JP6147502B2 - ポリヌクレオチドプライマー及びプローブ - Google Patents

ポリヌクレオチドプライマー及びプローブ Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本願は、２００９年１０月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／２５５，４６１号への優先権を主張し、その開示を参照により全体を本明細書に援用する。
本発明は、ポリヌクレオチドの組み合わせ及びそれらの用途に関する。
従来より、核酸の検出及び増幅は、遺伝子解析、分子的診断法、及び新薬開発で重要な役割を果たしている。そのような用途の多くは、特定のＤＮＡ又はＲＮＡ分子、遺伝子発現、全ポリヌクレオチドの小フラクション中に存在するＤＮＡ突然変異又はＤＮＡメチル化の特異的、高感度かつ安価な定量的検出を必要とする。多くの現行法は、非常に少量のＤＮＡ又はＲＮＡを臨床サンプルから検出かつ定量化するために、ポリメラーゼ連鎖反応、又はＰＣＲ，並びに特にリアルタイムＰＣＲ法（定量的、すなわちｑＰＣＲ）を用いる。
現在のＰＣＲアッセイの性能は、その感度が絶えず改善されてはいるが、特異性及びコストは、広範囲に許容可能な診断的テストになるためには未だほど遠い。ただし、当該技術分野で現在用いられている多くのＰＣＲ法は、その方法を多くの実際的な用途に対して不適切であるとするような技術的制限を受けている。例えば、標的分子が、１つ又は両プライマーの標的への結合を阻害又は完全に抑制するような二次構造を有する場合には、増幅が減少され得るか又は完全に排除され、このことが、例えば、診断的見地からすると、高感度であると期待される結合特性を備えた高度に特異的なプライマーの使用以外は有病誤診を引き起こす可能性がある。他の課題としては、それらが多数の非変異ＤＮＡ分子と混合される状況での単一の塩基突然変異を備えた希少ＤＮＡ分子の検出及び識別における現行のリアルタイムＰＣＲアッセイの低感度、並びに複数の突然変異検出アッセイを１つの多重診断的アッセイに組み合わせるための能力が挙げられる。
したがって、次世代配列決定プラットフォームを用いる診断法のためのＰＣＲの新規な用途を含む、当該技術分野で認識されている技術的問題を克服するための能力を保持する高結合特異性を低合成コストに組み合わせた増幅プライマーの開発のための必要性が、当該技術分野において存在している。
１つの態様では、本開示は、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせを提供し、第１のポリヌクレオチド（Ｐ）は、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に相補的な配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）を含み、第２のポリヌクレオチド（Ｆ）は、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に相補的である第１のドメイン（Ｆｂ）と、ＰｃとＦｄとが適切な条件下でハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含み、標的ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドへのＦｂのハイブリダイゼーションによって変性される二次構造を有する。１つの態様では、標的ポリヌクレオチドの二次構造は、Ｆの不在下において標的ポリヌクレオチドのポリメラーゼ伸長を阻害する。また、本開示は、ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせＰ及び／又はＦが、修飾核酸を更に含むような態様も意図している。
本開示は、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせを提供し、第１のポリヌクレオチド（Ｐ）は、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、第２のポリヌクレオチド（Ｆ）は、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｆｂ）と、ＰｃとＦｄとが適切な条件下でハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含み、Ｐ及び／又はＦは、修飾核酸を更に含む。
第１のポリヌクレオチドと、第２のポリヌクレオチドと、並びにブロッカーポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドプライマー組み合わせが更に提供され、第１のポリヌクレオチド（Ｐ）は、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、第２のポリヌクレオチド（Ｆ）は、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｆｂ）と、Ｐｃ及びＦｄが適切な条件下でハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含み、ブロッカーポリヌクレオチドは、Ｔ１及びＴ２の５’側に存在する第３の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ３）に相補的であるヌクレオチド配列を含む。プライマーの組み合わせの１つの態様では、Ｐの３’末端のヌクレオチドとブロッカーポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドは重複する。別の態様では、ブロッカーポリヌクレオチドは、Ｐａの全長にわたってＰａに重複する配列を有する。更に別の態様では、Ｐの３’末端のヌクレオチドとブロッカーポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドとは異なっている。これら態様のそれぞれでは、Ｐ、Ｆ，及び／又はブロッカーポリヌクレオチドが修飾核酸を含むような実施形態が意図されている。
本開示は、第１のポリヌクレオチドと、第２のポリヌクレオチドと、並びにプローブポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせを更に提供し、第１のポリヌクレオチド（Ｐ）は、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に相補的である第１のドメイン（Ｐａ）と特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、第２のポリヌクレオチド（Ｆ）は、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に相補的である第１のドメイン（Ｆｂ）と、Ｐｃ及びＦｄが適切な条件下でハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含み、プローブポリヌクレオチドは、Ｔ１及びＴ２の５’末端に存在する第３の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ４）に対して相補的であるヌクレオチドを含む。特定の態様では、プローブポリヌクレオチドは、標識及びクエンチャーを含む。他の態様では、Ｐ，Ｆ及び／又はプローブポリヌクレオチドは、修飾核酸を含む。ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせがブロッカーポリヌクレオチドを含むような実施形態も提供されていて、ブロッカーポリヌクレオチドは、Ｔ１及びＴ２の５’側とＴ４の３’側に存在する第４の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ３）に相補的であるヌクレオチド配列を含む。１つの態様では、ブロッカーポリヌクレオチドは、修飾核酸を含む。
第１のポリヌクレオチドと、第２のポリヌクレオチドと、並びにユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせが更に提供され、第１のポリヌクレオチド（Ｐ）は、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に相補的である第１のドメイン（Ｐａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）と、その５’末端における標識とを含み、第２のポリヌクレオチド（Ｆ）は、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に相補的である第１のドメイン（Ｆｂ）と、２つのポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）と、Ｐｃ及びＦｄの５’側ポリヌクレオチド配列が適切な条件下でハイブリダイズするように、Ｐｃの５’側配列に十分に相補的である５’側ポリヌクレオチド配列と、Ｆｄの３’側ポリヌクレオチド配列とユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチド配列が適切な条件下でハイブリダイズするように、ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドに対して十分に相補的である３’側ポリヌクレオチド配列とを含み、ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチド配列は、クエンチャーと、ユニバーサルポリヌクレオチドとＦｄの３’側ポリヌクレオチド配列が適切な条件下でハイブリダイズするように、Ｆｄの３’側ポリヌクレオチド配列に十分に相補的であるヌクレオチド配列とを含む。１つの態様では、Ｐ，Ｆ及び／又はユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドは、修飾核酸を含む。別の態様では、ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせは、逆方向プライマーを更に含み、逆方向プライマーは、Ｔ１にハイブリダイズする配列を含むポリヌクレオチド鎖に相補的なポリヌクレオチド配列を含む。
本明細書で提供された任意のプライマーの組み合わせの種々の態様では、Ｐは修飾核酸を含む。他の態様では、Ｆが修飾核酸を更に含み、これら態様のあるものでは、修飾核酸はＰａ内に存在し、及び／又は修飾核酸はＦｂ内にも存在する。
本開示のそれぞれのポリヌクレオチドプライマーの組み合わせでは、態様で示されたように、Ｐは複数個の修飾核酸をＰａ内に含み、及び／又はＦは複数個の修飾核酸をＦｂ内に含む。態様で示されたように、Ｐが修飾核酸を含む場合、修飾核酸はＰの３’末端におけるヌクレオチドである。
開示されたそれぞれのプライマーの組み合わせでは、ＦｄがＰｃに対して少なくとも７０％相補的であり、ＰｃがＦｄに対して少なくとも７０％相補的であり、鋳型ポリヌクレオチドの不在下中でＰｃとＦｄが互いにハイブリダイズし、ＰがＤＮＡ，修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又はそれらの組み合わせであり、及び／又はＦがＤＮＡ，修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又はそれらの組み合わせであるような態様が提供される。
それぞれのプライマー対の組み合わせでは、ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせは、ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせが、ＤＮＡポリメラーゼからの伸張を遮断する、Ｆにその３’末端で結合されたブロック基を更に含むような態様が提供されている。本態様では、ブロック基が３’リン酸塩基、３’アミノ基、ジデオキシヌクレオチド、及び逆位デオキシチミジン（ｄＴ）からなる群から選択される。
