JPH09505556A - 蛍光性ｎ−ヌクレオシド及び蛍光性ｎ−ヌクレオシド構造類似体の応用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 生理的条件下で本来的に蛍光性を有する、ＲＮＡおよびＤＮＡに通常存在する６つの非蛍光Ｎ−ヌクレオシドの構造類似体が同定され、それらの製造方法が提供された。該類似体は、酵素的または化学的合成によって、ＤＮＡまたは／およびＲＮＡオリゴヌクレオチド中に取り込まれ、規定された配列を有する蛍光オリゴヌクレオチドが製造される。そのような類似配列は、該蛍光オリゴヌクレオチドがハイブリダイズできる鋳型または標的ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列と、同一であるかまたは類似した相補体である。本発明のＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブを供給する方法、該方法に用いられる中間体、オリゴヌクレオチドの増幅、検出、同定、および／またはハイブリダイゼーションアッセイに本発明のプローブを用いる方法もまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 蛍光性Ｎ−ヌクレオシド及び蛍光性Ｎ−ヌクレオシド構造類似体の応用 発明の背景 Ａ．発明の属する技術分野 本発明はＤＮＡやＲＮＡ中に普遍的に存在する非蛍光ヌクレオシドの蛍光構造 アナログ、それらの誘導の方法及びそれに続く蛍光オリゴヌクレオチドの合成に おける使用、そしてそれらの蛍光モノマーとしての及び特定の配列の蛍光オリゴ ヌクレオチドの中においての、新しく有用な応用に関するものである。加えて、 本発明は蛍光構造アナログが特定のＤＮＡもしくはＲＮＡ配列中で特定の非蛍光 ヌクレオシドと置換される応用法、及び蛍光オリゴヌクレオチドを診断や治療の 目的または診断や治療の研究の道具として、ハイブリダイゼーションの試薬やプ ローブとして使用する方法に関するものである。Ｂ．技術の全般的な記述 あらゆる所から得られるＤＮＡやＲＮＡの組成において主成分である、６つの 普遍的に存在するＮ−ヌクレオシドは図１に示される構造を持っているが、図の 中でＲ₆はイノシンにおいてＨでありグアノシンにおいてはＮＨ₂、Ｒ₉はウリジ ンにおいてＨでありチミジンにおいてＣＨ₃である。さらにＲ₁₂，Ｒ₁₄はリボヌ クレオチドにおいてＯＨである。２｀−デオキシヌクレオチド（2｀-deoxy nucl eotides）においてはＲ₁₂はＯＨ、Ｒ₁₄はＨであり、３｀−デオキシヌクレオチ ド（3｀-deoxy nucleotides）においてはＲ₁₂はＨ、Ｒ₁₄はＯＨ、であり、ジデ オキシヌクレオチド（dideoxy nucleotides）においてＲ₁₂,Ｒ₁₄は共にＨである 。 ６つの普遍的ヌクレオチドは２９０ｎｍより大きい波長の光は吸収せず、生理 的条件下においては実際上非蛍光である。様々な合成、診断及び治療目的の、普 遍的Ｎ−ヌクレオシドの誘導体は良く知られているが、その中にはヘテロサイク リック（heterocyclic）な塩基やフラノース環の置換体が含まれる。これらの置 換は図２に示された位置において可能であるが、その中でＲ₄は検出可能なラベ ル（ＮＨ₂、ＳＨ、＝Ｏであり、それらはアミド、チオエーテル、あるいはジス ルフィド結合を含む（がそれに限らない）、あるいは任意の結合相手、もしくは 追加の様々な反応基、Ｒ₁からＲ₃（例えばＲ₁−（ＣＨ₂）_x−Ｒ₂またはＲ₁−Ｒ₂ −（ＣＨ₂）_x−Ｒ₃−など（ｘは１から２５の間の整数であり、Ｒ₁、Ｒ₂及びＲ₃ はＨ、ＯＨ、アルキル基、アシル基、アミド基、チオエーテル基またはジスルフ ィド基であり得る）の組み合わせ）；Ｒ₅はＨまたはＲ₄とのエテノ結合の一部； Ｒ₆はＨ，ＮＨ₂、ＳＨまたは＝Ｏ；Ｒ₉は水素、メチル基、臭素（bromine）、フ ッ素（fluorine）またはヨウ素（iodine）もしくはアルキルまたは芳香族置換体 、もしくはアミド基、チオエーテル基またはジスルフィド結合を含む任意の結合 相手、もしくはＲ₁−（ＣＨ₂）_x−Ｒ₂またはＲ₁−Ｒ₂−（ＣＨ₂）_x−Ｒ₃−（ｘ は１から２５の範囲の整数）のような組み合わせ；Ｒ₁₀は水素または酸感受性の 塩基の安定なブロッキング官能基、もしくはリン誘導体、Ｒ₁₁＝Ｒ₁₂＝Ｈ；Ｒ₁₂ は水素、ＯＨまたはリン誘導体；Ｒ はＨ、ＯＨまたはＯＲ（Ｒは保護基もしく は追加的な蛍光担体）である。Ｎ−ヌクレオシドやＣ−ヌクレオシドにおけるＮ やＣの文字はグリコシジル共有結合が糖やヘテロサイクリック塩基において結合 している原子を示している。普遍的ヌクレオシドの場合、塩基はアデニン、グア ニン、シトシン、イノシン、ウラシルまたはチミンのいずれかである。塩基はフ ラノース糖に結合しているが、その一般的な構造は図３に示している。蛍光アナ ログの糖置換体はすべてのＲ基について同じ番号付けの体系を共有するが、いく つかのヘテロサイクリックアナログについての番号付けの体系は異なる場合もあ る。I．ヌクレオチドの既知のラベル法 ヌクレオチド配列は、ターゲットＤＮＡやＲＮＡとハイブリダイズする診断や 治療用のプローブや、ターゲット配列の増幅を含む様々な応用に一般的に用いら れている。ヌクレオチド配列のラベルが必要になる、又は便利であることがよく ある。A．放射性同位元素を用いたオリゴヌクレオチドプローブのラベル法 特異的なＤＮＡまたはＲＮＡ配列のハイブリダイゼーションは典型的には最小 ５塩基から１０、０００塩基（１０ｋｂ）以上の範囲の長さを持つオリゴヌクレ オチドのアニーリングを含む。近年の研究目的に用いられるオリゴヌクレオチド プローブの大半は放射活性によりラベルされている；しかし（ａ）一般的な使用 における同位体の短い半減期（ｂ）安全性の必要及び（ｃ）放射活性を持つプロ ーブの取り扱いや廃棄の費用、が理由で簡便で感度の良い非同位性（non-isotop ic）の検出方法がハイブリダイゼーション診断法の広範囲にわたる普及と応用を 達成するために求められる。B．オリゴヌクレオチドプローブのラベリングの非同位元素による方法 一般的に現在利用できる非同位性のハイブリダイゼーションプローブの検出法 のすべてが、検出のために抗体の結合、酵素的な作用、または結合した”レポー ター”分子の蛍光または化学発光などの、ヌクレオチドのある種の誘導によって いる。多くの場合、オリゴヌクレオチドは一般に環内または環外の特定の位置で 同じレポーター基の単一のもしくは複数の分子を取り込むことにより誘導される 。レポーター基をとりつける技術は、 （ａ）モノメリックなヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドの５｀または３｀ 末端の脱保護化されたオリゴヌクレオチドを用いた水もしくは非常に親水性の溶 媒中での種種の化学反応による機能化（Cardullo et al．［1988］PNAS 85:8790 -8794）（ｂ）（ｉ）保護された反応性の官能基、例えばＮＨ₂、ＳＨ，ＣＨＯや ＣＯＯＨなど（ｉｉ）ＮＨＳエステル、アルデヒドまたはヒドラジド（hydrazid es）のような活性化しうる単機能のリンカー、もしくは（ｉｉｉ）ヘテロサイク リック塩基またはフラノース部位に結合したビオチンのようなアフィニティーバ インディンググループの合成（完全なオリゴヌクレオチドまたはターミナルトラ ンスフェラーゼまたは”ニックトランスレーション”（Brumbaugh et al．［198 8］PNAS 85:5610-5614; Sproat，B.S.，A.I．Lamond，B．Beijer，P．Neuner，P ．Ryder［1989］Nucl．Acids Res．17:3371-3386; Allen，D.J.，P.L．Darke，S .J．Benkovic［1989］Biochemistry 28:4601-4607）を通して化学合成の間にオ リゴヌクレオチド内に引き続いて取り込まれるモノメリックヌクレオシドに修飾 がなされる。） （ｃ）例えば５’−アミノヘキシル−３’−Ｏ−フォスフォルアミダイト(Hara lambidis，J.，L．Duncan，G.W．Tregar［1990］Nucl．Acids Res．18:493-499) のように化学的合成の間に保護されたオリゴヌクレオチドの５’末端に結合され うる適当な保護をされた化学物質の使用 （ｄ）糖部分またはポリマーのフォスフォジエステル骨格中への官能基の付加（ Conway，N.E.，J．Fidanza，L.W．McLaughlin［1989］Nucl．Acids Res．Sympos ium Series 21:43-44; Agrawal，S.，P.C．Zamecnik［1990］Nucl．Acids Res． 18:5419-5423） に大きく依存している。 最も単純な方法では、非ヌクレオチドリンカーとラベルが酵素的または化学的 方法により、存在するオリゴヌクレオチドの３’または５’末端に付加される。 ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖配列中のヌクレオシド残基の修飾は、反応条件がＲＮＡや ＤＮＡオリゴマーが無傷で、しかし、通常のワトソン−クリック型塩基対形成や スタッキング相互作用できる反応産物を得ることが可能なほど穏やかでなければ ならないことから、難しい操作であることが明らかにされている（図４参照）。C．複素環式塩基の誘導体化（Ｂ） 環内や環外両方の誘導のためのいくつもの方法が述べられてきたが、それらに は以下のものが含まれる。(1)ハプテンラベリング ＤＮＡプローブがアミノ修飾され、続いてラベルとして発光性の基質を用いて 作用させることができる、酵素結合を施された抗ハプテン抗体が結合する２、４ −ジニトロフェノール（ＤＮＰ）のようなハプテンを持つように誘導される（Ke ller et al．［1988］Analytical Biochemistry 170:441-450）。(2)アミノおよびチオール誘導オリゴヌクレオチド TakedaとIkeda（[1984]Nucl．Acids Research Symposium Series 15:101-104 ）はプトレセイニルチミジン（putresceinyl thymidine）のフォスフォトリエス テル誘導体をアミノ誘導されたオリゴマーの調製に用いた。RuthらはＣ５の長さ で一級アミンの”リンカーアーム”の１２炭素を用いてデオキシウリジンアナロ グを合成する方法について述べている（Jablonski et al．［1986］Nucl．Acids Res．14:6115-6128）。これらはその後蛍光分子を生成するために蛍光体と反応 させ られた。UrdeaとHornは１９９０年にＣ₄の６−アミノ基が修飾されたピリミジン 誘導体に関する特許を取得した（U.S．Patent No．4,910,300）。３’と５’が アミノ修飾されたフォスフォルアミダイト（Phosphoramidites）は化学的合成も しくは誘導されたオリゴヌクレオチドにおいて広く用いられており商品として入 手できる。(3)フォトビオチンまたは他のビオチン化試薬を用いたラベリング ビオチンのアビジンに対する高い親和性は、酵素的に結合させることや化学発 光性の試薬を誘導されたＤＮＡプローブに結合させるのに利用されてきた（Fost er et al．［1985］Nucl．Acids Res．13:745-761）。他のリンカーに結合され たビオチンもまた広く利用されてきたが、それらはビオチン−ＮＨＳエステル（ Bayer，E.A.，M．Wilchek［1980］Methods in Biochemical Analysis 26:1）、 ビオチンスクシンアミド（Lee，W.T.，D.H．Conrad［1984］J．Exp．Med．159:1 790）、そしてビオチンマレイミド（Bayer，E.A．et al．［1985］Anal．Bioche m．149:529）を含む。Reisfeldら（[1987] BBRC 142:519-526）はビオチンハイ ドロアジド（biotin hydrazide）をシチジンの４−アミノ基をラベルするのに用 いた。アデニンの６位、シトシンの４位、そしてグアニンの２位におけるそのよ うな誘導に対して、Klevanらに１９８９年に特許が与えられた（U.S．Patent No ．4,828,979）。これらの誘導は水素結合そして塩基対形成を阻害するため、ハ イブリダイゼーションに使うオリゴマーを生成する場合においては用途が限られ てきた。(4)dU-ビオチンラベリング ヌクレオシド５’−トリフォスフェイトまたは３’−Ｏ−フォスフォルアミダ イト（3’-O-phosphoramidites）はウラシルの５位においてアリファチックアミ ノ基（aliphatic amino group）と結合したビオチンにより修飾された（Langer et al．［1981］PNAS 78:6633-6637; Saiki et al．[1985]Science 230:1350-13 54）。ヌクレオチドトリフォスフェイト誘導体は”ニックトランスレーション” の標準的な技術により二重鎖ＤＮＡに効率的に取り込まれる。一度オリゴヌクレ オチドに取り込まれればその残基は、蛍光、化学発光または酵素的作用による検 出に利用できるアビジン、ストレプトアビジンもしくは抗ビオチン抗体に結合さ れる。(5)11-ジゴキゲニン-ddUTPラベリング 酵素ターミナルトランスフェラーゼはオリゴヌクレオチドの３’末端に一つの ジゴキゲニン-11-ジデオキシUTP（digoxigenin-11-dideoxyUTP）を結合するのに 使われている。続いての標的核酸へのハイブリダイゼーションにより、DIG-ddUT Pラベルされたハイブリダイゼーションプローブは、対をなす抗DIG抗体を使用し て検出された。(6)AAIF 蛍光抗体による検出は、プローブが例えばビオチン−１１−ＵＴＰにより誘導 されたＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに対して特異的なモノクローナルＦａｂ’断 片を使用して行うことができる（Bobo et al．［1990］J．Clin．Microbiol．28 :1968-1973; Viscidi et al．［1986］J．Clin．Microbiol．23:311-317）。(7)シトシンのビサルファイト修飾 DraperとGold（[1980] Biochemistry 19:1774-1781）はビサルファイト（bisu lfite）により触媒された終結反応によりシチジンに脂肪族アミノ基（alphatic amino groups）を導入した；アミノ基は続いて蛍光タグによりラベルされた。こ の手順ではアミノ基はピリミジン塩基に直接結合している。ウラシルの誘導のよ うにこれらの誘導は水素結合や塩基対形成を阻害するため、ハイブリダイゼーシ ョンオリゴマーを効率よく生成するのに有用とは限らない。(8)フルオロフォアが誘導するDNAプローブ テキサスレッド（スルフォクロロ−ローダミン（Sulfochloro-Rhodamine）） 誘導されたプローブは、特定の標的ＤＮＡにハイブリダイズするものやフローサ イトメーターまたは顕微鏡を使用して検出できるものが商業的に入手可能である 。何人もの著者が５’または３’末端にアミノ基またはチオール基を持つ化学的 に合成されたオリゴヌクレオチドに蛍光単体を結合させることについて報告して いる（Brumbaugh et al．［1988］Nucleic Acids Res. 16:4937-4956）。(9)直接的酵素ラベリング 化学的に合成されたプローブに酵素を直接化学的に結合させることは、基質の 変換を通して直接検出するのに使われてきた。例えば、Urdeaらは複数のＤＮＡ プローブハイブリダイゼーションを固定相に標的ＤＮＡを結合するのに用い、そ の後それをさらに追加的なアルカリホスファターゼにより誘導されたハイブリダ イ ゼーションプローブによりラベルするオリゴヌクレオチドサンドイッチアッセイ について述べている（Urdea et al．［1989］Clin．Chem．35:1571-1575）。(10)アクリジニウムエステルラベリング（Acridinium ester labeling） １分子のメチルアクリジニウム（methyl acridinium）のフェニルエステルが ＲＮＡまたはＤＮＡプローブの中央部に付加される。エステルの加水分解により アクリドン（acridone）、ＣＯ₂および光が放出される。ハイブリダイズしてい ないプローブのエステルは標的となるＲＮＡまたはＤＮＡにハイブリダイズして いるプローブ上のエステルよりも早く加水分解されるため、ハイブリダイズした プローブの化学発光はフリーのプローブのそれから区別可能であり”ハイブリダ イゼーションプロテクションアッセイ”において使用される（Weeks et al．［1 983］Clin．Chem．29:1474-1479）。D．フラノース環の誘導体化（Ｆ） フラノース環（図３のＲ₁₁からＲ₁₄）とオリゴヌクレオチドのフォスフォジエ ステル骨格（図３のＲ₁₀）における誘導の方法が報告されている。(1)ヌクレオチド内に結合したレポーター基(R₁₀部位) フォスフォロ−チオエートエステル（phosphoro-thioate esters）がモノブロ モビマン（monobromobimane）のような蛍光担体の結合部位を提供するのに使用 されてきた（Conway et al．［1989］Nucl．Acids Res．Symposium Series 21:4 3-44）。AgrawalとZamecnik（[1990] Nucl．Acids Res．18:5419-5423）はアミ ン特異的レポーター基（例えばモノブロモビマン）やチオール特異的レポーター 基（例えばフルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocyanate） をＤＮＡのフォスフォジエステル骨格をそれぞれフォスフォルアミダイトやフォ スフォロチオエートジエステル（phosphorothioate diesters）へと修飾するこ とにより取り込む方法を報告している。(2)配糖体性のレポーター基(R₁₁からR₁₄部位) Smith、Fung及びKaiser（[1989] U．S．Patent No．4,849,513）はアリファチ ックアミノ基をＲ₁₀に導入することによる誘導体の取りそろえと、ヌクレオシド やヌクレオシドアナログのグリコシド部分へのラベルのための合成について述べ ている。著者らは化学的にまたは酵素的につくられた元来蛍光性のオリゴヌクレ オチドのいかなる使用や応用についても、あるいは蛍光ヌクレオシドアナログま たはその誘導体の使用についても報告も主張もしていない。E．オリゴヌクレオチドをラベルする非同位元素法の限界 非放射性の検出可能なオリゴヌクレオチドの種類を作り出すためには、ＤＮＡ やＲＮＡプローブに使用されるヌクレオシドを化学的に修飾することが必要であ るがこのことがそのようなプローブ調製を高価でわずらわしいものにしてきた； 多くの場合検出するための化学反応も実際使用するには煩わしく高価であること が明らかになっており、それらのことが臨床研究室における重要な応用法を発見 することの失敗の大きな原因である。それらのハイブリダイゼーションへの応用 では化学的に誘導されたプローブの他の制約も明らかになってきた。 （１）化学的に誘導されたｄＮＴＰは、増幅されたＤＮＡのラベリングがＰＣＲ 増幅におけるデオキシヌクレオチドトリフォスフェイトのストックとして使用す ることは一般的に費用に見合わないので（ｉ）予めラベルされたプライマーを用 いた増幅または（ｉｉ）ラベルされたハイブリダイゼーションプローブとのアニ ーリングに限られて使用される。前者を使用することは（ｉ）増幅の間における プライマーのＤＮＡ上の非標的領域への非特異的アニーリング、もしくは（ｉｉ ）以前の増幅実験から残っている研究室環境中に存在する増幅物の混入、による 増幅中の偽陽性を頻繁に生ずる。費用とハイブリダイゼーション後のプロセッシ ングにおける技術的困難は、ラベルされたハイブリダイゼーションプローブの研 究と応用を制限してきた。 （２）塩基対合は、配列中の不適当な部位へのかさばったまたは非水素結合塩基 の導入を通して、誘導された塩基からつくられた多くのオリゴマーにおいて邪魔 される。多くの臨床サンプルの元から存在する化学発光のバックグラウンドによ って、アクリジニウムエステルプローブでさえその理論的な検出感度のレベルを 達成することができない。ハイブリダイゼーション後のプロセッシングの必要性 はそのような方法に制約を残している。 （３）大量に安価に生成できる非放射性ラベルされたプローブを提供することは 困難であることが明らかになっている。 （４）化学発光性のプローブは寿命が短く、今までテストされたプローブは定量 することや正確に”リプローブ”することが困難である。 （５）殆どの場合のハイブリダイゼーションは推測されるだけであり、非定量的 もしくは半定量的で自動化できないものである。 これらの制約は、臨床研究試験や治療目的の使用へのＤＮＡやＲＮＡハイブリ ダイゼーションプローブの応用を妨げてきた。F．蛍光性Ｎ−ヌクレオシドと蛍光性構造類似体 原型的な蛍光ヌクレオチドアナログであるフォルマイシンＡ（Formycin A）（ 一般的にフォルマイシンと呼ばれる）は、元々Nocardia interformaの培養濾液 から抗腫瘍抗生物質として単離され（Hori et al．［1966］J．Antibiotics，Se r．A 17:96-99）、その構造が７−アミノ−３−ｂ−Ｄ−リバフラノシル（１Ｈ −ピラゾロ−［４，３ｄ］ピリミジン）［7-amino-3-b-D-ribafuranosyl(1H-pyr azolo-[4,3d]pyrimidine)］と同定された（図５と６）。この抗生物質［Strepto myces lavendulae（Aizawa et al．［1965］Agr．Biol．Chem．29:375-376）お よびStreptomyces gummaensis（日本国特許番号10,928／1967年に「Nippon Kaya ku Co.，Ltd.」に特許された）の培養液からも単離された］は、あらゆる由来の ＲＮＡ中に普通に見られる、数ある微生物性のＮ−ヌクレオシドのＣ−ヌクレオ シドアナログのうちの一つである。微生物から単離された自然に存在する他のＣ −ヌクレオシド（図４）はフォルマイシンＢ（Koyama et al．［1966］Tetrahed ron Lett. 597-602; Aizawa et al.，supra; Umezawa et al．［1965］Antibiot ics Ser．A 18:178-181）、オキソフォルマイシンＢ（oxoformycin B）（Ishizu ka et al.[1968]J．Antibiotics 21:1-4; Sawa et al．［1968］Antibiotics 21 :334-339）、シュードウリジン（pseudouridine）（Uematsu and Suahdolnik［1 972］Biochemistry 11:4669-4674）、ショードマイシン（Showdomycin）（Darna ll et al．［1967］PNAS 57:548-553）、ピラゾマイシン（pyrazomycin）（Swee ny et al．［1973］Cancer Res．33:2619-2623）、そしてミニマイシン（minimy cin）（Kusakabe et al．［1972］J．Antibiotics 25:44-47）を含む。フォルマ イシン、フォルマイシンＢ、そしてオキソフォルマイシンＢはピラゾロピリミジ ンヌクレオシド（pyrazolopyrimidine nucleosides）であり、それぞれアデノシ ン、イノシン及 びヒポキサンチンの構造アナログである；自然界から得られたグアノシンのピラ ゾピリミジン（pyrazopyrimidine）構造アナログは文献中に報告されていない。 これらの化合物の生合成に関する詳細なレビューはOchi et al．（1974）J．Ant ibiotics xxiv:909-916に記載されている。ヌクレオチド類似体の物理的性質 Ｃ−ヌクレオシドのうちのいくつかは抗微生物、抗ウイルスまたは抗腫瘍化合 物として知られているため、それらの化学誘導及び物理的性質は詳しく調べられ 、ＤＮＡやＲＮＡ中に普通に見いだされるＮ−ヌクレオシドの構造や合成と比較 されてきた。１９６０年代の後半に、６つの普通に存在するＮ−ヌクレオシドの いくつかの構造アナログが生理的条件下で蛍光性であることが発見された；例え ば得られたタイプの、例えばＣ−ヌクレオシドのすべての構造アナログがすべて 蛍光性な訳ではなく、蛍光性が構造アナログのすべての特定の種類の独占的ある いは元来の性質という訳でもない。本発明者は、ピラゾロ（pyrazolo）及びピロ ロ（pyrolo）ピリミジンやプリンのうち一部だけが蛍光性であり、その性質は図 ５から図１１にその構造が示されているいくつかの置換されたＮ−ヌクレオシド 、アザヌクレオシド（azanucleosides）、エテノヌクレオシド（ethenonucleosi des）を含む（がそれに限らない）いくつかのヌクレオシド誘導体や構造アナロ グにも共有されていることを示した。四角い枠によって囲まれている図５から図 １１に示される構造は、以前に報告されたものか、本発明を生み出す過程で蛍光 性であることが見いだされたものである。 蛍光アナログを含む、性質が明らかにされていないオリゴマーがWardらにより 物理的研究のために、当時利用できたヌクレオシドポリメラーゼ酵素を使用して 調製された（Ward et al．［1969］J．Biol．Chem．244:3243-3250; Ward et al .［1969］loc cit 1228-1237）。蛍光ヌクレオシドもしくはその構造アナログを 合成あるいは分子生物学のハイブリダイゼーション技術と絡めたり、そこから蛍 光オリゴヌクレオチドを合成するのに使用する試みについては文献中には最近の 報告はない。 本発明の簡単な要約 本発明は蛍光性のヌクレオシドアナログに関するものである。これらの蛍光ヌ クレオシドアナログはヌクレオチド配列の合成やラベリングにおけるモノマーと して有益である。本発明はさらにオリゴヌクレオチドプローブの合成において自 然界に存在するヌクレオシドを代替することができるこれらの蛍光ヌクレオチド の使用にも関係する。ハイブリダイゼーションのプローブとして使用した場合、 そのようなオリゴヌクレオチドの蛍光は、特定の遺伝子配列を検出し同定する診 断のためのツールとして用いることが可能である。この手法は酵素や反応性の蛋 白質と結合させたヌクレオチドを利用せず、ハイブリダイゼーションの検出にハ イブリダイゼーション後の処理を必要としないという点において他の非放射性プ ローブ検出法とは区別される。 「背景」の章で述べたように、ＤＮＡやＲＮＡプローブ技術において近年使用 されている方法や組成には多くの欠点がある。本発明の目的は（ｉ）鋳型または 標的ＤＮＡに相補的な配列中の決められた位置に現れる、元の非蛍光ヌクレオチ ドの特定の置換体として、また（ｉｉ）鋳型の、産物の、増幅された、あるいは 標的のＤＮＡまたはＲＮＡの特定の配列の同定と検出のためのラベルとして、規 定された配列中に直接取り込ませられる蛍光ヌクレオシド及びその蛍光構造アナ ログの利用を通して、以前の技術のこれらの欠点を克服することである。 本発明の他の目的として、新たな、元来蛍光性のヌクレオシド及びヌクレオシ ドアナログ、及び新たなトリフォスフェイト及びフォスフォルアミダイト型を提 供することであるが、それらはラベルされたポリヌクレオチドプローブ、増幅物 、診断物、及び治療物の合成に役立つ。本発明の更なる目的は、標的ＤＮＡある いはＲＮＡの規定された配列と特異的なワトソン−クリック型塩基対を形成でき る自己蛍光オリゴヌクレオチドを作る方法を提供することである。 本発明の他の目的は、本発明の方法に従って合成された蛍光ヌクレオチドアナ ログ及びそこから作られたオリゴヌクレオチドを既知のＤＮＡおよびＲＮＡ核酸 配列の同定、存在の検出や機能の変更に使用する方法を提供することである。加 えて、検出方法の発展及び簡素化、ＤＮＡおよびＲＮＡハイブリダイゼーション 技術の、応用と使用を簡素化することが目的である。 本発明の別の面として、ＤＮＡ二重鎖の両方ではなく、センス鎖だけまたはア ンチセンス鎖だけに相補的で、片方のみに結合する核酸プローブを作製する（非 対称的な合成）ための酵素的方法が提供される。非対称的な合成がすばやく定量 的な核酸プローブ試験法、アッセイ法、診断法そして治療法を開発するのに必要 な条件であるということは、本発明の重要な一面である。非対称的合成の重要な 一面は、二重鎖のうちの片方の鎖のみを鋳型として用い、プロモーター、プライ マー、またはリンカーにより修飾されたプライマーを、オリゴヌクレオチドまた はオリゴマーの合成または単離を方向付けする際に非対称的に使用することに依 存するということである。 また本発明の別の側面として、一個の核酸、ジェノミックＤＮＡ、または染色 体上の独立で唯一の標的部位に同時にハイブリダイズできる非対称的なプローブ の”カクテル”を同時に合成ために用いられる複数の異なる鋳型において、非対 称的な合成が、方向付けされた使用を可能にするということがある。プローブ” カクテル”の発明の重要な一面は、実施例７に示されている多コピーのタンデム リピートインタージェニック配列（tandem repeat intergenic sequences）のよ うに、もし一つのゲノム上に同じ標的配列が複数コピー存在すると、非対称なプ ローブの一つの鋳型が、配列は同じだがゲノム上の位置が広い範囲に散らばって いるようなゲノム上の多くの標的に結合する”カクテル”を作り出すのに利用で きるということである。 本発明の一つの面として、オリゴヌクレオチドの合成、ラベリング、そして検 出に有用な、図５〜図１１の構造式を持つ、普通に存在するヌクレオシドの蛍光 構造アナログとその誘導体を提供するということがある。普通に存在するヌクレ オシドはその特徴として、図４に示すようなワトソン−クリック塩基対合と呼ば れる水素結合を、特異的なドナー／アクセプターの関係で形成する。適当な場所 では、普通のヌクレオシドのワトソン−クリック水素結合形成に類似した形を再 現することができる特定の蛍光ヌクレオシドアナログを、例えば図４におけるＡ ：Ｔとフォルマイシン：Ｔのようにドナー／アクセプターの形で提供する。 本発明の別の面として、自然界に存在するヌクレオシドの蛍光構造アナログの 、Ｒ₁₀、Ｒ₁₂およびＲ₁₄部位を（ｉ）ＤＮＡまたはＲＮＡの合成において活性化 すること、及び（ｉｉ）構造アナログからの蛍光の共鳴エネルギー転移における 活性化状態へ誘導するステップを含む、作製と誘導の方法が提供される。 さらに本発明の別の面として、ポリヌクレオチドプローブの合成と使用の方法 が蛍光構造アナログもしくはその誘導された形のうちの一つまたは複数を使用し て提供される、ということがある。そのようなプローブは、多数の単鎖または二 重鎖ポリヌクレオチドを含むサンプルのスクリーニングに使用できるし、目的の 配列が存在するならば、ハイブリダイゼーションによりラベルし、検出し、同定 することができる。蛍光オリゴヌクレオチドプローブを、図１２〜図１８に描か れたような”ソリューションハイブリダイゼーション”法に使用できることは本 発明の重要な一面である。 先に述べた目的に従えば本発明は、そこから作製されたオリゴヌクレオチドを ラベル、修飾、あるいは同定するのに使用できる元来蛍光性のヌクレオシド、そ れらの元来蛍光性のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションプローブとし ての使用、及びヌクレオチド配列の検出方法を含む。 本発明の重要な一面は蛍光担体の安定な蛍光放射、そしてサンプル中に存在す る蛍光担体の量を検出し定量するための「time-resolved分光器」または光子計 数の利用である。 さらなる方式、長所、使用法、及び本発明の新たな特徴は以下の「説明」中に 述べられるが、一部は以下の方法を試験して当業者に明らかになるか、本発明を 実現することで修得されるであろう。図面の簡単な説明 図１はＤＮＡやＲＮＡ中で主要な、６種類の普通に存在するＮ−ヌクレオシド を示している。 図２は普通に存在するＮ−ヌクレオシドの一般的な構造及びその誘導部位Ｒ_n ’を示している。 図３はプリン及びピリミジンヌクレオシド両方のフラノース環の一般的な構造 及び誘導によく使われる部位Ｒ_nを示している。 図４は通常のＮ−ヌクレオチドであるＡ：Ｔ及びＧ：Ｃ間でのワトソン−クリ ック塩基対、及びフォルマイシン：Ｔ、フォルマイシン：Ｕ、２、６−ジアミノ プリン：Ｔ、及び５−アミノ−フォルマイシンＢ：Ｃの間での塩基対を示してい る。 図５は生物由来の、普遍的Ｎ−ヌクレオシドの構造アナログを示している。 図６はピラゾロ（pyrazolo）［４、３ｄ］ピリミジンヌクレオシドアナログを 示している。 図７はピラゾロ［３、４ｄ］ピリミジンヌクレオシドアナログを示している。 図８はピラゾロ［１、５ａ］−１，３，５−トリアジン（triazine）ヌクレオ シドアナログを示している。 図９はアザピリミジン及びアザプリンヌクレオシドアナログを示している。 図１０はデアザピリミジン及びデアザプリンヌクレオシドアナログを示してい る。 図１１Ａ−１１Ｂはいくつかの蛍光構造アナログの例を示している。 （１１Ａ）非Ｈ結合アナログ （１１Ｂ）蛍光共鳴エネルギー転移（fluorescence resonance energy transfer (FRET)）アナログ 図１２はＦＴＰまたはＡＴＰを用いた対称的ＲＮＡ合成の図解である。 図１３はウイルスのプロモーターとウイルスＲＮＡポリメラーゼを用いた、プ ロモーターに方向付けされた非対称的なＲＮＡプローブ合成の図解である。 図１４はｐＵＣ／Ｍ１３プラスミドベクターのＥｃｏＲＩ部位に挿入された単 鎖ＤＮＡの一段階ラベリングの方法の例とｄＦ₁₀₅’の利用の図解を示している 。 図１５は標的ＤＮＡへの早くしかも定量的なハイブリダイゼーションのための 非対称的なＤＮＡまたはＲＮＡプローブの使用の必要性を示した図解である。示 してあるように、非対称的なプローブは対称的なプローブと比較して顕著にハイ ブリダイゼーション効率の上昇をもたらす。 図１６はリボヌクレオチドアナログであるフォルマイシンＡの２’−デオキシ トリフォスフェイト型、またはフォスフォルアミダイト型への変換を示した図で ある。 図１７は蛍光プローブを用いたジェノミックＤＮＡハイブリダイゼーションに おける標的ＤＮＡ配列検出の図である。 図１８は蛍光プローブのソリューションハイブリダイゼーションによる増幅Ｄ ＮＡ断片の検出の図である。 図１９はＲＮＡプローブ中におけるＡＴＰのＦＴＰによる酵素的置換反応に続 いて未反応試薬から反応産物を分離するのに使われた分離方法を図にしたフロー チャートを示している。 図２０は異なる配列の複数のプローブを含むプローブ”カクテル”の使用によ る検出感度増大機構の概要（schematics）を示している。 図２１Ａ−２１Ｆ−１はすでに同定され種類、構造、化合物名、吸収分光、放 射分光、及び合成法などの特性を明らかにされた特定の蛍光ヌクレオシドアナロ グを示している。 図２２は４つの区別される官能基からなる５’ユニバーサルエンドラベルを示 しているがそれには以下のものが含まれる：領域Ａ、１からおよそ５０蛍光ヌク レオシドアナログの長さにわたる塩基対を形成しないホモポリマー；領域Ｂ、領 域Ａと領域Ｃをつなぐ任意の非ヌクレオシド性のフォスフォジエステルの”つな ぎ”；領域Ｃ、標的配列中のプロモーターと相補的な、酵素的な合成のプライマ ー；そして領域Ｄ、標的ヌクレオチド配列と相補的なおよそ４０から２０、００ ０塩基の長さを持つヌクレオチド鎖。典型的なもので２０から６０塩基の長さを 持つ領域Ａ、Ｂ，Ｃは化学的に合成可能である。領域Ｄは酵素的な合成が好んで 用いられる。５’ユニバーサルエンドラベルの合成については実施例８に述べら れている。 図２３は高度に蛍光性の５’ラベルされたプローブの合成法の概略を示してい る。合成法は以下のステップからなる：（１）既知のプロモーター部位と既知の プロモーター部位の下流の既知の制限酵素部位を持つ配列を特定の制限酵素によ り切断、（２）制限酵素部位への唯一の標的配列を挿入、（３）挿入された標的 配列のプロモーターに相補的な配列からなる蛍光ヌクレオシドアナログプローブ のハイブリダイゼーション、そして（４）挿入された標的配列に相補的な特定な プローブを合成するために、核酸ポリメラーゼを用いてのハイブリダイズしたプ ロモーター領域からのプローブの伸長。 図２４はＦ₁₈₅（ethenoadenosine）とＦ₁₀₅（formycin）の標準化されたスペ クトルプロファイルを示している。化合物のスペクトルは２５０−４５０ｎｍの 間 で２．５ｎｍスリットを使用して決定された。 図２５は検出、あるいは５’ユニバーサルエンドラベルの複数のコピーを用い たディファレンシャルラベリングの感度を増大させる方法について示している。 示されているのは標的配列の例であり、プローブの使用はそれぞれのプローブ配 列が標的配列上の異なる断片や領域に相補的であるようなそれぞれ複数のプロー ブ配列の５’ユニバーサルエンドラベルである。 図２６は塩基配列決定への５’ユニバーサルエンドラベルの応用を示している 。ユニークなプローブ（図２４中に示している方法により作製することができる ）異なる長さを持つ複数のジデオキシ断片を生成するのにＤＮＡポリメラーゼを 用いることで利用できる。 図２７は持続的シグナル増幅（Sustained Signal Amplification）の手順を示 している。図中の例では二重鎖ゲノムを形成しているＤＮＡが二つの異なる長さ を持っているヘパティティスＢビリオン（Hepatitis B virion）由来のゲノムを 用いている。この方法は以下のステップを示す：（１）ヌクレオチドまたはリン 酸化されたヌクレオシドアナログを使用した短い方のＤＮＡ鎖の伸長；（２）二 つの鎖の分離と、二つのプライマー、ＡとＢの付加；（３）逆転写酵素を用いた ＡプライマーがハイブリダイズしたＤＮＡ鎖の伸長；（４）合成された二重鎖配 列の（ａ）ＲＮＡポリメラーゼを用いた合成ＤＮＡからのアンチセンスＲＮＡの 生成、（ｂ）プライマーＢと核酸ポリメラーゼを用いたＲＮＡ鋳型からのＤＮＡ 合成、及び（ｃ）Ｂプライマー−ＤＮＡからの二重鎖ＤＮＡの合成（ＤＮＡ複製 ）、を含む増幅サイクル中における合成二重鎖配列の利用。複製ＤＮＡはその後 、シグナル増幅サイクル（ステップ（４））を繰り返すことができる。 配列の簡単な説明 配列番号１は本発明に従った合成オリゴヌクレオチドである。 配列番号２は合成オリゴヌクレオチドであり、配列番号１に相補的である。 配列番号３は合成オリゴヌクレオチドであり、配列番号２の蛍光アナログであ る。 