JP4643262B2 - 検体検出法 - Google Patents

Description

本発明は広義には３個以上のリン酸基含む末端リン酸標識ヌクレオチドを核酸ポリメラーゼの基質として用いて１種以上の検体を検出する方法に関する。使用する標識は酵素での活性化の可能なものであり、化学発光部分、蛍光部分、電気化学的部分、発色団及び質量タグを含む。

サンプル中の検体を高い特異性及び感度で検出する方法は公知である。こうした方法には、抗原抗体アッセイ、ＤＮＡハイブリダイゼーションに基づくアッセイがある。免疫検出を用いる検体の検出は当技術分野で周知である。その例としては、放射性同位体、蛍光もしくは化学発光タグを用いた抗体の直接標識、又は抗体に結合した酵素で発色性基質から検出可能な化学種への変換を触媒するＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。１回の結合で複数の検出可能な部分を生成させることができ、感度を高めることができるので、一般にＥＬＩＳＡアッセイの方が望ましい。同様の方法がＤＮＡハイブリダイゼーションに基づくアッセイに組み込まれており、これは概してさらに感度が高く、大半の診断アッセイでは疾病の進行の初期段階で用いることができる。感度の増大は、特定の標的配列の存在に基づいてまず核酸配列を増幅することによって達成される。増幅後、増幅配列を検出して定量する。核酸配列の増幅法としては、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）プロセスが知られている。現在、ＰＣＲは最も一般的な核酸のインビトロ増幅手段である。しかし、ＰＣＲには、厳密な温度制御の必要性、指数的増幅のため定量には適さないこと、微量の夾雑ＤＮＡが同時の増幅されるため誤った結果を与えかねないことなど、幾つかの短所がある。さらに、核酸以外の大半の検体については増幅は容易でない。かかる場合、シグナル増幅法の方が望ましい。こうした方法では、増幅した分解産物を検出する。つまり、反応生成物又は副生物を標的検体からのシグナルとして増幅する。

従来のシグナル増幅法では抗体又はポリヌクレオチドに結合した酵素を用いるが、達成できる多重化の量による制約がある。抗体又はＤＮＡプローブに結合させる酵素、アルカリホスファターゼや西洋ワサビペルオキシダーゼのような数種しかない。その他のシグナル増幅法は核酸代謝酵素に基づくものである。

λ−エキソヌクレアーゼを利用して二本鎖ＤＮＡを特異的に切断するサイクリングアッセイが開発されている（Ｃ．Ｇ．Ｃｏｐｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｖｏｌ．１３， Ｎｏ．６， ｐｐ８８２−８９２， １９９２）。この方法では、オリゴヌクレオチドプローブを相補的な核酸配列とハイブリダイズさせ、形成された二本鎖ＤＮＡにλ−エキソヌクレアーゼを作用させて、ハイブリダイズしたプローブを分解させる。プローブは別のプローブで置き換わり、次いで分解される。このようにしてサイクリング反応を繰返す。この方法では、標的ＤＮＡ配列の存在は、変性プローブの検出によって概算される。この方法の短所は、λ−エキソヌクレアーゼには、５′末端がリン酸化されたプローブが基質として必要とされることである。公知の方法によるプローブの化学合成後、５′末端をリン酸化する必要があるが、すべての５′末端が完全にリン酸化されたことを確認するのは困難である。この方法のもう一つの問題は、サイクリング反応のターンオーバー数（つまり、プライマーと標的ヌクレオチドの間で起こるハイブリダイゼーションの回数）が低いことである。ターンオーバー数が低いのは、ハイブリダイゼーション段階を繰返す必要があるからである。

エキソヌクレアーゼによる別のサイクリングアッセイが欧州特許出願公開第５００２２４号に開示されている。この方法では、標的ＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖の合成は、プライマーから進行するが、同時にそのプライマーの反対側から５′→３′エキソヌクレアーゼによる分解が起こり、その結果、前にハイブリダイズしていた分解プライマーに代わって、別のプライマーが標的配列とハイブリダイズする。従って、一サイクルの反応で、ＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖の合成だけでなく合成された鎖の分解が繰返し起こる。この方法の短所は、ターンオーバー数が低く、ハイブリダイゼーション段階を繰返し起こす必要があるのでハイブリダイゼーション段階が律速段階となることである。

特定の配列を含むポリヌクレオチドの検出のための別のサイクリングアッセイが米国特許第５８４９４８７号に開示されている。この方法は、シグナル増幅及び分解産物の検出に基づく。この方法は、核酸ポリメラーゼと３′→５′エキソヌクレアーゼとヌクレアーゼ耐性プライマーと標的核酸（限られた濃度のＤＮＡでもよい）と１種以上のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）の組合せを用いて、標的核酸配列を検出する。この方法は、さらに、ヌクレアーゼ耐性プライマーの３′末端に隣接して位置するヌクレオチド種である相補鎖の合成、次いでプライマーの末端に結合したヌクレオチド種の分解、生成したピロリン酸又はデオキシヌクレオシド一リン酸の検出を含んでおり、ヌクレオチド種の合成及び分解を２回以上繰返す。この方法及び現在広く用いられている他の検出法の短所は、最終標識産物又は副生物から標識出発物質を分離する必要があることである。かかる分離には、一般に、ゲル電気泳動又は検出用メンブランへの標的核酸配列の固定が必要とされる。例えば、米国特許第５８４９４８７号では、ヌクレアーゼ反応で生じたデオキシヌクレオシド一リン酸をクロマトグラフィーで分離し、光学的に測定する。或いは、ＤＮＡポリメラーゼによる相補塩基の取込みの際に生成するピロリン酸を、アデノシン−５′−ホスホ硫酸及びアデノシン三リン酸スルフラーゼと反応させてアデノシン三リン酸を生じさせ、次いでこれをルシフェリン−ルシフェラーゼ反応で検出することもできるが、追加の試薬及びインキュベーション段階を要するという短所がある。

ＤＮＡ及びＲＮＡポリメラーゼは、三リン酸部分のγ位が修飾又はγ位に代わる修飾をもつヌクレオチドを認識して利用することができることが知られている。γ修飾ヌクレオシド三リン酸を認識し利用する各種ポリメラーゼの能力が、γリン酸に結合した基に応じて変わることも知られている。

γリン酸修飾ヌクレオシド存在下でのＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成をモニターするための比色定量アッセイが報告されている（Ｖａｓｓｉｌｉｏｕ Ｗ， Ｅｐｐ ＪＢ， Ｗａｎｇ ＢＢ， Ｄｅｌ Ｖｅｃｃｈｉｏ ＡＭ， Ｗｉｄｌａｎｓｋｉ Ｔ， Ｋａｏ ＣＣ． Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ： Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． ２０００ Ｓｅｐ １； ２７４（２）：４２９−３７）。この報文では、ＲＮＡポリメラーゼ反応は、ジニトロフェニル基を用いてγリン酸を修飾したγ修飾アルカリホスファターゼ耐性ヌクレオシド三リン酸の存在下で実施されている。このγ修飾ＮＴＰを唯一のヌクレオシド三リン酸としてホモポリマー系鋳型の存在下でＲＮＡポリメラーゼ反応を実施すると、ＲＮＡポリメラーゼがこの修飾ＮＴＰを認識及び利用できることが分かっている。さらに、ポリメラーゼ反応をアルカリホスファターゼの存在下で実施すると、リン酸基転移のｐ−ニトロフェニルピロリン酸アルド産物を消化して発色性ｐ−ニトロフェニレートを生じ、吸光度が増大すると報告されている。この検出法の短所は、アルカリホスファターゼ存在下で実施されるリアルタイム比色定量アッセイが、ホモポリマー系の鋳型でしか機能しないことである。
欧州特許出願公開第５００２２４号 米国特許第５８４９４８７号明細書 Ｃ．Ｇ．Ｃｏｐｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｖｏｌ．１３， Ｎｏ．６， ｐｐ８８２−８９２， １９９２ Ｖａｓｓｉｌｉｏｕ Ｗ， Ｅｐｐ ＪＢ， Ｗａｎｇ ＢＢ， Ｄｅｌ Ｖｅｃｃｈｉｏ ＡＭ， Ｗｉｄｌａｎｓｋｉ Ｔ， Ｋａｏ ＣＣ． Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ： Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． ２０００ Ｓｅｐ １； ２７４（２）：４２９−３７

そこで、検体の検出及び特性決定法であって、エキソヌクレアーゼによるサイクリングアッセイにおけるＤＮＡポリメラーゼの基質として末端リン酸標識ヌクレオチドを利用する方法を提供できれば有益である。また、かかる方法で、ヌクレオチドの末端リン酸に酵素活性化可能標識を用いて標的核酸からの検出可能な増幅化学種を生じさせ、標識生成物又は副生物から標識出発物質を分離する必要性がなくなればさらに有益である。さらに、かかる核酸の検出及び特性決定法で、通常の実験装置を用いてヘテロポリマーの標的核酸のリアルタイムモニタリングができれば極めて望ましい。最後に、かかる方法が容易に多重化できて、反応コンパートメント当たり４種以上の検体を同時に又は逐次解析できればさらに望ましい。

本発明の一態様では、ＤＮＡに作用する３′→５′ＤＮＡエキソヌクレアーゼを、ＤＮＡポリメラーゼ、ホスファターゼ、及びプライマー又は鋳型又はプライマー−鋳型複合体を検体に固定するのに有用なアンカー部分を有するプライマー−鋳型複合体と共に用いて、標識出発物質からの標識反応生成物の分離のようなそれ以上の作業を必要とせずに、標的検体からのシグナルを増幅し検出することのできる検体の検出法を提供する。

本発明は、検体の検出法を提供する。一つの方法は、（ａ）アンカー部分を用いて鋳型核酸を標的検体に固定する段階、（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施する段階であって、該反応が、鋳型、非加水分解性プライマー、１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ及び３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素（該酵素はＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ及びその組合せから選択し得る。）の反応を含み、この反応で標識ポリリン酸を生成させる段階、（ｃ）標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて、検出可能な化学種を生成させる段階、及び（ｄ）検出可能な化学種を検出する段階を含む。

