JPH04507402A - 架橋オリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 架橋オリゴヌクレオチド 発明の分野 本出願は１９８８年８月２８日に出願された出願番号第２５０．４７４号の一部 継続出願である。

発明の背景 本発明はヌクレオシド架橋剤およびオリゴヌクレオチドの製造におけるこれら化 合物の使用に関するものである。

治療および診断用途に使用される架橋可能なヌクレオチドプローブのＷ念はビー −アール・ベーカー（Ｂ、　Ｒ，Ｂａｋｅｒ）　の開拓的研究、「活性部位指向 性不可逆的酵素阻害剤の設計」、ニュ一式−り州りイリー、（１９８７）に関連 しており、彼は化学療法適用で「活性部位指向性酵素阻害剤」と称されるものを 使用した。

近年、オリゴヌクレオチドに架橋を導入するＩ！！念は、優れた配列プローブを 開発する努力において散発的に論議されてきた。クノーレＱｎｏｒｒｅ）および ブラソフ（Ｖｌａｓｓｏｖ）　、Ｐｒｏｇ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｓ 、　Ｎｏ１．　Ｒｉｏｔ、　、３２：　２９夏（１９８５）はオリゴヌクレオチ ドの３−かまたは５゛−末端かの１１ずれかに結合したＮ−（２−クロロエチル ）−Ｎ−メチルアニリン基を使用して配列指向性架橋（「相補的指向性修飾」） を考察した。サマートン（Ｓｕ−議ｅｒｔｏｎ）およびバートレブト（Ｂｓｒｔ ｌｅｔｔ）、Ｊ、　ｌ１ｏｌ。Ｂｌｏｌ、　、！２２：　１４５　（１９７８） はシトシン残基のＣ−４位に結合しそして非常に反応性のブロモメチルケトン基 で終結している８原子鎖がグアノシンのＮ−７にＩＩＲ横できることを示してい る。

ウェブ（Ｗｅｂｂ）およびマチｘブシ（Ｉｌａｔｔｅｕｃｃｉ）　、Ｎｕｃｌｅ ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、足ニア６６１　（１９８Ｂ）　は相補的ストラン ドとゆっ（り架橋できる５−メチル−Ｎ、Ｎ−エタノシトシン塩基を含有するオ リゴヌクレオチドを製造している。　ＤＮＡ）洩イブリッド内のリンカ−アーム を介する、概念的に関係したアルキル化において、イバーソン（Ｉｖｅｒｓｏｎ ）　およびデーパン（Ｄｅｒｖａｎ）　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　ＵＳＡｓ８５　：　４８１５　（１９８８）は、メチルチオエーテ ルのＢｒＣＮ活性化によって誘発され、リンカ−を有する塩基から２対に位置す るグアニン塩基に優先的な相手側のストランドメチル化を示している。

オリゴヌクレオチドは、ウィルス、菌類、寄生虫または細菌のような侵入生物に 特有の遺伝子配列の発現を制御する化学療法剤として使用することができる。

天然では、細菌におけるＲＮＡ発現は「アンチセンスＪＲＮ＾によってＭＩｌさ れる場合があり、［ＲＮＡは相補的標的ＲＮＡとＲＮＡ：　ＲＮＡハイプリブト を形成しそしてそれらの生物学的活性を１１節するかまたは不活性化することに よってその効果を発揮する、アンチセンスＲＮ＾を真核細胞中に導入するために プラスミドベクターを使用する最近の種々の研究は、それらがインビボでのｍＲ ＮＡａｌ的の発現を効果的に阻止することを示している（グリーン（Ｇｒｅｅｎ ）等の総説、＾ｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅ雪、　５５　：　５Ｂ９〜５９ ７　（＋９８６）　）。更に、多数のｍＲＮＡのなかで特定の閤ＲＮ＾は相補的 ＤＮＡ制限フラグメントとハイブリッド形成することによってタンパク質合成を 選択的に不活性化することができ、該フラグメントは−ＲＮＡと結合しそしてリ ポソーム上のタンパク質中へのｍＲＮＡの翻訳を妨げる（パダーリン（Ｐａｔａ ｒｓｏｎ）等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　７４　：　４ ３７０〜４３７４　（１９７７）　；　／Ｎステ４　（Ｈａｓｔｔｅ）等、Ｐｒ ｏｃ、　Ｘａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃ１．７５　：　１２１７〜１２２！　（１９７８）　）。

遺伝子発現の調面剤としてまた化学療法剤として配列特異的アンチセンスオリゴ ヌクレオチドを使用するという概念の最初の説明において、ザメクニク（Ｚａ腸 ｅｃｎｉｋ）およびステフェンソン（Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ）　、Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、７５：　２８０　（１９７ｇ）　 は小さいアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブがラウス肉腫ウィルス（Ｒ３ Ｖ　’）の細胞培養での複製を阻止することおよびＲ５Ｖウィルス性ＲＮＡ翻訳 がこれらの条件下で阻止されることを示した（ステフェンソン等、Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪＳ＾、７５　：　２８５　（＋９７８） 　）、ザメクニク等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ−Ａｃｔｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、＋ １３　：　４１４３　（１９８ｆｌ）はＨＩＶゲノムの部分に相補的なオリゴヌ クレオチドが細胞培養でのタンパク質発現およびウィルス複製を阻止し得ること も示した。約７０μＭのオリゴヌクレオチド濃度で９５％までの阻止が得られた ４要なことは、彼らはオリゴヌクレオチドが無傷で細胞に入りそして代謝に対し てかなり安定であることを標識ホスフェート研究で示したことである。

ウサギグロビン■ＲＮＡの開始コドン領域に相補的な配列を育する非荷電メチル ホスフェートオリゴデオキシヌクレオチドは両無細胞系およびウサギ網状赤血球 に１９８５）　）。もう１つの非荷電メチルホスフェートオリゴヌクレオチド類 似体、即ちヘルペス　シンプレブクスウイルス、タイプｌのｍＲＮＡの受容体ス プライス結合部に相補的な８−ヌクレオチド配列は無傷のＶｅｒｏ細胞中でのウ ィルス複製を阻止することができる。しかし乍ら、この阻害には上記非イオン性 プローブのかなり高い濃度（＞２５ｓＭ）が必要であった。

化学療法分野での架橋オリゴヌクレオチドの効果は非常に重要であるにちがいな いが、ＤＮＡプローブに基づ（診断におけるこれらの効果は同じように非常に重 要である。プローブ−標的ハイブリッドを共有結合的に架橋する能力は、新しい アッセイフォーマットを可能にするだけでな（診断アッセイにおける背景および 感度限界を劇的に改善する能力を有する。特異的な革新（ギャンバー（Ｇａ畦ｓ ｒ）等が以前に考慮した、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、　、１４．９９ ４３　（１９８８）　）には以下のものが含まれる： （ａ）ｉｆ景を除去するための変性洗浄段階の導入、（ｂ）識別の追加段階とし て架橋の使用、（ｃ）＃ｉ敵な特異性を確保しそして標的内の二次的構造を実質 的に減少させるために、予想されるハイブリッドの融点温度またはその近辺で生 起しそれによってハイブリッド形成の効率を上昇させる架橋、および（ｄ）逆す ザンブロトコールによって例示される新しい溶液バイブリフト形成フｔ−マット ・ しかし乍ら、架橋の概念は回避しなければならない潜在的な問題を示唆している 。例えば、架橋アームを有するオリゴヌクレオチドは非常に容易に標的配列と共 有結合すると思われるので、配列の誤った組合せが起こり、これは多分宿主毒性 を生じさせるであろう。他方、架橋反応は正しく組み合わせられた配列の解離が 生じる前に生起するほど速（なければならない。

この問題は、ハイブリッド形成によってＴ■が３７℃の生理学的温度をわずかに 超えている二量体が生じるオリゴヌクレオチドを構築することによって着手する ことができる。か鳴して、１つの誤った組合甘塩基でさえ）１イブリツド形成を 阻害し、その結果架橋を阻害する。最適化はオリゴヌクレオチドの長さおよび塩 基組成の慎重な選択並びにプローブ内の修飾塩基の位置によって達成することが できる。しかし乍ら、プローブは特有の部位の特異的標的化を確実にするのに十 分長くなければならない。