発明の詳細な開示 ここに開示され請求されているのは、新たな蛍光ヌクレオシドアナログ、及び 蛍光ヌクレオシドの、例えば核酸プローブや診断キットへの使用方法である。一 つの望ましい具体化例としては、固相合成（solid phase synthesis）、鋳型に 方向付けされたポリメラーゼチェーン反応法を用いたポリメライゼーション及び 増幅を含む、ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブの化学的または酵素的合成 における元来蛍光性のヌクレオシドアナログの使用に関するものがある。他の具 体化例は特定のＤＮＡ配列の同定、例えば遺伝子マッピング、感染症や遺伝子疾 患の検出や診断など、における自己蛍光ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブ の使用に関するものがある。 特に本発明は、蛍光性であるヌクレオシドアナログや、オリゴヌクレオチドの 合成において普通のヌクレオシドと置き換わることが可能なヌクレオシドアナロ グに関係する。ハイブリダイゼーションプローブとして使用する場合、そのよう なオリゴヌクレオチドの蛍光は、特定の遺伝的配列の検出と同定のための様々な 手法に使用することが可能である。この方法論は、酵素や他の反応性の蛋白質と 結合させたヌクレオチドを使用しないという点で、他の非放射性プローブ検出法 とは区別される。それ故ここに記載された方法は、日常的で自動化された臨床診 断のためのハイブリダイゼーション技術の開発における、元来蛍光性のヌクレオ シドアナログの応用である。 本発明の蛍光アナログは以下の３つの一般的な種類に分けられる：（Ａ）Ｃ− ヌクレオシドアナログ；（Ｂ）Ｎ−ヌクレオシドアナログ；そして（Ｃ）Ｎ−ア ザヌクレオチド及びＮ−デアザヌクレオチドのアナログ、である。これらの化合 物すべては共通して以下の３つの特徴を持っている：１）これらはオリゴヌクレ オチドの酵素的あるいは化学的な合成において自然界に見られるヌクレオシドと 置換することが可能な、普遍的ヌクレオシドのアナログである；２）これらは適 当な波長の光により励起された際に元々蛍光性であり、その検出に更なる化学的 または酵素的な処理を必要としない：３）これらは自然界に存在するＤＮＡ中に 見られるヌクレオシドとは異なるスペクトルを持つ。本発明の少なくとも１２５ の特定の化合物が同定されている。種類、構造、化学名、吸収スペクトル、放射 スペクトル、及び合成法に従って特性を明らかにされたこれらの化合物は図２１ Ａ〜図２１Ｆ−１に示されている。定義 以下の定義は記述の理解を助けるために提供される： ”普遍的に存在するヌクレオシド”は図１に示してある６つのモノメリックな Ｎ−ヌクレオチドであるが、これらは自然界に存在するＤＮＡやＲＮＡ中で主要 なもので、古典的なワトソン−クリック塩基対に取り込まれ、生理的条件下では 実際的には非蛍光性である。配列の略記中のそれぞれの１文字記号は、Ａ，Ｃ， Ｇ，Ｔ，Ｕ，Ｉがそれぞれアデノシン、シチジン、グアニジン、チミジン、ウリ ジン、そしてイノシンを表している。 普遍的に存在するヌクレオシドの”構造アナログ”（Structual Analogs）と は、構造（原子やその配列の種類）が普遍的に存在する塩基に似ているが、基本 的な生物活性または生化学的な機能に影響を与えないようなある種の修飾や置換 を受けている場合もあるような、通常のプリンまたはピリミジン塩基に似せた、 構造的に関連した分子のことである。そのような塩基アナログは、イミダゾール とその２、４−及び／又は５−置換誘導体；インドールとその２−、３−、４− 、５−、６−及び／又は７−置換誘導体；ベンズイミダゾール（benzimidazole ）とその３−、４−及び／又は５−置換誘導体；インダゾール（indazole）とそ の３−、４−、５−、６−及び／又は７−置換誘導体；ピラゾールとその３−、 ４−及び／又は５−置換誘導体；トリアゾール（triazole）とその４−及び／又 は５−置換誘導体；テトラゾール（tetrazole）とその５−置換誘導体；ベンゾ トリアゾール（benzotriazole）とその４−、５−、６−及び／又は７−置換誘 導体；８−アザアデニンとその置換誘導体；６−アザチミンとその置換誘導体； ６−アザウラシルとその置換誘導体；５−アザシトシンとその置換誘導体；８− アザヒポキサンチンとその置換誘導体；ピラゾロピリミジン（pyrazolopyrimidi ne）とその置換誘導体；３−デアザウラシル；オロチン酸（orotic acid）；２ 、６−ジオキソ−１、２、３、６−テトラヒドロ−４−ピリミジンカルボン酸（ 2,6-dioxo-1,2,3,6-tetrahydro-4-pyrimidine carboxylic acid）；バルビツー ル酸；尿酸；エテノアデノシン（ethenoadenosine）；エテノシチジン（ethenoc ytidine）；アロプ リノール類（４−ヒドロキシ−ピラゾロ［３，４ｄ］ピリミジン）；あるいはこ れらの保護された誘導体を含む（がこれに限らない）。塩基アナログはまた、図 ４及び図５に示すような、通常の塩基とフラノース間の間のＣ−Ｎ結合がＣ−Ｃ 結合で置換されたようないかなるＣ−ヌクレオシドでもあり得る；そのような塩 基には、Ｃ−ヌクレオシドシュードウリジン中のウラシル；１−メチルウラシル ；１、３−ジメチルウラシル（1,3-dimethyluracil）；５（４）−カルボメトキ シ−１、２、３−トリアゾール（5(4)-carbomethoxy-1,2,3-triazole）；５（４ ）−カルボキサミド−１、２、３−トリアゾール（5(4)-carboxamido-1,3-triaz ol）；３（５）−カルボキシメチルピラゾール（3(5)-carboxymethylpyrazole） ；３（５）−カルボメトキシピラゾール（3(5)-carbomethoxypyrazole）；５− カルボエトキシ−１−メチルピラゾール（5-carboethoxy-1-methylpyrazole）； （Ｃ−ヌクレオシドショードマイシン（C-nucleoside showdomycin）中の）マレ イミド（maleimide）；（Ｃ−ヌクレオシドピラゾマイシン（C-nucleoside pyra zomycin）中の）３（４）−カルボキサミド−４（３）−ヒドロキシピラゾール （3(4)-carboxamido-4(3)-hydroxypyrazole）；及び図５から１１中にリストさ れるか推測されている他のすべてのアナログ；もしくはその保護された誘導体を 含む（がそれに限らない）。 ”蛍光担体”（Fluorophore）とは、検出可能な範囲に蛍光を放射する能力の ある物体またはその一部を指す。ヌクレオチドの蛍光構造アナログにおいては、 典型的にはこの蛍光は紫外線近い（＞３００ｎｍ）波長から可視波長のあたりに 生じる。望ましいのは蛍光が３００ｎｍから７００ｎｍの間の波長に生ずること であり、最も望ましいのは３００ｎｍから５００ｎｍの間の可視波長で生ずるこ とである。 ”蛍光構造アナログ”（Fluorescent Structual Analogs）は図５から図１１ に示されたような、６つの普遍的なヌクレオシドの、合成的もしくは生化学的に 誘導されたモノメリックな構造アナログをさす。それらが標準的なワトソン−ク リック塩基対を形成できるかできないかはモノマー構造及び／またはそれらが使 用されたオリゴヌクレオチドによるが、それらはスペクトル的にユニークであり 生理的条件下での選択的な励起と放射の能力において普遍的なヌクレオシドと区 別 される。たとえばＣ−ヌクレオシドであるフォルマイシンＡはアデノシンと同様 のドナー／アクセプター水素結合を形成することができるアデノシンアナログで あるが、最大励起波長は３０３ｎｍであり最大放射波長は４０５ｎｍである（ス トークスシフト＝１０２ｎｍ）。 ”誘導”（Derivatized）ヌクレオシドアナログは、反応性または保護官能基 が、共有的にもしくは別の方法で、複素環（heterocycle）のＲ₄からＲ₉位、も しくはグリコシド基のＲ₁₀（５’），Ｒ₁₂（３’）及びＲ₁₄（２’）位に結合し ている蛍光構造アナログである。２’グリコシジル位での誘導体は蛍光共鳴エネ ルギー転移（fluorescent resonance energy transfer(FRET)）のアクセプター または蛍光構造アナログ自身の固有の蛍光放射を強めるもしくは吸収しより長い 波長で再放射するドナー、を含む。 ”ポリヌクレオチド”、”オリゴヌクレオチド”、または”オリゴマー”とは 、２つ以上の普遍的ヌクレオチドまたは蛍光構造アナログを含む鎖状のヌクレオ チドである。ここで用いられる”蛍光オリゴヌクレオチドプローブ”または”蛍 光ハイブリダイゼーションプローブ”とは上記のように、少なくとも１つが蛍光 性であるような２つ以上のモノマーを含む鎖状のヌクレオチドである。 ”ハイブリダイゼーション”とは、２つの相補的な単鎖分子のワトソン−クリ ック塩基対を通した一組ごとのアニーリングである（図４）が、それはＤＮＡ： ＤＮＡ，ＤＮＡ：ＲＮＡ，ＲＮＡ：ＲＮＡのいずれでもよい。アニーリングは、 （ｉ）水素結合のドナーとアクセプターが図４のような向きに並んでいる相補的 な塩基対、及び（ｉｉ）プローブがハイブリダイズする特定の遺伝子、標的ＤＮ Ａ、または標的ＲＮＡ（以後”標的ＤＮＡ／ＲＮＡ”）に相補的な遺伝的配列、 に特異的である。例として、アデノシンとフォルマイシンの水素結合のパターン （図４）の比較が挙げられる。 ”ＤＮＡ／ＲＮＡ融解温度”及び”Ｔｍ”は、ＤＮＡあるいはＲＮＡのハイブ リダイズした鎖の間の水素結合が壊され２つの鎖が一本鎖へと解離する、つまり 二重鎖もしくはハイブリッドが壊される温度を指す。 ”アナロガスな蛍光配列”は、本発明中に述べられているいずれかの酵素的ま たは化学的方法によって合成されたポリヌクレオチドのヌクレオシド配列であり 、 かつその中で普遍的ヌクレオシドが蛍光ヌクレオシドアナログと明白に置き換わ っている（例えば決められたＤＮＡ鋳型に相補的なＲＮΛプローブの作製にＲＮ Ａポリメラーゼを使用する場合、アデノシン−５’−トリフォスフェイト（ＡＴ Ｐ）の代わりにフォルマイシンＡ−５’−トリフォスフェイト（ＦＴＰ）での置 換）ものを指す。アナロガスな蛍光配列においては、蛍光ヌクレオシドアナログ はオリゴヌクレオチド鎖中で一部もしくはすべての普遍的ヌクレオチドの、酵素 的合成の際には鋳型によって決まる位置で置き換わっている。同様のプログラム された置換は、標準的なフォスフォジエステル結合形成の間それぞれの蛍光アナ ログの３’−Ｏ−フォスフォルアミダイト（3’-O-phosphoramidites)を使用す ることで行うことが可能である。従って例えば、Chlamydia tracheomatisのMOMP 遺伝子の相補的な配列、もしくはその蛍光アナログ配列が、それぞれｄＡＴＰま たはｄＦＴＰを用いてＤＮＡポリメラーゼ、ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰの存 在下で酵素的に合成することが可能である： MOMP遺伝子配列（配列番号１）： 相補的配列（配列番号２）： 類似した蛍光配列（配列番号３）： この中で類似した配列中の下線部の蛍光デオキシフォルマイシンＡ（Ｆ）は、 相補的配列中の対応する位置のデオキシアデノシン（Ａ）の構造アナログである 。 ”ＦＲＥＴアクセプター”または”蛍光共鳴エネルギー転移アクセプター”と は、物質、置換体、クロモフォア（chromophore）、または蛍光担体（例えばダ ンシル（dansyl）、ナフチル（naphthyl）、アントリル（anthryl）、ピレニル （pyrenyl）、メチルアンベリフェロン（methylunbelliferone）、あるいはクー マリン基（coumarin））を指すが、それらは蛍光構造アナログドナーからの放射 光を吸収し、そのエネルギーを他のより長い波長で再放射する能力がある。本発 明においては、そのような２次的な蛍光担体は第２のラベルにより選択的に励起 されるか、蛍光アナログエネルギードナーの１次蛍光を拡げて増強するための蛍 光ア クセプターとして使われる。A．蛍光ヌクレオシドアナログの構造、起源、合成、及び誘導体化 簡潔に述べると、本発明は生理的条件下において蛍光性である普遍的ヌクレオ シド塩基（Ｂ）のヘテロサイクリックピリミジンもしくはプリンの構造アナログ 、及びそれが炭素−炭素もしくは炭素−窒素結合によりリボース（Ｒ₁₂＝Ｒ₁₄＝ ＯＨ）、デオキシリボース（Ｒ₁₂＝Ｈ，Ｒ₁₄＝ＯＨまたはＲ₁₂＝ＯＨ，Ｒ₁₄＝Ｈ ）、ジデオキシリボース（Ｒ₁₂＝Ｒ₁₄＝Ｈ）のフラノース環（図４−９中Ｆで表 される）に結合したもの、及び以下に述べるようなそれらの誘導体、および／ま たはヌクレオチド化学に明るい者に自明なものに関連する。 本発明においては、フォルマイシン、２−アミノプリンリボヌクレオシド、及 び２、６−ジアミノリボヌクレオシド（これらすべては（ｉ）アデノシンと同じ またはそれに似た塩基対水素結合を形成でき、（ｉｉ）核酸の複製、ライゲーシ ョン、リン酸化を含む幅広い酵素反応においてワトソン−クリック塩基対中のア デノシンを特異的に置換できる）が蛍光ヌクレオシド及びヌクレオシドアナログ （図４）の代表として用いられる。本発明において、関連した性質や同等のクレ ームは、すべての他のグアノシン、シチジン、チミジン、ウリジン、イノシンの 蛍光アナログ及びその誘導体についても適用できる。(1)ヌクレオシドアナログの構造 普遍的なヌクレオシドに対する構造アナログの各タイプに属するプリンやピリ ミジン構造体が、図５〜図１１のそれぞれの上段に示してあり、下段には各種類 のアナログの代表例が示してある。図６と図７ではプリンアナログの例だけが示 してあるのは、その既知のピリミジンアナログが図５に既に描かれているからで ある。Ｒ₄，Ｒ₆，Ｒ₉での置換のみが知られているＮ−ヌクレオシドアナログの 例外を除いて、各ページの上段に属する構造では、複素環塩基への置換が図１に 示された普遍的Ｎ−ヌクレオシドからアナログを区別するような構造の部分を楕 円で囲っている。(2)蛍光ヌクレオシドアナログに一般的なフラノース分子 フラノースにおける糖炭素の番号は図２に示すように１’から５’となってい る；そのため塩基、Ｂ、は糖のＣ１に結合している。本発明中で請求されている すべての蛍光複素環のフラノース基は、他のすべてのアナログと共通して、セッ トＦ、グリコシド及び置換されたグリコシド、を以下に述べるように持っている ：基本的には、置換は５つの糖炭素のいずれにおいても行われる；サブセットＦ は誘導体及び／又はＲ₁₀，Ｒ₁₁，Ｒ₁₂，Ｒ₁₃，Ｒ₁₄位における置換によって定義 されるが、これらは（ｉ）当業者にとって明らかであり、（ｉｉ）本発明中に述 べられているすべての蛍光ヌクレオシドアナログのフラノシル誘導体である。こ れらはすべてのリン酸置換（例えばトリフォスフェイト（triphosphate）、チオ フォスフェイト（thiophosphate）、アミノフォスフェイト（aminophosphate） など）やＲ₁₀位でのすべての保護置換（protecting substitutions）（例えばジ メトキシトリチル）を含む。図５から図１１中のすべてのグリコシド、Ｆについ て、Ｒ₁₀，Ｒ₁₁，Ｒ₁₂，Ｒ₁₃，およびＲ₁₄が以下のように定義されている：Ｒ₁₁ およびＲ₁₃＝Ｈ；Ｒ₁₄＝Ｈ，ＯＨまたはＯＲｉ；Ｒ₁₂とＲ₁₀は共にＨ、ＯＨ，Ｏ Ｒｍ、またはＮＨＲ_kであるが、その中で（ａ）Ｒ_i保護基は典型的には、例えば メチル、ｔ−ブチル、ベンジル、ｏ−ニトロベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｏ −ニトロフェニル、またはトリフェニルメチルのような、低級アリル基もしくは アルキルエーテル；又はアセチル、ベンゾイル、ｐ−ニトロベンゾイルもしくは アルキル基のような低級アルキル基やアリルエステル；テトラヒドロピラニル基 （tetrahydropyranyl）のようなアセタール；トリメチルシリル（trimethylsily l）やｔ−ブチル−ジメチルシリルエーテル（t-butyl-dimethylsilyl）のような シリル基（silyl）；ｐ−トルエンスルフォニル基（p-toluenesulfonyl）やメタ ンスルフォニル基（methanesulfonyl）のような硫酸エステル（sulfonic acid） ；臭素（bromine）、フッ素（fluorine）、ヨウ素（iodine）のようなハライド （halide）、である。適当な保護基の追加例はGreen，T.W．（1981）Protective Groups in Organic Synthesis，New York: Wiley&Sonsの中に見いだされる。他 にもＲ₁₄はＦＲＥＴ誘導体でもよい。これには、例えば（これに限られるもので はないが）、次の蛍光体が含まれる。７−［３−（クロロジメチルシリル）プロ ポキシ］−４−メチルクーマリン、Ｏ−４−メチルクーマリニル−Ｎ−［３−ト リエトキシシ リル）プロピルカルバメート、Ｎ−３−トリエトキシシリルプロピル）ダンシル アミド；（ｂ）Ｒ_mは２’または３’−アミド、２’または３’−アジド、２’ 、３’−不飽和、及びリン酸エステル、トリフォスフェイトエステル、またはア ミノフォスフェイトエステルを持つオリゴヌクレオチドの酵素的または化学的合 成に関与するリン酸誘導体のサブセットを含む適当な保護、置換、または反応性 リンカー基を代表している；（ｃ）Ｒ_kはペプチド合成（Geiger，R.，W．Konig ［1981］In The Peptides:Analyusis，Synthesis，Biology，Vol．3，E．Gross ，J．Meienhofer，eds.