JPS62255499A - 螢光性ヌクレオシド又はヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、螢光を発するヌクレオシド又はヌクレオチド
及びこれらを分子中又は分子末端に含むオリゴ又はポリ
ヌクレオチドに関する。

生体高分子、特に蛋白質や核酸における構造と搬能の相
関を明らかにするために、螢光プローブを利用した研究
が広く行なわれている。そして核酸の研究においては、
核酸中に存在する螢光性の微量塩基をプローブとして用
いる方法や、核酸へ螢光分子番化学的に導入してこれを
プローブとして用いる方法がある。螢光性塩基を有する
ヌクレオシドの例としては、アデノシン類やシチジン類
をクロルアセトアルデヒドで化学修飾して得られる、下
記式で示されるような螢光性のエテノ誘導体がある。

１、Ｎ６−ニテノア　　　　　３．Ｎ４−エテノシデノ
シン　　　　　　　　　チジン 特に、エテノアデノシン類は、中性で強く螢光を発する
ことから、これをプローブとして用いて種々の研究が行
なわれてきた。しかし、これらは塩基対形成能を有しな
い。

本発明者らは、螢光性を有しグアニンとの塩基対形成が
可能な、ピリミジンヌクレオシド又はヌクレオチド誘導
体を得るべくｔ１２意研究を行ない、本発明に刺違した
。

即ち、本発明は、一般式（１）で表わされる螢光性ヌク
レオシド又はヌクレオチドである。

Ｙ＋　Ｚ＋ とＹ＋が共にＨＯ−でｚｌがＨ−又はＨＯ−でＷ＋がＨ
−の化合物、あるいはＸ＋及び／又はＹｌがＨＯ（−Ｐ
−○＋ｎ　　（ｎは１．２又は３の整Ｈ 数を示す）でＺｌがＨ−又はＨＯ−でＷｌがＨ−である
。水酸基が公知の適当な保護基で保護されているものも
、本発明の範囲に含まれる。

一般式（Ｉ）の化合物の製造法を、×１とＹｌが共にＨ
Ｏ−で、ｚｌとＷｌが共にＨ−の場合を例にとって説明
する。まず、糖部の水酸基を保護した５−ヨードデオキ
シシチジンにトリメチルシリルアセチレンを２価のＰｄ
の存在下で作用させ、得られた化合物のＮ−４位をアセ
チル化し、ヨウ化第−銅の存在、下に′加熱処理し、次
いで保護基を除去する。

上記の如くして得られた螢光性ヌクレオシドは、その３
′位又は５′位に後述の如き方法でリン酸基を導入し本
発明のヌクレオチドとすることができる。

かくして得られた一般式（Ｉ）の化合物は、螢光性であ
りかつ核酸塩基のグアニンと塩基対を形成する能力があ
るので、これを分子中又は分子末端に有するオリゴ又は
ポリヌクレオチドは、螢光プローブとして利用できる。

あるいは、これらの化合物は、ＤＮＡ二重らせん中に組
み入れた際に、塩基部分は空間的に適合しており、相補
的な塩基間の水素結合形成能力又はスクッキング作用を
増強する可能性も考えられる。

従って、本発明はまた、分子中又は分子末端に、一般式
（ＩＩ）で表わされる螢光性ヌクレオチドを、少なくと
も１個含有するオリゴ又はポリヌクレオチドをも含むも
のである。

ＲＩ　　　Ｒ２ ２Ｚ２ ○ ＩＩ が−Ｐ−０−であり、Ｙｌが一〇−でＷ７がＨ−０ｆ−
（ である、オリゴ又はポリヌクレオチドである。

螢光性ヌクレオシド又はヌクレオチドをＤＮＡオリゴマ
ーあるはポリマーへ導入するには、有礪化学的に合成す
る方法と、酵素化学的に導入する２通りの方法がとられ
る。

有礪化学的に合成する方法は、螢光性ヌクレオシド（Ｆ
）を含むオリゴヌクレオチドを直接合成する方、法であ
る。Ｉ　ｔａｋｕｒａらが開発した、固相リン酸トリエ
ステル法を用いて、第１図に示すサイクルに従って合成
を行なった。

