DE4119075A1 - Nucleosidtriphosphorsaeureester und deren verwendung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft modifizierte Nucleosidtriphosphor­ säureester, deren Verwendung in enzymatischen Umsetzungen, im besonderen für Enzyme, die Nucleotide in Nukleinsäuren einbauen, deren Verwendung zur Herstellung von Nukleinsäuresonden, deren Verwendung in Nukleinsäure- Sequenzanalysen und deren Verwendung zur Messung der Nukleinsäuresynthese in vitro und in vivo.

Nucleosidtriphosphorsäureester bzw. die Nucleosidtriphosphat- Salze und deren Derivate haben große Bedeutung in vielen Bereichen. Als Enzym-Substrate können sie in Umsetzungen mit geeigneten Enzymen eingesetzt werden. Bei Verwendung in enzymatischen Umsetzungen mit Nukleinsäure-modifizierenden Enzymen wie zum Beispiel DNA-Polymerasen, RNA-Polymerasen oder Terminaler Deoxynucleotidyl Transferase können die entsprechenden Nucleotide und Nucleotid-Derivate in Nukleinsäuren eingebaut werden. Als Nukleinsäuren sind alle Arten von Nukleinäuren zu verstehen, wie Ribonukleinsäuren (RNA), Desoxyribonukleinsäuren (DNA), Oligoribonucleotide sowie Oligodesoxyribonucleotide (die letzten beiden Nukleinsäurearten lassen sich unter dem gemeinsamen Kurzbegriff "Oligonucleotide" zusammenfassen).

Von besonderem Interesse ist die Verwendung von Derivaten von Nucleosidtriphosphorsäureestern in Umsetzungen mit Nukleinsäure­ modifizierenden Enzymen, um spezielle Markierungssubstanzen, mit denen die Nucleosidtriphosphorsäureester modifiziert sind, in eine Nukleinsäure einzubauen. Die resultierende Nukleinsäure kann dann über die Markierung selbst nachgewiesen werden oder als Nukleinsäuresonde in Hybridisierungsreaktionen zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen eingesetzt werden. Die Nukleinsäurehybridisierung zum spezifischen Nachweis von Nukleinsäuresequenzen ist von wesentlicher Bedeutung für die Anwendungen in der biochemischen und biomedizinischen Grundlagenforschung, in der angewandten Medizin und im Bereich der Umweltanalytik. Von großer Nichtigkeit für die Aussagekraft dieser Nachweistechnik ist eine hohe Sensitivität der Markierungsmethode für die Hybridisierungssonden. Die bislang eingesetzte, empfindliche Markierung von Nukleinsäuren mit Radioisotopen versucht man wegen der arbeits- und überwachungsintensiven Handhabung, der Instabilität der Nukleinsäureproben infolge Isotopenzerfalls und den Problemen bei der radioaktiven Abfallbeseitigung zunehmend zu ersetzen.

Bei den alternativ eingesetzten nicht radioaktiven Hybridisierungsverfahren werden die Nukleinsäureproben mit Biotin oder immunchemisch nachweisbaren Haptenen modifiziert. Die US-47 11 955 offenbart zu diesem Zweck Biotin-modifizierte Nucleotide, während in der DE-OS 38 13 278 Digoxigenin­ modifizierte Nucleotide zur Markierung der Nukleinsäuresonden verwendet werden. Nach erfolgter Hybridisierung werden in einem zweiten Reaktionsschritt, d. h. indirekt, die Markierungsstellen mit fluoreszenzmarkiertem Avidin oder Antikörpern nachgewiesen. Anstelle fluoreszenter Antikörper können auch enzymmarkiertes Avidin oder Antikörper verwendet werden, die chromogene, fluorogene oder luminogene Substrate umsetzen.

Neben dem Nachteil, daß aufgrund dieser immunchemischen Nachweisreaktionen der Zeitaufwand für die gesamte Hybridisierungsanalyse vergrößert wird, können zudem bei den indirekten Indikatorreaktionen, besonders bei histologischer oder zytologischer in-situ Hybridisierung, unspezifische Neben­ reaktionen auftreten, die eine empfindliche quantitative Auswertung der Hybridisierung erschweren. Bei Verwendung von fluoreszenten Nachweissystemen kann außerdem eine Empfindlichkeitsminderung durch die, biologischem Material inhärente Autofluoreszenz von Zellen, Geweben oder Nukleinsäure-Trägermaterialien auftreten. Zudem kann die Fluoreszenzmessung durch die einem Fluoreszenzmeßsystem allgemein inhärente Streu- und Interferenzstrahlung gestört werden.

Ein anderes Anwendungsgebiet von Nucleosidtriphosphor­ säureestern liegt in deren Verwendung in der enzymatischen Nukleinsäuresequenzanalyse. Das Verfahren wurde ursprünglich von Sanger et al. beschrieben (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977): 5463-5467) und wird - als Alternative zum sogenannten "chemischen Maxam-Gilbert-Sequenzierungsverfahren" - als "enzymatische Sanger-Didesoxy-Kettenabbruch-Sequenzierungs­ verfahren" bezeichnet, in dem neben den nativen Nucleosidtriphosphaten deren 2′,3′-Didesoxyderivate als Ketten­ abbruchreagenzien eingesetzt werden. Die EP 02 52 683 beschreibt ein automatisierbares, nicht-radioaktives Sanger- Sequenzierungsverfahren als Alternative zur radioaktiven Sequenzierungsanalyse. Dabei kommen Didesoxynucleosidtri­ phosphorsäureester zum Einsatz, welche am Purin- bzw. Pyrimidinring Fluoreszenzfarbstoffe vom Xanthentyp enthalten. Für die mit diesen Fluoreszenzfarbstoffen modifizierten Didesoxynucleosidtriphosphorsäureester gilt jedoch, daß wiederum Hintergrund- und Streustrahlung die Sequenzanalyse stören kann und daß es schwierig ist, den in einer automatischen Sequenzanalyse erforderlichen differenzierten, gleichzeitigen Nachweis von vier verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen mit sehr nahe beieinander liegenden Fluoreszenzemissionsbanden zu gewährleisten, ohne daß Lesefehler auftreten.

Ein weiteres wichtiges Anwendungsfeld für Nucleosidtriphos­ phorsäureester ist die Bestimmung der zellulären Nukleinsäure­ synthese. Herkömmlich wurden vorwiegend radioaktiv mit ³H, ³²P, ¹⁴C etc. markierte Nucleoside zu diesem Zweck verwendet (B. Helpap und W. Maurer, Naturwissenschaften 54, 520 (1967)). Diese Nucleoside werden von den lebenden Zellen aufgenommen, von diesen Zellen dann in vivo durch Phosphorylierung in aktivierte Nukleinsäurebausteine umgewandelt, sodaß sie schließlich in die zelluläre Nukleinsäure (DNA und/oder RNA) als Nucleotide eingebaut werden. über die in die Nukleinsäure eingebaute Radioaktivität kann dann die Nukleinsäure- Syntheserate ermittelt werden.

Auch hier wurden Alternativen zu radioaktiven Methoden entwickelt. Dabei wurde als in die DNA einbaubares Nucleosidanalogon 5-Brom-2′-desoxyuridin (BrdU) verwendet. Ein so modifiziertes Nucleotid ist jedoch nur auf indirekte Weise nachweisbar. Ein Nachweisverfahren bedient sich eines speziell gegen die Modifizierung gerichteter Antikörper, der seinerseits eine Markierung trägt (H.G. Gratzner, Science 218 (1982): 474). Ein anderes Verfahren beruht auf einer Quenchung eines Bis- Benzimidazol DNA-Fluoreszenzfarbstoffs nach Einbau des BrdU- modifizierten Nucleotids (S.A. Latt, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70 (1973): 3395).

Wiederum können sich die der indirekten Detektion inhärenten Probleme ergeben.

Zusammengefaßt besteht das Bedürfnis nach Nucleosidtriphosphorsäureestern, die auf nicht-radioaktive und empfindliche Weise, ohne Störung durch Hintergrund-, Autofluoreszenz- oder Streustrahlung und direkt nachweisbar sind. Mit einem direkten Nachweis ist gemeint, daß zu dessen Nachweis keine weiteren Nachweisreagenzien notwendig sind.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, Nucleosidtriphosphorsäure­ ester zur Verfügung zu stellen, die so modifiziert bzw. so markiert sind, daß sie auf nicht-radioaktive Weise direkt und mit hoher Empfindlichkeit ohne Störung durch Hintergrund- und Streustrahlung nachweisbar sind und in enzymatischen Umsetzungen eingesetzt werden können.