，Academic Press，New York，pp.1-99）に広く用いられ ているような一般的で標準的な窒素保護基（nitrogen protecting group）であ る；これはホルミル基（formyl）、ｔ−ブチロキシカルボニル基（t-butyloxyca rbonyl）、ベンジロキシカルボニル基（benzyloxycarbonyl）、２−クロロベン ジルオキシカルボニル基（2-chrolobenzyloxycarbonyl）、４−クロロベンジル オキシカルボニル基（4-chrolobenzyloxycarbonyl）、２、４−ジクロロベンジ ルオキシカルボニル基（2,4-dichrolobenzyloxycarbonyl）、フルフリロキシカ ルノニル基（furfuryloxycarnonyl）、ｔ−アミロキシカルボニル基（t-amyloxy carbonyl）、アダマンチルオキシカルボニル基（adamantyloxycarbonyl）、２− フェニルプロピル−（２）−オキシカルボニル基（2-phenylpropyl-(2)-oxycarb onyl）、２−（４−ビフェニル）プロピル−（２）−オキシカルボニル基（2-(4 -biphenyl)propyl-(2)-oxycarbonyl）、トリフェニルメチル基（triphenylmethy l）、ｐ−アニシルジフェニルメチル基（p-anisyldiphenylmethyl）、ジ−ｐ− アニシルジフェニルメチル基（di-p-anisyl diphenylmethyl）、２−ニトロフェ ニルスルフェニル基（2-nitrophenylsulfenyl）、またはジフェニルフォスフィ ニル基（diphjenylphosphinyl）のような酸に不安定な保護基を含む（がそれに 限らない）；トリフルオロアセチル基（trifuloroacetyl）、９−フルオレニル メチロキシカルボニル基（9-fluorenylmethyloxycarbonyl）、４−トルエンスル フォニレチロキシカルボニル基（4-toluenesulfonylethyloxycarbonyl）、メチ ルスルフォニレチロキシカルボニル基（methylsulfonylethyloxycarbonyl）、及 び２−シアノ−ｔ−ブチロキシカルボニル基（2-cyano-t-butyloxycarbonyl）の ような、塩基に不安定な保護基；他にもクロロアセチル 基（chloroacetyl）、アセトアセチル基（acetoacetyl）、２−ニトロ−ベンゾ イル基（2-nitro-benzoyl）、ジチアサクシノイル基（dithiasuccinoyl）、マレ オイル基（maleoyl）、イソニコチニル基（isonicotinyl）、２−ブロモエチロ キシカルボニル基（2-bromoethyloxycarbonyl）、及び２，２，２−トリクロロ エチロキシカルボニル基（2,2,2-trichloroethyloxycarbonyl）のように；ある いはＲ_kは検出可能なラベル（ＮＨ₂、ＳＨ）＝Ｏであり、それらはアミド、チオ エーテル、ジスルフィド結合あるいはそれらの付加的な可変の反応基Ｒ₁からＲ₃ の組み合わせ（例えばＲ₁−（ＣＨ₂）_x−Ｒ₂，ｘは１から８の間の整数；Ｒ₁， Ｒ₂、Ｒ₃はＨ，ＯＨ，アルキル、アシル、アミド、チオエーテルまたはジスルフ ィド基）を含む任意の結合部も含む）で誘導可能なすべての反応基、またはヒド ラジド（hydrazides）、マレイミダゾール（maleimidazoles）、酸化可能なジオ ール（oxidizable diols）、そしてスクシニミジル基（succinimydyl groups） のような反応基を含む（がすべてではない）ような、ホモバイファンクショナル あるいはヘテロバイファンクショナルなリンカーとして働くすべてのリンカーま たはスペーサーでありうる。せいぜいＲ₁₂とＲ₁₀のうち一つだけＮＨＲ_kであり 得る。 本発明はさらに以下の構造式を持つ新規のフォスフォルアミダイト（phosphor amidites）を含む： この中でＢは本文中で述べた蛍光ヌクレオシドアナログのいずれかであり、Ｒ₁₀ ，Ｒ₁₁，Ｒ₁₂，Ｒ₁₃はグリコシド、Ｆ、のセットとして上記に定義されており 、Ｒ₁₄はＨかＯＨである。Ｒ₁₆＝低級アルキル、その中でもメチル基またはイソ プロピル基、もしくはモルフォリノ基（morpholino）、ピルロリドノ基（pyrrol idono）、または２、２、６、６−テトラメチルピルロリドノ基（2,2,6,6-tetra me thylpyrrolidono）のような複素環；Ｒ₁₅＝メチル基、ベータ−シアノエチル基 （beta-cyanoethyl）、ｐ−ニトロフェニル基、ｏ−クロロニトロフェニル基（ ｏ-chloronitrophenyl）またはｐ−クロロフェニル基（P-chlorophenyl基）であ る。すべての他のＲ基は１から２５炭素原子の長さを持つスペーサーまたはリン カーアームとして同定されているものを含む、以前に示されたものである。（ｉ ）ワトソン−クリック塩基対に関わる複素環上の重要な反応性置換体を保護し、 （ｉｉ）アミダイトをＤＮＡまたはＲＮＡ鎖形成の化学反応できるようにするた め、Ｒ₁₂でのフォスフォルアミダイトの合成に先立って、フォスフォルアミダイ ト中の塩基Ｂは保護されうるが、それにはエキソサイクリックアミノ基（exocyc lic amino groups）のアセチル化またはアミデーション（amidation）が含まれ 、アセチル、ベンゾイル、イソブトリル（isobutryl）、スクシニル（succinyl ）、フタロイル（phthaloyl）、またはｐ−アニソイル（p-anisoyl）が含まれる （がすべてではない）；ジメチルフォルマミジン（dimethylacetamidine）、ジ −ｎ−ブチルフォルマミジン（di-n-butylformamidine）またはジメチルアセタ ミジン（dimethylacetamidine）を含む（がそれがすべてではない）アミジン基 のような；もしＢがカルボキシル、ヒドロキシル、またはメルカプト基のような 他の反応性官能基と置換されると、それらは同様に適当に保護される。 本発明は固相支持体上でのオリゴヌクレオチドの合成にまたがっているが、そ の中で図５から図１１に描かれたようにオリゴマーは保護された蛍光ヌクレオシ ドアナログであるフォスフォルアミダイトと反応し、上記の構造のように誘導さ れる。加えて本発明は、その配列中に最低一つ、上記の構造中のフォスフォルア ミダイトのように誘導された蛍光ヌクレオシドアナログを含む新規の蛍光オリゴ ヌクレオチドを含む。さらに本発明のさらに別の側面として、固体支持体に結合 した前述の蛍光体３’−Ｏ−フォスフォルアミダイトの反応によって作製された 蛍光オリゴヌクレオチドを提供することである。(3)蛍光ヌクレオシドアナログの起源および他の製造方法 フォルマイシンＡ（formycin A）はNocardia interformaの培養液からリボヌ クレオチドとして単離される。抗生物質はStreptomyces lavendulaeとStreptomy ces gummaensisの培養液からも単離され、それらはあらゆるところから得られる Ｒ ＮＡ中で普遍的に見つかる、数々の微生物性のＮ−ヌクレオシドのＣ−リボヌク レオシドアナログのうちの一つである。微生物から単離された他の普遍的なＣ− ヌクレオシドアナログ（図５）はフォルマイシンＢ、オキソフォルマイシンＢ（ oxoformycin B）、シュードウリジン（pseudouridine）、ショードーマイシン（ showdowmycin）、ピラゾマイシン（pyrazomycin）、そしてミニマイシン（minim ycin）を含む。フォルマイシンＡ、フォルマイシンＢ、そしてオキソフォルマイ シンＢは図６に示された種類のＣ−ヌクレオシドまたはピラゾロピリミジンヌク レオシド（pyrazolopyrimidine）であり、それぞれアデノシン、イノシン、ヒポ キサンチンの構造アナログである；自然界から得たグアノシンのピラゾロピリミ ジン構造アナログは文献では報告されていないが、２−クロロ−フォルマイシン Ｂまたはそのデオキシ型から化学的に合成可能である。これらの化合物の生合成 に関する詳細なレビューはOchi et al．（1974）J．Antibiotics xxiv.:909-916 にある。Ｃ−ヌクレオチドのＮ４およびＮ６の誘導体の合成はLewisとTownsend （[1980]J．Am．Chem．Soc．102:2817）の文献中に述べられている。アイソメリ ックなアミノピラゾロ−［３，４ｄ］−ピリミジン（isomeric aminopirazolo-[ 3,4d]-pyrimidines）はWierchowskiら［他のすべてのものはリボース、そしてい くつかはデオキシ及びジデオキシ系で商品として入手可能である（それらにはア ザヌクレオチドやデアザヌクレオチドが含まれる）か、７−デアザアデニン（７ -azaadenine）（Gerster et al．［1967］J．Med．Chem．10:326）のようにde n ovoに合成可能である］の文献中に述べられている。デオキシ、ジデオキシ、リン酸化された形の蛍光リボヌクレオシドアナログの製 造 化学合成は、Ｎ−ヌクレオシドの２’−デオキシ型や３’−デオキシ型、Ｃ− ヌクレオシドと同じようにエテノヌクレオシド（ethenonucleosides）は文献に 従って誘導に用いることができる（Robins et al．［1973］Can．J．Chem．51:1 313；Jain et al．｛1973］J．Org．Chem．38:3719; DeClerq et al．［1987］J ．Med.Chem．30:481）。似たような手法がアザヌクレオチド、デアザヌクレオチ ドについて得られており、同じ及び追加の源についても見つかっている（例えば Robins et al．［1977］Can．J．Chem．55:1251; DeClerq et al.，supra）。３ ’−アジ ド、３’−アミノ、２’、３’−不飽和、及び２’、３’−ジデオキシアナログ の合成のためのプロトコールや手法は報告されている通りである（Lin et al． ［1987］J．Med．Chem．30:440; Serafinowski，P．［1987］Synthesis 10:897 ）。２’−ＯＨのシリル基またはＦＲＥＴ基による保護あるいは誘導はＰａｔｅ ｒｓｏｎとＡｎｄｅｒｓｏｎによってなされている（[1989]Silicon Compounds: Register and Review，Petrarch Systems，Inc.，pp.60-70）。 ここに報告されているのは、アナログの２’−デオキシ型だけ生じるＣ−ヌク レオチドのリボースからデオキシリボースへの変換のサイクリック保護法（cycl ic protection procedure）の新たな応用であり、この方法から、先に述べた文 献によるアセトキシイソブトリルハリド法（acetoxyisobutyryl halide procedu re）を用いた場合に生じる２つのアイソマーを分離するために必要な、難しい精 製なしに高い収量を得ることが可能である。 酵素的合成のためには、ヌクレオシドアナログのモノ−及びトリフォスフェイ ト型が、例えば確立された手法を使用しポリヌクレオチドキナーゼを用いて、あ るいは化学的フォスフォリレーションによって調製することが可能である。一般 的には、５’−モノフォスフェイトはＰＯＣ１２を用いて化学的に調製される（ Smith and Khorana［1958］J．Am．Chem．Soc．80:1141; Yoshikawa et al．［1 967］Tetrahedron Lett．5095）。対応するトリフォスフェイトは同じ著者、ま たはMitchelson（[1964]Biochem．Biophys．Acta 91:1）；あるいはHoardとOtt （[1965]J．Am．Chem．Soc．87:1785）に従った方法により化学的に合成可能で ある。これはモノフォスフェイトがカルボジイミド（Carbodiimide (CDI)）、続 いてトリブチルアンモニウムピロフォスフェイト（tributylammonium pyrophosp hates）により処理されトリフォスフォリル化された型を生ずるものである。露 出したアミノ基のところでアナログをフォスフォリル化する必要があるところで は、そのような置換体は、Thayerら（[1974]Biochem．J．139:609）の方法に従 ってエチルトリフルオロチオアセテート（ethyltrifluorothioacetate）で処理 することによりチオアセチル化することができる。B．蛍光オリゴヌクレオチドの合成 本発明は、通常ヌクレオチドにみられる蛍光ヌクレオシドアナログのひとつ、 または複数を、合成ヌクレオチドに導入する合成方法を提供するものである。 (1)蛍光フォスフォルアミダイドの使用 蛍光フォスフォルアミダイトは本発 明によって得られるものであるが、蛍光残基は、ヌクレオシドアナログ、例えば ２’−デオキシフォルマイシンＡ（2’-deoxyformycin A）の保護された３’− Ｏ−フォスフォルアミダイトの最初の合成によって、化学的合成オリゴヌクレオ チドに導入される。それからフォスフォルアミダイトは、対応する標準的なフォ スフォルアミダイト、この場合はデオキシ−アデノシン−３’−Ｏ−フォスフォ ルアミダイト（deoxy-adenosine-3’-O-phosphoramidite）に置換され、通常の フォスフォトリエステルの化学的合成法を用いて固床上で合成されたオリゴヌク レオチドと、反応させられる。β−シアノエチル誘導体が、化学的に合成された オリゴヌクレオチドの任意の位置に選択的に導入され、６０塩基長またはそれ以 上の長さの前述した塩基配列を持ち、そこにあらかじめ決めた数の蛍光塩基を取 り込んだオリゴマーを作成するであろう。 例えば、ノンセルフハイブリダイジングオリゴヌクレオチドを合成したが、こ れらは完全に異なる塩基配列、すなわち［ＡＣ］_xと［ＦＣ］_xを有し、いずれも 繰り返し（＞９８％）と合成の全収率に関してほぼ同じ値を示した上、［ＦＣ］_x が蛍光を持つのに対し［ＡＣ］_xが持たないという１点においてのみ異なるとい うオリゴマーを生成した。ここでｘとはＡＣとＦＣのダイマー対の数であり、ｘ はｘ＝１０、１５、２０、２５、３０の値をとる。いずれのオリゴマーも、交互 に［ＴＧ］_x配列を繰り返す相補的オリゴマーに対して、特異的にハイブリダイ ズした。しかし、（ｉ）アガロースゲル中での臭化ブロマイド染色、（ｉｉ）ハ イブリッドの溶解の挙動などで示されたように、それ自身、あるいは［ＡＧ］_x 、または［ＴＣ］_xのような非相補的配列には、ハイブリダイズしなかった。０ ．０７５ＭのＮａＣｌ溶液中、［ＦＣ］_x：［ＴＧ］_x及び［ＡＣ］_x：［ＴＧ］_x ハイブリッドの溶融転移温度に相当する値は、ｘ（オリゴヌクレオチドの長さ） で与えられる値に対して、１°Ｃ以下の違いしかみられなかった。本発明が有す る視点には以下のようなものが含まれることを明記しておく。すなわち、蛍光ヌ クレオチドとその蛍光構造アナログの３’−Ｏ−フォスフォルアミダイトの合成 、前述した塩基配列を持つ高蛍光オリゴヌクレオチドを合成する際のアミダイト の使用、 そうしたオリゴヌクレオチドを増幅プライマー、蛍光オリゴヌクレオチド”タグ ”、ハイブリダイゼーションプローブとして使用すること、などである。 (2)蛍光ポリヌクレオチドおよびポリデオキシヌクレオチドの使用 前述した 配列を有する蛍光ポリリボヌクレオチドとポリデオキシリボヌクレオチドは、Ｄ ＮＡテンプレートを用い、酵素的に合成することが可能である。このＤＮＡテン プレートは、化学合成、クローニングテクニックによって調整、あるいはゲノム ＤＮＡから得られた試料、などを含むさまざまなものから作られる。そうした３ 種類のＤＮＡテンプレート、E.coli ＲＮＡポリメラーゼ、フォルマイシンＡか アデノシンのリボーストリフォスフェイトと併せて ｒＮＴＰすなわちシチジン 、ウリジン、グアノシンなどを用いたＲＮＡオリゴヌクレオチドの再現性ある合 成は、図１２に示してある。方向性のある活性プロモーターを有するテンプレー ト、活性を持つＲＮＡポリメラーゼ、フォルマイシンＡかアデノシンのリボース トリフォスフェイトと併せてｒＮＴＰすなわちシチジン、ウリジン、グアノシン などを用いたＲＮＡプローブの再現性ある非対称合成は、図１３に示してある。 対称なポリデオキシリボヌクレオチドは、以下の方法を用い、２’−デオキシフ ォルマイシンＡ−５’−トリフォスフェイト(2’-deoxyformycin A-5’-triphos hate)（ＦＴＰ）をデオキシアデノシン−トリフォスフェイト（deoxyadenosine- triphosphate）（ＡＴＰ）に置換することによって、作られてきた。この方法と は、通常のＤＮＡポリメラーゼ合成と、熱に安定なＤＮＡポリメラーゼ酵素とＰ ＣＲ法を利用したＤＮＡ増幅である。ここで言う非対称合成は、以下に述べる変 更を別にして同じ試薬と方法を用いることで、好適に行うことができた。（ｉ） クレノゥ・フラグメントまたは修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼといったＤＮＡポリ メラーゼを用いた合成が、テンプレートとして用いられる配列のはじめの方にあ る二重鎖のうちの一方の鎖で始まった。また、対応するプライマーは全ての合成 をはじめるために用いられた。（ｉｉ）テンプレートの一方の鎖にのみ相補的な プライマーが、非対称ＰＣＲとして通常記述されるのと同様なＤＮＡ増幅で、用 いられた。（ｉｉｉ）それぞれのプライマー対のひとつがビオチンのようなリン カーと結合しているようなプライマー対が、ＰＣＲのような通常のＤＮＡ増幅に 用いられた。しかし一方の鎖は、アビジニル化カラムまたは磁気ベッドを用いる といっ た単離を引き続き行うことによって、優先的に除去された。これに比肩し得る合 成は、他の置換によって行うことも可能である。他の置換とは、例えば、リボー ス及びデオキシリボース形態の蛍光Ｎ−ヌクレオシド、２−アミノプリン、２、 ６−アミノプリン（いずれもアデノシン−５’−トリフォスフェイトに置換され た）、あるいはフォルマイシンＢの蛍光Ｃ−ヌクレオシドトリフォスフェイトか または５−アミノ−フォルマイシンＢ（それぞれイノシントリフォスフェイトと グアノシン−トリフォスフェイトに置換された）などを含む。C．蛍光ポリヌクレオチドの標識 ＲＮＡとＤＮＡは、いくつかの方法で酵素的にラベルすることができる。それ に含まれるものは、これだけに限定するわけではないが、（ｉ）フォワード・リ ン酸化反応（Richardson，C.C．［1965］PNAS 54:158）、またはエクスチェンジ ・キナーゼ反応（Van de Sande et al．［1973］Biochemistry 12:5050）のいず れかを用いた５’ＤＮＡの末端ラベリング、（ｉｉ）制限断片にアニールした混 合配列のヘキサデオキシヌクレオチドを伸長することによる混合プライマーラベ リング（Feinberg，A.，B．Vogelstein［1983］Anal．Biochem．132:6; Feinbe rg，A.，B．Vogelstein［1984］Anal．Biochem．137:266）、（ｉｉｉ）３’Ｄ ＮＡ末端ラベリング、ただしこれにはターミナルデオキシヌクレオチジルトラン スフェラーゼを、デオキシトリフォスフェイトのモノヌクレオチドユニットの繰 り返し付加を触媒させるために用いる（Okayama et al．［1987］Methods Enzym ol．154:3; Heidecker，G.，J．Messing［1987］Methods Enzymol．154:28）。 あるいは、デオキシトリフォスフェイトの一残基付加を触媒させるために用いる 。ここで言うデオキシトリフォスフェイトとは、ＤＮＡイニシエイターの３’− 水酸基末端に対するいくつかの蛍光ヌクレオシドアナログである。これには前述 した配列、例えば、以下に記述したように合成したChlamydia trachomatis MOMP 遺伝子のプローブといった、非蛍光プローブを含まれている。（ｉｖ）非蛍光” 粘着末端”あるいは”ニックド”ＲＮＡやＤＮＡのオリゴヌクレオチドが、適当 な蛍光ＲＮＡまたはＤＮＡオリゴマーとのライゲーションによってラベルされる ようなライゲースラベリング（Pharmacia LKB［1989］Analects 17.2; Helfman ，D.M．［1987］Methods Enzymol．152:343）。（ｖ）ニックトランスレーショ ン、ただしそ こではＤＮＡポリメラーゼが、二重鎖のうち実際に読まれるＤＮＡ鎖の中で、蛍 光アナログのトリフォスフェイトをランダムに結合させるために用いられる（Me inkoth，J.，G.M．Wahl［1987］Methods Enzymol．152:91）。D．規定された配列の蛍光オリゴヌクレオチドの性質 ハイブリダイゼーション、熱融解、アガロースゲルによるキャラクタリゼーシ ョン、蛍光検出実験を、前述した配列のオリゴヌクレオチドの性質の同定に用い た。