本発明の別の態様は、サンプル中の複数の検体の検出法であって、（ａ）付加される相補的ヌクレオチドの向かい側に特有の塩基を有する特定の鋳型核酸配列を各検体に固定する段階、（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施する段階であって、該反応が、鋳型、非加水分解性プライマー、異なる標識を有する２種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ及び３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素（該酵素はＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ及びその組合せから選択し得る。）の反応を含み、この反応で標識ポリリン酸を生成させる段階、（ｃ）標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて検出可能な化学種を生成させる段階、及び（ｄ）検出可能な化学種を検出する段階を含む方法に関する。この方法では、天然塩基を用いて同時に４種類の検体を検出することができる。各々独自の相補対を有する非天然塩基であって、向かい側に他の天然又は非天然塩基が誤って取込まれることが容易には起こらないものを用いることによって、さらに多重化することができる。これらの非天然塩基の例は、Ｌｅｉ Ｗａｎｇ ｅｔ．ａｌ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２０００， １２２， ５０１０−５０１１及びその引用文献に記載されており、その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。

本発明の別の態様は、反応コンパートメント中の複数の検体を解析するための代替法に関するもので、当該方法は、（ａ）各検体に、特有の鋳型核酸配列を結合する段階、（ｂ）反応コンパートメントの表面に検体を固定する段階、（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施する段階であって、該反応が、検体上の特定の鋳型配列、非加水分解性相補的プライマー、１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ及び３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素（該酵素はＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ及びその組合せから選択し得る。）の反応を含み、この反応で標識ポリリン酸を生成させる段階、（ｄ）標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて、検出可能な化学種を生成させる段階、（ｄ）検出可能な化学種を検出する段階、（ｆ）未固定成分をすべて洗浄する段階、及び（ｇ）別の検体の標的配列に相補的な異なる非加水分解性プライマーを用いて上記プロセスを繰返す段階を含む。

さらに、検体の検出法であって、（ａ）鋳型核酸を標的検体に固定する段階、（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施する段階であって、該反応が、鋳型、非加水分解性プライマー、ポリリン酸鎖に４個以上のリン酸基を有する１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ及び３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素（該酵素はＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ及びその組合せから選択し得る。）の反応を含み、この反応で標識ポリリン酸を生成させる段階、及び（ｃ）標識ポリリン酸を検出する段階を含む方法も提供する。

本発明の別の態様は、サンプル中の複数の検体の検出法であって、（ａ）付加される相補的ヌクレオチドの向かい側に特有の塩基を有する鋳型核酸を標的検体に固定する段階、（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施する段階であって、該反応が、鋳型、非加水分解性プライマー、ポリリン酸鎖に４個以上のリン酸基を有していて各々異なる標識を有する２種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ及び３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素（該酵素はＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ及びその組合せから選択し得る。）の反応を含み、この反応で標識ポリリン酸を生成させる段階、及び（ｃ）標識ポリリン酸を検出する段階を含む方法に関する。

本発明の別の態様は、反応コンパートメント中の複数の検体の検出法であって、（ａ）各標的検体に、特有の鋳型核酸を固定する段階、（ｂ）反応コンパートメント表面に検体を固定する段階、（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施する段階であって、該反応が、検体上の特定の鋳型配列、相補的な非加水分解性プライマー、ポリリン酸鎖に４個以上のリン酸基を有する１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ及び３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素（該酵素はＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ及びその組合せから選択し得る。）の反応を含み、この反応で標識ポリリン酸を生成させる段階、（ｄ）標識ポリリン酸を検出する段階、（ｅ）固定されていない成分をすべて洗浄する段階、及び（ｆ）別の検体の標的配列に相補的な非加水分解性プライマーで上記プロセスを繰返す段階を含む方法に関する。

本発明の別の態様は、検体の検出法であって、（ａ）鋳型核酸を標的検体に固定する段階、（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施する段階であって、該反応が、鋳型、非加水分解性プライマー、ポリリン酸鎖に４個以上のリン酸基を有する１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ及び３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素（該酵素はＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ及びその組合せから選択し得る。）の反応を含み、この反応で標識ポリリン酸を生成させる段階、（ｃ）標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて検出可能な化学種を生成させる段階、及び（ｄ）検出可能な化学種を検出する段階を含む方法に関する。

本発明の別の態様は、サンプル中の複数の検体の検出法であって、（ａ）各標的検体に、特有の鋳型核酸を結合させる段階、（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施する段階であって、該反応が、検体上の特定の鋳型核酸配列、非加水分解性プライマー、ポリリン酸鎖に４個以上のリン酸基を有していて各々異なる標識を有する２種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ及び３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素（該酵素はＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ及びその組合せから選択し得る。）の反応を含み、この反応で標識ポリリン酸の生成させる段階、（ｃ）標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて検出可能な化学種を生成させる段階、及び（ｄ）検出可能な化学種を検出する段階を含む方法に関する。

本発明の別の態様は、反応コンパートメント中の複数の検体の検出法であって、（ａ）各標的検体に、特有の鋳型核酸を結合させる段階、（ｂ）反応コンパートメント表面に検体を固定する段階、（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施する段階であって、該反応が、検体上の特定の鋳型配列、相補的な非加水分解性プライマー、ポリリン酸鎖に４個以上のリン酸基を有する１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ及び３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の反応を含み、この反応で標識ポリリン酸の生成させる段階、（ｄ）標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて検出可能な化学種を生成させる段階、（ｅ）検出可能な化学種を検出する段階、（ｆ）すべての未結合の成分を洗浄する段階、及び別の検体の標的配列に相補的な非加水分解性プライマーを用いて上記プロセスを繰返す段階を含む方法に関する。

本発明はさらに、検体の特性決定法を提供する。例えば、本発明は、（ａ）鋳型核酸を標的検体に結合させる段階、（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施する段階であって、該反応が、鋳型、非加水分解性プライマー、１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ及び３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素（該酵素はＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ及びその組合せから選択し得る。）の反応を含み、この反応で標識ポリリン酸を生成させる段階、（ｂ）標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて検出可能な化学種を生成させる段階、（ｃ）検出可能な化学種を検出する段階、及び（ｄ）検出結果に基づいて検体を特性決定する段階を含む方法を提供する。

本発明には、検体の特性決定法であって、（ａ）鋳型核酸を標的検体に結合させる段階、（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施する段階であって、該反応が、鋳型、非加水分解性プライマー、ポリリン酸鎖において４個以上のリン酸基を有する１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ及び３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素（該酵素はＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ及びその組合せから選択し得る。）の反応を含み、この反応で標識ポリリン酸を生成させる段階、（ｃ）標識ポリリン酸を検出する段階、及び（ｄ）検出結果に基づいて検体を特性決定する段階を含む方法も包含される。

また、検体の検出法であって、（ａ）鋳型核酸を標的検体に結合させる段階、（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施する段階であって、該反応が、鋳型、非加水分解性プライマー、ポリリン酸鎖に４個以上のリン酸基を有する１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ及び３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素（該酵素はＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ及びその組合せから選択し得る。）の反応を含み、この反応で標識ポリリン酸を生成させる段階、（ｃ）標識ポリリン酸をアルカリホスファターゼと反応させて検体に特徴的なシグナル特性を有する検出可能な化学種を生成させる段階、（ｄ）検出可能な化学種を検出する段階、及び（ｅ）シグナル特性に基づいて検体を特性決定する段階を含む方法も提供する。

上述の方法と同様の方法を、反応コンパートメント中の複数の検体の特性決定に用いることができる。上述の各態様において、検体に非加水分解プライマーを結合させること及び溶液中の鋳型を準備することも同様に実施可能である。上述の態様の好ましい実施形態では、非加水分解性プライマーと鋳型が結合して図１に示すヘアピン構造をなすが、検体結合官能基はヘアピンオリゴヌクレオチドのループ上にある。上述の各態様の最も好ましい実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施する前に、固定されていない鋳型核酸を固定材料から除去する。これは、標的検体に応じて、簡単な洗浄、沈殿、濾過を始めとする様々な方法、或いはクロマトグラフィー又は電気泳動法で達成できる。

本発明には、検体の検出用キットも包含されるが、このキットは、（ａ）１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｃ）ホスファターゼ、（ｄ）鋳型及び相補的非加水分解性プライマーであって、そのいずれかがアンカー部分を有するもの、及び（ｅ）ＤＮＡを３′→５′方向に分解するのに十分な酵素活性を有するヌクレアーゼを備える。

さらに、検体の検出用キットであって、（ａ）１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、（ｂ）ホスファターゼ、（ｃ）鋳型及び相補的非加水分解性プライマーであって、そのいずれかがアンカー部分を有するもの、及び（ｄ）ＤＮＡを３′→５′方向に分解するのに十分な酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼを備えるキットも提供される。

本発明のさらに別の態様では、検体の検出用キットであって、（ａ）１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、（ｃ）ホスファターゼ、（ｄ）アンカー部分と非加水分解性３′末端を有するヘアピン構造の鋳型−プライマーの組合せ、（ｅ）ＤＮＡを３′→５′方向に分解するのに十分な酵素活性を有するヌクレアーゼを備えるキットを提供する。

最後に、検体の検出用キットであって、（ａ）１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、（ｂ）ホスファターゼ、（ｃ）アンカー部分と非加水分解性３′末端を有するヘアピン構造の鋳型−プライマーの組合せ、及び（ｄ）ＤＮＡを３′→５′方向に分解するのに十分な酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼを備えるキットも提供する。

本明細書では、検体という用語は、特に限定されないが、生体高分子、細胞全体又は市販の重要な基質であってその分布又は同定について調べる必要のあるものを包含する。生体高分子としては、核酸、ペプチド、タンパク質、オリゴ糖、脂質、抗原などがあり、市販の重要な基質としては、特に限定されないが、有機及び無機ポリマー又はそれらから作られた生成物がある。

本明細書では、「ホスファターゼ」という用語は、末端リン酸基が標識されたヌクレオシドポリリン酸は切断できないが、ポリメラーゼによるヌクレオシド一リン酸の取込み後は、得られた色素ポリリン酸からリン酸単位を取り除くことができるアルカリ及び酸性ホスファターゼ、５′−ヌクレオチダーゼ、並びにリン酸又はポリリン酸転移酵素を包含する。