Diese Aufgabe wird gelöst durch die Bereitstellung von Nucleosidtriphosphorsäureestern mit der allgemeinen Formel

R-K oder R-A-K,

worin R ein Ribonucleosid-, ein 2′-Desoxyribonucleosid oder ein 2′,3′-Didesoxyribonucleosid-triphosphorsäureester oder deren metallisches oder nicht-metallisches Salz ist, A - falls vorhanden - eine Amino-, eine Alkyl-, eine Alkenyl-, eine Alkinyl-, eine Aryl-, eine Aralkyl oder eine Alkarylgruppe ist, die als strukturelle, funktionelle Einheiten, sowohl endständig als auch intermediär eine oder mehrere Amino-, Amido-, Imino-, Hydrazino-, Azo-, Triazen-, Keto-, Ester-, Hydroxy-, Ether-, Thioether, Disulfid-, Ureido-, und/oder Thioureido-Gruppe oder Gruppen enthalten können, wobei die Wasserstoffatome dieser strukturellen, funktionellen Einheiten durch Alkyl-, Alkenyl-, Aryl-, Alkaryl- oder Aralkyl-Reste substituiert sein können, und K ein Komplexbildner für Lanthanidenionen ist, der einen Energiedonor für Lanthanidenionen enthält.

Zur vereinfachten Schreibweise werden Nucleosidtriphosphor­ säureester, welche Ribonucleosid-, 2′-Desoxyribonucleosid oder 2′,3′-Didesoxyribonucleosid-triphosphorsäureester oder deren metallische oder nicht-metallische Salze umfassen, nachfolgend als Nucleosidtriphosphate bezeichnet.

Der Molekülteil K dient zum Nachweis der Nucleosidtriphosphate bzw. der in enzymatischen Umsetzungen mit diesen Nucleosid­ triphosphaten entstehenden Produkte. Der den Nucleosidtri­ phosphat markierende Komplexbildner K kann zunächst in Lanthanidenion-freier Form vorliegen, um zu einem späteren Zeitpunkt, zum Beispiel vor oder in der Verwendung der erfindungsgemäßen Nucleosidtriphosphate, Lanthanidenionen zu komplexieren.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält der Komplexbildner mit dem Energiedonor jedoch bereits ein komplexiertes Lanthanidenion bzw. komplexierte Lanthaniden­ ionen. Als Lanthanidenionen werden besonders bevorzugt Europium-, Terbium-, Samarium-, und/oder Dysprosiumionen verwendet. Falls mehr als ein Lanthanidenion durch den Komplex komplexiert ist - d. h. im allgemeinen zwei Ionen - kann ein weiterer Energietransfer zwischen den Lanthanidenionen stattfinden, wie dies beispielsweise bei F.S. Richardson (Chemical Reviews 82 (1982): 541-552) beschrieben ist.

Die Markierung der Nucleosidtriphosphate mit einem Lanthanidenion-Komplex, der einen Energiedonor für Lanthanidenionen enthält, erlaubt einen direkten Nachweis mit spektroskopischen Mitteln. Ein besonderer Vorteil dieser Markierung, insbesondere gegenüber Markierungen mit herkömmlichen Fluoreszenzfarbstoffen wie beispielsweise Fluoreszein, Rhodamin oder Coumarinfarbstoffen liegt darin begründet, daß eine zeitgesteuerte bzw. zeitverzögerte Fluoreszenzmessung angewendet werden kann. Das generelle Konzept der zeitverzögerten Fluoreszenzmessung wird in den US- Patentschriften 41 50 295 und 40 58 732 sowie in "Immunofluorescence and Related Staining Techniques", Knapp et al. (Herausgeber), Elsevier/North Holland Biomedical Press, Seiten 67 bis 80 (1978), beschrieben. Die zeitverzögerte Fluoreszenzmessung ("TRF" = "time-resolved fluorometry") der Lanthanidenionen-Komplexe im Mikro- bis Millisekundenbereich verhindert die Beeinflussung der Meßresultate durch die schnell abklingende Autofluoreszenz- bzw. Streustrahlung. Das TRF- Meßprinzip beruht darauf, daß erst nach einer kurzen Zeitspanne nach der Licht-Anregung mit einer geeigneten Lichtquelle, in dessen Verlauf die kurzlebige Hintergrund-Strahlung abfällt, die emittierenden Photonen des langlebigen Fluoreszenzmarkers gemessen werden. Der Zyklus Anregung - Zeitverzögerung - Messen der emittierten Strahlung kann beliebig oft wiederholt werden, um die Ausbeute an emittierter Strahlung zu erhöhen.

Die Fluoreszenz-Lebensdauer oder die -Abklingzeit kann bei diesen Lanthanidenion-Komplexen über eine Millisekunde betragen. Der Energiedonor für die Anregung der Langzeit- Fluoreszenz ist wichtiger Bestandteil dieser Komplexe und ist im allgemeinen selbst Lanthaniden-Komplexligand. Der Energiedonor wird durch eingestrahlte Lichtstrahlung angeregt und überträgt dann Energie in einem Energietransferschritt über seinen Triplett-angeregten Zustand auf das komplexierte Lanthanidenion. Das dadurch in einem angeregten Energiezustand befindliche Lanthanidenion gibt dann Energie in Form von emittierter Fluoreszenz-Strahlung frei.

Die Nucleosidtriphosphate tragen, verestert am 5′-OH der Ribosyleinheit, drei Phosphorsäuregruppen, um als Substrate für enzymatische Umsetzungen, insbesondere zum Einbau von Nucleosidmonophosphat-Einheiten in Nukleinsäuren, eingesetzt werden zu können.

Als 2′,3′-Didesoxyribonucleosidtriphosphorsäureester werden als äquivalent auch die 2′- und/oder 3′-Derivate angesehen, bei denen die Protonen an diesen Positionen zum Beispiel durch Halogen, -NH₂ oder -N₃ substituiert sind. Auch diese Derivate sind als Kettenabbruchreagenzien im Sanger-Nukleinsäure­ sequenzierungsverfahren verwendbar.

Die Nucleobasen sind wie in den nativen Nukleinsäuren ß-N­ glycosidisch an die 1′-C-Position des Riboserings gebunden, und zwar bei Pyrimidinen über die N¹-Position und bei Purinen über die N⁹-Position.

Falls vorhanden, dient der Molekülteil A als Brücke oder Linker zwischen Nucleosidtriphosphat R und Komplexbildner K. A ist eine Amino-, eine Alkyl-, eine Alkenyl-, eine Alkinyl-, eine Aryl-, eine Aralkyl oder eine Alkarylgruppe. A kann als strukturelle, funktionelle Einheiten, sowohl endständig als auch intermediär eine oder mehrere Amino-, Amido-, Imino-, Hydrazino-, Azo-, Triazen-, Keto-, Ester-, Hydroxy-, Ether-, Thioether, Disulfid-, Ureido-, und/oder Thioureido-Gruppe oder Gruppen enthalten. Diese strukturellen, funktionellen Einheiten sind häufig eine Folge der Herstellungsverfahren der erfindungsgemäßen Nucleosidtriphosphate. Sie können aber auch dazu dienen, die Hydrophilizität bzw. die Wasserlöslichkeit des Komplexbildners und damit des gesamten Nucleosidtriphosphats zu erhöhen. Daher können auch intermediäre, an C-Atome gebundene Wasserstoffatome durch diese strukturellen, funktionellen Einheiten insbesondere Amino- und Hydroxygruppen, substituiert sein.

Die Wasserstoffatome dieser strukturellen, funktionellen Einheiten können ihrerseits durch Alkyl-, Alkenyl-, Aryl-, Alkaryl- oder Aralkyl-Reste substituiert sein.

Falls vorhanden, kann die Länge der Brücke A und das Ausmaß der Substituierung der Wasserstoffatome von A zwar beliebig sein. Aus praktischen Erwägungen sollten jedoch zu lange bzw. zu stark substituerte Brücken vermieden werden, damit die Nucleosidtriphosphate noch effektiv von Enzymen wie DNA- oder RNA-Polymerasen umgesetzt werden können. Daher sollte A entlang der längsten Kette bevorzugt nicht mehr als 20 Atome, weiter bevorzugt nicht mehr als 11 Atome und noch weiter bevorzugt nicht mehr als 4 Atome aufweisen.

Komplexbildner K kann jedoch auch direkt, d. h. nicht über eine verknüpfende Brücke, an das Nucleosidtriphosphat R gebunden sein.