あるケースでは、蛍光オリゴヌクレオチドは、治療上重要な病因または突然 変異、例えばChlamydia trachomatis MOMP遺伝子配列などであるが、そこから得 られた標的ＤＮＡの既知の配列に相補的であった。これらの研究において、蛍光 オリゴヌクレオチドの酵素的合成に用いられた鋳型は、続いて行われるハイブリ ダイゼーション実験で標的ＤＮＡとして後に用いることをも目的としたクローン 断片で行った。標的ＤＮＡとオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、 蛍光プローブ中の構造アナログの蛍光をクエンチするという結果をもたらすが、 ここでハイブリッドのデナチュレーションによって蛍光が回復するため、ハイブ リダイゼーションが起こったと判断できるのである。合成オリゴヌクレオチドで あるポリ（ｒＦｒＵ）のセルフハイブリダイゼーション（後に、長さについて記 載されている）はそうした実験で得られた結果に関して再現性があり、このこと は表１にまとめられている。本発明によれば、望まれるべきプロセスは、４つの 基本的なステップを含んでいる。まず最初に、蛍光構造アナログが化学的または 生物学的に合成され、本発明に供した部分では、蛍光オリゴヌクレオチドプロー ブを合成するための要求にしたがって、更に誘導体が作られる。２番目として、 対象となる核酸サンプルに対し相補的なＤＮＡまたはＲＮＡプローブ分子が、蛍 光ヌクレオシドアナログを有するように構築される。ここで蛍光ヌクレオシドア ナログは、（ｉ）その全長にわたって、特異的な位置あるいはランダムな位置に 分配されるか、または（ｉｉ）以下に記述されるように末端ラベルされ得る。３ 番目に、核酸サンプルは未反応のモノマーから分離され、直接に同定される。そ の際に、特異的ハイブリダイゼーションプローブに付けるための別の非特異的ラ ベルを用いるか、あるいはそのサンプル自体を直接ハイブリダイゼーションプロ ーブとして用いる。後者の場合、ハイブリダイゼーションは固床で行うことにな るであろう。この固床には、サザンブロットトランスファーか”ドット・ブロッ ト”法のように、標的ＤＮＡ／ＲＮＡかまたは蛍光プローブが固着される。ある いは、簡単な洗浄かろ過によって、プローブ／標的ハイブリッドをハイブリダイ ズしていないプローブから単離した後に、液体中でハイブリダイゼーションして もよい（この中に含まれるのが”液体ハイブリダイゼーション”である）。最後 に、標的ＤＮＡ／ＲＮＡにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの蛍光が、検 出および定量される。E．蛍光プローブ分子の構築 本発明によれば、あらかじめ選択された蛍光ヌクレオシドアナログまたは蛍光 アナログの混合物は、ひとつまたはそれ以上の、通常用いられるような非蛍光ヌ クレオシドに、非特異的に置換される。それらは更に、ＤＮＡまたはＲＮＡオリ ゴヌクレオチドに結合して、前述した塩基配列を作る。前述した塩基配列は、通 常生じるヌクレオチドから構築されたヌクレオチド配列に対するワトソン−クリ ック塩基対に関して同等であるように、また与えられたＤＮＡまたはＲＮＡに対 して相補的であるように、選択されるであろう。そうした蛍光プローブは、標的 ＤＮＡまたはＲＮＡの相補配列に対するアナログであると考えられる。蛍光プロ ーブは、以下に述べるような応用に引き続き供せられるために、酵素的あるいは 化学的合成のいずれかによって合成されるであろう。その応用とはすなわち、（ ｉ）ハイブリダイゼーションプローブ、（ｉｉ）与えられたプライマーセットに 対し相補的で増幅可能な遺伝子配列を直接検出するためのアンプリマー（amplim er）、（ｉｉｉ）特異的ハイブリダイゼーションプローブに、例を挙げるならラ イゲーションによって、結合し得るような非特異的”ユニバーサル”なラベルと して用いる、といったものである。 通常存在するリボ−、デオキシ−、あるいはジデオキシリボオチドの蛍光ヌク レオシドアナログは、さまざまな他の簡便な酵素学的及び化学的技術のいずれか を用いることによって、核酸ポリマーに結合させることが可能である。それらの 技術は本明細書に記載されているが、しかしこれに限定されるものではない。(1)酵素による合成 酵素による合成には、以下の記載が含まれている。 (a)小さな”ニック”をＤＮＡ二重鎖の一方の鎖に導入するためのＤＮアーゼ Ｉの使用。E.coliのＤＮＡポリメラーゼＩのホロ酵素型は、蛍光ヌクレオチドア ナログのトリフォスフェイトの混合物とともに、それらニックの修復と拡張に用 いることができる。例として、反応溶液中におけるデオキシフォルマイシン−５ ’−トリフォスフェイト（deoxyformycin-5'-triphosphate）（ＦＴＰ）と通常 存在するデオキシヌクレオチドトリフォスフェイトが挙げられる。この方法は大 量の蛍光担体を、ＤＮＡポリマー（これは二重らせんの両方の鎖を含んでいる） にランダムに導入する。実施例において、通常存在するヌクレオチド（この場合 はデオキシアデノシン−５’−トリフォスフェイト（dAdenosine-5'-triphospha te）（ｄＡＴＰ））は、完全に除去することができ、その場所にｄＦＴＰが置換 した。その際、合成収率の著しい減少、ハイブリダイゼーション特異性の低下、 ＤＮＡ融解温度の値を測定することによる二重鎖形成能の増加などは、みられな かった。 (b)先に用いた制限酵素によって生じたＤＮＡの一本鎖領域のオーバーハング をフィルインするための、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ・フラグメントとＴ ４ＤＮＡポリメラーゼを含む各種の酵素の使用。この方法は、それぞれのＤＮＡ 鎖の末端に蛍光アナログを濃縮する。同様に、特異的ＤＮＡテンプレートに相補 的な蛍光ＤＮＡヌクレオチドは、以下の方法によって合成されることが可能であ る。すなわち（ｉ）ＤＮＡ断片とＥ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼを用いる方 法、（ｉｉ）Ｍ１３の、要求されるＤＮＡテンプレート配列のすぐ５’側のフォ ワードプライマーのように、特異的なプライマーに対するプライマーサイトを含 む組換えプラスミドを構築する方法、である。ＤＮＡポリメラーゼは、デオキシ リボヌクレオチドあるいは他のデオキシアナログ（例えば、反応液中に存在する ｄＡＴＰの置換体としてのｄＦＴＰ）を利用して、相補的なＤＮＡ鎖を合成する であろう。 (c)蛍光アナログの末端濃縮をも生じさせる結合法は、ホモポリマー、あるい はＤＮＡオリゴマーの３’末端に蛍光デオキシアナログの”テイル”を加えるた めに、”テイリング”酵素（末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ）を 用いることを含んでいる。実際上、通常存在するヌクレオチドに蛍光アナログを 置換させたとき、ホモポリマーの合成によって得られた収率は、ヘテロポリマー の合成に際して得られた収率よりも、ずっと少なかった。それに対して、蛍光ア ナログのジデオキシ体、あるいは２’が保護された蛍光アナログ（ＦＲＥＴで保 護されたアナログを含む）は別にして、一残基の蛍光ヌクレオチドアナログは、 同じ酵素、全く同じ方法（ジデオキシＡＴＰ（コルデシピン（cordecypin））で 用いられた方法）を用いて任意のオリゴマーの３’の水酸基に付加されるであろ う。エンドラベリングハイブリダイゼーションプローブの３番目の別法は、ＤＮ ＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼの活性を利用している。それによって、非特異 的二本または一本鎖蛍光オリゴヌクレオチドは、特異的なハイブリダイゼーショ ンプローブの３’または５’末端に共有結合することが可能である。この方法に おいて用いられた蛍光オリゴヌクレオチドは、プローブの特異性を決定するワト ソン−クリック塩基対にあずかるとは限らず、しかし一般的または普遍的な蛍光 ”タグ”として単独で用いられるであろう。前述した方法のそれぞれについて、 ＤＮＡプローブは二重鎖であり、それらの使用に先立ち、熱処理またはアルカリ 処理を用いて、一本鎖形態に解離されなければならない。 (d)ＤＮＡの増幅、または複製のための標準的な方法と、市販されている数種 類のＤＮＡポリメラーゼ（熱に安定なＤＮＡポリメラーゼ、具体的にはＴａｑポ リメラーゼ、修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ・フラグメント、Ｔ４ＤＮ Ａポリメラーゼを含むが、しかしそれだけに限定される訳ではない）のひとつを 用いた接合法。それは、前述した長さと配列を有する蛍光プローブを生成するた めの標準的な方法としても用いられることが可能であるが、ヌクレオチドトリフ ォスフェイトの混合物中で、蛍光デオキシリボヌクレオチドアナログ（具体的に は２’−デオキシフォルマイシンＡ−５’−トリフォスフェイト（2’-deoxyfor mycin A-5-triphosphate）または５’−アミノ−デオキシフォルマイシンＢ−５ ’−トリフォスフェイト（5-amino-deoxyformycin B-5'-triphosphate））のひ とつを、ＡＴＰやＧＴＰとそれぞれ置換する。蛍光オリゴヌクレオチドは、通常 存在するヌクレオチドから成り、かつ標的テンプレートＤＮＡにハイブリダイズ する非蛍光オリゴマーに対し、収率と長さに関して同等である。また、ハイブリ ッド二重鎖が一度形成した非蛍光コントロールが示したのと同じ程度の熱安定性 とエチジウムブロミドに染色される度合いを示す。そうした増幅においては、蛍 光オ リゴヌクレオチドの生成は、ある特定の塩基配列の存在を直接に証明するものと とらえることが可能であるし、その配列の同定は、（ｉ）確定している相補的プ ローブによるハイブリダイゼーションと、（ｉｉ）類似した塩基配列を認められ るようなシークエンシングなどによって、更に確定させることができる。 (e)特異的なＤＮＡテンプレートに対し相補的な蛍光ＲＮＡオリゴヌクレオチ ドの使用。ここで言う特異的なＤＮＡテンプレートは、（ｉ）ＤＮＡ断片と、例 えば図１２に示したようなE.coliＲＮＡポリメラーゼを用いることによって対称 的に、あるいは、（ｉｉ）図１３に示したように、テンプレートとして用いられ ているような望ましいＤＮＡ配列のすぐ５’側にある、特異的ＤＮＡのＲＮＡポ リメラーゼ依存性プロモーターを含む組換えプラスミドを構築することによって 非対称的に、合成することが可能である。このテンプレートの例としては、プロ ーブと共にハイブリダイゼーションの標的として用いられるであろう塩基配列を 有する、クローニングされたChlamydia MOMP遺伝子の断片のすぐ５’側にあるＴ ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを持っているＤＮＡテンプレートが挙げら れる。ほとんどの応用については、非対称的合成が最も好ましい方法であるが、 対応するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、リボヌクレオチド（例えば、ＡＴ ＰやＴＴＰの代わりのＵＴＰに対する置換体としてのＦＴＰなどである。）を利 用してＲＮＡ分子を合成するであろう。そのＲＮＡ分子は、テンプレートの二本 鎖のうちの片方の鎖、唯一その鎖だけに対して類似の相補性を示す。こうして得 られた一本鎖プローブは、変性段階なしで、次のハイブリダイゼーション反応に 直接に用いることが可能である。(2)化学合成 保護された蛍光デオキシヌクレオシドアナログの３’−Ｏ−フォ スフォルアミダイト、特に、Ｒ₁₀＝ジメトキシトリチル、Ｒ₁₆＝イソプロピル、 Ｒ₁₅＝メチルまたはβ−シアノエチルなどは、固床支持担体に固定された、伸長 しつつあるオリゴヌクレオチドの５’−ＯＨに、標準的なフォスフォルアミダイ トＤＮＡ合成技術（Atkinson，T.，M．Smith［1984］Oligonucleotide Synthesi s: A Practical approach，M．J．Gait，ed.，IRL Press，Oxford，pp．35-82を 参照のこと）を用いることで、結合させられる。固床支持担体に結合したオリゴ ヌクレオチド（あらかじめ５’−ＯＨ基を脱保護するために酸洗浄してあるも の）を、アルゴン雰囲気下、テトラゾールの存在下に無水アセトニトリル中で、 ５’−トリチル保護したデオキシヌクレオシドアナログの３’−Ｏ−フォスフォ ルアミダイトと反応させ、過剰な試薬を洗浄してから、新たな５’末端を脱保護 するような溶液中で、フォスファイト生成物を望ましいフォスフェイトに酸化す る。こうしたサイクルは、望ましい長さと塩基配列に達するまで、必要な回数だ け繰り返すことが可能である。付加される新たなヌクレオチドは、通常存在する ヌクレオチドでもいいし、蛍光ヌクレオシドアナログでもよい。それ故、ひとつ またはそれ以上の蛍光担体が、例えばフォルマイシン残基を含む望ましい塩基配 列中でのＡ残基全ての完全な置換に相当し、かつそれを含んでいるような、与え られたプローブに結合させられる。こうした結合は、１０分間のカップリングタ イムで、ミニリアクター試薬びん中、人力で行うことが可能である。または「Ph armacia LKB遺伝子合成機」あるいはプログラム合成プロトコルを利用できる類 似した機械で、行うことができる。蛍光ヌクレオチドは、多孔性ガラス床からＤ ＮＡを解離させることで単離されるが、そのために、ＮＨ₄ＯＨ：エタノール（ ３：１）中で、５５°Ｃで一晩反応させる。アンモニウムヒドロキシド溶液を含 む蛍光ＤＮＡは、「Speed-Vac」中で急速乾燥され、弱塩及びｐＨ勾配を利用し て、QEAE-HPLCカラムの未反応配列から分離される。ヌクレオシドアナログのフ ォスフォルアミダイトの収率は、脱保護過程のトリチル陽イオンの放出から計算 される、再現性ある収率を元にした標準的なアミダイトから得られる収率と、比 肩し得るものである。 蛍光ヌクレオシドアナログを含むプローブ分子をどのようにして構築し利用す るかということについて、特別な説明を加えるために記述したのが、以下の具体 例である。この具体例は、本発明を実行するにあたって、最も優れたやり方を含 む手順を示してある。これら具体例は、限界として提示されたものではない。全 てのパーセンテージは、重量パーセント濃度であり、全ての溶液混合率は、特に 断らない限り、体積によるものである。例１‐フォルマイシンＡ（Formycin A）の２’−デオキシフォルマイシンＡ（2' -Deoxy Formycin A）への変換、および５’トリフォスフェート（5'-Triphosph ate）ならびに３’−ｏ−（２シアノエチル）−Ｎ，Ｎ，ジイソプロピルフォル アミダイト（3'-O-(2-cyanoethyl)-N,N,-Diisopropyl Phorphoramidite）の調整 図１６は、２’−デオキシ−５’−トリフォスフェイト（2'-deoxy-5'-tripho sphate）、またはフォルマイシンＡの２’−デオキシ−３’−Ｏ−フォスフォル アミダイト（2'-deoxy-3'-O-phosphoramidite of formycin A）を合成するため の、本発明におけるスキームを図示している。De Clerqら（[1987]J．Med．Chem ．30:481）によって報告されているように、α−アセトキシブチリル ハライド （α-acetoxyisobutyryl halid）と反応させることで最初の段階がすでに達成さ れてはいるが、その方法は、分離が困難で収率が低い３’及び２’デオキシ体の 両方を生成してしまう。本発明は、アデノシンを２’−デオキシアデノシンに変 換するという行程ですでにすぐれた応用例が報告されている（[1981]J．Am．Che m．Soc．103:932）、３’，５’−ジシラ保護を採用している。その方法が、多 くの蛍光ヌクレオシドアナログのそれに相当する変換に対して、一般的に応用可 能であることが明らかにされている。 (I) ７−アミノ−３−［３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソ プロピル−１，３−ジシロキサン−ジリル）−β−Ｄ−リボフラノシル ピラゾ ロ［４，３ｄ］ピリミジン(7-amino-3-[3',5'-O-(1,1,3,3,-tetraisopropyl-1,3 -disiloxane-dilyl)-β-D-ribofuranosyl pyrazolo［4,3d］pyrimidine) １，３−ジクロロ−１，１，３，３，−テトライソプロピル−１，３−ジシロ キサン（1,3-dichloro-1,1,3,3,-tetraisopropyl-1,3-disiloxane）（０．９ｇ 、２．８５ｍＭｏｌ）を、無水ピリジン中で完全に脱水してあるフォルマイシン Ａ（０．６６ｇ、２．５ｍＭｏｌ）の懸濁液に加え、室温で２４時間攪拌した。 溶媒をＴ＝４０°Ｃで減圧除去し、生成物をエチルアセテートと水で抽出した。 エチルアセテイト層を、（ｉ）冷却した１Ｎ ＨＣｌ、Ｈ₂Ｏ、飽和ＮａＨＣＯ₃ 水溶液、飽和ＮａＣｌ水溶液の順番で洗い、続いてゴム状になるまで減圧蒸留し た。シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーを用い、（ｉ）２．５％メタノー ル−クロロフォルムと、（ｉｉ）５％メタノール−クロロフォルムで段階的に溶 出した後に、得られた生成物（シリカＴＬＣでシングルスポットとなる（２０％ メタノール−クロロフォルム中で、Ｒｆ＝０．８０））は、３’，５’環状保護 され た産物であることが、プロトンＮＭＲと元素分析によって判明した。 (II) ７−アミノ−３−［３’５’−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロ ピル−１，３−ジシロキサン−ジリル）−２’−（フェノキシチオカルボニル） β−Ｄ−リボフラノシル］ピラゾロ［４，３ｄ］ピリミジン（7-amino-3-[3',5' -O-(1,1,3,3,-tetraisopropyl-1,3-disiloxane-dilyl)-2'-(phenoxythiocarbony l)-β-D-ribofuranosyl pyrazolo［4,3d］pyrimidine ) ４８０ｍｇのジシラ保護フォルマイシンＡ（０．９３ｍＭｏｌ）を、無水Ｍｅ ＣＮ中でＤＭＡＰ（０．９ｇ、７．６ｍＭｏｌ）と共に溶解した。すりガラスジ ョイントにマウントしたドライシリンジを用いて、２００ｍＬのフェノキシチオ カルボニルクロライド（phenoxythiocarbonyl chloride）を滴下した後に、反応 物を室温で２４時間攪拌し、溶媒を減圧下除去した後に、生成物を再びエチルア セテートと水で分別した。エチルアセテート層は、上述と同じように洗い、溶媒 を減圧除去し、残渣物をフラッシュクロマトグラフィー上で分離して、クロロフ ォルム−ＭｅＣＮ（５０／５０）で溶出した。求める生成物を集めたフラクショ ンは、プロトンＮＭＲと元素分析で同定し、以下に述べる合成の第２段階に供し た。 (III) ７−アミノ−３−（２’−β−Ｄ−リボフラノシル）ピラゾロ［４， ３ｄ］ピリミジン(7-amino-3-(2'-deoxy-β-D-ribofuranosyl)pyrazolo［4,3d］ pyrimidine)(２’−デオキシフォルマシン Ａ(2'-deoxy formycin A)) (II)に記載されている方法から得られた生成物２４０ｍｇを、大過剰のヘキサ メチルジシラザン（hexamethyldisilazane）中で、１２．