JP4360904B2

JP4360904B2 - 単一ヌクレオチドの増幅およびポリメラーゼによる検出

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Publication number: JP4360904B2
Application number: JP2003525595A
Authority: JP
Inventors: ジョン・ネルソン; カール・フラー; アヌップ・ソード; シブ・クマー
Original assignee: Amersham Biosciences Corp
Current assignee: Global Life Sciences Solutions USA LLC
Priority date: 2001-08-29
Filing date: 2002-08-29
Publication date: 2009-11-11
Anticipated expiration: 2022-08-29
Also published as: US7033762B2; EP1427852B1; ATE458068T1; DE60235383D1; WO2003020891A2; CA2456906C; DK1427852T3; WO2003020891A3; CA2456906A1; US20030096253A1; AU2002324826B2; EP1427852A4; EP1427852A2; JP2005501551A

Description

発明の詳細な説明

(関連出願)
本出願は、２００１年８月２９日に出願した、米国仮出願第６０／３１５,７９８号の表題３５§１１９(ｅ)の下で優先権の恩典を主張する。

（技術分野）
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼのための基質として非−加水分解可能なプライマーおよび末端−ホスフェート−標識ヌクレオチドの使用に基づいて、試料中でポリヌクレオチドを検出して特徴づけする方法に一般的に関する。本発明はさらに、標的ポリヌクレオチドにおける特異的ヌクレオチド塩基の突然変異を検出する方法に関する。使用される標識は、酵素で活性化可能であって、化学発光の、蛍光性の、電気化学的なおよび発色性の部分ならびに質量タグを含む。

（背景技術）
高度の特異性および感度を持って試料中で特異的な核酸もしくはアナライトを検出する方法は公知である。核酸配列間の相補性に基づいている分析方法は、遺伝子の特性の直接分析を可能とする。これは、遺伝子の障害もしくは正常細胞のがん性変化を確認する非常に有用な手段を提供する。

しかしながら、試料中での微量の標的ヌクレオチドの検出および特徴づけは困難である。それ故に、遺伝子の直接検出方法は一般的に、特異的な標的配列もしくはアナライトの存在に基づいて核酸配列を先ず増幅することを必要とする。増幅に引き続いて、増幅された配列が検出されて、定量化される。核酸のための従来の検出システムには、蛍光性の標識の検出、蛍光性の酵素−結合検出システム、抗体−仲介標識検出および放射性標識の検出が含まれる。

核酸配列を増幅する方法として、ＰＣＲ(ポリメラーゼ連鎖反応)方法が公知である。現在、ＰＣＲは、核酸のインビトロ増幅のための最も従来的な手段である。しかしながら、ＰＣＲは、厳密な温度制御の必要性、対数的増幅による不適切な定量化、微量の汚染ＤＮＡの同時の増幅によりもたらされる誤った結果の危険を含む、特定の不利点を有する。

配列の検出および特徴づけを伴う増幅方法に加えて、増幅された分解生成物を検出するシグナル増幅方法がある、即ち、反応の生成物もしくは副産物が標的核酸からのシグナルとして増幅される。

例えば、λ−エキソヌクレアーゼを利用して、二本鎖ＤＮＡを特異的に開裂するところのサイクリングアッセイが開発されている(C.G. Copley et al., Bio Techniques, Vol. 13, No. 6, pp 882-892, 1992)。この方法は、オリゴヌクレオチドプローブをそれに相補的な核酸配列でハイブリダイズすることを伴い、λ−エキソヌクレアーゼが形成した二本鎖ＤＮＡに作用して、ハイブリダイズされたプローブを分解させる。プローブは、次いで分解されるところのもう一つのプローブに置き換えられる。この方式で、サイクリング反応が繰り返される。この方法では、標的ＤＮＡ配列の存在は、分解されたプローブの検出により見積もられる。この方法の不利点は、λ−エキソヌクレアーゼが、基質としてその５'−末端でリン酸化されるプローブを必要とすることである。プローブの既知方法による化学合成に引き続いて、５'−末端をリン酸化する必要があって、全ての５'−末端が完全にリン酸化されることを確認することはしばしば困難である。この方法のさらに別な問題は、サイクリング反応の低い代謝回転数、即ち、ハイブリダイゼーションがプライマーおよび標的ヌクレオチドの間に起こる回数、である。ハイブリダイゼーション工程が繰り返して起こらねばならないので、代謝回転数は低い。

エキソヌクレアーゼによるさらに別なサイクリングアッセイがEP 500224/A1に開示されている。この方法では、標的ＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖の合成は、もう一つのプライマーが前にハイブリダイズされた分解したプライマーの代わりに標的配列とハイブリダイズするように、プライマーから同時に同一のプライマーの５'→３'エキソヌクレアーゼによる他の側からの分解と共に進行する。それ故に、単一のサイクル反応において、ＤＮＡポリメラーゼによる相補的な鎖の合成ならびに合成された鎖の分解の両方が繰り返して起こる。この方法の不利点は、低い代謝回転数であり、ハイブリダイゼーション工程は、そこで繰り返して起こらねばならない、律速段階である。

特異的配列を含むポリヌクレオチドの検出のためのさらなるサイクリングアッセイは、米国特許第５,８４９,４８７号に開示されている。この方法は、シグナル増幅および分解生成物の検出に頼る。この方法は、核酸ポリメラーゼ、３'→５'エキソヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ−抵抗性プライマー、限定濃度でＤＮＡであり得る標的核酸、および少なくとも一つのデオキシヌクレオシド三リン酸(ｄＮＴＰ)を用いて、標的核酸配列を検出することを含む。この方法はさらに、ヌクレアーゼ−抵抗性プライマーの３'−末端に隣接して位置するヌクレオチド種である相補的鎖を合成し、それに引き続いてプライマーの末端に結合したヌクレオチド種の分解および得られたピロリン酸もしくはデオキシヌクレオシド一リン酸の検出を行うことを含み、ヌクレオチド種の合成および分解は一つもしくはそれ以上の回数で繰り返される。現在広く使用されるこの方法ならびに他の検出方法の不利点は、最終の標識生成物もしくは副産物から標識出発原料を分離する必要である。そのような分離は一般的に、検出のためにゲル電気泳動もしくは標的核酸配列の膜の上への固定化を必要とする。例えば、米国特許第５,８４９,４８７号には、ヌクレアーゼ反応により形成したデオキシヌクレオシド一リン酸が、クロマトグラフィーで分離されて、光学的に測定された。これに代えて、ＤＮＡポリメラーゼによる相補性塩基の組み込みで形成されるピロ燐酸をアデノシン−５'−ホスホ硫酸およびアデノシン三リン酸スルフラーゼと反応させ、アデノシン三リン酸を形成させて、次いでそれをルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を用いて検出させ得る；これは、さらに別な試薬およびインキュベーション工程を必要とする不利点を提示する。

さらに、米国特許第５,８４９,４８７号は、ヌクレアーゼ消化の後に残るヌクレオチド種の存在もしくは不存在のみを用いて、標的中の特異的ヌクレオチド塩基の突然変異を検出する。即ち、単にもしも特異的塩基が検出されるべき突然変異であるか、もしくはそうでない、ときのみに、ヌクレオチドは、プライマーの３'−末端の上に結合するであろう。この特許は、存在する実際の突然変異を最初の分析により同定する方法を開示していない。

ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼは、トリホスフェート部分のガンマ位置におけるかもしくは代わりに修飾を持つヌクレオシドを認識して、利用することができることが知られている。種々のポリメラーゼがガンマ−修飾ヌクレオチド三リン酸(ＮＴＰの)を認識して、利用する能力は、ガンマホスフェートに付加した部分に依存して変わるように見えることがさらに公知である。