それぞれのプライマー対の組み合わせの別の態様では、Ｐａが長さ約５塩基〜長さ約３０塩基、長さ約５塩基〜長さ約２０塩基、長さ約５塩基〜長さ約１５塩基、長さ約５塩基〜長さ約１０塩基、並びに長さ約５塩基〜長さ約８塩基である特定の実施形態が提供されている。他の態様では、Ｐｃが、長さ約５塩基〜長さ約２００塩基、長さ約５塩基〜長さ約１５０塩基、長さ約５塩基〜長さ約１００塩基、長さ約５塩基〜長さ約５０塩基、長さ約５塩基〜長さ約４５塩基、長さ約５塩基〜長さ約４０塩基、長さ約５塩基〜長さ約３５塩基、長さ約５塩基〜長さ約３０塩基、長さ約５塩基〜長さ約２５塩基、長さ約５塩基〜長さ約２０塩基、長さ約５塩基〜長さ約１５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約５０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約４５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約４０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約３５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約３０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約２５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約２０塩基、又は長さ約１０塩基〜長さ約１５塩基である。更に他の態様では、Ｆｂが長さ約１０塩基〜長さ約５０００塩基、長さ約１０塩基〜長さ約４０００塩基、長さ約１０塩基〜長さ約３０００塩基、長さ約１０塩基〜長さ約２０００塩基、長さ約１０塩基〜長さ約１０００塩基、長さ約１０塩基〜長さ約５００塩基、長さ約１０塩基〜長さ約２５０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約２００塩基、長さ約１０塩基〜長さ約１５０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約１００塩基、長さ約１０塩基〜長さ約９５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約９０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約８５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約８０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約７５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約７０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約６５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約６０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約５５塩基、長さ約１０塩基〜５０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約４５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約４０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約３５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約３０塩基、又は長さ約１０塩基〜長さ約１００塩基である。なお更らに他の態様では、Ｆｄが長さ約５塩基〜長さ約２００塩基、長さ約５塩基〜長さ約１５０塩基、長さ約５塩基〜長さ約１００塩基、長さ約５塩基〜長さ約５０塩基、長さ約５塩基〜長さ約４５塩基、長さ約５塩基〜長さ約４０塩基、長さ約５塩基〜長さ約３５塩基、長さ約５塩基〜３０塩基、長さ約５塩基〜長さ約２５塩基、長さ約５塩基〜長さ約２０塩基、長さ約５塩基〜長さ約１５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約５０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約４５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約４０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約３５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約３０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約２５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約２０塩基、又は長さ約１０塩基〜長さ約１５塩基である。
プライマー対の組み合わせのそれぞれの態様では、実施形態として、Ｐが標識を含むものが挙げられる。いくつかの態様では、標識はＰの５’末端に位置し及び／又は標識は消光可能である。これら実施形態のいくつかの態様では、Ｆはクエンチャーを含み、及び／又はクエンチャーはＦの３’末端に存在する。特別な実施形態では、クエンチャーは、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ １、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ２、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＲＱ，及びＤａｂｃｙｌ． Ｇ−ｂａｓｅからなる群から選択される。
特定のプライマー対の組み合わせは、修飾核酸を含み、ブロッカーポリヌクレオチド内の修飾核酸は、ブロッカーポリヌクレオチドの５’末端におけるヌクレオチドであり、修飾核酸は、Ｐの３’末端におけるヌクレオチドであり、及び／又は修飾核酸はロックド核酸である。
本開示は、プライマーの組み合わせを使用して、サンプル内の標的ポリヌクレオチドの存在を検出する方法を更に提供し、プライマーの組み合わせは、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含み、第１のポリヌクレオチド（Ｐ）は、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に対して完全に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、この中でＰａは、サンプル内の非標的ポリヌクレオチドに対して完全には相補的ではない配列を有し、並びに第２のポリヌクレオチド（Ｆ）は、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に相補的である第１のドメイン（Ｆｂ）と、ＰｃとＦｄが適切な条件下でハイブリダイズするように、Ｐｃに対して十分に相補的なポリヌクレオチド配列を含む第３のドメイン（Ｆｄ）とを含み、方法は、サンプル内に標的ポリヌクレオチドが存在する場合、標的ポリヌクレオチドに相補的であるＰａからの配列の伸張を可能にするような条件下で、サンプルをプライマーの組み合わせとポリメラーゼとに接触させるステップと、サンプル内の標的ポリヌクレオチドの存在を示すＰａから伸張した配列を検出するステップとを含む。特定の態様では、方法は、標的ポリヌクレオチドを備えたサンプルからの配列検出に対して、非標的ポリヌクレオチドを備えたサンプルからの配列検出を変化させる。
ＰがＴ１に完全に相補的である第１のドメインを含み、Ｐａがサンプル内の非標的ポリヌクレオチドに完全に相補的ではない、本明細書に開示されたようなプライマーの組み合わせを用いて、サンプル内の標的ポリヌクレオチドの存在を検出する方法が更に提供され、方法は、標的ポリヌクレオチドがサンプル内に存在する場合、標的ポリヌクレオチドに相補的であるＰａからの配列の伸長を可能にするような条件下にて、プライマーの組み合わせとポリメラーゼをサンプルと接触させるステップと、Ｐａから伸長された配列を検出するステップとを含み、この検出は、サンプル内の標的ポリヌクレオチドの存在を示す。いくつかの態様では、方法は、標的ポリヌクレオチドを備えるサンプルからの配列検出に対して、非標的ポリヌクレオチドを備えたサンプルからの配列検出を変化させる。
これら方法のそれぞれにおいて、検出ステップがポリメラーゼ連鎖反応を用いて実行されるような実施形態が提供される。これら実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応がプライマーの組み合わせのＰとＰａから伸張された配列に相補的な配列を有する逆方向プライマーとを使用する態様、及び／又はポリメラーゼ連鎖反応がＰａから伸張された配列に相補的な逆方向プライマーと、それに対してＰａがハイブリダイズする標的ポリヌクレオチド鎖に相補的な配列を有する順方向プライマーとを使用する態様が提供されている。
方法の別の態様において、検出はリアルタイムで実行される。
本開示は、プライマーの組み合わせを用いて、サンプル内の標的ポリヌクレオチド上でポリメラーゼ伸張を開始させる方法を更に提供していて、プライマーの組み合わせは、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含み、第１のポリヌクレオチド（Ｐ）は、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に完全に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、この中でＰａは、サンプル内の非標的ポリヌクレオチドに完全には相補的でない配列を有し、並びに第２のポリヌクレオチド（Ｆ）は、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に相補的である第１のドメイン（Ｆｂ）と、ＰｃとＦｄが適切な条件下でハイブリダイズするように、Ｐｃに対して十分に相補的なポリヌクレオチド配列を含む第３のドメイン（Ｆｄ）とを含み、サンプルは、(ｉ)Ｐａ内の配列に対して完全に相補的である第１の領域内の配列（Ｔ１）を有する標的ポリヌクレオチドと、（ｉｉ）Ｐａに対して完全に相補的ではない第１の領域内の配列（Ｔ１ ＊）を有する非標的ポリヌクレオチドとを含み、方法は、ＰａがＴ１に接触する際に、標的ポリヌクレオチド鎖に対して相補的であるＰａからの配列の伸張を可能にする条件下で、サンプルをプライマーの組み合わせとポリメラーゼとに接触させるステップを含む。特定の態様では、標的ポリヌクレオチド内の第１の領域（Ｔ１）中の配列は、非標的ポリヌクレオチド内の第１の領域（Ｔ１ ＊）中の配列とは、１つの塩基で異なる。他の態様では、方法は、Ｐａから伸張された配列を検出するステップを更に含み、検出はサンプル内の標的ポリヌクレオチドの存在を示す。
本開示は、Ｐが第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に完全に相補的である第１のドメイン（Ｐａ）を含み、Ｐａがサンプル内の非標的ポリヌクレオチドに完全に相補的ではない、本明細書で開示されたようなプライマーの組み合わせを用いて、サンプル内の標的ポリヌクレオチド上でポリメラーゼ伸張を開始させる方法を更に提供していて、方法は、標的ポリヌクレオチドがサンプル内に存在する場合、標的ポリヌクレオチドに対して相補的であるＰａからの配列の伸長を可能にする条件下において、サンプルをプライマーの組み合わせとポリメラーゼとに接触させるステップを含む。いくつかの態様では、方法は、サンプル内の標的ポリヌクレオチドの存在を示す、Ｐａから伸張された配列を検出するステップを更に含む。種々の実施形態では、検出ステップは、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて実行され、並びに本実施形態の特定の態様では、ポリメラーゼ連鎖反応は、プライマーの組み合わせのＰと、Ｐａから伸張された配列に相補的な配列を有する逆方向プライマーとを使用し、及び／又はポリメラーゼ連鎖反応は、Ｐａから伸張された配列に相補的な逆方向プライマーと、Ｐａがそれにハイブリダイズする標的ポリヌクレオチドの鎖に相補的な配列を有する順方向プライマーとを使用する。方法のそれぞれの実施形態では、検出がリアルタイムで実行されるような態様が提供されている。
ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせを用いて、サンプル内の標的ポリヌクレオチドを増幅させる方法が更に提供され、プライマーは第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドを含み、第１のポリヌクレオチド（Ｐ）は、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に完全に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、この中でＰａは、サンプル内の非標的ポリヌクレオチドに完全には相補的ではない配列を有し、並びに第２のポリヌクレオチド（Ｆ）は、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に相補的である第１のドメイン（Ｆｂ）と、ＰｃとＦｄが適切な条件下でハイブリダイズするように、Ｐｃに対して十分に相補的なポリヌクレオチド配列を含む第３のドメイン（Ｆｄ）とを含み、サンプルは、（ｉ）Ｐａ内の配列に対して完全に相補的である第１の領域（Ｔ１）中の配列を有する標的ポリヌクレオチドと、（ｉｉ）１つまたはそれ以上の、Ｐａに対して完全には相補的ではない非標的ポリヌクレオチドとを含み、方法は、(a)標的ポリヌクレオチドがサンプル内に存在する場合、標的ポリヌクレオチドに対して相補的であるＰａからの配列の伸張を可能にする条件下において、サンプルをプライマーの組み合わせとポリメラーゼとに接触させるステップと、（ｂ）標的ポリヌクレオチドからのＰａからの伸張した配列を変性させるステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）におけるＰａから伸張された配列内の領域に相補的な配列を有する逆方向プライマーの存在中で、ステップ（ａ）を繰り返して、標的ポリヌクレオチドを増幅させるステップと、とを含み、ＰａがＰａ内の配列に対して完全に相補的である場合に、標的ポリヌクレオチドの伸張及び増幅が生じるが、標的ポリヌクレオチド内の第１の領域がＰａ内の配列に対して完全に相補的でない場合は、伸張及び増幅の効率が落ちるか又は伸張及び増幅は生じない。
本開示は、第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に完全に相補的である第１のドメイン（Ｐａ）を含み、Ｐａがサンプル内の非標的ポリヌクレオチドに対して完全に相補的ではない、本明細書で開示されたようなポリヌクレオチドプライマーの組み合わせを用いて、サンプル内の標的ポリヌクレオチドを増幅させる方法をまた提供し、方法は、（ａ）標的ポリヌクレオチドがサンプル内に存在する場合、標的ポリヌクレオチドに対して相補的であるＰａからの配列の伸張を可能にする条件下において、サンプルをプライマーの組み合わせとポリメラーゼとに接触させるステップと、（ｂ）標的ポリヌクレオチドからのＰａからの伸長した配列を変性させるステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）でのＰａから伸張された配列内の領域に相補的な配列を有する逆方向プライマーの存在中で、ステップ（ａ）を繰り返して、標的ポリヌクレオチドを増幅させるステップと、とを含み、標的ポリヌクレオチドの伸長及び増幅は、Ｔ１がＰａ内の配列に対して完全に相補的である場合に生じるが、標的ポリヌクレオチド内の第１の領域がＰａ内の配列に完全には相補的でない場合には、伸長及び増幅の効率が落ちるか、又は伸長及び増幅が生じない。方法のいくつかの態様では、逆方向プライマーは、Ｐａから伸張された配列内の領域に対して完全に相補的である配列を有する。他の態様では、逆方向プライマーは、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含むプライマーの組み合わせであり、第１のポリヌクレオチド（ＰＰ）は、ステップ（ａ）でＰａから伸張された配列内の第１の領域（ＴＴ１）に完全に相補的である配列を有する第１のドメイン（ＰＰａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（ＰＰｃ）とを含み、第２のポリヌクレオチド（ＦＦ）は、ステップ（ａ）でＰａから伸張された配列内の第２の領域（ＴＴ２）に相補的である第１のドメイン（ＦＦｂ）と、適切な条件下でＰＰｃとＦＦｄがハイブリダイズするように、ＰＰｃに対して十分に相補的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（ＦＦｄ）とを含む。特定の態様では、方法は、本方法で増幅された生成物を検出するステップを更に含み、検出は、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて実行され、及び／又は検出はリアルタイムで実行される。
開示のそれぞれの方法では、本明細書で開示されたように、逆方向プライマーがプライマーの組み合わせであるような態様が提供されている。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであって、
前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ １ ）に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、
前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ ２ ）に相補的である第１のドメイン（Ｆｂ）と、適切な条件下でＰｃとＦｄがハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含む、ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであり、
前記標的ポリヌクレオチドが、前記標的ポリヌクレオチドに対するＦｂのハイブリダイゼーションによって変性される二次構造を有する、ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目２）
前記標的ポリヌクレオチドの前記二次構造が、Ｆの不在下で、前記標的ポリヌクレオチドのポリメラーゼ伸張を阻害する、項目１に記載のポリヌクレオチドプライマー。
（項目３）
前記Ｐ及び／又はＦが、修飾核酸を更に含む、項目１又は２に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目４）
第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであって、
前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１のポリヌクレオチド領域（Ｔ １ ）に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、
前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ ２ ）に相補的である第１のドメイン（Ｆｂ）と、適切な条件下でＰｃとＦｄがハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含む、ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであり、
Ｐ及び／又はＦが、修飾核酸を更に含む、前記ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目５）
第１のポリヌクレオチドと、第２のポリヌクレオチドと、ブロッカーポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであり、
前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ １ ）に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、
前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ ２ ）に相補的である第１のドメイン（Ｆｂ）と、適切な条件下でＰｃとＦｄがハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含み、
前記ブロッカーポリヌクレオチドが、Ｔ １ とＴ ２ の５’側に存在する第３の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ ３ ）に相補的であるヌクレオチド配列を含む、前記ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目６）
Ｐの３’末端におけるヌクレオチドと前記ブロッカーポリヌクレオチドの５’末端が重複する、項目５に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目７）
前記ブロッカーポリヌクレオチドが、Ｐａの全長にわたってＰａに重複する配列を有する、項目６に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目８）
前記Ｐの３’末端における前記ヌクレオチドと前記ブロッカーポリヌクレオチドの前記５’末端におけるヌクレオチドが異なる、項目６に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目９）
Ｐ、Ｆ及び／又は前記ブロッカーポリヌクレオチドが、修飾核酸を含む、項目５、６、又は８に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目１０）
第１のポリヌクレオチドと、第２のポリヌクレオチドと、プローブポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであって、
前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ １ ）に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、
前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ ２ ）に相補的である第１のドメイン（Ｆｂ）と、適切な条件下でＰｃとＦｄがハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含み、
前記プローブポリヌクレオチドが、Ｔ １ とＴ ２ の５’側に存在する第３の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ ４ ）に相補的であるヌクレオチド配列を含む、前記ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目１１）
前記プローブポリヌクレオチドが、標識とクエンチャーとを含む、項目１０に記載のポリヌクレオチドプライマー。
（項目１２）
Ｐ、Ｆ及び／又は前記プローブポリヌクレオチドが、修飾核酸を含む、項目１０又は１１に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目１３）
