ES2271036T3 - Analogos de bases. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto que tiene la estructura Q es H o un azúcar o un análogo de azúcar o una espina dorsal de ácido nucleico o un análogo de espina dorsal donde X es H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, hetero-arilo o una combinación de los mismos o un informador, Y= O, S, NR donde R es H, alquilo, alquenilo alquinilo.
Description
Análogos de bases.
La presente invención se refiere a compuestos
novedosos como, por ejemplo, análogos de bases modificados que se
pueden usar para etiquetar ácidos nucleicos en una amplia variedad
de aplicaciones de biología molecular.
Las moléculas de ácidos nucleicos etiquetadas
con grupos informadores se han usado en muchas de las técnicas de
biología molecular tales como los estudios de secuenciación e
hibridación. Las moléculas de ácido nucleico etiquetadas se han
producido mediante una variedad de métodos.
Estos métodos han incluido trifosfatos
nucleósidos, desoxinucleósidos y didesoxinucleósidos etiquetados,
fosforamiditas etiquetadas y acoplamiento directo de etiquetas con
los ácidos nucleicos (Renz, EP 120376). Los nucleótidos etiquetados
y las moléculas de ácido nucleico etiquetados producidos se pueden
usar en estudios de hibridación de ácido nucleico y secuenciación
de ácido nucleico. Una amplia variedad de etiquetas se ha usado en
estas técnicas incluyendo isótopos radioactivos, como por ejemplo
^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{33}P y ^{35}S, hapteno, biotina,
etiquetas de masa o fluorescencia.
Ha habido un interés creciente en el uso de
análogos de base y nucleótido modificados en el etiquetado de
ácidos nucleicos. Algunos de estos análogos son específicos de base
y se pueden incorporar a ácidos nucleicos en el lugar de una base
natural sola, es decir A, T, G o C. Otros análogos tienen el
potencial de un par de base con más de una base natural y de allí
incorporarse al lugar de más de una base natural.
WO 97/28177 divulga análogos nucleósidos que
contienen la estructura
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\vskip1.000000\baselineskip
En la cual
X es O, S, Se, SO, CO o NR^{7}
R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4} son los
mismos o diferentes y cada uno es H, OH, F, NH_{2}, N_{3},
O-hidrocarbilo u otro grupo informador,
R^{5} es OH o mono-, di-, o
tri-fosfato o tiofosfato o boranofosfato
correspondiente,
O uno de R^{2} y R^{5} es una
fosforamidita,
Z es O, S, Se, SO, NR^{9} o CH_{2}
y R^{6}, R^{7}, R^{8}, R^{9} son los
mismos o diferentes y cada uno es H, alquilo, arilo o un grupo
informador.
\newpage
WO 99/06422 divulga análogos básicos de la
estructura
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde
X = O o NH o S
Y = N o CHR^{6} o CR^{6}
W = N o NR^{6} o CHR^{6} o CR^{6}
n = 1 ó 2
cada uno de R^{6} es independientemente H o O
o alquilo o alquenilo o alcoxi o arilo o un grupo funcional
informador
donde necesariamente (es decir, cuando Y y/o W
es N o CR^{6}) está presente un doble enlace entre Y y W o W y
W,
Q es un azúcar o análogo de azúcar
La presente invención describe compuestos
novedosos de la fórmula i
Fórmula
I
\vskip1.000000\baselineskip
Donde
Q es H o un azúcar o un análogo de azúcar o una
espina dorsal de ácido nucleico o análogo de espina dorsal, Y = O,
S, NR^{10}, donde
R^{10} es H, alquilo, alquenilo, alquinilo, X
es H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo o una
combinación de los mismos o, preferiblemente u grupo
informador.
En un primer aspecto, la presente invención
proporciona compuestos novedosos de la fórmula (I), en la cual Q es
H o un azúcar o un análogo de azúcar o una espina dorsal de ácido
nucleico o un análogo de espina dorsal, Y = O, S, NR^{10}, donde
R^{10} es H, alquilo alquenilo, alquinilo, X es H, alquilo,
alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo o una combinación de los
mismos o preferiblemente un grupo informador. El grupo informador
se puede unir al heterociclo a través de un brazo enlazador que
puede ser similar a las opciones ya definidas para X o puede ser
más grande. En este aspecto, X puede comprender adecuadamente una
cadena de hasta 30 átomos, más preferiblemente hasta 12 átomos. El
informador puede contener más de 12 átomos. X puede también contener
un grupo cargado que imparte una carga positiva o negativa a la
base nucleótida.
De manera adecuada, Q puede ser H o un grupo
seleccionado de
Donde
Z es O, S, Se, SO, NR^{9} o CH_{2}, donde
R^{9} es H, alquilo, alquenilo, alquinilo o un informador,
R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4} son los
mismos o diferentes y cada uno es H, OH, F, NH_{2}, N_{3},
O-hidrocarbilo, NHR^{11} donde R^{11} es
alquilo, alquenilo, alquinilo, o un grupo informador. De manera
adecuada el grupo hidrocarbilo tiene hasta 6 átomos de carbono.
R^{11} y R^{9} pueden comprender una cadena de hasta 30 átomos,
preferiblemente de hasta 12 átomos.