本明細書では、「ヌクレオシド」という用語は、プリン、デアザプリン又はピリミジン塩基が糖又は炭素環式もしくは非環式リンカーのような糖置換体に１′位又は等価な部位で結合した化合物であり、２′−デオキシ及び２′−ヒドロキシ、２′，３′−ジデオキシ型その他の置換体を包含する。

本明細書では、「ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシドのリン酸エステルをいい、エステル化部位は典型的には五炭糖のＣ５位についた水酸基に相当する。

「オリゴヌクレオチド」という用語には、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシドなどを始めとするヌクレオチド又はその誘導体の線状オリゴマーが包含される。本明細書全体を通して、オリゴヌクレオチドを文字の配列で示すときは、特記しない限り、ヌクレオチドは左から右に５′→３′方向の順序で示し、Ａはデオキシアデノシン、Ｃはデオキシシチジン、Ｇはデオキシグアノシン、Ｔはチミジンを表す。

「プライマー」という用語は、ユニークな鋳型核酸配列に特異的にアニールしてそのユニーク配列の増幅を可能にする線状オリゴヌクレオチドをいう。

「標的核酸配列」などの用語は、プライマーが標的とする核酸配列をいう。

「固定」又は「アンカー」という用語は、共有結合又は非共有結合的な相互作用による結合を意味する。

本発明は、サンプル中の１種以上の検体を検出・特性決定する方法に関するが、鋳型核酸又は非加水分解性プライマー又はこれらのＤＮＡヘアピン構造の形態の組合せの結合によって検体を標識し、簡便なアッセイを用いて、非加水分解性プライマーの３′末端への標的核酸の特定の塩基に相補的な末端リン酸標識ヌクレオチドの付加と、その後のヌクレアーゼ分解をモニターする。ＤＮＡポリメラーゼは、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）から伸長オリゴヌクレオチド鎖の３′ヒドロキシルへのヌクレオシド一リン酸の移動を介して、オリゴヌクレオチドを合成する。

この反応の駆動力は、無水結合の切断と無機ピロリン酸の同時形成である。本発明では、ヌクレオチドの末端リン酸を構造的に修飾しても、ポリメラーゼ反応で機能するその能力はなくならないという知見を利用する。このオリゴヌクレオチド合成反応で直接変化するのはヌクレオチドのα及びβホスホリル基のみであり、そのため末端リン酸位が修飾されたヌクレオチドは核酸ポリメラーゼ反応の基質として有用となる。

本発明の提供する方法では、末端リン酸に電気化学的標識、質量タグ又は発色性、化学発光性もしくは蛍光性色素標識が結合したデオキシヌクレオシドポリリン酸又はジデオキシヌクレオシドポリリン酸アナログのようなヌクレオシドポリリン酸アナログを利用する。このアナログを核酸ポリメラーゼが基質として利用すると、リン酸基転移の無機ポリリン酸副生物に酵素活性化可能標識が存在する。ホスファターゼによるリン酸基転移のポリリン酸生成物の切断によって、リン酸に結合した標識に検出可能な変化が生じる。例えば、３−シアノウンベリフェロン色素がそのヒドロキシル基を介してヌクレオチドの末端リン酸位に結合している場合、この色素は４０８ｎｍで励起しても蛍光発光せず、アルカリホスファターゼの基質でもない。このヌクレオチドがＤＮＡにいったん取込まれれば、遊離した色素無機ポリリン酸（これも４０８ｎｍで励起しても蛍光性でない。）は、アルカリホスファターゼの基質である。いったん脱リン酸化されれば、色素は４０８ｎｍで励起すれば蛍光を発し、検出可能である。ポリリン酸生成物の特異的な分析を、ポリメラーゼ及びエキソヌクレアーゼ反応と同じ反応溶液中で実施することができ、出発物質から反応生成物を分離する必要はない。そのため、蛍光定量又は分光光度計のような通常の装置を用いて、ポリメラーゼ反応で形成された核酸の検出と適宜定量、また核酸が検体に結合していれば検体の検出及び適宜定量が可能となる。

なお、ＲＮＡ及びＤＮＡポリメラーゼは、末端リン酸基が修飾されたヌクレオチドを認識できるが、本発明者らは、この出発材料がホスファターゼの基質ではないという知見を得た。以下のスキームに、本発明の方法に関連する分子、すなわち、末端リン酸標識ヌクレオチド、標識ポリリン酸副生物及び酵素活性化標識を示す。

上記スキームにおいて、ｎは１以上であり、Ｒ_１及びＲ_２は独立にＨ、ＳＨ、ＳＲ、Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、Ｎ_３、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＯＲ又はＯＨであり、Ｂは天然又は修飾ヌクレオシド塩基であり、ＸはＯ、Ｓ又はＮＨであり、ＹはＯ、Ｓ又はＢＨ_３であり、Ｌはホスファターゼで活性化可能な標識であって、発色性、蛍光発生性又は化学発光分子、質量タグ又は電気化学的に検出可能な部分とし得る。質量タグは、質量の差によって他の反応生成物から容易に識別できる質量分析法に適した低分子量部分である。電気化学的タグは、容易に酸化又は還元できる種である。ｎが２以上の場合、ヌクレオチドは、ｎが１のときよりもポリメラーゼの基質として格段に優れていることが判明した。従って、本発明の好ましい実施形態では、ｎは２、３又は４である。本発明のさらに好ましい実施形態では、Ｘ及びＹはＯであり、Ｒ_１及びＲ_２は独立にＨ又はＯＨであり、Ｂはヌクレオシド塩基であり、Ｌは標識であって、発色性、蛍光発生性又は化学発光分子とし得る。

本発明で提供する検体の検出法の一実施形態では、検体に鋳型核酸を固定する段階、ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施する段階であって、該反応が、鋳型、非加水分解性プライマー、１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ及び３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素（該酵素はＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ及びその組合せから選択し得る。）の反応を含み、末端リン酸標識ヌクレオチドが鋳型に相補的である場合にはこの反応で標識ポリリン酸が生じる段階、標識ポリリン酸をアルカリホスファターゼのようなホスファターゼと反応させて検出可能な化学種を生成させる段階、及び検出可能な化学種を検出する段階を含む。

本発明で提供する分析サンプルの特性決定法では、検出可能な化学種の有無によって標的検体の特性を決定することができる。さらに、検出可能な化学種は、それに付随して特徴的な染色特性又はシグナル特性を有していてもよく、その特性はサンプルに特有である。こうして、検出可能な化学種に特有の特性に基づく標的検体の特性決定が可能となる。

図１は、上述の各方法で用いられる一般的スキームを示す。このスキームにおいて、ｎは１以上であり、Ｒ_１及びＲ_２は独立にＨ、ＯＨ、ＳＨ、ＳＲ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ_３、ＮＨ_２、ＮＨＲ又はＯＲであり、Ｇはグアニンつまり天然又は修飾ヌクレオシド塩基の代表例であり、Ｃはシトシンつまり付加されるヌクレオチドに相補的な塩基の代表例であり、ＹはＯ、Ｓ又はＢＨ_３であり、Ｌは発色性、蛍光発生性、化学発光もしくは電気化学的標識又は質量タグであり、好ましくはリン酸基が除去されたときに独立に検出可能となるものである。図１に示す通り、非加水分解性ではあるが伸長可能な３′末端を有するＤＮＡヘアピン構造を検体に結合させる。未結合ＤＮＡヘアピンを分離した後、ヘアピンに固定された検体と１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチドの存在下で、末端リン酸標識ヌクレオチドに由来するヌクレオシド一リン酸がヌクレアーゼ耐性ＤＮＡヘアピンの３′末端に結合するような条件下でＤＮＡポリメラーゼ反応を実施する。これは標識生成物の同時形成を伴うが、この標識生成物は独立に検出できなくてもよい。ヌクレオチド種の取込みと同時に形成される標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて独立に検出可能な化学種を生じさせ、これが標的ポリヌクレオチドからのシグナルとして機能する。プライマーの３′末端への相補的ヌクレオチド種の付加に続いて、３′→５′エキソヌクレアーゼ（これはＤＮＡポリメラーゼ自体に付随するものでもよい。）の反応によってこれを分解させる。相補鎖の合成と分解（これはヌクレオチド種に本質的である）を２回以上繰返して、サイクリングアッセイを実施する。

上述の方法で、ポリメラーゼ反応をアルカリホスファターゼのようなホスファターゼ又はリン酸転移酵素の存在下で実施してもよく、これらは標識ポリリン酸生成物を検出可能な標識に変換する。こうして、検出可能な化学種の形成を連続的リアルタイムにモニターできる核酸の検出及び特性決定のための簡便なアッセイ法が確立される。この方法は、ＤＮＡ鋳型又はプライマー又は鋳型プライマーヘアピン複合体を予め固定しておいた検体を用いて単一の試験管で実施できる均一系アッセイフォーマットである。

なお、末端リン酸標識ヌクレオチドがポリリン酸鎖に４個以上のリン酸を有する実施形態では、ホスファターゼ処理を用いなくてもリン酸基転移の標識ポリリン酸副生物を検出できることは、本発明で想定される範囲内である。例えば、天然又は修飾ヌクレオシド塩基、特にグアニンは、蛍光マーカーの消光を起こし得ることが知られている。従って、末端リン酸標識ヌクレオチドでは、標識を塩基によって部分的に消光することができる。ヌクレオシド一リン酸の取込みの際に、標識ポリリン酸副生物をその蛍光の増強によって検出し得る。別法として、蛍光、色、化学発光又は電気化学的検出による同定の前にクロマトグラフィー分離法で標識ポリリン酸生成物を物理的に分離することもできる。また、質量分析法を用いれば、質量の差によって生成物を検出することもできる。

検出可能な化学種は標的検体の量に実質的に比例した量で生成してもよく、それ自体で標的検体の量のシグナルとなる。本明細書に開示した方法は、反応で生じた検出可能な化学種の量に基づいて標的検体を定量する段階をさらに含んでいてもよい。標的検体の定量段階は、望ましくは、既知量の標的を用いて検出可能な化学種で得られたスペクトルを対比することによって行われる。