５ｍｇの（ＮＨ₄）₂Ｓ Ｏ₄に加えた。反応混合物を、６０°Ｃ以上、オーバーナイトで還流した。減圧 下溶媒を除去した後、粗トリシリル誘導体をトルエンに再溶解し、アゾビスイソ ブチロニトリル（azobisisobutyronitrile）と、トリブチル水素化スズ（tribut yl tin hydride）と共に反応させて完全に還元した。生成物をＴＨＦ中８０°Ｃ でＴＢＡＦによって脱保護し、減圧下溶媒を除去した後、エチルアセテートと水 で分別した。水層を濃縮し、水で平衡化したＤｏｗｅｘ５０Ｗ−Ｘ８カラムにア プライしてから、１５％ＮＨ₄ＯＨで溶出した。主生成物（２０％メタノール− クロロフォルム中で、Ｒｆ＝０．３）は、上述のＤｅ Ｃｌｅｒｑらの方法を用 いて 調製された２’−デオキシフォルマイシンＡの精製物と同一であることが、プロ トンＮＭＲと元素分析によって判明した。 (IV) ７−アミノ−３−（２’−β−Ｄ−リボフラノシル ピラゾロ［４，３ ｄ］ピリミジン−５’−トリフォスフェート(7-amino-3-(2'-deoxy-β-D-ribofu ranosyl)prazolo［4,3d］pyrimidine-5'-triphosphate)(２’−デオキシフォル マシンＡ−５’−トリフォスフェート(2'-deoxy formycin A-5'-triphoshate)) ２’−デオキシフォルマイシンＡの２８ｍｇ（０．１１ｍＭｏｌ）を、ガラス 栓付き試験管中に加え、リエージェントグレードのアセトン０．２ｍＬ、フォス フォラス オキシクロライド（phosphorous oxychloride）０．１ｍｌと混合し た。異種反応混合物を、溶液が深黄色である間、２４時間４°Ｃで保存した。冷 却し、３ｍｌのアセトンを加えた後、濃ＮＨ₄ＯＨの６ｍｌを、攪拌しながらす ばやく加えた。アセトンを減圧除去してから、ｐＨを２以下に下げ、混合物を１ ．５時間還流し、希釈してからＤｏｗｅｘｌ−フォルメイトに直接アプライした 。そこから、２’−デオキシフォルマイシンＡ−ＭＰ（2'-deoxyformycin A-MP ）を、０．７５Ｍのギ酸で溶出した。２’−デオキシフォルマイシンＡ−ＭＰは 、Ｙｏｓｈｉｋａｗａらの方法（[1967]Tetrahedron Lett．5095）で、トリフォ スフェイトに変換した。 (V) ７−アミノ−３−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル ピラゾ ロ［４，３ｄ］ピリミジン−３’−Ｏ−フォスフォルアミダイト(7-amino-3-(2' -deoxy-β-D-ribofuranosyl)pyrazolo［4,3d］pyrimidine-3'-O-phosphoramidit e)(２’−デオキシフォルマシンＡ−３’−Ｏ−フォスフォルアミダイト(2'-deo xy formycin A-3'-O-phosphoramidite)) ２’−デオキシフォルマイシンＡは、ＤＭＴによる５’−Ｏ−保護と、通常の 方法による７−アミノ基ののベンゾイル化がなされるよう処理された。ジクロロ メタン１．５ｍｌ中で、生成物の０．３ｍＭｏｌと２５ｍｇのジイソプロピルア ンモニウム テトラゾライド（diisopropylammonium tetrazolide）に対し、０ ．３３ｍＭｏｌのＯ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピル フォスフォロジアミダイト（O-cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphoro di amidite）を含む溶液を加えた。混合物を４時間攪拌し、ジクロロメタンで抽出 し、飽和ＮａＨＣＯ₃水溶液中で冷却した。ジクロロメタン層を飽和食塩水で洗 い、Ｎａ₂ＳＯ₄で脱水し、ろ過してから濃縮した。２５ｍｍカラム（９：１のＣ Ｈ₂Ｃｌ₂／Ｅｔ₃Ｎ）中、塩基性アルミナの２”プラグを通すろ過による精製は 、フォスフォルアミダイトを与えたが、これを泡状になるまで乾燥させた。生成 物の同定は、プロトンＮＭＲ、元素分析、ヘテロサイクルの蛍光、オリゴヌクレ オチド合成に使用することなどで確認した。例２ ＲＮＡまたはＤＮＡプローブにおけるＦＴＰまたは２’ｄＦＴＰによるＡ ＴＰまたはｄＡＴＰの酵素的な完全な置換 A．リボースオリゴマーの対称合成（Symmetric synthesis） ＲＮＡオリゴヌ クレオチドを、Wardらによって原著論文が報告されているように、３つのＤＮＡ テンプレート（図１２）から合成した。これに用いたのは、（ｉ）ＡＴＰの置換 体としてのＦＴＰ（Ｆ₁₀₅）、（ｉｉ）E.coliから精製したＲＮＡポリメラーゼ である。Wardらの論文と違う点は、合成が、反応が止められるまで３７°Ｃで３ 時間行われたことである。ＦＴＰは、効果的にＡＴＰと置換したが、他の３種類 の通常のヌクレオチド、すなわちＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰはいずれも置換しなか った。 合成の最後に、ｐＨ７の飽和食塩水中、４°ＣでSephadex G-50を用いて、反 応生成物を未反応の試薬から分離した。未反応の試薬から反応生成物を単離する スキームは、図１９にフローチャートとして示してある。 この反応において、ＦＴＰは、合成オリゴヌクレオチドポリマーテンプレート と同様に未変性、及び変性したＤＮＡと同様に、ＲＮＡポリメラーゼに対し共に 用いたときの、効果的な置換体である。ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＲＮＡポリメ ラーゼ、ＤＮＡテンプレートのひとつＦＴＰまたはＡＴＰのどちらかなどを含む サンプル中で、高分子量の生成物が、空隙容量においていずれのサンプルからも 溶出されてきたが、その一方で、両サンプルの保留されたフラクション中の単量 体ＮＴＰの量は、それぞれ７０％以上に減じた。酵素フリーのコントロールから 溶出された小量のテンプレートと未反応のｒＮＴＰ以外に、高分子量分画は、減 少しなかった。同様に、テンプレートフリーのコントロールは、保留された体積 中で通常のリボヌクレオチド トリフォスフェイトと同時に溶出されてくる未反 応のｒＮＴＰしか含んでいなかった。同様の結果が、天然の、あるいは合成した さまざまなＤＮＡテンプレートから得られたが、そうしたＤＮＡテンプレートは 、別々のコポリマーであるポリｄ（ＡＣ）、ポリ（ＡＧ）、ポリ（ＡＣＧＴ）を 含んでいる。更に、高分子量オリゴマーが、（ｉ）Ｎ−ヌクレオシドアナログ、 すなわち２，６−ジアミノ−アデノシン−５’−トリフォスフェイト（2,6-diam ino-adenosine-5'-triphosphate）、または２−ジアミノ−アデノシン−５’− トリフォスフェイト（2-diamino-adenosine-5'-triphosphate）が反応液中でＡ ＴＰと置換し、あるいは （ｉｉ）Ｃ−ヌクレオシド、すなわちフォルマイシン Ｂ−５’−トリフォスフェイト（formycin B-5'-triphosphate）（Ｆ_bＴＰ）、 または−アミノ−フォルマイシンＢ−５’−トリフォスフェイト（-amino-formy cin B-5'-triphosphate）（ａＦ_bＴＰ）がテンプレートとなったような合成から 、良い収率で得られた。テンプレートが何であれ、ＡＴＰまたはＧＴＰに対する デアザ−、またはアザ−ヌクレオシドアナログの幾種類かの置換によって得られ た収率は、極めて低かった。 B．ＲＮＡまたはＤＮＡプローブの非対称的合成（Asymmetric synthesis） 試験管内で、ＤＮＡ依存的なＲＮＡポリメラーゼの転写システムは、基質及び ハイブリダイゼーションのプローブとして用いられるＲＮＡの合成に使われるが 、これは、分子生物学においてごく普通に用いられる道具である。このシステム が、本発明において、自動蛍光プローブとその生成物という独特な形で応用され た。本発明で展開された方法は一般的であり、ＳＰ６、Ｔ７、Ｔ３などを含むあ らゆるファージポリメラーゼシステムにも応用される。今回のケースでは、本発 明は一対のプロモーターを採用しているが、このプロモーターは、図１３に示し たように、二重鎖プラスミドの別々の鎖に別れて存在し、ポリリンカーの互いの 末端に位置している。ベクターは、（ｉ）プロモーターのひとつを認識する活性 ポリメラーゼの使用を通じて、非対称合成に影響を及ぼすことが可能なプロモー ターに結合するために、また （ｉｉ）蛍光プローブあるいはプローブの標的の 非蛍光のコピーの非対称的合成に用いられるテンプレートの複数のコピーを複製 するた めに、用いられる。ＤＮＡの標的の配列のコピーは、プロモーターのひとつの近 傍の制限サイトに、二重鎖の形で、ポリリンカーに挿入される。コンピテントセ ル中でのプラスミドの複製は、転写のためのテンプレートの莫大な量を与える。 ふたつの別々な、しかしパラレルな方法が、ＤＮＡプローブの非対称的合成に関 して発展してきた。最初の方法では、ｓｓＤＮＡプローブが、図１４に示したよ うに、５’末端にプライマーの結合部位を有するテンプレートから合成される。 そうした合成においては、プライマーは非蛍光でよいが、あるいは図の左に示し たように、蛍光アナログのフォスフォルアミダイトを用いて合成してもよい。こ のバリエーションは、非対称増幅と分離である。そこでは、テンプレートの両鎖 が、蛍光オリゴマーのように増幅されることによって複製される。ここで用いら れるのは、変性させたセンス鎖及びアンチセンス鎖を分離するのに用いられるビ オチンのように、一時的に親和性があるリンカーを、ひとつの、そしてそれだけ が持っているようなプライマー対である。 ＲＮＡプローブとＤＮＡプローブの両方に対し、全ての転写とプローブ検出能 が測定されているような、リファレンスとなるテンプレート、プローブ配列、標 的配列を確立することが有用であることが判明した。Xenopusの翻訳伸長因子（ Ｘｅｆ−１α）のアルファ鎖が役に立つこととはすなわち、目的と、非対称ＲＮ Ａプローブ合成が、本発明において、全ＲＮＡ及びＤＮＡ合成の指標として用い られているということである。Ｘｅｆ−１αのｍＲＮＡは、Xenopusの胚におけ る主要な転写産物であるが、その胚は、中期抱胚過程後に直ちに現れる、非常に 多くの非ミトコンドリアルｍＲＮＡ転写物を含んでいる。Ｘｅｆ−１αの遺伝子 は同定されており、ｃＤＮＡライブラリーの構築を通じて、ＥｃｏＲＩ認識部位 がクローンの末端に付け加えられている。１７０５塩基対の断片を、一方の鎖に Ｔ７プロモーターを、その相補鎖にＳＰ６プロモーターを持っているようなプラ スミドｐＳＰ７２に挿入した。プラスミドの複製とテンプレートの直鎖化に続い て、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、ｒＮＴＰすなわちシチジン、ウリジン、グアノシ ンそしてフォルマイシンＡかアデノシンのいずれかのリボーストリフォスフェイ トを用いた転写によって、ＦあるいはＡ残基のいずれかを含むような１７４９塩 基長のオリゴマーを生成した。全長より短い転写産物は全く検出されなかった。 それ ぞれの場合において、類似及びコントロールのオリゴマーは、比肩し得るだけの 量が生成され、また、類似の塩基配列が恒久的に蛍光を有することを除き、物理 学的挙動に関して、あらゆる意味で区別が不可能であった。 この新規な合成システムには、独特な試みが２つ存在する。（１）アンチセン ス鎖の合成（例えば、ＳＰ６と通常存在する非蛍光ｒＮＴＰを用いる）が、高収 率標準化された標的配列を与える。これに対応するＤＮＡプローブの非対称的合 成においては、相補テンプレート鎖上の異なるプライマーサイトを、同じ目的を 達成するのに用いることが可能である。（２）いく種類かの異なるプラスミドを 含んでいるようなプラスミドの混合物は、直鎖化されたテンプレートの”カクテ ル”を作るために用いることが可能である。そこから、対応するプローブの”カ クテル”（以下の「例７」を参照）を、同時に翻訳することができる。このプロ ーブは、ゲノム配列上の、複数の部位に結合することができるのである。例３ ヌクレシチドアナログＲＮＡプローブの蛍光および溶液中での該プローブ のハイブリダイゼーションの確認 例１に記載されたように、ポリｄ（ＡＴ）に導かれる合成において、ＦＴＰを 効果的に利用することで、およそ３００−５００塩基の長さのポリマーを合成し たが、これは、加水分解及び／または配列決定された際、ポリ（ＦＵ）という配 列を除いて、ＤＮＡテンプレートの全く別の複製物であると判明した。この配列 から予想されたように、生成物は、１度のサーマルサイクルによって、似た配列 にアニールすることが可能だった。そのために、推定上の生成物、すなわちポリ （ＦＵ）：ポリ（ＦＵ）を考えたが、比較し得る処置を施したポリ（ＦＣ）と違 って、それは予想されたようなセルフ−ハイブリダイゼーションの証拠を示さず 、アガロースゲル中でエチジウムブロミドによって染色され、吸光と蛍光の両方 で鋭い熱転移を与えたポリ（ＦＵ）：ポリ（ＦＵ）のアニールしたハイブリッド は、プローブが効果的かつ特異的にハイブリダイズするということを示している 。精製したポリ（ＦＵ）、ポリ（ＦＣ）、ポリ（ＦＧ）、ポリ（ＵＦｂ）、ポリ （ＣａＦｂ）、ポリ（ＦＣＧＵ）の吸光と発光スペクトルは、精製したポリ（Ａ Ｕ）、ポリ（ＡＣ）、ポリ（ＡＧ）、ポリ（ＴＧ）、ポリ（ＡＣＧＴ）のコント ロール の吸光及び発光スペクトルと、４つの点に関して異なっている。（ｉ）遠ＵＶ吸 光の最大値が、比較物の２６５ｎｍに対しコントロールの２６０ｎｍというよう に、わずかにシフトする。（ｉｉ）３４０ｎｍのわずかな吸光ピークの近傍であ る２９０ｎｍと３２０ｎｍの間に、重要な強い構造的吸光（室温で３本のピーク ）が存在する。（ｉｉｉ）最大励起は３０３ｎｍでみられる。（ｉｖ）４０５ｎ ｍのピークに、可視波長域にまで広がる幅広い発光バンドがみられる（Ｓｔｏｋ ｅｓシフト＝１０２ｎｍ）。蛍光が、例えばポリ（ＦＵ）：ポリ（ＦＵ）ハイブ リッドにおいて完全にクエンチされ、溶液のｐＨをｐＨ１０以上にまで上げて鎖 を変性させるまで検出されない、ということは、重要な特性である。ひとたび変 性されたならば、３６０ｎｍから４６０ｎｍにまたがる範囲のピークの強度の相 対蛍光強度４０％以上において、オリゴマーの蛍光は完全に積算可能である。 例４ 標的ＲＮＡと標的ＤＮＡへの蛍光プローブのハイブリダイゼーション；固 相における検出を可能にしたリンカーの使用 合成テンプレートポリ（ＴＧ）を、相補的なＲＮＡプローブ、ポリ（ＡＣ）と ポリ（ＦＣ）（いずれも自己相補的ではなく、いずれにおいてもハイブリッドは アニールできない、または検出できない）を生成するために用いた。２つのうち 、ポリ（ＦＣ）だけが蛍光を有する。パラレルな実験であるが、ビオチン化した 合成２２量体のプライマー、^5#ＢＩＯＴＩＮ−（ＴＧ）₁₁ ^3'を用い、通常のポリ メラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）法によって、ポリ（ＡＣ）テンプレー トを増幅し、^5#ＢＩＯＴＩＮ−ポリ（ＴＧ）^3'という配列を有するＤＮＡ増幅体 を合成した。続いて、ゲルサイジング及び／またはＱＥＡＥイオン交換クロマト グラフィーによって、未反応のプライマーから分離した。その後、ポリマーを、³² Ｐ−ＡＴＰと酵素ポリヌクレオチドキナーゼを用いて放射能ラベルした。ビオチ ン化したアンプリマー、^5#ＢＩＯＴＩＮ−ポリ（ＴＧ）^3'、ＲＮＡプローブの両 方、そしてポリ（ＡＣ）とポリ（ＦＣ）を、等量ずつ別々に混合した際、（ｉ） エチジウムブロミド染色、（ｉｉ）融解の挙動によって、形成したハイブリッド を区別することが可能であったが、予想されたように、ポリ（ＦＣ）プローブの 蛍光は、ハイブリダイゼーションによってクエンチされた。ハイブリッドは、半 分の^5'ＢＩＯＴＩＮによってアビジン化したベッドに吸着することができ、洗浄 によってハイブリダイズしていないポリ（ＦＣ）を除去し、放射活性と蛍光を等 量アッセイした。洗浄したサンプルの変性以前には、溶液中の検出可能な蛍光は きわめて小さかった。高いｐＨ緩衝液中で変性したとき、すでにハイブリダイズ した（これは、プローブの標準化された希釈の蛍光から測定した際のことである が）ポリ（ＦＣ）の量は、標的ＤＮＡである^5#ＢＩＯＴＩＮ−ポリ（ＴＧ）^3'の 量の１％以内でしかなかった。これらは、サンプル中の放射活性ラベルの量を、 標準化された希釈液との比較によって測定した結果である。例５ 標的ＤＮＡに対するヌクレオシドアナログ-3'-O-フォスフォルアミダイト （Nucleoside Analog-3'-O-Phosphoramidites）から合成された蛍光プローブの ハイブリダイゼーション 蛍光ヌクレオシドアナログのフォスフォルアミダイトを用いることを示す実験 においては、２５量体から６０量体といった５塩基の倍数の長さで、また（ＡＣ ）_xあるいは（ＦＣ）_x（ここでＸ＝１２．５，１５，１７．５，２０，２２．５ ，２５，２７．５，３０）といった配列を有するｎ量体を、パラレルに合成した 。その際に、デオキシアデノシン−３’−Ｏ−フォスフォルアミダイト（dAdeno sine-3'-O-phosphoramidite）か、デオキシフォルマイシン−３’−Ｏ−フォス フォルアミダイト（dF-3'-O-phosphoramidite）のいずれかを、デオキシシチジ ン−３’−Ｏ−フォスフォルアミダイト（dC-3'-phsphoramidite）とともに、フ ァルマシアＬＫＢ ジーンアッセンブラー中で用いた。固定面からの脱着とＱＥ ＡＥ−セファロースによる精製の後、決まった長さの蛍光オリゴマー（ＦＣ）_x を放射能ラベルされたポリ（ＴＧ）のアンプリマーにハイブリダイズした。この ポリ（Ｔ Ｇ）は、上述の実験例及び３から得られ、ＤＮＡ融解の挙動、臭化エチジウム染 色、クエンチされた蛍光体がハイブリッドの変性によって再び蛍光活性を持つこ となどによって検査されたものである。例６ ＦＴＰで置換されたＲＮＡプローブを用いたChlamydia trachomatisのア ッセイ Chlamydia trachomatisは、その活動的な感染期において、細菌１個あたり３ ×１０³から４×１０³コピーのリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）と、１コピーのゲ ノムＤＮＡを含んでいるような、完全に細胞内で生育する病原因子である。１対 のプライマー（そのうちのひとつは、ハイブリダイズするプライマー配列に対し て５’末端であるような５’−ビオチン化したＴ７プロモーターを含む）を使用 して、C.trachomatis L2の保存株から得たＭＯＭＰ遺伝子の１５０塩基対のＤＮ Ａ断片を増幅した。ＤＮＡ断片のおよそ５００ｎｇ（これは、５’末端にＴ７Ｒ ＮＡポリメラーゼのプロモーター部位を含んでいる）を、ｒＣＴＰ、ｒＵＴＰ、 ｒＧＴＰ、ｒＦＴＰかｒＡＴＰ（＋コントロール）のいずれか一方、などの存在 下にＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いることによって、転写した。１００°Ｃ、３ 分間加熱して酵素を失活させることで、反応を止めた。反応しなかったｒＮＴＰ は、Sephadex G-25上でのゲルサイジングクロマトグラフィーによって、ラベル したＲＮＡから分離した。その後、プローブの濃度を２６０ｎｍでの吸光によっ て、測定した。