルギー遷移（ener
gy−transfer（ET））プライマーについて記載してい
る。PCR産物標識付け及び検出のためのETプライマーの
使用について記載するWang et al.,Anal.Chem.67:1197
−1203（1995）も重要である。
本発明の要約 蛍光標識化合物（Fluorescent label compositions）
であって、エネルギー・アブソーバー／ドナー成分と、
プリン塩基とピリミジン塩基を含まないリン酸糖を含む
スペーサーに結合されたエネルギー・アクセプター／フ
ルオレッサー成分を含んで成るものが提供され、ETカセ
ットが形成される。同一のアブソーバー／ドナー及び異
なるエネルギー・アクセプター／フルオレッサー成分を
もつ、多数の蛍光染料化合物を提供することにより、い
ずれかの配列により標識分子を標識することができ、そ
して同一波長において励起されることができる蛍光染料
化合物（ETカセット）のファミリーは、異なる核酸と会
合したとき、広く離れた波長において発光し、そして電
気泳動における易動性に対し同一の効果を提供する。ま
た、本化合物は、慣用のポリヌクレオチド合成化学を使
用して容易に合成されることができる。
図面の簡単な説明 図１は、４つのエネルギー遷位（ET）プライマーの蛍
光発光強度の比較を示す。
図２は、ETプライマーFS6F,FS6J,FS6T,FS6R及びSeque
nase 2.0を使用したM13mp18 DNA配列決定プロフィール
の４色分析データの一部（ヌクレオチド10〜230）を示
す。プライマー濃度:0.4pモル;DNA鋳型:1.6μｇ（各塩
基伸長について0.4μｇ）。CE配列決定プロトコール
は、記載されたものに似たものであった（Ju et al.,An
al.Biochem.,in Press（1995））。
特定の態様の説明 新規蛍光化合物、その化合物を含むキット、及び使用
方法を提供する。本化合物は、糖、例えば、リン酸リボ
シル・リンクであってその１′−位のヒドロキシルが水
素で置換されているか又はエーテル化されているものを
含むスペーサーにより互いに連結された、エネルギー・
アブソーバー／ドナー成分とエネルギー・アクセプター
／フルオレッサー成分を含む。この蛍光化合物は、特に
核酸との会合において、標識として有用である。共通の
エネルギー・アブソーバー／ドナー成分と共通のスペー
サーを共有するが、そのエネルギー・アクセプター／フ
ルオレッサー成分に関しては変動する多数の成分を使用
することにより、同一波長において励起されることがで
き、かつ、広く離れた発光波長を提供することができる
蛍光標識のファミリーを提供することができる。これら
の化合物ファミリーは、特に核酸配列決定により例示さ
れる電気泳動により分離される予定の核酸を標識付けす
るために特に利用される。
本標識は、少なくとも３つのリン酸糖（sugar−phosp
hate）単位をもつスペーサーに結合されたエネルギー・
アブソーバー／ドナー成分並びに少なくとも３つのリン
酸糖単位によりそのドナー成分から分離されたスペーサ
ーに結合されたエネルギー・アクセプター／フルオレッ
サー成分をもつことを特徴とするであろう。上記スペー
サーは、上記ドナーとアクセプターが付着されて、いず
れかの標的分子にタグを付けるために使用されることが
できるETカセットを形成する。標識の１端は、特にヌク
レオシド又はヌクレオチドのホスフェート又はヒドロキ
シルと反応するための官能基、通常、反応に利用される
ことができる唯一の官能基をもつであろう。一般に、リ
ン酸糖分子の数は、15以下、通常12以下、好ましくは約
９以下、そして少なくとも３、好ましくは少なくとも約
４、より普通には約５〜８の範囲内にあるであろう。５
〜６炭素原子をもつ様々な糖が使用されることができる
けれども、便利には、使用される糖はリボースである。
この糖の２つのヒドロキシル基は、そのリン酸エステル
結合に関係するであろうし、一方、１′−位のヒドロキ
シル基を除く、残りのヒドロキシル基は、化学的に不活
性であるように、又は水素で置換されるように、１〜３
炭素原子のアルキルにより、置換され、特にエーテル化
されるであろう。この１′−位は、エネルギー遷位成分
に結合するための部位として役立つことができ、又は上
記のように非反応であるように修飾されるであろう。上