ブロッカーポリヌクレオチドを更に含み、前記ブロッカーポリヌクレオチドが、Ｔ １ 及びＴ ２ の５’末端に存在し、かつＴ ４ の３’末端に存在する第４の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ ３ ）に相補的であるヌクレオチド配列を含む、項目１０、１１又は１２に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目１４）
前記ブロッカーが、修飾核酸を含む、項目１３に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目１５）
第１のポリヌクレオチドと、第２のポリヌクレオチドと、ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであって、
前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ １ ）に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）と、その５’末端における標識とを含み、
前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ ２ ）に相補的である第１のドメイン（Ｆｂ）と、２つのポリヌクレオチド配列、Ｐｃの５’ポリヌクレオチド配列とＦｄが適切な条件下でハイブリダイズするようにＰｃの５’に対して十分に相補的である５’ポリヌクレオチド配列、及びＦｄの３’ポリヌクレオチド配列とユニバーサルクエンチャーが適切な条件下でハイブリダイズするように、ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドに対して十分に相補的である３’ポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含み、
前記ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドが、クエンチャーと、ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドとＦｄの３’ポリヌクレオチド配列が適切な条件下でハイブリダイズするようにＦｄの３’ポリヌクレオチド配列に対して十分に相補的であるヌクレオチド配列とを含む、前記ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目１６）
Ｐ、Ｆ及び／又は前記ユニバーサルクエンチャーが、修飾核酸を含む、項目１５に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目１７）
上記項目のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーが、逆方向プライマーを更に含み、前記逆方向プライマーが、Ｔ １ に対してハイブリダイズする配列を含むポリヌクレオチド鎖に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む、項目１〜１６のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマー。
（項目１８）
Ｐが修飾核酸を含む、項目３、４、９、１２、１４又は１６のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目１９）
Ｆが修飾核酸を更に含む、項目３、４、９、１２、１４又は１６のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目２０）
前記修飾核酸がＰａ内にある、項目１８に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目２１）
前記修飾核酸がＦｂ内にある、項目１９に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目２２）
Ｐが、Ｐａ内に複数個の修飾核酸を含む、項目１〜２１のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目２３）
Ｆが、Ｆｂ内に複数個の修飾核酸を含む、項目１〜２２のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目２４）
前記修飾核酸が、Ｐの３’末端におけるヌクレオチドである、項目２１に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目２５）
Ｆｄが、Ｐｃに対して少なくとも７０％相補的である、項目１〜２４のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目２６）
Ｐｃが、Ｆｄに対して少なくとも７０％相補的である、項目１〜２５のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目２７）
ＰｃとＦｄが、前記鋳型ポリヌクレオチドの不在下で互いに対してハイブリダイズする、項目１〜２６のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目２８）
Ｐが、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又はそれらの組み合わせである、項目１〜２７のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目２９）
Ｆが、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又はそれらの組み合わせである、項目１〜２８のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目３０）
ＤＮＡポリメラーゼからの伸張をブロックする、Ｆにその３’末端において結合されているブロッキング基を更に含む、項目１〜２９のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目３１）
前記ブロッキング基が、３’リン酸塩基、３’アミノ基、ジデオキシヌクレオチド、及び逆位デオキシチミジン（ｄＴ）からなる群から選択される、項目３０に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目３２）
Ｐａが、長さ約５塩基〜長さ約３０塩基、長さ約５塩基〜長さ約２０塩基、長さ約５塩基〜長さ約１５塩基、長さ約５塩基〜長さ約１０塩基、長さ約５塩基〜長さ約８塩基である、項目１〜３０のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目３３）
Ｐｃが、長さ約５塩基〜長さ約２００塩基、長さ約５塩基〜長さ約１５０塩基、長さ約５塩基〜長さ約１００塩基、長さ約５塩基〜長さ約５０塩基、長さ約５塩基〜長さ約４５塩基、長さ約５塩基〜長さ約４０塩基、長さ約５塩基〜長さ約３５塩基、長さ約５塩基〜長さ約３０塩基、長さ約５塩基〜長さ約２５塩基、長さ約５塩基〜長さ約２０塩基、長さ約５塩基〜長さ約１５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約５０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約４５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約４０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約３５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約３０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約２５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約２０塩基、又は長さ約１０塩基〜長さ約１５塩基である、項目１〜３２のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目３４）
Ｆｂが、長さ約１０塩基〜長さ約５０００塩基、長さ約１０塩基〜長さ約４０００塩基、長さ約１０塩基〜長さ約３０００塩基、長さ約１０塩基〜長さ約２０００塩基、長さ約１０塩基〜長さ約１０００塩基、長さ約１０塩基〜長さ約５００塩基、長さ約１０塩基〜長さ約２５０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約２００塩基、長さ約１０塩基〜長さ約１５０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約１００塩基、長さ約１０塩基〜長さ約９５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約９０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約８５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約８０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約７５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約７０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約６５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約６０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約５５塩基、長さ約１０塩基〜５０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約４５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約４０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約３５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約３０塩基、又は長さ約１０塩基〜長さ約１００塩基である、項目１〜３３のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目３５）
Ｆｄが、長さ約５塩基〜長さ約２００塩基、長さ約５塩基〜長さ約１５０塩基、長さ約５塩基〜長さ約１００塩基、長さ約５塩基〜長さ約５０塩基、長さ約５塩基〜長さ約４５塩基、長さ約５塩基〜長さ約４０塩基、長さ約５塩基〜長さ約３５塩基、長さ約５塩基〜３０塩基、長さ約５塩基〜長さ約２５塩基、長さ約５塩基〜長さ約２０塩基、長さ約５塩基〜長さ約１５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約５０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約４５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約４０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約３５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約３０塩基、長さ約１０塩基〜長さ約２５塩基、長さ約１０塩基〜長さ約２０塩基、又は長さ約１０塩基〜長さ約１５塩基である、項目１〜３４のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目３６）