単純なデュアルモノクロメーター・蛍光スペクトロフォトメータ ーを用いて、ＲＮＡプローブのわずか５×１０^-14モルを、バックグラウンドか ら識別することが可能であったが、この際に、２０ｎｍのスリットを、励起と発 光モノクロメーターの両方に用いた。感受性を高めるために設計された光量子計 測フルオリメーター（後述の例９を参照のこと）が、同じプローブの５×１０^{-1 6} モルから５×１０^-17モルを検出するのに有用である。このプローブは、５００ ０から５００００個のバクテリアから得られることが期待されるリボソームＲＮ Ａの量に等しい。（ｉ）C.trachomatisのゲノムＤＮＡ、あるいは、（ｉｉ）増 幅された標的ＤＮＡのいずれか一方２００μｌを、ハイブリダイゼーション緩衝 液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０２Ｍ クエン酸ソーダ（sodium citrate）、 ０．０２Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．００４Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中で、プローブの１／２０ ０希釈したもの２００μｌを混合し、それを３分間煮沸した後、１時間以上かけ て室温で徐々に冷却した。ゲノムＤＮＡサンプルのアリコットを、ウルトラフィ ルトレーションマイクロチューブまたは９６穴フィルタープレート（ポアサイズ ＝０．１μｍ）に溶出したが、これは図１７に示した通りである。０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０２Ｍ クエン酸ソーダ（sodium citrate）、ｐＨ７．４の洗浄 液で５回洗い、サンプルを２つに分けた後、一方を高ｐＨで変性し、両アリコッ トを走査して蛍光のバックグラウンドとハイブリダイズしたプローブの蛍光を、 それぞれ測定した。標的ＤＮＡのアンプリマーを同様に処理したが、その際、以 下の点だけが異なっている。すなわち、標的ＤＮＡ断片の５’−ビオチン化した プライマーを、アビジン化磁床（直径２．８μｍ）に最初に吸着したため、材料 を損失することなく、洗浄することが可能であった（図１８）。いずれの処理に おいても、プローブの蛍光は、標的ＤＮＡを１×１０^-16以下しか含まないよう なサンプルの希釈液からも検出されることが予想されるが、これは、同じような サイズの１本のプローブを感染Chlamydiaから得られたｒＲＮＡの検出に用いた 場合に、１００００個以下のバクテリアを検出する際に必要とされる検出能力と 、ほぼ同等である。ここで用いたプローブは約１５０塩基の長さであり、プロー ブあたりおよそ３８個のフォルマイシン残基を含み、リボソームＲＮＡのそれぞ れのコピー上にある唯一の標的部位だけに結合する。プローブあるいはプローブ ”カクテル”中の蛍光担体数の増加が、検出能力を増大させるということは、本 発明の重要な点である。１５０塩基のＭＯＭＰ遺伝子に対し、プローブあたりの フォルマイシン残基が１３倍の場合に、Ｘｅｆ−１αプローブの１×１０^-18モ ルを、デュアルモノクルメーター・蛍光スペクトロフォトメーターを用いて検出 することが可能であるが、これに対して、例９に記載したように、光量子計測技 術を用いれば、１×２０^-20モル以下を検出することもできる。例７ 複数の標的部位の検出 診断及び治療、例えばアンチセンスなど、その双方への核酸の応用に対する非 対称合成の重要な点は、プローブ”カクテル”を同時に合成する能力である。こ こで、このプローブ”カクテル”には、長さ、その位置、あるいはそれらが結合 するＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ上の標的部位の数が、それぞれ異なるプローブが 含まれている。３種類の異なるタイプの診断標的に対するプローブカクテルの利 用例が、本発明の幅広い重要性を示している。A．マルチコピーで存在する単一の標的核酸 ある種の病原体のなかには、複数のコピーのｒＲＮＡをそれぞれの個体に持っ ているものもある。例えば、Chlamydia trachomatisのバクテリアは、その個体 あたりおよそ２×１０⁴のｒＲＮＡ分子を含んでいる。ChlamydiaのｒＲＮＡは通 例３０００から５０００ヌクレオチド長の間であるから、診断的検査における検 出能力は、ｒＲＮＡ上の標的配列に対する特異的な、また、５から１０もの異な ったプローブ配列から成るプローブカクテルを用いることで、大きく増加するだ ろう。それら相異なるプローブそれぞれは、図２０に図示されているダイアグラ ムの下半分にあるプローブ（ａ）から（ｅ）に示してある、標的ｒＲＮＡまたは 標的ＤＮＡの独立した部分に結合することができる。この図の中で、（ａ）、（ ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）は、一方のＤＮＡ鎖の相異なる標的配列に特異的 な、類似した相補的プローブである。 診断の標的としてｒＲＮＡ配列を用いるのには、二つの不利な点がある。 （ｉ）ｒＲＮＡ配列は高度に保存されており、それ故、さまざまな短い配列だけ が、感染性病原体の検出と同定に有用である。この、診断の検出能力に対する影 響のひとつは、ごく限られた数の”レポーター”ラベルのみが、それぞれのプロ ーブに用いることができ、それゆえ検出能力に限界がある、というものである。 （ｉｉ）ごくわずかの病原体のみが、ｒＲＮＡを高コピーで保持しており、多く の病原体が、例えばＤＮＡ性ウイルスのように、全くｒＲＮＡを保持していない 、それゆえこの方法を採用できる診断の種類が限られてしまう。B．一本鎖ＤＮＡ上の複数の異なった標的配列 あらゆる生物のゲノムはｒＲＮＡよりもはるかに巨大であり、通例、より大き く、独特の配列を数多く保持している。この配列は、核酸プローブハイブリダイ ゼーションの標的配列を提供し得るものである。例えば、Chlamydia trachomati sの完全なゲノムがすでに単離されており、分子量が６６０×１０⁶以上の、ある いは１×１０⁵よりやや長い塩基長の、比較的小さい二重鎖ＤＮＡから成ってい る。それぞれの細菌細胞もまた、７０００以上の塩基を含む４．４×１０⁶ダル トンのプラスミドを保持している。この種のｒＲＮＡと違って、プラスミドは、 その全体を通じて、chlamydiaに対して独特の配列である（例えば、Neisseria g onorrheaから得られたＤＮＡでは、クロス−ハイブリダイゼーションは検出され ない）。確かに、プラスミドそれ自体の相異なる制限断片間では、クロス−ハイ ブリダイゼーションはおこならい。ハイブリダイゼーションの標的として用いる ために選ばれたChlamydiaのゲノムＤＮＡの他の部分がないときでさえ、Chlamyd iaプラスミドだけの複数の制限断片に特異的なカクテルは、少なくとも４つ以上 のＸｅｆ−１αのプローブに対して、長さに関して同等であり、１００から１０ ００個の細菌細胞に同等のレベルで検出することが可能である。C．一本鎖ＤＮＡ上のマルチコピーの単一の標的部位 いくつかの遺伝子の両側に隣接する配列が、タンデムリピートの中程度のもの から長いものまでを含んでいることが、ごく最近になって発見された。リボソー ム遺伝子のリピートは、本発明に記述されるＤＮＡを利用する診断の類に、特に 興味深いものである。リボソーム遺伝子のように、それらは高コピーで存在し、 検出の感受能を改善するが、加えるに、遺伝子間のスペーサー領域は、種によっ てきわめてさまざまであることが普通である。というのも、それらは選択圧を受 けにくいからである。一本のＤＮＡ鎖上の同じ独特な配列の複数のコピーは、そ のなかではハイブリダイゼーションの標的はそれぞれのゲノム上の部位のカクテ ルであるという、特別なケースを意味している。つまり、ひとつのプローブ配列 は、同じ配列の、また同じＤＮＡ鎖上の複数の標的部位を調べることができる。 それらは、特異的プローブの標的のための種や属として、理想的にふさわしいも のである。 そうしたプローブと標的の典型的な例が、さまざまな家畜に球菌感染症状をひ きおこす、原生動物の寄生生物であるEimeriaの異なる種に対して示された。E.t enellaから得られたゲノムＤＮＡをいくつかの異なる制限酵素で切断し、断片を 適当に切断した非対称プラスミドベクターに結合して、それを用いてEscherichi a coliを形質転換した。ランダムプライミングによって³⁵ＳにラベルされたEime ria tenellaのゲノムＤＮＡとのハイブリダイゼーションによって、コロニーを 、反復配列に関して、スクリーンした。強くハイブリダイズするクローンを取り 上げ、スクリーニングにかけた。このときに用いた、ラベルしたゲノムＤＮＡは 、E.mitis、 E.maxima、E.acervulina、E.tenellaから得たもの、ならびに近隣 の属であるPlasmodium、Trypanosoma、Sarcocystisから得たＤＮＡであった。ク ローンの大部分は、他の属から得たＤＮＡと同じ強さのシグナルを与えた。しか しながら、いくつかのクローンは、Eimeriaによって特に強く認識されたし、ま た、E.tenellaによってのみ認識されたクローンも１つある。 後者のクローン中で挿入された配列の完全なものは、３３４塩基対を含んでい る。制限断片の物理学的キャラクタリゼーションが示していたことは、以下の通 りである。すなわち、配列はおよそ７３８塩基対のタンデムな繰り返し単位中に 存在する。また、最低３０個の遺伝子がタンデムにリンクしており、全てがひと つの染色体上にあることがわかった。タンデムリピートをテンプレートとして用 いて合成した非対称プローブは、テンプレート配列あたり１７９個のフォルマイ シンＡ残基を含んでいる。 ハイブリダイゼーションの標的として用いるために選ばれたEimeriaのゲノム ＤＮＡの他の部分がないときでさえ、Eimeriaゲノム上のタンデムリピートの複 数のコピーだけに特異的な配列のプローブは、少なくとも１１個以上のＸｅｆ− １αのプローブに対して、長さに関して同等である。Eimeriaの感染性粒子は卵 であるから、そのひとつひとつが８個のゲノムを含んでおり、そうした標的のカ クテルは１０個以下の卵の検出を可能にする。タンデムリピートを導入すること は、検出能力を高めることになるが、しかし、あるいは、このひとつの属の検出 を簡単にする。というのも、タンデムリピート配列は、広くさまざまな種と属の ゲノムＤＮＡ中に存在するからであり、同時にこれらの種で異なるからである。 それ故、広範囲に及ぶ病原体の診断検査の設計の、幅広い基礎を提供するもので あり、診断のためのｒＲＮＡ標的が存在しないようなものも含んでいる。例８ ライゲーションまたは化学的結合による非特異的およびハイブリダイズし ない蛍光オリゴマーのユニバーサル蛍光”タグ”としての利用 ３’、５’、あるいは３’と５’末端の両方に”粘着末端”（例えば、^5'ＡＣ ＧＴ−ポリｄ（ＡＴ）、ポリｄ（ＡＴ）−ＴＧＣＡ^3'、あるいは^5'ＡＣＧＴ−ポ リｄ（ＡＴ）−ＴＧＣＡ^3'など）を作るための、テンプレートの簡単な変更によ って、上述の特性を全て有する核酸プローブを合成することが可能になったが、 それは（ｉ）より長い蛍光プローブを作るような鎖、または（ｉｉ）指示された ターゲットＤＮＡに特異的な他のハイブリダイゼーションシークエンスのどちら かに対して接着させることも可能であった。あらゆるクローン化されたＤＮＡ断 片の普遍的なラベルを作ったり、その末端で高い蛍光活性を有するがどちらの鎖 もハイブリダイズしないシークエンスを同定するためのプローブを与えたりする 場合に、後者は、特に有効な方法である。その際には、これまで述べてきたよう に、単純なポリ（ＦＵ）において見られた、検出のためのハイブリッドの変性を 必要としない。同等の非ハイブリダイジングユニバーサルプローブを、化学合成 によって作ることがすでに可能である。この化学合成においては、例えばエテノ アナログフォスフォルアミダイト、例えば、１，Ｎ₆−エテノアデノシン−３’ −Ｏ−フォスフォルアミダイト（1,N₆-ethenoAdenosine-3'-O-phosphoramidite ）（ｅＡ）を、続いてあらゆるハイブリダイゼーションプローブにリンクできる ような非特異的タグを合成するのに用いた。 また、そうしたユニバーサルプローブの３’あるいは５’末端を、他のオリゴマ ーや固相に、酵素的というよりもむしろ化学的に結合するために、備えることも 可能である。その際に加えるのは、５’−アミノヘキシル（5'-amino hexyl）、 ５’−サルフヒドリルヘキシル（5'-sulfhydryl hexyl）、３’−アミノヘキシ ルアミノ（3'-aminohexyl amino）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（N -hydroxysuccinimide esters）、そして他のそうしたリンカーである。このプロ ーブ技術の独自な応用（ユニバーサルエンドラベルを採用している）は、定量的 であり、高い感受能を必要とするルーチン検査において、よく機能する。本稿で ”持続型シグナル増幅”として言及されているこの技術の別の応用は、非定量的 であり、ある遺伝子マーカーがはたして存在しているのかどうか、正しいか否か の答を得るために、極端な感受能が要求されるような状況において有用である。 例えば、低コピー数の標的配列があるような場合である。”持続型シグナル増幅 ” は、以下の例８（Ｂ）に、より詳細に記述してある。A．５’ユニバーザル末端標識 例えばエテノアデノシン（ethenoadenosine）のように、蛍光ヌクレオシドア ナログに非水素結合しているホモポリマーが、小プローブ（配列決定の際の小断 片上で）のカクテルの蛍光ラベルの強度を増大するため、また、小さい、あるい は低コピー数の標的のラベリングの感受能を増大するために、一本鎖ＤＮＡとＲ ＮＡの非対称合成とともに用いられた。総体的な概念は、オリゴマーのプローブ を含んでいが、このオリゴマーは、典型的なフォスフォジエステル骨格をもとに 構築されたものである。しかし、それは、異なる機能領域−５’蛍光ホモポリマ ー、プライマーまたは相補的なプロモーター、オプショナルな”ティーザー”領 域（これは、ホモポリマーをプライマーに結合させることができる）、そして相 補的な標的に分配することが可能である。ここに記述された５’ユニバーサルエ ンドラベルのダイアグラムは、図２２に示してある。 図２２に示されたフォスフォジエステル鎖の機能領域は、 Ａ＝１からおよそ５０の蛍光ヌクレオシドアナログの非塩基対ホモポリマー。 Ｂ＝例えば、オリゴマーのフォスフォジエステル骨格の一部に挿入された、ひ とつ、またはそれ以上の自由回転するアルキル鎖を含む、オプショナルな非ヌク レオチドフォスフォジエステル”ティーザー”。 Ｃ＝標的特異的なＤ領域の酵素合成をはじめる際に用いる、酵素合成プライマ ー。典型的な例は、本稿に記述されている、非対称ＲＮＡまたはＤＮＡプローブ 合成に用いられたような、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター、あるいはＭ １３フォワードプライマーに相補的な配列であろう。 領域Ａ、Ｂ、Ｃは、代表的なものは２０から６０塩基長であるが、化学的に合 成することが可能である。５’ユニバーサルエンドラベルは、すくなくとも領域 Ａ、Ｃを含み、あるいは、オプショナルな領域Ｂを含み得る。 Ｄ＝４０から２００００のヌクレオシド長の、標的に相補的な配列。この配列 は、蛍光ヌクレオシドアナログを含んでいてもよいし、含んでいなくてもよいが 、主としてプロモーターあるいはプライマーサイト（これに対して、領域Ｃは相 補的である）に隣接するテンプレートから合成された領域として、機能する。 ５’ユニバーサルエンドラベルを用いた酵素的合成は、M.tuberculosis IS611 0のテンプレート（その最近に独自な配列）を用いて示してある。このテンプレ ートは、合成テンプレートを作るために、標準的なジェミニプラスミドに挿入し てある。他のプラスミドも、同様に用いることができる。この酵素合成のプロセ スは、図２３に示してある。以下に挙げた、５’ユニバーサルエンドラベルに有 利な点もまた、発見されている。 (1)図２４に示したように、ひとつの非水素結合蛍光アナログ、エテノアデノ シンの励起スペクトル（Ｆ₁₈₅と示されている）が、比較対象であるフォルマイ シンの励起スペクトル（Ｆ₁₀₅）と、比較されている。二つの重要な発見が、Ｆ_{1 85} の励起と発光スペクトルの両方から見いだされた。（ｉ）波長の最大値は、ｐ Ｈ７とｐＨ１１の両方で等しい。（ｉｉ）量子収量は、Ｆ₁₀₅がｐＨ７とｐＨ１ １それぞれにおいて示している０．５５、０．６５という値の１０倍以上。これ は、５’ユニバーサルエンドラベルを、幅広いｐＨコンディション下で用いても 良いということであり、より少ない蛍光担体の総量から、はるかに強い蛍光を引 き出せることができる、ということである。ｐＨ１１で、２７０ｎｍ≦λ≦３１ ０ｎｍの範囲で励起するＦ185の２０マーが、３から１０の蛍光分子へのラベリ ングに相当するということが、示されている。更に、蛍光はクエンチされず、時 間分析分光に用いることが可能である。 (2)非塩基対末端ラベルは、プライマーが介在するＤＮＡの増幅、または複製 に干渉しないし、１０^-3Ｍまでの濃度では水に可溶であり、また結合試験の際に 、非標的配列に対する非特異的ハイブリダイゼーションによるバックグラウンド を増大させることもない。 (3)そうしたプローブは、化学的に合成したプローブの能力を上回っている。 というのも、こうした技術においてよく知られているように、満足できるような 収率における合成の実用上の限界は、およそ６０塩基にとどまっているからであ る。５’ユニバーサルエンドラベルは、”Ｄ”領域の長さがおよそ１００塩基で あるような、相対的に短いプローブのカクテルを用いることで、検出の感受能を 増大することが可能である。具体例を挙げるなら、図２５に示したように、M.tu berculosis IS6110の塩基配列１３６１ｂｐが、１０種のプローブのカクテルに 対 する標的として用いられたが、これらはそれぞれが、相異なる”Ｄ”部分か、あ るいは標的に相補的な配列を有している。しかし、それぞれのプローブは、同じ ５’ユニバーサルエンドラベルを保持している。M.tuberculosisの場合、細菌細 胞１個体あたりＩＳ６１１０の遺伝子は１６コピー存在する。図２５に示された 方法で末端ラベルを用いることによって、それぞれの細菌が、恒久的な蛍光担体 を有するプローブカクテルによってラベルされるという可能性を有するようにな った。この蛍光担体は、４８０から１６００の蛍光分子が同時に発光することに 相当する。 (4)同じラベリングの計画を、標準的なＤＮＡ塩基配列決定における標準化さ れた蛍光ラベルの供給に用いることが可能であるが、すでにラベルされたＤＮＡ 断片を有しているので、配列をゲルから直接読むか、記録することができる。そ うした用い方は、図２６に示している。B．持続するシグナル増幅(SSA) ５’ユニバーサル末端標識が、こうした状況において特に有用であることが判 明するであろう。検出の極めて高い感受レベルが要求されるような応用、あるい は極めて小さい標的が存在するような場合の応用において、蛍光ラベリングとシ グナル複製あるいは増幅のある組み合わせが、求められる。Ｂ型肝炎がそうした ケースにあたる。