本発明では、オリゴヌクレオチドプライマーはいったんハイブリダイズすれば、鋳型ヌクレオチド配列に対して少なくとも等モル量で反応が定量的に進行するように繰返し機能させることができる。別々に用いる場合、本発明の方法に有用なオリゴヌクレオチド鋳型とプライマーとの比は、好ましいハイブリダイゼーションを達成するのに十分なものとすべきである。一般に、存在する鋳型プライマー比１、望ましくは一方が他方の５倍過剰によって、鋭敏なアッセイを達成できる。

本発明で提供する方法は、ＤＮＡポリメラーゼ反応に１種以上の追加の検出試薬を配合する段階をさらに含んでいてもよい。追加の検出試薬は、検出可能な化学種とは検出性の異なる応答ができるものであればよい。例えば、追加の検出試薬は抗体であってもよい。

本発明の標的検体としては、特に限定されないが、核酸、ペプチド、タンパク質、抗原、脂質、複合糖質などの生体高分子、細胞全体、並びに合成ポリマー及び／又は基質が挙げられる。

本発明の方法及びキットに有用な末端−リン酸−標識ヌクレオチドは、式Ｉで表すことができる。

式中、Ｐはリン酸（ＰＯ_３）及びその誘導体であり、ｎは２以上であり、Ｙは酸素又はイオウ原子であり、Ｂは含窒素複素環式塩基であり、Ｓは非環式部分、炭素環式部分又は糖部分であり、Ｌは、天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸でのリン酸エステル、チオエステル又はホスホルアミデート結合の形成に適したヒドロキシル基、スルフヒドリル基又はアミノ基を含有する酵素活性化可能標識であり、Ｐ−Ｌはリン酸化標識であって、好ましくはリン酸が取り除かれたときに独立に検出可能となるリン酸化標識である。

本発明の方法に有用な炭素環式部分は、Ｆｅｒｒａｒｏ，Ｍ．及びＧｏｔｏｒ，Ｖ．， Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ． ２０００， ｖｏｌ．１００， ４３１９−４８に記載されている。適当な糖部分は、Ｊｏｅｎｇ，Ｌ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９３， ｖｏｌ．３５６， ２６２７−３８、Ｋｉｍ，Ｈ．Ｏ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９３， ｖｏｌ．３６， ３０−７並びにＥｓｃｈｅｎｍｏｓｓｅｒ，Ａ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９， ｖｏｌ．２８４，２１１８−２１２４に記載されている。また、有用な非環式部分は、Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｃ．Ｉ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９９， ｖｏｌ．２７， １２７１−１２７４、Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｃ．Ｉ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９９７， ｖｏｌ．７， ３０１３−３０１６並びにＴｒａｉｎｅｒ，Ｇ．Ｌ．の米国特許第５５５８９１号に記載されている。これらの部分の構造を以下に示すが、すべての部分についてＲはＨ、ＯＨ、ＮＨＲ、低級アルキル及びアリールであり、糖部分についてはＸ及びＹは独立にＯ、Ｓ又はＮＨであり、非環式部分についてはＸ＝Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＮＲである。

ある実施形態では、糖部分は、リボシル、２′−デオキシリボシル、３′−デオキシリボシル、２′，３′−ジデオキシリボシル、２′，３′−ジデヒドロジデオキシリボシル、２′−アルコキシリボシル、２′−アジドリボシル、２′−アミノリボシル、２′−フルオロリボシル、２′−メルカプトリボキシル、２′−アルキルチオリボシル、炭素環式、非環式及び他の修飾糖から選択し得る。

また、上記の式Ｉにおいて、塩基としては、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニン、７−デアザグアニン、ヒポキサンチン、７−デアザヒポキサンチン、アデニン、７−デアザアデニン、２，６−ジアミノプリン又はそのアナログが挙げられる。

ヌクレオチドの末端リン酸位に結合した酵素活性化可能な標識は、１，２−ジオキセタン化学発光化合物、蛍光発生色素、発色色素、質量タグ、電気化学的タグ又はこれらの組合せから選択し得る。こうして、色、蛍光発光、化学発光又はこれらの組合せのいずれかの存在によって、検出可能な化学種を検出することができる。

酵素活性化可能標識は、検出可能シグナルを生じる追加の化学反応又は酵素反応の基質となる化学基であってもよい。

上記の式Ｉに示すリン酸化標識が蛍光発生部分である場合、望ましくは、以下の具体例（リン酸エステルとして示す。）のいずれかから選択される：ＥＬＦ９７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）という商品名で市販されている２−（５′−クロロ−２′−ホスホリルオキシフェニル）−６−クロロ−４−（３Ｈ）−キナゾリノン、フルオレセイン二リン酸、フルオレセイン３′（６′）−Ｏ−アルキル−６′（３′）−リン酸、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）リン酸、４−メチルウンベリフェリルリン酸、レゾルフィンリン酸、４−トリフルオロメチルウンベリフェリルリン酸、ウンベリフェリルリン酸、３−シアノウンベリフェリルリン酸、９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イルリン酸、及び６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルリン酸。これらの色素の構造を以下に示す。

式中、上記の式Ｉに示すリン酸化された標識が発色団である場合、以下の部分（リン酸エステルとして示す。）から選択し得る：５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸、３−インドリルリン酸、ｐ−ニトロフェニルリン酸及びこれらの誘導体。これらの発色色素の構造は以下に示す。

末端リン酸位の部分は化学発光化合物であってもよく、この場合、アルカリホスファターゼ活性化１，２−ジオキセタン化合物であるのが望ましい。１，２−ジオキセタン化合物のリン酸エステルとしては、特に限定されないが、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（Ｔｒｏｐｉｘ社（米国マサチューセッツ州ベッドフォード））という商品名で市販されている二ナトリウム２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′−（５−クロロ−）トリシクロ［３，３，１−１^３，７］−デカン］−１−イル）−１−フェニルリン酸、ＣＳＰＤ（Ｔｒｏｐｉｘ）という商品名で市販されているクロロアダマンタ−２′−イリデンメトキシフェノキシリン酸化ジオキセタン、及びＡＭＰＰＤ（Ｔｒｏｐｉｘ）という商品名で市販されている３−（２′−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３″−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタンが挙げられる。これらの市販のジオキセタン化合物の構造は、それぞれ米国特許第５５８２９８０号、同第５１１２９６０号及び同第４９７８６１４号に開示されており、以下に示す通りである。

本発明の方法では、非加水分解性プライマーは、系に存在する３′→５′エキソヌクレアーゼによるその分解が起こらないようにヌクレアーゼ耐性とすべきである。

上述の通り、３′→５′エキソヌクレアーゼ活性は、ＤＮＡポリメラーゼ自体に付随するものでもよい。本発明で用いるのに適当なＤＮＡポリメラーゼとしては、特に限定されないが、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ａｍｐｌｉｔａｑ ＦＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、逆転写酵素及びＴ７ ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。

ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドプライマーの合成法は特に限定されず、当技術分野で公知の適当な方法を使用すればよい。例えば、本発明の一実施形態では、非加水分解性プライマーは最も３′側のホスホジエステル末端結合でホスホロチオエート化する。プライマーの標的部位にホスホロチオエート結合を導入することによってヌクレアーゼ耐性をもつオリゴヌクレオチドプライマーを化学合成する方法は周知である。一つの方法では、プライマーはホスホルアミダイト法の変法で化学合成し得るが、この方法ではヨウ素水による通常の酸化段階をホスホロチオエート化に適した試薬での酸化処理で置き換えて通常のホスホジエステル結合の代わりにホスホロチオエート結合を導入する。ホスホロチオエート化に適した一つの試薬はＢｅａｕｃａｇｅ試薬（３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキサン）である。この方法を用いれば、最も３′側のホスホジエステル結合を始めとする所定の部位でホスホロチオエート結合をプライマーに導入することができる。

解析の前の時点でホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドプライマーを調製する別の手段は、酸素原子がα位でイオウに置換されるヌクレオチドアナログのＤＮＡポリメラーゼ取込みを介する。かかる置換化合物は、α−Ｓ−デオキシヌクレオシド三リン酸と呼ばれる。ＤＮＡポリメラーゼは、デオキシヌクレオシド三リン酸に代わってイオウ置換アナログを取込んで、ヌクレアーゼ耐性を有するホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドプライマーを得ることができる。

いずれにしても、オリゴヌクレオチドプライマーの３′−末端の近傍にホスホジエステルの代わりにホスホロチオエート結合が存在すると、３′−末端側からのエキソヌクレアーゼの切断に対する耐性をプライマー部分に与える。単一のホスホロチオエート結合の導入だけで、オリゴヌクレオチドプライマーは十分に非加水分解性となる。

他の物質にオリゴヌクレオチドを固定する方法は当技術分野で周知であって、ビオチン−ストレプトアビジン結合のような非共有結合、及び官能化オリゴヌクレオチド（例えば、アミン官能化オリゴヌクレオチド）と活性化酸、アルデヒド、エポキシドなどとの反応、又はチオール修飾ヌクレオチドと活性化ハロアセトアミドとの反応又はその逆反応などで得られる共有結合がある。

緩衝液、ｐＨ及び温度などの反応条件は、十分なハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ及びホスファターゼ活性が達成されるように選択すべきである。ハイブリダイゼーションに適した温度はオリゴヌクレオチドプライマーと標的配列との相同性に依存するが、約２０〜約６０℃の範囲にあると予測される。ｐＨ値はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液又はＨＥＰＥＳのような適当な緩衝液中で約７〜９の範囲であるのが望ましい。

本発明は、上述の鋳型核酸又はプライマー又は両者の組合せを検体に固定した後、１種以上の末端リン酸標識デオキシヌクレオシドポリリン酸、固定した検体に存在していなければ相補的オリゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレアーゼ（ポリメラーゼに付随したものでもよい。）及びホスファターゼを系に添加して、プライマーの３′末端の隣に位置し標的核酸に相補的なヌクレオチドを取込ませ、次いでこれを分解して標的検体からのシグナルとして機能する検出可能な化学種を検出し、相補鎖の合成と分解を１回以上繰返してシグナルの増幅のためのサイクリングアッセイを行うことを特徴とする。

