JPH11513388A

JPH11513388A - 選択的結合性相補的オリゴヌクレオチド

Info

Publication number: JPH11513388A
Application number: JP9514458A
Authority: JP
Inventors: カトヤビン，イゴール・ブイ; ウー，ジンスク; ルクタノフ，ユージェニー・エイ; メイヤー，リッチ・ビー・ジュニア; ガンパー，ハワード・ビー
Original assignee: エポック・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
Priority date: 1995-10-04
Filing date: 1996-10-02
Publication date: 1999-11-16
Also published as: US5912340A; WO1997012896A1; AU7205596A

Abstract

(57)【要約】オリゴヌクレオチド（ＯＤＮs）の適合対において、その対の各構成員は、ワトソン・クリック型で、標的配列の２つの鎖がそれ自身お互いに相補的であるような二本鎖核酸の標的配列に対して相補的または実質的に相補的である。ＯＤＮsは、天然のパートナー塩基とは安定に水素結合した塩基対を形成するが修飾されたパートナーとは安定に水素結合した塩基対を形成しないような性質の修飾塩基を含む。これは、ハイブリダイズした構造において、修飾塩基がその天然の相補的塩基と２つまたはそれ以上の水素結合を形成できるが、修飾されたパートナーとは１つしか水素結合を形成できない場合に達成される。お互いに安定な水素結合を形成できないため、オリゴヌクレオチドの適合対は、生理的または実質的に生理的な条件下でおよそ４０℃またはそれ以下の融解温度を有する。しかしながら、本発明の各適合ＯＤＮ対は、二本鎖核酸の各鎖において標的配列と実質的に安定なハイブリッドを形成する。本発明のＯＤＮ対により形成された標的二本鎖核酸のハイブリッドは、遺伝子マッピングや診断および治療的応用に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】選択的結合性相補的オリゴヌクレオチド発明の背景１．発明の分野本発明は、オリゴヌクレオチド適合対の各構成員がお互いとは安定なハイブリッドを形成できないのに、相補的非修飾ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖とは安定な配列特異的ハイブリッドを形成できるような、修飾塩基を含むオリゴヌクレオチドに関する。本発明は、また、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ中の特異的配列に対するアンチ−センスやアンチ−遺伝子（anti-gene）要因およびプローブなどのオリゴヌクレオチドの使用に関する。２．従来技術の簡単な説明オリゴヌクレオチド（ＯＤＮs）は二本鎖ＤＮＡ中やＤＮＡまたはＲＮＡ二次構造中の相補的配列と容易にハイブリダイズしないことはよく知られている。それにもかかわらず、二次構造において二本鎖ＤＮＡや一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡに配列特異的に接近する能力が遺伝子マッピング、診断および治療的応用に多大な有用性を有することもまた知られている。範囲は限られているが、ＯＤＮを二本鎖核酸へハイブリダイゼーションするという従来技術の既知法には、三本鎖形成（Troel，S.等、Science 1991,254,1639参照）、分岐点捕獲反応(branch capt ure reaction)(Weinstock,P.等、Nucl.Acids Res.1990,18,4207)、リコンビナーゼ介在対合(synapsis)(Roca,A.I.等、Rev.Biochem.Mol.Biol.1990,25,415)およびハイブリダイズしたＯＤＮを二本鎖核酸の少なくとも一方の鎖へ架橋させる方法（ＰＣＴ出願ＷＯ９３／０３７３６、１９９３年３月４日公開）がある。しかしながら、当分野では依然として、配列特異的に二本鎖核酸にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドに対する多大な需要や開発の余地がある。本発明はそのようなオリゴヌクレオチドを提供するものである。発明の概要本発明によれば、対の各構成員がワトソン・クリック型で標的二本鎖配列に対して相補的または実質的に相補的である、オリゴヌクレオチド（ＯＤＮs）適合対を提供する。しかしながら、このＯＤＮは修飾塩基を含み、その修飾塩基は天然のパートナー塩基とは安定に水素結合した塩基対を形成するが、修飾されたパートナーとは安定に水素結合した塩基対を形成しないような性質である。要するに、ハイブリダイズした構造において、この修飾塩基はその天然の相補的塩基と２またはそれ以上の水素結合を形成できるが、修飾されたパートナーとは１つしか水素結合を形成できないかまたは全く形成できないということである。従って、本発明のオリゴヌクレオチド適合対は、（生理的または実質的に生理的な条件下）融解温度がおよそ４０℃またはそれ以下であることから明らかなように、お互いとは実質的に安定な水素結合ハイブリッドを形成しない。しかしながら、本発明のＯＤＮsは、二本鎖核酸の各鎖において標的配列と実質的に安定なハイブリッドを形成する。（一本鎖ＯＤＮと二本鎖核酸との間に形成されるハイブリッドと比較した場合）このようなハイブリッドでは水素結合数が増大(およそ２倍) するため、本発明のＯＤＮ対から形成されたハイブリッドはより安定であり、遺伝子マッピング、診断および治療的用途に適している。本発明のＯＤＮsを選択的結合性相補的（ＳＢＣ）ＯＤＮsと名付け、本特許出願中ではその名称で呼ぶ。本発明のＳＢＣＯＤＮsは、所望により、各ＯＤＮが標的配列の一方の鎖にハイブリダイズするのを妨害しないような性質の共有“テザー”によりお互いに連結させてもよい。本発明のＳＢＣＤＮsは、所望により、糖部分やホスフェート主鎖を修飾することもでき、架橋基および／またはレポーター基を結合させてもよい。発明の詳細な説明本出願の概要で記述したとおり、本発明のＳＢＣＯＤＮsの重要な特徴は、ＳＢＣＯＤＮsの適合対のそれぞれ一方が二本鎖核酸中の一標的配列に相補的または実質的に相補的であり、その標的配列自身はお互いに相補的または実質的に相補的であること、およびＳＢＣＯＤＮsの適合対のそれぞれ一方が標的配列の一方の鎖と安定に水素結合したハイブリッドを形成することである。ＳＢＣＯＤＮ中に修飾塩基が存在するため、これらのＯＤＮsはお互いに相補的であっても、融解温度がおよそ４０℃またはそれ以下であることから明らかなように、安定に水素結合したハイブリッドを形成できない。そのため、ＳＢＣＯＤＮsはお互いとはハイブリダイズしないが、特に標的が長い二本鎖ＤＮＡ中にある場合、リコンビナーゼ酵素の存在下で標的配列の両方の鎖と容易にハイブリダイズする。当分野で十分に確立された常識によると、核酸の天然起源のヌクレオチド成分は、Ａ、Ｕ、ＧおよびＣ(ＲＮＡ)、そしてdＡ、dＴ、dＧおよびdＣ（ＤＮＡ）と呼ばれる。下記の説明から明らかになるように、本発明は、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの両方に適用されるので、特記しないかぎり、ＡとdＡ、ＵとdＴ等の記載にはなんら区別をつける必要はない。ＯＤＮ−核酸またはＯＤＮ−ＯＤＮ相互作用においてＴ'ではなくＴ（またはＲＮＡの場合Ｕ）と安定な水素結合対を形成させるために塩基部分で修飾したＡの類似体はＡ'と呼ぶ。ＯＤＮ−核酸またはＯＤＮ−ＯＤＮ相互作用においてＡ' ではなくＡと安定な水素結合対を形成させるために塩基部分で修飾したＴの類似体はＴ'と呼ぶ。ＯＤＮ−核酸またはＯＤＮ−ＯＤＮ相互作用においてＣ'ではなくＣと安定な水素結合対を形成させるために塩基部分で修飾したＧの類似体はＧ 'と呼ぶ。ＯＤＮ−核酸またはＯＤＮ−ＯＤＮ相互作用においてＧ'ではなくＧと安定な水素結合対を形成させるために塩基部分で修飾したＣの類似体はＣ'と呼ぶ。前述の条件を満たすのは、Ａ'、Ｔ'、Ｇ'およびＣ'ヌクレオチドそれぞれ（集合的には修飾ＳＢＣヌクレオチド）が、ＯＤＮ− 核酸またはＯＤＮ−ＯＤＮ相互作用においてその天然のパートナーとは２つまたはそれ以上の水素結合を形成するが、その修飾ＳＢＣヌクレオチドパートナーとは１つしか水素結合を形成しないか全く形成しない場合である。このことは、式１a、１b、２a、２b、３a、３b、４aおよび４bに例示しており、ここでは、天然Ａ−Ｔ（またはＲＮＡの場合Ａ−Ｕ）およびＧ−Ｃ対間の水素結合形成および例示的にＡ'−Ｔ、Ｔ'−Ａ、Ｇ'−Ｃ、−Ｃ'−Ｇ、Ａ'−Ｔ'およびＧ'−Ｃ'対間の水素結合形成を示している。両ＳＢＣＯＤＮs中の相補的位置を修飾して、適合組の対が安定なハイブリッドを形成しないように、言い換えれば、生理的条件下で、それがおよそ４０℃またはそれ以下の融解温度を持つように、十分な数の修飾ＳＢＣヌクレオチドを本発明のＳＢＣＯＤＮの適合対へ組み込む。そのためにＯＤＮの各天然ヌクレオチドを修飾ＳＢＣヌクレオチドに置換する必要はない。しかしながら、適合対の両構成員は二本鎖または二本鎖核酸中の標的配列と相補的であり、標的二本鎖の２つの鎖または部分はそれ自身お互いに相補的または実質的に相補的である。下記により詳細に説明するとおり、本発明のＳＢＣＯＤＮの重要な用途は、ヘアピンループ構造のような、ｍＲＮＡ自身が二本鎖を形成している場合のｍＲＮＡ二次構造とのハイブリダイゼーションである。ｍＲＮＡとリボゾームＲＮＡの二次構造は、厳密な意味での２つの鎖を持たないことは知られている。それにもかかわらず、本説明においては、特記しないかぎり、二本鎖核酸の“２つの鎖”という専門用語は、二本鎖ｍＲＮＡ並びに二本鎖リボゾームＲＮＡの２つの相補的部分を表すこととする。二本鎖ＤＮＡやｍＲＮＡおよびリボゾームＲＮＡの二次構造の一般的概念は、本説明では“二本鎖（duplex）核酸”という用語に包括される。“ＲＮＡ”という用語は、生物中のあらゆる機能性ＲＮＡ、例えば、メッセンジャーＲＮＡ、転移ＲＮＡ、リボゾームＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ等に適用できる。要するに、本発明のＳＢＣＯＤＮsは、修飾ＳＢＣヌクレオチドの他にも天然起源のヌクレオチドを含み、またその他の微量の天然起源ヌクレオチドまたは上記のように化学的に修飾したヌクレオチドも含むことができ、ただしかかる修飾がＯＤＮの相補的結合能と有意に抵触しない場合に限る。本発明のＳＢＣＯＤＮsの重要な実施態様には、ＯＤＮの１またはそれ以上のヌクレオチドに共有結合したレポーター基および／または架橋機能がある。これらの実施様態は下記に詳細に記載する。本発明のＳＢＣＯＤＮsは、リボースまたは２−デオキシリボース以外のペントフラノース部分、並びにリボースおよび２−デオキシリボースの誘導体、例えば、３−アミノ−２−デオキシリボース、２−フルオロ−２−デオキシリボースおよび２−Ｏ−Ｃ_1-6アルキルまたは２−Ｏ−アリルリボース、特に２−Ｏ−メチルリボースを含むことができる。グリコシド結合は、α配置のものでもβ配置のものでもよいが、好ましくはβ配置である。本発明のＳＢＣＯＤＮのホスフェート主鎖は、ホスホロチオエート結合を含むことができる。更に、架橋剤、レポーター基、脂肪親和性基（コレステロースおよび関連“ステロイド”誘導体を含む）インターカレーター、副溝結合剤、並びにアルキル、ヒドロキシアルキルまたはアミノアルキルテイルをＳＢＣＯＤＮsの３'−または５' −ホスフェート末端に結合させてもよい。本発明のＳＢＣＯＤＮ中のヌクレオチド基礎単位数は重要でなく、一般的には、およそ５から９９の範囲である。