すなわちステップ１として、ベンゼンスルホン！　（Ｂ
ＳＡ）で、５′−水酸基のジメトキシトリチル基（ＤＮ
Ｔｒ基）を除去し、ステップ２で、ダイマーブロックを
メシチレンスルホン酸ニトロトリアゾール（ＭＳＮＴ）
で縮合し、固相■に担持されＦ含有オリゴマーの鎖を伸
長した。また、目的と異なる配列のオリゴマー生成を防
ぐために、縮合反応において未反応の５′−水酸基は、
４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）存在下無水酢
Ｍ（ＡＣｚ○）でキャッピングを行なった。

このサイクルをくり返すことによって、目的とするオリ
ゴマーを合成した。オリゴヌクレオチドのポリマー支持
体からの切り出しとリン酸の保護基の除去は、ｙ　４で
アンモニア水で処理することにより行なった。

更にアンモニア水で加熱処理することにより、塩基部の
アシル基を除去した。次いで逆豹のシリカゲルカラムク
ロマトグラフィーで精製し、必要なフラクションを分取
し、５′−末端のＤＭＴｒ基を除去し、更に高速液体ク
ロマトグラフィーで精製した。

螢光性ヌクレオシド又はヌクレオチドをＤＮＡオリゴマ
ーあるいはポリマーに酵素化学的に導入する方法として
は、例えば、 （ｉ）ＤＮＡポリメラーゼを用いるニック・トランスレ
ーション （Ｒｉｇｂｙ、　Ｐ　、　Ｗ、ら、　Ｊ、　Ｍｏｌ、　
Ｂｉｏｌ、　、ユ旦。

２．３７　（１９７７）参照） （ｆｉ）　　末端デオキシヌクレオチドトランスフェラ
ーゼを用いる３′−末端付加反応 （Ｆ、Ｊ、Ｂｏｌｌｕｍ　　、Ｔｈｅ　　Ｅｎｚｙｍｅ
ｓ、　　（Ｐ、Ｄ。

Ｂｏｙｅｒ、ｅｄ、　）、３ｒｄ　　Ｅｄ、　　　Ｖｏ
ｌ、１０　　、ｐｐ、１４５−　１７１．Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　、Ｎ。

Ｙ、　　（１９７４）参照） の２つが、通常用いられる。

いずれの酵素を用いる場合にも、基質としては、好まし
くは、ヌクレオシド５′−トリリン酸が用いられる。螢
光性ヌクレオシドの５′−モノリン酸の合成は、Ｙ　ｏ
ｓｈｉｋａｗａら（Ｔ　ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　ｌ　
ｅｔｔ、、　５０６５　（１９６７）　）の方法に従っ
て合成できる。

また、５′−モノリン酸をイミダゾリドとした後シリン
酸と反応させる、５′−トリリン酸の合成は、Ｑ　ｔｔ
ｏらの方法（Ｊ、　Ａｍ　、Ｃｈｅｗ、Ｓｏｃ、。

鉦−＋　１７８５−１７８８　（１９６５）　）に従っ
て行なうことができる。

次に合成した５′　−トリリン酸を基質として用い、Ｄ
ＮＡポリメラーゼを用いて、ニック・トランスレーショ
ンを行なうと、シチジンの代りに、螢光性ヌクレオチド
が導入され螢光標識されたオリゴマーあるいはポリマー
を調製することができる。また、末端デオキシヌクレオ
チドトランスフェラーゼを用いると、３′−末端に螢光
性ヌクレオチドポリマーを付加することができる。

以下、実施例により本発明を詳述する。

実施例１ Ｃ４Ｈ９ （１）５−ヨードデオキシシチジン（ａ＋８ｇを無水ピ
リジン１５０ｄに懸濁させ、これに１．１，３．３−テ
トライソプロピル−１，３−ジクロルジシロキサン８．
６７　（１，２当岱）を水冷下で加え、その後室温で２
時間反応させた。

水冷下で、水２ｄを加えて反応を停止し、１０分間放置
した後、溶媒を減圧上留去した。残漬を水−クロロホル
ム系で抽出し、クロロホルム層を無水５Ａ５！２ナトリ
ウムで乾燥した。クロロホルムを留去した後、シリカゲ
ルクロマトグラフィーにより・　精製し、メタノールで
再結晶して、３’　、５’　−０−（１，１，３，３−
テトライソプロプルジシロキサン−１，３−ジイル）−
５−ヨードデオキシシチジン＋ｂ＋１２．１ｇを得た。

