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Einführung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft neue Verbindungen, zum Beispiel modifizierte
Basenanaloga, welche verwendet werden können, um Nukleinsäuren zu
markieren, die in einer breiten Vielzahl molekularbiologischer Anwendungen
eingesetzt werden können.
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Hintergrund
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Nukleinsäuremoleküle, die
mit Reportergruppen markiert sind, wurden in vielen molekularbiologischen Verfahren
verwendet, wie zum Beispiel der Sequenzierung und in Hybridisierungsstudien.
Die markierten Nukleinsäuremoleküle wurden
durch verschiedene Verfahren hergestellt. Diese Verfahren umfassten
markierte Nukleoside, Desoxynukleoside oder Didesoxynukleosidtriphosphate,
markierte Phosphoramidite sowie eine direkte Kopplung der Markierungen
an die Nukleinsäuren
(Renz,
EP 120 376 ). Die
hergestellten, markierten Nukleotide und markierten Nukleinsäuremoleküle können in
Hybridisierungsstudien mit Nukleinsäuren oder zum Sequenzieren
der Nukleinsäuren
verwendet werden. Eine breite Vielzahl von Markierungen wurde bei
diesen Verfahren verwendet, einschließlich radioaktiver Isotope,
zum Beispiel
3H,
14C,
32P,
33P und
35S, Hapten, Biotin, Mass-Tags (absolut quantifizierte
Peptide) oder Fluoreszenz.
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Es
gab ein zunehmendes Interesse an der Verwendung modifizierter Basen
und Nukleotidanaloga bei der Markierung von Nukleinsäuren. Einige
dieser Analoga sind basenspezifisch und können in Nukleinsäuren anstelle
einer einzelnen, natürlichen
Base eingebaut werden, d.h. A, T, G oder C. Andere Analoga besitzen das
Potential, eine Basenpaarung mit mehr als einer natürlichen
Base einzugehen, und können
daher anstelle von mehr als einer natürlichen Base eingebaut werden.
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WO
97/28177 offenbart Nukleosidanaloga, welche die Struktur enthalten:
wobei X ein O, S, Se, SO,
CO oder NR
7 ist,
R
1,
R
2, R
3 und R
4 gleich oder verschieden sind, und jeweils
ein H, OH, F, NH
2, N
3,
O-Kohlenwasserstoffrest oder eine Reportergruppe sind,
R
5 ein OH oder ein Mono-, Di- oder Triphosphat
oder ein Thiophosphat oder ein entsprechendes Boranphosphat ist,
oder
einer der Reste R
2 und R
5 ein
Phosphoramidit ist,
Z ein O, S, Se, SO, NR
9 oder
CH
2 ist,
und R
6,
R
7, R
8, R
9 gleich oder verschieden sind, und jeweils
ein H, Alkyl, Aryl oder eine Reportergruppe sind.
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WO
99/06422 offenbart Basenanaloga der Struktur
wobei X = O oder NH oder
S,
Y = N oder CHR
6 oder CR
6,
W
= N oder NR
6 oder CHR
6 oder
CR
6,
n = 1 oder 2,
R
6 jeweils
unabhängig
voneinander ein H oder O oder Alkyl oder Alkenyl oder Alkoxy oder
Aryl oder ein Reporterrest ist,
wenn nötig (d.h., wenn Y und/oder
W ein N oder CR
6 ist) liegt eine Doppelbindung
zwischen Y und W oder zwischen W und W vor,
und wobei Q ein
Zucker oder Zuckeranalogon ist.
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Zusammenfassung der vorliegenden
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt neue Verbindungen der Formel Formel
(I)
wobei Q ein H oder ein Zucker oder ein Zuckeranalogon
oder ein Rückgrat
einer Nukleinsäure
oder ein Rückgrat-Analogon
ist, Y = O, S, NR
10 ist, wobei R
10 ein H, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl ist, X
ein H, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Heteroaryl oder eine Kombination
derselben oder bevorzugt eine Reportergruppe ist.
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Genaue Beschreibung der
Erfindung
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In
einem ersten Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung neue
Verbindungen der Formel (I) bereit, wobei Q ein H oder ein Zucker
oder ein Zuckeranalogon oder ein Rückgrat einer Nukleinsäure oder
ein Rückgrat-Analogon
ist, Y = O, S, NR10 ist, wobei R10 ein H, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl ist, X
ein H, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Heteroaryl oder eine Kombination
derselben oder bevorzugt eine Reportergruppe ist. Die Reportergruppe
kann mit dem Heterocyclus über
einen geeigneten Linkerarm verbunden sein, welcher ähnlich zu den
Optionen sein kann, die bereits für X definiert wurden, oder
er kann größer sein.
In dieser Hinsicht kann X in geeigneter Weise eine Kette von bis
zu 30 Atomen umfassen, stärker
bevor zugt eine Kette von bis zu 12 Atomen. Der Reporter kann mehr
als 12 Atome umfassen. X kann ebenfalls eine geladene Gruppe enthalten, welche
der Nukleotidbase eine positive oder negative Nettoladung verleiht.
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In
geeigneter Weise kann Q ein H oder eine Gruppe sein, die ausgewählt wird
aus
wobei Z ein O, S, Se, SO,
NR
9 oder CH
2 ist,
wobei R
9 ein H, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl
oder ein Reporter ist,
R
1, R
2, R
3 und R
4 gleich oder verschieden sind und jeweils
ein H, OH, F, NH
2, N
3,
O-Kohlenwasserstoffrest, NHR
11 sind, wobei
R
11 eine Alkyl, Alkenyl, Alkinyl oder eine
Reportergruppe ist. In geeigneter Weise besitzt die Gruppe des Kohlenwasserstoffrestes
bis zu 6 Kohlenstoffatome. R
11 und R
9 können
eine Kette von bis zu 30 Atomen, vorzugsweise von bis zu 12 Atomen
umfassen.