記スペーサー内で使用される糖として特に重要なのは、
その３′と５′位がその鎖におけるリン酸エステル部位
として働くであろう１′,2′−ジデオキシ・リボースで
あろう。所望により、その末端５′位は、エネルギー遷
位成分の中の１に結合するための部位として使用される
ことができる。
エネルギー遷位（“ET"）成分は、効率的なエネルギ
ー遷位を許容するスペーサーのいずれかの部位に存在す
ることができる。それ故、このエネルギー遷位成分は、
一般に、約３〜９、より普通には約４〜８のリン酸ホス
フェート部分程離れて配置されるであろう。この特定の
配置は、同様の配置が、組合せにおいて使用されること
が予定されている各化合物について使用される限り、本
発明にとって臨界的ではない。便利には、５′末端ヒド
ロキシル基は、エネルギー遷位成分の中の１、特にドナ
ー・エネルギー遷位成分のための部位であることができ
る。また、他の成分も、便利には、１′位において、直
接的にか又は、約20以下の、より普通には約12以下の
（環介在基が存在する場合には、その環の周りにより少
ない数の原子がカウントされる）連結基を通じて、置換
されるであろう。
上記連結基は、広く変動することができ、そして本発
明には臨界的ではない。これら連結基は、脂肪族、非環
式、芳香族又は複素環式、又はそれらの組合せであるこ
とができる。上記連結基内に存在することができる官能
基又は複素原子は、酸素、硫黄その他を含み、ここで存
在することができるその複素原子官能基は、オキシ、オ
キソ、チオ、チオノ、アミノ、アミドその他である。エ
ネルギー遷移及び電気泳動を妨害しないさまざまな連結
基のいずれも使用されることができ、これらは、置換が
環員、例えば炭素、又は側鎖上、例えばチミジン内のメ
チルであるであろう、プリン又はピリミジン、特にウリ
ジン、チミジン、シトシンを含むことができる。ET成分
は、１〜６、より普通には１〜３の原子、特に炭素原子
の連結基を通じて又は直接に上記塩基を結合されること
ができる。この連結基は、飽和又は、通常約１以下の脂
肪不飽和の部位をもって不飽和であることができる。
その１′−位へ連結されたET成分については、そのET
成分を連結するための部位としてヌクレオチドの塩基、
その糖の１′−ヒドロキシルを有利に使用することがで
き、又はその１′−位に官能基、例えば、網野、カルボ
キシその他を導入することができる。その１′−位の官
能基は、特に２〜８、通常２〜６炭素原子の置換アルキ
レン基を用いて延長されることができ、ここで、その最
終的な官能性は、そのET成分上に存在する利用可能な官
能性に依存するであろう。通常、ET成分に連結するため
の官能性は、カルボキシル又はアミノであろう。
含まれることができる連結基は、アミノ（例えば、還
元的アミノ化による）、アミド、エーテル、オキシ又は
チオ、エステルその他を含む。ET成分を含む蛍光標識
は、いずれかの慣用の連結基、通常リン酸エステル結合
によりその核酸分子に結合されることができる。本蛍光
標識分子は、通常、その核酸分子の５′末端にあるであ
ろうが、特定の状況においては、所望により異なる部位
にあることができる。配列決定における使用のために、
本化合物は、通常、その配列の５′末端にあるであろ
う。
着目の化合物は、一般に、以下の式： 方式中： Ｄは、ドナー成分であり； Ａは、アクセプター成分であり； Ｓは、スペーサー・モノマーであり； Ｓ′は、修飾されたスペーサー・モノマーであり、こ
こで、その修飾は、Ａへの連結についてその１′−位に
あり； Ｘは、標識付けされるべき標的分子であり、これはポ
リヌクレオチド、ポリペプチドその他であることがで
き、そしてＸは、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシ
ル、又はモノー又は一般に１〜30、より普通には１〜20
ヌクレオチドをもつポリヌクレオチド、特にデオキシリ
ボヌクレオチドとの反応のための活性化されたリン酸基
を含み：そして ｎは、２〜14、より普通には４〜７の範囲にある。
をもつであろう。
上記エネルギー・ドナーは、一般に、約300〜800nmの
範囲内で、より普通には、約450〜700nmの範囲内で吸収
する成分であり、そしてドナーの吸収波長よりも、15n