Hieraus ergibt sich ein weiterer Vorteil gegenüber den bekannten Biotin- oder Hapten-modifizierten Nucleosidtri­ phosphaten. Biotin- oder Hapten-modifizierte Nucleosidtri­ phosphate machen eine relativ lange Brücke zwischen Nucleosidtri-phosphat und Biotin bzw. Hapten erforderlich, damit ein Avidin- bzw. Antikörpermolekül anbinden kann. Die gegebenenfalls in eine Nukleinsäure eingebauten Nucleotide mit einer Modifizierung gemäß der vorliegenden Erfindung erfordern jedoch keine Bindung von Avidin, eines Antikörpers oder eines anderen Nachweisreagenzes, sodaß die Brücke sehr kurz sein kann oder ganz wegfallen kann. Eine auf diese Weise geringere Modifizierung bedeutet, daß die Nucleosidtriphosphate als Enzym-Substrate besser toleriert werden, also zum Beispiel effizienter in Nukleinsäuren eingebaut werden.

Der Molekülteil R umfaßt neben dem Triphosphatrest und der Ribose-, 2′-Desoxyribose- oder 2′,3′-Didesoxyribose-Einheit als Nucleobase einen Purin- oder einen Pyrimidinring. Von den Nucleobasen sind vor allem Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil, Hypoxanthin, 7-Desazaadenin-, 7-Desazaguanin und 7-Desazahypoxanthin geeignet.

Der Molekülteil -K oder -A - K ist bevorzugt an den Positionen 5-C eines Pyrimidinrings, 8-C eines Purinrings, N⁴ des Cytosinrings, 7-C eines 7-Desazapurinrings oder N⁶ des Adeninrings an den Molekülteil R gebunden. Von diesen ist eine 5-C-Pyrimidin-, eine 7-C-Desazapurin oder eine 8-C-Purin- Modifikation besonders zu bevorzugen, da solche Modifizierungen eine gegebenenfalls spätere Basenpaarung nach enzymatischem Einbau der Nucleosidmonophosphateinheiten in Nukleinsäuren am geringsten stören.

In weiteren bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung weist A - falls vorhanden - je nach Anknüpfungsposition an den Pyrimidin- bzw. Purinring spezielle Strukturen auf. Danach hat, wenn A vorhanden ist und

• a) der Molekülteil -A-K an der Position 5-C eines Pyridinrestes gebunden ist, -A- die Struktur -CH=CH-(CH₂)₁- (NH)_m(CO)_n-(CH₂)_o-,
  -C≡C-(CH₂)_l-(NH)_m(CO)_n-(CH₂)_o-, oder
  -S-(CH₂)_l-(NH)_m(CO)_n-(CH₂)_o-,worin l und o, unabhängig von l, eine Zahl von 0 bis 8 ist, m und n, unabhängig von m, gleich 0 oder 1 ist;
• b) der Molekülteil -A-K an der Position 8-C eines Purin­ restes oder 7-C eines 7-Desazapurinrings gebunden ist, -A- die Struktur -X -(CH₂)_l-(NH)_m(CO)_n-(CH₂)_o-,worin X=CH₂, CH₂O, O, S oder NH ist und l, m, n und o wie oben definiert sind; oder
• c) der Molekülteil -A-K an den Positionen N⁴ des Cytosinrestes oder N⁶ des Adeninrestes gebunden ist, -A- die Struktur -(NH)_p-(CH₂)_l-(NH)_m(CO)_n-(CH₂)_o- oder
  -(NH)_p-(CH₂)_l- (CO)_n(NH)_m-(CH₂)_o-,worin p gleich 0 oder 1 ist und l, m, n und o wie oben definiert sind.

Die Art des Komplexbildners, der einen Energiedonor für Lanthaniden enthält, richtet sich in erster Linie nach dem Lanthanidenion, welches komplexiert wird oder komplexiert werden soll. Allgemein gilt, daß die Fluoreszenz-Lebensdauer (entspricht der Zeit, in der die Fluoreszenzintensität auf den wert F₀/e abgesunken ist, wobei F₀ die Maximalintensität nach Blitzlicht-Anregung ist) der Lanthanid-komplexierten Komplexbildner mit Energiedonor länger sein sollte als die Fluoreszenz-Lebensdauer der Hintergrund- bzw. Streustrahlung. Sie sollte bevorzugt mindestens 1 µs und weiter bevorzugt mindestens 100 µs betragen.

Die Energiedonoren werden bevorzugt so gewählt, daß der Triplettzustand des Energiedonors einem Energiezustand entspricht, der mindestens genauso hoch, bevorzugt jedoch etwas höher liegt als der Energiezustand des Lanthanidenions, in den das Lanthanidenion durch den Energietransfer angeregt wird. Die Triplettzustands-Energie des Energiedonors beträgt demnach bei Europium als Lanthanidenion mindestens 17 270 cm^-1, bei Terbium mindestens 20 480 cm^-1, bei Samarium mindestens 17 860 cm^-1 und bei Dysprosium mindestens 20 700 cm^-1. Durch solche Triplett- Sensibilisatoren erfolgt ein Energietransfer besonders effektiv.

Der Komplexbildner K sollte mindestens eine funktionelle Gruppe aufweisen, um ihn kovalent an das Nucleosidtriphosphat, entweder direkt oder über den Linker A, ankoppeln zu können.

In bevorzugten Ausführungsformen enthält K, wenn das zu komplexierende Lanthanidenion Eu³⁺ ist, als Energiedonor ein Kryptat mit α,α′-Bipyridin- und/oder 1,10-Phenantrolin­ einheiten, wie sie in EP-A-01 80 492 beschrieben sind, ein Phenanthrolin wie zum Beispiel das von Evangelista R.A. et al. in Clin. Biochem. 21 (1988), Seiten 173 bis 178 beschriebene 4,7-Bis(chlorosulfophenyl)-2,9-dicarboxyl-1,10-phenanthrolin oder die in EP-A-00 68 875 offenbarten Phenanthroline, ein Pyridin wie in EP-A-02 03 047 offenbart, ein Bipyridin wie zum Beispiel beschrieben in WO 89/08 263 und WO 90/00 623 oder ein Terpyridin, wie in WO 90/00 550 offenbart. Die aromatischen Ringe können Carboxylat-, Amino-(poly-) carboxylat- und/oder Polyamino-(poly-)carboxylat-Reste enthalten, die weitere Koordinationsbindungen zum Lanthanidenion bilden, um die Komplexstabilität zu erhöhen. Es kann auch sehr wünschenswert sein, daß die aromatischen Ringe der Energiedonoren geladene Gruppen wie Carboxylatreste tragen, die so lokalisiert sind, daß sie das Lanthanidenion nicht koordinieren, um die Hydrophilie des Energiedonors des Komplexbildners in Wasser zu erhöhen.

In weiteren Ausführungsformen der Erfindung läßt sich der Komplexbildner K, wenn das zu komplexierende Lanthanidenion Tb³⁺ ist, näher kennzeichnen durch die strukturellen Einheiten D - C oder C - D, worin D ein Energiedonor für Terbiumionen ist und als strukturelle Einheit bevorzugt eine ortho- Aminobenzoesäure oder eine para-Aminosalicylsäure oder deren Salze enthält und C ein Polyaminopolycarboxylat ist. Das Polyaminopolycarboxylat C ist vorzugsweise von Ethylendiamin­ tetraessigsäure (EDTA) oder Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) abgeleitet, sodaß C vorzugsweise EDTAyl oder DTPAyl ist. Die Verknüpfungen zwischen A - C bzw. A - D und C - D bzw. D - C entsprechen vorzugsweise Amidbindungen, wobei die Säuregruppen der Polyaminopolycarboxylate und die Säuregruppen und/oder die Aminogruppen der Tb-Energiedonoren an den Amidverknüpfungen beteiligt sind.

Die Fluoreszenz-Lebensdauer von Tb³⁺-(ortho-DTPAyl)-Amino­ benzoe-säure beispielsweise wurde zu 2,2 ms bestimmt, und diejenige von Tb³⁺-(para-DTPAyl)-Aminosalicylsäure zu 1,9 ms.

Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung hat der Nucleosidtriphosphorsäureester folgende Struktur:

wobei R wie oben definiert ist.

Als Lanthanidenion ist für diesen Komplex vor allem Tb³⁺ geeignet.

Dieser Nucleosidtriphosphorsäureester ist sehr gut geeignet, da die Modifizierung, verglichen mit einem natürlich vorkommenden Nucleosidtriphosphat, relativ gering ist, sodaß das Nucleotid von Enzymen als Substrat in enzymatischen Umsetzungen effektiv umgesetzt wird.

Das Molekulargewicht von K oder A-K sollte also dementsprechend nicht sehr hoch sein. Das Molekulargewicht von K oder A-K (in protonierter Form ohne Lanthanidenion berechnet) beträgt bevorzugt höchstens 2000, weiter bevorzugt höchstens 750.

Die freien Säuregruppen des Komplexbildners K werden, da sie schwache Säuren darstellen, in wäßriger Lösung in einem Gleichgewicht zwischen der protonieten Form und der entsprechenden deprotonierten Salzform vorliegen.