ポリメラーゼと一本鎖ヌクレアーゼ（ポリメラーゼに固有の特性であっても、別の酵素であってもよい。）を用いて増幅反応を行うことができることも本発明で想定する範囲内である。反応をサーマルサイクリングすると、低温時のポリメラーゼによるプライマーの伸長と、高温時のヌクレアーゼによる付加塩基の除去が可能となる。こうすると、増幅量はサーマルサイクリングの実施回数に依存するので、ユーザーは増幅の量を制御することができる。

以下の実施例で幾つかの好ましい実施形態を例示するが、あらゆる実施形態を例示するものではない。

実施例１
γ（７−ヒドロキシ−３Ｈ−フェノキサジン−３−オン）ｄｄＧＴＰ（γ−レゾルフィン−ｄｄＧＴＰ）の調製
ｄｄＧＴＰ（１２５μｌの８６．７ｍＭ溶液、１０．８μｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（３×０．２５ｍｌ）と同時エバポレートした。ここにＤＣＣ（５当量）を添加して、混合物を再度無水ＤＭＦ（０．２５ｍｌ）とともに同時エバポレートした。残滓を無水ＤＭＦ（１ｍｌ）にとって、その反応物を週末にわたって室温で撹拌した。レゾルフィン（２０当量）を無水ＤＭＦ（２×１ｍｌ）とともに同時エバポレートして、上記の環化段階からｄｄＧＴＰトリメタリン酸を添加して、次いで２０当量のトリエチルアミンを添加した。２週間後、反応混合物をロータリーエバポレーターで濃縮して、その残滓を水（３×２ｍｌ）で抽出して濾過した。その濾液を、５カラム容積の０．１Ｍトリエチルアンモニウム重炭酸塩（ｐＨ６．７）に含まれる０〜３０％のアセトニトリル、及び１カラム容積の３０〜５０％のアセトニトリルを用いて、Ｘｔｅｒｒａ ＲＰ Ｃ１８（１９×１００ｍｍ）カラムで精製した。純粋な画分をロータリーエバポレーターで濃縮して、メタノール（２×５ｍｌ）と同時エバポレートさせた。その残滓を水（１．５ｍｌ）に溶解して、０．５ｍＭ溶液を得た。ＨＰＬＣ純度は、２６０ｎｍで９８％を超え、４７０ｎｍで９７．５％を超えていた。ＵＶ／ＶＩＳ＝２５１及び４７２ｎｍ。ＭＳ：Ｍ−１＝６８５．１０（計算値、６８５．０３）。

実施例２
γ−（３−シアノクマリニル）ｄｄＡＴＰ（γＣＮクマリン−ｄｄＡＴＰ）の調製
ｄｄＴＡＰ（１００μｌの８９ｍＭ溶液，＞９６％）を無水ＤＭＦ（２×１ｍｌ）とともに同時エバポレートした。ここにＤＣＣ（９．２ｍｇ、５当量）を添加して、混合物を再度無水ＤＭＦ（１ｍｌ）とともに同時エバポレートした。残滓を無水ＤＭＦ（０．５ｍｌ）にとって、その反応物を室温で撹拌した。一晩後に、７−ヒドロキシ−３−シアノクマリン（３３．３ｍｇ、２０当量）及びＴＥＡ（２５μｌ、２０当量）を添加して混合物を室温で撹拌した。１日後、ＨＰＬＣ解析によって、８．１分で主な生成物（２５４ｎｍで５５％）とともに１０分で別のわずかな生成物（約１０％）が示された。もう１日後には有意な変化は生じなかった。反応混合物をロータリーエバポレーターで濃縮して残滓を３×２ｍｌの水で抽出して濾過した。水溶液を濃縮して、０〜３０％アセトニトリル含有０．１ＭＴＥＡＢ（ｐＨ６．７）を３０分で、３０〜５０％アセトニトリルを１０分で、流速１５ｍｌ／分で用いてＣ１８で精製した。主なピークを３つの画分に収集した。主なピーク（画分２）のＨＰＬＣは、２５４ｎｍで９５．６％の純度を、３３５ｎｍで９８．１％の純度を示した。これをロータリーエバポレーター（室温で）濃縮して、ＭｅＯＨ（２×）及び水（１×）とともに同時エバポレートした。残滓を０．５ｍｌの水に溶解した。ＵＶ解析用に５μｌのサンプルを１ｍｌに希釈した。Ａ３４６ｎｍ＝０．７８４。推定吸光係数２０，０００（７−エトキシ−３−シアノクマリン，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｃａｔａｌｏｇ）、濃度＝７．８４ｍＭ、収量＝３．９２μｍｏｌ、４４％。サンプルを上記と同じ方法を用いてＣ１８カラム上で精製した。サンプルピークを３つの画分に収集した。画分２及び３を合わせたところ、２５４ｎｍで９８％を超え、３４０ｎｍで９９．５％を超える純度であった。濃縮後、残滓をＭｅＯＨ（２×）及び水（１×）とともに同時エバポレートした。サンプルを水（１ｍｌ）に溶解して、２．７７ｍＭの溶液を得た。ＭＳ：Ｍ⁻＝６４２．９８ａｕ（計算値、６４３．００ａｕ）、ＵＶλ_Ａ＝２６３ｎｍ及び３４６ｎｍ。ｄｄＡＴＰのγリン酸に結合したシアノクマリン色素は、蛍光性であって３４６ｎｍの最大励起及び約４１１ｎｍの最大発光を有する。遊離のクマリン色素を放出するリン酸エステルの加水分解の際、スペクトルは、約４０８ｎｍの最大励起及び約４５０ｎｍの最大発光で変化する。この変化は単純な蛍光測定又は色調変化によって容易に検出される。γヌクレオチドの合成は、一般に、Ａｒｚｕｍａｎｏｖ，Ａら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９９６）Ｏｃｔ ４；２７１（４０）：２４３８９〜９４によって記載されている。

実施例３
δ−９Ｈ（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）ジデオキシチミジン−５′−テトラホスフェート（ｄｄＴ４Ｐ−ＤＤＡＯ）の調製
ｄｄＴＴＰ（１００μｌの８０ｍＭ溶液）を無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ，２×１ｍｌ）とともに同時エバポレートした。ここにジシクロヘキシルカルボジイミド（８．３ｍｇ、５当量）を添加して、その混合物を再度無水ＤＭＦ（１ｍｌ）とともに同時エバポレートした。残滓を無水ＤＭＦ（１ｍｌ）にとって、反応物を室温で一晩撹拌した。ＨＰＬＣによってほとんど環化された三リン酸（約８２％）が示された。反応混合物を濃縮して、残滓を無水ジエチルエーテル３×で洗浄した。これを無水ＤＭＦに再度溶解して、ロータリーエバポレーターで乾燥するまで濃縮した。残滓をＤＤＡＯ一リン酸、アンモニウム塩（５ｍｇ、１．５当量）を含む２００μｌ無水ＤＭＦと一緒に、週末にかけて４０℃で撹拌した。ＨＰＬＣによって１１．９６分で所望のＵＶ特徴を有する新規な生成物の形成が示された。（ＨＰＬＣ法：０．３０％アセトニトリル含有０．１Ｍトリエチルアンモニウム酢酸（ｐＨ７）で１５分、３０〜５０％のアセトニトリルで５分、Ｎｏｖａｐａｋ Ｃ−１８ ３．９×１５０ｍｍカラム、１ｍｌ／分）。ＬＣＭＳ（ＥＳ−）はまた、Ｍ−１ピークについて主な質量ピーク８３４を示した。反応混合物を濃縮して、０．１Ｍ ＴＥＡＢ（ｐＨ６．７）及びアセトニトリルを用いてＤｅｌｔａｐａｋ Ｃ１８，１９×３００ｍｍカラムで精製した。生成物を含む画分を、上記と同じ方法を用いてＨＰＬＣによって再度精製した。純粋な生成物を含む画分を濃縮して、ＭｅＯＨ（２×）及び水（１×）とともに同時エバポレートさせた。残滓を水（１．２ｍｌ）に溶解して、１．２３ｍＭ溶液を得た。ＨＰＬＣ純度は、２５４ｎｍで９７．５％を超え、４５５ｎｍで９６％を超えた；ＵＶλ_Ａ＝２６７ｎｍ及び４５５ｎｍ；ＭＳ：Ｍ−１＝８３４．０４（計算値８．３３．９５）。

δ−９Ｈ（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７＝イル）−ジデオキシシチジン−５′−テトラホスフェート（ｄｄＣ４Ｐ−ＤＤＡＯ）、δ−９Ｈ（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−ジデオキシアデノシン−５′−テトラホスフェート（ｄｄＡ４Ｐ−ＤＤＡＯ）及びδ−９Ｈ（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−ｙ−ＹＬ）−ジデオキシグアノシン−５′−テトラホスフェート（ｄｄＧ４Ｐ−ＤＤＡＯ）を、合成して、同様の方式で精製した。これらの精製された化合物の解析によって、以下のデータが得られた：ｄｄＣ４Ｐ−ＤＤＡＯ：ＵＶλ_Ａ＝２６８ｎｍ及び４５４ｎｍ；ＭＳ：Ｍ−１＝８１９．３２（計算値８１８．９６）；ｄｄＡ４Ｐ−ＤＤＡＯ：ＵＶλ_Ａ＝２６３ｎｍ及び４５７ｎｍ；ＭＳ：Ｍ−１＝８４３．３０（計算値８４２．９７）；ｄｄＧ４Ｐ−ＤＤＡＯ：ＵＶλ_Ａ＝２５７ｎｍ及び４５７ｎｍ；ＭＳ：Ｍ−１＝８５９．４０（計算値８５８．９７）。