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R
5 ist ein OH, SH oder NH
2 oder
ein Mono-, Di- oder Triphosphat oder ein Thiophosphat oder ein entsprechendes
Boranphosphat, oder einer der Reste R
2,
R
4 und R
5 ist ein
Phosphoramidit oder eine andere Gruppe zum Einbau in eine Polynukleotidkette,
oder eine Reportergruppe;
oder Q kann eine der folgenden, modifizierten
Zuckerstrukturen sein:
Acyclische Zucker mit den Strukturen
(ii) oder (iii)
wobei
R
12 ein C
1-C
4-Alkyl, Hydroxy-C
1-C
4-Alkyl oder H, vorzugsweise ein Methyl,
Hydroxymethyl oder H ist, oder
Zucker mit den Strukturen (iv)
bis (vi)
wobei
R
14 ein C
1-C
6-Alkyl, Hydroxy-C
1-C
6-Alkyl, C
1-C
6-Alkylamin, C
1-C
6-Carboxyalkyl oder vorzugsweise ein Reporterrest
ist,
(vii) oder Q ist ein Rückgrat
einer Nukleinsäure,
das aus sich wiederholenden Einheiten von Zuckerphosphat oder sich
wiederholenden Einheiten aus modifiziertem Zuckerphosphat (zum Beispiel
LNA) (Koshkin et al., 1998, Tetrahedron 54, 3607–30) oder aus einem Rückgrat-Analogon, wie zum
Beispiel Peptide oder Polyamidnukleinsäure (PNA) (Nielsen et al.,
1991, Science 254, 1497–1500)
oder aus einem polykationischen Ribonukleinsäure-Guanidin (RNG) (Bruice
et al., 1995, PNAS 92, 6097) oder aus Pentopyranosyl-Oligonukleotiden (HNA)
(Eschenmoser A., 1999, Science, 284, 2118–2124) besteht.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform,
wenn Q ein H ist, sind diese Verbindungen Basenanaloga. In einer
zweiten bevorzugten Ausführungsform
ist Q ein Zucker oder ein Zuckeranalogon oder ein modifizierter Zucker,
zum Beispiel eine Gruppe mit einer Struktur gemäß (i) bis (vi), und die Verbindungen
sind Nukleotidanaloga oder Nukleosidanaloga. Wenn Q ein Rückgrat einer
Nukleinsäure
oder ein Rückgrat-Analogon
ist, oder gleich (vii) ist, werden diese Verbindungen nachfolgend
Nukleinsäuren
oder Polynukleotide genannt.
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Wenn
Q eine Gruppe der Struktur (i) aufweist, können R1,
R2, R3 und R4 jeweils ein H, OH, F, NH2,
N3, O-Alkyl oder ein Reporterrest sein.
Somit werden Ribonukleoside und Desoxyribonukleoside und Didesoxyribonukleoside
zusammen mit anderen Nukleosidanaloga ins Auge gefasst. Diese Zuckersubstituenten
können eine
Reportergruppe zusätzlich
zu einer beliebigen anderen enthalten, die auf dieser Base vorhanden
sein kann. Vorzugsweise ist R1 = H, R2 = H, OH, F, N3,
NH2, NH(CH2)nR13 oder O-(CH2)nNH2,
wobei n gleich 0–12 ist,
R4 = H, OH, N3,
NH2, F, OR13, R3 = H, OH oder OR13,
wobei R13 ein Alkyl, Alkenyl, Alkinyl oder
ein Reporter ist. Stärker
bevorzugt ist mindestens einer der Reste R1 und
R2 und mindestens einer der Reste R3 und R4 ein H.
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R5 ist ein OH, SH, NH2 oder
ein Mono-, Di- oder Triphosphat oder ein Thiotriphosphat oder ein
entsprechendes Boranphosphat. Wenn R5 ein
Triphosphat ist, werden solche Triphosphatnukleotide in eine Polynukleotidkette
eingebaut, indem ein geeigneter Templatprimer zusammen mit einer
DNA-Polymerase oder reversen Transkriptase und geeigneten dNTPs
und ddNTPs, falls nötig,
eingesetzt werden. NTPs können
mit geeigneten RNA-Polymerasen eingesetzt werden. Die Verbindungen
der vorliegenden Erfindung können
unter Verwendung von Standardtechnologien in ein PCR-Produkt eingebaut
werden, oder zur Herstellung einer cDNA aus einem geeigneten RNA-Templat,
Primer, dNTP-Mix und reverser Transkriptase verwendet werden. Oligonukleotid-
und Polynukleotidketten können
ebenso durch Nukleotidanaloga der vorliegenden Erfindung durch Verwendung
einer terminalen Transferase verlängert werden.
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In
alternativer Weise kann einer der Reste R2,
R4 und R5 ein Phosphoramidit
oder ein H-Phosphonat oder ein Methylphosphonat oder ein Phosphorthioat
oder -Amid, oder eine ge eignete Verbindung zu einer festen Oberfläche, zum
Beispiel ein mit Hemisuccinat behandeltes Glas mit kontrollierten
Poren, oder eine andere Gruppe für
den Einbau, der im Allgemeinen durch chemische Mittel erfolgt, in
eine Polynukleotidkette sein. Die Verwendung von Phosphoramiditen
und verwandten Derivaten bei der Synthese von Oligonukleotiden ist
wohl bekannt und in der Literatur beschrieben.
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Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform
sind Nukleosidanaloga oder Nukleotidanaloga, welche ein Basenanalogon
wie definiert enthalten, das mit mindestens einer Reportergruppe
markiert ist. Geeignete Reporterreste können aus verschiedenen Arten
von Reportern ausgewählt
werden. Die Reportergruppe kann ein Radioisotop sein, mittels dessen
das Nukleosidanalogon leicht nachweisbar gemacht wird, zum Beispiel
ein 32P oder 33P
oder 35S, die in eine Phosphat- oder Thiophosphat-
oder Phosphoramidit- oder H-Phosphonat-Gruppe eingebaut sind, oder
alternativ ein 3H oder 14C
oder ein Iod-Isotop. Es kann ein Isotop sein, das mittels Massenspektrometrie
oder NMR nachweisbar ist. Es kann eine Signalgruppe oder ein Rest
sein, zum Beispiel ein Enzym, Hapten, Fluorophor, Chromophor, oder
eine chemolumineszente Gruppe, eine Raman-Markierung oder eine elektrochemische
Markierung. Besonders bevorzugte Reporter sind Fluoreszenzfarbstoffe,
wie zum Beispiel Fluorescein, Rhodamin, Bodipy und Cyanine.