物性値は次の通りであった。

ｍ、ｐ、２１０−２１１℃ メタノ−１し ＵＶ　　　λｍａｘ　　　２９３ｎｌｌ！Ｍａｓｓ　　
　　ｍ／ｅ　　　　５９５（Ｍ”　　）　　５５２（Ｍ
−４３＞ＮＭＲ（ＣＤＣＬ３　）　　δ＋　８．０６　
　（ｓ、　　１Ｈ，Ｈ−６７，５１（ｂｒｓ、　　ＩＨ
、−ＮＨｚ　　）　　、　　５．９８　　（Ｑ。

ＩＨ，Ｈ−１’　　）、　　５．５７　　（ｂｒｓ、　
　ＩＨ，−ＮＨｚ　　）４．５〜３．７（ｍ、４Ｈ，Ｈ
−３’　　、４’　　、５’　　）。

２．８〜２．２（ｍ、　　２Ｈ，Ｈ−２’　　）　　１
．２〜０．８（ｉ、　　２８Ｈ，−ＣＨ（ＣＨ３）２　
　）元素分析値　Ｃｊ＋　Ｈ３８０５Ｎ３　１　Ｓｉ　
２として、ＣＨＮ 計算値（％）　　　４２．３４　　６．４３　　　７．
０５実測値（％）　　　４２．１０　　６．４１　　　
７．００（２）３’　、５’　−０−（１，１，３，３
−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）
−５−ヨードデオキシシチジン山）６ｇを無水ジメチル
ホルムアミド２０ｄに溶かし、水冷下で、１−ヘキシン
２．１ｄ（１，２当］）、ジクロロビス（トリフェニル
ホスフィン〉パラジウム３５０１ｔ’ｊ　（０，０５当
量）、ヨウ化第−銅１９０＃１ｇ（０，１当量）、トリ
エチルアミン２．１ｄ　（１，５当量）を加えた、６０
℃で２時間加熱した。溶媒を減圧上留去して、残渣をク
ロロホルム１５０ｍ１に溶解し、２％ＥＤＴＡ水溶液１
００ｄ×３．蒸溜水１００ａｉ！　Ｘ　３の順に洗浄し
た。クロロホルム層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、
クロロホルムを減圧下で留去した後、シリカゲルクロマ
トグラフィーにより精製して、３’　、５’　−０−（
１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１
，３−ジル）−５−（１−へキシニル）−２’−デオキ
シシチジン＋ｃ＋　４．５ｇを得た。物性値は以下の通
りであった。

Ｕ　Ｖ　　ｉ”ｎ”−ａ’Ａ　　２３４．２９７ｎｌｌ
ｌＮ　Ｍ　Ｒ（ＣＤ　Ｃ２３）δ＋７．９６　　（ｓ、
　ＩＨ，Ｈ−６）　、　　７．１８　　（ｂｒｓ、　Ｉ
Ｈ、−ＮＨ２＞　、　　６．０１（ｄ、Ｊ−４，５Ｈ２
，ＩＨ，Ｈ−１’　）　、　　５．７８（ｂｒｓ、　Ｉ
Ｈ，−ＮＨｚ　）　　４．３４　　（Ｌ　１Ｈ，Ｈ−３
’　）　、　　４．１０　　（ｍ、　ＩＨ，Ｈ−４’　
）　　３．７９（ｍ、　２Ｈ，１−１−５’　　）　、
　　２．６〜２．２（ｍ、　２Ｈ。