R^{5} es OH, SH o NH^{2} o mono-, di o
tri-fosfato o -tiofosfato, o boranofosfato
correspondiente, o
uno de R^{2}, R^{4}, y R^{5} es una
fosforamidita u otro grupo para incorporación en una cadena
polinucleótida, o un grupo informador;
o Q puede ser uno de las siguientes estructuras
modificadas de azúcar:
Azúcares acíclicos que tienen estructuras (ii) o
(iii)
En la cual R^{12} es alquilo de
C_{1}-C_{4}, hidroxialquilo de
C_{1}-C_{4}, o H, preferiblemente metilo,
hidroximetilo o H, o azúcares que tienen estructuras (iv) a (vi)
R^{14} = alquilo de
C_{1}-C_{6}, hidroxi alquilo de
C_{1}-C_{6}, alquiloamina de
C_{1}-C_{6}, carboxialquilo de
C_{1}-C_{6} o preferiblemente un grupo funcional
informador (vii)
o Q es una espina dorsal de ácido nucleico que
consiste en un fosfato de azúcar que se repite o un fosfato de
azúcar modificado que se repite (por ejemplo, LNA) (Koshkin et
al, 1998, Tetrahedron 54, 3607-30) o un análogo
de espina dorsal tal como un péptido o ácido nucleico de poliamida
(PNA) (Nielsen et al, 1991, Science 254,
1497-1500) o un ácido ribonucleico policatiónico
(RNG), Bruice et al, 1995 PNAS 92 6097, o oligonucleótidos
de pentopiranosilo (HNA), Eschenmosser A., 1999, Science, 284,
2118-2124.
En una realización preferida, cuando Q es H,
estos compuestos son análogos de base. En una segunda realización
preferida, Q es un azúcar o análogo de azúcar, por ejemplo un grupo
que tiene una estructura de acuerdo con (i) hasta (vi), y los
compuestos son análogos de nucleótidos o análogos de nucleósidos.
Cuando Q es una espina dorsal de ácido nucleico o análogo de espina
dorsal, (vii), estos compuestos se llaman de aquí en adelante
ácidos nucleicos o polinucleótidos.
Cuando Q es un grupo de estructura (i) R^{1},
R^{2}, R^{3} y R^{4} pueden ser cada uno H, OH, F, NH_{2},
N_{3}, O-alquilo o un grupo functional informador.
Así, los ribonucleosidos y desoxiribonucleosidos están previstos
juntos con otros análogos de nucleósido. Estos substituyentes de
azúcar pueden contener un grupo informador en adición a cualquiera
que pueda estar presente en la base, preferiblemente, R^{1} = H,
R^{2} = H, OH, F, N_{3}, NH_{2},
NH(CH_{2})_{n} R^{13} o
O-(CH_{2})_{n}NH_{2} donde n es 0-12,
R^{4} = H, OH, N_{3}, NH_{2}, F, OR^{13}, R^{3} H, OH o
OR^{13} donde R^{13} es alquilo, alquenilo, alquinilo o un
informador. Más preferiblemente por lo menos uno de R^{1} y
R^{2} y por lo menos uno de R^{3} y R^{4} es H.
R^{5} es OH, SH, NH_{2} o mono, di- o
tri-fosfato o -tiotrifosfato o boranofosfato
correspondiente. Cuando R^{5} es trifosfato, tal como los
nucleótidos de trifosfato se pueden incorporar a la cadena
polinucleótida usando un iniciador de plantilla adecuado con una
polimerasa de ADN o transcriptasa inversa y dNTPs y ddNTPs
apropiadas cuando necesariamente NTPs se puede usar con polimerasas
de ARN adecuadas. Los compuestos de la presente invención se pueden
incorporar a un producto de PCR usando técnicas estándares o usadas
en la producción de cDNA a partir de una plantilla adecuada de ARN,
iniciador de dNTP mix y transcriptasa inversa. Las cadenas de
oligonucleótido y polinucleótido se pueden también extender por
análogos de nucleótido de la presente invención mediante el uso de
transferasa terminal.
De manera alternativa, uno de R^{2}, R^{4} y
R^{5} puede ser una fosforamidita o H-fosfonato o
metilfosfonato o fosforotioato o amida, o un enlace apropiado a una
superficie sólida como por ejemplo vidrio de hemisuccinato u otro
grupo para ser incorporado, generalmente por medios químicos, a una
cadena polinuclótida. El uso de fosforamiditas y derivados
relacionados en la síntesis de oligonuclótidos es bien conocido y
descrito en la literatura.
En otra realización preferida el análogo de
nucleósido o análogo de nucleótido que contiene un análogo de base
como se definió se etiqueta con por lo menos un grupo informador. Se
pueden seleccionar grupos funcionales informadores adecuados a
partir de varios tipos de informadores. El grupo informador puede
ser un radioisótopo por medio del cual el análogo de nucleósido se
vuelve fácilmente detectable, por ejemplo ^{32}P o ^{33}P o
^{35}S incorporados a un fosfato o tiofosfato o fosforamidita o
un grupo H-fosfonato, o de manera alterna ^{3}H o
^{14}C o un isótopo de yodo. Puede ser un isótopo detectable
mediante espectroscopia de masas o RMN. Puede ser un grupo de señal
o grupo funcional por ejemplo, una enzima, hapteno, fluoróforo,
cromóforo, grupo quemiluminiscentes, etiqueta de Raman o etiqueta
electroquímica. Particularmente los informadores prefridos son
colorantes fluorescnetes como fluoresceína, rodamina, bodipy
(Dipirrometeno Boron Difluoruro) y cianinas.