Die Komplexbildungskonstante zwischen dem Komplexbildner K und dem Lanthanidenion muß groß sein. Der Logarithmus dieser Komplexbildungskonstante sollte mindestens 10 betragen.

Die aromatischen Ringe der Energiedonoren für die Lanthanidenionen der erfindungsgemäßen Nucleosidtriphosphate können geeignete Substituenten tragen, um die Fluoreszenzeigenschaften der modifizierten Nucleotide zu modulieren. Als Substituenten für die aromatischen Wasserstoffatome eignen sich beispielsweise Niedrigalkylgruppen wie -CH₃, Niedrigalkoxygruppen wie -O-CH₃, Halogenatome, Nitro-, Sulfo- und/oder Cyanogruppen. So kann nach geeigneter Wahl und geeigneter Positionierung von Substituenten die Fluoreszenzintensität und die Fluoreszenzexcitations- und Fluoreszenzemissions-Wellenlänge verändert werden. Besonders letzteres ist hinsichtlich der Verwendung der Nucleosidtriphosphate sehr interessant.

Es kann nämlich erwünscht sein, bei Anwendungen der erfindungs­ gemäßen Nukleosidtriphosphate in enzymatischen Umsetzungen verschiedene Arten solcher Nucleosidtriphosphate einzusetzen, wobei 2, 3 oder mehrere erfindungsgemäße Nucleosidtriphosphate kombiniert werden. Das hat den Vorteil, daß die bei diesen Umsetzungen entstandenen Produkte in deren Fluoreszenz- Anregungswellenlänge und/oder -Emissionswellenlange unterscheidbar sind. Das ist besonders dann sinnvoll, wenn in einem Hybridisierungsansatz verschiedene Nukleinsäuresequenzen mit Hilfe von unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nucleosidtriphosphate hergestellten Nukleinsäuresonden nachgewiesen werden sollen, oder bei der Nukleinsäure- Sequenzierung, in der nach den vier verschiedenen Basen A, G, T, und C differenziert werden muß. Bei der Bestimmung der Nukleinsäuresynthese wirkt sich die Anwendung zweier verschiedener Koplexarten ebenfalls sehr vorteilhaft aus, wenn ein 2′-Desoxyribonucleotid, welches mit einer bestimmten, erfindungsgemäßen Komplexart modifiziert ist, zur Bestimmung der DNA-Syntheserate verwendet wird, während im gleichen Ansatz ein Ribonucleotid, welches mit einer anderen, von der Ersten durch dessen Fluoreszenz-Anregungs- und/oder Fluoreszenz- Emissionswellenlänge unterscheidbaren Komplexart modifiziert ist, zur Bestimmung der RNA-Syntheserate verwendet wird.

"Verschiedene" Nucleosidtriphosphate kann bedeuten, daß zwar das gleiche Lanthanidenion vorhanden ist, die Lanthanidenionen jedoch von unterschiedlichen Energiedonor-Komplex-Liganden gebunden sind. Oder die Lanthanidenionen sind verschieden, wobei dann auch die Energiedonor-Komplex-Liganden verschieden sein können. Auch Kombinationen beider Alternativen sind möglich.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Nucleosidtriphosphate sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik ausreichend Verfahren zur Modifizierung und Funktionalisierung von Nucleosiden bzw. Nucleotiden und zur Anknüpfung der Komplexbildner K an einen Linker A, an ein mit dem Linker A modifiziertes Nucleosidtriphosphat oder direkt an ein Nucleosidtriphosphat bekannt.

Einen Überblick über zahlreiche Reaktionsmöglichkeiten von Nucleosiden bzw. Nucleotiden wird zum Beispiel gegeben in: Mizuno Y.: "Studies in Organic Chemistry, Vol. 24 - The Organic Chemistry of Nucleic Acids" (1986), Kodansha Ltd. und Elsevier Science Publishers B.V.; und "Chemistry of Nucleosides and Nucleotides", herausgegeben von Townsend L.B. (1988), Plenum Press.

Bequemerweise bedient man sich kommerziell erhältlicher Nucleotide, die bereits reaktive Gruppen wie primäre Aminogruppen tragen. Beispiele sind: 5-Aminoallyl-desoxy­ uridintriphosphat, 5-Amino-(12)-desoxyuridintriphosphat (die Zahl 12 charakterisiert einen 12-atomigen Linker), 5-Amino­ allyl-uridintriphosphat, 8-(6-Aminohexyl)-amino-adenosintri­ phosphat und N⁶-((6-Aminohexyl)-carbamoylmethyl)-adenosin-tri­ phosphat.

Bei der Herstellung kann aber auch vom entsprechenden unmodifizierten Nucleosidtriphosphat ausgegangen werden, welches, wenn notwendig, funktionalisiert und weiter modifiziert werden kann. Oder aber man geht vom Nucleosid, vom -monophosphat oder vom -diphosphat aus und phosphoryliert am 5′-Riboseende in einer späteren Synthesestufe. Im Rahmen der Möglichkeiten kann sogar eine de novo Synthese von Pyrimidinen oder Purinen erfolgen, die bereits Modifikationen für die weitere Synthese enthalten können und die dann N-glycosidisch an einen geeigneterweise Schutzgruppen-tragenden Ribosering gebunden werden (siehe hierzu die oben erwähnten Übersichtsmonographien von Y. Mizuno und L.B. Townsend). 2′,3′- Didesoxyribonucleosid kann vom entsprechenden, kommerziell erhältlichen 2′-Desoxyribonucleosid nach der Vorschrift von E.Pfitzner et al., J. Org. Chem. 29 (1964), Seiten 1508 bis 1511, erhalten werden. Die Ribonucleoside und die Desoxyderivate können in einem Eintopf-Verfahren nach der Methode von J.L. Ruth et al., Molecular Pharmacology 20 (1981), Seiten 415 bis 422, in die entsprechenden 5′- Triphosphorsäureester überführt werden.

Zur Funktionalisierung des Nucleosids/Nucleotids eignet sich die Merkurierung und die Halogenierung an der C-5-Position eines Pyrimidin-Molekülteils, der C-8-Position eines Purin- Molekülteils oder der C-7-Position eines 7-Desazapurin- Molekülteils (Dale R.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70 (1973), 2238-2242, Dale R.M. et al., Biochemistry 14 (1975), 2447-2457) mit deren weiteren Modifikationsmöglichkeiten. Die Halogenmodifizierung erlaubt weitere Modifikationen durch nucleophile Substitutionen des Halogens. Eine Merkurierung ist besonders gut bei der Herstellung erfindungsgemäßer Nucleotidtriphosphate geeignet, die Pyrimidinringe enthalten, da auch Nucleosidtriphosphate dafür eingesetzt werden können und weitere Modifizierungen, zum Beispiel über Thiole oder über Alkene oder Alkine mittels Palladiumkatalysatoren, leicht möglich ist. Eine Synthesevorschrift zur Merkurierung und anschließender Funktionalisierung zum reaktiven Amin wie zum Beispiel Allylamin-dUTP ist in der US 47 11 955 gegeben. Die Aminogruppe kann dann als Nucleophil direkt mit einem geeigneten Komplexbildner K oder einem Komplexbildner, der einen weiteren Linkerteil trägt, reagieren.

Das merkurierte Nucleosid/Nucleotid-Derivat kann auch direkt mit einem geeigneten Molekülteil K oder A-K umgesetzt werden, das endständig eine SH-Gruppe oder eine Alken-/Alkin-Gruppe trägt. Beispiele einer Modifizierung eines 5-Hg-Nucleotids mit einem SH-Reagens sind in Hopman et al., Histochemistry 84 (1986), 169-178, beschrieben. Alternativ kann auch geeignetes Disulfid eingesetzt werden, siehe D.Bergstrom et al., J. Amer. Chem. Soc. 111 (1989), Seiten 374 bis 375.

Cytidinreste in Nucleosiden oder Nucleotiden sind einer Modifikation leicht durch die bisulfitkatalysierte Transaminierung an der N⁴-Position zugänglich (Draper D.E., Nucleic Acids Research 12 (1984), 989-1002). Entsprechende Komplexbildner K, Linker A oder bereits vorsynthetisierte Molekülteile A-K können dabei direkt eingesetzt werden.

Aminofunktionalisierungen an der 7-C-Position von 7- Desazapurinen sind beispielsweise in der EP 02 52 683 beschrieben.

Weiterhin lassen sich die exocyclischen Aminogruppen der Purin­ oder Pyrimidinbasen direkt modifizieren, wobei das exocyclische Stickstoffatom nucleophil reagiert und Wasserstoffatome dieser Aminogruppen substituiert werden.