ヨーロッパ特許出願第８８３０９０９０．８号は、置換基は架橋していないが化 学的または物理的リポータ−基を有している５−Ｗ１換ウリジニルのような化学 的に修飾した口Ｎ＾プローブの形成を記載している。国際出願８７０７８１１は 、例えばフラグメントを化学的に修飾し次いで蛍光染料と反応させることによる ような［ｌＮ＾フラグメントの標識化方法を記載している。ヤブサキ（Ｙａｂｕ ｓａｋ　ｉ　）等は米国特許第４．５９９．３０３号で、例えば光励起によって 他のヌクレオチドと共有結合するように作られているチミジンのフロクマリンモ ノ付加物の形成によるような共有的に結合した架橋オリゴヌクレオチドの配列を 開示している。ヨーロッパ特許０２５９！８６は、架橋核酸ハイブリッド形成プ ローブとして使用できる巨大分子とビオチンの付加物を記載している。国際出１ １１１６Ｑ３ＱＴ５は核酸フラグメント化剤として有用な架橋ジスルホン酸エス テルを記載して〜する。ドイツ特許３３１０３３７は一重鎖ポリヌクレオチドと タンパク質のような巨大分子の共有結合架橋を記載しでおり、得られたコンプレ ックスは続いて、外来ポリヌクレオチドにおける相補的配列の研究でノルイブリ ッド化実験のマーカーとして使用される。

特異性の高い標的配列を同定するのに十分な塩基配列からなり、特異的な相補的 塩基と容易に共有結合を形成する１つまたはそれ以上のｔＪ！欄アームを育する プローブオリゴヌクレオチドの必要性が存在する。このようなオリゴヌクレオチ ドはハイブリッド形成アッセイの高選択性プローブとして使用することができる 。

このオリゴヌクレオチドはまた、例えば化学療法におけるＲＮＡのアンチセンス 化剤としても使用することができる。

本発明の要約 本発明は、オリゴヌクレオチドの隣接ストランド上の特定の部位間の架橋を達成 する架橋剤に関するものである。観察される架橋反応は特異性が優れて−する。

本発明はまた、これら架橋剤の少な（とも１つからなるオリゴヌクレオチドおよ び得られた新し一１オリゴヌクレオチドを診断および治療目的用に使用すること にも関するものである。

更に詳細には、本発明の架橋剤は架橋アームを有するヌクレオチド塩基の誘導体 であり、下記式（Ｉ゛）のものである：Ｒｒ−Ｂ　−（ＣＨ２）ｑ　−（Ｙ）ｒ 　−（ＣＲ２）＠　−Ａ　’　（１’）（式中、 Ｒ１は水素または糖部分若しくはその類似体であって、そのＷＩＭｔｌ似体は糖 部分に酸素によって酸素を介して結合し且つ基Ｑｌ、Ｑ２＃よびＱ、を含有する リン酸誘導体またはヌクレオチド結合形成に適する上記リン酸誘導体の反応性プ リカーサ−で糖部分の３′または５°位で任意に置換されている、Ｑ、は水素、 ホスフェートまたはジホスフェートであり、Ｑ２は＝０または＝Ｓであり、 Ｑ、はＣＨ２−Ｒ’、Ｓ−Ｒ’、Ｏ−Ｒ’またはＮ−Ｒ’Ｒ”であり、Ｒ’およ びＲ”の各々は独立して水素またはＣｌ−６アルキルであり、Ｂはオリゴヌクレ オチドの成分である核酸塩基またはその類似体であり、Ｙは機能的結合基であり 、 ｍおよびｑの各々は独立して０から８まで（０と８を含む）であり、ｒは０また は１であり、そして Ａ′は脱離基である）。

本発明はまた式Ｉ゛の上記ヌクレオチド塩基誘導体の少なくとも１つからなる新 規なオリゴヌクレオチドも提供する。

本発明のヌクレオチドおよび該ヌクレオチドが導入されているオリゴヌクレオチ ドはプローブとして使用することができる。プローブのハイブリッド形成は緩慢 ではあるが、可逆的であるので、プローブが正しい標的配列とハイブリッド形成 する毎にプローブを上記配列と不可逆的に確実に結合させることが望ましい。

本願発明のヌクレオチド塩基の共有結合架橋アームは標的ストランドを永久的に 修飾するかまたは脱プリン化を生じさせる。それだけで、本発明のオリゴヌクレ オチドは無細胞系および細胞系で重要な相補的核酸配列の同定、単離、位置測定 および／または検出に有用である。それ故、本発明は更に、本願発明の標識ヌク レオチド塩基の少なく七も１つからなるオリゴヌクレオチドプローブを使用する ことからなる、標的核酸配列の同定方法を提供する。

他に示さない限り、上記説明および本明細書を通して表記Ｃ＋−ａは！、２．３ ．４．５および６個の炭素を有する化合物並びにそれらの異性体を示すようなも のを含む。

本発明の本質および利点は本明細書の残りの部分および図面を参照することによ って更に理解することができる。

図面の簡単な説明 図１は　５１方向に沿った相補的塩基から２部位間れたデオキシグアノシン残基 にアセトアミドプロピルサイドアームを介して架橋したオリゴデオキシヌクレオ チドの修飾デオキシウリジン残基を描写する。

図２は、架橋グアノシンの３゛側での開裂後の”Ｆ’ｍ１ｌｌＨｐｖ標的および ｔＪｌ横生酸生成物−トラジオグラムを描写する。レーン１：　３２Ｐ−１８８ １５量体サイズのマーカー。レーン２：２０℃で２４時間反応。レーン３：２０ ℃で７２時間反応。レーン４：３０℃で２４時間反応。レーン５：３０’Ｃで７ ２時間反応。反応は２−アミノエタノチオールで抑えそしてピペリジン溶液で処 理して開裂させた。そして図３は、”　Ｐｌｌｌｌ）ＩＰＶ標的および架橋生成 物の変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるバイブ１Ｊブト分離を示すオー トラジオグラムを描写する。レーンｌ：対照１７）”Ｐ−欄１１ＣＭＶｆｉ的、 　レーア２：　２０’Ｃテ２４時閏反応。ｖ−ン３：　２０’Ｃテア２時間反応 。レーン４：３０℃で２４時間反応。レーン５：３０’Ｃで７２時間反応。反応 溶液はヨードアセトアミド基を抑える２−アミノエタノチオールで処理した。

特別の実施態様の説明 本発明は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドのＩｔ！に有用で且つＩＲ檎剤とし て有用なＩＩ檎ファーム有する新規な置換ヌクレオチド塩基を提供する。この置 換塩基は下記式（Ｉ゛）のものである： Ｒ，−Ｂ−（ＣＨ２）Ｑ　−（Ｙ）ｒ　−（ＣＨｚ）ｍ　−Ａ’　（１’）（式 中、 Ｒ＋は水素または糖部分若しくはその類似体であつて、その＊＊＊似体は糖部分 に酸素によって酸素を介して結合し且っ基Ｑ＋、ＱｚｓｓよびＱ３を含有するリ ンｌ！ｌ誘導体またはヌクレオチド結合形成に適する上記リン酸誘導体の反応性 プリカーサ−で糖部分の３°または５°位で任意に置換されている、Ｑｌは水素 、ホスフェートまたはジホスフェートであり、Ｑ２は工Ｏまたは＝Ｓであり、 Ｑ、はＣＨ２−Ｒ’、Ｓ−Ｒ’、Ｏ−Ｒ’またはＮ−Ｒ’Ｒ”であり。

Ｒ’およびＲ′′の各々は独立して水素またはＣｌ−ａアルキルであり、Ｂはオ リゴヌクレオチドの成分である核酸塩基またはその類似体であり、Ｙは機能的結 合基であり、 ｍおよびｑの各々は独立してＯから８まで（０と８を含む）であり、ｒはＯまた は１であり、そして Ａ′は脱離基である）。

本願発明の実施において、糖部分またはその類似体はヌクレオチドの成分として 有用なものから選択される。このような部分は、例えばリボース、デオキシリボ ース、ペントース、デオキシペントース、ヘキソース、デオキシヘキソース、グ ルコース、アラビノース、ベントフラノース、キシロース、リキソースおよびシ クロペンチルから選択される。糖部分は好ましくはリボース、デオキシリポース 、アラと／−スまたは２−０−メチルリボースから選択され、そしてアノマー、 αかまたはβかのいずれかを含有する。