本発明の範囲内で好ましい種類の、ＳＢＣＯＤＮに組み込んだ３'−ホスフェート（またはホスホロチオエート）として示した修飾Ａ類似体Ａ'の一般構造は、式５、６および７に与えており、式中、ＸはＮまたはＣＨであり；ＹはＯまたはＳであり；ＺはＯＨまたはＣＨ₃であり；ＲはＨ、ＦまたはＯＲ₂であり、Ｒ₂はＣ_1-6アルキルまたはアリル、もしくはＲＮＡの場合はＨであり、Ｒ₁はＣ_1-4アルキル、Ｃ_1-4アルコキシ、Ｃ_1-4アルキルチオ、ＦまたはＮＨＲ₃ であり、Ｒ₃はＨまたはＣ_1-4アルキルであり、ここで、プリンの８位、ピラゾロピリミジンの３位またはピロロピリミジンの５位は、所望により、下記のように架橋機能またはレポーター基の結合点として働く。ＳＢＣヌクレオチドＡ'の好ましい実施態様は、式１ｂに示したように塩基として２,６−ジアミノプリン（２−アミノアデニン）を持つ。この後者のヌクレオチドは適宜２−amＡまたは d２−amＡと略す。本発明の範囲内で好ましい種類の、ＳＢＣＯＤＮに組み込んだ３'−ホスフェート（またはホスホロチオエート）として示した修飾Ｔ類似体Ｔ'の一般構造は、式８に与えており、式中、Ｙ、ＺおよびＲは上記定義のとおりであり、Ｒ₄はＨ、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_1-6アルケニル、Ｃ_1-6アルキニルであるか、または所望により、ピリミジンの５位は、下記のように架橋機能またはレポーター基の結合点として働く。ＳＢＣヌクレオチドＴ'の好ましい実施態様は、式２ｂに示したように塩基として２−チオ−４−オキソ−５−メチルピリミジン(２−チオチミン)を持つ。この後者のヌクレオチドは適宜２−sＴまたはd２−sＴと略す。本発明の範囲内で好ましい種類の、ＳＢＣＯＤＮに組み込んだ３'−ホスフェート（またはホスホロチオエート）として示した修飾Ｇ類似体Ｇ'の好ましいクラスの一般構造は、式９、１０および１１に与えており、式中、ＲはＨ、Ｃ_1-4アルキル、Ｃ_1-4アルコキシ、Ｃ_1-4アルキルチオ、ＦまたはＮＨＲ₃であり、Ｒ₃は上記定義のとおりであり、Ｘ、Ｙ、ＺおよびＲは、上記定義のとおりであり、プリンの８位、ピラゾロピリミジンの３位またはピロロピリミジンの５位は、所望により、下記のように架橋機能またはレポーター基の結合点として働く。ＳＢＣヌクレオチドＧ'の好ましい実施態様は、式３ｂに示したように塩基として６−オキソ−プリン（ヒポキサンチン）を持つ。この後者のヌクレオチドは適宜ＩまたはdＩと略す。本発明の範囲内で好ましい種類の、ＳＢＣＯＤＮに組み込んだ３'−ホスフェート（またはホスホロチオエート）として示した修飾Ｃ類似体Ｃ'の一般構造は、式１２および１３に与えており、式中、Ｙ、Ｚ、ＲおよびＲ₄は上記定義のとおりであるか、または所望により、ピリミジンの５位は、下記のように架橋機能またはレポーター基の結合点として働き；Ｚ₁はＯまたはＮＨであり、Ｒ₅はＨまたはＣ_1-4アルキルである。ＳＢＣヌクレオチドＣ'の好ましい実施態様は、式４ｂに示したように塩基としてピロロ−[２,３−ｄ]ピリミジン−２(３Ｈ)−オンを持つ。この後者のヌクレオチドは適宜ＰまたはdＰと略す。上記のように、本発明のＳＢＣＯＤＮsは、対の構成員がお互いに共有結合しない適合対において利用される。その他の実施態様では、ハイブリダイゼーションと関係がなく、２つの構成員（それぞれが二本鎖核酸の一方の標的配列に相補的である）が標的配列の２つの鎖にハイブリダイゼーションするのを妨害しない共有結合によって、適合対の２つの構成員をお互いと共有的に結合（テザー結合）させてもよい。適合対の２つのＳＢＣＯＤＮsをお互いに連結させるための“ テザー”として適した連結基には、（水素結合形成を避けるために）大まかに選択したおよそ１から１０のヌクレオチドを持つヌクレオチド配列がある。このテザーの具体例は、Ｔ'を４つ持つＯＤＮ部分である。あるいは、テザー結合には、ｎ"が１ないし１０である原子団−[ＯＣＨ₂−ＣＨ₂]n"−Ｏ−があり得る。架橋基を担持するＳＢＣＯＤＮ本発明のＳＢＣＯＤＮsの中でも重要なものは、架橋機能または基を持つものである。架橋機能または基は、それ自身が（上記定義の）ＳＢＣヌクレオチドであるヌクレオチドまたはその他の“天然”または修飾ヌクレオチドに結合させることができ、複素環式塩基、糖またはホスフェート、好ましくは末端ホスフェート部分に結合させることができる。架橋基または機能は、二本鎖核酸の標的配列にＳＢＣＯＤＮがハイブリダイズした後に、架橋機能がＳＢＣＯＤＮを標的へ共有結合させるという役目を果たす。当業者ならば容易に認識できるとおり、共有架橋は、診断、分析またはその他の調査目的のプローブとしての、あるいは治療用アンチ−センスおよびアンチ−遺伝子剤としてのＳＢＣＯＤＮs の効率および効果を高める。架橋基または機能をＳＢＣＯＤＮsの適合対の一方または両方の構成員に結合させることもでき、そうすることで、標的配列の一方または両方の鎖をこの種のＳＢＣＯＤＮsにより共有的に結合（アルキル化）された状態にすることができる。前述からみて、本発明に組み込まれる架橋剤は、（１）各架橋剤はＳＢＣＯＤＮ上のある部位に共有結合し、（２）その長さおよび立体配向は、ＳＢＣＯＤＮが標的にハイブリダイズするかまたは標的と複合体を形成した後に標的配列中の適切な反応部位に届くようなものであり、（３）標的配列の反応性求核基と反応する反応性基を持つ、という要件を満たす。最も簡単に言えば、架橋剤自身は、概念的に２つの基または部分に分けることができ、即ち、典型的に好ましくは求電子性脱離基（Ｌ）である反応性基と脱離基ＬをＳＢＣＯＤＮ上のそれぞれの部位に結合させる“アーム”（Ａ*）である。脱離基Ｌは、例えば、クロロ、ブロモ、ヨード、ＳＯ₂Ｒ"'またはＳ⁺Ｒ'"Ｒ"" などの基から選択でき、ここで、Ｒ'"およびＲ""はそれぞれ独立してＣ_1-6アルキルまたはアリールであるか、またはＲ'"およびＲ""が一緒になってＣ_1-6アルキレンブリッジを形成している。クロロ、ブロモおよびヨードが好ましい。これらの基の中では、−ＣＯＣＨ₂Ｉなどのハロアセチル基および−Ｎ−[(ＣＨ₂)₂− Ｃ1]₂などの二官能性“ナイトロジェンマスタード”が好ましい。脱離基は、その脱離基能力に合わせて変える。個々の脱離基の性質および反応性に合わせて、使用する基をそれぞれの場合で選択し、不可逆的に結合するプローブまたは化学治療剤に対して望ましい特異性を与える。上記のように、“アーム”（またはリンカーアーム）Ａ*は、概念的にはＳＢＣＯＤＮを脱離基Ｌに共有結合させ、脱離基ＬをＳＢＣＯＤＮに対し所望の距離および立体位置に維持する単一物とみなすことができるが、実際には“アーム”Ａ*は、二官能性分子がその第１官能性によりＳＢＣＯＤＮに共有結合（例えば、３'または５'末端へのホスフェートエステル結合または複素環塩基への炭素−炭素結合による）し、更に、その第２官能性（例えばアミン）により次に脱離基を担持する“ヒドロカルビルブリッジ”（アルキルブリッジ、アルキルアリールブリッジまたはアリールブリッジなど）へ共有結合する合成スキームにて構築できる。よって、架橋機能の一般式は、−Ａ*−Ｌまたは−Ａ*-Ｌ₂、式中Ｌは上記定義の脱離基であり、Ａ*はＳＢＣＯＤＮに共有結合する部分である、である。Ａ* “アーム”部分自身は、ＳＢＣＯＤＮが標的核酸配列とハイブリダイゼーションする条件下で（脱離基Ｌによる以外は）未反応性であるべきであり、脱離基Ｌを標的配列中のグアノシン残基のＮ−７位などの所望の反応部位からみて望ましい立体位置と距離に維持すべきである。一般に、Ａ*基の長さは、およそ２ないし５０炭素の通常のアルキル鎖の長さに等しくあるべきである。好ましい実施態様の架橋機能種のより具体的な式の一例は、 −(ＣＨ₂)q-Ｙ*−（ＣＨ₂）_m−Ｌ式中、Ｌは上記定義の脱離基であり、ｍと５ｑはそれぞれ独立して０から８までであり、Ｙ*は“機能性連結基”と定義される、である。“機能性連結基”は、２つの官能性、例えば−ＮＨ₂と−ＯＨ、または −ＣＯＯＨと−ＯＨ、または−ＣＯＯＨと−ＮＨ₂を持つ基であり、これらは、( ＣＨ₂)_qおよび(ＣＨ₂)_mブリッジをつなげることができる。アセチレン末端（ＨＣ≡Ｃ−）もまた、下記のように、ある種の複素環に結合でき、その後、水素化することができるため、Ｙ*の前駆体として適切な官能性である。好ましい実施態様の架橋機能種のより具体的な式の他の例は、 -(ＣＨ₂)q-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨ₂)_m-(Ｘ*)_n-Ｎ(Ｒ₁)-(ＣＨ₂)_p-Ｌおよび -(ＣH₂)q'-Ｏ-(ＣH₂)q"-ＮＨ-ＣＯ-(ＣＨ₂)_m-(Ｘ*)_n-Ｎ(Ｒ₁)-(ＣＨ₂)p-Ｌ式中、ｑ、ｍおよびＬは上記定義のとおりであり、ｑ'は３から７までであり、ｑ"は１から７までであり、Ｘ*は、フェニルまたは簡単な置換フェニル（例えば、クロロ、ブロモ、低級アルキルまたは低級アルコキシ置換フェニル）であり、ｎは０または１であり、ｐは１から６の整数であり、Ｒ₁はＨ、低級アルキルまたは(ＣＨ₂)p-Ｌである、である。好ましくは、ｐは２である。当業者ならば、構造−Ｎ(Ｒ₁)−(ＣＨ₂)₂−Ｌが強力なアルキル化剤の一種である“ナイトロジェンマスタード”を表すことが分かるであろう。本発明のこの種のＳＢＣＯＤＮsの中で特に好ましいのは、架橋剤が官能性−Ｎ(Ｒ₁)−(ＣＨ₂)₂−Ｌ、式中Ｌはハロゲン、好ましくは塩素である、を含むようなものであり、この種の中でも一層好ましいのは、架橋剤が原子団−Ｎ−[(ＣＨ₂)₂−Ｌ]₂（“二官能性”Ｎ− マスタード）を含むような修飾ＳＢＣＯＤＮsである。架橋剤の特に好ましい部分構造には、原子団 −ＣＯ−(ＣＨ₂)₃−Ｃ₆Ｈ₄−Ｎ−[(ＣＨ₂)₂Ｃl]₂− がある。特に好ましい実施態様では、今述べた架橋基を下記の構造：Ｒ'−Ｏ−(ＣＨ₂)₆−ＮＨ−ＣＯ−(ＣＨ₂)₃−Ｃ₆Ｈ₄−Ｎ−[(ＣＨ₂)₂Ｃl]₂ 式中、Ｒ'はＳＢＣＯＤＮの末端５'または３'ホスフェート基を表す、に従い、ＳＢＣＯＤＮの５'および３'末端でｎ−ヘキシルアミン担持テイルに結合させる。Ａ*−Ｌ基のその他の例は、特に、オリゴヌクレオチド中の複素環塩基に（例えば、２'−デオキシウリジンの５位に）結合させた場合、３−ヨードアセトアミドプロピル、３−(４−ブロモブチルアミド)プロピル、４−ヨードアセトアミドブチルおよび４−(４−ブロモブチルアミド)ブチル基である。その他の好ましい実施態様によると、架橋官能性を複素環塩基、例えば、ＳＢＣＯＤＮの２'−デオキシウリジル酸基礎単位のウラシル部分に共有結合させる。更にその他の好ましい実施態様では、“アーム−脱離基結合物”をＳＢＣＯＤＮの２'−デオキシウリジル酸基礎単位の５位に炭素−炭素結合により結合させる。一般に、５−置換−２'−デオキシウリジンは、反応スキーム１に示したように、Robins等（Can.J.Chem.,60:554(1982);J.Org.Chem.,48:1854 (1983))の総括的方法を適用して得ることができる。この適用に従い、置換１− アルキンを５−ヨード−２'−デオキシウリジンへパラジウム媒介結合させてアセチレン結合生成物を得る。アセチレンdＵrd類似体を例えばラネーニッケルで還元して、飽和化合物を得、次いで、これを下記のように自動ＤＮＡ合成機用の試薬へと直接転化するのに使用する。反応スキーム１では、ｑは上記定義のとおりであり、Ｙ'はＹ*（上記定義）かまたはＹ*の適切な保護誘導体かのいずれかである。Ｙ'もまた、保護アミンのような、適切に保護した求核性官能基を末尾にもつ基として定義できる。このスキームに従い５−ヨード−２'−デオキシウリジンに結合させることができる試薬の例は、ＨＣ≡ＣＣＨ₂ＯＣＨ₂ＣＨ₂Ｎ(ＣＯ)₂Ｃ₆Ｈ₄(フタルイミドエトキシプロピン)、ＨＣ≡ＣＣＨ₂ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨＣＯＣＦ₃（トリフルオロアセトアミドエトキシプロピン）、ＨＣ≡ＣＣＨ₂Ｎ( ＣＯ)₂Ｃ₆Ｈ₄(フタルイミドプロピン)およびＨＣ≡ＣＣＨ₂ＮＨＣＯＣＦ₃（トリフルオロアセトアミドプロピン）である。これらの例では、このスキームで得られたヌクレオシドを所望のＳＢＣＯＤＮに組み込み、架橋剤のアルキル化部分をそれぞれのフタルまたはトリフルオロアセチル保護基の除去後のみ“Ｙ'”の末端アミノ基に結合させる。 “アーム−脱離基結合物”(Ａ*−Ｌ)の特に好ましいもう一つの例は、ナイトロジェン−マスタード型アルキル化剤をＳＢＣＯＤＮの５−(３−アミノプロピル)−２'−デオキシウリジン基礎単位のアミノ官能基へ結合させたものである。５−(３−アミノプロピル)−２'−デオキシウリジンヌクレオシド部分を含むＯＤＮ合成に適したヌクレオチド基礎単位は、反応スキーム１と同様にして、また Meyer等、J.Am.Chem.Soc.1989,111,8517の教示に従い、得ることができる。この特に好ましい実施態様では、５−(３−アミノプロピル)−２'−デオキシウリジン部分を有するヌクレオチドを常用の合成によりＳＢＣＯＤＮに組み込み、ＳＢＣＯＤＮと活性化形態の“ナイトロジェンマスタード”、例えば、２,３,５, ６−テトラフルオロフェニル-４'−[ビス(２−クロロエチル)−アミノ]フェニル −ブチレート（クロラムブシル２,３,５,６−テトラフルオロフェニルエステル；クロラムブシル自身は市販されている）を反応させることにより、架橋機能を導入する。反応図式１架橋剤が複素環塩基に結合しているヌクレオチドのその他の例は、２'−デオキシ−４−アミノピラゾロ[３,４−d]ピリミジン誘導体である。これらの誘導体の一般構造は、下記の式１４に示す。Ａ*-Ｌは、上記のように、架橋官能性の“ アーム”と“脱離基”を表す。Ｒ₆は上記のように糖部分を表し、Ｒ₇およびＲ₈ は独立してＨ、ＯＲ、ＳＲ、ＮＨＯＲ、ＮＨ₂またはＮＨ(ＣＨ₂)_tＮＨ₂であり、ＲはＨまたはＣ_1-6アルキルであり、ｔは０ないし１２である。これらの化合物は、出典明示により本明細書の一部とするChem.Phar.Bull.21:941-951(1973)のK obayashiの教示に従い、３,４−二置換および３,４,６−三置換ピラゾロ[３,４ −d]ピリミジンから製造できる。本発明のＳＢＣＯＤＮの架橋種の構造について更に総括的に議論すると、注目されるのは、ボール−アンド−スティックモデルおよび高分解能コンピューターグラフィックによる二本鎖ＤＮＡの解析により、プリンの７位およびピリミジンの５位が二本鎖核酸のＢ型二本鎖の主溝に存在することが示されたことである。これらの位置は、その塩基のハイブリダイゼーション特性を妨害することなく、かなりの量の側鎖で置換できる。これらの側鎖アームは、dＴhdまたはdＣydの誘導体化、または複素環状塩基の直接的全合成、続くグリコシル化のいずれかにより導入できる。これらの修飾ヌクレオチドは、自動ＤＮＡ合成機を用いてオリゴヌクレオチドへ組み入れるのに適した活性化ヌクレオチドへと変換させてもよい。アデニンの類似体であるピラゾロ[３，４−d]ピリミジンの場合、３位に架橋アームを結合させるが、これはプリンの７位に等しい。架橋側鎖（アーム＝Ａ*）は、プリン７位または８位、ピリミジン５位、ピロロピリミジン５位またはピラゾロピリミジン３位から主溝をまたぎ、修飾類似体を含有する塩基対上（オリゴマー３'側上）に位置するプリン（好ましくはグアニン）のＮ−７と反応するのに十分な長さのものであるべきである。塩基が他の塩基と二本鎖複合体中で対になっているときに、架橋側鎖（アーム＝Ａ*）は塩基から離れた官能基を保有する。上記したように、大略、アームＡ* は２−５０炭素の通常のアルキル鎖と長さが等しくなければならない。好ましくは、アームは、１−１２炭素原子のアルキレン基、２−１２炭素原子のアルキレン基と１または２のオレフィン結合、２−１２炭素原子のアルキレン基と１または２のアセチレン結合、またはオキシ、チオ、アミノまたはその化学的にブロックされた誘導体(例えば、トリフルオロアセトアミド、フタルイミノ、ＣＯＮＲ' 、ＮＲ'ＣＯおよびＳＯＮＲ'、なお、ＲはＨまたはＣ_1-6アルキル)などの求核基で終末点が置換された上記の基を含む。このような官能性は、脂肪族または芳香族アミンを含み、求核性を示し、 −(ＣＨ₂)_m−Ｌ、 −ＣＯ−(ＣＨ₂)_m−(Ｘ*)_n−Ｎ(Ｒ₁)−(ＣＨ₂)_p−Ｌおよび −ＣＯ−ＣＨ₂−Ｌのような基に対する結合点として働き得る。これらの基は説明的に架橋官能基の成分として上記した。架橋官能性Ａ*−Ｌまたはその適当なプレカーサー（例えば、−(ＣＨ₂)_q−ＮＨ₂または−(ＣＨ₂)_q−Ｙ*基、Ｙ*はＮＨ₂などの求核基で終わっている）を運ぶヌクレオシドまたはヌクレオチドをつくった後、さらに、本発明の修飾オリゴヌクレオチドの製造は既存技術に即して行うことができる。このようにオリゴヌクレオチドを製造するために、保護基がヌクレオシドまたはヌクレオチドに導入されて、化合物がオリゴヌクレオチドの合成に用いるために活性化される。保護・活性型への転換は、いくつかの文献に詳記されている２'−デオキシヌクレオシドについての方法によってなされる。参照、Sonveaux,Bioorganic Chemistry,14 :274-325(1986);Jones，in“Oligonuc1eotide Synthesis，a Practical Approa ch”,M.J．Gait，Ed.,IRL Press,p.23-34(1984)。活性化されたヌクレオチドはオリゴヌクレオチドに、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドについての方法と同様の方法で、組みこまれ、正しいヌクレオチドが連続的に結合して、標的ＤＮＡまたはＲＮＡにおいてヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチドの鎖を形成する。ヌクレオチドは酵素的にあるいは化学合成によって組みこむことができる。ヌクレオチドはその５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−３'−（Ｎ,Ｎ'−ジイソプロピル）−ホスホルアミジト・シアノエチルエステル誘導体に転換され、合成オリゴヌクレオチド中に組みこまれる。これは、“ Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach”（前出）の方法に準じる。次いでＮ−保護基は、一般的に知られている方法により、合成後アミノ分解によって他のオリゴヌクレオチドブロック基と共に、除去される。好ましい実施態様において、活性化ヌクレオチドは、特定の合成機器の方法および指示に従い、自動ＤＮＡ合成機に直接的に使用することができる。オリゴヌクレオチドは標準の市販のホスフォルアミジトまたはＨ−ホスフォナート化学物を用いて合成機でつくられる。本発明のＳＢＣＯＤＮを製造するための上記の記載は、１またはそれ以上の架橋剤を有するＳＢＣＯＤＮに適用されるだけでなく、本発明のすべてのＳＢＣＯＤＮについても一般的に適用される。しかし、以下に詳記するように、ＳＢＣヌクレオチド（Ｔ'アナログ）を含む２−チオチミンは、アンモニア（または他の求核試薬）での処置に対して、自動合成機で逐次的ＯＤＮ合成に一般的に用いられる他の成分よりも感受性が高い。これらの成分を本発明のＳＢＣＯＤＮ中に組みこむための好ましい方法、および自動ＯＤＮ合成の普通の方法と異なる他の化学方法については、下記する。ハロアシル基（ＣＯ−ＣＨ₂−Ｌ、ＬはＩなどのハロゲン）または−ＣＯ−(ＣＨ₂)_m−(Ｘ*)_n−Ｎ(Ｒ₁)−(ＣＨ₂)_p−Ｌ基（より好ましくはＣＯ−(ＣＨ₂)₃−Ｃ₆ Ｈ₄−Ｎ−[ＣＨ₂ＣＨ₂Ｃｌ]₂）などの離脱基を含む部分は、オリゴヌクレオチドへの組こみおよびブロック基の除去に続いて、アミノアルキルまたは類似の基 (−ＣＨ₂)_q−Ｙ*)に加えられる。例えば、α−ハロアセトアミドの付加は、アミノ基の正電位の除去に対応して、ＨＰＬＣで修飾化合物の移動度の変化により確認され、次いで２−アミノエタンチオールとの反応による正電位の再付加によって、元のアミノアルキル−オリゴヌクレオチドに類似する逆相ＨＰＬＣ移動度を有する誘導体が得られる。架橋剤（Ａ*−Ｌ部分）がオリゴヌクレオチドの３'または５'端末に、例えば式−(ＣＨ₂)_q−Ｙ*（Ｙはアミンで終わっている）のアルキルアミン結合によって、結合している場合には、オリゴヌクレオチド合成がなされて、最初に該アミノアルキルテイルを有するオリゴヌクレオチドが得られて、それに上記したハロアシル基（ＣＯ−ＣＨ₂−Ｌ）または−ＣＯ−(ＣＨ₂)_m−(Ｘ*)_n−Ｎ(Ｒ₁)−(ＣＨ₂)_p−Ｌなどのアルキル化部分が導入される。レポーター基、親油基またはテイルを有するＳＢＣＯＤＮ知られているように、“レポーター基”は、ＯＤＮ中に組みこまれるか、またはＯＤＮに結合し、何らかの分析的、物理的、化学的または生化学的方法の適用によってＯＤＮの検出または単離を可能にする基であると大略的に定義し得る。ＯＤＮがプローブとして用いられたときに、一般的にレポーター基はＯＤＮに結合している。一般的にレポーター基をＯＤＮに結合せしめることについて、技術的によく知られており、ここでは概要しか記述しない。結合したレポーター基を有する本発明のＳＢＣＯＤＮは、既存のハイブリダイゼイション技法に実質的に従って用いられ、核酸の二本鎖領域における特殊な標的配列を検出することができる。本発明のＳＢＣＯＤＮの利点は、既存の技術に比して、本発明のＳＢＣＯＤＮが二本鎖核酸配列に効率的に侵入し、結合できることである。プローブは既存技術で典型的に用いられているいくつかの方法の一つで標識される。検出の普通の方法は、³Ｈ、¹²⁵Ｉ、³⁵Ｓ、¹⁴Ｃまたは³²Ｐ標識プローブなどでのオートラジオグラフィーの使用である。他のレポーター基に、蛍光団、化学ルミネッセンス剤および酵素で標識された抗体と結合するリガンドが含まれる。他方、プローブは、蛍光団、化学ルミネセンス、酵素および酵素基質などの標識に直接的にコンジュゲートされ得る。他方、同じ成分が標識でコンジュゲートされたリガンドを有する活性抗体などのリガンド−アンチリガンド複合体を通して間接的に結合され得る。標識の選択は、必要とする感受性、プローブとのコンジュゲーションの容易性、安定性の要件および利用できる機器による。標識の選択は標識がプローブに組みこまれる方法を指定する。放射活性プローブは、望まれる放射性同位元素を含有する市販のヌクレオチドを用いてつくられる。放射活性ヌクレオチドはプローブ中に、例えばＤＮＡ合成機、ニック・トランスレーションまたは放射活性塩基のティリングによって、プローブの３'末にターミナル・トランスフェラーゼでまたは５'末にポリヌクレオチドキナーゼで、組みこまれる。非放射活性プローブはシグナル（例えば蛍光団、化学ルミネセンス剤または酵素）で直接的に標識されるか、リガンドとのコンジュゲーションにより間接的に標識される。例えばリガンド分子はプローブに共有結合する。次いで、このリガンドはレポーター分子に結合する。この分子は本来検出可能であるか、あるいは酵素または光活性化合物などの検出可能なシグナルに共有結合しているものである。リガンドおよびアンチリガンドは非常に多様である。リガンドが天然の“アンチリガンド”、すなわちビオチン、チロシンおよびコルチゾールなどのリガンドを有していると、その標識天然発生アンチリガンドと共に用いられる。他方、ハプテン性または抗原性化合物は適切に標識された抗体と併用される。好ましい標識方法はオリゴヌクレオチドのビオチン標識同族体を用いる。この方法はLang er et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:6633-6637(1981)（引用により本明細書の一部とする）に記載されている。レポーター基として興味のある酵素は、まずヒドロラーゼ、特にホスファターゼ、エステラーゼ、ウレアーゼおよびグリコシダーゼまたはオキシドルダクターゼ、特にペルオキシダーゼである。蛍光化合物には、フルオレセインおよびその誘導体、ローダニンおよびその誘導体、ダンシル、ウムベリフェロン、希土類などが含まれる。化学ルミネセンスにはルシフェリン、アクリジニウムエステルおよび２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えばルミノールが含まれる。レポーター基およびその特殊な例は米国特許第５,４１９,９６６（引用により本明細書の一部とする）に記載されている。特殊なハイブリダイゼーションの条件は重要でなく、研究者の好み、必要性に応じて変わる。