ガンマ−ホスフェートで修飾したヌクレオチドの存在下でＲＮＡポリメラーゼからＲＮＡ合成をモニターするための比色アッセイは報告されている(Vassiliou W, Epp JB, Wang BB, Del Vecchio AM, Widlanski T, Kao CC.、「ポリメラーゼ無差別性の利用：簡単な比色性ＲＮＡポリメラーゼアッセイ」、Virology. 2000 Sep 1;274(2):429-37を参照)。この報告においては、ＲＮＡポリメラーゼ反応は、ガンマ−ホスフェートにおいてジニトロフェニル基で修飾した、ガンマ−修飾のアルカリ性ホスファターゼ耐性のヌクレオチド三リン酸の存在下で実施された。ＲＮＡポリメラーゼ反応が、単なるヌクレオチド三リン酸およびホモポリマー性鋳型としてこのガンマ−修飾のＮＴＰの存在下で実施されたときには、ＲＮＡポリメラーゼが修飾ＮＴＰを認識して、利用することができることが見出された。さらに、ポリメラーゼ反応が、発色性ｐ−ニトロフェニレートへのホスホリル転移のピロリン酸ｐ−ニトロフェニルのアルド−生成物を消化した、アルカリ性ホスファターゼの存在下で実施されたときには、吸光度の増加が報告された。この検出方法の不利点は、アルカリ性ホスファターゼの存在下で実施される、リアルタイムの比色アッセイは、ホモポリマー性鋳型でもって単に働くことである。

それ故に、核酸を検出して特徴づけする方法を提供することは恩恵をもたらして、その方法は、エキソヌクレアーゼによるサイクリングアッセイにおいてＤＮＡポリメラーゼのための基質として末端−ホスフェート−標識ヌクレオチドの利用を含むであろう。もしそのような方法が、標識生成物もしくは副産物から標識出発原料を分離する必要を除外するところの標的核酸から増幅された検出種の生産のためにヌクレオチドの末端ホスフェートにおいて酵素で活性化可能な標的を使用するであろうならば、さらに恩恵をもたらすであろう。さらに、もしそのような核酸を検出して特徴づけする方法が、日常的な実験室計測器を用いてヘテロポリマー性標的核酸のリアルタイムのモニタリングを可能とするであろうことは高度に望ましいであろう。

(発明の概要)
本発明の態様は、ポリヌクレオチドを検出する方法を提供することであって、その中では、ＤＮＡに作用する３'→５'ＤＮＡエキソヌクレアーゼが、標的ヌクレオチドからのシグナルが増幅されて、標識出発原料から標識生成物を分離する必要無しに検出され得るように、ＤＮＡ反応ポリメラーゼおよびホスファターゼと一緒に用いられる。

本発明は、核酸試料を検出する方法を提供する。一つの方法は、(ａ) ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施し、反応が、鋳型、非―加水分解可能なプライマー、少なくとも一つの末端ホスフェート−標識ヌクレオチド，ＤＮＡポリメラーゼならびに、酵素がＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼおよびそれらの組合せから選択され得る、３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の反応を含み、その反応は標識ポリホスフェートの生産をもたらす；(ｂ)標識ポリホスフェートがホスファターゼと反応して、検出可能な種を生産することを可能とすること；ならびに(ｃ)検出可能な種を検出すること：の工程を含む。

さらに、核酸試料を検出する方法であって、(ａ) ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施し、反応が、鋳型、非―加水分解可能なプライマー、ポリホスフェート鎖中に四つもしくはそれ以上のホスフェート基を有する少なくとも一つの末端ホスフェート−標識ヌクレオチド，ＤＮＡポリメラーゼならびに、酵素がＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼおよびそれらの組合せから選択され得る、３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の反応を含み、その反応は標識ポリホスフェートの生産をもたらす；ならびに(ｂ)標識ポリホスフェートを検出すること：の工程を含む、方法が提供される。

本発明のもう一つの態様は、核酸試料を検出する方法であって、(ａ) ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施し、反応が、鋳型、非―加水分解可能なプライマー、ポリホスフェート鎖中に四つもしくはそれ以上のホスフェート基を有する少なくとも一つの末端ホスフェート−標識ヌクレオチド，ＤＮＡポリメラーゼならびに、酵素がＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼおよびそれらの組合せから選択され得る、３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の反応を含み、その反応は標識ポリホスフェートの生産をもたらす；(ｂ)標識ポリホスフェートがホスファターゼと反応して、検出可能な種を生産することを可能とすること；ならびに(ｃ)検出可能な種を検出すること：の工程を含む、方法に関する。

本発明はさらに、核酸試料を特徴づけする方法を提供する。例えば、本発明は、(ａ) ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施し、反応が、鋳型、非―加水分解可能なプライマー、少なくとも一つの末端ホスフェート−標識ヌクレオチド，ＤＮＡポリメラーゼならびに、酵素がＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼおよびそれらの組合せから選択され得る、３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の反応を含み、その反応は標識ポリホスフェートの生産をもたらす；(ｂ)標識ポリホスフェートがホスファターゼと反応して、検出可能な種を生産することを可能とすること；(ｃ)検出可能な種を検出すること；ならびに(ｄ)検出に基づいて核酸を特徴づけすること：の工程を含む、方法を提供する。

本発明によりさらに包含されるものは、核酸試料を特徴づけする方法であって、(ａ) ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施し、反応が、鋳型、非―加水分解可能なプライマー、ポリホスフェート鎖中に四つもしくはそれ以上のホスフェート基を有する少なくとも一つの末端ホスフェート−標識ヌクレオチド，ＤＮＡポリメラーゼならびに、酵素がＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼおよびそれらの組合せから選択され得る、３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の反応を含み、その反応は標識ポリホスフェートの生産をもたらす；(ｂ)標識ポリホスフェートを検出すること；ならびに(ｃ)検出に基づいて核酸試料を特徴づけすること：の工程を含む、方法である。

また、核酸試料を特徴づけする方法であって、(ａ) ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施し、反応が、鋳型、非―加水分解可能なプライマー、ポリホスフェート鎖中に四つもしくはそれ以上のホスフェート基を有する少なくとも一つの末端ホスフェート−標識ヌクレオチド，ＤＮＡポリメラーゼならびに、酵素がＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼおよびそれらの組合せから選択され得る、３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の反応を含み、その反応は標識ポリホスフェートの生産をもたらす；(ｂ)標識ポリホスフェートがホスファターゼと反応して、試料に特徴的なシグナルプロフィールを有する検出可能な種を生産することを可能とすること；(ｃ)検出可能な種を検出すること；ならびに(ｄ)シグナルプロフィールに基づいて核酸試料を特徴づけすること：の工程を含む、方法が提供される。

さらに、本発明は、標的核酸鎖中の特異的ヌクレオチド塩基の突然変異を検出する方法を提供する。一つの発明的方法は、(ａ) ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施し、反応が、鋳型、非―加水分解可能なプライマー、少なくとも一つの末端ホスフェート−標識ヌクレオチド，ＤＮＡポリメラーゼならびに、酵素がＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼおよびそれらの組合せから選択され得る、３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の反応を含み、その反応は標識ポリホスフェートの生産をもたらす；(ｂ)標識ポリホスフェートがホスファターゼと反応して、独特なシグナルプロフィールを有する検出可能な種を生産することを可能とすること；(ｃ)検出可能な種を検出すること；ならびに(ｄ) 検出可能な種の存在もしくは不存在およびその独特なシグナルプロフィールに基づいて核酸配列における突然変異を特徴づけすること：の工程を含む。

これに加えて、標的核酸鎖中の特異的ヌクレオチド塩基の突然変異を検出する方法であって、以下の工程：(ａ) ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施し、反応が、鋳型、非―加水分解可能なプライマー、ポリホスフェート鎖中に四つもしくはそれ以上のホスフェート基を有する少なくとも一つの末端ホスフェート−標識ヌクレオチド，ＤＮＡポリメラーゼならびに、酵素がＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼおよびそれらの組合せから選択され得る、３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の反応を含み、その反応は、もし末端ホスフェート−標識ヌクレオチドが特異的塩基に相補的であるならば、標識ポリホスフェートの生産をもたらす；(ｂ)標識ポリホスフェートを検出すること；ならびに(ｃ)標識ポリホスフェートの存在もしくは不存在に基づいて核酸配列における突然変異を特徴づけすること、を含む、方法が提供される。