El grupo informador puede comprender un grupo de
señal y un grupo funcional y un grupo enlazante que lo une al resto
de la molécula. El grupo enlazante puede ser una cadena de hasta 30
átomos de carbono, nitrógeno, oxígeno y átomos de azufre; rígida o
flexible, saturada o insaturada. Tales enlazantes son bien conocidos
para aquellos versados en el arte. El grupo enlazante puede tener
un grupo terminal u otro grupo, por ejemplo NH_{2}, OH, COOH, SH,
maleimida, haloacetilo u otro grupo mediante el cual se puede pegar
un grupo funcional de señal antes o después de la incorporación del
análogo de nucleósido a la cadena de ácido nucleico. También es
posible enlazar las moléculas de la presente invención a una
superficie sólida a través de un grupo enlazante adecuado tal como
se describe
arriba.
arriba.
También es posible que las moléculas de presente
invención puedan actuar ellas mismas como informadoras. Se pueden
elevar anticuerpos a la molécula entera o a parte de la molécula por
ejemplo estructura de anillo o de azúcar modificado. Los mismos
anticuerpos pueden llevar etiquetas o detectarse por segundos
anticuerpos mediante métodos bien conocidos en el arte. Estos
métodos con frecuencia usan detección de enzimas o
fluorescencia.
Los análogos nucleósidos de esta invención se
pueden usar en cualquiera de las aplicaciones existentes que usan
sondas de ácido nucleico etiquetadas con haptenos, fluoróforos u
otros grupos informadores. Estos incluyen Southern blots, manchas
de puntos y métodos basados en gel de poliacrilamida o agarosa sobre
ordenación en soportes sólidos. Las sondas se pueden detectar con
anticuerpos dirigidos contra haptenos que se pegan al análogo o
contra los análogos mismos. El anticuerpo se puede etiquetar con una
enzima o fluoróforo.
También se puede usar detección fluorescente si
el análogo de base es fluorescente por sí mismo o si hay un grupo
fluorescente pegado al análogo.
El uso de la masa diferente del análogo de
nucleósido también se usa en detección así como también mediante la
adición de una etiqueta identificadota de masa específica al mismo.
Se han reportado (US 5,288,644 y WO 94/16101) métodos para el
análisis y detección de oligonucleótidos, fragmentos de ácido
nucleico y productos iniciadores de extensión. Estos métodos se
basan usualmente en espectrometría de masas MALDI ToF. Se mide la
masa total de un oligonucleótido y a partir de esto se puede
averiguar la secuencia del oligonucleótido. En algunos casos la
masa del oligonucleótido o del fragmento puede no ser única para una
secuencia específica. Esto ocurrirá cuando la proporción de las
bases naturales, ACGT es similar en secuencias diferentes. Por
ejemplo el oligonucleótido simple 4 mero tendrá la misma masa que
otros 24 posibles 4 meros, por ejemplo CAGT, CATG, CGTA etc.
Con fragmentos de ácido nucleico más largos
puede ser difícil resolver diferencias en masa entre dos fragmentos
debido a la falta de resolución en el espectro de masa a pesos
moleculares mayores. La incorporación de análogos de base
modificados de acuerdo con la presente invención se puede usar para
ayudar a identificar el oligonucleótido específico o el fragmento
de ácido nucleico en la medida que sus masas son diferentes de
aquellas de las bases naturales. Por ejemplo, las dos secuencias
ACGT y CAGT se pueden identificar en la presencia uno del otro
mediante espectrometría de masas si uno de los nucleótidos naturales
en una de las secuencias es reemplazada con uno de los análogos de
la presente invención. Por ejemplo, el nucleótido CAGT, la T se
puede reemplazar con un análogo de la presente invención con poco
efecto sobre una aplicación específica, por ejemplo hibridación o
incorporación enzimática. No obstante, las dos secuencias se pueden
identificar fácilmente mediante espectroscopia de masas debido al
cambio en la masa por la introducción del análogo.
La modificación se puede hacer a las bases y
también a los azúcares o un enlazamiento internucleótido. Por
ejemplo enlaces de tio azúcares o fosfotioatos también darán lugar a
cambios de masa distintivos. Una larga variedad de cambios a la
base, azúcar o enlazante puede producir un número de moléculas de
masas diferentes que serán útiles para definir una secuencia
específica de manera exacta por su masa, especialmente en
hibridación de ácido nucleico multiplex o aplicaciones de
secuenciación.
ARN es una molécula biológica extremadamente
versátil. Estudios experimentales por varios laboratorios han
mostrado que las técnicas de selección in vitro se pueden
emplear para aislar moléculas cortas de ARN a partir de librerías
de ARN que se enlazan con alta afinidad y especificidad a proteínas
no asociadas normalmente con enlazamiento de ARN, incluyendo
algunos anticuerpos, (Gold, Allen, Binkley, et al, 1993,
497-510 en The RNA World (El mundo del ARN), Cold
Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor N.Y., Gold, Polisky,
Uhlenbeck, and Yarus, 1995, Annu. Rev. Biochem. 64:
763-795, Tuerk and Gold, 1990, Science
249:505-510, Joyce, 1989, Gene
82:83-87, Szostak, 1992, Trends Biochem. Sci
17:89-93, Tsai, Kenan and Keene, 1992, PNAS 89:
8864-8868, Tsai, Kenan and Keene, 1992, PNAS
89:8864-8868, Doudna, Cech and Sullenger, 1995, PNAS
92: 2355-2359). Algunas de estas moléculas de ARN
se han propuesto como candidatas de medicamento para el tratamiento
de enfermedades como myasthenia gravis y varias otras
enfermedades auto-immunes.