特定のハイブリダイゼーションの技法は本発明に必須でない。一般的にハイブリダイゼーションの技法は“Nucleic Acid Hybridizatioin，A Pra ctical Ａpproach”，Hames and Higgins，Eds.,IRL Press，1985;Gall and Par due, Proc.Natl.Acad.Sci.USA.63-378-383(1969);and John et al.，Nature,223 :582-587(1969)に記述されている。ハイブリダイゼーションの技法に改良が加えられるときは、容易に適用される。ハイブリダイゼーション溶液に存在する標識プローブの量は非常に多様である。一般的に、標的二本鎖核酸の化学量論的な量を越えた過剰のプローブが、標識配列に対するプローブの結合率を高めるために、用いられる。用いた特定のハイブリダイゼーション溶液に適した温度と時間でのハイブリダイゼーション後に、プローブー標的ハイブリドの付着したガラス、プラスチックまたはフィルター支持体は、ハイブリダイゼーション溶液で準備したのと同じ試薬を典型的には含む洗液に入れる。ハイブリダイゼーションおよび洗液は厳格になされる。適切かつ厳格な洗浄後に、正しいハイブリダイゼーション複合体が標識の性質に応じて検出される。プローブは標識と直接的にコンジュゲートされる。例えば、標識が放射活性であると、関連ハイブリダイゼーション複合体基質を有する支持表面がＸ線フィルムに露出される。ラベルが蛍光であると、特定の波長の光でまず照射することによりサンプルが検定される。サンプルがこの光を吸収し、検出器で捕捉される異なった波長の光を放出する(“Physical Biochemistry”，Freifelder，D.，W.H. Freeman & Co.,1982,pp.537-542)。標識が酵素であると、サンプルは酵素に適した基質でインキュベーションすることにより検定される。生じたシグナルは、着色沈澱、着色または蛍光可溶物質またはバイオルミネセンスまたは化学ルミネセンスにより生じたフォトンである。ディプスティック検定に好ましい標識は、着色沈澱を生じ、正の読み取りを示す。例えば、アルカリホスファターゼはインドキシル・ホスフェートを脱リン酸し、このホスフェートは還元反応に関与して、テトラゾリウム塩を高着色で不溶性のフォルマザンに変換せしめる。ハイブリダイゼーション複合体の検定は、シグナル生成複合体を標的およびプローブのポリヌクレオチドまたは核酸の二本鎖に結合せしめることを要する。典型的には、このような結合は、リガンド−コンジュゲート・プローブとシグナルでコンジュゲートしたアンチリガンドとの間におけるようにリガンドおよびアンチリガンド相互作用を通しておきる。標識はまたハイブリダイゼーション複合体の間接的な検出を可能にする。例えば、標識がハプテンまたは抗原であると、サンプルは抗体を用いることにより検定される。これらのシステムにおいて、シグナルは、蛍光団または酵素分子が抗体に結合することにより、またはある場合には放射活性標識に結合することにより生成される（Tijssen，P.,“Practice and Theory of Enzyme Immunoassays， Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology”，Burdon，R .H.，van Knippenberg，P.H.,Eds.,Elsevier，1985,pp.9-20)。ハイブリダイゼーション溶液中に存在する標識プローブの量は、標識の性質、細胞性標的核酸に理論的に結合し得る標識プローブの量およびハイブリダイゼーション培地および／または洗浄培地の正確なストリジェンシーによって、非常に多様である。一般的に、標的の化学量論的な量を越えて実質的に過剰なプローブが標的核酸へのプローブの結合量を高めるために用いられる。本発明のこの観点は、標的二本鎖核酸配列を同定する方法にも関し、この方法は、上記の標識を含むＳＢＣＯＤＮプローブを利用することを含む。一つの実施態様において、この方法は、次の工程を含む。（ａ）試験するサンプル中での核酸を製造すること。（ｂ）標的核酸にＳＢＣＯＤＮプローブをハイブリダイズすること。ＳＢＣＯＤＮは、ペアの各ＯＤＮが標的核酸配列の２本の相補的鎖の１本に相補的であるマッチペアである。（ｃ）サンプルを洗浄し、結合していないプローブを除くこと。（ｄ）検出剤と共にサンプルをインキュベートすること。（ｅ）サンプルを検査すること。上記の方法は既存の技術でよく知られている技法に従って行い得る。本発明のＳＢＣＯＤＮはまた、特にＯＤＮの３'または５'ホスフェート末端に結合する“テイル”部分および関連テイル、例えばアミノアルキル基（約３−１０炭素を有する）またはヒドロキシアルキル基（約３−２０炭素を有する）として親油基を組みこむ。知られているように、親油基は、その親油性によって化合物の脂質溶解性を実質的に増大せしめる基である。親油基の例は、長鎖（３−２０炭素）のアルキル、シクロアルキル基、およびコレステロール、コール酸、プロゲステロンおよびエストラジオールのようなステロイド骨格を有する化合物である。さらに親油基の例としてメントールおよびレチノイン酸またはその同族体がある。親油性および他のテイル部分を本発明のＳＢＣＯＤＮの３'または５'末端に結合せしめるのに適した合成方法は、米国特許第５,４１９,９６６（引用により本明細書の一部とする）に記載されている。本発明のＳＢＣＯＤＮの製造本発明のＳＢＣＯＤＮの成分として示されるヌクレオシドおよびヌクレオチドは、化学文献に記載されている方法でつくることができる。自動合成機でのオリゴヌクレオチド合成は、架橋官能性を含有するＳＢＣＯＤＮについての記載と共に一般的に上記した。修飾固体支持体を用いる自動合成機でのＯＤＮ合成は、本発明のＳＢＣＯＤＮの製造に一般的に好ましい方法において用いられるが、その詳細は米国特許第５,４１９,９６６に記載されている。しかし、ＳＢＣＯＤＮ含有の２−チオチミンが製造されるとき、この複素環が核酸の天然塩基複素環よりも塩基反応活性であるので、標準“ホスフォラミジト”ＯＤＮ合成方法を修飾して用いられる。従って、このヌクレオチドに関しては、ヌクレオチド成分の環外アミノ基からブロック基を除去する工程において、そして固体支持体からＳＢＣＯＤＮを除去するのに、アンモニアでの緩和な処置を必要とする。核酸合成のための２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボフラノシドの適当に保護された“ホスフォラミジト”試薬（化合物３および６）を製造する修正方法は、反応図式２および３に示す。反応図式２から分かるように、フェノキシアセチル・ブロック基は環外アミノ基に結合しており、反応図式３では９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆmoc）保護基が用いられている。Ｎ−フェノキシアセチル保護２'−デオキシグアノシンおよび２'−デオキシシチジン−３'−Ｏ−２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ−ヂイソプロピルホスフォラミジトは、BioGenex,Alameda,Californiaから市販されている。５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−チオチミジン−３'−Ｏ−(２−シアノエチル)−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルホスフォラミジトは、Connolly et al.(1989)Nucleic Acids Res.17,4957-4 974の既知方法に合わせて得ることができる。２，６−ジアミノプリン−２'−デオキシリボシド（反応図式２および３における出発物質）は、Fathi et al．Tet rahedron Lett.31,319-322の既知方法にあわせて得ることができる。反応図式２反応図式３式４ｂに示すヌクレオチド部分は、実質的に既知の化学文献に準じる反応図式４の方法で得られる。最初に“フラン”同族体デオキシリボフラノシド、すなわち３−(２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル)フラノ−[２，３−ｄ]ピリミジン−６(５Ｈ)−オン（化合物１１）は、Robins et al.J.Org.Chem.1983,48,18 54の文献方法に実質的に従って、既知の抗ウイルス性ヌクレオシド５−エチニル −２'−デオキシウリジン（化合物１０）から銅（Ｉ）触媒環化により合成される。この化合物は、ジメトキシトリチレート化され、ＯＤＮ合成の試薬として適切な対応シアノエトキシホスフォラミジト（化合物１２）に転換される。これは実質的に既知方法による(参照、Sinha et al．Nucleic Acid Research.1984，12 ,4539)。次いで、本発明のＳＢＣＯＤＮが固体支持体上に構築される。ＳＢＣＯＤＮをアンモニアで処理し保護基を除去する最終工程で、フラノ−[２,３−ｄ ] ピリミジン−６(５Ｈ)−オン塩基が式４ｂに示すピロロ−[２,３−ｄ]ピリミジン−６(５Ｈ)−オン塩基に転換される。Connolly et al.Nucleic Acids Res.198 9,17,4957-4974,Fathi et al.Tetrahedron Lett.1990,31,319-322,Robins et al .J.Or.Chem.1983,48,1854およびShinha et al.Nucleic Acid Research.1984,12, 4539の公表は、出典明示により本明細書の一部とする。反応図式４本発明のＳＢＣＯＤＮの使用および配列特異的選択的結合能力の証拠 dＧのためのdＩ、dＣのためのdＰを含む、またはdＴのためのd２−sＴおよびd Ａのためのd２−amＡを含む数個のオリゴヌクレオチドを製造した。これらのＯＤＮのハイブリダイゼーション特性は、ハイブリッドの融解温度の測定（実質的に生理学的条件下で）および非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以後、ＰＡＧＥ）分析で実験した。これらの測定は、各ＳＢＣＯＤＮが、天然相補的または（実質相補的）ＯＤＮと安定なハイブリッドを形成するが、相補的ＳＢＣＯＤＮとはしないことを確認した。従って、ＳＢＣＯＤＮの適合対は、そのそれぞれの天然相補的標的と安定なハイブリッドを形成するが、互いにはしないことが判明した。下記表１は、表に示す条件下で観察された融解温度およびまた修飾塩基対当たりの融解温度の計算した減少（低下）も示す。表１において、２８マーＯＤＮはpＢＲ３２２プラスミド由来の配列である。ハイブリッド１は、両方のＯＤＮでＸおよびＹが天然dＣおよびdＧ残基である相補的オリゴデオキシヌクレオチドから形成される。従って、ハィブリッド１は、参考を提供し、それと修飾ＳＢＣＯＤＮの形の他のハイブリッドを比較できる。ハイブリッドIVとして表１に示すＳＢＣＯＤＮの対は二つの２８マー配列を含み、ここでそれぞれの天然ｄＧおよびｄＣヌクレオチドがそれぞれdＩおよびdＰに置換されている。ハイブリッドIVは融解温度２０.２℃で不安定である。それにもかかわらず、この対の各メンバーはハイブリッドIIおよびIIIにおいてその天然相補物と安定なハイブリッドを形成する。ＰＡＧＥ分析は、ＳＢＣ２８マーの合致ペアの二つのメンバーが安定な形でハイブリダイズせず、各ＳＢＣＯＤＮおよびその天然相補物は安定なハイブリッドを形成することも示す。更に、通常のワトソン鎖は正常クリック鎖にＳＢＣクリック鎖以上の優先性を示さない。なぜならこれは当モル量のこれら３つの鎖が同時に室温で混合された場合、当モル量の２本鎖ハイブリッドＩおよびIIIが形成されたからである。更に、存在するとすれば、少しの鎖置換または鎖交換が、前形成ハイブリッドIIIをＳＢＣ鎖の正常相同物と、またはハイブリッドIIとインキュベートした時に存在した。これらのデータは、ＳＢＣＯＤＮは、それらの非修飾相補鎖とインキュベートした時は天然ＯＤＮのように行動するが、それら自身とは安定なハイブリッドを形成しないことを証明した。