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Die
Reportergruppe kann eine Signalgruppe oder einen Signalrest sowie
eine Linkergruppe umfassen, die mit dem Rest des Moleküls verbunden
ist. Die Linkergruppe kann eine Kette von bis zu 30 Kohlenstoff-, Stickstoff-,
Sauerstoff- und Schwefel-Atomen sein, und sie kann starr oder flexibel,
gesättigt
oder ungesättigt sein.
Solche Linker sind für
den Fachmann wohl bekannt. Die Linkergruppe kann eine endständige oder
eine andere Gruppe aufweisen, zum Beispiel ein NH2,
OH, COOH, SH, Maleimid, Haloacetyl oder eine andere Gruppe, durch
welche ein Signalrest vor oder nach dem Einbau des Nukleosidanalogons
in eine Nukleinsäurekette
gebunden sein kann. Es ist ebenfalls möglich, die Moleküle der vorliegenden
Erfindung an eine feste Oberfläche über eine
geeignete Linkergruppe wie vorstehend beschrieben zu verknüpfen.
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Es
ist ebenfalls möglich,
dass die Moleküle
der vorliegenden Erfindung selbst als Reporter wirken können. Antikörper können als
ganze Moleküle
oder als Teil des Moleküls,
zum Bei spiel eine Ringstruktur oder ein modifizierter Zucker, herangezogen
werden. Die Antikörper
können
selbst Markierungen tragen oder durch Sekundärantikörper anhand von Verfahren,
die im Stand der Technik wohl bekannt sind, nachgewiesen werden. Diese
Verfahren verwenden häufig
einen enzymatischen Nachweis oder Fluoreszenz.
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Die
Nukleosidanaloga dieser Erfindung können in jeder der vorhandenen
Anwendungen eingesetzt werden, welche native Nukleinsäuresonden
verwenden, die mit Haptenen, Fluorophoren oder anderen Reportergruppen
markiert sind. Diese umfassen Southern Blots, Dot Blots und Verfahren,
die auf Polyacrylamid- oder Agarose-Gelen beruhen, oder Hybridisierungs-Assays in Lösung sowie
andere Assays in Mikrotiterplatten oder Röhrchen, oder Assays von Oligonukleotiden
oder Nukleinsäuren
auf Arrays auf festen Trägern.
Die Sonden können
mittels Antikörper
nachgewiesen werden, die entweder gegen Haptene gerichtet sind,
welche mit dem Analogon verbunden sind, oder die gegen die Analoga
selbst gerichtet sind. Der Antikörper
kann mit einem Enzym oder Fluorophor markiert werden. Fluoreszenzdetektion
kann ebenso verwendet werden, falls das Basenanalogon selbst fluoreszierend
ist oder falls eine fluoreszierende Gruppe vorliegt, die mit dem
Analogon verbunden ist.
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Die
Verwendung von unterschiedlichen Massen der Nukleosidanaloga kann
ebenso beim Nachweis verwendet werden, sowie die Zugabe eines spezifischen
Mass-Tags (eines genau quantifizierbaren Proteins), welcher eine
Identifizierung erlaubt. Es wurden Verfahren für die Analyse und den Nachweis
der Oligonukleotide, Nukleinsäurefragmente
und der Produkte der Primerverlängerung
beschrieben (
US 5,288,644 und
WO 94/16101). Diese Verfahren beruhen in der Regel auf einer MALDI-ToF-Massenspektrometrie.
Sie messen die gesamte Masse eines Oligonukleotids, und aus dieser
kann die Sequenz des Oligonukleotids ermittelt werden. In manchen
Fällen
kann die Masse des Oligonukleotids oder des Fragments für eine spezifische
Sequenz nicht eindeutig sein. Dieser Fall wird dann eintreten, wenn
das Verhältnis
der natürlichen
Basen, ACGT in unterschiedlichen Sequenzen ähnlich ist. Zum Beispiel besitzt
das einfache 4-mer Oligonukleotid dieselbe Masse wie 24 andere mögliche 4-mere,
zum Beispiel CAGT, CATG, CGTA, etc..
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Bei
längeren
Nukleinsäurefragmenten
kann es schwierig sein, Unterschiede bezüglich der Masse zwischen zwei
Fragmenten aufgrund eines Mangels an Auflösung im Massenspektrum bei
höheren
Molekulargewichten aufzulösen.
Der Einbau von Basen-modifizierten Analoga entsprechend der vorliegenden
Erfindung kann verwendet werden, um die spezifischen Oligonukleotide
oder das Proteinsäurefragment
zu identifizieren, da ihre Massen von jenen der natürlichen
Basen verschieden sind. Zum Beispiel können die beiden Sequenzen ACGT
und CAGT für
den Fall ihres gleichzeitigen Vorliegens mittels Massenspektrometrie
identifiziert werden, falls eines der natürlichen Nukleotide in einer
der Sequenzen durch eines der Analoga der vorliegenden Erfindung
ersetzt wird. Zum Beispiel kann in dem Oligonukleotid CAGT das T
durch ein Analogon der vorliegenden Erfindung ersetzt werden, wobei
nur eine geringe Auswirkung auf eine spezifische Anwendung gegeben
ist, zum Beispiel bei der Hybridisierung oder dem enzymatischen
Einbau. Schon jetzt können
die beiden Sequenzen mittels Massenspektrometrie leicht identifiziert
werden, weil sich die Masse aufgrund des Einbaus des Analogons verändert.
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Die
Modifikation kann an den Basen und ebenso an den Zuckern oder zwischen
den Nukleotid-Verknüpfungen
erfolgen. Zum Beispiel führen
Thiozucker oder Phosphothioat-Verknüpfungen ebenso zu bestimmten
Massenveränderungen.
Eine breite Vielzahl von Veränderungen
an der Base, dem Zucker oder dem Linker kann eine Anzahl von Molekülen mit
unterschiedlichen Massen ergeben, welche nützlich sein werden, um eine
spezifische Sequenz genau durch ihre Masse zu definieren, insbesondere
bei einer Hybridisierung mit vielerlei verschiedenen Nukleinsäuren oder
bei Sequenzierungsanwendungen.