実施例４
ε−９Ｈ（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）−ジデオキシチミジン−５′ペンタホスフェートＤＤＡＯ−ｄｄＴ−ペンタホスフェート（ｄｄＴ５Ｐ−ＤＤＡＯ）の調製
Ａ．ＤＤＡＯピロリン酸の調製
ＤＤＡＯ−リン酸二アンモニウム塩（１１．８μｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（３×０．２５ｍｌ）とともに同時エバポレートして、ＤＭＦ（０．５ｍｌ）に溶解した。ここにカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ，９．６ｍｇ、５当量）を添加して、その混合物を室温で一晩撹拌した。過剰なＣＤＩをＭｅＯＨ（５μｌ）の添加によって破壊して、３０分間撹拌した。この混合物にトリブチルリン酸二水素アンモニウム（１０当量、２３６ｍｌの０．５Ｍ溶液含有ＤＭＦ）を添加して、この混合物を室温で４日間撹拌した。反応混合物をロータリーエバポレーターで濃縮させた。残滓を、緩衝液Ａとして０．１Ｍ ＴＥＡＢ／アセトニトリル（３：１）、緩衝液Ｂとして１Ｍ ＴＥＡＢ／アセトニトリル（３：１）を用い０〜１００％Ｂを用いるＨｉＰｒｅｐ １６．１０ Ｑ ＸＬカラムで精製した。主なピーク（ＨＰＬＣ純度９８％）を収集して、濃縮して、メタノール（２×）とともに同時エバポレートした。残滓を１ｍｌの水に溶解して、５．９ｍＭ溶液を得た。ＵＶ／ＶＩＳ λ_ｍａｘ＝４５６ｎｍ。

Ｂ．ｄｄＴ５Ｐ−ＤＤＡＯの調製
ｄｄＴＴＰ（１００μｌの４７．５ｍＭ溶液を含有する水）を無水ＤＭＦ（２×１ｍｌ）とともに同時エバポレートした。ここにＤＣＣ（５当量、４．９ｍｇ）を添加して、混合物をＤＭＦ（１×１ｍｌ）とともに同時エバポレートした。残滓を無水ＤＭＦ（０．５ｍｌ）にとって、室温で３時間撹拌した。ここに、無水ＤＭＦ（２×１ｍｌ）と別々に同時エバポレートした１．０３当量のＤＤＡＯピロリン酸をＤＭＦ溶液として加えた。混合物を乾燥するまで濃縮して、ついで２００μｌの無水ＤＭＦにとった。混合物を３８℃で２日間加熱した。反応混合物を濃縮して、水で希釈して、濾過して、２段階勾配を用いる０〜１００％のＡ−Ｂを用いて、ＨｉＴｒａｐ ５ｍｌイオン交換カラムで精製した。溶媒Ａ＝０．１Ｍ ＴＥＡＢ／アセトニトリル（３：１）、溶媒Ｂ＝１Ｍ ＴＥＡＢ／アセトニトリル（３：１）。ほとんどの生成物を含んだ画分１２及び１３を合わせて、濃縮して、メタノール（２×）とともに同時エバポレートした。残滓を０．３０％アセトニトリル含有０．１Ｍ ＴＥＡＢを５カラム容積で、３０〜５０％のアセトニトリルを２カラム容積、流速１０ｍｌ分で用いて、Ｘｔｅｒｒａ ＲＰ Ｃ−１８ ３０−１００ｍｍカラムで再精製した。純粋な生成物を含む画分を濃縮して、メタノール（２×）及び水（１×）とともに同時エバポレートさせた。ＨＰＬＣ純度は４５５ｎｍで９９％を越えた。ＵＶ／ＶＩＳ＝２６８ｎｍ及び４５５ｎｍである。ＭＳ：Ｍ−１＝９１４．０３（計算値９１３．９３）。

これらのポリリン酸のγリン酸に結合したＤＤＡＯ色素は蛍光性であって、４５５ｎｍの最大励起及び約６０８ｎｍの最大発光を有する。遊離の色素を放出するリン酸エステルの加水分解の際、スペクトルは、約６４５ｎｍの最大励起及び約６５９ｎｍの最大発光で変化する。この変化は単純な蛍光測定又は色調変化によって容易に検出される。

実施例５
δ−９Ｈ（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）−デオキシチミジン−５′−四リン酸（ｄＴ４Ｐ−ＤＤＡＯ）の調製
１０μｍｏｌのＴＴＰ ＴＥＡ塩を乾燥するまでエバポレートさせた。この残滓に４０μｍｏｌトリブチルアミン及び５ｍｌ乾燥ピリミジンを添加した。この溶液を乾燥するまで再度エバポレートさせた。３ｍｌの乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いた２回の同時エバポレーション後、残滓を２００μｌの乾燥ＤＭＦに再溶解して、アルゴンでフラッシュして、栓でふさいだ。シリンジを用いて、１００μｌの乾燥ＤＭＦに溶解した５０μｍｏｌ（８ｍｇ）カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を添加した。フラスコを環境温度で４時間撹拌した。

上記の反応をすすめながら、３５ｍｇ（８３μｍｏｌ）ＤＤＡＯリン酸及び１６６μｍｏｌのトリブチルアミンを乾燥ＤＭＦに溶解した。ＤＤＡＯリン酸を乾燥するまでエバポレートさせて、次いで乾燥ＤＭＦを用いて３回同時エバポレートさせた。残滓を３００μｌの乾燥ＤＭＦに溶解した。

４時間の反応後、３．２μｌ無水メタノールをＴＴＰ−ＣＤＩ反応に添加した。この反応物を３０分撹拌した。この混合物に、ＤＤＡＯリン酸溶液を添加して、混合物を１８時間環境温度で撹拌した。この反応を逆相ＨＰＬＣによってチェックした（Ｘｔｅｒｒａ ４．６×１００カラム、０．１Ｍ ＴＥＡＡ／アセトニトリル）。この反応容積をエバポレーションによって２００μｌまで低下させ、この反応を８０時間進行させた。

８０時間後、１５ｍｌ ０．１Ｍ ＴＥＡＢを添加することによって、この反応を停止させた。この希釈された混合物を１９×１００ Ｘｔｅｒｒａ ＲＰカラムに加えて、アセトニトリル勾配を有する０．１Ｍ ＴＥＡＢを用いて溶出させた。純粋なＴ４Ｐ−ＤＤＡＯを含む画分を乾燥するまでエバポレートさせて、エタノールとともに２回、同時エバポレートさせた。この残滓をＭｉｌｌｉＱ水で再構成した。収率：１．１０μｍｏｌ，１１％；ＨＰＬＣ純度は４５５ｎｍで９８％を超える；ＭＳ：Ｍ−１＝８５０．０７（計算値８４９．９５）。

δ−９Ｈ（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）−デオキシグアノシン−５′−四リン酸（ｄＧ４Ｐ−ＤＤＡＯ），δ−９Ｈ（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）−デオキシシチジン−５′−四酢酸（ｄＣ４Ｐ−ＤＤＡＯ）及びδ−９Ｈ（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）−デオキシアデノシン−５′−四リン酸（ｄＡ４Ｐ−ＤＤＡＯ）を、３．５当量のＤＤＡＯリン酸を８．３当量の代わりに用いること以外は、上記と同様の方式で調製した。Ｃ１８精製の後に、Ｍｏｎｏ Ｑ １０／１０カラムを用いるイオン交換においてサンプルを精製した。

δ−９Ｈ（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）−デオキシグアノシン−５′−四酢酸（ｄＧ４Ｐ−ＤＤＡＯ）：収率０．５７μｍｏｌ，５．７％；ＨＰＬＣ純度は４５５ｎｍで９９％；ＭＳ：Ｍ−１＝８７５．０３（計算値８７４．９６）。

δ−９Ｈ（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）−デオキシシチジン−５′−四リン酸（ｄＧ４Ｐ−ＤＤＡＯ）：収率０．２４μｍｏｌ，２．４％；ＨＰＬＣ純度は４５５ｎｍで９９％；ＭＳ：Ｍ−１＝８３５．０３（計算値８３４．９５）。

δ−９Ｈ（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）−デオキシアデノシン−５′−四リン酸（ｄＡ４Ｐ−ＤＤＡＯ）：収率０．３８μｍｏｌ，３．８％；ＨＰＬＣ純度は４５５ｎｍで９９％；ＭＳ：Ｍ−１＝８５９．０７（計算値８５８．９７）。

実施例６
蛍光発生的な色素を有する末端リン酸上の標識ヌクレオチドの取込みによって生成されたシグナルを増幅するためのエキソヌクレアーゼＩＩＩの使用
２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．５ｍＭ ＭｎＳＯ_４、４０ｐｍｏｌ ｄｄＴ４Ｐ−ＤＤＡＯ（ＤＤＡＯ−δ−２′，３′−ジデオキシチミジン−５′−四リン酸）、５ｐｍｏｌプライマー（５′ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴ＊Ａ３′（配列番号１）ここで＊はホスホロチオエート結合である）及び１０ｐｍｏｌの鋳型（５′ＧＴＣＧＴＴＡＴＡＣＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＣＴＧＧＧＡＡＡＡ＊ｄｄＣ３′（配列番号２）ここで＊はホスホロチオエート結合であり、ｄｄＣは、末端ジデオキシヌクレオチドを示す）を含む５０μｌの反応物を、４分間７５°に加熱及び２１°に冷却することによってアニーリングさせた。ここで図２を参照して、この反応物へ、以下を添加した：０．１５単位のシュリンプアルカリホスファターゼ及び０．５単位のエキソヌクレアーゼＩＩＩ（四角）又は０．１５単位のシュリンプアルカリホスファターゼ、０．５単位のエキソヌクレアーゼＩＩＩ、及び１６単位のＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（丸）。第三の反応混合物に、０．１５単位のシュリンプアルカリホスファターゼ及び１６単位のＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅを添加し、次いで１０分後、０．５単位のエキソヌクレアーゼＩＩＩを添加した（三角）。６１２ｎｍの励起及び６７０ｎｍの発光による時間駆動式の方式で操作されるＬＳ−５５発光分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）中で石英の蛍光ウルトラマイクロキュベット中において、反応物を室温でインキュベートした。発光を任意単位で示す。

図２に示す通り、ポリメラーゼなしの反応混合物からは蛍光発光は得られなかった。さらに、図２に示すように、シグナルの増幅は、エキソヌクレアーゼＩＩＩ及びポリメラーゼの両方が反応混合物に存在する場合にのみ得られる。