本発明によりさらに包含されるものは、標的核酸鎖中の特異的ヌクレオチド塩基の突然変異を検出する方法であって、(ａ) ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施し、反応が、鋳型、非―加水分解可能なプライマー、ポリホスフェート鎖中に四つもしくはそれ以上のホスフェート基を有する少なくとも一つの末端ホスフェート−標識ヌクレオチド，ＤＮＡポリメラーゼならびに、酵素がＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼおよびそれらの組合せから選択され得る、３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の反応を含み、その反応は、もし末端ホスフェート−標識ヌクレオチドが特異的塩基に相補的であるならば、標識ポリホスフェートの生産をもたらす；(ｂ)標識ポリホスフェートがホスファターゼと反応して、独特なシグナルプロフィールを有する検出可能な種を生産することを可能とすること；(ｃ)検出可能な種を検出すること；ならびに(ｄ)検出可能な種の存在もしくは不存在におよびその独特なシグナルプロフィールに基づいて核酸配列における突然変異を特徴づけすること：の工程を含む、方法である。

ポリヌクレオチドを検出するキットが本発明によりさらに提供されて、一つのキットは、(ａ)少なくとも一つの末端−ホスフェート−標識ヌクレオチド；(ｂ)ＤＮＡポリメラーゼ；(ｃ)ホスファターゼ；および(ｄ)ＤＮＡを３'→５'方向で分解するのに十分な酵素活性を持つヌクレアーゼ含む。

(ａ)少なくとも一つの末端−ホスフェート−標識ヌクレオシド；；(ｂ)ホスファターゼ；および(ｃ)ＤＮＡを３'→５'方向で分解するのに十分な酵素活性を持つＤＮＡポリメラーゼ：を含むところのポリヌクレオチドを検出するさらなるキットが提供される。

本発明のさらなる態様は、標的核酸鎖中の特異的ヌクレオチド塩基の突然変異を検出するためのキットを提供することであって、一つのキットは(ａ)少なくとも一つの末端−ホスフェート−標識ヌクレオチド；(ｂ)ＤＮＡポリメラーゼ；(ｃ)ホスファターゼ；および(ｄ)ＤＮＡを３'→５'方向で分解するのに十分な酵素活性を持つヌクレアーゼ：を含む。

最後に、(ａ)少なくとも一つの末端−ホスフェート−標識ヌクレオチド；(ｂ)ホスファターゼ；および(ｃ)ＤＮＡを３'→５'方向で分解するのに十分な酵素活性を持つＤＮＡポリメラーゼ：を含むところの標的核酸鎖中の特異的ヌクレオチド塩基の突然変異を検出するためのキットが本明細書で提供される。

(本発明の説明)
本明細書中で定義される際には、用語“ヌクレオシド”とは、炭素環式のもしくは非環式のリンカーのような、糖または糖代用品に結合したプリン、デアザプリン、ピリミジンまたは修飾塩基を、１'位置または同等な位置に含む化合物であって、２'−デオキシおよび２'−ヒドロキシル、２',３'−ジデオキシ形ならびに他の置換を含む。

本明細書中で使用される際には、用語“ヌクレオチド”とは、エステル化部位がペントース糖のＣ−５位置に付加したヒドロキシル基に典型的には対応する、ヌクレオシドのリン酸エステルを指す。

用語“オリゴヌクレオチド”には、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド等を含む、ヌクレオチドの線状オリゴマーもしくはそれらの誘導体が含まれる。本明細書を通じて、オリゴヌクレオチドが文字の配列により表されるときは何時でも、ヌクレオチドは、左から右に５'→３'の順序にあって、そこでは、別に指示が無い限り、Ａはデオキシアデノシンを意味し、Ｃはデオキシシチジンを意味し、Ｇはデオキシグアノシンを意味し、そしてＴはチミジンを意味する。

用語“プライマー”とは、独特な核酸配列に特異的な方式でアニールして、その独特な配列の増幅を可能とするところの線状オリゴヌクレオチドを指す。

語句“標的核酸配列”等とは、その配列の個性、またはヌクレオシドの順番もしくは位置が本発明の一つもしくはそれ以上の方法により決定される、核酸を指す。

本発明は、便利なアッセイが、標的ポリヌクレオチド中の特異的塩基に相補的な末端−ホスフェート−標識ヌクレオチドの非―加水分解可能なプライマーの上への添加に引き続いてそのヌクレアーゼ分解をモニターするために用いられる、試料中でポリヌクレオチドを検出して特徴づけする方法に関する。ＤＮＡポリメラーゼは、デオキシヌクレオシド三リン酸(ｄＮＴＰ)から成長するオリゴヌクレオチド鎖の３'ヒドロキシルへのヌクレオシド一リン酸の転移を介してオリゴヌクレオチドを合成する。

この反応を駆動する力は、酸無水物結合の開裂および無機のピロホスフェートの付随する形成である。本発明は、ヌクレオチドの末端−ホスフェートの構造的修飾はポリメラーゼ反応において機能するその能力を破棄しないという発見を利用する。オリゴヌクレオチドの合成反応は、ヌクレオチドのα−およびβ−ホスホリル基においてのみ直接な変化を伴い、末端ホスフェート位置における修飾を持つヌクレオチドを核酸ポリメラーゼ反応のための基質として貴重であるようにさせる。

本発明により提供される方法は、末端−ホスフェートに付加した電気化学的標識、質量タグ、または発色性の、化学発光のもしくは蛍光性の色素標識を持つデオキシヌクレオシドポリリン酸またはジデオキシヌクレオシドポリリン酸類似体のような、ヌクレオシドポリリン酸類似体を利用する。核酸ポリメラーゼがこの類似体を基質として用いるときには、酵素で活性化可能な標識は、ホスホリル転移の無機のポリホスフェート副産物上に存在する。ホスファターゼによるホスホリル転移のポリホスフェート生成物の開裂は、その上に付加した標識中で検出可能な変化をもたらす。例えば、もしも３−シアノウンベリフェロン色素が、ヒドロキシル基を介してヌクレオチドの末端−ホスフェート位置に付加されるならば、色素は、４０８ｎｍにおいて励起されたときには、蛍光を放たないで、それはアルカリ性ホスファターゼに対する基質でない。一旦このヌクレオシドがＤＮＡの中に組み込まれると、放出色素の無機ポリホスフェート(これもまた、４０８ｎｍにおいて励起されたときには、蛍光を放たない)がアルカリ性ホスファターゼに対する基質である。一旦脱リン酸化されると、色素は、４０８ｎｍにおいて励起されたときには、蛍光性にかつそれ故に検出可能になる。ポリホスフェート生成物の特異的分析を、出発原料から反応生成物を分離する必要無しで、ポリメラーゼおよびエキソヌクレアーゼ反応液のような、同一の反応溶液中で行うことができる。これは、蛍光計もしくは分光光度計のような日常的な計測器を用いて、ポリメラーゼ反応の間に形成される核酸の検出および、任意に、定量化を可能とする。

ＲＮＡおよびＤＮＡポリメラーゼは、修飾した末端ホスホリル基を持つヌクレオチドを認識することができる一方で、本発明者等はこの出発原料はホスファターゼのための基質ではないことを決定していることが注目される。下の反応式は、本発明の方法において最も関連する分子；即ち、末端−ホスフェート−標識ヌクレオチド、標識ポリホスフェート副産物および酵素で活性化された標識、を示す。