表２は実質的に生理学的条件下（０.２ＭＮaＣl、０.０１ＭＮa₂ＨＰＯ₄ 、０.１mＭＥＤＴＡ、pＨ７.０、ＯＤＮ濃度＝４×１０^-7Ｍ）でハイブリダイズする２０マーのオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮＶおよびＯＤＮ VI ）に関する。表２にＳＢＣ(Ｖ)およびＳＢＣ(VI)と名付けられているＯＤＮは、各dＡおよび各dＴがd２amＡおよびd２sＴと置換されるように修飾されている。これらの対の融解温度を表に示す。見られるように、本発明の好ましいＡ'およびＴ'修飾で完全に修飾されたＯＤＮは、二つの天然相補鎖の間の結合で見られるより幾分強い天然相補ＯＤＮとの結合を示す。同時に、ＳＢＣＯＤＮの適合対は、それにもかかわらず互いに安定なハイブリッドの形成はできなかった(その融解温度は２６℃)。融解温度測定およびＰＡＧＥ分析の目的で、本発明に従って行った更なる実験は、二本鎖ＤＮＡの標的配列の両方の鎖に相補的なＳＢＣＯＤＮの適合対は、天然２本鎖核酸を妨害し、安定３アームジョイントを形成することを示した。類似に対形成した正常ＤＮＡＯＤＮは同じ標的の妨害をしなかった。長い二本鎖ＤＮＡの場合、対ＳＢＣＯＤＮがＤＮＡ標的の各メンバーに連続してハイブリダイズし、次いでこれらのハイブリッドの組み合わせが安定なＤループ形成をもたらし、これが標的ＤＮＡ中のＳＢＣＯＤＮ対および対応する相補配列の各メンバーの間の結合を安定化する。ＳＢＣＯＤＮおよびＤＮＡの間の得られる３アームジョイントは、レゾルバーゼ酵素で開裂できる。対になったＳＢＣＯＤＮによる長いＤＮＡにおける鎖中断および２本鎖Ｄループ形成は、recＡのようなリコンビナーゼ酵素により触媒される。これらの部位のレゾルバーゼによる開裂は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーからのように、任意の予め選択した部位での非常に長いＤＮＡの制限を可能にする。従って、本発明のＳＢＣＯＤＮは遺伝子地図形成および類似の分析および診断目的に使用できる。ＳＢＣＯＤＮは、特にＳＢＣＯＤＮの適合対の１個または好ましくは両方のメンバーが架橋機能を含む時、標的遺伝子の阻止またはブロック発現にも使用できる。このような場合、遺伝子の標的配列との標的２本鎖Ｄループ形成後、核酸の両方の鎖はＳＢＣＯＤＮと共有結合し、遺伝子の有効な抑制が得られる。架橋機能を有するＳＢＣＯＤＮは、遺伝子地図形成および類似の診断目的にも使用できる。本発明のＳＢＣＯＤＮの診断的および他の“プローブ”様の適用は、本発明のＳＢＣＯＤＮがこれらの２本鎖リボ核酸の２次構造を配列特異的に妨害できるため、メッセンジャーおよびリボソームＲＮＡまでも含む。治療的使用は、特にＳＢＣＯＤＮが架橋機能を有する場合、アンチセンス分野である。細菌のリボソームＲＮＡの配列が種特異的であることは既に知られている。更に、ＤＮＡプローブに基づいたアッセイにおけるこのｒＲＮＡの検出は、２次構造のため、プローブのＲＮＡへの接近ができず通常妨害される。従って、細菌リボソームＲＮＡを配列特異的に妨害するように設計したＳＢＣＯＤＮは、本発明に従って、ヒトおよび動物種における細菌感染の診断の診断目的で使用する。実験の部−具体的実施例ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンヌクレオチドの合成実施例１：６−(トリチルアミノ)カプロン酸６−アミノカプロン酸（２６ｇ、０.２mole）を、トリエチルアミン(１００m Ｌ)の添加によりジクロロメタン(２００mＬ)に溶解した。塩化トリチル(１２０ｇ、０.４５mole)を添加し、溶液を３６時間攪拌した。得られた溶液を１ＮＨＣｌで抽出し、有機相を蒸発乾固した。残渣を２−プロパノール／１ＮＮaＯＨ (３００mＬ／１００mＬ)に懸濁し、３時間還流した。溶液を濃厚シロップまで蒸発させ、ジクロロメタン(５００mＬ)を添加した。水を添加し、酸性化した。相を分離し、有機相を硫酸ナトリウムで乾燥して蒸発乾固した。残渣を温２−プロパノールに懸濁し、冷却し、濾過して中間体化合物として有用な６−(トリチルアミノ)カプロン酸４３.５(５８％)を得た。実施例２：５−(トリチルアミノ)ペンチルヒドロキシメチレンマロノニトリル氷浴中の６−(トリチルアミノ)−カプロン酸(２０.２ｇ、５３mmole)およびトリエチルアミン(２０mＬ)のジクロロメタン溶液に、イソブチルクロロホルメート(８.３mＬ、６４mmole)を３０分にわたり滴下した。混合物を２時間、氷浴中で攪拌した後、新たに蒸留したマロノニトリル(４.２ｇ、６４mmole)を一度に添加した。溶液を２時間氷浴中でおよび２時間ＲＴで攪拌した。ジクロロメタン溶液を氷冷２ＮＨＣl(３００mＬ)で洗浄し、２相性混合物を濾過して沈殿した生産物(１３.２ｇ)を除去した。相を分離し、有機相を濃厚シロップまで乾燥させ、蒸発させた。シロップをジクロロメタンで覆い、放置すると生産物の細結晶が付着した。結晶を濾過し、乾燥させて生産物の全収率１９.５ｇ(８７％)に対して６.３ｇ得、これは中間体として有用であった。実施例３：５−(トリチルアミノ)ペンチルメトキシメチレンマロノニトリル氷浴で冷却したエーテル／ジクロロメタン(９００mＬ／１００mＬ)中の実施例２のマロノニトリル(１３ｇ、３１mmole)の懸濁液を、ジアゾメタンの新たに調整したエーテル性溶液(５００mmoleのDiazald(登録商標)(Aldrich Chemical Com pany)から)で処理した。この溶液を６時間攪拌し、次いで酢酸(１０mＬ)で中和した。溶液を蒸発乾固し、残渣を溶出液としてジクロロメタン／アセトン(４／１)を使用したシリカゲルクロマトグラフィーに付した。生産物を含むフラクションをプールし、シロップまで蒸発させた。シロップをジクロロメタンでトリチル化し、結晶を誘発した。結晶を濾過し、乾燥させて８.３ｇ(６１％)のクロマトグラフィーでは純粋な生産物を得、これは中間体化合物として有用であった。実施例４：５−アミノ−３−[(５−トリチルアミノ)ペンチル]ピラゾール−４−カルボニトリル氷浴中の実施例３の生産物(７.０ｇ、１６mmole)のメタノール溶液(１００mＬ )に、ヒドラジン一水和物(７.８mＬ、１６０mmole)を１５分にわたり滴下した。３０分、氷浴中で攪拌した後、溶液を蒸発乾固した。残渣を冷メタノールに懸濁し、乾燥後、５−アミノ−３−[(５−トリチルアミノ)ペンチル]ピラゾール−４ −カルボニトリル７.１ｇ(１００％)を得、これは中間体化合物として有用であった。分析用サンプルを水からの再結晶により製造した。実施例５：５−アミノ−１−(２−デオキシ−３,５−ジ−Ｏ−トルオイル−β−Ｄ−エリスロペントフラノシル)−３−[(５−トリチルアミノ)ペンチル]ピラゾール−４ −カルボニトリル実施例４由来のカルボニトリル(３.５ｇ、８mmole)の氷冷溶液を水素化ナトリウムで処理し、３０分、０−４℃で攪拌した。１−クロロ−１,２−ジデオキシ −３,５−ジ−Ｏ−トルオイルリボフラノースを添加し、溶液を１時間、０−４ ℃で攪拌した。溶液を炭酸水素ナトリウムの飽和溶液に添加し、ジクロロメタンで抽出した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発乾固した。残渣をフラッシュクロマトグラフィーに付した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発乾固した。残渣を溶出液としてトルエン／酢酸エチル(５／１)を使用したシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーに付した。二つの主生産物を単離し、Ｎ−１およびＮ−２異性体として同定し、それぞれ５７％(３．６ｇ)および２０％(１.２ｇ)のＮ−１およびＮ−２の収量であった。Ｎ−１およびＮ−２の混合物約１ｇも回収した。糖付加物質の全収量は５.８ｇ(９２％)であった。Ｎ−１異性体である５−アミノ−１−(２−デオキシ−３,５−ジ−ｏ−トルオイル−β−Ｄ−エリスロペントフラノシル)−３−[(５−トリチルアミノ)−ペンチル]ピラゾール −４−カルボニトリルを更に精製することなく実施例６に使用した。実施例６：１−(２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロペントフラノシル)−３−[５−(トリチルアミノ)−ペンチル]ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−４−アミン実施例５のピラゾール−４−カルボニトリル(３.５ｇ、４.４mmole)のトルエン(１００mＬ)溶液に、酢酸ジエトキシメチル(１.１mＬ、６.７mmole)を添加した。溶液を８０−９０℃に５時間保ち、次いでシロップまで蒸発させた。シロップをジクロロメタン(１０mＬ)に溶解し、ガラス加圧ビン中の氷冷メタノール性アンモニア(１００mＬ)に添加した。二日間、ＲＴの後、ビンの中身を蒸発乾固した。残渣をメタノールに溶解し、新たに調整したナトリウムメトキシドでpＨを８に調整し、脱保護を完了させた。一晩攪拌後、溶液をＤowex(登録商標)−５０Ｈ＋樹脂で処理し、濾過して蒸発乾固した。残渣をアセトン／ヘキサン(３／２)を溶出液として使用したシリカゲルクロマトグラフィーに付し、分析的に純粋な生産物２.０ｇ(７７％)を得た。実施例７：５'−１リン酸１−(２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロペントフラノシル)−３ −[５−(トリチルアミノ)−ペンチル]ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−４−アミンリン酸トリメチル（５mＬ）中の実施例６のピラゾロピリミジン−４−アミン（２５０mg、０.４３mmole）の氷冷溶液に、塩化ホスホリル（５０μＬ）を添加し、溶液を０−４℃に保った。反応を２５分にわたる水中の０から１００％のアセトニトリルの直線勾配を使用した逆相クロマトグラフィーで追跡した。５時間攪拌後、塩化ホスホリルの更なるアリコート（２５μＬ）を添加し、溶液を更に３０分攪拌した。溶液を０.１Ｍ炭酸水素アンモニウムに注ぎ、一晩冷却した。次いで溶液をエーテルで抽出し、水相を蒸発乾固した。残渣を水（５mＬ）に溶解し、２２mm×５０cm Ｃ１８カラムを使用した逆相ＨＰＬＣで精製した。カラムを水で平衡化し、２０分にわたるアセトニトリルの０から１００％の勾配で溶出した。所望の物質を含むフラクションをプールし、凍結乾燥しクロマトグラフィー的に純粋なヌクレオチド１６０mg（５６％）を得た。実施例８：５'−１リン酸１−(２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロペントフラノシル)−３ −{５−[(６−ビオチンアミド)ヘキサンアミド]ペンチル}ピラゾロ[３,４−ｄ] ピリミジン−４−アミン実施例７のヌクレオチドのエタノール溶液(１０mＬ)、水酸化パラジウム炭素( ５０mg)およびシクロヘキサジエン(１mＬ)を３日間還流し、濾過し、蒸発乾固した。残渣をジクロロメタンで洗浄し、トリエチルアミン(１００mＬ)を含むＤＭＦ(１.５mＬ)に溶解し、ビオチニルアミノカプロン酸Ｎ−ヒドロキシ−サクシンイミジル(５０mg)で処理した。一晩攪拌後、更なる量の６−ビオチンアミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシサクシンイミジル(５０mg)を添加し、溶液を１８時間攪拌した。反応混合物を蒸発乾固し、実施例７の方法に従いクロマトグラフィーに付した。フラクションをプールし、凍結乾燥してクロマトグラフィー的に純粋なビオチンアミド置換ヌクレオチド８０mgを得た。実施例９：５'−３リン酸１−(２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロペントフラノシル)−３ −[５−(６−ビオチンアミド)−ヘキサンアミドペンチル]ピラゾロ[３,４−ｄ] ピリミジン−４−アミン実施例８の１リン酸(８０mg、約０.