Zur Ankopplung von K an R, direkt oder über das Linkermolekül A, können weitere Synthesewege eingeschlagen werden, die dem Fachmann hinreichend bekannt sind. Geeignet ist zum Beispiel der Einsatz von homo-, bevorzugt heterobifunktionellen Quervernetzungsreagentien. Der Linkerteil A kann demnach - ganz oder zum Teil - von einem solchen Vernetzungsreagenz herrühren. Die Wahl eines geeigneten Vernetzungsreagenzes richtet sich nach den funktionellen Gruppen, die in R und K vorhanden sind bzw. eingeführt wurden. Als aminogruppen-spezifische, homo­ bifunktionelle Quervernetzungsreagenzien eignen sich zum Beispiel bis-N-Hydroxysuccinimidester von Dicarbonsäuren und Dimethylsuberimidat (DMS); als Aminogruppen-/Thiolgruppen­ spezifische, heterobifunktionelle Quervernetzungsreagenzien eignen sich beispielsweise 4-(N-Maleimidomethyl) cyclohexan -l­ carbonsäure- N -hydroxysuccinimidester (MBS) und N- Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP).

Weisen das Nucleosid/Nucleotid und der Komplexbildner oder deren bereits funktionalisierte bzw. modifizierte Formen einerseits Amino- oder Hydroxyfunktionen und andererseits Carboxyfunktionen auf, eignen sich insbesondere Amid- oder Ester-Kondensationen zur Kupplung. Amidkondensationen werden in bekannter Weise, vorzugsweise mit einem Carbodiimid- Kupplungsreagens wie zum Beispiel N,N′-Cyclohexylcarbodiimid oder 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid, durchge­ führt. Die Carboxygruppe kann auch zunächst - geeigneterweise wiederum mit einem Carbodiimid-Kupplungsreagens - in einen reaktiven N-Hydroxysuccinimidester überführt werden, um sie dann leichter mit dem entsprechenden Amin reagieren zu lassen. Zur Esterkondensation wird die Carboxyfunktion geeigneterweise vor der Umsetzung mit dem entprechenden, OH-funktionalisierten Reaktionspartner zum o-Nitrophenolester, N-Hydroxysuccinimid­ ester oder Säurechlorid aktiviert.

Polyaminopolycarboxylate können in bekannter Weise mit aktivierten Gruppen zur Ankopplung synthetisiert werden. Mukkala et al. (Analytical Biochemistry 176 (1989), 319-325) beschreiben die Herstellung und Ankopplung von solch aktivierten Metall-Chelatoren wie DTPA-Dianhydrid und p-Isothiocyanatophenyl-EDTA an Antikörper, was hier entsprechend anzuwenden ist. Als aktivierte Polyamino­ polycarboxylate sind alternativ einsetzbar beispielsweise EDTA- Dianhydrid, p-Isothiocyanatophenyl-DTPA (Westerberg et al., Journal of Medicinal Chemistry 32 (1989), 236-243) und gemischte Säureanhydride von Polyaminopolycarboxylaten mit geeigneten Carbonsäuren.

Zur Herstellung von speziellen, erfindungsgemäßen Nucleosid- Criphosphaten, welche Polyaminopolycarboxylate wie EDTA oder DTPA im Molekülteil K umfassen - insbesondere für solche Nucleosidtriphosphate, die Terbiumionen komplexieren sollen -, kann man die Dianhydride dieser Polyaminopolycarboxylate in wasserfreiem Medium wie Dimethylsulfoxid zunächst mit einem NH₂-funktionalisierten Reaktionspartner, vorzugsweise einem Lanthanidenion-Energiedonor, zum Monoaddukt umsetzen, und läßt direkt anschließend die noch freie, zweite Anhydridfunktion mit der anderen, ebenfalls NH₂-funktionalisierten Molekülkomponente reagieren, die vorzugsweise dann ein Aminogruppen-tragendes Nucleosidtriphosphat wie z. B. Aminoallyl-dUTP ist.

Solche erfindungsgemäßen Nucleosidtriphosphaten, welche im Molekülteil K den Energiedonor ortho-Aminobenzoesäure für Terbiumionen als strukturelle Einheit enthalten, werden am geeignetsten hergestellt, indem vom Isatosäureanhydrid (2H-3,1- Benzoxazin-2,4(1H)-dion) ausgegangen wird. Nach Aktivierung des Isatosäureanhydrids zum Beispiel mit Dimethylaminopyridin kann dann die Kopplung zu einem Nucleosidtriphosphat, welches eine reaktive NH₂-Gruppe aufweist, erfolgen. Die dann noch freie Aminogruppe der Anthranilatgruppe kann dann mit einem NH₂­ reaktiven Polyaminopolycarboxylat, z. B. DTPA-Dianhydrid, zum gewünschten Produkt umgesetzt werden. Ein solcher Syntheseweg ist auf dem Schema in Fig. 1 und im Ausführungsbeispiel näher erläutert.

Die die Fluoreszenzeigenschaften modulierenden Substituenten wie Halogenatome, Niedrigalkyl-, Niedrigalkoxy-, Nitro-, Sulfo­ und/oder Cyanogruppen werden geeigneterweise in einer frühen Synthesestufe in die aromatischern Ringe der Energiedonoren eingeführt, am besten durch Bereitstellung entsprechend substituierter Aromaten bei der Synthese der Energiedonoren.

Die hergestellten Verbindungen, eventuell auch bereits die Vor­ und Zwischenstufen bei deren Herstellungen, sollten nach den gängigen Methoden der Organischen Chemie gereinigt werden. Hierzu sind vor allem moderne chromatographische Methoden wie die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), insbesondere die Umkehrphasen- und die Ionenaustausch-HPLC, die Säulenchromatographie und die präparative Dünnschichtchromato­ graphie geeignet.

Die erfindungsgemäßen Nucleosidtriphosphate können vielfach angewendet werden. Ganz allgemein können sie als Substrate für enzymatische Umsetzungen eingesetzt werden. Im Besonderen sind solche enzymatischen Umsetzungen von Interesse, in denen von den geeigneten Enzymen Nukleotide in Nukleinäuren wie DNA, RNA oder Oligonucleotide eingebaut werden. Geeignete Enzyme sind beispielsweise alle DNA- oder RNA-abhängigen DNA- und RNA- Polymerasen wie zum Beispiel die DNA-Polymerase I aus Escherichia coli, das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, die T4- und die T7-Phagen-DNA-Polymerase, die DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus und andere thermoresistente DNA-Polymerasen wie diejenigen aus Thermus flavis oder Thermococcus litoralis, die Poly(A)-Polymerase aus Escherichia coli, die AMV- und die M-MuLV-Reverse Transkriptase und thermoresistente RNA- Polymerasen, die RNA-Polymerase aus Escherichia coli, die SP6- RNA-Polymerase, die T3- und die T7-Phagen-RNA-Polymerase und die RNA-abhängige RNA-Polymerasen wie die Q-beta Replicase. Weiterhin ist die Terminale Deoxynucleotidyl Transferase (TdT) sehr gut geeignet, insbesondere zum "Tailing" von Oligonucleotiden.

Die verwendeten Enzyme müssen nicht von Enzymisolierungen stammen, sondern können auch klonierten Ursprungs sein.

Die Nukleinsäuren, die durch den Einbau der Nucleotide mit den Lanthanidenion-Komplexen modifiziert und damit markiert werden, können dann mit spektroskopischen Mitteln, bevorzugt mit der zeitgesteuerten Fluorometrie im zeitverzögerten Modus, direkt und sehr empfindlich detektiert und nachgewiesen werden. Die Detektion der Nukleinsäure kann direkt aus dem Reaktionsansatz oder auch nach Isolierung der Nukleinsäure, zum Beispiel durch elektrophoretische Auftrennung, erfolgen.

In einer weiteren Ausführung der Erfindung können die Nucleosidtriphosphate, die mit Energiedonor-enthaltenden Lanthanidenion-Komplexbildnern modifiziert sind, zur Herstellung von Nukleinsäuresonden verwendet werden. Die Herstellung der Nukleinsäuresonden kann mit Hilfe der oben aufgeführten Enzyme und den erfindungsgemäßen Nucleosidtri­ phosphaten als Subtrate erfolgen. Dadurch kann eine Vielzahl von Lanthanidenion-Komplexbildnern K zum Zweck der Markierung in die Nukleinsäure eingebaut werden.

