JP2004502701A - 塩基類似体 - Google Patents
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Abstract
Description
(序言)
本発明は、新規化合物、例えば、広範な種々の分子生物学の応用に用いることができる核酸を標識化するために用いることができる、修飾した塩基類似体、に関する。
【0002】
(背景技術)
レポーター基で標識化された核酸分子は、シークエンシングおよびハイブリダイゼーション研究のような多くの分子生物学技法に用いられている。標識化された核酸分子は種々の方法により生成されている。これらの方法としては、ヌクレオシド、デオキシヌクレオシドもしくはジデオキシヌクレオシドのトリホスフェートの標識化、ホスホルアミダイトの標識化および標識の核酸への直接結合が挙げられる(Renz、EP 120376)。生成した標識化ヌクレオチドおよび標識化核酸分子は、核酸のハイブリダイゼーション研究および核酸のシークエンシングに用いることができる。これらの技法には、例えば3H、14C、32P、33Pおよび35Sの放射性同位元素、ハプテン、ビオチン、質量標識もしくは蛍光を含む、広範な種々の標識が用いられている。
【0003】
核酸の標識化において、修飾した塩基またはヌクレオチド類似体の使用に益々興味がもたれている。これらの類似体の幾らかは、塩基特異的でありそして単一の天然塩基、即ちA、T、GもしくはC、の代わりに核酸中に組み込まれ得る。他の類似体は、一つ以上の天然塩基と塩基対になりこの故に一つ以上の天然塩基の代わりに組み込まれる潜在性を有する。
【0004】
WO 97/28177は以下の構造式を含むヌクレオシド類似体を開示するが:
【化4】
式中、XはO、S、Se、SO、COもしくはNR7であり、
R1、R2、R3およびR4は同一もしくは異なりかつそれぞれがH、OH、F、NH2、N3、O−ヒドロカルビルもしくはレポーター基であり、
R5はOHまたはモノ−、ジ−もしくはトリ−ホスフェートまたはチオホスフェートまたは対応するボラノホスフェートであり、
またはR2およびR5の一つはホスホルアミダイトであり、
ZはO、S、Se、SO、NR9もしくはCH2であり、
そして、R6、R7、R8およびR9は同一もしくは異なりかつそれぞれがH、アルキル、アリールもしくはレポーター基である。
【0005】
WO 99/06422は以下の構造式を含む塩基類似体を開示するが:
【化5】
式中、XはOもしくはNRもしくはSであり、
YはNまたはCHR6もしくはCR6であり、
WはNもしくはNR6またはCHR6もしくはCR6であり、
nは1もしくは2であり、
それぞれのR6は独立してHもしくはOまたはアルキルもしくはアルケニルまたはアルコキシもしくはアリールまたはレポーター部分であるが、
そこでは、必要により(即ち、Yおよび/もしくはWがNもしくはCR6であるとき)、二重結合がYおよびWもしくはWおよびWの間に存在し、
そしてQは糖もしくは糖類似体である。
【0006】
(本発明の概要)
本発明は、下記の式の新規化合物を記載するが:
【化6】
式(I)
式中、QはHまたは糖もしくは糖類似体または核酸バックボーンもしくはバックボーン類似体であり、YはO、SまたはNR10(式中、R10はH、アルキル、アルケニルもしくはアルキニルである)、XはH、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリールもしくはそれらの組合せまたは、好ましくは、レポーター基である。
【0007】
(発明の詳細な説明)
第一の態様において、本発明は、式(I)の新規化合物を提供するが、式中、QはHまたは糖もしくは糖類似体または核酸バックボーンもしくはバックボーン類似体であり、YはO、SまたはNR10(式中、R10はH、アルキル、アルケニルもしくはアルキニルである)、XはH、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリールもしくはそれらの組合せまたは、好ましくは、レポーター基である。このレポーター基は、Xについて既に定義したオプションと同様であり得るかもしくはより大きくてもよい、適切なリンカーアームを介して複素環に結合してもよい。この態様において、適切には、Xは、30個の原子まで、さらに好ましくは12個の原子までの鎖を含むことができる。レポーターは12個の原子以上を含んでもよい。Xはまた、ヌクレオチド塩基に正味の正もしくは負の電荷を付与する、荷電した基を含んでもよい。
【0008】
適切には、QはHまたは以下の置換基から選択してもよい:
(i)
【化7】
式中、ZはO、S、Se、SO、NR9(式中、R9はH、アルキル、アルケニル、アルキニルもしくはレポーター基である)またはCH2であり、
R1、R2、R3およびR4は同一もしくは異なりかつそれぞれがH、OH、F、NH2、N3、O−ヒドロカルビル、NHR11(式中、R11はH、アルキル、アルケニルもしくはアルキニルである)またはレポーター基である。適切には、ヒドロカルビル基は6炭素原子までを持つ。R11およびR9は30個の原子まで、さらに好ましくは12個の原子までの鎖を含んでもよい。
【0009】
R5はOH、SHもしくはNH2またはモノ−、ジ−もしくはトリ−ホスフェートまたはチオホスフェート、または対応するボラノホスフェートであり、またはR2、R4およびR5の一つはホスホルアミダイトもしくはポリヌクレオチド鎖に組込みのための他の基、またはレポーター基であり;