Ｐが、標識を含む、項目１〜３５のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目３７）
前記標識が、Ｐ内にその５’末端において存在する、項目３６のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目３８）
前記標識が、消光可能である、項目３６又は３７に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目３９）
Ｆがクエンチャーを含む、項目３６、３７又は３８に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目４０）
前記クエンチャーが、Ｆ内にその３’末端において存在する、項目３９に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目４１）
前記クエンチャーが、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ１、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ２、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＲＱ、及びＤａｂｃｙｌ．Ｇ−ｂａｓｅからなる群から選択される、項目３９又は４０に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目４２）
前記ブロッカーポリヌクレオチド内の前記修飾核酸が、前記ブロッカーポリヌクレオチドの５’末端におけるヌクレオチドである、項目９、１４及び１８〜４１のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目４３）
前記修飾核酸が、前記Ｐの３’末端におけるヌクレオチドである、項目３、４、９、１２、１３、１６又は１７〜４２のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目４４）
前記修飾核酸が、ロックド核酸である、項目３、４、９、１２、１４、１６、１８〜２４、４２又は４３のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
（項目４５）
サンプル中の標的ポリヌクレオチドの存在を、プライマーの組み合わせを使用して検出する方法であって、前記プライマーの組み合わせが、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含み、
前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ １ ）に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、Ｐａが、前記サンプル中の非標的ポリヌクレオチドに完全に相補的ではない配列を有し、
前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ ２ ）に相補的である第１のドメイン（Ｆｂ）と、適切な条件下でＰｃとＦｄがハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含み、
前記方法が、
前記標的ポリヌクレオチドが前記サンプル中に存在する場合、前記標的ポリヌクレオチドに相補的であるＰａからの配列の伸張を許容する条件下で、前記サンプルを、前記プライマーの組み合わせとポリメラーゼとに接触させるステップと、
前記標的ポリヌクレオチドの存在を示す、Ｐａから伸張した前記配列を検出するステップとを含む、方法。
（項目４６）
前記方法が、標的ポリヌクレオチドを備えたサンプルからの配列検出に対して、非標的ポリヌクレオチドを備えたサンプルからの配列検出を変化させる、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
ＰがＴ １ に対して完全に相補的である第１のドメインを含み、Ｐａがサンプル中の非標的ポリヌクレオチドに対して完全に相補的ではない、項目１〜４４のうちのいずれか一項に記載されたプライマーの組み合わせを使用して、サンプル中の標的ポリヌクレオチドの存在を検出する方法であって、
前記方法が、
標的ポリヌクレオチドが前記サンプル中に存在する場合、前記標的ポリヌクレオチドに対して相補的であるＰａからの配列の伸張を許容する条件下で、前記サンプルを、前記プライマーの組み合わせとポリメラーゼとに接触させるステップと、
検出が前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドの存在を示すような、Ｐａからの前記配列を検出するステップとを含む、方法。
（項目４８）
前記方法が、標的ポリヌクレオチドを備えたサンプルからの配列検出に対して、非標的ポリヌクレオチドを備えたサンプルからの配列検出を変化させる、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記検出するステップが、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて実行される、項目４５〜４８のうちのいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、前記プライマーの組み合わせのＰと逆方向プライマーとを使用し、前記逆方向プライマーが、Ｐａから伸張した配列に相補的な配列を有する、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、Ｐａから伸張した配列に相補的な逆方向プライマーと、Ｐａがハイブリダイズする前記標的ポリヌクレオチドの鎖に相補的な配列を有する順方向プライマーとを使用する、項目４９に記載の方法。
（項目５２）
検出がリアルタイムで実行される、項目４５〜５１のうちのいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
プライマーの組み合わせを用いて、サンプル中の標的ポリヌクレオチド上でポリメラー伸張を開始させる方法であって、前記プライマーの組み合わせが、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含み、
前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ １ ）に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、Ｐａが、前記サンプル中の非標的ポリヌクレオチドに完全に相補的ではない配列を有し、
前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ ２ ）に相補的である第１のドメイン（Ｆｂ）と、適切な条件下でＰｃとＦｄがハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含む、プライマーの組み合わせであり、
前記サンプルが、（ｉ）前記Ｐａ内の配列に完全に相補的である第１の領域内の配列（Ｔ １ ）を有する標的ポリヌクレオチドと、（ｉｉ）Ｐａに対して完全に相補的ではない第１の領域内の配列（Ｔ １ ＊ ）を有する非標的ポリヌクレオチドとの混合物を含み、
前記方法が、ＰａがＴ １ に接触する場合、前記標的ポリヌクレオチドに対して相補的であるＰａからの配列の伸張を許容する条件下で、前記サンプルを前記プライマーの組み合わせとポリメラーゼとに接触させるステップを含む、方法。
（項目５４）
前記標的ポリヌクレオチドの前記第１の領域（Ｔ １ ）内の前記配列が、前記非標的ポリヌクレオチド内の前記第１の領域（Ｔ １ ＊ ）内の前記配列と、１つの塩基で異なる、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
Ｐａから伸張した前記配列を検出するステップを更に含み、前記検出が、前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドの存在を示す、項目５３に記載の方法。
（項目５６）
項目１〜４４のうちのいずれか一項に記載のプライマーの組み合わせを用いて、サンプル中の標的ポリヌクレオチド上で、ポリメラーゼ伸張を開始する方法であって、Ｐが、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ １ ）に完全に相補的である第１のドメイン（Ｐａ）を含み、Ｐａが、前記サンプル中の非標的ポリヌクレオチドに対して完全に相補的ではなく、
前記方法が、
前記標的ポリヌクレオチドが前記サンプル中に存在する場合、前記標的ポリヌクレオチドに相補的であるＰａからの配列の伸張を許容する条件下で、サンプルを前記プライマーの組み合わせとポリメラーゼとに接触させるステップを含む、方法。
（項目５７）
前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドの存在を示す、Ｐａから伸張した前記配列を検出するステップを更に含む、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記検出するステップが、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて実行される、項目５５〜５７のうちのいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、前記プライマーの組み合わせのＰと逆方向プライマーとを使用し、前記逆方向プライマーが、前記Ｐａから伸張した配列に相補的である配列を有する、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、前記Ｐａから伸張した配列に相補的である逆方向プライマーと、Ｐａがハイブリダイズする標的ポリヌクレオチドの鎖に対して相補的な配列を有する順方向プライマーとを使用する、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
検出がリアルタイムで行われる、項目５７〜６０のうちのいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせを用いて、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを増幅させる方法であって、前記プライマーの組み合わせが、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含み、
前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ １ ）に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、Ｐａが、前記サンプル中の非標的ポリヌクレオチドに完全に相補的ではない配列を有し、
前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ ２ ）に相補的である第１のドメイン（Ｆｂ）と、適切な条件下でＰｃとＦｄがハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含む、プライマーの組み合わせであり、
前記サンプルが、（ｉ）前記Ｐａ内の配列に完全に相補的である第１の領域内の配列（Ｔ １ ）を有する標的ポリヌクレオチドと、（ｉｉ）Ｐａに対して完全に相補的ではない、１つまたはそれ以上の非標的ポリヌクレオチドとの混合物を含み、
前記方法が、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドが前記サンプル中に存在する場合、前記標的ポリヌクレオチドに相補的であるＰａからの配列の伸張を許容する条件下で、前記サンプルを前記プライマーの組み合わせとポリメラーゼとに接触させるステップと、
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドからの前記Ｐｃから伸張した配列を変性させるステップと、