Als Verfahren zur Herstellung der Nukleinsäure eignen sich beispielsweise folgende Reaktionsansätze:

• 1. Das "Tailing" mit der Terminalen Deoxynucleotidyl Transfe­ rase, bei der am 3′-Ende von doppel- oder einzelsträngigen DNA­ oder RNA-Proben Polynucleotid-Schwänze angehängt werden.
• 2. Die "Nick Translation" nach Rigby et al. (J. Mol. Biol. 113 (1977): 237-251), bei der im wesentlichen doppelsträngige DNA mit dem Enzym DNA Polymersase I (E. coli) und einer kleinen Menge des Enzyms DNase I in Gegenwart von Nucleosidtri­ phosphaten, von denen mindestens eine Art markiert ist, umgesetzt wird.
• 3. Die "Random Primed"-Methode nach Feinberg und Vogelstein (Anal. Biochem. 132 (1983): 6-13; Addendum Anal. Biochem. 137 (1984): 266-267). Dabei wird zunächst doppelsträngige DNA denaturiert und dann eine de novo Synthese von komplementaren DNA-Strängen mittels kurzen Primern mit zufälliger Sequenz ("Random Primer"), die an kurze, komplementäre Abschnitte der DNA binden und damit die weitere Synthese des komplementären DNA-Stranges primen. Als Enzyme eignet sich die Klenow-DNA- Polymerase oder andere DNA-abhängige DNA-Polymerasen, wie sie oben beispielhaft aufgeführt sind. Bei der ähnlichen "Specific Primed"-Methode wird anstelle der kurzen Random-Primer mit beliebiger Sequenz Primer verwendet, die eine spezifische Sequenz aufweisen und die DNA-Synthese nur an ganz bestimmten, definierten Sequenzabschnitten starten.
• 4. Mit der "Reversen Transkription", bei der eine Ribo­ nukleinsäuresequenz mit einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase (Reverse Transkriptase), wie z. B. der AMV- und die M-MuLV- Reversen Transkriptase, in eine komplementäre Desoxy-ribo­ nukleinsäuresequenz überführt wird. Neben Nucleosid-tri-phos­ phaten sind wiederum Oligonucleotid-Primer zum Start der Retro­ transkription erforderlich.
• 5. Mit der "Transkriptions"-Methode (J. Mol. Biol. 166 (1983): 477), bei der Phagen-RNA-Polymerasen die RNA-Transkription von doppelsträngigen Desoxyribonukleinsäuren katalysieren, die entsprechende Promotoren enthalten. Wird zum Beispiel Phage SP6-, T7- oder T3-codierte RNA-Polymerasen verwendet, enthalten die zu transkribierenden DNA-Sequenzen entsprechend SP6-, T7- oder T3-Promotoren.
• 6. Bei der Polymerase-Kettenreaktion ("Polymerase Chain Reaction", PCR) wird eine definierte doppelsträngige DNA- Sequenz mittels zweier flankierender Oligonucleotid-Primer, die jeweils zu einem kleinen Bereich der beiden DNA-Stränge dieser definierten DNA-Sequenz komplementär sind und so an die komplementäre Sequenz binden können, daß ihre 3′-Enden zueinander gerichtet sind, über einen häufig wiederholten Reaktionszyklus: DNA-Denaturierung - Primer-Bindung ("Annealing") - Polymerisation exponentiell amplifiziert. Neben den notwendigen Nucleosidtriphosphaten wird als DNA-Polymerase geeigneterweise aufgrund der bei jedem Reaktionszyklus notwendigen, hohen Denaturierungstemperaturen eine thermoresistente DNA-Polymerase, z. B. die Thermus aquaticus DNA-Polymerase, verwendet.

Bei allen Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäure-Sonden sind bei den Reaktionsansätzen bis zu vier der nativen Nucleosidtriphosphat-Arten von Adenosin, Guanosin, Cytidin, Thymidin und/oder Uridin teilweise oder vollständig durch entsprechend substituierbare, erfindungsgemäß modifizierte Nucleosidtriphosphate zum Einbau der Lanthanoiden-Komplex­ bildner in die Nukleinsäure-Sonde ersetzt.

Die im allgemeinen mit üblichen Methoden gereinigte Nukleinsäure-Sonde kann dann in allen, homogenen (d. h. einphasigen) und heterogenen (d. h. zweiphasigen) Hybridisie­ rungsansätzen zum spezifischen Nachweis von Nukleinsäure­ sequenzen eingesetzt werden. Beispiele verschiedener Hybridisierungstechniken sind die sogenannten "Southern"-, die "Northern"-, die "Dot-Blot"- bzw. "Slot-Blot"-, die "Colony"­ bzw. "Plaque"-, die "Sandwich"- und die "in situ"- Hybridisierung. Als homogenes Hybridisierungsverfahren in Lösung eigne sich auch eine Kombination mit Biotin- oder Hapten-modifizierten Nukleinsäuresonden, die in einer Art "Sandwich Hybridisierung" als "Einfang-Sonde" dienen, während die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nucleoditriphosphate hergestellten Nukleinsäure-Sonde, die zu einem anderen Sequenzbereich der nachzuweisenden Nukleinsäure komplementär ist, zum eigentlichen Nachweis dient (s. hierzu M.Ranki et al., Gene 21 (1983): 77).

Einen Überblick über die verschiedenen Nukleinsäurehybridi­ sierungs-Methodiken werden bei U.Landegren et al. (Science 242 (1988): 229-237), bei J. Meinkoth und G. Wahl (Anal. Biochem. 138 (1984): 267-284) und bei B.D.Hames und S.J. Miggins ("Nucleic Acid Hybridization. A Practical Approach" (1985) IRL press) gegeben.

Die Detektion der nachzuweisenden Nukleinsäuresequenz(en) kann direkt ohne weitere Nachweisreagenzien durch die zeitgesteuerte Fluoreszenzmessung im zeitverzögerten Modus sensitiv ohne Störung durch Hintergrund- oder Streustrahlung erfolgen.

Im Rahmen der Anwendungsmöglichkeiten steht auch eine Kombination des Hybridisierungsnachweises mit den unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nucleoditriphosphate hergestellten Nukleinsäure-Sonden mit einer vorgeschalteten in vitro-Amplifikation einer zu untersuchenden Nukleinsäure­ sequenz. Als in vitro-Amplifikationstechniken eignet sich die Polymerase-Kettenreaktion (PCR, s. Saiki et al., Science 230 (1985): 1350-1354), das auf Transkription basierende Amplifikationssystem (TAS, s. D.Y. Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989): 1173-1177) und das nach retroviralem Replikationsmuster ablaufende "Sequenz-Replikationssystem" (3SR, s. J.C. Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990): 1874-1878).

Einen großen Vorteil durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nucleosidtriphosphate ergibt sich durch deren direkte Verwendung in in vitro-Amplifikationsansätzen. Der Einbau der Lanthanoidenion-Komplexbildner K durch diese Amplifikationsreaktionen erlaubt dabei einen direkten und damit besonders schnellen Nachweis der amplifizierten Nukleinsäure­ sequenz. Neben den oben aufgeführten in vitro-Amplifikations­ ansätzen ist hierzu auch das Q-beta Replicase-System (s. F.R.Kramer und P.M. Lizardi, Nature (London) 339 (1989): 401-402, geeignet.

Eine weitere Verwendungsmöglichkeit eines Teils der erfindungs­ gemäßen Nucleosidtriphosphate, nämlich der 2′,3′- Didesoxyribosederivate, liegt in deren Einsatz in Nukleinsäure- Sequenzierungsanalysen. Nie oben erläutert, werden im enzymatischen Sanger-Didesoxy-Kettenabbruch-Sequenzierungs­ verfahren neben den vier nativen Triphosphat-Arten von Adenosin, Guanosin, Cytidin und Thymidin oder Uridin 2′,3′- Didesoxyribosederivate von basenpaarfähigen Purin- oder Pyrimidin-Nucleosidtriphosphaten als Kettenabbruchreagenzien eingesetzt. Dabei kann nach der automatisierbaren Sequenzierungsanalye von Prober at al. (EP 02 52 683, s. auch Science 238 (1987): 336) verfahren werden. Sind dabei diese 2′,3′-Didesoxyribosederivate gemäß der Erfindung modifiziert, wobei jeweils eine native Nucleosidtriphosphat-Art durch ein substituierbares, erfindungsgemäßes 2′,3′-Didesoxyribo­ nucleosidtriphosphat teilweise ersetzt ist, ist eine nicht­ radioaktive, aufgrund des Löschung der Hintergrund- bzw. Streustrahlung mittels zeitverzögerter Fluoreszenzmessung sehr sensitive Sequenzierungsanalyse möglich. Werden, wie oben beschrieben, vier durch die Modifikation gemäß der Erfindung unterscheidbare 2′,3′-Didesoxyribonucleosidtriphosphate ver­ wendet, wobei jeweils eine erfindungsgemäße 2′,3′-Didesoxy­ ribonucleosidtriphosphat-Art eine native Nucleosidtri-phosphat- Art teilweise ersetzt, ist eine besonders ökonomische und effiziente Sequenzierungsanalyse durchführbar, bei der die enzymatisch gebildeten DNA-Fragmente in einer einzigen Elektrophorese-Spur aufgetrennt und identifiziert werden können.