Ｈ−２’　）　、　１．７〜１．２（ｍ、　４Ｈ，メチ
レン）。

１．２〜０．８（１１１，３１Ｈ，−ＣＨ（ＣＨ３）　
　２　　。

−ＣＨ３） （３）　　３’　、５’　−０−（１，１，３，３−テ
トライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−５
−（１−ヘキシニル）−２′−デオキシシチジン（Ｃ）
　４．０ｇを、無水塩化メチレン５０１ｒ１１に溶解さ
せ、無水酢酸Ｌｄ（１，５当量）、ピリジン１．２ｍ　
（２当量）を加えて、室温で３時間反応させた。メタノ
ール１ｄを加えて、反応を停止し、クロロホルム５０ｄ
を加えて、飽和重曹水１００ｄ　Ｘ　２　、蒸留水１０
０ｄ　Ｘ３の順で、クロロホルム層を洗浄し、無水硫酸
ナトリウムで乾燥し、クロロホルムを減圧下で留去した
。残渣のうち、１．３ｇを無水ジメチルホルムアミド５
ｄに溶解し、ヨウ化第−銅２２０１１１９　（０，５５
当量）を加えて、１２５℃で１０分間加熱して反応させ
た。沈澱を、遠心で除去して、上滑にクロロホルム５０
ｍを加えた。クロロホルム層を、２％ＥＤＴＡ水溶液５
０ｒｄ、Ｘ　２　、蒸溜水５０ＩｄＸ　３の順で洗浄し
、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。クロロホルムを減圧
上留去した後、シリカゲルクロマトグラフィーにて［１
して、７−７セチルー６−ブチルー３−　［３’　、５
’　−０−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシ
ロキサン−１，３−ジイル）−β−Ｄ−デオキシリボフ
ラノシル］−２−オキソピロロ［２，３−ｄ　］ピリミ
ジン（ｅ＋　１．０６　ｇを得た。物性値は以下の通り
であった。

メタｔ−ｒし Ｕ　Ｖ　　　′λ　ｍａｘ　　　　　　２４５，３４２
ｒ＋＋ｎＭａｓｓ　　　ｍ／ｅ　　　　　　５９１（Ｍ
”　　）Ｎ　　Ｍ　　Ｒ（ＣＤ　　Ｃ１３）　　δ　＋
　　８．３７　　　（ｓ、　　ＩＨ，Ｈ−４＞　、　　
６．０８　　（ｄ、Ｊ−６，３Ｈｚ、　　ＩＨ，Ｈ−１
’　　＞。

５．９７　　　（ｓ、　　ＩＨ，Ｈ−５）、　　４．４
〜３．７（ｍ、　　５Ｈ。

Ｈ−３’　　　、４’　　　、５’　　　）　　、　　
　　２．８９　　　（Ｓ、　　３Ｈ，ＡＪ　　Ｌ２．８
〜　２．２（＋、　　２Ｈ，Ｈ−２’　　　）　　、　
　　　１．７〜　１．２（ｍ、４）（、メチレン＞、　
　１．２〜０．８（ｍ、　　３１Ｈ。

−ＣＨ（ＣＨ３）２　　、　　−ＣＨ３）（４）７−ア
セチル−６−プチルー３−　［３’　、５’−Ｏ−（１
，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，
３−ジイル）−β−Ｄ−デオキシリボフラノシル］−２
−オキソピロロ［２，３−ｄ　］ピリミジン（ｅ）　１
．’０１　ｇを無水Ｔ　ＨＦ　２０ｒｄ、に溶解して、
１Ｍテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリド１ｒｎ
ｌを加えて、空温で３時間反応させた。次いで１アンモ
ニア水２ｄを加えて、空温で３０分間反応させた。溶媒
を、減圧下で留去し、残漬をジエチルエーテル−エタノ
ール水から再結品して、６−プチルー３−（β−Ｄ−デ
オキシリボフラノシル）−２−オキソピロロ［２，３−
ｄ　］ピリジン（ｔ＋　３９０ｍｇを得た。物性値は以
下の通りであった。

（３４０ｎｍ　　（ε−３，８００） ＮＭＲ（ＤＭＳ〇−ｄ　６−Ｃ２０）δ＋８．４９（ｓ
、　ＩＨ，Ｈ−４）　、　　６．２５　　（ｄ、Ｊ−６
，ＩＨｚ。

ＩＨ，Ｈ−１’　）　、　　５．９０　　（ｓ、　ＩＨ
，Ｈ−５）。

４．２３　　（ｉ、　ＩＨ，Ｈ−３’　）　、　　３．
８６　　（ｍ、　ＩＨ。

Ｈ−４’　）　、　　３，６５　　（Ｌ　２Ｈ，Ｈ−５
’　）　。

２．４〜１．８（ｍ、　２ｔ−１，Ｈ−２’　）　、　
　１．８〜１．１（ｉ、４日、メチレン）−０，８９＜
ｔ　、　　３Ｈ。

−ＣＨ３） −，（’Ｉ ｕ （１）実施例１と同様の方法に従って、３’　、５’　
−０−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキ
サン−１，３−ジイル）−５−ヨード−２′−デオキシ
シチジン（ｂ＞に対して、１−ヘキシンの代りに、トリ
メチルシリルアセチレンを反応させて、３，５゜−Ｏ−
（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−
１，３−ジイル）−５−［２−（トリメチルシリル）エ
チニル］−２１−デオキシシチジン（Ｃ）を得た。