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RNA
ist ein äußerst vielseitiges
biologisches Molekül.
Experimentelle Studien durch verschiedene Laboratorien haben gezeigt,
dass an vitro Selektionsverfahren verwendet werden können, um
kurze RNA-Moleküle
aus RNA-Bibliotheken zu isolieren, welche mit hoher Affinität und Spezifität an Proteine
binden, die normalerweise nicht mit RNA-Bindung assoziiert sind,
einschließlich
einiger Antikörper
(Gold, Allen, Binkley et al., 1993, 497–510 in The RNA World, Cold
Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor NY; Gold, Polisky, Uhlenbeck und
Yarus, 1995, Annu. Rev. Biochem. 64: 763–795; Tuerk und Gold, 1990,
Science 249: 505–510;
Joyce, 1989, Gene 82: 83–87;
Szostak, 1992, Trends Biochem. Sci. 17: 89–93; Tsai, Kenan und Keene,
1992, PNAS 89: 8864–8868;
Doudna, Cech und Sullenger, 1995, PNAS 92: 2355–2359). Einige dieser RNA-Moleküle wurden
als Kandidaten für
Arz neimittel für
die Behandlung von Krankheiten, wie zum Beispiel Myasthemia gravis oder
einige andere Autoimmunkrankheiten, vorgeschlagen.
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Das
Grundprinzip beinhaltet die Zugabe einer RNA-Bibliothek zum Protein
oder dem betreffenden Molekül.
Es wird gewaschen, um nicht gebundene RNA zu entfernen. Anschließend wird
die an das Protein oder das betreffende andere Molekül gebundene
RNA spezifisch eluiert. Diese eluierte RNA wird dann revers transkribiert
und mittels PCR amplifiziert. Die DNA wird dann unter Verwendung
modifizierter Nukleotide (entweder 2'-Modifikationen, um eine Nukleaseresistenz
zu ergeben, zum Beispiel 2'-F,
2'-NH2,
2'-OCH3 und/oder
C5-modifizierte Pyrimidine und/oder C8-modifizierte Purine) transkribiert.
Jene Moleküle,
von denen gefunden wurde, dass sie das Protein oder das betreffende
andere Molekül
binden, werden kloniert und sequenziert, um nach gemeinsamen („consensus") Sequenzen zu suchen.
Diese Sequenz wird optimiert, um ein kurzes Oligonukleotid zu erzeugen,
welches eine verbesserte spezifische Bindung zeigt, welche dann
als ein therapeutisches Mittel verwendet werden kann.
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Die
hier beschriebenen Basenanaloga werden die molekulare Diversität, die für dieses
Auswahlverfahren verfügbar
ist, signifikant erhöhen,
wenn sie in das Ribonukleosidtriphosphat oder Ribonukleosidphosphoramidit überführt werden.
Dies kann zu Oligonukleotiden mit erhöhter Bindungsaffinität gegenüber dem Zielmolekül führen, welche
mit den derzeitigen Bausteinen nicht erhältlich ist.
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Die
Analoga der vorliegenden Erfindung können Eigenschaften aufweisen,
welche von jenen der nativen Basen verschieden sind, und sie können andere,
wichtige Anwendungen besitzen. Sie können auf dem Gebiet der Antisense-Technologie
Anwendung finden. Sie können
ebenso nützlich
auf therapeutischem Gebiet als antivirale Mittel (anti-HIV-Mittel
und und anti-HBV-Mittel,
etc.) (WO 98/49177) sowie als Antikrebs-Mittel sein. Viele Nukleoside
und Nukleotidanaloga wurden als antivirale Mittel entwickelt. Sie
wirken häufig
durch die Inhibition der Aktivität
der DNA-Polymerase und/oder der reversen Transkriptase auf zahlreichen
Wegen. Eine Zahl von Nukleosidanaloga, wie zum Beispiel AZT, ddC,
ddI, D4T und 3TC werden allein oder in Kombination mit anderen Nukleosiden
oder Nicht-Nukleosidanaloga als anti-HIV Mittel eingesetzt. Die
Analoga der vorliegenden Erfindung können ebenso antivirale Aktivitäten allein
oder in Kombination mit anderen Verbindungen aufweisen. Da die Kombinationstherapie
mit Arzneimitteln häufiger
verwendet wird, um virale Infektionen zu behandeln, ist eine erhöhte Anzahl
von Verbindungen verfügbar,
einschließlich
der Verbindungen der vorliegenden Erfindung, welche die Möglichkeit
einer erfolgreichen Behandlung steigern können.
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Besonders
bevorzugte Verbindungen der Erfindung sind Verbindungen der Formel
(II)
wobei X die hier vorstehend
definierte Bedeutung besitzt.
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Die
Erfindung wird nunmehr unter Bezugnahme auf die folgenden, nicht
begrenzenden Beispiele weiter beschrieben werden.
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Synthesebeispiel
1 Synthese
von 6-(β-D-2-Desoxyribofuranosyl)-5-hydro-3-methyl-8H-pyrimido-[4,5-c][1,2]pyridazin-7-on-5'-triphosphat (5)
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(a) 3-(β-D-2-Desoxyribofuranosyl)-6-methyl-furo[2,3-d]pyrimidin-2-on
(3)
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7,1
g (20 mmol) 5-Iod(β-D-2-desoxyribofuranosyl)uridin,
2,32 g (2 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) und 0,76
g (4 mmol) Kupfer(I)iodid wurden unter Argon in ein Glasgefäß für Druckreaktionen mit
100 ml Fassungsvermögen
gegeben. Wasserfreies DMF (50 ml) und Triethylamin (4,2 ml, 30 mmol)
wurden anschließend
in das Reaktionsgefäß eingespritzt.