酸素を介して糖部分に結合したリン１！ｌｓ導体は好都合には、例えばモノホス フェート、ジホスフェート、トリ本スフエート、アルキルホスフェート、アルカ ンホスフォネート、ホスフォロチオエート、ホスフｔロジチオエート等から選択 される。

ヌクレオチド間結合形成に適する反応性プリカーサ−はオリゴヌクレオチドの合 成における鎖延長中に有用であるものである。本願発明で特に有用な反応基はリ ン酸を含有するものである。ヌクレオチド間結合形成に適するリン酸含有基は好 ましくはアルキルホスフォルクロリダイト、アルキルホスファイトまたはアルキ ルホスフｔルアミダイトである。或いは、活性化ホスフェートジエステルをこの 目的で使用することができる。

核酸塩基またはその類似体（Ｂ）はプリン、ピリミジンおよびデアザプリンから 選択することができる。これは好ましくはウラシル−５−イル、シトシン−５− イル、アデニン−７−イル、アデニン−８−イル、グアニン−７−イル、グアニ ン−８−イル、４−アミノピロロ［：２．３−ｄｌｌビリジン−５−イル、　２ −アミノ−４−オキソピロロＣ２，３−ｄゴビリミジン−５−イルから選択され 、その際プリンは９−位を介して、ピリミジンは１−位を介してそしてピロロピ リミジンは７−位を介してオリゴヌクレオチドの糖部分に結合している。

機能的結合基Ｙはオキシ、チオ、アミノまたはそれらの化学的に封鎖した誘導体 、例えばトリフルオロアセトアミド、ブタルイミド、Ｃ０ＮＲ’、ＮＲ’ＣＯ１ および５Ｏ２ＮＲ’　（式中、Ｒ′はＨまたはＣ１−６アルキルである）のよう な親核性基から選択することができる。脂肪族または芳番族アミンを含む上記の ような機能性は親核特性を示しそして−（Ｃ）１２）■−Ａ゛基の結合点として 役立つことができる。アミノ基およびその封鎖誘導体が好ましい。

脱離基Ａ’＋！例えば、ｙａｏ、ブｏモ、ヨード、ＳＯ，Ｒ”’まりｉ＊Ｓ−Ｒ ”’Ｒ１１１１（式中、Ｒ１゛およびＲ１゛の各々は独立してｃ＋−ｅアルキル 若し食はアリールであるかまたはＲ１゛およびＲ″１は一緒になって０１−６ア ルキレン橋を形成する）から選択することができる。クロロ、プロそおよびヨー ドが好ましい。ａｍ基はその脱離性によって変更される。特別の脱離基の性質お よび反応性によって、使用すべき基は不可逆的結合プローブの所望の特異性をも たらすように各事例で選択される。

ボウル−アンド−スティック（ｂａｌｌ　−ａｎｄ−ｓｔｉｃｋ）モデルによる 二本鎖ＤＮＡの試験および高解像コンピューターグラフィックはプリンの７−位 およびピリミジンの５−位が二本鎖核酸のＢ型２倍体の主要みぞにあることを示 している。これらの位置は、塩基のハイブリッド形成特性を妨げることな（かな りの量の側鎖で置換することができる。これらのサイドアームはｄＴｈｄまたは ｄｃＷｄの誘導化によってかまたは興項環塩基の直接的総合酸かのいずれかによ りて、次いでグリコジル化によって導入することができる。これらの修飾ヌクレ オシドは自動ＤＮＡ合成器を使用してオリゴヌクレオチド中に導入するのに適当 な活性化ヌクレオチドに変換することができる。

架橋側鎖 架橋側鎖はプリンの７−または８−位、ピリミジンの５−位、ピロロピリミジン の５−位から主要みぞを横切って到達しそして修飾順位体を含む塩基対の上部（ オリゴマーの３′−側）に位置するプリン（好ましくはグアニン）のＮ−７と反 応するのに十分な長さでなければならない、かくして、側鎖は長さが、少なくと も３個の原子、好ましくは少な（とも５個の原子、更に好ましくは少な（とも６ 個の原子でなければならな〜１゜側鎖の一般的に好ましい長さは約５から約９個 までの炭素原子である。

ストランドの架橋を最適にするためには、Ｗ横アームを有するオリゴヌクレオチ ド内の修飾塩基の３′側にある第１または第２の塩基と対になる攻撃される標的 ストランド塩基を有することが好ましい０例えば、攻撃されてＩｌｌる標的スト ランド塩基がグアニンである場合には修飾ウラシルを含有するプローブ用の標的 配列は相手ＧＺＡ　（好ましくはＧＧＡ）（その際、２は任意の塩基である）を 含有すべきであり、該プローブオリゴヌクレオチドはＵＺＣ（好ましくはＵＣＣ ）を含有し、そのｌＩ［Ｕ、は架橋アームで５−置換したｄＵｒｄである。例え ば、架橋アデニン誘導体を含有するオリゴヌクレオチドでは、アデニン−修飾Δ Ｚ’Ｃ）リブレフトはＧＺ’Ｔ　（式中Ｚｌは任意の塩基である）を標的とする であろう。

架橋アームを含有する修飾塩基がウラシルでありそして標的配列がＧＧＡである きき、架橋リンカ−修飾塩基対である標的の５°側の第２のグアニンのアルキル 化が（図１に示されるように）観察された唯一の作用であることが見いだされた 。架橋反応は電子性を核性に「最良に適合」させるのに非常に特異的であると思 われる。ｆｆ１Ｉち、２つまたはそれ以上のグアニン残基は、アルキル化の部位 を見つけるために修飾塩基中の相手に隣接する必要があると思われる。

架橋剤−ヌクレオシドの製造 修飾２°−デオキシヌクレオシドの１つのクラスは本願発明で配列指向性架橋剤 としてオリゴヌクレオチド中に導入するのに特に有用であることを証明した。

これは一般的な構造が下記で示される５−置換−２′−デオキシウリジンである ：５−（ｒＩ！換）−２゛−デオキシウリジンは図式ｌおよび２で示される経路 によってｌＩ造することができる。図式ｌおよび２中の部分Ｙ°は−（Ｙ）ｒ　 （ＣＨ２）ｍ　−Ａ’である。

図式ｌ： 直換１−アルキン（ＸＸＩ）と５−ヨード−２゛−デオキシウリジン（ＸＸ）の パラジウム介在カップリングに適合させてアセチレン−カップリング生成物（Ｘ ＸＩＩ）を生じさせることができる。このアセチレン性ｄＵｒｄ類似体ＸＸＩ＋ は、例えばラネーニッケルで還元して飽和化合物（ＸＸＩＩ＋）　を生じさせ、 これは次いで以下で記載するように、自動ＯＮ＾合成器で使用される試薬に直接 変換するために使用される。

図式２： （ＸＸＩＩＩ） ５−クロロ水銀−２°−デオキシウリジン（ＸＸｍ　を出発化合物として使用す るとき、機能化したオレフィンとのパラジウム触媒カブプリングによってオレフ ィン基と直接カップリングさせてオレフィン性化合物（ＸＸＶＩＩ）　を生じさ せることはできない。その代わり、図式２に示される通り、置換アルケン（ＸＸ Ｖ）　と５−クロロ水銀−２°−デオキシウリジン（ＸＸＩＶ）　をメタノール と一緒に反応させてアルファーメトキシ付加物（ＸＸＶＩ）を生じさせ、これは トリフルオロ酢酸およびトリフルオロ酢酸無水物によってオレフィン性化合物ｘ ｘｖ＋＋に変換される。還元すると飽和化合物（ＸＸＩｌｌ）が生じ、これは以 下で記載されるようにＤＮＡ合成器用試薬に変換される。

本願発明の実施では、糖部分またはその類似体はヌクレオチドの成分として有用 なものから選択される。このような部分は、例えばペントース、デオキシペント ース、ヘキソース、デオキシヘキソース、リボース、デオキシリボース、グルコ ース、アラビノース、ベントフラノース、キシロース、リキソースおよびシクロ ペンチルから選択することができる。糖部分は好ましくはリポース、デオキシリ ボース、アラビノースまたは２′−〇−メチルリボースであり、アノマー、αか またはβかのいずれかを含有する。

糖部分に酸素を介して結合したリン酸誘導体は好都合には、例えばモノホスフェ ート、ジホスフェート、トリホスフェート、アルキルホスフェート、アルカンホ スフェート、ホスフｔロチオエート、ホスフオロジチオエート等である。