〆り／−Ｊし ＵＶ　　λｍａｘ　　　２４３，２９８ｎｏ＋ＮＭＲ（
ＣＤＣｊｓ　）δ＋８．０４　　（Ｓ、　ＩＨ，Ｈ−６
）。

７．４４　　（ｂｒｓ、　１Ｈ，−ＮＨ２）　、　　６
．０２　　（ｄ　。

Ｊ　−４，９Ｈｚ、　ＩＨ，Ｈ−１’　）　、　　５．
７８　　（ｂｒｓ　。

ＩＨ，ＮＨｚ　）　、４．３４　　（ｎ＋、　ＩＨ，Ｈ
−３’　　）　。

４．１０　　（ｍ、　ＩＨ，Ｈ−４’　）　、　　３，
７６　　（ｍ、　２Ｈ。

）−１−５’　　）、　　２．７〜２．１（ＩＩ、　２
Ｈ，Ｈ−２’　　）　。

１．２〜０．９（ｍ、　　２８Ｈ，−ＣＨ（ＣＨ３）　
ｚ　）　。

０．１９　　（ｓ　、　　９Ｈ，−３ｉ　　（ＣＨ３）
３　）元素分析ｇ１Ｃユ＆ＨＩ＋７０５　Ｎ３　Ｓ！　
３としてＣＨＮ 計算値（％）　　　５５．１８　　　８，３７　　　７
．４２実測値（％）　　　５４，９４　　　８，３６　
　　７．５１（２実施例１と同様の方法に従って、７−
７セチルー３−　［３’　、５’−〇−（１，１，３，
３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル
）−β−Ｄ−デオキシリボフラノシル］−２−オキソピ
ロｏ［２，３−ｄ］ピリミジン（ｅ）を得た。

メタノ−！し Ｕ　■　　　λ　ｍａｘ　　　　　　２４７，３４０ｎ
ｍＮ　　Ｍ　　Ｒ（ＣＤ　Ｃ２３）　　δ　＋　　８．
５９　　　（Ｓ、　　ＩＨ，Ｈ−４）７．６５　　　（
ｄ、Ｊ−４，２Ｈ２，ＩＨ，Ｈ−６＞　　。

ｅ、３２　　　（ｄ、Ｊ＝　　　４．２Ｈｚ、　　　１
１−１．　　　Ｈ−５＞　　。

６、Ｒ（ｄ、Ｊ＝　　　６．８Ｈｚ、　　　ＩＨ，Ｈ−
１’　　　）　　。

４．６〜３．８（ｍ、　　４Ｈ，Ｈ−３’　　　、４’
　　　、５’　　　）　　。

２．９４　　　（ｓ、　　３Ｈ，Ａｃ　　）　　、　　
　　２．９〜　２．２（ｍ、　　２Ｈ。

１−１−　　２’　　　）、　　　　１．２〜　０．９
（ｍ、　　　　２８Ｈ，−Ｃ）（（ＣＨ３）２　　）Ｍ
ａｓｓ　　　ｒｐ／ｅ　　　５３５（Ｍ”　　）（３）
実施例１と同様の方法に従って、脱保護を行なって、３
−（β−Ｄ−デオキシリボフラノシル）−２−オキソピ
ロロ［２，３−ｄ　］ピリミジン（ｆ＞を得た。物性値
は、以下の通りであった。

ＬＤ、　１６８〜１６９℃（メタノール−水より再結晶
）水 ＵＶ　　λｍａｘ　　　２７０ｎｍ　　（ε−４，２０
０）　、　　３３６ｔｖ（ε−３，３００） ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ　ｓ　−Ｄｚ　Ｏ）δ＋８．７１
（ｓ、　１）−１，Ｈ−４）　　７．１０　　（ｄ　、
　　Ｊ　−３，９Ｈｚ　。