m、より普通には20nm以上高い波長の光を一般に吸収す
るフルオレッサーにエネルギーを遷移させることができ
る。これらのフルオレッサーは、一般に、約400〜90nm
の範囲内で発光するであろう。多種多様なエネルギー・
アブリーバー、例えば、フルオレセイン、BODLPY,DAPI,
Indo1−１、クマリン、ダンシル、シアニン染料その他
を使用することができる。エネルギー・アクセプター／
フルオレッサーは、約450nm以上において蛍光を発する
先に示した化合物のいくつか、並びにローダミン、フラ
ー２、及び別種のシアニン染料の如き化合物を含むこと
ができる。一般に、上記ET成分は、電気泳動の条件下、
非インターカレーティングで、安定であるであろうし、
そして高い消光係数及び高い蛍光効率をもつ。
上記エネルギー・ドナーは、所望の消光波長、望まし
くは、約104を超える、好ましくは約105cm-1M-1を超え
る強いモル吸光係数をもつであろう。上記ドナーの最大
励起及び上記アクセプターの最大発光は、少なくとも約
15nm以上程離れているであろう。上記ドナーの発光スペ
クトルも上記アクセプター発色団の吸収スペクトルの間
の、スペクトル重複総体（spectral overlap integra
l）並びに上記発色団の間の距離は、ドナーからアクセ
プターへのエネルギー遷移の効率が典型的には約20〜10
0％の範囲にあるであろうようなものであろう。一般
に、上記ドナー・アクセプター染料は、約2kD未満、一
般、約1.5kD未満の分子量をもつであろう。
一般に、１対のET成分が使用されるであるけれども、
３つまでの異なる発色団がセットで使用されるであろう
状況が存在することができ、通常、２を超えない異なる
発色団により相違することができる。すなわち、通常、
上記エネルギー・ドナーは、同一及び最終フルオレッサ
ーであり、そして１の他の中間体発色団は、相違するで
あろう。より多くのET成分を使用することにより、可視
波長範囲内で励起させ、そして赤外波長範囲、通常、約
1,000nm未満、より普通には約900nm未満での発光をもつ
ことができるように、そのStokesシフトをかなり延長さ
せることができる。この赤外波長範囲内の光を検出する
ことは、多くの利点をもつ、なぜなら、その励起光から
生じるRaman及びRayleigh光からの干渉を受けないであ
ろうし、そして生物学的サンプルからのバックグラウン
ド発光シグナルは、上記赤内でより低いからである。易
動定数を維持するために、各標識に対し２〜３の同一ET
成分をもって、各標識に対し同数のET成分を使用するこ
とができる。
本標識がプライマーとして使用される場合、それら
は、約８〜30の、より普通には約８〜20ヌクレオチドの
ヌクレオチド配列をもつことができ、ここで、この配列
は、上記プライミング部位又は、様々な商業的に入手可
能なベクター内のプライミング部位に相補的である。こ
れらのベクターは、一本鎖糸状バクテリオファージ・ベ
クター、バクテリオファージ・ラムダ・ベクター、シャ
ロン（charon）ベクター、pUCベクター、pGEMベクター
その他を含むことができる。従って、本標識は、そのベ
クターの共通配列からそのクローン化された配列内まで
延長されるであろう。例えば、汎用プライマーが調製さ
れることができ、このプライマーは、そのプライマーへ
の上記標識の結合により修飾されている汎用プライマー
の中のいずれか１であることができる。従って、様々な
商業的プライマー、例えば、pUC/M13,λgt10,λgt11そ
の他からのプライマーである。Sambrook et al.,Moleca
lar cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.,CSHL,1989,
Section 13を参照のこと。
本発明は、核酸鎖と共に特に利用され、ここで、これ
らの核酸鎖は、配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応、特に
サイジング、又はプライマーが核酸伸長のために使用さ
れ、そして特定の標識に関して混合物の各種成分の間を
識別しようとするような他のシステム内での、プライマ
ーとして利用される。例えば、配列決定においては、汎
用プライマーが使用されることができ、ここでは、ET成