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の全ゲノムはわずか３２００塩基 長であり、ウイルス粒子の内部では、鎖のひとつは、更に短い。ウイルス粒子は 、宿主細胞から得たヌクレオチドトリフォスフェイトを利用して、感染の初期段 階として短い鎖を完成させるような、ＤＮＡポリメラーゼを含んでいる。 本稿に記載されている新規蛍光ヌクレオシドアナログと共に用いられる、ウイ ルス粒子中のＤＮＡポリメラーゼを、非ＰＣＲタイプの増幅に組み合わせたが、 これは、今までＲＮＡ複製にしか用いられていなかったものである。このスキー ムにおいては、図２７に示されているように、ウイルス粒子のＤＮＡはin situ テンプレートとして供与され、上述した非対照合成法と組み合わせることで、蛍 光シグナルの強度の増大に用いることができる。そのプロセスは、図２７に言及 することによってより理解されるはずであるが、ふたつのステップから成ってい る。 最初の段階は、サンプルＤＮＡを （ｉ） 三リン酸化された蛍光ヌクレオシドア ナログを含むデオキシヌクレオチドトリフォスフェイト（ｄｅｏｘｙＮＴＰｓ） と、（ｉｉ）ふたつのプライマー（図２７においてＡ及びＢと示されている）と に結合させる。その最初は、その５’末端に、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター に対し相補的な配列を有している。この実験例において言及されているプライマ ーは、ふたつの分離したプライマーを用いることを示すため、”Ａ”及び”Ｂ” として記述されている。これらは、説明を目的とするために記述されたのであり 、そうしたものは、本技術の熟練者には、あらゆるプライマーに言及しているこ とが、理解されるであろう。このプライマーとは、標的配列上のプロモーター領 域に相補的な配列を含み、また、核酸ポリメラーゼとともに用いることができる 。図２７に示されている説明において、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは 、プライマーＡの末端に、太線で表現されている。はじめにサンプルを、ウイル スＤＮＡポリメラーゼが短いゲノム鎖を完成できるように、１０分間３７°Ｃで インキュベイトしてから、ゲノムを変性させるために、１分間６５°Ｃに上げ、 その後、４２°Ｃでプライマーをアニールさせた。次の段階は、二種類の酵素、 すなわちリバーストランスクリプターゼとＴ７ＲＮＡポリメラーゼを、蛍光リボ ヌクレオシドアナログを含むリボースＮＴＰと共に加え、サンプル全体を１時間 ４２°Ｃでインキュベイトする。これは、図２７の下半分に示したように、ＤＮ Ａ鎖とＲＮＡ鎖のサイクル合成となっている。ネット効果によって、１０⁸から １０⁹の蛍光ＲＮＡ鎖と、そのおよそ１００分の１以下の蛍光ＤＮＡ鎖が生成す る。未使用の単体蛍光ＮＴＰを除去するため、セルフリーな状態の中でサンプル を洗浄することに続いて、サンプル中になんらかのテンプレート（この場合はＢ 型肝炎ＤＮＡ）が存在するかどうかを決めるために、蛍光によってサンプルを読 むことが簡単にできるのである。例９ 時間分解フルオロメトリーを用いた蛍光プローブの定量 結合した蛍光オリゴヌクレオチドプローブの蛍光ヌクレオシドアナログ、蛍光 オリゴヌクレオチド、あるいは類似な配列を検出する新規な方法を、サンプル中 の蛍光単体の量を測定する光量子計測を使用することを基礎として、発展させた が、この方法を以下に述べる。この方法は、蛍光担体または核酸プローブからの 全蛍光発光を総和するという点において、また蛍光の波長の独立性において、更 にいずれも時間とスペクトル総和の新規な組み合わせであり、診断検査、あるい は治療的処置に対する同定、検出、核酸標的配列の定量を行うための光量子計測 の新規応用であるという点において、時間分解分光分析とは異なっている。 あらゆる発光の計測に用いられる基本的な実験パラメーターは、発光の強度１ である。その単位は、毎秒毎リットルあたりの光量子のモル数である。ここで用 いた蛍光ヌクレオシドアナログは、全ての実用上の目的のため、恒常的に蛍光を 有し、通常の測定におけるライフタイム間では光退色しないので、蛍光の発光（ これは、毎秒、蛍光担体のモルあたり、発光する光量子のモル数で測定される） は、蛍光担体の量の指標として（それゆえ、サンプル中のプローブの量の指標と して）用いることが可能である。そうした測定のための適切な機械の使用は、Ch romagen社によって開発されてきたものだが、以下の操作を含んでいる。すなわ ち、（ｉ）２９０ｎｍ≦λ≦３２０ｎｍの範囲で高い強度の励起を可能にする１ ５０ワットのＨｇ／Ｘｅ ＣＷ 円筒型ランプ、（ｉｉ）超高感受性フォトマル チプライアー（これに使用されているフォトダイノードは、発光の範囲が３６０ ｎｍ≦λ≦５５０ｎｍの間のみで反応するようコートされている）、（ｉｉｉ） 発光フィルターとして用いることが可能な、ガラス壁ではない水晶製励起窓を有 する円筒型キュベット、である。このキュベットをマウントするのは、全サンプ ルをフォトマルチプライアーのチューブの前面に集めることを可能にするためで ある。そして（ｉｖ）５台の、コンピューター制御された光量子計測クロック（ これは順番に接続されており、いずれも毎秒１０⁹の頻度で光量子を識別できる ）。 室温、及びｐＨ＝１０の条件下で、モノマーのフォルマイシンＡと、４８９個 のフォルマイシン残基を含む完全長のＸｅｆ−１αプローブを用いた実験におい て、我々が見いだしたことは、（ｉ）モノマーとプローブの連続希釈の発光は、 濃度と直線的な関係があり、（ｉｉ）プローブの発光は、同じ数のフリーなモノ マーと、等価である、ということである。図１７と１８に示したような、恒久的 な蛍光担体を用いた代表的なアッセイにおいて、サンプル中に存在する標的の量 は、結合しなかったプローブを洗い落とした後に、ハイブリッドを変性すること によって、結合したプローブの量を測定することで、決定された。ここで用いた 塩基性条件下において、モノマーの数と同じだけの発光量に対するアナログプロ ーブ配列中の残基の蛍光の当量が示すものは、無視し得る自己消光がオリゴマー 中にしかないので、ターゲットＲＮＡやＤＮＡによって結合したプローブの量の 定量に、プローブの発光を直接に用いることができるということをも示している 。それ故、幅広い用途での核酸アッセイや診断に用いる検出材料のデザインにあ たって、広範囲にわたる原理を与えるものである。検出感度とシグナル／ノイズ 比は、計測される光量子の数と計測されている間の時間周期数との相関であると いう点が、本発明から得られた重要な結論である。例１０ オリゴヌクレオチドおよび複合体の固定のための、または”標識”とし ての蛍光オリゴマーの接続のための、５’および３’リンカーの接続 本発明の実験手順と化学原理は、蛍光ヌクレオシドアナログを用いるあらゆる プローブの合成と同定に用いることが可能である。その合成法が酵素を用いるも のであろうと化学的なものであろうと、蛍光活性とハイブリダイゼーションの特 異性の両方に関して適用できる。そうしたプローブは、ここに述べてきたような 液体中でのハイブリダイゼーションの形態だけでなく、研究室などでより頻繁に 用いられる技術にも用いることができる。その技術とは、”ドット−ブロット” 検出法、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動、サザンブロッティ ング、フィルターやメンブレン上でのハイブリダイゼーションとＨＰＬＣやキャ ピラリー電気泳動法によるハイブリッドの分離などである。リンカーは液体ハイ ブリダイゼーションに必須ではないが、ビオチン／アビジンを利用したものや、 ホモ／へテロ−二官能性リンカーなどのように、適当な親和性を持つリンカーは 、ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片について図１８に図示してあるように、プローブ あるいはハイブリッドを、捕捉、濃縮、単離または検出するために用いることが 可能である。本発明には、オリゴヌクレオチドと同様リンカーから派生した蛍光 ヌクレオチド、蛍光オリゴヌクレオチドプローブによる増幅やそれに続く検出に 用いられる、リンカーから派生したプライマー、そうしたオリゴヌクレオチドプ ローブ、プラスミド、ここに記述されているような応用例と使用法をもとに開発 さ れた、もしくはそれから”標識”された治療薬などが含まれている。そうした派 生例は以下の応用例も含むが、しかしこれらに限定されるものではない。すなわ ち、プリンまたはピリミジンヌクレオシド、もしくはそれらの蛍光構造を持つア ナログへのアミノ基転移、アミノ−チオール（amino-thiol）、アジド（azido- ）、アルデヒド（aldehyde）、ヒドロキシコハク酸イミド（hydroxysuccinimide ）、５’アミノアルキル−３’−Ｏ−フォスフォルアミダイト（5'aminoalkyl-3 '-O-phosphoramidite）、５’−チオアルキル−３’−Ｏ−フォスフォルアミダ イト（5'-thioalkyl-3'-O-phosphoramidite）、３’−アミノヘキシルアミノ（3 '-aminohexyl amino）、アミノシラン（amino silane）、アミノシリル派生物（ aminosilyl derivatives）、及び他のリンカーやリンカーと反応する物質群、ま たは、３’か５’が酸化されたシス−ジオールのシッフ塩基縮合のように、縮合 反応中の物質群などである。これらは、技術に通じている者にはよく知られてい るものである。以上にあげたことを説明するために、特殊なケースを以下に示す 。 （ｉ） ＭＯＭＰ遺伝子のシークエンスに対する非蛍光増幅プライマーのセッ トを、化学的に合成した。合成の最終段階で、もう１サイクル増やして、５’− アミノヘキシル−３’−Ｏ−フォスフォルアミダイトを、通常のフォスフォトリ エステル化学を用い化学的に合成して完成させたプライマーの５’末端に付加し た。 （ｉｉ） 強力なエトキシドで固相担体から外した後、それぞれの鎖の末端ア ミノ群をＮＨＳ−ビオチンエステルと反応させて、５’ビオチン化プライマーを 合成した。 （ｉｉｉ） プライマーを通常の方法で増幅に用いた。その後、アンプリマー をアビジン化した９６穴フィルタープレートで捕獲し、未反応の原料と不純物を 除去するために洗った。 （ｉｖ） 上述したように、捕獲したアンプリマーを、蛍光アナログでラベル したオリゴヌクレオチドプローブでハイブリダイズして、アンプリマー中のター ゲットシークエンスの量を定量した。 本発明に含まれているのは、固定ビーズ、フィルター、活性化プラスチックプ レート上で、蛍光アナログを他の蛍光または非蛍光オリゴヌクレオチドに結合さ せることである。その結合には、ライゲーションのように酵素的に結合させるも の、ここに記述されているようにリンカーを用いて化学的に結合させるものを含 む。例１１ 蛍光ヌクレオシドアナログおよびプローブの使用を拡大し促進するため の蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）の利用 ここに記述したように、オリゴヌクレオチドを合成もしくは誘導体化させるこ とができた。これは、二つあるいはそれ以上のスペクトル、検出可能なラベル、 他と分離してはっきりした蛍光発光特性を伴う２つかそれ以上のヌクレオシドア ナログを用いるか、または上記にあるように共有結合したＦＲＥＴアクセプター を用いるか、いずれかの方法によって明らかになったものである。もし、ＦＲＥ Ｔアクセプターが、プローブ発光のアクセプターとして溶液中で簡単に扱えるの ならば、それらもまた、蛍光プローブの検出の感度を上げるか、検出範囲を広げ るために用いることができる。実例を挙げるならば、クマリンのような染料、例 えば７−アミノ−４−メチルクマリン−３−アセテート（7-amino-4-methylcoum arin-3-acetate）、７−メチル−ウンベリフェロン（7-methyl-umbelliferone） 、ナフタレン（naphthalene）及びアントラセン染料（anthracene dyes）などの 励起スペクトラムは、蛍光ヌクレオシドアナログ、例えばポリ（ＦＵ）から合成 したオリゴマーの発光スペクトラムと重複している。ただし、オリゴマー自身の 励起スペクトラムとは重複していない。７−アミノ−４−メチルクマリン−３− アセテートのような染料は、そうした理由により、（ｉ）実例としては、Ｎ−ヒ ドロキシコハク酸イミドエステル（N-hydroxysuccinimide ester）とオリゴマー 上のアミノ基群とを反応させたときのように、共有結合したＦＲＥＴアクセプタ ーとして用いるか、または（ｉｉ）プローブ蛍光のＦＲＥＴインジケーターとし て用いるために、プローブ溶液に単なる染料として加えるか、いずれかの利用の 仕方がある。ハイブリダイゼーションプローブへの２つめの蛍光ラベルを与える という明らかな利点に加えて、この方法論はプローブシグナルの増幅にも役立つ 。それは、発光のより効率的な捕獲、励起源からの拡散光を主とするバックグラ ウンドの低減、そしてより長い可視波長の検出などによって実現する。例１２ ＲＮａｓｅＨ増幅法 はじめに、ＲＮＡ蛍光プローブをＤＮＡサンプルと接触させる。ＲＮＡ蛍光プ ローブは、標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズする。ＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡ：Ｄ ＮＡハイブリッドのみを切断し、１本鎖ＲＮＡプローブは切断しない。その結果 生じた蛍光モノマーは、溶液中に放出されるので、次のＲＮＡプローブが、切断 されるべくハイブリダイズすることができる。実験の最終段階では、モノマーを 通常のメンブレン上で分離し、放出されたモノマーの量を、簡単なフルオロメト リーで測定する。ハイブリッドをＤＮＡなしで行った標品は、蛍光を全く生じな かった。 ここに記述した実験例と具体例は、ただ説明する目的のためだけのものであり 、それに照らしてみた場合の各種修正や変更は、当業者に示唆されているもので あることは理解されるべきである。それらは、出願の思想と範囲および添付され た請求の範囲の権利範囲の中に包含されるべきものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．以下の構造を有する蛍光性ヌクレオシド、またはその構造類似体。 ここで、Ｘ₁、Ｘ₂、Ｘ₃、Ｘ₄、Ｘ₅、およびＸ₆は、Ｎ、Ｏ、Ｃ、Ｓ、またはＳｉ であり、Ｘ₁、Ｘ₂、Ｘ₃、Ｘ₄、Ｘ₅、およびＸ₆のうち少なくとも一つは、Ｎであ り、Ｒ₄は、検出可能な標識で誘導体化されうる反応性基であり、Ｒ₅はＨまたは Ｒ₄とのエテノ結合の一部であり、Ｒ₆は、Ｈ、ＮＨ₂、ＳＨまたは＝Ｏであり、 Ｒ₈とＲ₉は、水素、メチル、臭素、フッ素またはよう素；アルキルまたは芳香族 置換体；アミド、チオエステルまたはジスルフィド結合を含む結合性分子、また はxが１以上２５以下の整数で、Ｒ₁とＲ₂は、Ｈ、ＯＨ、アルキル、アクリル、 アシル、アミド、チオエーテルまたはジスルフィドであるＲ₁-（ＣＨ₂）_x-Ｒ₂の ようなそれらの組み合わせであり、Ｒ₁₀は、水素、酸感受性／塩基安定性のブロ ッキング基またはリン誘導体であり、Ｒ₁₁とＲ₁₃は水素であり、Ｒ₁₂は、水素、 ＯＨ、３’アミノ、３’アジゾ、３’チオール、３’不飽和または３’リン誘導 体であり、Ｒ₁₄は、水素、ＯＨまたはＯＲ₃（Ｒ₃は反応性基、保護基、または付 加的な蛍光団）である。 ２．請求の範囲１に記載の化合物の、合成、増幅、酵素的分解、塩基対形成、標 識、塩基配列決定、複製、転写、ロケーション、検出またはＤＮＡもしくはＲＮ Ａオリゴヌクレオチドの同定における、６つの通常存在する非蛍光性Ｎ-ヌクレ オ 性Ｎ-ヌクレオチドのいずれかの代替物としての使用。 ３．請求の範囲２に記載の使用において、ＤＮＡもしくはＲＮＡオリゴヌクレオ チドの増幅、合成、標識、検出または同定が、（i）化学的な、合成、伸長また は結合方法か、（ii）増幅、複製、エンドヌクレアーゼによるＤＮＡまたはＲＮ Ａの分解、転写、末端標識、フィリングまたはニックトランスレーションの酵素 的方法、で行われる使用。 ４．蛍光ヌクレオシドを含む、標的ポリヌクレオチド配列の検出または増幅のた めに用いられるポリヌクレオチドプローブ。 ５．ハイブリダイゼーションが起こる条件下で、効果的な量の請求の範囲２に記 載のプローブを含む混合物と標的配列が存在する疑いのあるサンプルとを接触さ せ、蛍光の観測または蛍光の変化によるハイブリダイゼーションの検出を行うこ とを含む、標的ポリヌクレオチド配列の検出方法。 ６．ゲノム内の複数の部位を同時に検出することを含む、請求の範囲５に記載の 方法。 ７．オリゴヌクレオチドの合成に使用するための蛍光ヌクレオシド類似体の２’ −デオキシ体を製造する方法において、 （１）該類似体を、３’、５’ジシラ（disila）保護された類似体に変換するこ と （２）２’−デオキシ−５’トリフォスフェートまたは２’−デオキシ−３’− Ｏ−フォスフォルアミダイトを製造するために、該ヌクレオシドを脱保護するこ と を含む方法。 ８．核酸配列用の５’ユニバーサル末端標識剤であって、ハイブリダイズしない 蛍光ヌクレオシド類似体を含む５’ホモポリマー、および核酸配列のプロモータ 一部位に相補的な配列を含む標識剤。 ９．請求の範囲８に記載のユニバーサル末端標識剤であって、該ホモポリマー配 列および該プロモーター部位に相補的な配列の間で両配列に接続されるように位 置する核酸を更に含む、ユニバーサル末端標識剤。 １０．請求の範囲８に記載のユニバーサル末端標識剤であって、単一の標的配列 に相補的な核酸配列を更に含む、ユニバーサル末端標識剤。 １１．以下の工程を含む、蛍光５’末端標識プローブの製造方法。 （ａ）既知のプロモーター部位と該既知のプロモーター部位の下流に既知の制限 部位を有する配列を、特異的な制限酵素で切断する。 （ｃ）挿入された標的配列のプロモーターに相補的な配列を含む蛍光ヌクレオシ ド類似体プローブをハイブリダイズさせる。 （ｄ）挿入された標的配列に相補的な特異的なプローブを合成するために、核酸 ポリメラーゼを用いて、ハイブリダイズされたプロモーター領域からプローブ配 列を伸長させる。 １２．以下の工程を含む、標的ヌクレオチド配列を検出する感度を上昇させる方 法。 （ａ）５’ユニバーサル末端標識を化学的に合成する。 （ｂ）該標的配列の識別可能な領域に相補的な、複数の核酸配列を酵素的に合成 する（それぞれの該複数の核酸配列は、段階（ａ）の末端標識を含む）。 （ｃ）該複数の５’末端標識された核酸配列の混合物カクテルを作る。 （ｄ）該ラベルされた核酸配列を、標的核酸配列にハイブリダイズする。 １３．以下の工程を含む、ポリヌクレオチド中の塩基の配列を決定する方法。 （ａ）それぞれが異なる長さを有する複数の核酸断片（該それぞれの核酸断片は ５’ユニバーザル末端標識を付加されている）を合成する。 （ｂ）ゲル上でそれぞれ異なる長さを有する該核酸断片を分離する。 （ｃ）該断片長のそれぞれをゲル上で直接測定する。 １４．以下の工程を含む、継続するシグナル増幅を得るための方法。 （ａ）相補的な二本鎖核酸配列を形成するように、二本鎖の第１の鎖を伸長する 。 （ｂ）二本鎖を分離し、それぞれの核酸配列に相補的なプライマー配列をハイブ リダイズさせる。 （ｃ）核酸ポリメラーゼによって、第１の鎖の核酸配列を伸長する。 （ｄ）繰り返し核酸鎖が合成されるように、逆転写酵素および核酸ポリメラーゼ を供給する。