ＩＨ，Ｈ６）、　　６．２５　　（ｔ、Ｊ−６，４Ｈ２
，ＩＨ。

Ｈ−１’　　）　、　　６．２３　　（ｄ、Ｊ−３，９
Ｈｚ、　　ＩＨ。

Ｈ−５）、　　４．３〜３．７（ｍ、　　５Ｈ，Ｈ−３
’　　、４’　　。

５’）、２．５〜１．８（ｍ、　２Ｈ，Ｈ−２’　　）
　。

元素分析ｆｉＩＣ１ｌ　Ｈ＋！０４　Ｎ３　トシテＣ）
（Ｎ 計算値（％）　　　５２，５９　　　５．２２　　１６
．７２実測値（％）　　　５２，３８　　　５．２８　
　１６．４９実施１！１１３ 実施例１で得られた３−（β−Ｄ−デオキシリボフラノ
シル）−２−オキソピロロ［２，３−ｄ　］ピリミジン
＜ｅｒ　５２０ｍｇを、無水トリエチルホスフェート５
ｄ１．：溶かし、これを０℃に冷却して、オキシ塩化リ
ン６１３ｍｙを加え、ａｌｌ￥間反応させた後、氷１ｇ
を加えて加水分解した。減圧下溌縮した後、残４漬を蒸
留水１ｄに溶かして、ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２
５（ＨＣＯＩ−型）を用い、トリエチルアンモニウムビ
カーボネートのＭ線淵度勾配にて、Ｍ製し、３−（Ｓ’
−０−ホスホリル−β−Ｄ−デオキシリボフラノシル）
−２−オキソピロロ［２，３−ｄ　］ピリミジン５００
■を得た。

実施例４ １−Ｉ　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｈｌり 実施例３で得られた３−（５’−０−ホスホリル−β−
Ｄ−デオキシリボフラノシル）−２−オキソピロロ［２
，３−ｄ　］ピリミジン（ｆ）９０Ｒｇを無水ジメチル
ホルムアミド５！ｄに溶かし、カルボニルジイミダゾー
ル４００　ｍｇを加えて、空温で１時間反応させた。そ
の後、反応液を、２０ｒｄの１％ヨウ化ナトリウム／ア
セトンに注ぎ、生成した沈澱は瀘濃縮した後、残漬を蒸
留水３−に溶かして、ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２
５（ＨＣＯ３−型）を用い、トリエチルアンモニウムピ
カーボネートの直線濃度勾配にて精製し３−（ｓ’−ｏ
−ジホスホリルーβ−Ｄ−デオキシリボフラノシル）−
２−オキソピロロ［２，３−ｄ　］ピリミジン（ロ）５
０ＩＩｔｇを得た。

実施例５ ＨＨ （ｈｌ 実施例４におけるモノートリー〇−ブチルアンモニウム
ホスフェートの代りに、ジ−トリーｎ−ブチルアンモニ
ウムジホスフェートを用いて、同じ操作を行ない、３−
（５’−０−トリホスホリル−β−Ｄ−デオキシリボフ
ラノシル）−２−オキソピロロ［２，３−ｄ　］ピリミ
ジンを得た。

法（第１因参照）で行なった。固相支持体は、１％架橋
ポリスチレン樹脂を３１−末端となるシチジンは、３′
−水酸基と樹脂とをこはく酸エステ。

ルで結合し、担持した。合成は、第１図に示すサイクル
に従って、ダイマーブロック縮合を行なった。

ステップ１（脱トリチル化反応） ５μｆｆ１０１ヌクレオシド相当の樹脂を用いて、２％
ベンゼンスルホンＷ！１（ＢＳＡ）クロロホルム溶液２
ｄで１分間処理した（２回くり返した）。

二二二ＬＬ（縮合反応） ダイマー２０μｌ１１０１を２００〜３００μ文のとリ
ジンに溶かし、縮合剤として、メシチレンスルホン酸ニ
トロトリアゾール（ＭＳＮＴ）７０μｆｆ１０１を加え
て、４０℃で２０分間反応させた。

ステップ３（キャッピング反応）（未反応物の非反応化
反応） 無水酢Ｒ（ＡＣｚ　Ｏ）　　０．２ｍｌを０．１Ｍ４−
ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）のピリジン溶液１
．８ｍｌと混合しく用時Ｏｉｌ製）、反応させた。

この操作（ステップ１〜３）を、５回くり返し、ドデカ
マーを合成した。

合成したドデカマー（ｄＧＧＧＡＡＦＴＴＴＣＣＣ・・
・・・・Ｆは螢光性ヌクレオシド）は、次の順序の操作
に従って、脱保護し精製した。

（１）濃アンモニア水１６ｄとピリジン４ｄを加え、空
温で２４時間反応させた。

０）　さらに、５０℃に加熱して４時間反応させた。

０　逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＩ８
カラム：ウォータース社製、３５〜１００μＴｒＬ）で
、ＩＩした（アセトニトリルグラジェント：１０％−３
５％）。