分の異なる対が、その配列決定反応の間その伸長のため
に使用される異なるジデオキシヌクレオチドの各々につ
いて使用される。DNA配列は、決定されるべき配列に結
合されたプライマー配列をもつ適切なベクター内でクロ
ーン化される。異なる２′,3′−ddNTPsが、その鎖伸長
において存在する特定のddNTPに依存して、異なる部位
において終結が生じるように、使用される。本プライマ
ーを使用することにより、各ddNTPは、特定の標識と会
合されるであろう。クレノウ断片による伸長後、得られ
た断片を、次に、電気泳動による単一レーン内で、又は
電気泳動による単一キャピラリー内で分離されることが
でき、ここで、この標識の蛍光によりその末端ヌクレオ
チドを検出することができる。
本化合物は、ヌクレオチドへの連結のために活性なホ
スフェートをもつことができる。各活性ホスフェート
は、ホスホアミジットを含み、ここで、その酸素は、１
〜３炭素原子をもつアルキル基、特に２〜３炭素原子を
もつシクロアルキル、等により置換される。このアミノ
基は、一般に、ジアルキル化されるであろうし、ここ
で、そのアルキル基は、１〜４の、より普通には、２〜
３炭素原子であろう。あるいは、ホスフィット・エステ
ルが使用されることができ、ここで、利用可能な酸素原
子は、１〜３炭素原子をもつアリール基により置換され
るであろう。
本化合物は、慣用の技術に従って容易に合成されるこ
とができ、ここで、この合成は、ヌクレオチドのための
慣用の合成手順に従う。従って、DNAが合成されるのと
同じやり方で１′−Y3′−活性化、５′−保護２′−デ
オキシリボースを容易に合成することができ、ここでＹ
は、水素、官能基、又は直接に又は連結基を介して結合
されたET成分である。
通常少なくとも２つの標識の組合せをもつキットが提
供される。各標識は、通常同一の骨格をもつ、ドナー・
アクセプター対をもつであろうし、ここでそれら標識
は、その骨格に沿って分離され、そして使用される分離
方法において妥当な易動性を与えるであろう。一緒に使
用される群内の標識のそれぞれが、ほぼ同一の波長にお
いて吸収し、そして異なる波長において発光するであろ
う。その群内の標識のそれぞれは、上記分離方法におけ
る易動性に対してほぼ同一の効果をもつであろう。
これらのキットは、対合している約６までの、通常約
４までの異なる標識をもつであろうが、２〜６の異なる
標識をもつ、マッチング標識の２以上のセットをもつこ
とができる。
以下の実施例を、限定のためではなく説明のために提
供する。
実施例 汎用スペーサーをもつ、エネルギー遷移蛍光染料タグ付
けオリゴヌクレオチド標識のデザイン及び合成 以下の配列： をもつ18−ヌクレオチドを含むM13（−21）汎用プライ
マーであって、DNA合成装置上で以下の５′−ジメトキ
シトリチル−１′,2′−ジデオキシリボース−３′−
〔（２−シアノエチル）−（N,N−ジイソプロピル）〕
−ホスホルアミジット（dSpacer CE Phosphoramidite,G
len Research）（構造式１）： を使用して導入された、６つの１′,2′−デオキシリボ
ース・ホスフェート（Ｓ）により分離されたドナー−ア
クセプター蛍光団対をもつものを、合成した。
上記18マーは、以下の５′−ジメトキシトリチル−５
−〔Ｎ−（トリフルオロアセチルアミノヘキシル）−３
−アクリルイミド〕−２′−デオキシウリジン,3′−
〔（２−シアノエチル）−（N,N−ジイソプロピル）〕
−ホスホルアミジット（Amino−Modifier c6 dT,Glen R
esearch）（構造式２）： であって、そのＣ−５位に保護された第１アミン・リン
カー・アームをもつものを使用することにより導入され
た修飾塩基Ｔ＊を含む。このＴ＊は、上記スペーサー前
のヌクレオチド配列の５′末端に付着された。ドナー染
料は、上記オリゴマーの５′側上の上記スペーサーの末
端に付着され、そしてアクセプター染料は、Ｔ＊上の第
１アミン基に付着された。これらのプライマーを、Ｄ−
S6−Ａ（ETカセット）と表す。ここで、Ｄはドナーであ
り、Ａはアクセプターであり、そしてS6はＤとＡの間の
スペーシング糖の数を示す。調製された全プライマーに
おいて、Ｄ＝FAM（Ｆ）、フルオレセイン透導体;A＝FAM