１mmole)をトリエチルアミン(１４μＬ)を添加しながらＤＭＦに溶解した。カルボニルジイミダゾール(８１mg、０.５mmol e)を添加し、溶液をＲＴで１８時間攪拌した。溶液をメタノール(４０μＬ)で処理し、３０分攪拌後、ピロリン酸トリブチルアンモニウム(０.５mＬＤＭＦ中０.５ｇ)を添加した。２４時間攪拌後、別のアリコートのピロリン酸トリブチルアンモニウムを添加し、溶液を一晩攪拌した。反応混合物を蒸発乾固し、実施例８の方法に従いクロマトグラフィーに付した。二つの生産物が回収され、各々濃水酸化アンモニウム(１mＬ)で１８時間、５５℃で処理することにより分離した。ＵＶおよびＨＰＬＣ分析は両方の生産物がアンモニア処置後には同一であることを示し、プールし、凍結乾燥してヌクレオシド３リン酸３５.２mgを得た。実施例１０：ニック翻訳反応実施例９の３リン酸を、Langer et al.(前掲)のニック翻訳プロトコールに従いpHPV-16に挿入させた。実施例９の３リン酸で製造したプローブを商品として入手可能なbio-11-dUTP（Sigma Chemical Co）と比較した。フィルターハイブリダイゼーションおよびin situ塗沫の両方で有意な差は観察されなかった。より具体的に、方法は以下の物質および工程を含む物質：ＤＮase（ICN Biomedicals）−４μｇ／mＬＤＮＡポリメラーゼ１(U.S．Biochemicals)−８Ｕ／mＬ pＨＰＶ−１６−２．１６mg／mＬ、これはヒトパピローマウイルスタイプ１６のゲノムを含むプラスミドである１０Ｘ−ＤP-１Ｍトリス、pＨ７.５(２０mＬ)；０.５ＭＯＴＴ(８０mＬ)；１ＭＭgＣl₂(２.８mL)；Ｈ₂Ｏ(１７mＬ) ヌクレオチド−混合Ａ-dＧＴＰ、dＣＴＰ、ＴＴＰ各２mm(Pharmacia) 混合Ｕ-dＧＴＰ、dＣＴＰ、dＡＴP各２mm Ｂio-１１−dＵＴＰ−１.０mg／mL（ＢＲＬ）Ｂio−１２−dＡＰＰＴＰ−１.０mg／mＬ工程：１０Ｘ−ＤＰ(４mＬ)、pＨＶ−１６(２mＬ)、ヌクレオチド混合Ａ(６mＬ)、Ｂ io-１２−dＡＰＰＴＰ(２mＬ)およびＨ₂Ｏ(２０mＬ)の氷冷混合物に、ＤＮase( １ mＬ)およびＤＮＡポリメラーゼ１(２.４mＬ)を添加した。反応混合物を１６℃で１時間インキュベートした。方法を、Ｂio−１２−dＡＰＰＴＰ（実施例９の３リン酸を含む）およびヌクレオチド混合Ａの代わりにＢio−１１−dＵＴＰおよびヌクレオチド混合Ｕを使用して繰り返した。核酸をエタノール沈殿により単離し、ニトロセルロースに差し込まれたpＨＰＶ−１６にハイブリダイズした。ハイブリダイズビオチニル化プローブを、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質に結合したストレプトアビジン−アルカリホスファターゼにより可視化した。いずれのビオチニル化ヌクレオチドを使用して製造したプローブも同一のシグナルを提供した。プローブはまた頚部塗沫のin situ形により試験し、シグナルおよび背景で定質的な差異は示されなかった。実施例１１：５−アミノ−３−[(５−トリチルアミノ)ペンチル]ピラゾール−４−カルボキサミドマロノニトリルの代わりにシアノアセトアミドを使用する以外実施例２の方法に従い、６−(トリチルアミノ)カプロン酸から５−(トリチルアミノ)ペンチルヒドロキシメチレンセシアノアセトアミドを製造する。次いで、これを実施例３の方法に従いジアゾメタンで処理してメトキシ誘導体を得、それを実施例４のようにヒドラジン１リン酸と反応させて５−アミノ−３−[(５−トリチルアミノ)− ペンチル]ピラゾール−４−カルボキサミドを得る。実施例１２：４−ヒドロキシ−６−メチルチオ−３−[(５−トリチルアミノ)ペンチル]ピラゾロ−[３,４−ｄ]ピリミジン実施例１１由来のカルボキサミドをエチルキサントゲン酸カリウムおよびエタノールと上昇した温度で反応させ、４−ヒドロキシピラゾロ[３,４−d]ピリミジン−６−チオールのカリウム塩を得る。この塩をヨードメタンと反応させ、４− ヒドロキシ−６−メチルチオ−３−[(５−トリチルアミノ)ペンチル]ピラゾロ− [３,４−d]ピリミジンを得る。実施例１３：１−(２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロペントフラノシル)−４−ヒドロキシ− ３−[５−(トリチルアミノ)ペンチル]ピラゾロ[３,４−d]ピリミジン−６−アミン実施例５の方法に従って、実施例１２のピラゾロピリミジンを水素化ナトリウムで処理し、１−クロロ−１,２−ジデオキシ−３,５−ジ−Ｏ−トルオイルリボフラノースと反応させる。得られる化合物をMCPBAとおよびメタノール性アンモニアと反応させ、トルオイル保護基を除去し、生産物を得る。実施例１４：５'−１リン酸１−(２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロペントフラノシル)−４ −ヒドロキシ−３−[５−(６−ビオチンアミド)ヘキサンアミドペンチル]ピラゾロ[３,４−d]ピリミジン−６−アミン実施例７の方法に従い、実施例１３のピラゾロピリミジンを塩化ホスホリルと反応させ、対応する５'−１リン酸を得る。実施例８の方法に従い、上記５'−１リン酸をパラジウム／炭素およびシクロヘキサジエンと反応させ、残渣をビオチニルアミノカプロン酸Ｎ−ヒドロキシ− スクシンイミジルと反応させ、５'−１リン酸１−(２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロペントフラノシル)−４−ヒドロキシ−３−[５−(６−ビオチンアミド)ヘキサンアミドペンチル]ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−６−アミンを得る。実施例１５：５'−３リン酸１−(２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロペントフラノシル)−４ −ヒドロキシ−３−[５−(６−ビオチンアミド)ヘキサンアミドペンチル]ピラゾロ[３,４−d]ピリミジン−６−アミン実施例９の方法に従い、実施例１４の５'−１リン酸をカルボニルジイミダゾールで処理し、次いでピロリン酸トリブチルアンモニウムと反応させて対応する５'−３リン酸を得る。実施例１６：１−(２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロペントフラノシル)−３−[５−(トリチルアミノ)−ペンチル]ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−４−ベンゾイルアミン実施例６由来の１−(２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロペントフラノシル)−３ −[５−(トリチルアミノ)ペンチル]ピラゾロ[３,４−d]ピリミジン−４−アミンを塩化ベンゾイルおよびピリジンと反応させ、１−(２−デオキシ−３,４−ジ− Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−エリスロペントフラノシル)−３−[５−(トリチルアミノ)ペンチル]ピラゾロ[３,４−d]ピリミジン−４−ジベンゾイルアミンを得る。これを水性水酸化ナトリウムで処理し、化合物を部分的に脱保護して１−(２ −デオキシ−β−Ｄ−エリスロペントフラノシル)−３−[５−(トリチルアミノ) ペンチル]ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−４−ベンゾイルアミンを得る。実施例１７：１−(２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロペントフラノシル)−３−[５−(トリフルオロアセトアミド)ペンチル]ピラゾロ[３,４−d]ピリミジン−４−ベンゾイルアミン実施例８の方法に従い、実施例１６のベンゾイルアミンを水酸化パラジウム炭素、次いでトリフルオロ酢酸無水物で処理し、１−(２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロペントフラノシル)−３−[５−(トリフルオロアセトアミノ)ペンチル]ピラゾロ[３,４−d]ピリミジン−４−ベンゾイルアミンを得る。実施例１８：１−(２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロペントフラノシル)−３−[５−(トリフルオロアセトアミド)ペンチル]ピラゾロ[３,４ −ｄ]ピリミジン−４−ベンゾイルアミン３'−Ｏ−(Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル)ホスホルアミデイトシアノエチルエステル実施例１７の化合物を塩化ジメトキシトリチルおよびピリジンと反応させ、対応する５'−ジメトキシトリチル化合物を得る。次いで、この化合物をシアノエチルクロロ−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミデイトと反応させ(Sinha et al.，Nucleic Acids Res.，12:4539(1984))、３'−Ｏ−活性化ヌクレオシドを得る。架橋機能を有するヌクレオチドおよびＯＤＮの合成実施例１９：５−(４−フタルイミドブト−１−イル)−２'−デオキシウリジン１−ヨード−２'−デオキシウリジン(３５４mg、１mmol)をジメチルホルムアミド１０mＬに溶解した。ヨウ化第１銅(７６mg、０.４mmol)、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(Ｏ)(２３０mg、０.２mmol)およびトリエチルアミン(２００mg、２.０mmol)を添加した。４−フタルイミドブト−１−イン(３００mg、１.５mmol)を一度に添加し、反応を６０℃に３時間保った。次いで、透明な黄色反応物を蒸発し、塩化メチレンを添加した。フラスコのスクラッチによりほとんど全ての生産物の結晶化が誘発され、それを濾過し、９５％エタノールから再結晶し、表題化合物３３５mg(７８％)を細かい、ふわふわした針状物として得た。実施例２０：５−(４−フタルイミドブト−１−イル)−２’−デオキシウリジン５−(４−フタルイミドブト−１−イル)−２'−デオキシウリジン１.００ｇを９５％ＥtＯＨに溶解し、中性ラネイニッケル約３ｇを添加した。４８時間後、触媒を慎重な濾過により除去し、濾液を蒸発させて固体を得、それをメタノール −水から再結晶して表題化合物９６０mg(９７％)を得た。実施例２１：５−(３−ヨードアセトアミドプロピル)−２'−デオキシウリジン５−(３−トリフルオロアセトアミドプロプ−１−イル)−２'−デオキシウリジン(０.３mmol)をアンモニア、次いでα−ヨード酢酸Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル(０.５mmol)で処理する。反応混合物を蒸発乾固し、クロマトグラフィーで精製して５−(３−ヨードアセトアミドプロピル)−２'−デオキシウリジンを得る。実施例２２：５−(４−(４−ブロモブチルアミド)ブチル)−２'−デオキシウリジン５−(４−フタルイミドブト−１−イル)−２'−デオキシウリジンをアンモニア、次いでＮ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−ブロモ酪酸で処理し、５−( ４−(４−ルボモブチルアミド)ブチル)−２'−デオキシウリジンを得る。合成オリゴヌクレオチドの製造実施例２３：ホスホルアミデイト製造およびＤＮＡ合成ヌクレオシドを、既知の方法に従って５'−ジメトキシトリチル化し、約８５％の収率を得、３'−ホスホロアミデイトを、塩化メチレン中のβ−シアノエチルクロロ亜リン酸ジイソプロピルアミノ(“Ｏligonucleotide Ｓynthesis：ＡＰractical Ａpproach”、前掲）とジイソプロピルエチルアミンを使用して製造した。ホスホロアミデイトをアセトニトリル中の０.