El principio básico involucra la adición de una
librería de ARN a la proteína o molécula de interés. Lavar para
retirar ARN no enlazado. Luego eluir específicamente el ARN enlazado
a la proteína u otra molécula de interés. Este ARN eluido se
transcribe inversamente y se amplifica mediante PCR. El ADN se
transcribe luego usando nucleótidos modificados (ya sea
modificaciones 2' para dar resistencia de nucleasa, por ejemplo 2'
F, 2' NH_{2}, 2' OCH_{3} y/o pirimidinas modificadas de C5 y/o
purinas modificadas de C8). Aquellas moléculas que se encontraron
para enlazar la proteína u otra molécula de interés se clonan y
secuencian para buscar secuencias comunes ("consenso"). Esta
secuencia se optimiza para producir un oligonucleótido corto que
muestra un enlazamiento específico mejorado que se puede usar luego
como un medio terapéutico.
Los análogos de base descritos aquí cuando se
convierten en trifosfato de ribonucleósido o fosforamidita de
ribonucleósido aumentarán significativamente la diversidad molecular
disponible para este proceso de selección. Esto puede conducir a
olinucleótidos con afinidad de enlazamiento aumentada por la diana
lo cual no está disponible usando los bloques de construcción
actuales.
Los análogos de la presente invención pueden
tener propiedades diferentes de aquellas de las bases nativas y
tienen otras aplicaciones importantes. Pueden encontrar uso en el
campo antisentido. También pueden ser útiles en el campo
terapéutico como antiviral (anti-VIH y
anti-VBH, etc) (WO 98/49177) y agente anticáncer.
Muchos análogos de nucleósidos y de nucleótidos han sido
desarrollados como agentes antivirales. Con frecuencia actúan por
inhibición de la actividad de polimerasa de ADN y/o transcriptasa
inversa mediante un número de medios. Un número de análogos de
nucleósido, tales como AZT, ddC, ddI, D4T, y 3TC están siendo usados
solos o en combinación de otros análogos de nucleósidos y no
nucleósidos como agentes anti VIH. Los análogos de la presente
invención pueden también tener actividades solos o en combinación
con otros compuestos. Puesto que la terapia de combinación de
drogas se está usando con frecuencia para tratar infecciones
virales, tener un número aumentado de compuestos disponibles,
incluyendo los compuestos de la presente invención podría
incrementar la posibilidad de tratamientos exitosos.
Compuestos particularmente preferidos de la
invención son compuestos de la fórmula (II)
\vskip1.000000\baselineskip
en la cual X es tal como se ha
definido
antes.
La invención se describirá ahora con referencia
a los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplo de síntesis
1
\vskip1.000000\baselineskip
A un recipiente de reacción a presión de vidrio
de 100 ml bajo argón se adicionó 7.1 g (20 mmol) de
5-yodo-(\beta-D-2-desoxiribofuranosil)uridina,
2.32 g (2 mmol) de tetraquis(trifenilfosfin)paladio
(0), y 0.76 g (4 mmol) de yoduro de cobre (I), DMF anhidro (50 ml)
y trietilamina (4.2 ml, 30 mmol) se inyectaron luego al recipiente
de reacción. A la mezcla de reacción revuelta y enfriada (0ºC) se
borboteó gas propino por diez minutos. Después de sellar el envase a
presión la temperatura de los reactantes se incrementó hasta
55-60ºC por medio un baño de aceite. Se revolvió la
reacción por 18 horas. Al enfriarse no se detectó material inicial
mediante análisis TLC. Metanol (25 ml), Chelex™ 100 resina (5 g,
tamiz 200-400, forma de sodium) y análisis de resina
AG 1-X8 (5 g, tamiz 20-50, forma de
bicarbonato) se adicionaron a la mezcla de reacción y se revolvió
suavemente por una hora. Después de filtrar se evaporó al vacío la
solución hasta un aceite. El residuo se purificó mediante
cromatografía de columna con gel de sílice (cloroformo/MeOH 100%
hasta 10:1) dando lugar
5-propinil-(\beta-D-2-desoxiribofuranosil)uridina
2(rf: 0.4) como una espuma tostada en rendimiento de 45%, y
3-(\beta-D-2-desoxiribofuranosil)-6-metil-furo[2,3-d]pirimidin-2-ona
3 (rf: 0.2) como un sólido amarillo con un rendimiento de 50%.
5-Propinil-(\beta-D-2-deoxiribofuranosil)uridina
se convirtió en
3-(\beta-D-2-desoxiribofuranosil)-6-metil-furo[2,3-d]pirimidin-2-ona
mediante reflujo en metanol/trietilamina (7:3) que contiene 5% de
yoduro de cobre (I) por 2 horas. Después de cromatografía de
columna se obtuvo un rendimiento de 61%. ^{1}H NMR
(DMSOd_{6}): 2.06 (m, 1H, 2'), 2.33 (s, 3H, Me), 3.38 (m,
1H, 2'), 3.65 (m, 2H, 5'), 3.91 (q, 1H, 4'), 4.24 (m, 1H, 3'), 5.09
(t, 1H, OH-5'), 5.26 (d, 1H,
OH-3'), 6.18 (t, 1H, 1'), 6.41 (s, 1H,
H-5), 8.66 (s, 1H, H-4). ^{13}C
NMR (DMSO-d_{6}): 29.8 (Me), 40.3 (2'), 60.8 (5'), 69.9
(3'), 85.3 (1'), 88.1 (4'), 88.8 (C-5), 98.3
(C-4a), 144.8 (C-4), 147.8
(C-6), 150.1 (C-2), 162.1
(C-7a).