（Ｆ）,JOE（Ｊ）,TAMRA（Ｔ）又はROX（Ｒ）であり、
最後の２つは、ローダミン誘導体である。我々はまた、
カルボキシローダミン−6Gは、JOEの良好な代替物であ
る（FAM:6−カルボキシフルオレセイン;JOE;2′,7′−
ジメトキシ−４′,5′−ジクロロ−６−カルボキシフル
オレセイン、TAMRA:N,N,N′,N′−テトラメチル−６−
カルボキシローダミン;ROX:6−カルボキシ−Ｘ−ローダ
ミン）ことを発見した。代表例として、FS6Tの構造式を
以下に示す（構造式３）： 本明細書中に記載するエネルギー遷移アプローチの利
点は、（１）単に、上記オリゴヌクレオチド配列の５′
末端にAmino modifier dT又は他のホスホルアミジッ
ト、例えば、以下のAmine−VN Phosphoramidite（CLONT
ECH）（構造式４）： を使用してＴ＊を導入し、そして次に、dSpacerを使用
して６つの１′,2′−ジデオキシリボース・ホスフェー
トを導入することにより、ETカップル染料で、いずれか
の配列を標識付けすることができること（ドナーと蛍光
染料は、この骨格に容易に付着されることができ、ETカ
セットを形成する。）、 （２）より大きなStokesシフトとより強い蛍光シグナ
ルが、488nmで励起されるときに発生することができる
こと、そして（３）FS6（F,J,T,R）プライマーから伸長
するDNA配列決定断片の４−色データ上の易動性シフト
の調整が、配列調査に全く必要とされないこと、であ
る。
ETプライマーの吸収スペクトルと発光スペクトルを図
１に示す。各ETプライマーは、496nmにおけるFAMの特徴
的な吸収並びにFS6J内のJOEに因る525nmにおける、FS6T
内のTAMRAに因る555nmにおける、そしてFS6R内のROXに
因る585nmにおける、強い吸収を示す。これらのETプラ
イマーの蛍光発光スペクトルは、そのアクセプター発光
により支配される。FS6Fの最大発光は525nmにあるけれ
ども、488nm励起によるJS6Jの発光は、555nmにStokes−
シフトされ、FS6Tの発光は、580nmにシフトされ、そし
てFS6Rは、605nmにシフトされる。FS6Rの場合には、こ
のStokesシフトは、100nmを超える。図１は、対応のET
プライマーのモル濃度と同一のモル濃度において計測さ
れた単一染料標識プライマーの発光スペクトルをも提示
する。ETプライマー発光強度の実質的な強化は、対応の
単一染料−標識プライマーに比較して観察され、効率的
なエネルギー遷移が生じていることを示している。図１
から得られた蛍光強度の改良は:FS6F＝1.7×FAM;FS6J＝
３×JOE;FS6T＝10×TAMRA;FS6R＝12×ROX。
ET（FS6F,FS6J,FS6T,FS6R）プライマーによるDNA配列
決定DNA配列決定のための汎用スペーサーを使用したET
染料−標識プライマーの首尾よい適用を具現化した。上
記プライマーは、いずれの異常をも伴わずにDNAポリメ
ラーゼのための良好な基質であることが示された。図２
は、FS6Nプライマー・セットを使用した４−色DNA配列
決定データの一部（10〜230ヌクレオチド）を示す。こ
の反応を各塩基伸長について、当量のプライマー（0.4p
モル）と0.4μｇの鋳型DNAを使用して行った。４−色CE
配列決定プロフィールを、それら４つのチャンネルの間
のクロストーク（crosstalk）について補正するため
に、その生データにマトリックス変換を単に適用した後
に得た。この配列は、いずれの易動性シフト調整を適用
せずにコール（call）されることができる。より複雑な
ピーク・コーリング・ソフトウェアを使用した上記デー
タの分析は、より良好な塩基コーリング及びより長い読
みを導くはずである。
上記の汎用スペーサー（ETカセット）方法により、我
々が、共通ドナー及び2,3,4以上の異なるアクセプター
をもつ、染料−標識バイオポリマー又は他の標的分子の
広いファミリーを合成することができるということは、
明らかである。このアプローチにより、配列決定、PCR
及びハイブリダイゼーションのための全てのオリゴヌク
レオチド・プライマー及びプローブは、ETカップル染料
でタグ付けされることができる。このようなクラスのド
ナー−アクセプター標識分子は、多色遺伝子分析におい