（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドを増幅させるために、ステップ（ｂ）中の前記Ｐａから伸張した配列内の領域に対して相補的な配列を有する逆方向プライマーの存在下で、ステップ（ａ）を繰り返すステップとを含み、
Ｐａが前記Ｐａ内の前記配列に対して完全に相補的である場合に、前記標的ポリヌクレオチドの伸張及び増幅が起こるが、前記標的ポリヌクレオチドの前記第１の領域が、前記Ｐａ内の配列に対して完全に相補的ではない場合に、伸長及び増幅は効率が落ちるか又は全く起こらない、前記方法。
（項目６３）
項目１〜４４のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせを用いて、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを増幅させる方法であって、前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ １ ）に対して完全に相補的である第１のドメイン（Ｐａ）を含み、Ｐａが、前記サンプル中の非標的ポリヌクレオチドに対して完全に相補的ではなく、
前記方法が、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドが前記サンプル中に存在する場合、前記標的ポリヌクレオチドに相補的であるＰａからの配列の伸張を許容する条件下で、前記サンプルを前記プライマーの組み合わせとポリメラーゼとに接触させるステップと、
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドからの前記Ｐｃから伸張した配列を変性させるステップと、
（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドを増幅させるために、ステップ（ｂ）中の前記Ｐａから伸張した配列内の領域に対して相補的な配列を有する逆方向プライマーの存在下で、ステップ（ａ）を繰り返すステップとを含む方法であり、
Ｔ １ が前記Ｐａ内の配列に対して完全に相補的である場合に、前記標的ポリヌクレオチドの伸張及び増幅が起こるが、前記標的ポリヌクレオチドの前記第１の領域が、前記Ｐａ内の配列に対して完全に相補的ではない場合に、伸長及び増幅は効率が落ちるか又は全く起こらない、前記方法。
（項目６４）
前記逆方向プライマーが、前記Ｐａから伸張した配列内の領域に対して完全に相補的である配列を有する、項目６２又は６３に記載の方法。
（項目６５）
前記逆方向プライマーが、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含むプライマーの組み合わせであり、
前記第１のポリヌクレオチド（ＰＰ）が、ステップ（ａ）の前記Ｐａから伸張した配列内の第１の領域（ＴＴ １ ）に完全に相補的である配列を有する第１のドメイン（ＰＰａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（ＰＰｃ）とを含み、
前記第２のポリヌクレオチド（ＦＦ）が、ステップ（ａ）の前記Ｐａから伸張した配列内の第２の領域（ＴＴ ２ ）に対して相補的である第１のドメイン（ＦＦｂ）と、ＰＰｃとＦＦｄが適切な条件下でハイブリダイズするように、ＰＰｃに対して十分に相補的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（ＦＦｄ）とを含む、項目６２又は６３に記載の方法。
（項目６６）
前記逆方向プライマーが、項目１〜４４のうちのいずれか一項に記載のプライマーの組み合わせである、項目６２又は６３に記載の方法。
（項目６７）
前記方法で増幅された生成物を検出するステップを更に含む、項目６２〜６６のうちのいずれか一項に記載された方法。
（項目６８）
検出が、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて実行される、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
検出が、リアルタイムで実行される、項目６７又は６８に記載の方法。
本明細書に開示された基本的なポリヌクレオチドの組み合わせ（すなわち、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチド）の構造的関係を示す図である。 本発明の３つの標的結合ドメインａ、ｇ及びｂを備えた２つの三方向接合部を含むプライマーの組み合わせを示す図である。 本発明の２つの標的結合ドメインを備えた安定な四方向（Ａ）及び五方向（Ｂ）接合部を有するポリヌクレオチドの組み合わせを示す図である。 本発明のブロッカーポリヌクレオチドを有するプライマーの組み合わせを示す図である。図４Ａに示されたように、ブロッカーポリヌクレオチドの５’側塩基は、第１のポリヌクレオチドの３’側塩基に重なり合い、第１のポリヌクレオチドの３’側塩基とは異なる。ブロッカーポリヌクレオチドの５’側塩基は、標的ポリヌクレオチドに対して相補的ではなく、ポリメラーゼによる第１のポリヌクレオチドの伸張の際に置き換えられる。図４Ｂに示したように、ブロッカーポリヌクレオチドの５’側塩基は、第１のポリヌクレオチドの３’側塩基に重なり合い、第１のポリヌクレオチドの３’側塩基とは異なる。ブロッカーポリヌクレオチドの５’側塩基は、非標的ポリヌクレオチドに対して１００％相補的であるが、一方、第１のポリヌクレオチドの３’側塩基は、非標的ポリヌクレオチドに対して相補的ではない。この配置では、ブロッカーポリヌクレオチドは、ポリメラーゼによる第１のポリヌクレオチドの伸張を遮断する。 本発明のプローブポリヌクレオチドを備えたプライマーの組み合わせを示す図である。図５Ａに示されたように、プローブポリヌクレオチドは、その５’末端に標識を含み並びにその３’末端にクエンチャーを含む。図５Ｂは、第１／第２のポリヌクレオチド対及びブロッカーポリヌクレオチドを組み合わせて、プローブポリヌクレオチドの構造的関係を示している。 本発明のユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドを備えた基本的なポリヌクレオチドの組み合わせを示す図である。図に示されたように、ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドの第２のドメインに対して相補的であり、第１のポリヌクレオチドがその５’末端に標識を含むのに対し、その３’末端にクエンチャーを含む。 本発明のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で用いられるようなポリヌクレオチドの組み合わせを示す概略図である。 本発明のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で用いられるようなポリヌクレオチドの組み合わせを示す概略図である。 本発明のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で用いられるようなポリヌクレオチドの組み合わせを示す概略図である。 本発明のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で用いられるようなポリヌクレオチドの組み合わせを示す概略図である。 本発明のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で用いられるようなポリヌクレオチドの組み合わせを示す概略図である。 本発明のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で用いられるようなポリヌクレオチドの組み合わせを示す概略図である。 本発明の基本的なポリヌクレオチドの組み合わせと逆方向プライマーとの構造的関係を示す図である。図８Ａでは、逆方向プライマーは単一のポリヌクレオチドである。図８Ｂでは、逆方向プライマーは、第１及び第２のポリヌクレオチドの第２の部分である。 本発明の基本的なポリヌクレオチドの組み合わせと逆方向プライマーとの構造的関係を示す図である。図８Ａでは、逆方向プライマーは単一のポリヌクレオチドである。図８Ｂでは、逆方向プライマーは、第１及び第２のポリヌクレオチドの第２の部分である。 図９Ａは、本発明の非特異的ＲＮＡリンカーを備えた蛍光体−クエンチャーが標識付された第１のポリヌクレオチド（プライマーＡ）と典型的な第２のポリヌクレオチド（フィクサーＡ）を示す図である。図９Ｂは、図９Ａで示された組み合わせのＰＣＲにおける使用を示している。プライマーＡに反対の鎖が生成される場合、ＲＮアーゼＨによるＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの開裂が蛍光体（又はクエンチャー）を放出して、蛍光信号が検出される。図９Ｃは、部位特異的ＲＮＡ−ＤＮＡリンカーを備えた蛍光体−クエンチャーで標識された第１のポリヌクレオチド（プライマーＡ）と典型的な第２のポリヌクレオチド（フィクサーＡ）を示す。図９Ｄは、図９Ｃで示された組み合わせのＰＣＲにおける使用を示す。プライマーＡを含むＰＣＲ生成物が変性される場合、ＲＮＡ−ＤＮＡリンカーがプライマーの下流領域にハイブリダイズして、ＲＮアーゼＨがＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを開裂し、かつ蛍光体を放出し、並びに配列に特異的な蛍光信号が検出される。 図９Ａは、本発明の非特異的ＲＮＡリンカーを備えた蛍光体−クエンチャーが標識付された第１のポリヌクレオチド（プライマーＡ）と典型的な第２のポリヌクレオチド（フィクサーＡ）を示す図である。図９Ｂは、図９Ａで示された組み合わせのＰＣＲにおける使用を示している。プライマーＡに反対の鎖が生成される場合、ＲＮアーゼＨによるＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの開裂が蛍光体（又はクエンチャー）を放出して、蛍光信号が検出される。図９Ｃは、部位特異的ＲＮＡ−ＤＮＡリンカーを備えた蛍光体−クエンチャーで標識された第１のポリヌクレオチド（プライマーＡ）と典型的な第２のポリヌクレオチド（フィクサーＡ）を示す。図９Ｄは、図９Ｃで示された組み合わせのＰＣＲにおける使用を示す。プライマーＡを含むＰＣＲ生成物が変性される場合、ＲＮＡ−ＤＮＡリンカーがプライマーの下流領域にハイブリダイズして、ＲＮアーゼＨがＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを開裂し、かつ蛍光体を放出し、並びに配列に特異的な蛍光信号が検出される。 図９Ａは、本発明の非特異的ＲＮＡリンカーを備えた蛍光体−クエンチャーが標識付された第１のポリヌクレオチド（プライマーＡ）と典型的な第２のポリヌクレオチド（フィクサーＡ）を示す図である。図９Ｂは、図９Ａで示された組み合わせのＰＣＲにおける使用を示している。プライマーＡに反対の鎖が生成される場合、ＲＮアーゼＨによるＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの開裂が蛍光体（又はクエンチャー）を放出して、蛍光信号が検出される。図９Ｃは、部位特異的ＲＮＡ−ＤＮＡリンカーを備えた蛍光体−クエンチャーで標識された第１のポリヌクレオチド（プライマーＡ）と典型的な第２のポリヌクレオチド（フィクサーＡ）を示す。図９Ｄは、図９Ｃで示された組み合わせのＰＣＲにおける使用を示す。プライマーＡを含むＰＣＲ生成物が変性される場合、ＲＮＡ−ＤＮＡリンカーがプライマーの下流領域にハイブリダイズして、ＲＮアーゼＨがＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを開裂し、かつ蛍光体を放出し、並びに配列に特異的な蛍光信号が検出される。 図９Ａは、本発明の非特異的ＲＮＡリンカーを備えた蛍光体−クエンチャーが標識付された第１のポリヌクレオチド（プライマーＡ）と典型的な第２のポリヌクレオチド（フィクサーＡ）を示す図である。