２Ｎ溶液に調製し、自動ＤＮＡ合成装置に入れた。これら新規および修飾ホスホロアミデイトの取り込みは、通常のホスホロアミデイトと同様の取り込みとなった(ＵＶによるトリチル色素放出のアッセイで検定して９７−９９％)。オリゴヌクレオチドをトリチル化形でＤＮＡ合成装置から除去し、３０％アンモニアを５５℃で６時間使用して、脱保護した。０.５Ｍ炭酸水素ナトリウム１０μＬを添加し、濃縮中の酸性化を防止した。オリゴヌクレオチドを真空下蒸発乾固し、水１.０mＬに再溶解した。オリゴヌクレオチドを２０分にわたる０.１Ｎ酢酸トリエチルアンモニウム中の１５−５５％アセトニトリルを使用したＨＰＬＣで精製した。非置換オリゴヌクレオチドは１０分で溶出した；アミノ誘導体は１１−１２分かかった。所望のオリゴヌクレオチドを回収し、蒸発乾固し、次いでそれを８０％水性酢酸に９０分再溶解し、トリチル基を除去した。脱塩は、Ｇ２５セファデックスカラムで達成し、適当なフラクションを取った。フラクションを濃縮し、特異的容量とし、希釈読み取りを全収率を確認するために行い、分析的ＨＰＬＣを純度を確認するために行った。オリゴヌクレオチドを使用するまで−２０℃に凍結させた。一般に、アミノアルキルオリゴヌクレオチドへの架橋アームの添加のために、アミノアルキルヌクレオチドの溶液１０μgおよび０.１Ｍホウ酸緩衝液、pＨ８. ５中の１００×Ｍ過剰のα−ハロ酢酸または４−ハロ酪酸のようなハロ酢酸n− ヒドロキシスクシンイミドの溶液を環境温度で暗中３０分インキュベートする。全反応物を蒸留水で平衡化および溶出するＮＡＰ−１０カラムを通過させる。ＵＶ吸収を基にした適当なフラクションを合わせ、濃縮物を分光光学的に測定する。トリフルオロ酢酸２,３,５,６−テトラフルオロフェニル２,３,５,６−テトラフルオロフェノール(５５.２ｇ、０.３３mol)、トリフルオロ酢酸無水物(６０mＬ、０.４２mol)およびホウ素トリフロリドエーテラート( ０.５mL)を１６時間還流した。トリフルオロ酢酸無水物およびトリフルオロ酢酸を常圧での蒸留により回収した。トリフルオロ酢酸無水物フラクション(bp４０ ℃)を反応混合物にホウ素トリフロリドエーテラート０.５mＬと共に戻し、混合物を２４時間還流した。この工程を２回繰り返し、完全な反応を確実にした。常圧での蒸留後、所望の生産物を６２℃／４５mm(４５℃／１８mm)で無色液体として回収した：収量＝８１.３ｇ(９３％)；d＝１.５２ｇ／mＬ；ｎ_D ²¹＝１.３７４７；ＩＲ(ＣＨＣl₃)３０１０、１８１５、１５２５、１４８５、１２３５、１１８０、１１１０および９５５cm^-1。Ｃ₈ＨＦ₇Ｏ₂の計算値：Ｃ、３６.６６；Ｈ、０.３８；Ｆ、５０.７４。実測値:Ｃ、３６.３１；Ｈ、０.４３；Ｆ、５０.９５。２,３,５,６−テトラフルオロフェニル−４'−[ビス(２−クロロエチル)アミノ]フェニル酪酸 (クロラムブシル２,３,５,６−テトラフルオロフェニルエステル) 乾燥ジクロロメタン５ml中のクロラムブシル(Ｆluka Ａ.Ｇ.より供給)０.２５ｇ(０.８２mmol)およびトリフルオロ酢酸２,３,５,６−テトラフルオロフェニル０.３ｇ(１.１mol)の溶液に、乾燥トリエチルアミン０.２mＬを添加した。混合物をアルゴン下、室温で０.５時間攪拌し、蒸発させた。油状残渣をヘキサン −クロロホルム(２：１)を溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、油状物としてエステルを得た：０.２８ｇ(７５％)；シリカゲルでのＴＬＣ(ＣＨＣｌ₃)Ｒf０.６；ＩＲ(ＣＨＣl₃中)３０１０、１７８０、１６１３、１５２１、１４８５cm^-1。２−プロパルギルオキシエチル)アミン(John，R.,およびSeitz，G.，Chem．Be r.，123，133(1990))を対応するプロピノールと２−ブロモエチルアンモラムブロミドから、液体アンモニア中、ＮaＮＨ₂存在下で製造し、次反応に粗物質を使用した。３−(２−トリフルオロアセトアミドエトキシ)プロピン (２−プロパルギルオキシエチル)アミン(１３.８ｇ、０.１４mol)を攪拌し、イソプロパノール−ドライアイス浴で冷却しながら、過剰のトリフルオロ酢酸無水物(２６mＬ、０.１８mol)を滴下する。Ｎ−(２−プロパルギルオキシエチル) トリフルオロアセトアミドを８４−８５℃／１.７トールで油状物として留去し、それを冷却により固化する；収量１４.４ｇ(５２％)、m.p.(１６°、ｎ_D ²¹１. ４１１０。Ｃ₇Ｈ₈Ｆ₃ＮＯ₂の計算値：Ｃ、４３.０９；Ｈ、４.１３；Ｎ、７.１８；Ｆ、２９.２１。実測値：Ｃ、４２.８０；Ｈ、４.０３；Ｎ、７.０６；Ｆ、２９.３８。５−[３−(２−トリフルオロアセトアミドエトキシ)プロピニル]−２'−デオキシウリジン５−ヨード−２'−デオキシウリジン(３.５４ｇ、１０mmol)、ヨウ化銅(Ｉ)( ０.１９ｇ、１mmol)およびテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(Ｏ) (０.５８ｇ、０.５mmol)を真空で６０℃で３時間乾燥させ、アルゴン下に置く。乾燥ＤＭＦ(２０mＬ)中の懸濁液をアルゴン下攪拌し、乾燥トリエチルアミン、続いて３−(２−トリフルオロアセトアミドエトキシ)プロピン（３.１７ｇ、１６mmol）で処理する。混合物を室温に水浴中で冷却し、１７時間攪拌する。混合物を２％酢酸で処理し、触媒を濾過により除去し、５０％メタノールで洗浄する。濾液を合わせ、ＬiＣhroprep ＲＰ−１８カラム（５×２５cm）を通し、カラムを５０％(v/v)メタノール中の１％酢酸で洗浄し、次いで溶出する。主生産物のフラクションを合わせ、蒸発させ、真空で乾燥させる。得られる泡状物をエーテル１５０mlと攪拌し、生産物を得る；収量３.６ｇ(８５％)；m.p．１４５−１５２°。５−[３−(２−トリフルオロアセトアミドエトキシ)プロピル]−２'−デオキシウリジンメタノール(２０mＬ)中の５−[３−(２−トリフルオロアセトアミドエトキシ) プロピニル]−２'−デオキシウリジン（３.４ｇ、８.１mmol）をギ酸アンモニウム（冷９８％ギ酸３mＬ、７９mmolのドライアイス凍結２５％アンモニア２mＬ、５０mmolへの添加により製造）および１０％Ｐd／Ｃ０.２ｇと７時間、室温で水素雰囲気下攪拌する。触媒を濾過により除去し、濾液を蒸発させ、生産物を LiChroprep RP-18カラムで上記方法により精製する。所望の生産物を含むフラクションを蒸発させ、真空で乾燥させて得られる固体を乾燥エーテルでトリチル化し、３.０ｇ(８７％)生産物を得る、m.p．１０７−１１０°；０.１Ｍトリエチルアミン−酢酸（pＨ７.５）中の最大nm、２２０、２６８。Ｃ₁₆Ｈ₂₂Ｆ₃Ｎ₃Ｏ₇ の計算値：Ｃ、４５.１８；Ｈ、５.２１；Ｎ、９.８８；Ｆ、１３.４０。実測値：Ｃ、４５.１６；Ｈ、５.１６；Ｎ、９.６８；Ｆ、１３.１３）。クロラムブシル残基のオリゴヌクレオチド１級アミノ基への挿入オリゴヌクレオチドのセチルトリメチルアンモニウム塩の製造：一般にトリメチルアンモニウム塩であるオリゴヌクレオチド（５０−５００μｇ）の水性溶液１００μＬアリコートをセチルメチルアンモニウム形のＤowex ５０wx８が詰められ、水中５０％アルコールで予備洗浄したカラムに注入した。カラムを５０％水性エタノール(０.１mＬ／分)で溶出した。オリゴヌクレオチド含有フラクションをSpeedvacで２時間乾燥させ、以下の反応に使用した。オリゴヌクレオチドのセチルメチルアンモニウム塩(５０−１００μg)のエタノール溶液（５０μＬ）を、アセトニトリル（５０μＬ）中の２,３,５,６−テトラフルオロフェニル−４'−[ビス(２−クロロエチル)アミノ]フェニル酪酸(クロラムブシルのテトラフルオロフェニルエステル)０.０８Ｍ溶液およびジイソプロピルエチルアミン３μＬと混合する。３時間、室温で振った後、生産物をアセトン(１.５mＬ)中の２％ＬiＣlＯ₄により沈殿させた。生産物をアセトン中の２％ＬiＣlＯ₄により水（６０μＬ）から３回再沈殿させた。最後にオリゴヌクレオチドのクロラムブシル誘導体を逆相クロマトグラフィーで精製し、ほぼ５０− ８０％の収率であった。生産物含有フラクションをブタノールの添加により濃縮した。単離したオリゴヌクレオチドのクロラムブシル誘導体をＬiＣlＯ₄のアセトン溶液で沈殿させ、アセトンで洗浄し、真空下乾燥させた。反応性オリゴヌクレオチドの全操作を氷冷溶液中の生産物でできるだけ早く行った。ＳＢＣＯＤＮの製造Ｎ−フェノキシアセチル保護２'−デオキシグアノシンおよび２'−デオキシシチジン３'−Ｏ−２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ'−ジイソプロピルホスホロアミデイトはＢioＧenex，Ａlameda，Ｃaliforniaから商品として入手可能である。５'− Ｏ−ジメトキシトリチル−２−チオチミジン−３'−Ｏ−(２−シアノエチル−Ｎ ,Ｎ'−ジイソプロピルホスホロアミデイト)をConnolly et al.，前掲の方法を使用して製造した。２,６−ジアミノプリン−２'−デオキシリボシドをFathi et al.，前掲に記載のように合成した。Ｎ²,Ｎ⁶−ビス(フェノキシアセチル)−２,６−ジアミノプリン−２'−デオキシリボシド（化合物１、反応図式１）この化合物は実質的にSchulhof et al.(1987)Nucleic Acids Res．15，397-41 6の文献方法に従って製造する。２,６−ジアミノプリン−２'−デオキシリボシド（１.８ｇ、６.８mmol）を乾燥ピリジンと共に蒸発により乾燥させる。乾燥ピリジン３５mＬ中の２,６−ジアミノプリン−２'−デオキシリボシドの氷冷溶液中にトリメチルクロロシラン（５mＬ、３９mmol）を滴下する。３０分後、フェノキシ酢酸無水物（８.０ｇ、２８mmol）を攪拌溶液に添加する。混合物を３時間ＲＴに保ち、次いで５℃に冷却する。水（５mＬ）を添加し、過剰のフェノキシ酢酸無水物を消去する。２時間攪拌後、反応混合物をロータリーエバポレーターで約１０mＬまで濃縮し、次いで水で１２０mＬまで希釈してエマルジョンを得る。エマルジョンをエーテル（１５０mＬ）で洗浄する。得られる沈殿を濾過し、エーテル、水で洗浄し、真空乾燥させる。この方法を使用して得られる物質（３.２ｇ、８７％）は十分純粋であり、更に精製することなく次工程に使用する。５'−Ｏ−ジメトキシトリチル-Ｎ²,Ｎ⁶−ビス(フェノキシアセチル)−２,６− ジアミノプリン−２'−デオキシリボシド（化合物２）Ｎ²,Ｎ⁶−ビス(フェノキシアセチル)−２,６−ジアミノプリン−２'−デオキシリボシド（３.２ｇ、５.８mmol）を乾燥ピリジン（２×２０mＬ）と共に蒸発乾固し、同じ溶媒３０mLに溶解する。塩化４,４'−ジメトキシトリチル（２.０ｇ、６mmol）を一度に激しく攪拌しながら添加する。１時間後、ＴＬＣ(ＣＨＣl₃ ／ＭeＯＨ、１９：１v/v)は完全な反応を示す。反応混合物をロータリーエバポレーターで濃縮し、ジクロロメタンで約２００mＬまで濃縮する。飽和ＮaＨＣＯ₃ （２×２００mＬ）で洗浄後、有機相をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥させ、次いで真空で濃縮して油状物を得た。ＣＨ₂Ｃl₂中の０から５％のＭeＯＨの勾配による分取シリカゲルクロマトグラフィーにより、結晶性固体として所望の生産物を得る(３.３ｇ、６８％)。５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ²,Ｎ⁶−ビス(フェノキシアセチル)−２,６ −ジアミノプリン−２'−デオキシリボシド−３'−Ｏ−(２−シアノエチル−Ｎ, Ｎ'−ジイソプロピルホスホロアミデイト) (化合物３) ジクロロメタン(３０mＬ)およびジイソプロピルエチルアミン(４mＬ)の混合物中の化合物２(３.１ｇ、３.７mmol)の懸濁液を２−シアノエトキシＮ,Ｎ−ジイソプロピルアミノクロロホスフィン(１.６mＬ、７.２mmol)で処理する。反応物を１時間攪拌し、メタノール(０.１mＬ)の添加により停止させる。