ヌクレオチド間結合形成に適する反応性プリカーサ−はオリゴヌクレオチドの合 成での鎖延長中に有用なものである。本願発明に特に有用な反応基はリン酸を含 有するものである。ヌクレオチド間結合形成に適するリン酸含有基は好ましくは アル午ルホスフオルクロリダイト、アルキルホスファイトまたはアルキルホスフ ォルアミダイトである。或いは、活性化したリン酸ジエステルをこの目的で使用 することができる。

オリゴヌクレオチド類の有用性および作成方法ターゲット（標的）核酸の相補的 配列とクロスリンクできるようなオリゴヌクレオチド類は、オリゴヌクレオチド 類をターゲット配列に共有的に付加させてｍＲＮＡの翻訳あるいは遺伝子発現制 御を阻害する効率を高めるので、このようなりロスリンク可能なオリゴヌクレオ チド類は化学療法上責這な価値を育するものである。クロスリンク剤がオリゴヌ クレオチドに共有的に付加されると、今度ｉｔこれが化学的に活性化されてクロ スリンケージが形成され、これにより更（こターゲットと相補的な配列順の切断 が誘発される、その結果として配列中１こ非可逆的な損傷を惹起する１１．１１ ．というように次々と連鎖反応を引き起こして、前記阻害効率の向上を達成する ことが可能である。電子親和性クロスリンキング部分の実施例はアルファーハロ カルボニル化合物類、２−クロロエチルアミン類およびエポキシド類を包含する 。

本発明になるオリゴヌクレオチド類を核酸分析におけるプローブとして利用する ときは、ハイブリッドφヌクレオチド類の存在が検出できるように標識を付番す る。このような標識はリポータ−・グループとしてはたらき、またターゲット・ ヌクレオチド類とそれらと相補的なオリゴヌクレオチド・プローブ類との二重体 形成を検出するための手段となる。

本発明において用いられるリポータ−Φグループは、測定乃至は検出可能な物理 的乃至は化学的特性を有するグループ（基）である。色彩変化、発光、蛍光、あ るいは放射能のような特性によって検出可能性が得られるであろう；ある−ｓｌ よ鳥すポーター争グループがリガンドの認識部位として役立つ被認識能を育する ならば、これを手掛かりとして検出可能性が得られるであろう。

本発明になるオリゴヌクレオチド類は、第１１式のヌクレオチド塩基類を置換し たものから得られるヌクレオチド類の少なくとも１１１から、全数に至るまでを 包含する。

オリゴヌクレオチド類を作成するには、第■°式のヌクレオチド塩基頭上に保護 基類を導入し、次にこれらのヌクレオチド塩基類を活性化してオリゴヌクレオチ ド類合成の用に宛てる。保護体あるいは活性化体への変換は、２′−ヌクレオチ ド類につｌ、１て数編の総論記事（レビュー）に詳述されてｌ、する手順に従う 。５Ｏｎｖｅａｕｘ＋　Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＋　１４： ２７４−３２５（１９８６）；Ｊｏｎｅｓ、”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ 　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ＋　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ＡＰｐｒｏａｃｈ”、Ｍ＋Ｊ、 Ｇａｉｔｇ。

ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ社、２３−３４頁（１９８４）を参照のこと。

活性化ヌクレオチド類を、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチド類に対して行うのと 同様の方法で、オリゴヌクレオチド類に組み込む。すなわち、ターゲットＤＮＡ 中あるいはＲＮＡ中のヌクレオチド類配列と相補的なヌクレオチド＊＊を形成す るために正しいヌクレオチド類が配列的にリンクされるであろうような方法で行 う。該ヌクレオチド類は、酵素的方法、あるいは化学合成による方法のいずれか で組み込んでもよい。該ヌクレオチド類は、それらの５’　−０−ジメトキシト リチル−３’　−（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル）フォスフオルアミダイトシアノエ チルエステル誘導体に変換され、Ｏ１ｉｇｏｎｕｃｌｓｏｓｉｄｅ　５ｙｎｔｈ ｅｓｉｓ＋　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｌ）ｐｒｏａｃｈ″上記、に記載の手順に 従って、合成オリゴヌクレオチド類中に組み込んでもよい。次に、合成後のアミ ノ酸分解により、当業者周知の方法により、Ｎ−保護基を、その他のオリゴヌク レオチドΦブロッキング・グループと共に外す。

好ましい一実施態様においては、個々のシンセサイザー使用機種の取扱い方法お よび指示するところにしたがって、活性化ヌクレオチド類をＤＮＡ自動シンセサ イザーに直接かけることも可能である。該オリゴヌクレオチド類は、標準的な市 販のフォスフオルアミタイドを使用するか、ある〜１はＨ−フォスフ−ネート化 学を駆使して、シンセサイザーで作成することも可能である。

ハロアシル基のような、残基は、オリゴヌクレオチド類中への組み込みとブロッ キング−グループ除外とを行った後に、アミノアルキル尾部（−ＣＨ２）−Ｙ） に付加できる。例えば、α−ハロアセタミド−個が付加されたことは、被修飾化 合物の高速液体クロマトグラフィで、当該アミノ基の陽性荷電の除去に対応する 移動度の変化すること、また、その後で、２−アミノエタンチオールと反応させ て誘導体を作り陽性荷電を付与すれば、逆相高速液体クロマトグラフィで元のア ミノアルキルオリゴヌクレオチドと同様な移動度を示すことから証明できるであ ろう。

特定の実施態様においては、以下に示す電子親和性残基類の各々が、ヒト拳パピ ローマ・ウィルス（ＨＰＶ）プローグ類上のアミノプロピル基に付加された：す なわち、ブロモアセチル基、ヨードアセチル基、およびこれらの反応基よりは反 応性は弱いが構造上はよりフレキシブルな４−ブロモブチリル基などである。

ブロモアセチル基およびヨードアセチル基は、クロスワンキングにおいて同等の 反応性であることが認められた。

オリゴヌクレオチド書プローブの標識 本発明になるオリゴヌクレオチドψプローブは、１１式の標識置換ヌクレオチド 塩基の少なくとも一個を包含する。

当業に用いられている典型的な数種の方法のいずれによっても、プローブ類の標 識が可能である。一般的な検出方法は、”Ｈｌ　１２ＩＩ　”Ｓｌ　”Ｃあるい は３２ｐ標識プローブ類を用いるオートラジオグラフィー、その他である。その 他のリボ−ター−グループ類には、蛍光担体類、化学的発光剤類、および酵素類 で標識した抗体と結合するリガンド類が包含される。代替法として、プローブ類 を、蛍光担体類、化学的発光剤類、酵素類および酵素基質類のような襟ｌＩ物類 と直接共役させることも可能である。代替法として、同組成物類を、標識と共役 したリガンドと反応する抗体のように、リガンド−抗リガンド複合体を介して間 接的に結合させることも可能である。標識の選択は、要求される感度、プローブ との共役の難易度、必要な安定性、および機器調達の難易度などによって決める 。

標識物の選択如何により、プローブへの標識組み込み方法が決まる。放射性プロ ーブ類は、望ましい放射性同位元素を含む入手可能な市販のヌクレオチド類を用 いて定型的に作成する。例えば、ＤＮＡシンセザイザー類の使用、ニブク・トラ ンスレージ璽ン、末端トランスフェラーゼを用いてプローブ類の３′末端に放射 性塩基類の尾部をつける、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌａｎｏｗ断片を用いた特定 の押入物類を有するＭ１３プラスミド類を放射性ｄＮＴＰ類の存在下で複写させ る、あるいはＲＮＡポリメラーゼを用いて放射性ｄＮＴＰ類の存在下でテンプレ ートからＲＮＡを転写させる、等々の操作により放射性ヌクレオチド類をプロー ブ類に組み込むことが可能である。