Eine weitere bedeutende Verwendungsmöglichkeit der erfindungsgemäßen Nucleosidtriphosphate besteht in deren Verwendung zur Untersuchung und Analyse von Stoffwechsel­ vorgängen, insbesondere für die Messung der Nukleinsäure­ synthese in vitro und in vivo. Die entsprechenden Ribonucleo­ sidtriphosphat-Derivate werden dabei zur Bestimmung der RNA- Syntheserate, und die entsprechenden 2′-Desoxyribonucleosid­ triphosphat-Derivate zur Bestimmung der DNA-Syntheserate verwendet. Eine Analyse der Nukleinsäuresynthese in vitro kann mit Replikations- oder Transkriptions-fähigen Zellextrakten erfolgen. Bevorzugt erfolgt eine Messung der Nukleinsäuresynthese jedoch in vivo mit intakten Zellen. Die Zellen befinden sich vorzugsweise in Kultur, wobei adhärent wachsende Zellen als auch Zellen in Suspension geeignet sind. Der Einbau der Lanthanidenion-Komplex-Markierung über die entsprechend modifizierten Nucleosidtriphosphate in die neu synthetisierte Nukleinsäure (DNA und/oder RNA) ergibt analog zum radioaktiven System mit radioaktiv markierten Nucleotiden ein Maß für die Nukleinsäuresyntheserate. Bei dieser Anwendung der erfindungsgemäßen Nucleosidtriphosphate werden die Vorteile der Modifizierungsart der Nucleotide gegenüber den herkömmlichen nicht-radioaktiven Modifizierungsarten wie Haptenisierung oder Fluoreszenzmarkierung mit herkömmlichen Fluorophoren wie Fluorescein, Rhodamin oder Cumarin, die nur über eine kurzlebige Fluoreszenz verfügen, besonders deutlich. Denn bei einem zellulären System sind unspezifische Bindungen von Avidin bzw. Antikörpern einerseits und die den Zellen inhärente Autofluoreszenz andererseits besonders groß.

Da Nucleosidtriphosphate praktisch nicht membrangängig sind, müssen die erfindungsgemäßen Nucleosidtriphosphate mit schonenden Verfahren in das Zellinnere eingebracht werden. Dabei eignen sich insbesondere Verfahren, die auch dem Fachmann bekannt sind zum Einschleusen von Oligonucleotiden oder makromolekularen Nukleinsäuren (z. B. zum Transformieren), wie zum Beispiel die Mikroinjektion, die Elektroporation, die Calciumphosphat-Präzipitiermethode oder das Liposomen- Verfahren. Die DE 39 16 595 gibt eine Verfahrensvorschrift zum Einschleusen von Nucleotiden in intakte Zellen zum Zwecke der Nukleinsäure-Syntheseratebestimmung speziell unter Verwendung von Liposomen, während K.T. Hiriyanna et al., Journal of Cell Biology 107 (1988), 33-44, die Mikroinjektion zu diesem Zweck verwenden.

Für alle Verwendungen der erfindungsgemäßen Nucleosid­ triphosphate gilt, daß die Komplexe K entweder bereits von vorneherein in Lanthanidenion-komplexierter Form vorliegen, oder die Komplexbildner mit Energiedonoren werden erst im Laufe der Verwendung mit Lanthanidenionen komplexiert.

Zur Detektion werden allgemein vorzugsweise solche Vorrichtungen verwendet, die ein zeitgesteuertes Abstrahlen und/oder Einfangen von Lichtstrahlung und damit eine zeitverzögerte Fluoreszenzmessung ermöglichen. Hierzu gehören beispielsweise im zeitverzögerten Modus arbeitende Fluoreszenzspektrometer, Fluoreszenzmikroskope, Durchfluß­ zytometer, Scanner und Kameras. Diese Vorrichtungen können auch in integrierender Weise mit anderen analytischen Vorrichtungen oder Meßeinrichtungen zu einem vollautomatischen System kombiniert werden.

Die Erfindung wird nachstehend anhand folgender Ausführungsbeispiele in Verbindung mit den Figuren näher beschrieben.

Fig. 1 zeigt schematisch einen Syntheseweg zu einer besonderen Ausführungsform der erfindungesgemäßen Nucleosidtriphosphate, Terbium³⁺ - Diethylentriamintetraacetat - (2-amidobenzoyl)-5­ (amidoallyl)-2′-desoxyuridin-5′-triphosphat (Tb-DTPA-AB-AA­ dUTP).

Fig. 2 zeigt das Elutionsprofil der Reinigung von Tb³⁺-DTPA-AB- AA-dUTP mittels Umkehr-Phasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschro­ matographie.

Fig. 3 zeigt den Einbau von Tb³⁺-DTPA-AB-AA-dUTP und von 2-Aminobenzoyl-5-(amidoallyl)-2′-desoxyuridin-5′-triphosphat (AB-AA-dUTP ) in eine Nukleinsäure durch enzymatische Oligonucleotidverlängerung ("Tailing") mittels Terminaler Deoxynucleotidyl Transferase (TdT).

Fig. 4 zeigt den Nachweis geringer Mengen verschiedener Komplexbildner K, die Terbiumionen komplexiert haben, mit der zeitverzögerten Fluorometrie (TRF) und die entsprechenden Fluoreszenz-excitations- und -emissionswellenlängen.

Beispiel 1 Darstellung von Terbium³⁺-Diethylentriamintetraacetat-(2­ amidobenzoyl)-5-(amidoallyl)-2′-desoxyuridin-5′-triphosphat (Tb-DTPA-AB-AA-dUTP) (Fig. 1) 1. Darstellung von Aminobenzoesäure-Aminoallyl-dUTP 4 (AB-AA­ dUTP)

0,32 g (2 mMol) Isatosäureanhydrid 1 werden in 1,8 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst. Nach Zugabe von 200 µl einer 1 M Dimethylaminopyridin-Lösung (DMAP) 2 schließt sich eine 5minütige Inkubation bei 37°C zur Aktivierung des Isatosäure­ anhydrids an.

10 mg (18,9 µMol) 5-(3-Aminoallyl)-2′deoxyuridin-5′-tri­ phosphat-Ammoniumsalz (AA-dUTP; Sigma, Deisenhofen, FRG) werden in einem separaten Ansatz in 100 µl deionisiertem H₂O vorgelöst und mit DMSO auf 500 µl verdünnt. Zu dieser AA-dUTP- Lösung werden 920 µl des Isatosäureanhydrid/DMAP-Gemisches gegeben.

Das Ende der Reaktion wird nach 16stündiger Inkubation bei 37°C durch HPLC- Auftrennung kontrolliert. Zur Reinigung wird das Reaktionsprodukt 4 (AB-AA- dUTP) 2mal mit 8 ml Ethylacetat/Ether (4 : 1) gefällt, durch 5minütige Zentrifugation bei 5000g sedimentiert, die Festsubstanz im Vakuumexsikkator getrocknet und anschließend wieder in 1 ml DMSO aufgenommen.

2. Darstellung von Tb³⁺DTPA-AB-AA-dUTP 6

1 ml der AB-AA-dUTP-Lösung 4 in DMSO wird mit 785 µl einer 100 mM Lösung von TbCl₃ in DMSO gemischt und 5 min bei 37°C inkubiert. Dazu werden 1573 µl einer in DMSO frisch angesetzten, 100 mM Lösung von DTPA-Anhydrid 5 pipettiert und 15 min geschüttelt. Das Produkt wird mit 12 ml Ethyl­ acetat/Ether (1 : 2) gefällt, bei 5000g 5 min sedimentiert, im Vakuumexsikkator getrocknet, danach in 1 ml deionisiertem H₂O aufgenommen und mit 300 µl Triethylamin alkalisch gemacht, bis die Substanz vollständig gelöst ist. Vor der abschließenden HPLC-Reinigung wird die Tb³⁺DTPA-AB-AA-dUTP-Lösung mit 500 µl 0,5 M EDTA (pH 8,0) 30 min bei Raumtemperatur inkubiert, um phosphatkomplexiertes Tb³⁺ abzufangen. Das synthetisierte Nukleotid wird auf einer Nucleosil 20 mm x 250 mm C₁₈-Säule in einem 0,1 molaren TEAA (pH 10; Lösung A)/Acetonitril (Lösung B) Gradienten (0-5 min 10% B; 5-30 min 10-55% B; 30-32,5 min 55-65% B; 32,5-35 min 65% B; 35-40 min 65-10% B) von restlichem DMAP und den Nebenprodukten der Reaktion gereinigt (Fig. 2). Aus der Tb³⁺DTPA-AB-AA-dUTP 6 haltigen HPLC-Fraktion entsteht, nach dem Abdampfen des Elutionspuffers, eine ölige Phase, aus der das Tb³⁺DTPA-AB-AA-dUTP 6 durch Zugabe von einigen Mikrolitern Aceton in reiner Form ausfällt. Anschließend wird das Produkt in einer Vakuumzentrifuge getrocknet.