ＧＪ　　８０％酢酸に溶かし、Ｖ温で２０分間処理して
、５′　−末端のジメトキシトリチル基な除去した。

（Ｖ）　　逆相店速液体クロマトグラフィーにてＭｌし
た（東洋ソーダー：ＴＳＫ−４１０ΔＫ）。

・Ｄ　イオン交換高速液体クロマトグラフィーにてＩＮ
して、単一ピークを（ｑた（東洋ソーダ：ＴＳＫｏｅｌ
　　ＩＥＸ　５４０Ｋ）。

以上の様な方法で下に示す５種類の自己相補的なドデカ
マー（１２母体）を合成した。

５’　　　ｄＧＧＧＡＡ　　ＣＧ　　ＴＴＣＣＣ３’３
’　　　ＣＣＣＴＴ　　ＧＣＡＡＧＧＧｄ　　５’５’
　　　ｄＧＧＧＡＡ　　ＦＴ　　ＴＴＣＣＣ３’３’　
　　ＣＣＣＴＴ　　ＴＦ　　ＡＡＧＧＧ（１５’５’　
　　ｄＧＧＧＡＡ　　ＦＣＴＴＣＣＣ３’３’　　　　
ＣＣＣＴＴ　　ＣＦ　　ＡＡＧＧＧｄ　　５’５’　　
　ｄＧＧＧＡＡ　　ＦＡ　　ＴＴＣＣＣ３’３’　　　
　ＣＣＣＴＴ　　ＡＦ　　ＡＡＧＧＧｄ　　５’５’　
　　　ｄＧＧＧＡＡ　　　ＦＧ　　ＴＴＣＣＣ３’３”
　　ＣＣＣＴＴ　　ＧＦ　　ＡＡＧＧＧｄ　　　５’ド
デカマーのＵＶスペクトルにおいて、３４５ｎｍの吸収
より、螢光性ヌクレオチドの存在が確認された。

（２）各ドデカマーの吸光度（２６０ｎｍ　）の温度変
化を測定し、Ｔｌｌ１を算出した。結果を第２表に示し
た。（測定条件：濃度０．７５　Ａ：＝ｂｏ、溶媒　０
．ＩＭＮａ　ＣＬ　　Ｏ，０１Ｍカコジル酸ナトリウム
）。

第２表の結果より、Ｆを含むドデカマーＮ０２〜５のう
ち、Ｎα５のみが、Ｔｌ１１を有し、Ｎ（１１のＴｌ１
１に近い温度であることから、ＦはＧとのみ水素結合を
形成し、その結合力も、Ｃと同程度であることがわかっ
た。

さらに、螢光相対強度については、ドデカマーに導入し
ても若干低下するだけであり、二本鎖を形成する場合で
も、変化がなかった。

第２表 ｄｉ：　　　　　　　　　　　１００ １、　ｄＧＧＧＡＡＣＧＴＴＣＣＣ５０，５０２、ｄＧ
ＧＧＡＡＦＴＴＴＣＣＣ１０１，４３、ｄＧＧＧＡＡＦ
ＣＴＴＣＣＣ９６，７４、ｄＧＧＧＡＡＦＡＴＴＣＣＣ
７３，６５、ｄＧＧＧＡＡＦＧＴＴＣＣＣ４９，５９１
，９（以下余白） 実施例７ ｔｊＦ　Ｔ　ＰのＤＮＡポリメレース■による認識○ ｄＦＴＰ　　　　　　　　　　　　　ｄＦ＊ＴＰ　　　
　　さら２、　ｄ ピロロ及びピリドピリジン誘導体（ｄＦＴＰ及　　　　
（び（ＩＦ”−ＴＰ）が、ＤＮＡポリメレースエの基質
として、認識されるかどうかを検討するため、次　　３
．大の実験系で検討した。　　　　　　　　　　　　　
　　　ラ１、反応混合液 １／ｄ）　　　　　　　　　　　　　　１μｎに滅菌水
を加えて、全体を１８μ又とする。