In die gerührte
und gekühlte
(0°C) Reaktionsmischung wurde
10 Minuten lang Propingas eingeleitet. Nach dem Abdichten des Druckgefäßes wurde
die Temperatur der Reaktionspartner auf 55–60°C mit einem Ölbad erhöht. Man ließ die Reaktionsmischung unter
diesen Bedingungen 18 Stunden lang rühren. Beim Abkühlen wurde
beim Nachweis mittels dünnschichtchromatographischer
Analyse kein Ausgangsmaterial nachgewiesen. Es wurden Methanol (25
ml), ChelexTM 100 Harz (5 g, 200–400 mesh,
Natrium-Form) und AG 1-X8 Harz (5 g, 20–50 mesh, Bicarbonat-Form)
zu der Reaktionsmischung gegeben und behutsam 1 Stunde lang gerührt. Nach
dem Filtrieren wurde die Lösung
unter Hochvakuum zu einem Öl
eingeengt. Der Rückstand
wurde durch eine Säulenchromatographie
mit Silica-Gel gereinigt (Chloroform: MeOH: 100 % bis 10 : 1) und
ergab 5-Propinyl-(β-D-2-desoxyribofuranosyl)uridin
(2) (rf: 0,4) als einen bräunlichen
Schaum mit 45 % Ausbeute, und 3-(β-D-2-Desoxyribofuranosyl)-6-methyl-furo[2,3-d]pyrimidin-2-on
(3) (rf: 0,2) als einen gelben Feststoff in 50 % Ausbeute. 5-Propinyl-(β-D-2-desoxyribofuranosyl)uridin wurde
zu 3-(β-D-2-desoxyribofuranosyl)-6-methyl-furo[2,3-d]pyrimidin-2-on
durch 2-stündiges
Rückflusskochen
in Methanol: Triethylamin (7 : 3), das 5 % Kupfer(I)iodid enthielt,
umgesetzt. Nach der Säulenchromatographie
wurde eine Ausbeute von 61 % erhalten. 1H
NMR (DMSO-d6): 2,06 (m, 1H, 2'), 2,33 (s, 3H, Me),
3,38 (m, 1H, 2'),
3,65 (m, 2H, 5'),
3,91 (q, 1H, 4'),
4,24 (m, 1H, 3'),
5,09 (t, 1H, OH-5'),
5,26 (d, 1H, OH-3'),
6,18 (t, 1H, 1'),
6,41 (s, 1H, H-5), 8,66 (s, 1H, H-4). 13C
NMR (DMSO-d6): 29,8 (Me), 40,3 (2'), 60,8 (5'), 69,9 (3'), 85,3 (1'), 88,1 (4'), 88,8 (C-5), 98,3
(C-4a), 144,8 (C-4), 147,8 (C-6), 150,1 (C-2), 162,1 (C-7a).
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(b) 6-(β-D-2-Desoxyribofuranosyl)-5-bydro-3-metbyl-8H-pyrimido[4,5-c][1,2]pyridazin-7-on (4)
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Zu
500 mg (1,35 mmol) 3-(β-D-2-Desoxyribofuranosyl)-6-methyl-furo[2,3-d]pyrimidin-2-on
(3) in einem 25 ml Rundkolben wurden 6 ml wasserfreies Hydrazin
gegeben. Man ließ die
Reaktionsmischung bei Raumtemperatur 2 Stunden lang rühren. Das überschüssige Hydrazin
wurde anschließend
durch Verdampfung unter Hochvakuum entfernt. Der Rückstand
wurde durch Säulenchromatographie
mit Silica-Gel gereinigt (Chloroform: MeOH: 10 : 1), um ein cremefarbenes,
kristallines Produkt mit 85 % Ausbeute zu ergeben. Kristalle, die
sich für
eine Röntgenstrukturanalyse
eigneten, wurden aus Methanol erhalten. 1H
NMR (DMSO-d6): 1,80 (m, 1H, 2'), 2,14 (m, 1H, 2'), 2,49 (s, 3H, Me),
3,49 (m, 2H, 5'),
3,62 (q, 1H, 4'),
4,16 (m, 1H, 3'),
4,40 (s, 2H, H-5), 4,79 (t, 1H, OH-5'), 5,13 (d, 1H, OH-3'), 6,24 (t, 1H, 1'), 7,34 (s, 1H, H-4), 10,29 (bs, 1H,
NH-8). 13C NMR (DMSO-d6):
21,1 (Me), 35,1 (2'),
47,8 (C-5), 61,8 (5'),
70,6 (3'), 83,1
(1'), 86,0 (4'), 120,8 (C-4a),
124,8 (C-4), 151,8 (C-7), 153,2 (C-3), 155,2 (C-8a).
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(c) 6-(β-D-2-Desoxyribofuranosyl)-5-hydro-3-methyl-8H-pyrimido[4,5-c][1,2]pyridazin-7-on-5'-triphosphat (5)
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Zu
140 mg (0,5 mmol) getrocknetem 6-(β-D-2-Desoxyfuranosyl)-5-hydro-3-methyl-8H-pyrimido[4,5-c][1,2]pyridazin-7-on
(4) in einem 50 ml Rundkolben wurden 5 ml Trimethylphosphat unter
Argon gegeben. Die homogene Lösung
wurde gekühlt
(Eisbad) und 70-μl
(0,75-mmol, 1,5 Äquiv.)
Phosphoroxychlorid (destilliert) wurden zugegeben. Die Reaktion
wurde unter Kühlen
1 Stunde lang gerührt.
Die Analyse mittels Dünnschichtchromatographie
wies darauf hin, dass die Reaktion zu etwa 70 % vollständig war.
Daher wurden 25 μl (0,27
mmol, 0,51 Äquiv.)
weiteres Phosphoroxychlorid zugegeben, und man ließ die Reaktion
für eine
weitere Stunde rühren.
Sowohl 1 M Tributylammoniumpyrophosphat in wasserfreiem DMF (2,5
ml, 2,5 mmol, 5 Äquiv.) als
auch Tri(n-butyl)amin (0,6 ml, 2,5 mmol, 5 Äquiv.) wurden gleichzeitig
zu der gekühlten
Lösung
gegeben. Nach 30 Minuten wurde gekühlter, 1-M Triethylammoniumbicarbonat-Puffer
(TEAB, pH 7,0) zu der Reaktionsmischung gegeben, bis die Lösung neutral
wurde. Der Puffer wurde anschließend bis zu einem Endvolumen von
40 ml zugegeben, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur
gerührt.