またはQは以下の修飾した糖構造式の一つであってもよい:
構造式(ii)もしくは(iii)を持つ非環式糖
【化8】
式中、R12はC1−C4アルキル、ヒドロキシC1−C4アルキルもしくはH、好ましくはメチル、ヒドロキシメチルもしくはHである、
または構造式(iv)〜(vi)を持つ糖
【化9】
【化10】
【化11】
上記の式中、R14はC1−C6アルキル、ヒドロキシC1−C6アルキル、C1−C6アルキルアミン、C1−C6カルボキシアルキルもしくは好ましくはレポーター部分である。
【0010】
(vii)すなわちQは、糖−ホスフェートの繰返し体もしくは修飾した糖−ホスフェートの繰返し体(例えばLNA)(Koshkin et al, 1998, Tetrahedron 54, 3607−30)からなる核酸バックボーンまたはペプチドもしくはポリアミド核酸(PNA)(Nielsen et al, 1991, Science 254, 1497−1500)またはポリカチオン系リボ核酸グアニジン(RNG)(Bruice et al, 1995 PNAS 92 6097)またはペントピラノシルオリゴヌクレオチド(HNA)(Eschenmosser A., 1999, Science, 284, 2118−2124)のようなバックボーン類似体である。
【0011】
一つの好ましい実施態様において、QがHであるときには、これらの化合物は塩基類似体である。第二の好ましい実施態様において、Qは、糖もしくは糖類似体または修飾した糖、例えば(i)〜(vi)に記載の構造式を持つ置換基、であり、そして化合物はヌクレオチド類似体もしくはヌクレオシド類似体である。Qが核酸バックボーンもしくはバックボーン類似体、(vii)、であるときには、これらの化合物を以後、核酸もしくはポリヌクレオチドと呼ぶ。
【0012】
Qが構造式(i)の置換基であるときには、R1、R2、R3およびR4はそれぞれがH、OH、F、NH2、N3、O−アルキルもしくはレポーター部分であってもよい。かくして、リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドおよびジデオキシリボヌクレオシドは他のヌクレオシド類似体と共にあると予測される。これらの糖置換基は、塩基上に存在し得るいずれかに加えてレポーター基を含んでもよい。好ましくは、R1はHであり、R2はH、OH、F、N3、NH2、NH(CH2)nR13もしくはO−(CH2)nNH2(式中、nは0〜12である)であり、R4はH、OH、N3、NH2、FもしくはO−R13であり、そしてR3はH、OHもしくはO−R13(式中、R13はアルキル、アルケニル、アルキニルもしくはレポーター基である)である。さらに好ましくは、少なくとも一つのR1およびR2ならびに少なくとも一つのR3およびR4はHである。
【0013】
R5はOH、SHもしくはNH2またはモノ−、ジ−もしくはトリ−ホスフェートまたはチオホスフェートまたは対応するボラノホスフェートである。R5がトリホスフェートであるときには、そのようなトリホスフェートヌクレオチドは、DNAポリメラーゼもしくは逆転写酵素ならびにdNTPおよび必要によりddNTPと共に適切な鋳型−プライマーを用いることによりポリヌクレオチド鎖中に組み込んでもよい。NTPは適切なRNAポリメラーゼと共に用いることができる。本発明の化合物は、標準技法を用いてPCR生成物中に組み込んでもよくまたは適切なRNA鋳型、プライマーdNTPミックスおよび逆転写酵素からのcDNAの生成に用いてもよい。オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド鎖はまた、ターミナルトランスフェラーゼを使用して本発明のクレオチド類似体により伸長し得る。
【0014】
これに代えて、R2、R4およびR5の一つは、ホスホルアミダイトまたはH−ホスホネートもしくはメチルホスホネートまたはホスホロチオエートもしくはアミドであってもよく、または、例えばヘミスクシネート−制御細孔ガラスのような固体表面への適当な連鎖であっても、またはポリヌクレオチド鎖中に、一般的には化学手段により、組み込むための他の基であってもよい。オリゴヌクレオチドを合成する際にホスホルアミダイトおよび関連誘導体の使用は周知でありかつ文献に記載されている。
【0015】
もう一つの好ましい実施態様において、定義したような塩基類似体を含む、ヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体を少なくとも一つのレポーター基で標識化する。適切なレポーター部分は種々のタイプのレポーターから選択し得る。レポーター基は、それによりヌクレオシド類似体が容易に検出されるようになる放射性同位元素、例えば、ホスフェートもしくはチオホスフェートまたはホスホルアミダイトもしくはH−ホスホネートに組み込まれた32Pもしくは33Pまたは35S、またはそれに代えて3Hもしくは14Cまたはヨウ素同位元素であってもよい。それは、質量分析法もしくはNMRにより検出可能な同位体であってもよい。それは、シグナル基もしくは部分、例えば酵素、ハプテン、蛍光体、化学体、化学発光基、ラマン標識もしくは電気化学的標識、であってもよい。特に好ましいレポーターは、フルオレセイン、ローダミン、ボディピーおよびシアニンのような蛍光性染料である。