ＦＴＰあるいは、ｄＦ＊ＴＰ溶液 ７．５．２５．５０．　１００．　２００μｕ）５μ旦 腸菌ＤＮＡポリメラーゼエ（タレノーフグメント）　（
１ユニツト／１０μｉ）２μ旦 ２．３の溶液を混合し、３７℃で２０分間イユベーショ
ンした。反応系を２０μ磨とっＤＥＡＥ−ベーパーにス
ポットし、洗浄、ＤＥＡＥ−ベーパー上の［Ｊ）−１］
ｊＥｌを、液体シンチレーションにて測定した。

結果を第２図と第３図に示した第２図はｄＣＴＰの代り
にｄＦＴＰあるいはｄＦ＊ＴＰを加え、第３図はｄＴＴ
Ｐの代りにｄＦＴＰあるいはｄＦ”ＴＰを加えた。

第２図と第３図から、ｄＦＴＰは、ｄＣＴＰの代りとし
てのみ認識されるが、ｄＦ＊　ＴＰは、ｄＣＴＰ及びｄ
Ｔ　Ｔ　Ｐの代りとして認識されて、とり込まれること
がわかった。従って本発明の化合物の方が選択性に優れ
ている。また、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆ　ｐｌｏ℃でＫ
ｍを求めたところ、第３表と第４表の様になり、ＤＮＡ
ポリメラーゼエとの親和性は、ｄＦＴＰ。

ｄＦ＊ＴＰのいずれも天然の基質とほとんど変わらない
ことがわかった。

第３表 第４表

【図面の簡単な説明】

第１図は、固相リン酸トリエステル法によるオリゴヌク
レオチドの合成システムを示す図である。 第２図と第３図は、ｄＦＴＰとｄＦ＊ＴＰのＤＮＡボリ
メレースエによる認識反応の結果を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式（ I ）で表わされる螢光性ヌクレオシド又
   はヌクレオチド。 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・・・・（ I
   ） 〔式（ I ）において、Ｘ＿１とＹ＿１は各々▲数式、
   化学式、表等があります▼を表わす（ｎは０、１、２ 又は３の整数を示す）。Ｚ＿１はＨ−又は ▲数式、化学式、表等があります▼を表わす（ｍは０、
   １、２ 又は３の整数を示す）。Ｗ＿１はＨ−又はＨＯ−を表わ
   す。Ｒ＿１とＲ＿２は水素又は炭素数が１〜１０のアル
   キル基を表わす。〕 ２、一般式（１）において、Ｘ＿１とＹ＿１が共にＨＯ
   −でＺ＿１がＨ−又はＨＯ−でＷ＿１がＨ−である、特
   許請求の範囲１項記載の螢光性ヌクレオシド。 ３、一般式（ I ）において、Ｘ＿１及び／又はＹ＿１
   が▲数式、化学式、表等があります▼（ｎは１、２又は
   ３の整数を 示す）でＺ＿１がＨ−又はＨＯ−でＷ＿１がＨ−である
   、特許請求の範囲第１項記載の螢光性ヌクレオチド。 ４、分子中又は分子末端に、一般式（II）で表わされる
   螢光性ヌクレオチド単位を、少なくとも１個含有するオ
   リゴ又はポリヌクレオチド。 ▲数式、化学式、表等があります▼・・・・・・（II） 〔式（II）において、Ｘ＿２は▲数式、化学式、表等が
   あります▼ 又は▲数式、化学式、表等があります▼を表わし、Ｘ＿
   ２が ▲数式、化学式、表等があります▼のときＹ＿２又はＺ
   ＿２は−Ｏ −を表わし（但し他方は水素又は水酸基を表わす）。 Ｘ＿２が▲数式、化学式、表等があります▼のときＹ＿
   ２又はＺ＿２は−Ｏ−又は▲数式、化学式、表等があり
   ます▼を表わす（但し他 方Ｈ−又はＨＯ−を表わす）（ｒは０、１、２又は３の
   整数を示し、ｓは１、２又は３の整数を示す）。Ｗ＿２
   は水素又は水酸基を表わす。Ｒ＿１、Ｒ＿２は水素又は
   炭素数が１〜１０のアルキル基を表わす。〕 ５、一般式（II）において、Ｘ＿２が▲数式、化学式、
   表等があります▼であり、Ｙ＿２が−Ｏ−でＷ＿２がＨ
   −である、特許請求の範囲第４項記載のオリゴ又はポリ
   ヌクレオチド。