Beispiel 2

e

Verwendung von Tb³⁺DTPA-AB-AA-dUTP in einer enzy-matischen Umsetzung zum Einbau in eine Nukleinsäure durch enzymatische Oligonucleotidverlängerung ("Tailing") mittels Terminaler Deoxynucleotidyl Transferase (TdT)

In einem Reaktionsvolumen von 20 µl wurden 10 pMol eines 5′-3²P-markierten (A.M.Maxam und W. Gilbert, Meth. Enzymology 65 (1980): 499-560) 20-mer-Oligodesoxyribonucleotids mit 100 pMol des nach Beispiel 1 hergestellten Tb³⁺DTPA-AB-AA-dUTP in 1 x Kakodylatpuffer mit 1,5 mM CoCl₂ oder 1,5 mM MnCl₂ (R. Roychoudhury et al., Nucleic Acids Res. 4 (1976): 863-877) umgesetzt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 Einheiten Terminaler Deoxynuccleotidyl Transferase gestartet und 1 h bei 37°C inkubiert. Das Oligonucleotid wurde mit Ethanol gefällt, auf einem Sequenzgel (s. Maxam und Gilbert, supra) aufgetrennt und autoradiographiert (Fig. 3). Der Einbau des erfindungsgemäßen Nukleosidtriphosphats zeigt sich gegenüber dem unmodifizierten Oligonucleotid anhand der zusätzlich erscheinenden Banden.

10 × Kakodylatpuffer:
  1 M Kalium-Kakodylsäure (pH 7,6)
250 mM Tris-(hydroxymethyl)aminomethan
  2 mM Dithiothreitol (DTT)
 15 mM CoCl₂ oder MnCl₂

Die somit hergestellte Nukleinsäure kann als Nukleinsäuresonde in Nukleinsäurehybridisierungsreaktionen dienen.

Beispiel 3

Die Fluoreszenzintensitäten verschiedener Komplexbildner K, welche Tb³⁺-Ionen komplexiert enthalten, wurden in "counts per second" in einem im zeitverzögerten Fluoreszenzmodus arbeitenden "Arcus-1230"-Fluoreszenzspektrometer von Pharmacia- LKB-Wallac gemessen, wobei und die Verzögerungszeit und die Meßzeit jeweils 400 µs betrug. Als Proben dienten wäßrige 1 ml-Lösungen. Die Signal-Dosis-Kurven in Fig. 4 zeigen, daß bereits geringe Mengen der Terbiumkomplexe nachweisbar sind. Zudem demonstriert die Figur, daß die Substituenten des aromatischen Rings des Komplexbildners die Langzeit-Fluoreszenz beeinflussen. Ebenso variieren die Excitationswellenlängen. Die maximalen Emissionswellenlängen sind für Terbiumionen spezifisch.

Claims (16)

1. Nucleosidtriphosphorsäureester mit der allgemeinen Formel R-K oder R-A-K,worin R ein Ribonucleosid-, ein 2′-Desoxyribonucleosid oder ein 2′,3′-Didesoxyribonucleosid-triphosphorsäureester oder deren metallisches oder nicht-metallisches Salz ist, A - falls vorhanden - eine Amino-, eine Alkyl-, eine Alkenyl-, eine Alkinyl-, eine Aryl-, eine Aralkyl oder eine Alkarylgruppe ist, die als strukturelle, funktionelle Einheiten, sowohl endständig als auch intermediär eine oder mehrere Amino-, Amido-, Imino-, Hydrazino-, Azo-, Triazen-, Keto-, Ester-, Hydroxy-, Ether-, Thioether, Disulfid-, Ureido-, und/oder Thioureido-Gruppe oder -Gruppen enthalten können, wobei die Wasserstoffatome dieser strukturellen, funktionellen Einheiten durch Alkyl-, Alkenyl-, Aryl-, Alkaryl- oder Aralkyl-Reste substituiert sein können, und K ein Komplexbildner für Lanthanidenionen ist, der einen Energiedonor für Lanthanidenionen enthält.

2. Nucleosidtriphosphorsäureester nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Komplexbildner ein oder mehr Lanthanidion(en) komplexiert hat.

3. Nucleosidtriphosphorsäureester nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Komplexbildner Europium-, Terbium-, Samarium- und/oder Dysprosiumion(en) komplexiert hat.

4. Nucleosidtriphosphorsäureester nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß A - falls vorhanden - entlang der längsten Kette nicht mehr als 20 Atome aufweist.

5. Nucleosidtriphosphorsäureester nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Molekülteil -K oder -A-K an den Positionen 5-C eines Pyrimidinrings, 8-C eines Purinrings, N⁴ des Cytosinrings, 7-C eines 7-Desazapurinrings oder N⁶ des Adeninrings gebunden ist.

6. Nucleosidtriphosphorsäureester nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß, wenn A vorhanden ist und

• a) der Molekülteil -A-K an der Position 5-C eines Pyridinrestes gebunden ist, -A- die Struktur -CH=CH-(CH₂)₁- (NH)_m(CO)_n-(CH₂)_o-,
  -C≡C-(CH₂)_l-(NH)_m(CO)_n-(CH₂)_o-, oder
  -S-(CH₂)_l-(NH)_m(CO)_n-(CH₂)_o-,aufweist, worin l und o, unabhängig von l, eine Zahl von 0 bis 8 ist, m und n, unabhängig von m, gleich 0 oder 1 ist;
• b) der Molekülteil -A-K an der Position 8-C eines Purin­ restes oder 7-C eines 7-Desazapurinrings gebunden ist, -A- die Struktur -X -(CH₂)_l-(NH)_m(CO)_n-(CH₂)_o-,aufweist, worin X= CH₂, CH₂O, O, S oder NH ist und l, m, n und o wie oben definiert sind; oder
• c) der Molekülteil -A-K an den Positionen N⁴ des Cytosinrestes oder N⁶ des Adeninrestes gebunden ist, -A- die Struktur -(NH)_p-(CH₂)_l-(NH)_m(CO)_n-(CH₂)_o- oder
  -(NH)_p-(CH₂)_l- (CO)_n(NH)_m-(CH₂)_o-,aufweist, worin p gleich 0 oder 1 ist und l, m, n und l m, n und o wie oben definiert sind.

7. Nucleosidtriphosphorsäureester nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß K ein Komplexbildner für Europiumionen ist und der Energiedonor ein Kryptat mit α,α′-Bipyridin- und/oder 1,10-Phenantrolin­ einheiten, ein Phenanthrolin, ein Pyridin, ein Bipyridin oder ein Terpyridin ist, wobei die aromatischen Ringe Carboxylat-, Amino-(poly-) carboxylat- und/oder Polyamino-(poly-)carboxylat- Reste enthalten können.

8. Nucleosidtriphosphorsäureester nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß K ein Komplexbildner für Terbiumionen ist und zusammengesetzt ist aus den strukturellen Einheiten D-C oder C-D, worin D ein Energiedonor für das Terbiumion ist und als strukturelle Einheit eine ortho-Aminobenzoesäure oder eine para-Amino­ salicylsäure oder deren Salze enthält und C ein Polyamino­ polycarboxylat ist.

9. Nucleosidtriphosphorsäureester nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyaminopolycarboxylat EDTAyl oder DTPAyl ist.

10. Nucleosidtriphosphorsäureester nach Anspruch 8, gekennzeichnet durch die Struktur

11. Nucleosidtriphosphorsäureester nach einem der vorher­ gehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die aromatischen Ringe der Energiedonoren für die Lanthanidenionen einen oder mehrere Halogen-, Niedrigalkyl-, Niedrigalkoxy-, Nitro-, Sulfo- und/oder Cyano-Substituenten tragen.

12. Verwendung der Nucleosidtriphosphorsäureester nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 11 als Substrate in enzymatischen Umsetzungen.

13. Verwendung der Nucleosidtriphosphorsäureester nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 11 als Substrate in enzymatischen Umsetzungen für Enzyme, die Nucleotide in Nukleinsäuren einbauen.

14. Verwendung der Nucleosidtriphosphorsäureester nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 11 zur Herstellung von Nukleinsäuresonden.

15. Verwendung der 2′,3′-Didesoxyribonucleosidtriphosphorsäure­ ester nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 11 zur Nukleinsäure-Sequenzanalyse.

16. Verwendunq der Nucleosidtriphosphorsäureester nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 11 zur Messung der Nukleinsäuresynthese in vitro und in vivo.