【0016】
レポーター基は、シグナル基もしくは部分およびそれを分子の残余に結合させるリンカー基を含んでもよい。リンカー基は、30個までの炭素、窒素、酸素および硫黄原子の鎖であって、硬くもしくは柔軟で、飽和もしくは不飽和でもよい。そのようなリンカーは当業者に周知である。このリンカー基は、末端のもしくは他の基、例えば、NH2、OH、COOH、SH、マレイミド、ハロアセチル、またはそれによりシグナル部分が核酸鎖中にヌクレオシド類似体を組込む前後に取り付け得る他の基を持ってもよい。また、上述の適切なリンカー基を通して本発明の分子を固体表面に連結することが可能である。
【0017】
また、本発明の分子はそれら自身でレポーターとして作用し得ることが可能である。抗体は分子全体もしくは分子の一部分、例えば環構造もしくは修飾した糖に対し産生してもよい。抗体は、それら自身で標識を保持しているかもしくは技術上周知の方法により第二の抗体によって検出されることができる。これらの方法はしばしば酵素検出もしくは蛍光を用いる。
【0018】
この発明のクレオシド類似体は、ハプテン、蛍光体もしくは他のレポーター基で標識化した天然の核酸プローブを用いる、現存する応用のいずれかに使用することができる。これらには、ポリアクリルアミドもしくはアガロースゲルを基剤にする方法もしくは溶液ハイブリダイゼーションアッセイにおけるサザンブロットおよびドットブロットならびにマイクロタイタープレートもしくはチューブ中での他のアッセイまたは固体支持体上におけるアレイ上でのオリゴヌクレオチドもしくは核酸のアッセイが挙げられる。プローブは、類似体に取り付けたハプテンに対するか類似体自身に対するかのどちらかに標的化した抗体で検出され得る。抗体を酵素もしくは蛍光体で標識化することができる。
【0019】
もし塩基類似体それ自身が蛍光性であるかもし類似体に取り付けた蛍光性の基があるならば、蛍光性検出をまた使用し得る。
【0020】
異なる質量のヌクレオシド類似体の使用はまた、検出にならびにそれに特異的質量標識確認体を添加することにより用いられ得る。オリゴヌクレオチド、核酸断片およびプライマー伸長生成物の分析および検出のための方法は報告されている(US 5,288,644およびWO 94/16101)。これらの方法は通常MALDI ToF質量分析法にに基づいている。これらはオリゴヌクレオチドの全質量を測定し、そしてこれからオリゴヌクレオチドの配列を確認し得る。幾らかな場合において、オリゴヌクレオチドもしくは断片の質量は特定の配列についてユニークでないかもしれない。これは、天然の塩基、ACGT、の比率が異なる配列において同様であるときに起こる。例えば、簡単な4マーのオリゴヌクレオチドは24個の他の可能な4マー、例えばCAGT、CATG、CGTA等、と同一の質量を持つであろう。
【0021】
比較的長い核酸断片では、比較的高い分子量における質量スペクトルでの分解能の欠如のために、二つの断片間の質量差を区別することは困難であるかもしれない。本発明に従う塩基で修飾した類似体の組込みを用いて、特定のオリゴヌクレオチドもしくは核酸の断片を同定する助けをすることができるが、これは、これらの質量が天然の塩基のそれらと異なるからである。例えば、二つの配列、ACGTおよびCAGT、は、もし一つの配列の中で一つの天然ヌクレオチドが本発明の一つの類似体で置換されるならば、質量分析法により相互の存在下で同定することができる。例えば、オリゴヌクレオチドCAGTにおいて、このTは、特定の応用、例えばハイブリダイゼーションもしくは酵素的組込み、に対して殆んど影響なしに本発明の一つの類似体で置換されることができる。まださらに、類似体の導入による質量の変化のために、二つの配列を質量分析法により容易に同定することができる。
【0022】
塩基についてかつまた糖もしくはヌクレオチド間連鎖について、修飾することができる。例えば、チオ糖もしくはホスホチオレート連鎖はまた特徴的な質量変化をもたらすであろう。塩基、糖もしくはリンカーについて多くの種類の変化は異なる質量を持つ数多くの変化を生じることができるが、これらは、特に複合性の核酸ハイブリダイゼーションもしくはシークエンシングの応用において、特定の配列をその質量により正確に規定するために有用であろう。
【0023】
RNAは極度に汎用性の生物分子である。幾つかの研究室による実験的試験によって示されているのは、インビトロの選択技法を使用して、通常はRNA結合に関連しない、少数の抗体を含むタンパク質に高い親和性と選択性を持って結合する短いRNAをRNAライブラリーから単離することができることである(Gold, Allen, Binkley, et al, 1993, 497−510 in The RNA World, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor N. Y.; Gold, Polisky, Uhlenbeck, and Yarus, 1995, Annu. Rev. Biochem. 64:763−795; Tuerk and Gold, 1990, Science 249: 505−510; Joyce, 1989, Gene 82: 83−87; Szostak, 1992, Trends Biochem. Sci 17: 89−93; Tsai, Kenan and Keene, 1992, PNAS 89: 8864−8868; Tsai, Kenan and Keene, 1992, PNAS 89: 8864−8868; Doudna, Cech and Sullenger, 1995, PNAS 92:2355−2359)。これらのRNA分子の幾らかは、重症筋無力症および他の自己免疫性疾病のような疾病の治療のための薬剤候補として提案されている。