\vskip1.000000\baselineskip
A 500 mg (1.35 mmol) de
3-(\beta-D-2-desoxiribofuranosil)-6-metil-furo[2,3-d]pirimidin-2-ona
(3) en un balón de fondo redondo de 25 ml se agregaron 6 ml de
hidracina anhidra. La mezcla de de reacción se revolvió a
temperatura ambiente por dos horas. Luego se retiró el exceso de
hidracina evaporando bajo un alto vacío. El residuo se purificó
mediante cromatografía de columna con gel de sílice (cloroformo/MeOH
10:1) para producir un producto cristalino blanco opaco con un
rendimiento de 85%. Se obtuvieron cristales de calidad de rayos X a
partir de metanol. ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}): 1.80
(m, 1H, 2'), 2.14 (m, 1H, 2'), 2.49 (s, 3H, Me), 3.49 (m, 2H, 5'),
3.62 (q, 1H, 4'), 4.16 (m, 1H, 3'), 4.40 (s, 2H,
H-5), 4.79 (t,1H, OH-5'), 5.13
(d,1H, OH-3'), 6.24 (t, 1H,1'), 7.34 (s,1H,
H-4), 10.29 (bs, 1H, NH-8). ^{13}C
NMR (DMSO-d_{6}): 21.1 (Me), 35.1 (2'), 47.8
(C-5), 61.8 (5'), 70.6 (3'), 83.1 (1'), 86.0 (4'),
120.8 (C-4a), 124.8 (C-4), 151.8
(C-7), 153.2 (C-3), 155.2
(C-8a).
\vskip1.000000\baselineskip
A 140 mg (0.5 mmol) de
6-(\beta-D-2-desoxiribofuranosil)-5-hidro-3-metil-8H-pirimido[4,5-c][1,2]piridazin-7-ona
(4) seco en un balón de fondo redondo de 50 ml bajo argón se
adicionaron 5 ml de trimetilfosfato. La solución se enfrió (baño de
hielo) y se agregaron 70 \mul (0.75 mmol, 1.5 eq.) de oxicloruro
fosforoso (redestilado). La reacción se revolvió enfriando por una
hora. El análisis de TLC indicó que la reacción había estado
completa en un 70%. Después, se agregaron adicionalmente 25 \mul
(0.27 mmol, 0.51 eq.) de oxicloruro fosforoso y la reacción se dejó
revolviendo por una hora adicional. Ambos, pirofosfato de
tributilammonio de 1 M en DMF anhidra (2.5 ml, 2.5 mmol, 5 eq.) y
n-tributilamina (0.6 ml, 2.5 mmol, 5 eq.) se
adicionaron simultáneamente a la solución enfriada. Después de 30
minutos se agregó búfer de bicarbonato de trietilamonio de 1 M
(TEAB, pH = 7.0) a la mezcla de reacción hasta que la solución se
volvió neutral. El búfer se adicionó hasta un volumen final de 40
ml y la mezcla se revolvió durante una noche a temperatura
ambiental. La mezcla de reacción se evaporó bajo alto vacío hasta
una solución viscosa, diluida con agua y filtrado. El filtrado que
contenía trifosfato se aplicó luego a una columna de 50 x 300 mm
DeltaPak™ (15P, 100A) C18 HPLC que se eluyó usando un gradiente
lineal por 25 minuto con TEAB de 0.1 M (pH = 7.0) a TEAB de 0.1 M
en acetonitrilo al 25% a una velocidad de flujo de 130 ml por
minuto. Un pico que contiene el producto 5 se recogió en 10.5
minutes. Después de evaporar, el trifosfato obtenido se repurificó
en una columna de HPLC de 21 x 250 mm Synchropak™ Ax100 usando un
gradiente lineal por 30 minutos a 15 ml por minuto de 0.1 M TEAB en
40% CH_{3}CN a 1 M TEAB en 40% CH_{3}CN. 31P NMR (D_{2}O):
-9.26 (d); -10.20 (d); -22.43 (t). HPLC (\DeltaPAK C 18, 3.9 por
30 cm, 0.1 M TEAB (pH = 7.0) hasta 0.1 M TEAB en CH_{3}CN al 25%
en 30 minutes a 1 ml por minuto) 12.7 minutos. UV \lambdamax 237
nm y 292 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de síntesis
2
Se adicionó trietilamina (3.04 g, 4.2 mL, 30
mmol, 1.5 eq) a una solución revuelta de
5-yodo-2'-deoxiuridine
(7.1 g, 20 mmol, 1 eq), Pd[P(C6H5)3]4
(1.16 g, 1 mmol, 0.05 eq), CuI (0.38 g, 2 mmol, 0.1 eq) y
2,2,2-trifluoro-N-propargilo
acetamida (4.53 g, 30 mol, 1.5 eq) en DMF seco (75 mL) y la mezcla
resultantes se revolvió durante dos días a 55ºC bajo una atmósfera
inerte. A la mezcla de reacción se adicionó la forma bicarbonato de
resina AG1 X8 para retirar hidro-yoduro de
trietilamonio, resina CHELEX™ para retirar cationes metálicos y
carbón activado para remover el color. Después de filtrar por
celite™ se produjo una solución ligeramente amarilla. La remoción
del solvente al vacío y la cromatografía de gel de sílice dio un
rendimiento de 4.2 g (56%) de 6a. UV (MeOH) \lambdamax 324 nm; 1H
NMR (d6-DMSO) \delta (ppm) 10.07 (s, 1H,
intercambiable, H-NHCOCF_{3}), 8.78 (s, 1H,
H-6), 6.63 (s, 1H, H-C H =
C(O)CH_{2}), 6.18 (t, J = 6.55 Hz,
H-1'), 5.00-5.3 (bm, 2H,
intercambiable, 2xOH), 4.48 (m, 2H, H-C
H_{2}-NH), 4.23 (m, 1H, H-4'),
3.95 (m, 1H, H-3'), 3.63 (m, 2H,
H-5'), 2.40 (m, 1H, H-2'b), 2.07
(m, 1H, H-2'a)
El compuesto del título se preparó siguiendo el
procedimiento descrito para
3-(\beta-D-2-desoxiribofuranosil)-6-metilfuro
[2,3-d]pirimidin-2-ona.