シグナル（例えば、蛍光担体、化学的発光剤あるいは酵素）で非放射性プローブ 類は直接標識したり、あるいはリガンドとの共役により間接的に標識することが 可能である。例えば、リガンド分子はプローブに共役結合される。すると、この リガンドは、本来的に検出可能である受容体分子か、あるいは酵素または光反応 性化合物のように検出可能なシグナルに共役結合されている受容体分子かのどち らかに結合する。リガンドおよび抗リガンドは非常に多様であろう、あるリガン ドに対する天然の「抗リガンド」が存在する場合は、即ちビオチン、チロキシン 、およびコルチゾールなどのようなリガンドがこれに相当するものであるが、そ のような場合にはそのリガンドを、天然に存在するその抗リガンドを標識したも のと共に用いることが可能である。また、代替法としては、ハプテン性あるいは 抗原性の化合物ならどんなものでも、適切にＩＩＩＡシた抗体と共に用いること ができる。好ましい標識法の一つは、ビオチンｌ１ｌｊｌシたオリゴヌクレオチ ド類似化合物を利用するものであり、Ｌａｎｇｅ　ｒら、Ｐｒｏｃ、ｎａｔ　１ ．Ａｃａｄ。

Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、ヱ旦：６６３３−６６３７　（１９８１）に開示されている 方法であるが、それは参照により本発明中に取り入れられている。

リポータ−・グループ類として興味深い酵素類には、先ず氷解酵素類、特にフォ スファターゼ類、ウレアーゼ類およびグリコシダーゼ票、あるいはオキシドレダ クターゼ類、とりわけパーオキシダーゼ類などであろう、蛍光性化合物には、フ ルオレブセンおよびその誘導体類、ローダミンおよびその誘導体類、ダンシル、 ウンベリフェロン、希育土類、等が包含される。化学的発光体には、ルシフェリ ン、アクリヂン・エステル類および２，３−ジヒドロフタラジンジオン類、例え ばルミノール、が包含される。

プローブとターゲットのハイブリッド化およびクロスリンキング−分析特定のハ イプリダイゼーシ諺ン（ハイブリッド化）およびクロスリンキングの諸条件は決 定的なものではなく、研究者の紅みと必要に応じて変更されるであろう。約２０ ％から約６０％容量、好ましくは約３０％、の極性有機溶媒からなる種々のハイ プリダイゼーシーン溶液を採用することができよう。一般的なハイプリダイゼー タ１ン溶液には、約３０−８０％　Ｖ／Ｖのフォルマミド、約０．５　。

からＩＭの塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、トリス塩酸、ＰＩＰＥＳある いはＨＥＰＥＳなどのような緩衝液類の約０．０５から０．１Ｍ液、ドデシルサ ルフェートナトリウムのような界面活性剤の０．０５％から０．５％溶液、およ びＩから１０ｍＭの間のＥＤＴＡ、０．０１％から５％のフィコール（約３００ から５００　ｋＤａｌ）、０．１％から５％のポリビニールピロリドン（約２５ ０から５００　ｋＤａ　ｌ）　、ならびに０．０１％から１０％のウシ血清アル ブミン、などが用いられるａまた、代表的なハイブリダイゼーシ１ン溶液には、 非標識担体核酸の約０．１から５ｍｇ／ｍＬが包含される、例えば特に断片化し た子ウシ胸腺あるいはサケ精子、ＤＮＡ、及び／又は特に断片化したイースト＠ ＤＮＡおよび随意に約０．５％から２％　ｗｅ／ｖｏｌのグリシン、などである 。

その他の添加剤が包含されてもよい、容積排除剤類のようなものであるが、これ らに包含されるものには檀々の極性水溶性あるいは膨潤剤類がある、すなわち陰 イオン性ポリアクリレートあるいはポリメチルアクリレート、またデキストラン サルフェートのような荷電サブカライドのポリマー、などのようなものである。

特定のハイプリダイゼーシ曽ン手技は本発明には必須ではな＋１１゜ハイプリダ イイー２１２手技についてはＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔ ｔｏｎ＋Ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｌ）ｐｒｏａｃｈ”＋ＨａｍｅｓとＨｉｒ ｇｉｎｓｌ！、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ社、１９８５：Ｇａ１ｌとＰａｒｄｅ＋　Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ、Ｓ、Ａ、、６３：３７８−３８ ３　（１９６９）；およびＪｏｈｎら、Ｎａｔｕｒｅ＋　２旦旦：　５８２−５ ８７　（１９８９）に一般的な記載がある。ハイプリダイゼータ１フ手技は諸改 良がなされているので、容易に応用することが可能である。

ハイブリダイゼータ１ン溶液中に存在するａｔ識プローブ量は広範囲にわたる諸 量でよい。一般的には、ターゲット核酸の化学量論的な量を実質的に超過する量 のプローブが用いられるであろう、そうすればプローブのターゲットＤＮＡへの 結合率が強化される。

ハイプリダイゼーシ１ンの厳密さの度合いはさまざまにしてよ〜１゜ハイブリダ イゼーシ１ン条件が厳密になるほど、プローブとターゲット相互間の相補性を益 々高度にしなければ、安定した二重体を形成できな〜１゜厳密度は温度、イオン 強度、極性有機溶媒の使用、その他によりＷＩ４１１Ｉできる。例えば、使用温 度は普通は約２０℃から８０℃の範囲で、通常２５℃から７５℃である。５０％ フォルマミド中に１５から５０１！Ｉのヌクレオチドを含むプローブの至適温度 範囲は２２から６５℃にわたる線温度でよ〜亀。ルーチンの実験には、室温で充 分量（満足量）のハイプリダイゼーシ■ンができる条件に設定してもよい。フォ ルマミドの濃度を約２０％から約５０％の範囲で操作して反応溶液のイオン強度 および極性を変化させることを介して、ハイプリダイゼーシ１ンの厳密度を都合 よ（変えることが可能である。

反応容器を市販の超音波槽に漬けることにより超音波処置を加えれば、ハイプリ ダイゼーシ１ン率を加速できることがよくある。

特定のハイプリダイゼータ１ン用溶液に遇した温度と時間でハイプリダイゼーシ 習ンおよびクロスリンキングを行った後に、ガラス、プラスチック、あるいは濾 過剤の支持器に付着したプローブ−ターゲットのハイブリッドを洗浄液に入れる 。代表的な洗浄液としては、ハイプリダイゼーシーン溶液中に加えた試薬ＩＩ（ 例えば、塩化ナトリウム、緩衝剤類、有機溶媒層および洗浄剤）と同一の試薬類 を含む、これらの試薬類はハイプリダイゼーシ１ン拳メジェームと同一濃度でよ いが、洗浄条件をより厳密にした＋１１と望むときには、もっと低い濃度にする ことがよくある。支持器を洗浄液に入れておく時間は、数分間がら数時間ある− １は更に長期間とさまざまに変えてもよい。

ハイプリダイゼーシ、ン・メジュームあるいは洗浄メジュームのどちらか一方を 厳密にしてもよ（１゜適当な厳密さで洗浄した後に、＋１１よいよ検出を行うが 、正しいハイプリダイゼーシーン複合体を標識体の特性に応じて検出を実施する 。

プローブを標識体に直接共役させてもよい。例えば、標識体が放射性である場合 は、ハイプリダイゼータ１ン複合体基質の会合物が付着した支持体面をＸ線フィ ルムに露出する。標識体が蛍光性である場合には、試料を先ず特定波長の光で照 射して検出する。試料はこの光を先ず吸収するが、その後で別の波長の光を放出 するので、この光を検出器で捕らえる（Ｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ″＋　Ｆｒｔｅｄｅｒ＋　Ｄ、ｒ　Ｗ、Ｈ，Ｆｒｓａｍａｎ社、５３７− ５４２頁）。標識体が酵素である場合は、ＩＦＩ！Ｉｆ素の基質と共にインキュ ベージｇンして試料を検出する。発生するシグナルは、有色沈澱物、有色あるい は蛍光性溶解物質、あるいは生物的発光または化学的発光による光子であるだろ う。ディツプスティック・アッセイの好ましい標識体は、有色沈澱物を生成して 、これにより陽性結果を示す。例えば、アルカリフォスファターゼはインドキシ ルフォスフートを脱リン酸化する、そうすると今度はこれが、テトラゾリウム塩 を高呈色性で不溶性の７オルマザン類に変換する還元反応に参画するだろう。