Die Reaktionsmischung wurde unter Hochvakuum zu einer viskosen Lösung eingeengt,
mit Wasser verdünnt
und filtriert. Das Filtrat, welches rohes Triphosphat enthielt,
wurde anschließend
auf eine 50 × 200
mm DeltaPakTM (15 μ, 100 A) C18 HPLC-Säule aufgetragen,
welche unter Verwendung eines linearen Gradienten über 25 Minuten
mit 0,1 M TEAB (pH 7,0) bis 0,1 M TEAB in 25 % Acetonitril bei einer
Fließgeschwindigkeit
von 130 ml pro Minute eluiert wurde. Ein Peak, welcher das Produkt
5 enthielt, wurde bei 10,5 Minuten gesammelt. Nach dem Entfernen
des Lösungsmittels
wurde das erhaltene Triphosphat erneut auf einer 21 × 250 mm
SynchropakTM A × 100 HPLC-Säule gereinigt,
wobei ein linearer Gradient über
30 Minuten bei 15 ml pro Minute von 0,1 M TEAB in 40 % CH3CN bis 1 M TEAB in 40 % CH3CN
verwendet wurde. 31P NMR (D2O): –9,26 (d); –10,20 (d); –22,43 (t).
HPLC (Δ PAK
C 18, 3,9 bei 30 cm, 0,1 M TEAB (pH 7,0) bis 0,1 M TEAB in 25 %
CH3CN in 30 Minuten bei 1 ml pro Minute)
12,7 Minuten. UVλmax 237 nm und 292 nm.
-
-
Synthese von 6-(β-D-2-Desoxyribofuranosyl)-5-hydro-3-aminomethyl-8H-pyrimido-[4,5-c][1,2]pyridazin-7-on-5'-triphosphat (8a)
-
(a) 3-(β-D-2-Desoxyribofuranosyl)-6-trifluoracetamidomethyl-furo[2,3-d]pyrimidin-2-on
(6a)
-
Triethylamin
(3,04 g, 4,2 ml, 30 mmol, 1,5 Äquiv.)
wurden zu einer gerührten
Lösung
von 5-Iod-2'-desoxyuridin
(7,1 g, 20 mmol, 1 Äquiv.),
Pd[P(C6H5)3]4 (1,16 g, 1 mmol,
0,05 Äquiv.),
CuI (0,38 g, 2 mmol, 0,1 Äquiv.)
und 2,2,2-Trifluor-N-propargylacetamid (4,53 g, 30 mol, 1,5 Äquiv.) in
trockenem DMF (75 ml) gegeben, und die erhaltene Mischung wurde
anschließend
2 Tage lang bei 55°C
unter einer inerten Atmosphäre
gerührt. Zu
der Reaktionsmischung wurde anschließend die Bicarbonat-Form des
AG1 X8 Harzes gegeben, um Triethylammonium-Hydroiodid zu entfernen,
ChelexTM Harz, um Metallkationen zu entfernen
und aktivierte Tierkohle, um verfärbende Substanzen zu entfernen.
Nach der Filtration über
CelitTM wurde eine leicht gelbe Lösung erhalten.
Die Entfernung des Lösungsmittels
unter Vakuum und die Chromatographie mit Silica-Gel ergaben 4,2
g (56 %) von 6a. UV (MeOH) λmax 324 nm; 1H NMR
(d6-DMSO)δ(ppm)
10,07 (s, 1H, austauschbar, H-NH-COCF3), 8,78 (s, 1H, H-6), 6,63 (s, 1H, H-CH=C(O)CH2), 6,18 (t, J = 6,55 Hz, H-1'), 5,00–5,3 (bm,
2H, austauschbar, 2 × OH),
4,48 (m, 2H, H-CH2-NH), 4,23 (m, 1H, H-4'), 3,95 (m, 1H, H-3'), 3,63 (m, 2H, H-5'), 2,40 (m, 1H, H-2'b), 2,07 (m, 1H,
H-2'a)
-
(b) 3-(β-D-2,3-Didesoxyribofuranosyl)-6-trifluoracetamidomethyl-furo[2,3-d]pyrimidin-2-on (6b)
-
Die
Titelverbindung wurde hergestellt, indem man dem für 3-(β-D-2-Desoxyribofuranosyl)-6-methyl-furo[2,3-d]pyrimidin-2-on
beschriebenen Verfahren folgte. 1H NMR (CD3OD): 1,94 (m, 2H, 3'), 2,01 (s, 3H, Me), 2,18 (m, 1H, 2'), 2,57 (m, 1H, 2'), 3,75–4,06 (ddd,
2H, 5'), 4,27 (m,
1H, 4'), 4,52 (s,
2H, CH2NH), 6,11 (dd, 1H, 1'), 6,65 (s, 1H, H-5),
9,13 (s, 1H, H-4).
-
(c) 6-(β-D-2-Desoxyribofuranosyl)-5-hydro-3-trifluoracetamidomethyl-8H-pyrimido[4,5-c](1,2]pyridazhin-7-on (7a)
-
Zu
754 mg (2 mmol) 3-(β-D-2-Desoxyribofuranosyl)-6-trifluoracetamidomethyl-furo-[2,3-d]pyrimidin-2-on
(6a) in einem 25 ml Rundkolben wurden 5 ml wasserfreies Hydrazin
gegeben. Man ließ die
Reaktionsmischung bei Raumtemperatur 3 Stunden lang rühren. Das überschüssige Hydrazin
wurde anschließend durch
Verdampfung im Hochvakuum entfernt. Zum Rückstand wurden 20 ml Methanol,
0,5 ml Triethylamin, gefolgt von 5 ml Trifluoressigsäureethylester,
gegeben. Die Reaktionsmischung wurde durch Rühren nach ungefähr 1 Stunde
homogen. Nach dem Rühren über Nacht
bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung eingeengt und der
erhaltene Rückstand
wurde durch eine Säulenchromatographie
mit Silica-Gel (EtOAc: MeOH: 20 : 1) gereinigt. Eine schwach gelbe,
kristalline Verbindung wurde mit einer Ausbeute von 86 % gesammelt. 1H NMR (DMSO-d6):
1,79 (m, 1H, 2'),
2,15 (m, 1H, 2'),
3,49 (m, 2H, 5'),
3,61 (q, 1H, 4'),
4,15 (m, 1H, 3'), 4,46
(d, 2H, H-5), 4,57 (d, 2H, CH2NH), 4,81
(t, 1H, OH-5'),
5,14 (d, 1H, OH-3'),
6,24 (t, 1H, 1'),
7,43 (s, 1H, H-4), 10,1 (t, 1H, NH-TFA), 10,51 (s, 1H, NH-8). 13C NMR (DMSO-d6):
35,1 (CH2NH), 39,0 (2'), 42,8 (C-5), 61,7 (5'), 70,5 (3'), 83,0 (1'), 85,9 (4'), 117,9 (CF3), 121,2 (C-4), 123,4 (C-4a), 152,7, 152,8
(C-3, C-7), 154,2 (C-8a), 156,7 (q, COCF3).