上の反応式において、ｎは１もしくはそれより大であり、Ｒ_１およびＲ_２は独立してＨ、ＳＨ、ＳＲ、Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、Ｎ_３、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＯＲもしくはＯＨであり；Ｂは天然もしくは修飾ヌクレオシド塩基であり；ＸはＯ、ＳもしくはＮＨであり；ＹはＯ、ＳもしくはＢＨ_３であり；そしてＬは、発色性の、蛍光原のもしくは化学発光の分子、質量タグまたは電気化学的に検出可能な部分であり得るところのホスファターゼで活性化可能な標識である。質量タグは、質量の相違により他の反応生成物から容易に識別可能であるところの質量スペクトル法に適当な小分子量部分である。電気化学的タグは、容易に酸化可能なもしくは還元可能な種である。ｎが２もしくはそれより大であるときには、ヌクレオチドは、ｎが１であるときよりポリメラーゼに対して顕著にさらに良い基質であることが発見されている。それ故に、本発明の好ましい実施態様において、ｎは２，３もしくは４である。本発明のさらに望ましい実施態様において、ＸおよびＹはＯであり；Ｒ_１およびＲ_２は独立してＨもしくはＯＨであり；Ｂはヌクレオチド塩基であり；そしてＬは、発色性の、蛍光原のもしくは化学発光の分子である。

本明細書中で提供される核酸配列を検出する方法の一つの実施態様において、工程は、反応が、鋳型、非―加水分解可能なプライマー、少なくとも一つの末端ホスフェート−標識ヌクレオチド，ＤＮＡポリメラーゼならびに、酵素がＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼおよびそれらの組合せから選択され得る、３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の反応を含み、その反応は、末端ホスフェート−標識ヌクレオチドが鋳型に相補的であるという条件で、標識ポリホスフェートの生産をもたらす、ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施すること；標識ポリホスフェートが、アルカリ性ホスファターゼのような、ホスファターゼと反応して、検出可能な種を生産することを可能とすること；ならびに検出可能な種を検出することを含む。

本発明により提供される核酸試料を特徴づけする方法において、標的核酸は、検出可能な種の存在もしくは不存在を決定することにより特徴づけされ得る。さらに、検出可能な種は、それに関連した特徴的な染色プロフィールもしくはシグナルプロフィールを有し得て、このプロフィールは試料に特徴的である。これは、検出可能な種の独特なプロフィールに基づく核酸標的の特徴づけを可能とする。

標的核酸の一つの特別な特徴づけは、標的核酸配列中の特異的ヌクレオチド塩基の突然変異の検出を含み得る。本明細書中で提供される突然変異を検出する方法は、(ａ)反応が、鋳型、非―加水分解可能なプライマー、少なくとも一つの末端ホスフェート−標識ヌクレオチド，ＤＮＡポリメラーゼならびに、酵素がＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼおよびそれらの組合せから選択され得る、３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の反応を含み、その反応は標識ポリホスフェートの生産をもたらす、ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施すること；(ｂ)標識ポリホスフェートがホスファターゼと反応して、独特なシグナルプロフィールを有する検出可能な種を生産することを可能とすること；(ｃ)検出可能な種を検出すること；ならびに(ｄ)検出可能な種の存在もしくは不存在におよびその独特なシグナルプロフィールに基づいて核酸配列における突然変異を特徴づけすること：の工程を含む。

図１は、上で説明した方法のそれぞれについて使用された一般的反応式をしめす。この反応式において、ｎは１もしくはそれより大であり、Ｒ_１およびＲ_２は独立してＨ、ＯＨ、ＳＨ、ＳＲ、Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、Ｎ_３、ＮＨ_２もしくはＯＲであり；Ｇはグアニンまたは天然もしくは修飾ヌクレオシド塩基の代表であり；Ｃはシトシンもしくは加えたヌクレオチドに相補的な塩基の代表であり；ＹはＯ、ＳもしくはＢＨ_３であり；そしてＬは、ホスフェートが除去されるときに、好ましくは独立して検出可能になる、発色性の、蛍光原の、化学発光のもしくは電気化学的な標識または質量タグである。図１に示すように、標的ポリヌクレオチドは、少なくとも部分的に標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を有するヌクレアーゼ−耐性で、非―加水分解可能なポリヌクレオチドプライマーとハイブリダイズする。ＤＮＡポリメラーゼ反応は、形成されたハイブリッドおよび少なくとも一つの末端ホスフェート−標識ヌクレオチドの存在下で、末端−ホスフェート−標識ヌクレオシドから誘導されたヌクレオシド一リン酸が、もしそれが標的ポリヌクレオチドに相補的であるならば、ヌクレアーゼ−耐性プライマーの３'−末端に結合するようにする条件下で、実施される。これは、独立して検出可能であり得ない標識生成物の付随的形成により達成される。ヌクレオチド種の組み込みの間に付随的に形成した標識ポリホスフェートは、ホスファターゼと反応して、標的ポリヌクレオチドからシグナルとして役立つところの独立して検出可能な種を生産することが許容される。プライマーの３'−末端に相補的ヌクレオチド種の添加は、ＤＮＡポリメラーゼ自身に関連し得る３'→５'エキソヌクレアーゼの反応によるその分解により引き続かれる。本質的にヌクレオチド種である相補的鎖の合成および分解は、一つもしくはそれ以上の回数で繰り返されて、サイクリングアッセイを成し遂げる。

上で説明した方法において、ポリメラーゼ反応はさらに、標識ポリホスフェート生成物を検出可能な標識へ転化するところのアルカリ性ホスファターゼのような、ホスファターゼの存在下で実施され得る。それ自体で、検出可能種の形成の連続的な、リアルタイムのモニタリングを可能とする便利なアッセイが、核酸を検出して、特徴づけするために確立される。これは、その中で単一の管の中で実施できる均一系アッセイフォーマットを表す。

ポリホスフェート鎖中に四つもしくはそれ以上のホスフェートを有する末端ホスフェート−標識ヌクレオチドを含む実施態様において、ホスホリル転移の標識ポリホスフェート副産物は、ホスファターゼ処置の使用無しに検出され得ることは本発明の意図の内にあることが注目される。例えば、天然もしくは修飾ヌクレオシド塩基、特にグアニン、は蛍光マーカーの失活を引き起こすことができることは公知である。それ故に、末端ホスフェート標識ヌクレオチドにおいては、標識は、塩基により部分的に失活させられ得る。ヌクレオシド一リン酸の組み込みで、標識ポリホスフェート副産物は、その強化された蛍光により検出され得る。これに代えて、標識ポリホスフェート生成物を、蛍光、色、化学発光もしくは電気化学的検出による同定の前にクロマトグラフ的分離方法により物理的に分離することが可能である。加えて、質量スペクトル法を用いて、質量の相違により生成物を検出できるかもしれない。

検出可能の種を、標的核酸配列の量に実質的に比例する量で生産し得て、それ自体で、標的核酸の量に対するシグナルである。本明細書中で説明された方法はさらに、反応の間に生産された検出可能の種の量に基づいて標的核酸配列を定量化する工程を含み得る。標的核酸配列を定量化する工程は、検出可能の種により作製されたスペクトルと既知の標的量との比較により行うように望まれる。

本発明においては、一旦ハイブリダイズされると、オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型ヌクレオチド配列に比して少なくとも同一なモル量で定量的に反応が進行することを可能とするように、繰り返して機能することができる。本発明の方法で有用なオリゴヌクレオチドプライマーの量は、好都合なハイブリダイゼーションを達成するのに十分なものであるべきである。一般に、高感度アッセイは、検出の意図する範囲に比して少なくとも同一なモル量で、望ましくは５倍過剰にあるプライマーの存在により達成されることができる。

本発明により提供される方法はさらに、ＤＮＡポリメラーゼ反応において一つもしくはそれ以上のさらに別な検出試薬を含む工程を含み得る。さらに別な検出試薬は、検出可能な種から検出的に異なるところの応答の能力があり得る。例えば、さらに別な検出試薬は抗体であり得る。