ハイブリダイゼーシ１ン複合体の検出には、シグナルを発生する複合体をターゲ ットとプローブ舎ヌクレオチド類あるいは核酸との二重体に結合させることが必 要である。代表的には、そのような結合は、リガンドに共役したプローブとシグ ナルに共役した抗リガンドとの間に見られるような、リガンドと抗リガンドの相 互作用を介して起こる。シグナル発生性複合体の結合は、やはり超音波エネルギ ーへの暴露による加速的影響を受け易〜１゜また、標識体はハイプリダイゼーシ １ン複合体の間接的検出も可能とする。例えば、１１１１１体がハプテンあるい は抗原である場合には、抗体を用いて試料の検出が可能である。これらの試験系 においては、蛍光性分子あるいは酵素分子を抗体に付加させることにより、また 場合によっては放射性標識体に（つつけることによって、シグナルが発生される （Ｔｉｊ　５Ｓｅｎｌ　ｐ、ｊ″Ｐｒａｃｔｉｃｅａｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ 　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ＋Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈ ｎｉｑｕｓｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄ　ｍｏｌｅｃｕ！ａｒ　 Ｂｉｏｌｏｆｙ″ｒ　Ｂｕｒｄｏｎ＋　Ｒ，Ｈ，ｒｖａｎ　Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅ ｒｇ、ｐ、Ｈ，編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ社、１９８５．９−２０頁）。

ハイブリダイゼーシ四ン溶液中に存在する標識プローブの量は、標識体の特性、 細胞のターゲット核酸に合理的に結合できる標識プローブ量、およびハイブリダ イゼーシロン・メジューム及び／又は洗浄メジュームの正密度、などにより広範 囲の諸変量をとり得る。一般に、プローブのターゲット核酸類への結合率を高め るためには、ターゲットの化学量論的な量を実質的に超過する量のプローブを用 ！１するのがよかろう。

ターゲット配列同定方法 本発明は、ターゲット核酸配列を同定する方法をも教示する。該方法はＩ’式の 標識した置換ヌクレオチド部分の少なくとも一つを包含するオリゴヌクレオチド ・プローブを利用することからなる。

一実施態様においては、該方法は： （ａ）被験試料中の核酸類を変性することと；（ｂ）プローブとターゲットのク ロスワンキングを可能にさせる条件下において、ターゲット核酸類に　［１式の ヌクレオチド部分の少なくとも一つが標識置換されたものを包含するオリゴヌク レオチド書プローブ１ｍをハイプリダイゼーシーンさせることと、その場合にお いて該プローブがターゲット核酸類の配列と相補的である配列からなるプローブ であることと：（Ｃ）非結合プローブを除去するために該試料を洗浄することと ；（ｄ）該試料を検出試薬類とインキュベージ１ンすることと；（ｅ）ＩＩ試料 を検出することの諸ステップからなる。

上記の方法は当業者周知の手順に従って実施することができる。

１１式のヌクレオチド部分の少なくとも一つが標！Ｉ置換されたものを包含する オリゴヌクレオチド・プローブを用いる、かつ上記の方法を包含する、ターゲッ ト核酸配列を同定するための分析は本発明の実施と思料される。そのような分析 はキットの形で提供され得る。例えば、代表的なキットには　ｌ　１式のヌクレ オチド部分の少なくとも一つが標！１ｉｌｌ換されたものを包含する該オリゴヌ クレオチドがターゲット核酸類の配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチ ドからなるプローブ試薬組成と；二重らせん構造の核酸を−重らせん構造核酸に 変換させる変性試薬と：ハイプリダイゼーシｔン反応ミクスチュアー（混合物） とを包含することができる。該キットは、例えば酵素、および該シグナル−発生 系の基質、のようなシグナル−発生系をも包含することができる。

本発明を説明するために、以下の諸実施例を示すが、これらの例示に限定される ものではない。

二吹豊 下記の溶媒諸混液を展開溶媒に用いて、シリカゲル８０　Ｆ　２５４　Ｎ層板（ Ａｎａｌｔｓｃｈ社）上で薄層クロマトグラフィを行った：Ａ−９０％メチレン クロライツク１０％メタノール：Ｂ−５０％エチルアセテート＝５０％へキチン 類；Ｃ−７０％エチルアセテート：１０％メタノール＝１０％水＝１０％アセト ン；Ｄ−５０％エーテル：５０％へ牛サン類。８０　Ｆ　２５４シリカ（Ｍｅｒ ｃｋ社）を用いてフラッシュ・クロマトグラフィを行った。オリゴヌクレオチド 類はＡＩ）Ｉ）Ｉｉｅｄ　Ｂｔｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３８０Ｂシンセザイザー で合成した。オリゴヌクレオチド類は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＢＲＬ 社）およびγ−”Ｐ−ＡＴＰ（Ｎｅｗ・　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ社） を用いて同位元素標識した。

ＲＴは室温を指す。

実施例１： ５−（４−フタルイミドブチ−１−イエ−１−イル）−２′−デオキシウリジン 。

５−ヨード−２′−デオキシウリジン（３５４ｍｇ＋　１　ｍｍｏ　Ｉ）をジメ チルフｔルマミド１０ｍＬに溶解した。ヨウ化第−銅（７８ｍｇ、０．４　ｍｍ ｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホフィン）パラジウム（０）（２００ｍｇｓ 　２．０　ｍｍｏ　ｌ）を加えた。４−フタルイミドブチ−１−イン（３００ｍ ｇｓ　１．５　ｍｍｏｌ）を−挙に加え、６０℃において３時間反応を続けた。

次に、澄明な黄色反応液を溜去しメチレンクロライドを加えた。フラスコを擦る と産生物のほぼ全量に相当する結晶が析出した。この産生物を濾過して９５％エ タノールから再結晶させると、３３５　ｍｇ　（７８％）の標記化合物が微細な 、羽毛のような針状物として得られた。

実施例２： ５−（４−フタルイミドブチ−１−イル）−２′−デオキシウリジン。

実施例１から得られたデオキシウリジン１．００グラムを９５％エタノールに溶 解し、約３　ｇの中性ラニー・ニッケルを加えた。４８時間後に、該触媒を注意 して濾去し、濾液を蒸発して固形物を得、これをメタノール−水混液から再結晶 させて９６０　ｍｇ（９７％）の標記化合物を得た。

実施例３： ５−（３−ヨードアセタミドプロピル）−２′−デオキシウリジン。

５−（３−）リフルオロアセタミドプロビー１−イル）−２′−デオキシクリジ ン（０，３ｍｍｏ　Ｉ）をアンモニアで処理し、次にＮ　−／１イドロキシーサ クシンイミジル　α−ヨードアセテート（０，５ｍｍｏ　ｌ）で処理する。該反 応混合物を蒸発乾固し、クロマトグラフィで精製して５−（３−ヨードアセタミ ドプロピル）−２’−デオキシウリジンを得る。

５−　（４−（４−ブロモブチルアミド）ブチル）−２′−デオキシクリジン。

実施例３の手順に従って、実施例２から得た５−（４−ツタルイミドプチー１− イル）−２’−デオキシウリジンをアンモニアで処理し、次にＮ−ハイドロキシ ーサクシンイミジル　４−ブロモブチレートで処理して、５−　（４−（４−ブ ロモブチルアミド）ブチル）−２１−デオキシウリジンを得る。

フォスフｔルアミダイトの作成およびＤＮＡの合成。

ヌクレオチド類を周知の方法に従って５”−ジメトキシトリチル化し、８５％前 後の収率を得た。また、メチレンクロライド中でジイソプロピルアミノβ−シア ノエチルクロロフォスファイトをジイソプロピルエチルアミンと共に用〜）て（ ”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ　ｐｒａｃｔｉｃ ａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ″、上記、に記載のように）３′−ホスフォルアミダイ トを作成した。該ホスフォルアミダイトを０．２規定溶液になるようにアセトニ トリル中に溶解して、自動Ｉ）ＮＡシンセザイザーにかけた。これらの新規かつ 修飾したホスフォルアミダイト類の組み込み操作で、通常のホスフォルアミダイ ト類と同様な組み込み収率を得た（紫外線により放出されたトリチルの呈色を測 定して判定したところ９７−９９％）。