【0024】
基礎原理は、興味のあるタンパク質もしくは分子へRNAライブラリーを加えることを含む。洗浄して未結合のRNAを除去する。それから、興味のあるタンパク質もしくは他の分子に結合したRNAを特異的に溶出する。それから、この溶出したRNAを逆転写させそしてPCRにより増幅させる。それから、修飾したヌクレオチド(ヌクリアーゼ抵抗性を与える2’修飾、例えば2’F、2’NH2、2’OCH3および/もしくはC5修飾ピリミヂンおよび/もしくはC8修飾プリンのどれか)を用いて転写させる。興味のあるタンパク質もしくは他の分子に結合したと見出されるこれらの分子をクローン化しかつシークエンス化して、共通の(“コンセンサス”)配列を捜す。この配列を最適化して、改善した特異的結合を示す短いオリゴヌクレオチドを生成するが、これは治療薬としてこれから使用されるかもしれない。
【0025】
ここで説明した塩基類似体は、リボヌクレオシドトリホスフェートもしくはリボヌクレオシドホスホルアミダイトへ変換するときには、この選択プロセスに使用可能な分子的多様性を著しく増加させるであろう。これは、現行のビルディングブロックを用いては使用可能でない、標的への増加した結合親和性を有するオリゴヌクレオチドに至り得る。
【0026】
本発明の類似体は、天然の塩基のそれらと異なる性質を持ちそして他の重要な応用を持つであろう。それらはアンチセンス分野に用途を見出すであろう。これらはまた、抗ウィルス性(抗−HIVおよび抗−HBV等)(WO 98/49177)および抗がん性の薬剤として治療分野において有用であろう。多くのヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体が抗ウィルス剤として開発されている。それらはしばしば、DNAポリメラーゼおよび/もしくは逆転写酵素活性を数多くの手段によって阻害することによって作用する。AZT、ddC,ddI、D4Tおよび3TCのような、数多くのヌクレオシド類似体が、単独でまたは他のヌクレオシドもしくは非−ヌクレオシド類似体の組合せで、抗−HIV剤として使用されつつある。本発明の類似体はまた、単独でもしくは他の化合物と組合わせて抗ウィルス性活性を所有し得る。組合わせ薬剤治療はさらに頻繁にウィルス性感染を治療するために使用されつつあるので、本発明の化合物を含むことにより増加した数の化合物が使用可能になることは治療の成功の可能性を増強させるであろう。
【0027】
この発明の特に好ましい化合物は式(II)の化合物であるが:
【化12】
式中、Xはここで以前に定義された通りである。
【0028】
ここで、以下の非−限定的実施例を参照して、この発明をさらに説明する。
【0029】
合成実施例1
6−(β−D−2−デオキシリボフラノシル)−5−ヒドロ−3−メチル−8H−ピリミド[4,5−c][1,2]ピリダジン−7−オン−5’−トリホスフェート(5)の合成。
【化13】
【0030】
(a)3−(β−D−2−デオキシリボフラノシル)−6−メチル−フロ[2,3−d]ピリミジン−2−オン(3)。
100−mlのガラス圧力反応容器へ5−ヨード−(β−D−2−デオキシリボフラノシル)ウリジン7.1g(20mmol)、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)2.32g(2mmol)およびヨー化銅(I)0.76g (4mmol)をアルゴン下に加えた。それから、無水DMF(50ml)およびトリエチルアミン(4.2ml、30mmol)を反応容器に注入した。攪拌および冷却(0℃)した反応混合物中にプロピレンガスを10分間泡立たせた。圧力容器を密封して、反応物の温度を油浴を介して55〜60℃に上昇させた。この条件で18時間攪拌し反応させた。冷却すると原料はTLC分析で検出されなかった。メタノール(25ml)、Chelex 100樹脂(5g、200〜400メッシュ、ナトリウム型)およびAG 1−X8樹脂(5g、20〜50メッシュ、重炭酸塩型)を反応混合物に加え、そして1時間の間緩やかに攪拌した。ろ過後、溶液を高度真空にて油にまで留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/MeOH 100%から10:1)により精製して、5−プロピニル−(β−D−2−デオキシリボフラノシル)ウリジン 2(rf:0.4)を淡褐色の泡沫物質として45%収率で、および3−(β−D−2−デオキシリボフラノシル)−6−メチル−フロ[2,3−d]ピリミジン−2−オン 3(rf:0.2)を黄色固体として50%収率で得た。5−プロピニル−(β−D−2−デオキシリボフラノシル)ウリジンを、5%ヨー化銅(I)を含有するメタノール/トリエチルアミン(7:3)中で2時間還流することにより3−(β−D−2−デオキシリボフラノシル)−6−メチル−フロ[2,3−d]ピリミジン−2−オンに変換した。カラムクロマトグラフィーの後、61%の収率を得た。1H NMR(DMSO−d6):2.06(m,1H,2’),2.33(s,3H,Me),3.38(m,1H,2’),3.65(m,2H,5’),3.91(q,1H,4’),4.24(m,1H,3’),5.09(t,1H,OH−5’),5.26(d,1H,OH−3’),6.18(t,1H,1’),6.41(s,1H,H−5),8.66(s,1H,H−4)。13C NMR(DMSO−d6):29.8(Me),40.3(2’),60.8(5’),69.9(3’),85.3(1’),88.1(4’),88.8(C−5),98.3(C−4a),144.8(C−4),147.8(C−6),150.1(C−2),162.1(C−7a)。