本発明の標的核酸には、限定するものではないが、染色体ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ウイルス−もしくはｍＲＮＡ−誘導化ｃＤＮＡ、または天然のオリゴヌクレオチドが含まれる。

本発明の方法は一般的に、興味のある領域中における標的核酸配列の知識を必要とする。例えば、興味のある領域は、点突然変異を含むと疑われるその領域であり得る。既知の標的配列以外の核酸配列からの汚染の最小化は、本発明における増幅のために望ましい。

本発明の方法およびキットにおいて有用な末端−ホスフェート−標識ヌクレオチドは、式Ｉ：

[式中、Ｐ＝ホスフェート(ＰＯ_３)およびその誘導体、ｎは２もしくはそれより大であり；Ｙは酸素もしくは硫黄原子であり；Ｂは窒素含有の複素環式塩基であり；Ｓは非環式部分、炭素環式部分もしくは糖部分であり；Ｌは、天然または修飾ヌクレオチドの末端ホスフェートにおいてリン酸エステル、チオエステルもしくはホスホラミデート結合を形成するのに適当なヒドロキシル基、スルフヒドリル基またはアミノ基を含む酵素で活性化可能な標識であり；Ｐ−Ｌは、ホスフェートが除去されるときに、好ましくは独立して検出可能になるところのリン酸化標識である]
により表され得る。

本発明の方法の目的には、有用な炭素環式部分は、Ferraro, M. and Gotor, V. in Chem Rev. 2000, volume 100, 4319-48、により記載されている。適当な糖部分は、Joeng, L.S. et al., in J Med. Chem. 1993, vol. 356, 2627-38; by Kim H.O. et al., in J Med. Chem. 193, vol. 36, 30-7; and by Eschenmosser A., in Science 1999, vol. 284, 2118-2124、により記載されている。さらに、有用な非環式部分は、Martinez, C.I., et al., in Nucleic Acids Research 1999, vol. 27, 1271-1274; by Martinez, C.I., et al., in Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 1997, vol. 7, 3013-3016;およびTrainer, G.Lへの米国特許第５,５５８,９１号、により記載されている。これらの部分の構造は下に示されるが、そこでは、全ての部分について、ＲはＨ、ＯＨ、ＮＨＲ、低級アルキルおよびアリ−ルであり得て；糖部分について、ＸおよびＹは独立してＯ、ＳもしくはＮＨであり；そして非環式部分について、Ｘ＝Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＮＲである。

炭素環式部分

糖部分

非環式部分

特定の実施態様において、糖部分は、以下：リボシル、２'−デオキシリボシル、３'−デオキシリボシル、２',３'−ジデオキシリボシル、２',３'−ジデヒドロジデオキシリボシル、２'−アルコキシリボシル、２'−アジドリボシル、２'−アミノリボシル、２'−フルオロリボシル、２'−メルカプトリボシル、２'−アルキルチオリボシル、炭素環式、非環式および他の修飾糖、から選択され得る。

さらに、上の式Ｉにおいて、塩基には、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニン、７−デアザグアニン、ヒポキサンチン、７−デアザヒポキサンチン、アデニン、７−デアザアデニン、２，６−ジアミノプリンもしくはそれらの類似体が含まれる。

ヌクレオチドの末端−ホスフェート位置に付加した酵素で活性化可能な標識は、１,２−ジオキセタン化学発光化合物、蛍光原色素、発色性色素、質量タグ、電気化学的タグおよびそれらの組むあわせから選択され得る。これは、検出可能な種を、色、蛍光放射、化学発光もしくはそれらの組み合わせのいずれか一つの存在により、検出可能にさせる。

酵素で活性化可能な標識はまた、検出可能なシグナルの生産をもたらすところのさらに別な化学もしくは酵素反応のための基質となる、化学部分であり得る。

上の式Ｉに示されたリン酸化標識が蛍光原部分であるところでは、それは、以下の例(それらのリン酸エステルとして示される)の一つから望ましくは選択される：ＥＬＦ９７の商品名(Molecular Probes, Inc.)で発売される、２−(５'−クロロ−２'−ホスホリルオキシフェニル)−６−クロロ−４−(３Ｈ)−キナゾリノン、二リン酸フルオレセイン、フルオレセイン３'(６')−Ｏ−アルキル−６'(３')−リン酸、９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル)リン酸、リン酸４−メチルウンベリフェリル、リン酸レゾルフィン、リン酸４−トリフルオロメチルウンベリフェリル、リン酸ウンベリフェリル、リン酸３−シアノウンベリフェリル、リン酸９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イルおよびリン酸６,８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルである。これらの色素の構造は以下に示される：

２−(５'−クロロ−２'−ホスホリルオキシフェニル)−６−クロロ−４−(３Ｈ)−キナゾリノン

二リン酸フルオレセインフルオレセイン３'(６')−Ｏ−アルキル−６'(３')−リン酸

９Ｈ−(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル)リン酸(ジアンモニウム塩)

リン酸４−メチルウンベリフェリル

リン酸６,８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリル

リン酸４−トリフルオロメチルウンベリフェリル

リン酸ウンベリフェリル

リン酸３−シアノウンベリフェリル

リン酸レゾルフィン

リン酸９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル

上の式Ｉに示されたリン酸化標識が発色性部分であるところでは、それは、以下の部分(リン酸エステルとして示される)から選択される：リン酸５−ブロモ−４クロロ−３−インドリル、リン酸３−インドリル、リン酸ｐ−ニトロフェニルおよびそれらの誘導体。これらの発色性色素の構造は、以下に示される。

リン酸５−ブロモ−４クロロ−３−インドリル(二ナトリウム塩)

リン酸３−インドリル(二ナトリウム塩)

リン酸ｐ−ニトロフェニル

末端ホスフェート位置における部分はさらに、アルカリ性ホスファターゼ活性化１,２−ジオキセタン化合物であることが望まれる、化学発光化合物であり得る。１,２−ジオキセタン化合物のリン酸エステルには、限定するものではないが、ＣＤＰ−Starの商品名(Tropix, Inc., Bedford, MA)で発売される、リン酸２−クロロ−５−(４−メトキシスピロ[１,２−ジオキセタン−３,２'−(５−クロロ−)トリシクロ[３,３,１−１^３,７]−デカン]−１−イル)−１−フェニル二ナトリウム、ＣＳＰＤの商品名(Tropix)で発売される、クロロアダマント−２'−イリデンメトキシフェノキシリン酸化ジオキセタン、ＡＭＰＰＤの商品名(Tropix)で発売される、３−(２'−スピロアダマンタン)−４−メトキシ−４−(３''−ホスホリルオキシ)フェニル−１,２−ジオキセタンが含まれる。これらの市販のジオキセタン化合物の構造は、米国特許第5,582,980号、第5,112,960号および第4,978,614号に、それぞれ、開示されていて、以下に示される。

リン酸２−クロロ−５−(４−メトキシスピロ[１,２−ジオキセタン−３,２'−(５−クロロ−)トリシクロ[３,３,１−１^３,７]−デカン]−１−イル)−１−フェニル二ナトリウム

クロロアダマント−２'−イリデンメトキシフェノキシリン酸化ジオキセタン

３−(２'−スピロアダマンタン)−４−メトキシ−４−(３''−ホスホリルオキシ)フェニル−１,２−ジオキセタン

本発明の方法において、非−加水分解可能なプライマーは、システム中に存在する３'→５'エキソヌクレアーゼによるその分解を防止するために、ヌクレアーゼに耐性でなければならない。上で説明したように、３'→５'エキソヌクレアーゼ活性は、ＤＮＡポリメラーゼ自身に関連し得る。本発明に使用のための適当なＤＮＡポリメラーゼには、限定するものではないが、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Thermo Sequenase (Amersham Biosciences Corporation)、Amplitaq FS (Applied Biosystems)、逆転写酵素およびＴ７ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。