^{1}H NMR (CD_{3}OD): 1.94 (m, 2H, 3'), 2.01 (s, 3H, Me), 2.18
(m, 1H, 2'), 2.57 (m, 1H, 2'), 3.75-4.06 (ddd, 2H,
5'), 4.27 (m, 1H, 4'), 4.52 (s, 2H, CH_{2}NH), 6.11 (dd, 1H, 1'),
6.65 (s, 1H, H-5), 9.13 (s, 1H,
H-4).
A 754 mg (2 mmol) de
3-(\beta-D-2-desoxiribofuranosil)-6-trifluoroacetamidometil-furo[2,3-d]pirimidin-2-ona
(6a) en un balón de fondo redondo de 25 ml se adicionaron 5 ml de
hidrazina anhidra. La mezcla de reacción se dejó revolviendo a
temperatura ambiente por 3 horas. El exceso de hidrazina fue
retirada entonces mediante evaporación bajo alto vacío. Al residuo
se agregaron 20 ml de metanol, 0.5 ml de trietilamina seguido de 5
ml de trifluoroacetato etílico. La mezcla de reacción se vuelve
homogénea después de revolverla una hora. Después de revolver por
una noche a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se evaporó y
el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía de columna
de sílice gelatinosa (EtOAc/MeOH 20:1). Se recogió un compuesto
cristalino amarillo pálido con un rendimiento de 86%. ^{1}H NMR
(DMSO-d_{6}): 1.79 (m, 1H, 2'), 2.15 (m, 1H, 2'), 3.49 (m,
2H, 5'), 3.61 (q, 1H, 4'), 4.15 (m, 1H, 3'), 4.46 (d, 2H,
H-5), 4.57 (d, 2H, CH_{2}NH), 4.81 (t, 1H,
OH-5'), 5.14 (d,1H, OH-3'), 6.24 (t,
1H,1'), 7.43 (s, 1H, H-4), 10.1 (t, 1H,
NH-TFA), 10.51 (s, 1H, NH-8).).
^{13}C NMR (DMSO-d_{6}): 35.1 (CH_{2}NH), 39.0 (2'),
42.8 (C-5), 61.7 (5'), 70.5 (3'), 83.0 (1'), 85.9
(4'), 117.9 (CF_{3}), 121.2 (C-4), 123.4
(C-4a), 152.7, 152.8 (C-3,
C-7), 154.2 (C-8a), 156.7 (q,
COCF_{3}).
La fosforilación de 200 mg (0.51 mmol) de
6-(\beta-D-2-desoxiribofuranosil)-5-hidro-3-trifluoroacetamidometil-8
H-pirimido[4,5-c][1,2]piridazin-7-ona
(7a) seca se llevó a cabo de la misma manera que se reportó arriba
para el compuesto 5. La mezcla cruda se aplicó a una columna de
HPLC de 50 x 300 mm DeltaPak™ (15P, 100A) C18 que se eluyó usando
un gradiente lineal por 25 minutos con TEAB (pH = 7.0) de 0.1 M
hasta TEAB 0.1 M en acetonitrile al 25% a una velocidad de flujo
de 130 ml por minuto. En 15 minutos se recogió un pico que contenía
el producto. Después de evaporar el trifosfato obtenido se
repurificó en una columna de HPLC de 21 x 250 mm Synchropak™ Ax100
usando un gradiente lineal por 30 minutos a 15 ml por minuto de TEAB
de 0.1 M en CH_{3}CN 40% hasta TEAB de 1 M en 40% CH_{3}CN. El
trifosfato se trató con NH_{4}OH concentrado por 30 minutos sin
cambio tal como se observó por medio de HPLC analítica verificando
que se haya retirado el grupo protector trifluoroacetilo antes de
este paso. ^{31}P NMR (D_{2}O): -9.65 (d), -10.86 (d), -22.54
(t). HPLC (\DeltaPAK C 18, 3.9 x 30 cm, TEAB 0.1 M (pH = 7.0)
hasta TEAB de 0.1 M en 25% CH_{3}CN en 30 minutos a 1 ml por
minuto) 12.2 minutos. UV \lambda max 241 nm y 293 nm.