【0031】
b)6−(β−D−2−デオキシリボフラノシル)−5−ヒドロ−3−メチル−8H−ピリミド[4,5−c][1,2]ピリダジン−7−オン(4)。
25−mlの丸底フラスコ中の3−(β−D−2−デオキシリボフラノシル)−6−メチル−フロ[2,3−d]ピリミジン−2−オン(3)500mg(1.35mmol)に無水ヒドラジン6mlを加えた。反応混合物を室温で2時間攪拌した。それから、過剰のヒドラジンを高度真空にて留去することにより除去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/MeOH 10:1)により精製し、灰白色の結晶生成物を85%収率で得た。X−線品質の結晶をメタノールから得た。1H NMR(DMSO−d6):1.80(m,1H,2’),2.14(m,1H,2’),2.49(s,3H,Me),3.49(m,2H,5’),3.62(q,1H,4’),4.16(m,1H,3’),4.40(s,2H,H−5),4.79(t,1H,OH−5’),5.13(d,1H,OH−3’),6.24(t,1H,1’),7.34(s,1H,H−4),10.29(bs,1H,NH−8)。13C NMR(DMSO−d6):21.1(Me),35.1(2’),47.8(C−5),61.8(5’),70.6(3’),83.1(1’),86.0(4’),120.8(C−4a),124.8(C−4),151.8(C−7),153.2(C−3),155.2(C−8a)。
【0032】
c)6−(β−D−2−デオキシリボフラノシル)−5−ヒドロ−3−メチル−8H−ピリミド[4,5−c][1,2]ピリダジン−7−オン−5’−トリホスフェート(5)。
50−mlの丸底フラスコ中の乾燥した6−(β−D−2−デオキシリボフラノシル)−5−ヒドロ−3−メチル−8H−ピリミド[4,5−c][1,2]ピリダジン−7−オン(4)140mg(0.5mmol)へ、アルゴン下でトリメチルホスフェート5mlを加えた。均一な溶液を冷却(氷浴)して、オキシ塩化リン(再蒸留した)70μl(0.75mmol、1.5当量)を加えた。反応液を冷却しつつ1時間攪拌した。TLC分析は反応が約70%終了していることが示した。それ故に、追加のオキシ塩化リン25μl(0.27mmol、0.51当量)を加え、そして反応液をさらに1時間攪拌した。無水DMF中の1M トリブチルアンモニウムピロホスフェート(2.5ml、2.5mmol、5当量)およびn−トリブチルアミン(0.6ml、2.5mmol、5当量)の両者を、冷却した溶液に同時に加えた。30分後、冷却した1M重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液(TEAB、pH=7.0)を、溶液が中性になるまで反応混合物に加えた。それから、緩衝液を加えて40mlの最終容量にし、そして混合物を室温にて終夜攪拌した。反応混合物を高度真空にて留去して粘性な溶液にし、水で希釈してろ過した。それから、粗製のトリホスフェートを含むろ液を50×300mmのDeltaPak(15μ,100A)C18 HPLCカラムに加え、それを毎分130mlの流速で0.1M TEAB(pH=7.0)から25%アセトニトリル中の0.1M TEABで25分間にわたる線形勾配を用いて溶出した。生成物5を含むピークを、10.5分において収集した。留去後、得られたトリホスフェートは、21×250mmのSynchropak Ax100 HPLCカラム上で40%CH3CN中の0.1M TEABから40%CH3CN中の1M TEABの毎分15mlで30分間の線形勾配を用いて再精製した。31P NMR(D2O):−9.26(d);−10.20(d);−22.43(t)。HPLC(ΔPAK C18、3.9×30cm、毎分1mlで30分にて0.1M TEAB(pH=7.0)から25%CH3CN中の0.1M TEAB):12.7分。UV λmax:237nmおよび292nm。
【化14】
【0033】
合成実施例2:
6−(β−D−2−デオキシリボフラノシル)−5−ヒドロ−3−アミノメチル−8H−ピリミド[4,5−c][1,2]ピリダジン−7−オン−5’−トリホスフェート(8a)の合成。
【0034】
a)3−(β−D−2−デオキシリボフラノシル)−6−トリフルオロアセタミドメチル−フロ[2,3−d]ピリミジン−2−オン(6a)。