実施例７
配列特異性を有する蛍光発生的な色素を有する末端リン酸上で標識ヌクレオチドの配列特異的取込みによって生じるシグナルを増幅するためのエキソヌクレアーゼＩＩＩの使用
図３Ａを参照して、鋳型におけるデオキシシチジン（Ｃ）の存在を決定するためにアッセイを実施した。図３Ａに示す各々の結果について、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０，５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．５ｍＭ ＭｎＳＯ_４、４０ｐｍｏｌのｄｄＧ３Ｐ−レゾルフィン（レゾルフィン−γ−２′，３′−ジデオキシグアノシン−５′−三リン酸）、５ｐｍｏｌプライマー（５′ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴ＊Ａ３′（配列番号１）、ここで＊はホスホロチオエート結合である）及び１０ｐｍｏｌの鋳型（５′ＧＴＣＧＴＴＣＴＡＣＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＣＴＧＧＧＡＡＡＡ＊ｄｄＣ３′（配列番号３）ここで＊はホスホロチオエート結合であり、ｄｄＣは、末端ジデオキシヌクレオチドを示す）を含む５０μｌの反応物を、４分間７５°に加熱及び２１°に冷却することによってアニーリングさせた。従って、図３Ａについては、プライマー／鋳型の組合せは以下であった：
５′ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡ（配列番号１）
ｄｄＣＡＡＡＡＧＧＧＴＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＡＣＡＴＣＴＴＧＣＴＧ（配列番号３）
ここに、０．１５単位のシュリンプアルカリホスファターゼ及び１６単位のＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ＤＮＡポリメラーゼを添加して、示したようにエキソヌクレアーゼＩＩＩを添加した。この反応物を２１℃で４０分間インキュベートした。インキュベーション後、２５μｌを９６ウェルプレートに取り出して、５３０ｎｍの励起及び５９０ｎｍの発光フィルターを備えるＴｅｃａｎ ＵＬＴＲＡプレートリーダーにおいて蛍光を測定した。蛍光発光を任意単位で示す。

図３Ｂを参照して、鋳型におけるデオキシチミジン（Ｔ）の存在を決定するためにアッセイを実施した。図３Ｂに示す各々の結果について、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０，５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．５ｍＭ ＭｎＳＯ_４、４０ｐｍｏｌのｄｄＴ４Ｐ−ＤＤＡＯ（ＤＤＡＯ−δ−２′，３′−ジデオキシチミジン−５′−四リン酸）、５ｐｍｏｌプライマー（５′ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴ＊Ａ３′（配列番号１）、ここで＊はホスホロチオエート結合である）及び１０ｐｍｏｌの鋳型（５′ＧＴＣＧＴＴＡＴＡＣＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＣＴＧＧＧＡＡＡＡ＊ｄｄＣ３′（配列番号２）ここで＊はホスホロチオエート結合であり、ｄｄＣは、末端ジデオキシヌクレオチドを示す）を含む５０μｌの反応物を、４分間７５°に加熱及び２１°に冷却することによってアニーリングさせた。従って、プライマー／鋳型の組合せは以下であった：
５′ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡ（配列番号１）
ｄｄＣＡＡＡＡＧＧＧＴＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＡＣＡＴＡＴＴＧＣＴＧ（配列番号２）
ここに、０．１５単位のシュリンプアルカリホスファターゼ及び１６単位のＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ＤＮＡポリメラーゼを添加して、示したようにエキソヌクレアーゼＩＩＩを添加した。この反応物を２１℃で４０分間インキュベートした。インキュベーション後、２５μｌを９６ウェルプレートに取り出して、６１２ｎｍの励起及び６７０ｎｍの発光フィルターを備えるＴｅｃａｎ ＵＬＴＲＡプレートリーダーにおいて蛍光を測定した。蛍光発光を任意単位で示す。

図３Ａに示す通り、末端リン酸標識ジデオキシグアノシン三リン酸色素を含む反応について、このプライマー−鋳型の組合せに関する蛍光発光を検出したが、鋳型中の次のヌクレオチドはｄＣであった。図３Ｂに関しては、末端リン酸標識ジデオキシリミジン四リン酸を含む反応について、このプライマー−鋳型の組合せに関する蛍光発光を検出したが、鋳型中の次のヌクレオチドはｄＡであった。シュリンプアルカリホスファターゼによるホスホリル転移のピロリン酸生成物の切断によって、レゾルフィン又はＤＤＡＯ標識の検出可能な変化がもたらされて、これによって核酸の検出、シグナルの増幅を発揮する数回繰返される相補的な標識ヌクレオチドの合成及び分解が可能になる。

実施例８
ビオチン化オリゴ及びｄｄＡ４Ｐ−メチルクマリンを用いるストレプトアビジン誘導体化ビーズの検出
Ａ．ストレプトアビジン誘導体化ビーズへのビオチン化オリゴの結合
ストレプトアビジンコーティングビーズ（１００μｌ，１０ｍｇ／ｍｌ）を１×ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０１％）２２５μｌ及び１×ＰＢＳ，２２５μｌを用いて洗浄した。ビーズを、１９５μｌ ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０１％）及び５μｌの５０μＭ溶液のビオチン化オリゴ（３７℃でヘアピンを形成し得る、配列番号４、３７℃で３０分間）の混合物とともにインキュベートした。上清の分離後、ビーズを０．５ｍｌ ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０１％）、０．５ｍｌのＰＢＳ緩衝液を用いて洗浄して、０．５ｍｌのＰＢＳ緩衝液に再懸濁した。６５℃で１０分間の濃ＮＨ４ＯＨを用いたビーズの一部からのオリゴの切断及びこのオリゴに結合したフルオレセインの蛍光を測定した後、オリゴローディングは、９ｐｍｏｌ／５００μｌの最終ビーズ懸濁液であることを確認した。

ここでＴ＊は、ビオチン化チミジン塩基であり、ｓは、Ｅｘｏ−ＩＩＩに抵抗するホスホロチオエート骨格に付けている。

Ｂ．ビオチン化オリゴへのｄｄＡＭＰの繰返しの付加及び除去によるｄｄＡ４Ｐメチルクマリンを用いるストレプトアビジン誘導体化ビーズの検出
５０μｌのオリゴをロードしたビーズ（０．９ｐｍｏｌオリゴ）を、上清から分離して、脱イオン水（５０μｌ）及び反応緩衝液（５０μｌ，２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ８．２、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０，０．００２６ｕ／μｌ シュリンプアルカリホスファターゼ、１ｍＭ ＤＴＴ、５μＭ ｄｄＡ４Ｐ−メチルクマリン、０．０６５ｕ／μｌ ＥｘｏＩＩＩ及び０．０１２ｕ／μｌ ＴＳＩポリメラーゼ）を用いて洗浄した。ビーズを同じ反応緩衝液中で、３７℃で１．５時間インキュベートした。上清を分離して、３６０ｎｍの励起及び４６５ｎｍの発光を用いてＴｅｃａｎ ＵＬＴＲＡプレートリーダーで蛍光を測定した。出発ｄｄＡ４Ｐ−メチルクマリン（２０２．６ｐｍｏｌ）の約８１％が消費されて、約２２５倍増幅のシグナルが得られた。

実施例９
ビオチン化オリゴ及び４つすべてのｄＮ４Ｐ−メチルクマリンヌクレオチドを用いるストレプトアビジン誘導体化ビーズの検出（Ｎ＝Ａ、Ｇ、Ｃ及びＴ）
実施例８Ａによる５０μｌのオリゴローディングビーズを、上清から分離して、脱イオン水（５０μｌ）及び反応緩衝液（５０μｌ，２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ８．２、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０，０．００２６ｕ／μｌ シュリンプアルカリホスファターゼ、１ｍＭ ＤＴＴ、４．７６μＭ ｄＡ４Ｐ−メチルクマリン、４．７６μＭ ｄＧ４Ｐ−メチルクマリン、４．７６μＭ ｄＣ４Ｐ−メチルクマリン、４．７６μＭ Ｔ４Ｐ−メチルクマリン、０．０６５ｕ／μｌ ＥｘｏＩＩＩ及び０．０１２ｕ／μｌ ＴＳＩポリメラーゼ）を用いて洗浄した。ビーズを同じ反応緩衝液中で、３７℃で１．５時間インキュベートした。上清を分離して、３６０ｎｍの励起及び４６５ｎｍの発光を用いてＴｅｃａｎ ＵＬＴＲＡで蛍光を測定した。出発ｄＮ４Ｐ−メチルクマリンヌクレオチド（２５７．７ｐｍｏｌ）の約２７％が消費されて、約２８６倍増幅のシグナルが得られた。

実施例１０
ビオチン化オリゴ及び３つメチルクマリン標識ヌクレオチド（ｄＡ４Ｐ−メチルクマリン、ｄＧ４Ｐ−メチルクマリン、ｄＣ４Ｐ−メチルクマリン）及びＤＤＡＯ標識ヌクレオチド（Ｔ４Ｐ−ＤＤＡＯ）を用いるストレプトアビジン誘導体化ビーズの検出
実施例８Ａによる５０μｌのオリゴローディングビーズを、上清から分離して、脱イオン水（５０μｌ）及び反応緩衝液（５０μｌ，２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ８．２、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０，０．００２６ｕ／μｌ シュリンプアルカリホスファターゼ、１ｍＭ ＤＴＴ、４．７６μＭ ｄＡ４Ｐ−メチルクマリン、４．７６μＭ ｄＧ４Ｐ−メチルクマリン、４．７６μＭ ｄＣ４Ｐ−メチルクマリン、４．７６μＭ Ｔ４Ｐ−ＤＤＡＯ及び０．０１２ｕ／μｌ ＴＳＩポリメラーゼ）を用いて洗浄した。Ｅｘｏ ＩＩＩは用いなかった。ビーズを同じ反応緩衝液中で、３７℃で１．５時間インキュベートした。上清を分離して、メチルクマリンについては３６０ｎｍの励起及び４６５ｎｍの発光を用いて、ＤＤＡＯについては６１２ｎｍの励起及び６７０ｎｍの発光を用いてＴｅｃａｎ ＵＬＴＲＡで蛍光を測定した。メチルクマリン及びＤＤＡＯ蛍光カウントの比は、７．０の期待される値（配列が完全に伸長される場合、Ｔ塩基に対するＡ、Ｇ及びＣの合計の比）に極めて近い７．１〜７．４であって、このことは、配列の組成が、別のものから１つの解析シグナルを識別するために用いることができることを示す。