ヌクレアーゼに耐性なオリゴヌクレオチドプライマーを合成する方法は、特に限定するものではなくて、当分野で公知の任意の適当な方法が使用され得る。例えば、本発明により提供される方法の一つの実施態様において、非−加水分解可能なプライマーは、３'−最リン酸ジエステル結合末端においてホスホロチオエート化される。プライマーの標識部位の中にホスホロチオエート結合を導入することによりヌクレアーゼに耐性を有するオリゴヌクレオチドプライマーを化学的に合成する方法は周知である。一つの方法において、プライマーは、ヨウ素水による普通の酸化工程が、ホスホロチオエート結合が普通のリン酸ジエステル結合の代わりに導入され得るように、ホスホロチオエート化に適当な試薬による酸化処置で取り替えられる、修飾ホスホラミダイト方法を用いて化学的に合成され得る。ホスホロチオエート化用の一つの適当な試薬は、Beaucageの試薬(３Ｈ−１,２−ベンゾジチオール−３−オン１,１−ジオキシド)である。この方法は、３'−最リン酸ジエステル結合においてを含んで、任意の選ばれた部位においてプライマーの中にホスホロチオエート結合を導入するために使用されることができる。

分析時間の前にホスホロチオエート結合を持つオリゴヌクレオチドプライマーを作成する代わりの手段は、α−位置の酸素原子が硫黄により置換されている、ヌクレオチド類似体のＤＮＡポリメラーゼの組み込みを介するものである。そのような置換化合物は、α−Ｓ−デオキシヌクレオチド三リン酸として言われる。ＤＮＡポリメラーゼは、デオキシヌクレオチド三リン酸の代わりに硫黄−置換類似体を組み込んで、ヌクレアーゼ耐性を含有するホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチドプライマーを与えることができる。

何れにせよ、オリゴヌクレオチドプライマーの３'−末端の近辺においてリン酸ジエステル結合の代わりのホスホロチオエート結合の存在は、３'−末端側から切断するエキソヌクレアーゼに対する抵抗をプライマーの部分上に付与する。オリゴヌクレオチドプライマーは、単一のホスホロチオエート結合の導入により十分に非−加水分解可能である。

緩衝液、ｐＨおよび温度のような反応条件は、十分なハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼならびにホスファターゼの活性を獲得するように選択されるべきである。ハイブリダイゼーションに適当な温度は、オリゴヌクレオチドプライマーおよび標的配列の間の相同性に依存するが、約２０℃〜約６０℃の範囲にあると期待される。ｐＨ値はトリス−ＨＣｌ緩衝液のような適当な緩衝液中で約７〜約９の範囲にあるのが望ましい。

下に実施例で示すように、標的核酸試料を、プライマーを含有しかつマグネシウムを含有する緩衝溶液中で約５分間、＞９０℃において加熱することにより先ず変性し、続けて適当な温度において十分な時間、通常約１０分、の間ハイブリダイゼーションを行わねばならない。ハイブリダイゼーション工程は、対応する基質の存在下において、適当なＤＮＡポリメラーゼと関連し得るところのＤＮＡポリメラーゼである、３'→５'エキソヌクレアーゼ、およびホスファターゼとの２０〜７０℃における酵素処置により直ちに引き継がれ得る。

本発明は、ハイブリダイゼーション工程に引き続いて、少なくとも一つの末端−ホスフェート−標識デオキシヌクレオチドポリリン酸、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレアーゼ(ポリメラーゼと関連し得るところの)およびホスファターゼを、プライマーの３'−末端の次に位置してかつ標的核酸に相補的なヌクレオチドが組み込まれるように、システムに加えて、引き続きその分解ならびに標的核酸からのシグナルとして働くところの検出可能の種の検出、一回もしくはそれ以上繰り返される相補的な鎖の合成と分解を行って、シグナルの増幅のためのサイクリングアッセイを成し遂げることを特徴とする。

単一の末端−ホスフェート−標識ヌクレオチドが存在する、そして、別に、全ての四つのタイプの末端−ホスフェート−標識ヌクレオチドが存在する、本発明の実施態様を例示することは有益であろう。

プローブは、試験されている特定の塩基にすぐ隣接した塩基に反対の３'−末端を持つ標的核酸にハイブリダイズされるようになる。我々は、例を介して、その上に星印を持つ塩基が点突然変異を表すところの標的配列を考えることができる。

プライマーは以下の配列を有する：
^3'TTGGTAG^5'
ハイブリッドは以下のように形成され得る。

一つのフォーマットにおいて、末端−ホスフェート−標識ジデオキシグアノシンポリリン酸が、本発明の方法のＤＮＡポリメラーゼ反応に、いかなる他のヌクレオチド無しに用いられ、そして一つのケースにおいて、しかし、組み込まれたヌクレオチドが下線で示される、下記の他のものではなく、組み込まれるであろう。

それ故に、Ｃ点突然変異は、アルカリ性−ホスファターゼ−耐性グアノシンヌクレオチド類似体の組み込みの間に付随して形成されるところの標識ポリホスフェート副産物のホスファターゼ消化にしたがって形成される検出可能の種の存在により分析の間に確認され得る。標的配列中のＴ点突然変異を確認するためには、末端−ホスフェート−標識アデニンを検出可能の種の生産についての別な分析の間に加え得る。上で説明したように、数回繰り返される相補的な鎖の合成および分解は、シグナルの増幅を成し遂げる。

代わりのフォーマットは、それにより任意の点突然変異が単一の分析の間に確認され得る手段を提供する。このフォーマットにおいては、全ての四つのタイプの末端−ホスフェート−標識ヌクレオチドが存在して(例えば、アデノシンポリリン酸、グアノシンポリリン酸、チミジンポリリン酸およびシチジンポリリン酸)、それぞれが独特な色素もしくは標識に結合し、そしてそれぞれが末端−ホスフェート−標識ジデオキシヌクレオチド三リン酸のような非−拡張可能なヌクレオチドである。一つの態様において、末端−ホスフェート−標識ヌクレオチドは、標的の特定の塩基の反対に組み込まれる。しかしながら、非−拡張可能なヌクレオチドを使用する代案として、拡張の長さが使用されるヌクレオチドを持つポリメラーゼより多いエキソヌクレアーゼの存在により限定されるという条件で、非−末端にあるヌクレオチドがまた使用されるかもしれない。本発明の方法と通して使用される末端−ホスフェート−標識ヌクレオチドはホスファターゼに耐性であることはさらなる態様である；すなわち、生成物として放出される標識ポリホスフェートのみが、ホスファターゼに対する基質として働いて、検出可能の種を生成する。全ての四つのタイプの末端−ホスフェート−標識ヌクレオチドを用いるアッセイフォーマットにおいては、非−加水分解可能なプライマーの３'−末端に隣接するヌクレオチドの個性は、独特な色、蛍光放射、化学発光もしくは検出可能の種から得られる他のシグナルから演繹され得る。

増幅反応がポリメラーゼおよび一本鎖ヌクレアーゼ(ポリメラーゼもしくは別の酵素の生来の性質であるかもしれないところの)を用いて実施されるかもしれないことは、本発明の意図内に十分にある。反応は熱的にサイクルされて、低温の間にポリメラーゼによるプライマーの拡張および高温の間にヌクレアーゼによる添加塩基の除去をさせる。これは、使用者が増幅の量を、それは実施される熱サイクルの数に依存するであろうので、制御することをさせるであろう。