5−ヨード−2’−デオキシウリジン(7.1g、20mmol、1当量)、Pd[P(C6H5)3]4(1.16g、1mmol、0.05当量)、CuI(0.38g、2mmol、0.1当量)および2,2,2−トリフルオロ−N−プロパルギルアセタミド(4.53g、30mmol、1.5当量)を乾燥DMF(75mL)中で攪拌している溶液に、トリエチルアミン(3.04g、4.2mL、30mmol、1.5当量)を加えてから、得られた混合物を不活性な雰囲気下で55℃にて2日間攪拌した。それから、反応混合物にAg1 X8樹脂の重炭酸塩型を加えてヨー化トリエチルアンモニウムを除去し、CHELEX樹脂を加えて金属陽イオンを除去しそして活性炭を加えて脱色した。セライト上でろ過後僅かに黄色の溶液が生成した。減圧下の溶媒除去およびシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、6aの4.2g(56%)を得た。UV(MeOH)λmax:324nm;1H NMR(d6−DMSO)δ(ppm)10.07(s,1H,交換可能,H−NH−COCF3),8.78(s,1H,H−6),6.63(s,1H,H−CH=C(O)CH2),6.18(t,J=6.55Hz,H−1’),5.00〜5.3(bm,2H,交換可能,2×OH),4.48(m,2H,H−CH2−NH),4.23(m,1H,H−4’),3.95(m,1H,H−3’),3.63(m,2H,H−5’),2.40(m,1H,H−2’b),2.07(m,1H,H−2’a)。
【0035】
b)3−(β−D−2,3−ジデオキシリボフラノシル)−6−トリフルオロアセタミドメチル−フロ[2,3−d]ピリミジン−2−オン(6b)。
3−(β−D−2−デオキシリボフラノシル)−6−メチル−フロ[2,3−d]ピリミジン−2−オンについて記載した方法に従って、表題化合物を合成した。1H NMR(CD3OD):1.94(m,2H,3’),2.01(s,3H,Me),2.18(m,1H,2’),2.57(m,1H,2’),3.75〜4.06(ddd,2H,5’),4.27(m,1H,4’),4.52(s,2H,CH2NH),6.11(dd,1H,1’),6.65(s,1H,H−5),9.13(s,1H,H−4)。
【0036】
c)6−(β−D−2−デオキシリボフラノシル)−5−ヒドロ−3−トリフルオロアセタミドメチル−8H−ピリミド[4,5−c][1,2]ピリダジン−7−オン(7a)。
25−mlの丸底フラスコ中の3−(β−D−2−デオキシリボフラノシル)−6−トリフルオロアセタミドメチル−フロ[2,3−d]ピリミジン−2−オン(6a)754mg(2mmol)に、無水ヒドラジン5mlを加えた。反応混合物を室温で3時間攪拌した。それから、過剰のヒドラジンを高度真空にて留去することにより除去した。残渣にメタノール20ml、トリエチルアミン0.5ml、引き続いてトリフルオロ酢酸エチル5mlを加えた。反応混合物は約1時間後の攪拌で均一に成る。室温にて終夜攪拌後、反応混合物を留去し、そして得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(EtOAc/MeOH 20:1)により精製した。微黄色の結晶化合物を86%収率で収集した。1H NMR(DMSO−d6):1.79(m,1H,2’),2.15(m,1H,2’),3.49(m,2H,5’),3.61(q,1H,4’),4.15(m,1H,3’),4.46(d,2H,H−5),4.57(d,2H,CH2NH),4.81(t,1H,OH−5’),5.14(d,1H,OH−3’),6.24(t,1H,1’),7.43(s,1H,H−4),10.1(t,1H,NH−TFA),10.51(s,1H,NH−8)。13C NMR(DMSO−d6):35.1(CH2NH),39.0(2’),42.8(C−5),61.7(5’),70.5(3’),83.0(1’),85.9(4’),117.9(CF3),121.2(C−4),123.4(C−4a),152.7,152.8(C−3,C−7),154.2(C−8a),156.7(q,COCF3)。
【0037】
d)6−(β−D−2−デオキシリボフラノシル)−5−ヒドロ−3−アミノメチル−8H−ピリミド[4,5−c][1,2]ピリダジン−7−オン−5’−トリホスフェート(8a)。
乾燥した6−(β−D−2−デオキシリボフラノシル)−5−ヒドロ−3−トリフルオロアセタミドメチル−8H−ピリミド[4,5−c][1,2]ピリダジン−7−オン(7a)200mg(0.51mmol)のリン酸化を、化合物5について上で報告したと同様な方法で実施した。粗製混合物を50×300mmのDeltaPak(15μ,100A)C18 HPLCカラムに加え、それを毎分130mlの流速で0.M TEAB(pH=7.0)から25%アセトニトリル中の0.1M TEABで25分間にわたる線形勾配を用いて溶出した。生成物を含むピークを15分において収集した。留去後、得られたトリホスフェートを、21×250mmのSynchropak Ax100 HPLCカラムにて毎分15mlで40%CH3CN中の0.1M TEABから40%CH3CN中の1M TEABの30分間の線形勾配を用いて精製した。このトリホスフェートを30分間濃NH4OHで処理したが、分析HPLCで観測すると変化はなく、トリフルオロアセチル保護基がこのステップ以前に除去されていたことを証明した。31P NMR(D2O):−9.65(d);−10.86(d);−22.54(t)。HPLC(ΔPAK C18、3.9×30cm、毎分1mlで30分にて0.1M TEAB(pH=7.0)から25%CH3CN中の0.1M TEAB):12.2分。UV λmax:241nmおよび293nm。