図９Ｂは、図９Ａで示された組み合わせのＰＣＲにおける使用を示している。プライマーＡに反対の鎖が生成される場合、ＲＮアーゼＨによるＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの開裂が蛍光体（又はクエンチャー）を放出して、蛍光信号が検出される。図９Ｃは、部位特異的ＲＮＡ−ＤＮＡリンカーを備えた蛍光体−クエンチャーで標識された第１のポリヌクレオチド（プライマーＡ）と典型的な第２のポリヌクレオチド（フィクサーＡ）を示す。図９Ｄは、図９Ｃで示された組み合わせのＰＣＲにおける使用を示す。プライマーＡを含むＰＣＲ生成物が変性される場合、ＲＮＡ−ＤＮＡリンカーがプライマーの下流領域にハイブリダイズして、ＲＮアーゼＨがＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを開裂し、かつ蛍光体を放出し、並びに配列に特異的な蛍光信号が検出される。 本発明のリアルタイムＰＣＲで用いられるための三方向又は四方向接合部を備えたプライマーの組み合わせを示す図である。三方向接合プライマーによって、プライマーポリヌクレオチド（すなわち、第１のポリヌクレオチド）が、その５’末端で蛍光体に標識され、並びにフィクサーポリヌクレオチド（すなわち、第２のポリヌクレオチド）が、その３’末端でクエンチャーに標識される。四方方向接合プライマーによって、プライマーポリヌクレオチドが、その５’末端で蛍光体に標識され、並びにステープルが、その３’末端でクエンチャーに標識される。フィクサーポリヌクレオチドは標識されていない。プライマー及びフィクサーの双方の第２のドメイン領域は特徴的であるために、ステープルポリヌクレオチドは、「ユニバーサル」クエンチャーポリヌクレオチドとして用いられ得る。 （スキーム１１）本発明の基本的プライマーと非共有結合で結合されたアンチプライマー（ＡＰ）を備えたフィクサーポリヌクレオチドを用いる３つの例を示す図である。 本発明の基本的なプライマーポリヌクレオチド（“Ｐ０”）と修飾フィクサーポリヌクレオチド構造（“Ｆ１〜Ｆ４”）で構成されたポリヌクレオチドを示す図である。鋳型ポリヌクレオチドに結合する場合、特異性の増加したレベルをもたらすために、ステムループ構造（図式１２の１〜４）を含む修飾ポリヌクレオチドの組み合わせが用いられてもよい。 本発明の修飾プライマーポリヌクレオチド（“Ｐ１”）と基本的フィクサーポリヌクレオチド（“Ｆ”）とで構成されたポリヌクレオチドの組み合わせを示す図である(図式１３)。図式１３では、右側に示された完全なポリヌクレオチドの組み合わせ（修飾プライマーポリヌクレオチドと基本的なフィクサーポリヌクレオチド）と共に、修飾プライマーポリヌクレオチドが左側に示されている。 本発明の修飾プライマーポリヌクレオチド（“Ｐ１”）と基本的フィクサーポリヌクレオチド（“Ｆ”）とで構成されたポリヌクレオチドの組み合わせを示す図である(図式１３)。図式１３では、右側に示された完全なポリヌクレオチドの組み合わせ（修飾プライマーポリヌクレオチドと基本的なフィクサーポリヌクレオチド）と共に、修飾プライマーポリヌクレオチドが左側に示されている。 本発明の修飾プライマーポリヌクレオチド（“Ｐ１”）と基本的フィクサーポリヌクレオチド（“Ｆ”）とで構成されたポリヌクレオチドの組み合わせを示す図である(図式１３)。図式１３では、右側に示された完全なポリヌクレオチドの組み合わせ（修飾プライマーポリヌクレオチドと基本的なフィクサーポリヌクレオチド）と共に、修飾プライマーポリヌクレオチドが左側に示されている。 （スキーム１６）本発明の点突然変異を検出するための、本明細書で開示された基本的なポリヌクレオチドの組み合わせ（すなわち、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチド）を用いるための２つのシナリオを示す図である。上部シナリオでは、プライマーポリヌクレオチドの第１のドメインは、鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドに対して１００％相補的であり、伸張が起こり、生成物を得る。下部シナリオでは、プライマーポリヌクレオチドの第１のドメインが、鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドに関してミスマッチを含有し、プライマーポリヌクレオチドの短い第１のドメイン内における不安定性のために、伸張が遮断される。この不安定性が、ＰＣＲの極めて低い効率をもたらし、並びに検出可能な生成物がほとんど又は全く得られない結果となる。 本発明の次世代配列決定（ＮＧＳ）を実行するためのポリヌクレオチドの組み合わせ（すなわち、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチド）の使用を示す図である。 本明細書に開示された基本的なポリヌクレオチドの組み合わせ（すなわち、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチド）を用いる染色色素ＳＹＴＯ ９の存在中での定量的ＰＣＲの結果を示す図である。 本発明の蛍光体標識プローブプライマー（すなわち、第１のポリヌクレオチド）とクエンチャー標識フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）による定量的ＰＣＲの結果を示す図である。 本発明の蛍光体標識プローブプライマー（すなわち、第１のポリヌクレオチド）とユニバーサルクエンチャーを用いるＰＣＲアッセイの結果を示す図である。 本発明の第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）、及びＳＹＢＲ緑色染色色素を用いた、混合物内の変異体ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す図である。 本発明の第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）、及びＳＹＢＲ緑色染色色素を用いた、混合物内の変異体ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す図である。 本発明の第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）及びＳＹＢＲ緑色染色色素を用いた、ホルムアルデヒドで固定されたサンプル内の変異体ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す図である。 本発明の第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）及びプローブポリヌクレオチド（すなわち、ＴａｑＭａｎ）を用いた、混合物内の変異体ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す図である。 本発明の第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）、プローブポリヌクレオチド（すなわち、ＴａｑＭａｎ）、及びブロッカーポリヌクレオチドを用いた、混合物内の変異体ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す図である。 本発明のその３’末端がＬＮＡで修飾された第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）、プローブポリヌクレオチド（すなわち、ＴａｑＭａｎ）、及びブロッカーポリヌクレオチドを用いた、混合物内の変異体ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す図である。 図２４Ａは、本発明のその３’末端がＬＮＡで修飾された第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）、プローブポリヌクレオチド（すなわち、ＴａｑＭａｎ）、及びブロッカーポリヌクレオチドを用いた、０．５コピー／ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＤＮＡの反応（統計的に決定）を備えた混合物内の変異体ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す図である。図２４Ｂは、本発明のその３’末端がＬＮＡで修飾された第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）、プローブポリヌクレオチド（すなわち、ＴａｑＭａｎ）、及びブロッカーポリヌクレオチドを用いた、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＤＮＡのコピーを有さない混合物内の変異体ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す図である。ＷＴ ＤＮＡサンプルの９４％（１６のうち１５）が全く信号を示さず、このことは、改善されたＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ｑＰＣＲアッセイによる単一の変異体ＤＮＡ検出の極めて高い選択性を示唆している。 図２４Ａは、本発明のその３’末端がＬＮＡで修飾された第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）、プローブポリヌクレオチド（すなわち、ＴａｑＭａｎ）、及びブロッカーポリヌクレオチドを用いた、０．５コピー／ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＤＮＡの反応（統計的に決定）を備えた混合物内の変異体ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す図である。図２４Ｂは、本発明のその３’末端がＬＮＡで修飾された第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）、プローブポリヌクレオチド（すなわち、ＴａｑＭａｎ）、及びブロッカーポリヌクレオチドを用いた、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＤＮＡのコピーを有さない混合物内の変異体ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す図である。ＷＴ ＤＮＡサンプルの９４％（１６のうち１５）が全く信号を示さず、このことは、改善されたＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ｑＰＣＲアッセイによる単一の変異体ＤＮＡ検出の極めて高い選択性を示唆している。 図２４Ａは、本発明のその３’末端がＬＮＡで修飾された第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）、プローブポリヌクレオチド（すなわち、ＴａｑＭａｎ）、及びブロッカーポリヌクレオチドを用いた、０．５コピー／ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＤＮＡの反応（統計的に決定）を備えた混合物内の変異体ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す図である。図２４Ｂは、本発明のその３’末端がＬＮＡで修飾された第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）、プローブポリヌクレオチド（すなわち、ＴａｑＭａｎ）、及びブロッカーポリヌクレオチドを用いた、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＤＮＡのコピーを有さない混合物内の変異体ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す図である。