(実施例)
実施例１
δ−９Ｈ(１,３−ジクロロ−９,９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル)−ジデオキシチミジン−５'−四リン酸(ｄｄＴ４Ｐ−ＤＤＡＯ)の作成
ｄｄＴＴＰ(８０ｍＭ溶液１００μｌ)を無水のジメチルホルムアミド(ＤＭＦ、２×１ｍｌ)と共に共蒸発した。これに、ジシクロヘキシルカルボジイミド(８.３ｍｇ、５当量)を加えて、混合液を再び無水のＤＭＦ(１ｍｌ)と共に共蒸発した。残渣を無水のＤＭＦ(１ｍｌ)中に取って、反応液を終夜室温で攪拌した。ＨＰＬＣはほとんど環化したトリホスフェート(約８２％)を示した。反応混合液を濃縮して、残渣を無水のジエチルエーテルで３回洗浄した。それを無水のＤＭＦ中に再溶解して、ロータリーエバポレーター上で濃縮乾固した。残渣を無水のＤＭＦ２００μｌ中のＤＤＡＯ−一リン酸、アンモニウム塩(５ｍｇ、１.５当量)と共に取って、週末にかけて４０℃で攪拌した。ＨＰＬＣは、１１.９６分に望ましいＵＶ特色を持つ新しい生成物の形成を示した。(ＨＰＬＣ方法：１５分間で０.１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム(ｐＨ７)中の０〜３０％アセトニトリル、５分間で３０〜５０％アセトニトリル、NovapakＣ１８３.９×１５０ｍｍカラム、１ｍｌ／分)。ＬＣＭＳ(ＥＳ−)はまた、Ｍ−１ピークとして主要質量ピーク８３４を示した。反応混合液を濃縮して、DeltapakＣ１８１９×３００ｍｍカラム上で０.１ＭＴＥＡＢ(ｐＨ６.７)およびアセトニトリルを用いて精製した。生成物を持つフラクションを上で説明したのと同一の方法を用いるＨＰＬＣにより再精製した。純粋な生成物を持つフラクションを濃縮して、ＭｅＯＨ(２回)および水(１回)と共に共蒸発した。残渣を水(１.２ｍｌ)中に溶解すると、１.２３ｍＭの溶液を与えた。ＨＰＬＣ純度：２５４ｎｍにおいて＞９７.５％、４５５ｎｍにおいて＞９６％；ＵＶλ_Ａ＝２６７ｎｍおよび４５５ｎｍ；ＭＳ：Ｍ−１＝８３４.０４(計算値８３３.９５)。

実施例２
γ−(７−ヒドロキシ−３Ｈ−フェノキサジン−３−オン)ｄｄＧＴＰ(γ−レゾルフィン−ｄｄＧＴＰ)の作成
ｄｄＧＴＰ(８６.７ｍＭ溶液１２５μｌ、１０.８μmol)を無水のＤＭＦ(３×０.２５ｍｌ)と共に共蒸発した。これに、ＤＣＣ(５当量)を加えて、混合液を再び無水のＤＭＦ(０.２５ｍｌ)と共に共蒸発した。残渣を無水のＤＭＦ(１ｍｌ)中に取って、反応液を室温で週末にかけて攪拌した。レゾルフィン(２０当量)を無水のＤＭＦ(２×１ｍｌ)と共に共蒸発して、上の環化工程からのｄｄＧＴＰトリメタリン酸に引き続いてトリエチルアミン２０当量を加えた。２週間後に、反応混合液をロータリーエバポレーター上で濃縮し、そして残渣を水(３×１ｍｌ)で抽出して、ろ過した。ろ液を、Xterra ＲＰＣ１８(１９×１００ｍｍ)カラム上で、０.１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム(ｐＨ６.７)中の０〜３０％アセトニトリルを５カラム容積でおよび３０〜５０％アセトニトリルを１カラム容積で用いて精製した。純粋なフラクションをロータリーエバポレーター上で濃縮して、メタノール(２×５ｍｌ)と共に共蒸発した。残渣を水(１.５ｍｌ)中に溶解すると、０.５ｍＭの溶液を与えた。ＨＰＬＣ純度：２６０ｎｍにおいて＞９８％、４７０ｎｍにおいて＞９７.５％；ＵＶ／ＶＩＳ＝２５１および４７２ｎｍ；ＭＳ：Ｍ−１＝６８５.１０(計算値６８５.０３)。

実施例３
末端−ホスフェート上に蛍光原色素で標識したヌクレオチドの組み込みにより生成したシグナルを増幅するためにエキソヌクレアーゼＩＩＩの使用
２５ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８.０、５ｍＭＭｇＣｌ_２、０.５ｍＭＭｎＳＯ_４、４０ピコモルのｄｄＴ４Ｐ−ＤＤＡＯ(ＤＤＡＯ−δ−２',３'−ジデオキシチミジン−５'−四リン酸)、５ピコモルのプライマー(５'ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴ＊Ａ３'(配列番号１)[式中、＊はホスホロチオエート結合である]および１０ピコモルの鋳型(５'ＧＴＣＧＴＴＡＴＡＣＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＣＴＧＧＧＡＡＡＡ＊ｄｄＣ３'(配列番号２)[式中、＊はホスホロチオエート結合であり、ｄｄＣは末端ジデオキシヌクレオチドを示す])を含有する反応液５０μｌを、４分間７５℃で加熱することによりアニールして、２１℃に冷却した。今や図２を参照して、この反応液に以下を加えた：エビアルカリ性ホスファターゼ０.１５単位およびエキソヌクレアーゼＩＩＩ(四角)０.５単位もしくはエビアルカリ性ホスファターゼ０.１５単位、エキソヌクレアーゼＩＩＩ０.５単位ならびにThermo Sequenase(円)１６単位である。第三の反応混合液に、エビアルカリ性ホスファターゼ０.１５単位およびThermo Sequenase１６単位を加えて、次いで１０分後に (三角)を加えた。６１２ｎｍにおける励起および６７０ｎｍにおける放射により時間ドライブモードで運転される、ＬＳ−５５ルミネセンス分光計(Perkin Elmer)の中の石英蛍光超微小キュベット中で、反応液を室温でインキュベートした。放射は任意の単位で表示される。

図２に示されるように、ポリメラーゼの無い反応混合液からは蛍光放射は何も得られなかった。さらに、図２に示されるように、シグナルの増幅は、反応混合液中にエキソヌクレアーゼＩＩＩおよびポリメラーゼの両方が存在するときにのみ得られた。

実施例４
末端−ホスフェート上に配列特異性を持つ蛍光原色素で標識したヌクレオチドの配列特異的組み込みにより生成したシグナルを増幅するためにエキソヌクレアーゼＩＩＩの使用
図３Ａを参照して、アッセイを実施して、鋳型中のデオキシシチジン(Ｃ)の存在を決定した。図３Ａに示されたそれぞれの結果について、２５ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８.０、５ｍＭＭｇＣｌ_２、０.５ｍＭＭｎＳＯ_４、４０ピコモルのｄｄＧ３Ｐ−レゾルフィン(レゾルフィン−δ−２',３'−ジデオキシグアノシン−５'−三リン酸)、５ピコモルのプライマー(５'ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴ＊Ａ３'(配列番号１)[式中、＊はホスホロチオエート結合である]および１０ピコモルの鋳型(５'ＧＴＣＧＴＴＡＴＡＣＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＣＴＧＧＧＡＡＡＡ＊ｄｄＣ３'(配列番号３)[式中、＊はホスホロチオエート結合であり、ｄｄＣは末端ジデオキシヌクレオチドを示す])を含有する反応液５０μｌを、４分間７５℃で加熱することによりアニールして、２１℃に冷却した。かくして、図３Ａについて、プライマー／鋳型の組合せは：
５' ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡ (配列番号１)
ｄｄＣＡＡＡＡＧＧＧＴＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＡＣＡＴＣＴＴＧＣＴＧ (配列番号３)
であった。