【0038】
e)6−(β−D−2,3−ジデオキシリボフラノシル)−5−ヒドロ−3−トリフルオロアセタミドメチル−8H−ピリミド[4,5−c][1,2]ピリダジン−7−オン(7b)。
化合物7aについて上で報告したように合成を実施した。淡褐色の泡沫物質を65%収率で収集した。1H NMR(DMSO−d6):1.84〜2.23(m,4H,2’,3’),2.01(s,3H,Me),3.58〜3.78(m,2H,5’),3.99(m,1H,4’),4.50〜4.71(dd,2H,H−5),4.66(s,2H,CH2NH),6.22(dd,1H,1’),7.48(s,1H,H−4)。
【化15】
【0039】
実施例3
6−(β−D−1,2−ジデオキシリボフラノシル)−5−ヒドロ−3−アミノメチル−8H−ピリミド[4,5−c][1,2]ピリダジン−7−オン−5’−トリホスフェート(8b)の合成。
8bの合成(0.73mmolスケールで)および生成/単離を、化合物5について記載されたように実施した。
【0040】
6−(β−D−2−デオキシリボフラノシル)−5−ヒドロ−3−Cy3−アミドメチル−8H−ピリミド[4,5−c][1,2]ピリダジン−7−オン−5’−トリホスフェート(9a)の合成。
8aの6.0μmol(690μL水溶液)をNa2CO3−NaHCO3緩衝液(pH=9.4)310μLで希釈し、そしてCy3−NHSエステル(7.2μmol、1.2当量)の攪拌したDMF溶液(1.0mL)に加えた。室温で2時間攪拌後、Cy3染料−ヌクレオチド抱合体(9a)をQ−Sepharose HPLCカラム(10×16mm)上で、5mL/分にて60分間で緩衝液A(0.1M TEAB中の40%CH3CN)から緩衝液B(1.0M TEAB中の40%CH3CN)の線形勾配を用いて精製することにより単離(35%)した。TOF MS ES−m/z、コーン100v、CH3CN/H2O:1144(MH−3)。
【0041】
6−(β−D−2−デオキシリボフラノシル)−5−ヒドロ−3−Cy5.5−アミドメチル−8H−ピリミド[4,5−c][1,2]ピリダジン−7−オン−5’−トリホスフェート(9a’)の合成。
9aについて記載したように、同様なスケールで8aをCy5.5NHSエステルと反応させることによってCy5.5蛍光染料−ヌクレオチド抱合体(9a’)を合成して、単離(33%収率)した。
【0042】
6−(β−D−2−デオキシリボフラノシル)−5−ヒドロ−3−フルオレセイン(5,6)−ヘキサナミド−アミドメチル−8H−ピリミド[4,5−c][1,2]ピリダジン−7−オン−5’−トリホスフェート(9a’’)の合成。
8aの8.0μmol(水溶液)をNa2CO3−NaHCO3緩衝液(pH=9.0)1.0mLで希釈し、そして攪拌した溶液に(5,6)−カルボキシ−x−NHSエステル(17.0μmol、2.1当量)の無水DMSO溶液を加えた。2時間後、染料で標識化したヌクレオチドを9aについて記載したようにQ−Sepharoseカラム上で精製して、9a’’を得た。TOF MS ES−m/z、コーン100v、CH3CN/H2O:1003(MH−3)。
【0043】
実施例4
【化16】
【0044】
6−(5−ジメトキシトリチル−β−D−2−デオキシリボフラノシル)−5−ヒドロ−3−メチル−8H−ピリミド[4,5−c][1,2]ピリダジン−7−オン(10)の合成。
4の1.16g(4.1mmol)を無水ピリジンと共に共留去し、そして無水ピリジン30mL中に再溶解した。DMT−Clの4.15g(12.24mmol、3当量)を、4の攪拌した溶液にアルゴン雰囲気下で室温にて加えた。3.5時間後、反応混合物を減圧下で留去し、そして残渣をCHCl3に溶解した。有機層を飽和NaHCO3で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥しそして減圧下で留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラム上でCHCl3に引き続いてCHCl3中の5%MeOHにより溶出して精製し、10(2.35g、99%)を得た。TOF MS ES−m/z、コーン100v、CH3CN/0.1M TEAB:581.24(MH−1)。
【0045】
6−(5−O−ジメトキシトリチル−3−O−(2−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルホスホルアミダイト)−β−D−2−デオキシリボフラノシル)−5−ヒドロ−3−メチル−8H−ピリミド[4,5−c][1,2]ピリダジン−7−オン(11)の合成。
化合物10の583mg(1.0mmol)を無水ピリジンに続いてトルエンと共に共留去し、そして無水のジクロロメタン(5mL)に溶解した。緩やかなアルゴン気流下で攪拌した溶液に、室温で、N,N−ジイソプロピルエチルアミン0.7mL(4.0mmol、4.0当量)を加え、引き次いて2−シアノエトキシ−N,N−ジイソプロピルアミノクロロホスフィン(0.28mL、1.25mmol、s)を滴下した。30分後、10%MeOH−CHCl3中でのTLCは、反応の終了を示した。反応混合物をCH2Cl2で希釈し、10%Na2CO3で洗浄し、有機層を乾燥後(無水Na2SO4)減圧下で留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラム(4×13cm)上にてCH2Cl2:EtOAc:Et3N(2.9:7:0.1)により溶出して精製し、11(570mg、73%)を得た。31P NMR(CDCl3):δ149.66。