２分後、ジクロロメタン（７０mＬ）を添加し、溶液を１ＭＮaＨＣＯ₃(１００mＬ)および次いで飽和食塩水(１００mＬ)で洗浄する。有機相を乾燥させ、濾過し、溶媒を真空で除去する。粗生産物を分取シリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル／ジクロロメタン／トリエチルアミン、４５：４５：５v/v/v）で精製する。精製後、生産物を更にヘキサンに沈殿させ、無色固体を得る(２.５ｇ、６５％)。Ｎ,Ｎ,Ｎ'−トリス(９−フルオレニルメトキシカルボニル)−２,６−ジアミノプリン−２'−デオキシリボシド（化合物４、反応図式２）２,６−ジアミノプリン−２'−デオキシリボシド（２.３ｇ、８.５mmol）を乾燥ピリジンと共に蒸発により乾燥させ、同じ溶媒４０mＬに溶解する。トリメチルクロロシラン（５mＬ、３.９mmol）を氷冷溶液に滴下し、反応物を１分５℃におよび１５分ＲＴに保つ。９−フルオレニルメトキシカルボニルクロライド（６ .２ｇ、２４mmol）を添加し、反応混合物を２時間攪拌する。トリメチルシリル基および過剰な塩化物の加水分解を水（３０mＬ）の添加により行う。１８時間攪拌後、混合物をほとんど乾燥するまで蒸発させ、トルエンと共蒸発させて残ったピリジンを除去する。水（１５０mＬ）の添加により白色固体が沈殿する。懸濁液をエーテル（１００mＬ）と共に振り、次いで濾過してオフホワイト色固体を得る。ＴＬＣ（ＣＨＣl₃／ＭeＯＨ、９：１v/v）は少なくとも３つの新規生産物を示す。高いＲfの主生産物をジクロロメタン中のメタノールの勾配を使用したシリカゲルクロマトグラフィーにより単離する。生産物は白色固体（１.２g、１５％）である。５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ,Ｎ,Ｎ'−トリス(９−フルオレニルメトキシカルボニル)−２,６−ジアミノプリン−２'−デオキシリボシド (化合物５) 表題化合物をデノキシアセチル化類似体について記載の方法に従い製造し、７０％収率である。５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ,Ｎ,Ｎ'−トリス(９−フルオレニルメトキシカルボニル)−２,６−ジアミノプリン−２'−デオキシリボシド−３'−Ｏ−( ２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピルホスホルアミデイト) （化合物６）フェノキシアセチル化類似体化合物３（上記参照）について記載の一般法をこのホスホルアミデイトの製造に使用する。ヘキサノール−オキザリルプライマー支持体の製造この支持体は文献法（A1ul et al.，Nucleic Acids Res.(1991)19，1527-1532 ）と同様に製造する。溶液Ｉを、乾燥アセトニトリル(８mＬ)にＯ−(４,４'−ジメトキシトリチル)−１,６−ヘキサンジオール(５)２.８ｇ（６.７mmol）を溶解することにより製造する。溶液IIの製造のために塩化オキザリル（０.６mＬ）をアセトニトリル６０mＬ中の１,２,４−トリアゾール（２.１ｇ、３０mmol）の攪拌溶液に添加し、次いでピリジン（２mＬ）を添加して得られる沈殿を溶解する。溶液Ｉを溶液IIに攪拌しながら滴下する。１時間後、アミノ修飾プライマー支持体(２０g)(Pharmacia)を一度に添加する。懸濁液を回転攪拌器で１５分渦巻きを形成させ、次いでガラス濾過器で濾過し、メタノール(２００mＬ)、アセトン（５００mＬ）およびエーテル（２００mＬ）で洗浄する。３０分、真空で乾燥後、支持体をピリジン（６０mＬ）、酢酸無水物（６mＬ）およびＮ−メチルイミダゾール(６mＬ)の混合物で処理する。１５分後、支持体を濾過し、上記のように洗浄し、真空で一晩乾燥させる。生産物をジメトキシトリチル含量に関して、文献法（Atkinson，T.，およびSmith．M.，“Oligonucleotide Synthesis，A Prac tical Approach”,M．Gait編,IRL Press，Washington，D.C.，35-81頁(1984)）に従い分析し、具体例は、３２μmol／ｇの充填を有することが判明した。オリゴヌクレオチド合成。オリゴヌクレオチド合成は、ヘキサノールＣＧＰ（ Gamper et al.(1993)Nucleic Acids Res．21，145-150）により製造したヘキサノールプライマー支持体または上記のヘキサノールオキザリルプライマー支持体を使用して１０μmolスケールでＰharmacia Ｏrigo Ｐilot ＤＮＡ合成装置で行う。２−チオチミジンおよび２−アミノアデノシンを含むオリゴヌクレオチドの合成のための、二つの別法が使用できる。第１の方法において、Ｎ−フェノキシアセチル保護５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−２'−デオキシヌクレオシド−２−シアノエチル−Ｎ,Ｎ'−ジイソプロピルアミンホスホルアミデイトを使用する。ＤＮＡ合成サイクルは通常のホスホルアミデイトのように行う。濃縮アンモニアでの脱保護の時間は２時間、５０℃に減少する。第２の方法において、Ｆmoc保護ホスホルアミデイドを使用する。この合成はヘキサノールオキザリルプライマー支持体および標準ＤＮＡ合成サイクルを使用するが、キャッピング工程が除去される。脱保護は固体支持体を、ＤＭＦ中の０.２Ｍ１,８−ジアゾビシクロ[５. ４.０]ウンデク−７−エン（ＤＢＵ）で５分、続く１０％アンモニアで更に５分処理することにより行う。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ )，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ウー，ジンスクアメリカ合衆国98036ワシントン州リンウッド、トゥーハンドレッドフォース・ストリート・サウス・ウエスト・ナンバー・シー−201、3730番 (72)発明者ルクタノフ，ユージェニー・エイアメリカ合衆国98012ワシントン州ボゼル、ノース・ロード16520番、アパートメント・ナンバー・イー−206 (72)発明者メイヤー，リッチ・ビー・ジュニアアメリカ合衆国98011ワシントン州ボゼル、シックスティファースト・アベニュー・ノース・イースト15533番 (72)発明者ガンパー，ハワード・ビーアメリカ合衆国98078ワシントン州ウッディンビル、トゥーハンドレッドトゥエルフス・ドライブ・ノース・イースト14048番

Claims

【特許請求の範囲】１．各オリゴヌクレオチド（ＯＤＮs）が天然起源のアグリコン塩基と（１）Ａ'、Ｔ'、（２）Ｇ'、Ｃ'および（３）Ａ'、Ｔ'、Ｇ'、Ｃ'の組からなる群から選択される修飾アグリコン塩基の組み合わせを有するヌクレオチド部分を含んでなるオリゴヌクレオチド（ＯＤＮs）対であって、該ＯＤＮs対の二本鎖は生理的条件下でおよそ４０℃以下の融解温度を有し、該ＯＤＮs対のそれぞれがワトソン・クリック型で二本鎖標的配列の２つの鎖の一方に対して実質的に相補的であり、修飾塩基を有するヌクレオチド部分は、相補的オリゴヌグオチドの中で、Ａ'はＴ'と安定に水素結合した塩基対を形成しないが、Ｔとは安定に水素結合した塩基対を形成し、相補的オリゴヌグオチドの中で、Ｔ'はＡ'と安定に水素結合した塩基対を形成しないが、Ａとは安定に水素結合した塩基対を形成し、相補的オリゴヌグオチドの中で、Ｇ'はＣ'と安定に水素結合した塩基対を形成しないが、Ｃとは安定に水素結合した塩基対を形成し、相補的オリゴヌグオチドの中で、Ｃ'はＧ'と安定に水素結合した塩基対を形成しないが、Ｇとは安定に水素結合した塩基対を形成する、という特徴を持ち、オリゴヌグオチド対は、所望により共有結合テザーによりお互いに連結している、オリゴヌグオチド（ＯＤＮs）対。２．ヌクレオチド部分Ａ'が式(i)、(ii)および(iii) 式中、ＸはＮまたはＣＨであり、ＹはＯまたはＳであり、ＺはＯＨまたはＣＨ₃であり、ＲはＨ、ＦまたはＯＲ₂であり、ここでＲ₂はＨ、Ｃ_1-6アルキルまたはアリルであり、Ｒ₁はＣ_1-4アルキル、Ｃ_1-4アルコキシ、Ｃ_1-4アルキルチオ、ＦまたはＮＨＲ₃ であり、ここでＲ₃はＨまたはＣ_1-4アルキルであり、プリンの８位、ピラゾロピリミジンの３位またはピロロピリミジンの５位は、所望により架橋機能またはレポーター基の結合点として働く、により示される群から選択される構造を有する、請求項第１項に記載のＯＤＮs。３．ヌクレオチド部分Ｔ'が式(iv) 式中、ＹはＯまたはＳであり、ＺはＯＨまたはＣＨ₃であり、ＲはＨ、ＦまたはＯＲ₂であり、ここでＲ₂はＨ、Ｃ_1-6アルキルまたはアリルであり、Ｒ₄はＨ、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_1-6アルケニル、Ｃ_1-6アルキニルであるか、または所望により、ピリミジンの５位は、架橋機能またはレポーター基の結合点として働く、を有する、請求項第１項に記載のＯＤＮs。４．ヌクレオチド部分Ｇ'が式(v)、(vi)および(vii)、式中、ＸはＮまたはＣＨであり、ＹはＯまたはＳであり、ＺはＯＨまたはＣＨ₃であり、ＲはＨ、ＦまたはＯＲ₂であり、ここでＲ₂はＨ、Ｃ_1-6アルキルまたはアリルであり、Ｒ₁はＨ、Ｃ_1-4アルキル、Ｃ_1-4アルコキシ、Ｃ_1-4アルキルチオ、ＦまたはＮＨＲ₃であり、ここでＲ₃はＨまたはＣ_1-4アルキルであり、プリンの８位、ピラゾロピリミジンの３位またはピロロピリミジンの５位は、所望により、架橋機能またはレポーター基の結合点として働く、により示される群から選択される構造を有する、請求項第１項に記載のＯＤＮs。５．ヌクレオチドＣ'が式(viii)および(ix) 式中、ＹはＯまたはＳであり、ＺはＯＨまたはＣＨ₃であり、ＲはＨ、ＦまたはＯＲ₂であり、ここでＲ₂はＨ、Ｃ_1-6アルキルまたはアリルであり、Ｒ₄はＨ、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_1-6アルケニル、Ｃ_1-6アルキニルであるか、または所望により、ピリミジンの５位は、架橋機能またはレポーター基の結合点として働き、Ｚ₁はＯまたはＮＨであり、Ｒ₅はＨまたはＣ_1-4アルキルである、で示される群から選択される構造を有する、請求項第１項に記載のＯＤＮs。６．ヌクレオチド部分Ａ'が式(i)に従う構造を有する、請求項第２項に記載のＯＤＮs。７．ＸがＮであり、ＺがＯＨであり、ＹがＯである、請求項第６項に記載のＯＤＮs。８．Ｒ₁がＮＨ₂である、請求項第７項に記載のＯＤＮs。９．ＺがＯＨであり、ＹがＯである、請求項第３項に記載のＯＤＮs。１０．Ｒ₄がＣＨ₃である、請求項第９項に記載のＯＤＮs。１１．ヌクレオチド部分Ｇ'が式(v)に従う構造を有する、請求項第４項に記載のＯＤＮs。１２．ＸがＮであり、ＺがＯＨであり、ＹがＯである、請求項第１１項に記載のＯＤＮs。１３．Ｒ₁がＨである、請求項第１２項に記載のＯＤＮs。１４．ヌクレオチド部分Ｃ'が式(viii)に従う構造を有する、請求項第５項に記載のＯＤＮs。１５．ＺがＯＨであり、Ｚ₁がＮＨであり、ＹがＯである、請求項第１４項に記載のＯＤＮs。１６．Ｒ₅がＨである、請求項第１５項に記載のＯＤＮs。１７．およそ５から９９個のヌクレオチド単位を有する、請求項第１項に記載のＯＤＮs。１８．各ヌクレオチドが２'−デオキシリボヌクレオチドである、請求項第１項に記載のＯＤＮs。１９．各ヌクレオチドがリボヌクレオチドである、請求項第１項に記載のＯＤＮs。２０．２−Ｏ−メチルリボース部分を有するヌクレオチド単位を少なくとも１つ含んでなる、請求項第１項に記載のＯＤＮs。２１．少なくとも１つのヌクレオチド単位に共有結合させた架橋剤を含んでなる、請求項第１項に記載のＯＤＮs。２２．レポーター基を含んでなる、請求項第１項に記載のＯＤＮs。２３．修飾アグリコン塩基の組み合わせがＡ'、Ｔ'である、請求項第１項に記載のＯＤＮｓ。２４．修飾アグリコン塩基の組み合わせがＧ'、Ｃ'である、請求項第１項に記載のＯＤＮs。２５．修飾アグリコン塩基の組み合わせがＡ'、Ｔ'、Ｇ'、Ｃ'である、請求項第１項に記載のＯＤＮs。