-
(d) 6-(β-D-2-Desoxyribofuranosyl)-5-hydro-3-aminomethyl-8H-pyrimido-[4,5-c][1,2]pyridazin-7-on-5'-triphosphat (8a)
-
Die
Phosphorylierung von 200 mg (0,51 mmol) getrocknetem 6-(β-D-2-Desoxyribofuranosyl)-5-hydro-3-trifluoracetamidomethyl-8H-pyrimido[4,5-c][1,2]pyridazin-7-on
(7a) wurde in derselben Weise ausgeführt, wie vorstehend für Verbindung
5 beschrieben. Die rohe Mischung wurde auf eine DeltaPakTM (50 × 300 mm,
15 μ, 100
A) C 18 HPLC-Säule
aufgetragen, welche unter Verwendung eines linearen Gradienten über 25 Minuten
mit 0,1 M TEAB (pH 7,0) bis 0,1 M TEAB in 25 % Acetonitril bei einer
Fließgeschwindigkeit
von 130 ml pro Minute eluiert wurde. Ein Peak, der das Produkt enthielt,
wurde bei 15 Minuten gesammelt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels
durch Verdampfung wurde das erhaltene Triphosphat erneut auf einer
21 × 250 mm
SynchropakTM A × 100 HPLC-Säule gereinigt,
wobei ein linearer Gradient über
einen Zeitraum von 30 Minuten bei 15 ml pro Minute von 0,1 M TEAB
in 40 % CH3CN bis 1 M TEAB in 40 % CH3CN verwendet wurde. Das Triphosphat wurde
mit konzentriertem NH4OH 30 Minuten lang
behandelt, ohne dass eine Veränderung auf
der analytischen HPLC beobachtet wurde, so dass bestätigt wurde,
dass die Trifluoracetyl-Schutzgruppe vor
diesem Schritt entfernt worden war. 31P
NMR (D2O): –9,65 (d), –10,86 (d), –22,54 (t).
HPLC (Δ PAK
C18, 3,9 × 30
cm, 0,1 M TEAB (pH 7,0) bis 0,1 M TEAB in 25 % CH3CN
in 30 Minuten bei 1 ml pro Minute) 12,2 Minuten. UVλmax 241
nm und 293 nm.
-
(e) 6-(β-D-2,3-Didesoxyribofuranosyl)-5-hydro-3-trifluoracetamidomethyl-8H-pyrimido[4,5-c][1,2]pyridazin-7-on
(7b)
-
Die
Synthese wurde ausgeführt
wie vorstehend für
Verbindung 7a beschrieben. Ein bräunlicher Schaum wurde in einer
Ausbeute von 65 % gesammelt. 1H NMR (CD3OD): 1,84–2,23 (m, 4H, 2', 3'), 2,01 (s, 3H, Me),
3,58–3,78
(m, 2H, 5'), 3,99
(m, 1H, 4'), 4,50–4,71 (dd,
2H, H-5), 4,66 (s, 2H, CH2NH), 6,22 (dd,
1H, 1'), 7,48 (s,
1H, H-4).
-
-
Synthese von 6-(β-D-1,2-Didesoxyribofuranosyl)-5-hydro-3-aminomethyl-8H-pyrimido[4,5-c][1,2]pyridazin-7-on-5'-triphosphat (8b)
-
Die
Synthese (im Maßstab
von 0,73 mmol) und die Reinigung/Isolierung von 8b wurden ausgeführt wie
für Verbindung
5 beschrieben.
-
Synthese von 6-(β-D-2-Desoxyribofuranosyl)-5-hydro-3-Cy3-amidomethyl-8H-pyrimido[4,5-c][1,2]pyridazin-7-on-5'-triphosphat (9a)
-
6,0 μmol(690 μl wässrige Lösung) von
8a wurden mit 310 μl
Na2CO3/NaHCO3-Puffer (pH 9,4) verdünnt, und zu einer gerührten DMF-Lösung (1,0
ml) von Cy3-NHS-Ester (7,2 μmol,
1,2 Äquiv.)
gegeben. Nach 2 Stunden Rühren
bei Raumtemperatur wurde das Cy3-Farbstoff-Nukleotid-Konjugat
(9a) isoliert (35 %), indem es auf einer Q-SepharoseTM HPLC-Säule (10 × 16 mm) gereinigt wurde, wobei
ein linearer Gradient von einem Puffer A (40 % CH3CN
in 0,1 M TEAB) bis zum Puffer B (40 % CH3CN
in 1,0 M TEAB) über
60 Minuten bei 5 ml pro Minute verwendet wurde. TOF-MS-ES- m/z,
Konus 100v, CH3CN/H2O:
1144 (MH-3).
-
Synthese von 6-(β-D-2-Desoxyribofuranosyl)-5-hydro-3-Cy5.5-amidomethyl-8H-pyrimido[4,5-c][1,2]pyridazin-7-on-5'-triphosphat (9a')
-
Das
Konjugat 9a' aus
dem Fluoreszenzfarbstoff Cy5.5 und dem Nukleotid wurde in einem ähnlichen Maßstab synthetisiert
und isoliert (33 % Ausbeute), indem 8a mit Cy5.5 NHS-Ester wie für 9a beschrieben
umgesetzt wurde.