て広く利用される。
本明細書中に述べた刊行物及び特許出願の全てを、あ
たかも個々の刊行物又は特許出願が特別に、かつ、別個
に引用により示されるような程度で、引用により本明細
書中に取り込む。
本発明をこれまで十分に記載してきたが、多くの変更
又は修正が、添付の請求の範囲又は本発明の本質から逸
脱せずに本発明に対して行われることができることは、
当業者にとって自明であろう。
フロントページの続き (72)発明者 グレイザー，アレキサンダー，エヌ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94720，バークレー，スタンリー ホー ル 229，デパートメント オブ モレ キュラー アンド セル バイオロジ ー，ユニバーシティ オブ カリフォル ニア (72)発明者 ユ，ジングュエ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94720，バークレー，ヒルドブランド 329，デパートメント オブ ケミスト リー，ユニバーシティ オブ カリフォ ルニア (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07H 21/00 - 21/04 C12Q 1/68 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】エネルギー・ドナー成分と、該エネルギー
    ・ドナー成分により遷移されるエネルギーを吸収するア
    クセプター成分と、を含む化合物であって、該成分が、
    １−ヒドロキシ基が水素により置換され又はエーテル化
    されている、最大15の糖リン酸エステル・モノマー結合
    を含む骨格により連結されている化合物。
  2. 【請求項２】前記骨格が、３〜15の1,2−ジデオキシリ
    ボシル−3,5−ホスフェート・エステル・モノマー結合
    を含む、請求項１に記載の化合物。
  3. 【請求項３】前記エネルギー・ドナー成分が、その５骨
    格末端で共有結合されており、そして前記アクセプター
    が、1,2−ジデオキシリボシル−3,5−ホスフェート・エ
    ステルの３−末端の１位において連結基を通じて前記骨
    格に共有結合されている、請求項２に記載の化合物。
  4. 【請求項４】前記骨格の３−末端が、ヒドロキシル、保
    護ヒドロキシル、ホスホルアミジット、ホスフィット、
    ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドである、請求項３
    に記載の化合物。
  5. 【請求項５】３〜15の1,2−ジデオキシリボース−3,5−
    ホスフェートモノマー単位をもち、そして1,2−ジデオ
    キシリボース−3,5−ホスフェート・モノマー単位の３
    −末端の１−位において連結基を通じてフルオレセイン
    又はローダミンで置換されている、５−フルオレセイン
    置換ポリ−1,2−ジデオキシリボース−3,5−ホスフェー
    ト化合物。
  6. 【請求項６】前記骨格の３−末端が、ヒドロキシル、保
    護ヒドロキシル、ホスホルアミジット、ホスフィット、
    ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドである、請求項５
    に記載の化合物。
  7. 【請求項７】前記連結基は、カルボキシル又はウリジル
    基である、請求項５に記載の化合物。
  8. 【請求項８】前記泳動分離に蛍光標識を組合せて使用す
    る異なる核酸配列を同定するための方法であって、該蛍
    光標識が異なる波長において蛍光を発し、そして各異な
    る標識が異なる核酸配列に結合され、そして標識として
    請求項１〜７のいずれか一に記載の化合物を使用するこ
    とを特徴とする方法。
  9. 【請求項９】アクセプターが相違し、かつ、同一のエネ
    ルギー・ドナーをもつ、請求項１〜７のいずれか一に記
    載の少なくとも２の化合物を含む、核酸配列の同定のた
    めのキット。
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