オリゴヌクレオチド類をトリチル化した形でＤＮＡシンセザイザーから取り外し 、５５℃において６時間にわたり３０％アンモニアを用いて脱ブロック（ｄｅｂ ｌｏｃｋ）Ｌ、た。０．５Ｍ重炭酸ナトリウム１０μＬを加えて、濃縮している 間に酸性化するのを防いだ。談オリゴヌクレオチドを真空下に蒸発乾固し１．０ ｍＬの水に再溶解した。Ｍオリゴヌクレオチド類を、０．１規定トリエチルアン モニウムアセテート中に１５−５５％のアセトニトリルを含む溶離液を用いて２ ０分間高速液体クロマトグラフィで精製した。置換されなかったオリゴヌクレオ チド類は１０分目に溶出した；アミノ誘導体は１１−１２分間を要した。望まし い該オリゴヌクレオチドを集め蒸発乾固して、次に８０％水性酢酸中に９０分の あいだ再溶解してトリチル基を除去した。Ｇ２５セフアデツクス６カラムを用い て脱塩を行い、適切な諸画分を採取した。ｍｌｉｉ分を濃縮して、所定の容量と なし、希釈測定（ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ｒｅａｄｉｎｓｒ）を行い、全体的な収量 を確かめ、分析高速液体クロマトグラフィを行って純度を保証した。ｍオリゴヌ クレオチド類は使用時まで一２０℃に凍結保存した。

上記の手順後、該ヌクレオチドの５−（３−トリフルオロアセタミドプロビー１ −イル）−２′−デオキシウリジンを５′−〇−ジメトキシトリチルー３’　（ Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル）−フォスフオルアミダイトシアノエチルエステル誘導 体に変換した。これをＤＮＡシンセザイザーに加え、以下の１４置体オリゴヌク レオチドを作成した： ３’　−ＣＴ　ＴＣＣＵ’　ＴＧ　ＴＡＧ　ＧＴＣ−５’式中Ｕ１は５−（３− アミノプロビー１−イル）−２′−デオキシウリジン（オリゴＡ）である。

同様にして、５−　（４−フタルイミドブチ−１−イル）−２′−デオキシウリ ジンを５′−〇−ジメトキシトリチルー３’（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル）−フォ スフオルアミダイトシアノエチルエステル誘導体に変換してＤＮＡシンセザイザ ーに加え、式中（Ｊｌは５−（４−アミノブチ−１−イル）−２゛−デオキシク リジン（オリゴＣ）である１４置体オリゴヌクレオチド配列を作成した。

これに対応する、式中Ｕ１が非修飾デオキシウリジンである１４１体オリゴヌク レオチドも作成した。

実施例６： オリゴヌクレオチド類の誘導化。

一般に、アミノアルキルオリゴヌクレオチドにクロスリンキングφアームを付与 するには、アミノアルキルオリゴヌクレオチド１０　μｇと１００分子倍過剰置 のα−ハロアセテートまたは４−へロプチレートのようなｎ−ハイドロキシサク シンイミドハロアシレートとを、１０μＬのＯ，１Ｍホウ酸緩衝液、１）Ｈ８， ５の中に含む溶液を環境温度において３０分のあいだ暗所でインキュベートした 。蒸留水で平衡化し溶出したＮＡＰ−１０カラムに該反応液全量を流した。紫外 線吸収に基づき適切な諸両分を採取し、これを合わせて、濃度を分光光度法で測 定した。

ハ０アシル部分の導入を高速液体クロマトグラフィで調べたｅＺｏｒｂａｘＲオ リゴヌクレオチド・カラム（Ｄｕ＋）ｏｎｔ社）で、下記の組成からなる溶離液 Ｂの濃度勾配を２０分間で６０％から８０％に上げるグラディエンド法で溶離し た：Ａ　（２０％ｙセトニト’）ｋ：８０％　０．０２Ｎ　ＮａＨ２ＰＯ４）お よびＢ　（２０％７セトニ）　！Ｊ　ル中１　、２Ｎ　Ｎａ　ＣＩ　：　０−０ ２Ｎ　Ｎ　ａＨ２Ｐ　Ｏ４）。１Ｎシステアミンに暴露すると、α−ハロアシル アミドアルキルオリゴヌクレオチドの保持時間が対応するアミノアルキルオリゴ ヌクレオチドの保持時間に戻ったことにより、反応性α−へロアシル部分の存在 が示された。システアミンを導入すると、アミノアルキルオリゴヌクレオチドと α−ハロアシルアミドアルキルオリゴヌクレオチドとの間に等荷電パターンを生 じた。

上記の操作後、該１４置体オリゴヌクレオチド：式中Ｕ１は５−（３−アミノプ ロビー１−イル）−２’−デオキシウリジン（オリゴＣ１実施例５）である ３’　−ＣＴ　ＴＣＣＵＩ　ＴＧ　ＴＡＧ　ＧＴＣ−５’をｎ−ハイドロキンサ クシンイミド　α−ヨードアセテートと反応させて上記の１４置体オリゴヌクレ オチドを得た、式中Ｕ１は５−（３−ヨードアセタミドプロビー１−イル）−２ ′−デオキシウリジン（オリゴＢ）。

オリゴＡおよびオリゴＢ１ならびに式中Ｕ１が非修飾デオキシウリジンである上 記の１４置体をＺｏｂｒａｘカラムで解離し、全て同一の配列が示された、それ らの保持時間は以下のとおりであった：非修飾１４置体、９．３１分；アミノロ ピル１４置体（オリゴＡ）、７．３８分：およびヨードアセタミドプロピル１４ 置体（オリゴＢ）、１０．０９分。

同様にして、該アミノロビル１４置体（オリゴＡ）をＮ−ハイドロキシーサクシ ンイミド　４−ブロモブチレートと反応させ、式中Ｕ’が５−　（３−（４−ブ ロモブチルアミド）プロピー１−イル）−２′−デオキシウリジンであるＭ１４ １４置得た。

また、該アミノブチル１４ｆｆｉ体（オリゴＣ１実施例５）をＮ−ハイドロキシ ーサクシンイミド　α−ヨードアセテートあるいはＮ−ハイドロキシーサクシン イミド　４−ブロモブチレートのいずれかと反応させ、式中Ｕ１がそれぞれ５− （４−ヨードアセタミドブチ−１−イル）−２′−デオキシクリジンあるいは５ −（４−（４−ブロモブチルアミド）ブチ−１−イル）−２′−デオキシウリジ ンである該１４置体を得た。

実施例７： 修飾したオリゴヌクレオチド類のクロスワンキング・ポテンシャルの測定。

ＤＮＡプローブをターゲット核酸にクロスリンキングする反応は、ハロアシルア ミドアルキル・プローブ１μｇｉ６よび”ｐ−標識コルヂセビンー尾部をもつタ ーゲットを２００ｕＬのＯ，ＬＭ）リス、ｐＨ８，０および０．９ＭＮａＣ１中 で２０′あるいは３０℃においてインキュベートすることを包含する。２４−あ るいは７２一時間間隔で部分試料を採取し、これを１０ｍＭシステアミン２０μ Ｌに希釈して、該ハロアシルアミド基をクエンチ（消却）した。これらの溶液を 室温において保存し、その１μＬをポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＰＡＧ Ｅ）による分析に用〜）た。

上記の手順後、２つのモデル・オリゴヌクレオチド類を用いて、被修飾プローブ がその補体にクロスリンクするポテンシャルを測定した。ヒト・パピローマウィ ルス（ＨＰＶ）あるいはヒト・サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）から得た配列を 下記に示す： ＨＰＶ系： ターゲット：５’−ＡＧＡ　ＣＡＧ　ＣＡＣＡＧＡＡＴＴ　ＣＧＡ　ＡＧＧ　Ａ ＡＣＡＴＣＣＡＧ−３’■ ターゲット：５’−ＡＣＣＧＴＣ ｌｏ　１５　２０ ＣＴＴ　ＧＡＣＡＣＧ　ＡＴＧ　ＧＡＣＴＣＣ−３’プローブ：　３’−ＧＡＡ 　ＣＴＣＴＧＣＵＡＣＣＴＣ−５’旦＝５−　（３−（α−ヨードアセタミド） −または３−（４−ブロモブチルアミド）−プロピルクー２′−デオキシウリジ ン、またはＵ＝５−　（３−（α−ヨードアセタミド）−または４−（４−ブロ モブチルアミド）−ブチルツー２′−デオキシウリジン。

ＨＰＶのターゲットは３０分体である、またＣＭＶのターゲットは２４分体であ る。ＨＰＶのクロスリンキング会プローブは１４分体で、またＣＭＶのそれは１ ５分体であった。各プローブは、上記の配列においてｙ、と示した単一の被修飾 デオキシウリジンを包含した。