La síntesis se llevó a cabo tal como se reportó
arriba para el compuesto 7a. Se recogió una espuma tostada con un
rendimiento de 65%. ^{1}H NMR (CD_{3}OD):
1.84-2.23 (m, 4H, 2',3'), 2.01 (s, 3H, Me),
3.58-3.78 (m, 2H, 5'), 3.99 (m, 1H, 4'),
4.50-4.71 (dd, 2H, H-5), 4.66 (s,
2H, CH_{2}NH), 6.22 (dd, 1H, 1'), 7.48 (s, 1H,
H-4).
La síntesis (a una escala de 0.73 mmol) y
purificación/aislamiento de 8b se llevó a cabo tal como se describe
para el compuesto 5.
6.0 \mumol (690 \muL de solución acuosa) de
8a se diluyeron con 310 \muL de un búfer
Na_{2}CO_{3}-NaHCO_{3} (pH = 9.4) y se
adicionó a una solución revuelta de éster Cy3-NHS
(7.2 Pmol, 1.2 eq.) en DMF (1.0 mL). Después de revolver 2 h a
temperatura ambiente, se aisló el conjugado de colorante Cy3 -
nucleótido (9a) (35%) purificando sobre una columna de HPLC de
Q-Sefarose™ (10 x 16 mm), usando un gradiente lineal
de búfer A (CH_{3}CN al 40% en TEAB 0.1 M) hasta un búfer B
(CH_{3}CN al 40% en TEAB de 1.0 M) en 60 minutos a 5 mL/min. TOF
MS ES-m/z, cono 100v, CH_{3}CN/H_{2}O:1144
(MH-3).
El conjugado colorante fluorescente nucleótido
Cy5.5 (9a') se sintetizó y aisló (33% de rendimiento) a una escala
similar haciendo reaccionar 8a con éster Cy5.5 NHS tal como se
describió para 9a.
8.0 \mumol (solución acuosa) de 8a se diluyó
con 1.0 mL de búfer Na_{2}CO_{3}-NaHCO_{3} (pH
= 9.0) y a la solución revuelta se agregó solución en DMSO anhidra
de éster
(5,6)-carboxi-x-NHS
(17.0 \mumol, 2.1 eq.). Después de 2 h, el nucleótido etiquetado
con colorante se purificó en una columna de
Q-Sefarose™ tal como se describió para 9a para dar
9a''. TOF MS ES-m/z, cono 100v, CH_{3}CN/H_{2}O:
1003 (MH-3).
1.16 g (4.1 mmol) de 4 se
co-evaporó con piridina anhidra y se
re-disolvió en 30 mL de piridina anhidra. 4.15 g
(12.24 mmol, 3 eq.) de DMT-Cl se adicionó a la
solución revuelta de 4, a temperatura ambiente bajoatmósfera de Ar.
Después de 3.5 h, la mezcla de reacción se evaporó a presión
reducida y el residuo se disolvió en CHCl_{3}. La capa orgánica
se lavó con solución saturada de NaHCO_{3}, secada con
Na_{2}SO_{4} anhidra y evaporada a presión reducida. El residuo
obtenido se purificó en una columna de sílice gelatinosa fluyendo
con CHCl_{3} seguido de MeOH al 5% en CHCl_{3} para producir 10
(2.35 g, 99%). TOF MS ES-m/z, cono 100v, CH3CN/0.1 M
TEAB: 581.24 (MH-1).
583 mg (1.0 mmol) de compuesto 10 se
co-evaporó con piridina anhidra seguido de tolueno y
se disolvió en diclorometano anhidro (5 mL). A la solución revuelta
bajo una corriente lenta de Ar, a temperatura ambiente, se adicionó
0.7 mL (4.0 mmol, 4.0 eq.) de
N,N-diisopropiletilamina seguido de una adición a
gotas de 2-cianoetoxi N,
N-diisopropilaminoclorofosfina (0.28 mL, 1.25 mmol,
s). Después de 30 min, TLC en MeOH-CHCl_{3} al
10% indicó que la reacción se completó. La mezcla de reacción se
diluyó con CH_{2}Cl_{2}, se lavó con Na_{2}CO_{3} al 10%, y
la capa orgánica después de secarse (Na_{2}SO_{4} anhidro) se
evaporó a presión reducida. El residuo obtenido se purificó en una
columna de gel de sílice (4 x 13 cm) eluyendo con
CH_{2}Cl_{2}:EtOAc:Et_{3}N (2.9:7:0.1) para dar 11 (570 mg,
73%). ^{31}P NMR (CDCl3): \delta149.66.
Se usó un ensayo de extensión de iniciador para
evaluar el trifosfato 5 como un subtrato para polimerasa I de
fragmento de ADN Klenow libre de exonucleasa (EFK). El ensayo usó un
extremo de iniciador hibridizado etiquetado conP 5' de un 15 mer
hasta una plantilla 24 mer. Las secuencias del iniciador y la
plantilla son
- Iniciador
\hskip0.5cm
5' TGCATGTGCTGGAGA 3'
- Plantilla
\hskip0.6cm
3' ACGTACACGACCTCTGAACTAGTC 5'
Un picomol de iniciador etiquetado con ^{33}P
se hibridizó hasta 2 picomoles de plantilla en búfer x2 de Klenow
(100 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl_{2}, 10 mM
2-mercaptoetanol). A esto se adicionó o bien 4
\muM dNTP\alphaS o 40 \muM (compuesto de prueba 5c) o una
mezcla de 4 \muM dNTP\alphaS y 40 \muM (compuesto de prueba).