以上、本発明の特定の望ましい実施形態について記載してきたが、本発明の技術的範囲から逸脱せずに変更を加えることができる。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲に記載される。

本発明の方法の一実施形態であって、非加水分解性３′末端を有するヘアピンループのＤＮＡプライマー−鋳型を標的検体に結合させ、鋳型に相補的な配列の末端リン酸標識ヌクレオチドをヌクレアーゼ耐性プライマーの３′末端に結合させ、次いでこれを分解して、サイクリングアッセイを実施し、ヌクレオチド取込みの標識ポリリン酸副生物がアルカリホスファターゼと反応して検出可能な化学種を生じる実施形態を示す。 蛍光発生色素で末端リン酸を標識したヌクレオチドの取込みによって生じたシグナルを増幅するため、５′→３′エキソヌクレアーゼを用いて得た時間と蛍光発光の関係を示すグラフ。 蛍光発生色素で末端リン酸を標識したヌクレオチドの配列特異的取込みによって生じたシグナルを増幅するため、５′→３′エキソヌクレアーゼを用いて得た蛍光発光の棒グラフ。

Claims (14)

1. 検体の検出法であって、
   （ａ）鋳型核酸に検体を固定する段階、
   （ｂ）鋳型、プライマー、１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド及び核酸ポリメラーゼの反応を含む核酸ポリメラーゼ反応を実施して標識ポリリン酸を生成させる段階、及び
   （ｃ）蛍光の検出によって標識ポリリン酸を分析する段階
   を含み、上記１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチドが次式で表される、方法。
   Ｂ−Ｓ−Ｙ−（Ｐ）_n−Ｐ−Ｌ
   （式中、Ｐはリン酸（ＰＯ₃）であり、ｎは２以上であり、Ｙは酸素又はイオウ原子であり、Ｂは含窒素複素環式塩基であり、Ｓは非環式部分、炭素環式部分又は糖部分であり、Ｌは、天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸でのリン酸エステル、チオエステル又はホスホルアミデート結合の形成に適したヒドロキシル基、スルフヒドリル基又はアミノ基を含有する酵素活性化可能標識であり、Ｐ−Ｌはリン酸化標識である。）
2. 前記プライマーがヌクレアーゼ耐性プライマーである、請求項１記載の方法。
3. 前記核酸ポリメラーゼ反応が３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素をさらに含む、請求項２記載の方法。
4. 前記分析段階が、（ａ）標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて検体に特徴的な検出可能な化学種を生成させる段階と（ｂ）検出可能な化学種を検出する段階を含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
5. 前記ヌクレアーゼ耐性プライマーが、ホスホン酸メチル、ボラノホスフェート又はホスホロチオエート結合を含む、請求項２記載の方法。
6. １種以上の末端リン酸標識ヌクレオチドの標識が、化学発光化合物、蛍光発生色素、発色色素、質量タグ、電気化学的タグ及びこれらの組合せからなる群から選択される酵素で活性化可能な標識である、請求項１記載の方法。
7. Ｐ−Ｌが、リン酸が取り除かれたときに独立に検出可能となるリン酸化標識である、請求項１記載の方法。
8. 検体の検出法であって、
   （ａ）検体を、（ｉ）プライマー、又は（ｉｉ）鋳型核酸とプラマーとを含むヘアピン構造に固定する段階、
   （ｂ）鋳型、プライマー、１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド及び核酸ポリメラーゼの反応を含む核酸ポリメラーゼ反応を実施して標識ポリリン酸を生成させる段階、及び
   （ｃ）蛍光の検出によって標識ポリリン酸を分析する段階
   を含み、上記１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチドが次式で表される、方法。
   Ｂ−Ｓ−Ｙ−（Ｐ）_n−Ｐ−Ｌ
   （式中、Ｐはリン酸（ＰＯ₃）であり、ｎは２以上であり、Ｙは酸素又はイオウ原子であり、Ｂは含窒素複素環式塩基であり、Ｓは非環式部分、炭素環式部分又は糖部分であり、Ｌは、天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸でのリン酸エステル、チオエステル又はホスホルアミデート結合の形成に適したヒドロキシル基、スルフヒドリル基又はアミノ基を含有する酵素活性化可能標識であり、Ｐ−Ｌはリン酸化標識である。）
9. サンプル中の複数の検体の検出及び特性決定法であって、
   （ａ）付加される相補的ヌクレオチドの向かい側に特有の塩基を有する特定の鋳型核酸配列を各検体に固定する段階、
   （ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施して標識ポリリン酸を生成させる段階であって、該反応が、鋳型、特定の鋳型配列に相補的なプライマー、異なる標識を有する２種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ及び３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の反応を含む段階、
   （ｃ）標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて、各検体に特有の検出可能な化学種を生成させる段階、及び
   （ｄ）検出可能な化学種を検出する段階
   を含み、上記２種以上の末端リン酸標識ヌクレオチドが次式で表される、方法。
   Ｂ−Ｓ−Ｙ−（Ｐ）_n−Ｐ−Ｌ
   （式中、Ｐはリン酸（ＰＯ₃）であり、ｎは２以上であり、Ｙは酸素又はイオウ原子であり、Ｂは含窒素複素環式塩基であり、Ｓは非環式部分、炭素環式部分又は糖部分であり、Ｌは、天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸でのリン酸エステル、チオエステル又はホスホルアミデート結合の形成に適したヒドロキシル基、スルフヒドリル基又はアミノ基を含有する酵素活性化可能標識であり、Ｐ−Ｌはリン酸化標識である。）
10. サンプル中の複数の検体の検出及び特性決定法であって、
    （ａ）付加される相補的ヌクレオチドの向かい側に特有の塩基を有する特定の鋳型核酸配列を各検体に固定する段階、
    （ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施して特有の標識をもつポリリン酸を生成させる段段階であって、該反応が鋳型、上記複数の検体の各々に特有の標的配列に相補的なヌクレアーゼ耐性プライマー、ポリリン酸鎖に４個以上のリン酸基を有していて各々異なる標識を有する２種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ及び３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の反応を含む段階、及び
    （ｃ）標識ポリリン酸を検出する段階
    を含み、上記２種以上の末端リン酸標識ヌクレオチドが次式で表される、方法。
    Ｂ−Ｓ−Ｙ−（Ｐ）_n−Ｐ−Ｌ
    （式中、Ｐはリン酸（ＰＯ₃）であり、ｎは３以上であり、Ｙは酸素又はイオウ原子であり、Ｂは含窒素複素環式塩基であり、Ｓは非環式部分、炭素環式部分又は糖部分であり、Ｌは、天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸でのリン酸エステル、チオエステル又はホスホルアミデート結合の形成に適したヒドロキシル基、スルフヒドリル基又はアミノ基を含有する酵素活性化可能標識であり、Ｐ−Ｌはリン酸化標識である。）
11. 反応コンパートメント中の複数の検体の検出及び特性決定法であって、
    （ａ）各検体に、特有の鋳型核酸配列を固定する段階、
    （ｂ）反応コンパートメントの表面に検体を固定する段階、
    （ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施して標識ポリリン酸を生成させる段階であって、該反応が、検体の１種類に特有の鋳型配列、特有の鋳型配列に相補的なヌクレアーゼ耐性プライマー、ポリリン酸鎖に４個以上のリン酸基を有する１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ及び３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の反応を含む段階、
    （ｄ）標識ポリリン酸を検出する段階、
    （ｅ）固定されていない成分を洗い流す段階、及び
    （ｆ）検体すべてが解析されるまで、別の検体に特有の鋳型配列に相補的なヌクレアーゼ耐性プライマーを用いて段階（ａ）〜（ｄ）を繰返す段階
    を含み、上記１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチドが次式で表される、方法。
    Ｂ−Ｓ−Ｙ−（Ｐ）_n−Ｐ−Ｌ
    （式中、Ｐはリン酸（ＰＯ₃）であり、ｎは３以上であり、Ｙは酸素又はイオウ原子であり、Ｂは含窒素複素環式塩基であり、Ｓは非環式部分、炭素環式部分又は糖部分であり、Ｌは、天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸でのリン酸エステル、チオエステル又はホスホルアミデート結合の形成に適したヒドロキシル基、スルフヒドリル基又はアミノ基を含有する酵素活性化可能標識であり、Ｐ−Ｌはリン酸化標識である。）
12. 前記末端リン酸標識ヌクレオチドがポリリン酸鎖に４個以上のリン酸基を有する、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
13. 請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法に適した、検体の検出用キットであって、
    （ａ）次式の１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
    Ｂ−Ｓ−Ｙ−（Ｐ） _n −Ｐ−Ｌ
    （式中、Ｐはリン酸（ＰＯ ₃ ）であり、ｎは２以上であり、Ｙは酸素又はイオウ原子であり、Ｂは含窒素複素環式塩基であり、Ｓは非環式部分、炭素環式部分又は糖部分であり、Ｌは、天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸でのリン酸エステル、チオエステル又はホスホルアミデート結合の形成に適したヒドロキシル基、スルフヒドリル基又はアミノ基を含有する酵素活性化可能標識であり、Ｐ−Ｌはリン酸化標識である。）、
    （ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、
    （ｃ）ホスファターゼ、
    （ｄ）１種以上の鋳型核酸、及び
    （ｅ）上記１種以上の鋳型核酸に相補的な１種以上のヌクレアーゼ耐性プライマー
    を含んでいて、１種以上の鋳型核酸及び／又は相補的ヌクレアーゼ耐性プライマーがアンカー部分を有する、キット。
14. ヌクレアーゼ耐性３′−末端を有する１以上のヘアピン構造の鋳型−プライマーの組合せをさらに含む、請求項１３記載の検体の検出用キット。

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