【0046】
実施例5
DNAポリメラーゼによるトリホスフェート 5の組込みを研究するためのプライマー拡張アッセイ
プライマー拡張アッセイを用いて、エキソヌクレアーゼを含まないクレノウフラグメントDNAポリメラーゼI(EFK)に対する基質としてのトリホスフェート 5を評価した。アッセイでは、24マー鋳型にハイブリダイズした33P 5’末端標識化15マープライマーが使用された。プライマーと鋳型の配列は以下の通りである:
プライマー 5’ TGCATGTGCTGGAGA 3’
鋳型 3’ ACGTACACGACCTCTGAACTAGTC 5’
【0047】
1ピコモルの33P標識化プライマーを、×2クレノウ緩衝液(100mM Tris−HCl pH7.5、10mM MgCl2、10mM 2−メルカプトエタノール)中で2ピコモルの鋳型にハイブリダイズさせた。これに4μM dNTPαSもしくは40μM(試験化合物5c)または4μM dNTPαSおよび40μM(試験化合物)の混合物のいずれかを加えた。1単位のEFKおよび20mUの無機ピロホスファターゼを反応ごとに用いた。プライマー単独、プライマープラス鋳型プラス酵素対照でも実施した。反応を37℃で3時間インキュベートした。それから、ホルムアミド/EDTA停止溶液の添加により反応を停止させた。反応生成物を20%ポリアクリルアミド 7M 尿素ゲル上で分離し、そして生成物断片は、Kodak Biomaxオートラジオグラフィーフィルムに露出後、標識化プライマーおよび4μM dNTPαSの存在下における拡張の生成物と比較することによってサイジングした。
【0048】
これにより試験化合物がEFKに対する基質であり、そしてdTTPの代わりに組込まれることが示された。フルオレセインもしくはシアニンのような基を含むこの発明の他の化合物は、同様な方法により組込まれ得る。
Claims (17)
- 請求項1に記載の化合物であって、
a)Qが以下に示す置換基である、ヌクレオシドもしくはヌクレオシド類似体:
R1、R2、R3およびR4は同一もしくは異なりかつそれぞれがH、OH、F、NH2、N3、O−ヒドロカルビル、NHR (式中、RはH、アルキル、アルケニルもしくはアルキニルである)またはレポーター基であり、
R5はOH、SHもしくはNH2またはモノ−、ジ−もしくはトリ−ホスフェートまたはチオホスフェート、または対応するボラノホスフェートであり、またはR2、R4およびR5の一つはホスホルアミダイトもしくはポリヌクレオチド鎖に組込みのための他の基、またはレポーター基であり、またはQは以下の修飾した糖構造式の一つからなるが:
またはb)Qが、糖−ホスフェートの繰返し体もしくは修飾した糖−ホスフェートの繰返し体(LNA)からなる核酸バックボーン、またはペプチドもしくはポリアミド核酸(PNA)のようなバックボーン類似体である、ポリヌクレオチドである化合物。 - レポーター部分が存在する、請求項1もしくは2のいずれか1項に記載の化合物。
- レポーター部分がシグナル部分である、請求項3に記載の化合物。
- レポーター部分が反応性基もしくはシグナル部分または少なくとも2個の鎖原子を持つリンカーにより分子の残余に結合した固体表面である、請求項3もしくは請求項4に記載の化合物。
- Xがヌクレオチド塩基に正味の正もしくは負の電荷を付与する、請求項1〜5に記載の化合物。
- R5がトリホスフェートである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の化合物。
- R2、R4およびR5の一つがホスホルアミダイトおよびH−ホスホネートから選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の化合物。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のヌクレオチド類似体の少なくとも一つの残基を含む、ポリヌクレオチド。
- DNAもしくはRNAである、請求項9に記載のポリヌクレオチド。
- ポリメラーゼもしくは末端のデオキシヌクレオチジル転移酵素の存在下で、ポリヌクレオチドを請求項1〜7のいずれか1項に記載のヌクレオシドトリホスフェート類似体と反応させることを含む、鎖伸長方法。
- その方法がヌクレオシド類似体残基の塩基に結合する抗体を検出のために用いることを含む、請求項9もしくは請求項10に記載のポリヌクレオチドを検出する方法。
- 逆転写酵素の存在下に、請求項1〜7のいずれか1項に記載のヌクレオチド類似体を含むモノマー混合物と共にRNA鋳型をインキュベートすることを含む、cDNAを作製する方法。
- その方法が、請求項1〜7のいずれか1項に記載のヌクレオチド類似体を含むモノマー混合物を用いることを含む、PCRによりポリヌクレオチドを増幅する方法。
- 質量分析法による分析のための標識として、請求項1〜8のいずれか1項に記載の化合物の使用。
- 治療に使用するための、請求項1〜8のいずれか1項に記載の化合物。
- 抗−ウィルス剤として使用するための、請求項16に記載の化合物。
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