これに、エビアルカリ性ホスファターゼ０.１５単位およびThermo SequenaseＤＮＡポリメラーゼ１６単位を加えて、エキソヌクレアーゼＩＩＩを指示のようにを加えた。反応液を２１℃で４０分間インキュベートした。インキュベーション後に、２５μｌを９６穴のプレートに取り去り、そして５３０ｎｍの励起および５９０ｎｍの放射フィルターを持つTecan ULTRAプレートリ−ダー中で、蛍光を測定した。蛍光放射は任意の単位で表示される。

今や図３Ｂを参照して、アッセイを実施して、鋳型中のデオキシチミジン(Ｔ)の存在を決定した。図３Ｂに示されたそれぞれの結果について、２５ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８.０、５ｍＭＭｇＣｌ_２、０.５ｍＭＭｎＳＯ_４、４０ピコモルのｄｄＴ４Ｐ−ＤＤＡＯ(ＤＤＡＯ−δ−２',３'−ジデオキシチミジン−５'−四リン酸)、５ピコモルのプライマー(５'ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴ＊Ａ３'(配列番号１)[式中、＊はホスホロチオエート結合である])および１０ピコモルの鋳型(５'ＧＴＣＧＴＴＡＴＡＣＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＣＴＧＧＧＡＡＡＡ＊ｄｄＣ３'(配列番号３)[式中、＊はホスホロチオエート結合であり、ｄｄＣは末端ジデオキシヌクレオチドを示す])を含有する反応液５０μｌを、４分間７５℃で加熱することによりアニールして、２１℃に冷却した。かくして、プライマー／鋳型の組合せは：
５' ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡ (配列番号１)
ｄｄＣＡＡＡＡＧＧＧＴＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＡＣＡＴＣＴＴＧＣＴＧ (配列番号２)
であった。

これに、エビアルカリ性ホスファターゼ０.１５単位およびThermo SequenaseＤＮＡポリメラーゼ１６単位を加えて、エキソヌクレアーゼＩＩＩを指示のようにを加えた。反応液を２１℃で４０分間インキュベートした。インキュベーション後に、２５μｌを９６穴のプレートに取り去り、そして６１２ｎｍの励起および６７０ｎｍの放射フィルターを持つTecan ULTRAプレートリ−ダー中で、蛍光を測定した。蛍光放射は任意の単位で表示される。

図３Ａに示すように、末端−ホスフェート−標識ジデオキシグアノシン三リン酸色素を含有する反応液については、プライマー−鋳型組合せについて蛍光放射を検出したが、そこでは鋳型中の次のヌクレオチドはｄＣであった。図３Ｂを参照して、末端−ホスフェート−標識ジデオキシチミジン四リン酸を含有する反応液については、プライマー−鋳型組合せについて蛍光放射を検出したが、そこでは鋳型中の次のヌクレオチドはｄＡであった。エビアルカリ性ホスファターゼによるホスホリル転移のピロホスフェート生成物の開裂は、核酸の検出、シグナルの増幅を成し遂げるために数回繰り返される相補的な標識ヌクレオチド合成および分解を可能とするレゾルフィンもしくはＤＤＡＯ標識中の検出可能な変化に至る。

本明細書に本発明の特別な、望ましい態様を説明しているので、本発明の意図する範囲から逸脱すること無しにここを通して修飾を成し得ることは、認識されるべきである。本発明の真の範囲は、本明細書に添付される特許請求の範囲に示される。

図１は、標的ポリヌクレオチドに配列で相補的である末端−ホスフェート−標識ヌクレオチドがヌクレアーゼ−抵抗性プライマーの３'末端に結合されて、引き続きその分解により、ヌクレオチド組み込みの標識ポリホスフェート副産物がアルカリ性ホスファターゼと反応して、検出可能な種を生産するところのサイクリングアッセイを成し遂げる、本発明の方法の態様を示す。図２は、蛍光原色素で末端ホスフェート上に標識したヌクレオチドの組み込みにより作成されたシグナルを増幅するために５'→３'エキソヌクレアーゼの使用により得られた蛍光放射対時間のグラフである。図３(ＡおよびＢ)は、蛍光原色素で末端ホスフェート上に標識したヌクレオチドの配列特異的組み込みにより作成されたシグナルを増幅するために５'→３'エキソヌクレアーゼの使用により得られた蛍光放射のバーグラフを示す。

Claims

核酸試料を検出する方法であって、当該方法が、
（ａ）鋳型と、非加水分解性プライマーと、１種以上の末端ホスフェート標識ヌクレオチドと、ＤＮＡポリメラーゼと、ホスファターゼと、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素であってＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ及びそれらの組合せから選択し得る酵素との反応を含むＤＮＡポリメラーゼ反応であって標識ポリホスフェートを生じるＤＮＡポリメラーゼ反応を実施し、
（ｂ）上記標識ポリホスフェートをホスファターゼと反応させて、検出可能な種を生じさせ、
（ｃ）上記検出可能な種を検出する
ことを含み、上記末端ホスフェート標識ヌクレオチドが次の式Ｉのものである、方法。

式中、Ｐ＝ホスフェート（ＰＯ₃）及びその誘導体であり、ｎは３以上であってポリホスフェート鎖中に４つ以上のホスフェート基を含んでおり、Ｙは酸素又は硫黄原子であり、Ｂは窒素含有複素環式塩基であり、Ｓは非環式部分、炭素環式部分又は糖部分であり、Ｌは、天然又は修飾ヌクレオチドの末端ホスフェートにリン酸エステル、チオエステル又はホスホラミデート結合を形成するのに適当なヒドロキシル基、スルフヒドリル基又はアミノ基を含む酵素で活性化可能な標識であり、Ｐ−Ｌは、ホスフェートが除去されたときに、独立して検出可能になるリン酸化標識である。
前記糖部分が２’,３’−ジデオキシリボシルである、請求項１記載の方法。
核酸試料を特徴づけする方法であって、当該方法が、
（ａ）鋳型と、非加水分解性プライマーと、１種以上の末端ホスフェート標識ヌクレオチドと、ＤＮＡポリメラーゼと、ホスファターゼと、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素であってＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ及びそれらの組合せから選択し得る酵素との反応を含むＤＮＡポリメラーゼ反応であって標識ポリホスフェートを生じるＤＮＡポリメラーゼ反応を実施し、
（ｂ）上記標識ポリホスフェートをホスファターゼと反応させて、上記試料に特徴的な検出可能な種を生じさせ、
（ｃ）上記検出可能な種を検出し、
（ｄ）上記検出に基づいて上記核酸を特徴づけする
ことを含み、上記末端ホスフェート標識ヌクレオチドが次の式Ｉのものである、方法。

式中、Ｐ＝ホスフェート（ＰＯ₃）及びその誘導体であり、ｎは３以上であってポリホスフェート鎖中に４つ以上のホスフェート基を含んでおり、Ｙは酸素又は硫黄原子であり、Ｂは窒素含有複素環式塩基であり、Ｓは非環式部分、炭素環式部分又は糖部分であり、Ｌは、天然又は修飾ヌクレオチドの末端ホスフェートにリン酸エステル、チオエステル又はホスホラミデート結合を形成するのに適当なヒドロキシル基、スルフヒドリル基又はアミノ基を含む酵素で活性化可能な標識であり、Ｐ−Ｌは、ホスフェートが除去されたときに、独立して検出可能になるリン酸化標識である。
工程（ａ）が、別個の標識を有する２種以上の末端ホスフェート標識ヌクレオチドの存在下で前記ポリメラーゼ反応を実施することをさらに含む、請求項３記載の方法。
前記糖部分が２’,３’−ジデオキシリボシルである、請求項３記載の方法。
請求項３記載の方法において、工程（ｂ）で独特なシグナルプロフィールを有する検出可能な種を生じさせ、工程（ｄ）で前記検出可能な種の存在又は不存在及び上記独特なシグナルプロフィールに基づいて前記核酸における突然変異を特徴づけ、もって標的核酸配列中の特異的ヌクレオチド塩基の突然変異を検出する方法。