ＨＰＶターゲットと５−　（３−Ｅｌ−ドアセタミドプロビル）側鎖を包含する クロスリンキング・プローブ限定置との反応結果を図２に示す。開裂パターンを 変性ＰＡＧＥゲルで分析すると、（メイン・バンドに）付随して低分子量バンド が分離して出現し、クロスリンクしたハイブリッドが失われたことを示した。こ のバンドの強度は、該初期反応物中のクロスワンキングの程度に依存した。ｗｉ ゲルの分離バンド２本の中にシグナルが局在したことは、ターゲット鎖あるいは プローブ鎖のどちらにも、（分子内のプローブ・アルキル化を含めて）非配列指 向性のアルキル化は起きなかったことを強力に立証するものである。

１５厘体の標準品（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）を隣接の溝に適用して泳動した結果、 分離断片の主なものは９！体であることが示唆された。オートラジオグラムの原 像（オリジナル）を詳細に調べた結果、泳動速度のもっと遅い非常に希薄なバン ドが見えた。この泳動像は、Ｇ−２１におけるアルキレ−ジーンが大きり、Ｇ− ２０におけるアルキレージ１ンは小さいことと一致するだろう。クロスリンクが 可能なＨＰＶハイブリッド類のＤｒｅｉｄｉｎｓｒのモデルを調べた結果、５− （３−ヨードアセタミドプロピル）側鎖は、ヘリックス（らせん）が僅かに歪む だけでターゲット鎖のＧ−２１残基にコンタクトできることが示された。もし、 アルキレージ１ンが主として、被修飾デオキシウリジン塩基対の５′側の２単位 に位置しているターゲット鎖上のグアノシンのところで起きるならば、ＣＭＶ配 列はプローブと反応しないはずである。この結果が実際に観察された。該プロー ブにはＣＭＶとの反応性がないことは、本発明になるクロスワンキング計画の特 異性を更に支持するものである。

実施例８： 時間および温度依存性。

時間および温度への依存試験を実施例７のＵが５−（３−ヨードアセタミドプロ ビー１−イル）−２′−デオキシウリジンであるＨＰＶで実施した。末端トラン スフェラーゼとのコルデセピン・ティリングによりターゲットを３２ｐ−標ａｍ （Ｍａｎｉａｔｉｓら、”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ＋ｒ−Ａ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ″、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ＋　１９８２．２３９頁）して、過剰量のプローブと共にｐ Ｈ８，０トリス緩衝液中で２０″あるいは３０℃にお（１てインキュベートした 。インキュベート後０．２４．あるいは７２時間に部分試料を取り、等容量の１ ０ｍＭメルカプトエチルアミン（これはヨードアセタマイドと反応する）とクエ ンチして、後に実施する変性ＰＡＧＥあるいは非変性ＰＡＧＥによる分析用に室 温において保存した。

ハイブリッドのクロスリンケージは、変性ＰＡＧＥによりモニターしたところ、 ２つの温度において２４および７２時間の時点で明らかであった＜１！１３参照 ）。クロスリンクしたハイブリッド量は温度および時間の両者とともに増加した 。

３０℃におけるインキュページ腫ン後７２時間で約２０％のハイブリッドがクロ スリンクした。

ある温度範囲で別途に行った実験では、３７℃におけるクロスリンキングの半増 期（ｈａｌｆ−１ｉｆｅ）は約２日間であること、また５８℃では２４時間後に 反応が完結することが示唆された。この時間依存性の反応は、ヨードアセタマイ ド部分が加水分解しない、あるいは緩衝液と反応しないことを意味する。より高 い温度で反応率が増加したことは、ハイブリッドが維持されることを示唆し、そ の結果としてアルキレージ１ン率が温度とともに期待どおりに増加を示すのであ る。

実施例９： アルキレーシ璽ン部位特異性。

アルキレージ曽ン部位の特異性を解明するために、実施例７のクロスリンクした ＨＰＶハイブリッド（式中Ｕは５−（３−１−ドアセタミドブロビーエーイル） −２′−デオキシウリジンである）を１０％ピペリジン溶液に９０℃において６ ０分のあいだ暴露した。Ｍａｘａｍらにより示されたように（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ 　１．Ａｃ　ａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、７４：５６０　（１９７７））、この処 理はターゲットｆＩＡ３１−をアルキレ−シーン部位で解離する。その結果得ら れたデーターは、上記のクロスリンカ−で修飾された塩基対の上位２つ目のグア ニン（すなわち、ターゲット塩基の上位のグアニン）が、観察された排除作用（ ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ　ａｃｔｉｏｎ）であることを示し、ＨＰＶモデル系におけ るクロスリンキング反応は著しく特異的であることが示唆された。

ｅ　３２ｐ−１票；Ａ−ｔｓ−讐ｌナマ−７−ＦｊＧ、、３゜ 手続補正書く方式） ％式％ １、事件の表示 （国際出願番号）第ＰＣＴ／ＵＳ９０１０２７４０号平成２年特許願　第５０８ ２４２号 ２、発明の名称 架橋オリゴヌクレオチド ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　マイクロプローブ・コーポレーシ鱈ン４、代理人 居　所　東京都千代田区永田町２丁目４番２号秀和溜池ビル８階 山川国際特許事務所内 （１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．下記式（Ｉ′）： Ｒ１−Ｂ−（ＣＨ２）ｑ−（Ｙ）ｒ−（ＣＨ２）ｍ−Ａ′（Ｉ′）（式中、 Ｒ１は水素または糖部分若しくはその類似体であって、その際該類似体は糖部分 に酸素によって酸素を介して結合し且つ基Ｑ１、Ｑ２およびＱａを含有するリン 酸誘導体またはヌクレオチド結合形成に適する上記リン酸誘導体の反応性ブリカ ーサーで糖部分の３′または５′位で任意に置換されている、Ｑ１は水素、ホス フェートまたはジホスフェートであり、Ｑ２は＝Ｏまたは＝Ｓであり、 Ｑ３はＣＨ２−Ｒ′、Ｓ−Ｒ′、Ｏ−Ｒ′またはＮ−Ｒ′Ｒ′′であり、Ｒ′お よびＲ′′の各々は独立して水素またはＣ１−６アルキルであり、Ｂはオリゴヌ クレオチドの成分である核酸塩基またはその類似体であり、Ｙは機能的結合基で あり、 ｍおよびｑの各々は独立して０から８まで（０と８を含む）であり、ｒは０また は１であり、そして Ａ′は脱離基である） を有する化合物。
2. ２．下記式： Ｒ１−Ｂ−（ＣＨ２）ｑ−（Ｙ）ｒ−（ＣＨ２）ｍ−Ａ′（Ｉ′）（式中、 Ｒ１は糖部分またはその類似体であって、その際該類似体は糖部分に酸素によっ て結合したモノホスフェート誘導体で糖部分の３′または５′位で任意に置換さ れている、 Ｂはオリゴヌクレオチドの成分である核酸塩基またはその類似体であり、Ｙは機 能的結合基であり、 ｍおよびｑの各々は独立して０から８まで（０と８を含む）であり、ｒは０また は１であり、そして Ａ′は脱離基である） の少なくとも１つからなるオリゴヌクレオチド。
3. ３．請求項１に定義した式（Ｉ′）の少なくとも１つの標識化合物を含有するオ リゴヌクレオチドプローブを使用することからなる標識核酸配列の同定方法。
4. ４．（ａ）試験すべき試料中の核酸を変性させ、（ｂ）プローブと標的の架橋を 可能にする条件下で、式（Ｉ′）の少なくとも１つの標識置換化合物を含有する オリゴヌクレオチドプローブを標識核酸とハイブリッド形成させ、その際該プロ ーブは標的核酸の配列と相補的な配列からなる、（ｃ）試料を洗浄して非結合プ ローブを除去し、そして（ｄ）標的とプローブ核酸間の二量体形成を検出する、 段階からなる請求項３に記載の方法。
5. ５．請求項１に定義した式（Ｉ′）の少なくとも１つの標識置換化合物を含有す るオリゴヌクレオチドプローブを使用することからなる標的核酸配列の同定アッ セイ。
6. ６．請求項１に定義した式（Ｉ′）の少なくとも１つの標識置換化合物を含有し 標的核酸の配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド；二本鎖核酸を一本 鎖核酸に変換する変性試薬；並びにハイブリッド形成および架橋反応混合物から なるプローブ試薬成分からなる標的核酸配列の同定用キット。