-
Synthese von 6-(β-D-2-Desoxyribofuranosyl)-5-hydro-3-fluorescin(5,6)hexanamidoamidomethyl-8H-pyrimido[4,5-c][1,2]pyridazin-7-on-5'-triphosphat (9a'')
-
8,0 μmol (wässrige Lösung) von
8a wurden mit 1,0 ml Na2CO3/NaHCO3-Puffer (pH = 9,0) verdünnt, und zu der gerührten Lösung wurde
wasserfreie DMSO-Lösung
von (5,6)-Carboxy-x-NHS-Ester
(17,0 μmol, 2,1 Äquiv.) gegeben.
Nach 2 Stunden wurde das mit Farbstoff mar kierte Nukleotid auf einer
Q-SepharoseTM Säule wie für 9a beschrieben gereinigt,
um 9a'' zu ergeben. TOF-MS
ES- m/z, Konus 100v, CH3CN/H2O:
1003 (MH-3).
-
-
Synthese von 6-(5-Dimethoxytrityl-β-D-2-desoxyribofuranosyl)-5-hydro-3-methyl-8H-pyrimido[4,5-c][1,2]pyridazin-7-on
(10)
-
1,16
g (4,1 mmol) der Verbindung 4 wurden zusammen mit wasserfreiem Pyridin
eingeengt und in 30 ml wasserfreiem Pyridin erneut gelöst. 4,15
g (12,24 mmol, 3 Äquiv.)
DMT-Cl wurden zu der gerührten
Lösung von
4 bei Raumtemperatur unter Argonatmosphäre gegeben. Nach 3,5 Stunden
wurde die Reaktionsmischung unter vermindertem Druck eingeengt,
und der Rückstand
wurde in CHCl3 aufgenommen. Die organische Schicht
wurde mit gesättigter
NaHCO3-Lösung
gewaschen, mit wasserfreiem Na2SO4 getrocknet und unter vermindertem Druck
eingeengt. Der erhaltene Rückstand
wurde auf einer Säule
mit Silica-Gel gereinigt, mit CHCl3 eluiert,
gefolgt von 5 % MeOH in CHCl3, um die Verbindung
10 zu ergeben (2,35 g, 99 %). TOF MS ES- m/z, Konus 100v, CH3CN/0,1 M TEAB: 581,24 (MH-1).
-
Synthese von 6-(5-O-Dimethoxytrityl-3-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramidit)-β-D-2-desoxy-ribofuranosyl)-5-hydro-3-methyl-8H-pyrimido[4,5-c][1,2]pyridazin-7-on
(11)
-
583
mg (1,0 mmol) der Verbindung 10 wurden zusammen mit wasserfreiem
Pyridin eingeengt, gefolgt von Toluol, und in wasserfreiem Dichlormethan
(5 ml) gelöst.
Zu der gerührten
Lösung
wurden unter einem schwachen Strom von Argon bei Raumtemperatur
0,7 ml (4,0 mmol, 4,0 Äquiv.)
N,N-Diisopropylethylamin gegeben, gefolgt von einer tropfenweisen
Zugabe von 2-Cyanoethoxy-N,N-diisopropylaminchlorphosphin (0,28 ml,
1,25 mmol, s). Nach 30 Minuten wies die Dünnschichtchromatographie in
10 % MeOH/CHCl3 auf die Vollständigkeit
der Reaktion hin. Die Reaktionsmischung wurde mit CH2Cl2 verdünnt,
mit 10 % Na2CO3 gewaschen,
und die organische Schicht wurde nach dem Trocknen (wasserfreies
Na2SO4) unter vermindertem Druck
eingeengt. Der erhaltene Rückstand
wurde auf einer Säule
mit Silica-Gel (4 × 13
cm) gereinigt, die mit CH2Cl2:
EtOAc: Et3N (2,9 : 7 : 0,1) eluiert wurde,
um 11 (570 mg, 73 %) zu ergeben. 31P NMR
(CDCl3): δ 149,66.
-
Beispiel 5:
-
Primerverlängerungs-Assays,
um den Einbau von Triphosphat 5 durch DNA-Polymerasen zu studieren
-
Ein
Primerverlängerungs-Assay
wurde verwendet, um das Triphosphat 5 als ein Substrat für die von Exonukleasen
freie DNA-Polymerase I des Klenow Fragments (EFK) zu bewerten. Der
Assay verwendete einen 15-meren Primer, der am 5'-Ende mit 33P
markiert war, und an ein 24-mer Templat hybridisiert war. Die Sequenzen
des Primers und des Templates sind:
Primer 5' TGC ATG TGC TGG
AGA 3'
Templat
3' ACG TAC ACG ACC
TCT GAA CTA GTC 5'
1
pmol des mit 33P markierten Primers wurde
an 2 pmol des Templats in 2-fachem Klenow-Puffer (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10
mM MgCl2, 10 mM 2-Mercaptoethanol) hybridisiert.
-
Dazu
wurden entweder 4 μM
dNTPαS oder
40 μM Testverbindung
5c oder eine Mischung von 4 μM dNTPαS und 40 μM Testverbindung
gegeben. 1 U EFK und 20 mU anorganische Pyrophosphatase wurden pro
Reaktion eingesetzt. Es wurden ebenfalls eine Kontrolle mit dem
Primer allein, und eine Kontrolle mit dem Primer, dem Templat und
dem Enzym durchgeführt.
Die Reaktionen wurden bei 37°C
3 Minuten lang inkubiert. Die Reaktionen wurden anschließend durch
die Zugabe einer Stopplösung
aus Formamid und EDTA beendet. Die Reaktionsprodukte wurden auf
einem Gel mit 20 % Polyacrylamid und 7 M Harnstoff getrennt, und
die Größen der
Produktfragmente durch Vergleich mit dem markierten Primer bestimmt,
und die Produkte, die in Gegenwart von 4 μM dNTPαS verlängert wurden, wurden nach der
Belichtung eines Kodak BiomaxTM Films mittels
Autoradiographie bestimmt.
-
Dies
zeigte, dass die Testverbindung ein Substrat für EFK war, und dass sie anstelle
von dTTP eingebaut wurde. Andere Verbindungen der Erfindung, die
Gruppen, wie zum Beispiel Fluorescein oder Cyanin enthalten, können durch ähnliche
Verfahren eingebaut werden.