Una unidad EFK y 20 mU de pirofosfatasa inorgánica se usaron por
reacción. También se llevaron a cabo controles del iniciador solo,
del iniciador más la plantilla. Las reacciones se incubaron a 37ºC
por 3 minutos. Las reacciones se detuvieron mediante la adición de
una solución de detención formamida/EDTA. Los productos de reacción
se separaron en poliacrilamida al 20% de urea gelatinosa de 7 M y
los fragmentos de producto tomados en comparación con el iniciador
etiquetado y los productos de entesión en presencia de 4PM
dNTP\alphaS después de exponerse a una película de
autoradiografía Kodak Biomax™.
Esto mostró que el compuesto de prueba era un
substrato para EFK y que se incorporó en lugar de dTTP. Otros
compuestos de la invención contienen grupos tales como fluoresceína
o cianina se pueden incorporar mediante métodos similares.
Claims (17)
1. Un compuesto que tiene la estructura
Q es H o un azúcar o un análogo de azúcar o una
espina dorsal de ácido nucleico o un análogo de espina dorsal donde
X es H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo,
hetero-arilo o una combinación de los mismos o un
informador, Y = O, S, NR donde R es H, alquilo, alquenilo
alquinilo.
2. Un compuesto tal como se reivindicó en la
reivindicación 1, el cual es a) un nucleósido o análogo de
nucleósido donde Q es
donde
Z es O, S, Se, SO, NR^{9} o CH_{2}, donde
R^{9} es H, alquilo, alquenilo, alquinilo o un informador,
R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4} son los
mismos o diferentes y cada uno es H, OH, F, NH_{2}, N_{3},
O-hidrocarbilo, NHR o un grupo funcional
informador,
donde R es alquilo, alquenilo o alquinilo,
R^{5} es OH, SH o NH_{2} o mono-, di o
trifosfato o tiofosfato, o boranofosfato correspondiente, o uno
de
R^{2}, R^{4}, y R^{5} es una fosforamidita
u otro grupo para incorporación en una cadena polinucleótida, o un
grupo funcional informador,
o Q consiste en una de las siguientes
estructuras de azúcar modificadas
donde R^{12} es alquilo de
C_{1}-C_{4}, hidroxi alquilo de
C_{1}-C_{4}, o H, preferiblemente metilo,
hidroximetilo o H, y donde R^{14} es alquilo de
C_{1}-C_{6}, hidroxialquilo de
C_{1}-C_{6}, alquiloamina de
C_{1}-C_{6}, carboxialquilo de
C_{1}-C_{6}, o preferiblemente un grupo
funcional
informador,
o b) un polinucleótido donde Q es una espina
dorsal de ácido nucleico que consiste de fosfato de azúcar repetido
o fosfato de azúcar repetido modificado (LNA), o un análogo de
espina dorsal tal como un péptido o un ácido nucleico poliamídico
(PNA).
3. Un compuesto tal como se reivindicó en
cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde está presente un
grupo funcional informador.
4. Un compuesto tal como se reivindicó en la
reivindicación 3, donde el grupo funcional informador es un grupo
funcional de señal.
5. Un compuesto tal como se reivindicó en la
reivindicación 3 o en la reivindicación 4, donde el grupo funcional
informador es un grupo reactivo o un grupo funcional de señal o una
superficie sólida unida al resto de la molécula mediante un
enlazador de hasta 30 átomos.
6. Un compuesto tal como se reivindicó en las
reivindicaciones 1 hasta 5 donde X imparte una carga positiva o
negativa a la base nucleótida.
7. Un compuesto tal como se reivindicó en
cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 6 donde R^{5} es
trifosfato.
8. Un compuesto tal como se reivindicó en
cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 5, donde uno de R^{2},
R^{4} y R^{5} se selecciona de fosforamidita y
H-fosfonato.
9. Un polinucleótido que comprende por lo menos
un residuo de un análogo de nucleótido de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 hasta 8.
10. Un polinucleótido tal como se reivindicó en
la reivindicación 9 el cual es ADN o ARN.
11. Un método de extensión de cadena que
comprende hacer reaccionar un polinucleótido con un análogo de
trifosfato de nucleósido de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 en presencia de una polimerasa o una enzima
terminal de transferasa de desoxinucleotidilo.
12. Un método de detectar el polinucleótido de
acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10, dicho
método comprende usar para detección un anticuerpo que se enlaza a
la base del residuo análogo de nucleósido.
13. Un método de hacer cDNA, el cual comprende
incubar una plantilla de ARN con una mezcla de monómero que incluye
un análogo de nucleótido como se reivindicó en cualquiera de las
reivindicaciones 1 hasta 7 en presencia de una transcriptasa
inversa.
14. Un método de amplificar un polinucleótido
mediante PCR, dicho método comprende usar una mezcla de monómero
que incluya un análogo de nucleótido tal como se reivindicó en
cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 7.
15. Uso de un compuesto de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 8, como una etiqueta para
análisis mediante espectrometría de masas.
16. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 hasta 8, para uso en terapia.
17. Un compuesto de acuerdo con la
reivindicación 16 para uso como agente antiviral.
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