ＷＴ ＤＮＡサンプルの９４％（１６のうち１５）が全く信号を示さず、このことは、改善されたＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ｑＰＣＲアッセイによる単一の変異体ＤＮＡ検出の極めて高い選択性を示唆している。 図２４Ａは、本発明のその３’末端がＬＮＡで修飾された第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）、プローブポリヌクレオチド（すなわち、ＴａｑＭａｎ）、及びブロッカーポリヌクレオチドを用いた、０．５コピー／ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＤＮＡの反応（統計的に決定）を備えた混合物内の変異体ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す図である。図２４Ｂは、本発明のその３’末端がＬＮＡで修飾された第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）、プローブポリヌクレオチド（すなわち、ＴａｑＭａｎ）、及びブロッカーポリヌクレオチドを用いた、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＤＮＡのコピーを有さない混合物内の変異体ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す図である。ＷＴ ＤＮＡサンプルの９４％（１６のうち１５）が全く信号を示さず、このことは、改善されたＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ｑＰＣＲアッセイによる単一の変異体ＤＮＡ検出の極めて高い選択性を示唆している。 図２４Ａは、本発明のその３’末端がＬＮＡで修飾された第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）、プローブポリヌクレオチド（すなわち、ＴａｑＭａｎ）、及びブロッカーポリヌクレオチドを用いた、０．５コピー／ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＤＮＡの反応（統計的に決定）を備えた混合物内の変異体ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す図である。図２４Ｂは、本発明のその３’末端がＬＮＡで修飾された第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）、プローブポリヌクレオチド（すなわち、ＴａｑＭａｎ）、及びブロッカーポリヌクレオチドを用いた、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＤＮＡのコピーを有さない混合物内の変異体ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す図である。ＷＴ ＤＮＡサンプルの９４％（１６のうち１５）が全く信号を示さず、このことは、改善されたＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ｑＰＣＲアッセイによる単一の変異体ＤＮＡ検出の極めて高い選択性を示唆している。 図２４Ａは、本発明のその３’末端がＬＮＡで修飾された第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）、プローブポリヌクレオチド（すなわち、ＴａｑＭａｎ）、及びブロッカーポリヌクレオチドを用いた、０．５コピー／ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＤＮＡの反応（統計的に決定）を備えた混合物内の変異体ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す図である。図２４Ｂは、本発明のその３’末端がＬＮＡで修飾された第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）、プローブポリヌクレオチド（すなわち、ＴａｑＭａｎ）、及びブロッカーポリヌクレオチドを用いた、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＤＮＡのコピーを有さない混合物内の変異体ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す図である。ＷＴ ＤＮＡサンプルの９４％（１６のうち１５）が全く信号を示さず、このことは、改善されたＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ｑＰＣＲアッセイによる単一の変異体ＤＮＡ検出の極めて高い選択性を示唆している。 図２４Ａは、本発明のその３’末端がＬＮＡで修飾された第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）、プローブポリヌクレオチド（すなわち、ＴａｑＭａｎ）、及びブロッカーポリヌクレオチドを用いた、０．５コピー／ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＤＮＡの反応（統計的に決定）を備えた混合物内の変異体ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す図である。図２４Ｂは、本発明のその３’末端がＬＮＡで修飾された第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）、プローブポリヌクレオチド（すなわち、ＴａｑＭａｎ）、及びブロッカーポリヌクレオチドを用いた、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＤＮＡのコピーを有さない混合物内の変異体ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す図である。ＷＴ ＤＮＡサンプルの９４％（１６のうち１５）が全く信号を示さず、このことは、改善されたＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ｑＰＣＲアッセイによる単一の変異体ＤＮＡ検出の極めて高い選択性を示唆している。 図２４Ａは、本発明のその３’末端がＬＮＡで修飾された第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）、プローブポリヌクレオチド（すなわち、ＴａｑＭａｎ）、及びブロッカーポリヌクレオチドを用いた、０．５コピー／ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＤＮＡの反応（統計的に決定）を備えた混合物内の変異体ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す図である。図２４Ｂは、本発明のその３’末端がＬＮＡで修飾された第１のポリヌクレオチド、フィクサー（すなわち、第２のポリヌクレオチド）、プローブポリヌクレオチド（すなわち、ＴａｑＭａｎ）、及びブロッカーポリヌクレオチドを用いた、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＤＮＡのコピーを有さない混合物内の変異体ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを検出するためのｑＰＣＲアッセイの結果を示す図である。ＷＴ ＤＮＡサンプルの９４％（１６のうち１５）が全く信号を示さず、このことは、改善されたＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ｑＰＣＲアッセイによる単一の変異体ＤＮＡ検出の極めて高い選択性を示唆している。
発明の詳細な説明
本発明は、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション中に、特に標的ポリヌクレオチドへの増幅プライマーハイブリダイゼーション中に遭遇する問題を克服する非連続的ポリヌクレオチドデザインの発見に基づく。これらの問題は、限定されるものではないが、標的ポリヌクレオチド内の困難な二次構造の克服と、標的ポリヌクレオチド内の単一塩基の変化に対する低い特異性とが挙げられる。
本明細書に記載されたポリヌクレオチドの組み合わせは、効率的に増幅させることが難しいポリヌクレオチド鋳型を用いる場合、標準的ＰＣＲプライマーと長いＰＣＲプライマーの双方にわたる利点を提供する。このような鋳型としては、例えば、妨害するようなループ、ヘアピンなどを生み出す内部自己ハイブリだーゼーションを経て形成されたある程度の二次構造を含有するような鋳型が挙げられ、これがハイブリダイゼーションの効率を下げ又はそれを阻害する。鋳型の二次構造は、内部ハイブリダイゼーションを不安定化させることができず、従ってプライマー相補体へのハイブリダイズが不可能であるような標準的なＰＣＲプライマーを使用してのプライミングを妨害し得る。本発明のポリヌクレオチドの組み合わせを用いることで、鋳型の二次構造がデハイブリダイズされて（又は溶融され）、相補的鋳型領域によるハイブリダイゼーションが、適切な条件下で起こる。本明細書で使用されたように、「標準鎖ＰＣＲプライマー」の長さは、約１０〜１００塩基であり得る。
また、長鎖ＰＣＲプライマーも、標的ポリヌクレオチド内の二次構造を解決することが可能であるが、プライマーの３’（プライミング）末端近辺において、特異性又は感応性のいずれかを同時に提供することはできない。このことが、長鎖ＰＣＲプライマーでは多くの部分が標的ポリヌクレオチドに対してハイブリダイズされて、標的ポリヌクレオチドに関するプライマーの３’末端近辺のミスマッチが、プライミング効率を低下させるには不十分である理由である。結果的には、ミスマッチがあるにもかかわらず、ＰＣＲ生成物が合成されるであろう。
本発明のポリヌクレオチドの組み合わせは他の利点を提供する。例えば、短鎖ＰＣＲプライマーは、標的ポリヌクレオチドに対する正確な配列ハイブリダイゼーションのために有用であるが、ＰＣＲでは望ましい標的ポリヌクレオチドに対するプライマー結合の高特異性を達成するために、典型的に可能な限り高いアニーリング温度が選択される。このアニーリング温度は、所与のプライマーの溶融温度に基づいて選択されて、短鎖プライマーに関しては、アニーリング温度は比較的低いであろう。しかしながら、低いアニーリング温度は、標的ポリヌクレオチドに対する短鎖プライマーの非特異的ハイブリダイゼーションを許容するという不都合を有し、この結果、非特異的なＰＣＲ生成物の形成に至る。短鎖ＰＣＲプライマーがその標的ポリヌクレオチドに対してアニーリングするよう用いられるべき比較的低いアニーリング温度に基づいて、短鎖プライマーが標的ポリヌクレオチドと二重鎖を形成するが、それらが標的ポリヌクレオチド領域に対して１００％相補的である場合でも、それは一般的に不安定である。更に、プライマーが１００％未満で相補的（すなわち、プライマーと標的ポリヌクレオチドとの間の少なくとも１つのミスマッチ）である場合では、これら二重鎖は更により不安定である。本発明のポリヌクレオチドの組み合わせは、短鎖ＰＣＲプライマーを用いることに関連する不安定問題を克服するよう補助し、並びに所望の標的への高度に特異的な結合を可能にする。例えば、本開示の組み合わせは、わずか１つの塩基のみが異なるような標的配列の間を識別することが可能である。
例えば、不連続的ポリヌクレオチドの組み合わせデザイン（図１参照）が、鋳型ポリヌクレオチドに対するフィクサーポリヌクレオチド（すなわち、「第２のポリヌクレオチド」）の第１のドメイン［Ｆａ］のハイブリダイゼーションと、フィクサーポリヌクレオチドの第２のドメイン［Ｆｄ］に対するプライマーポリヌクレオチド（すなわち、「第１のポリヌクレオチド」）の第２のドメイン［Ｐｃ］のハイブリダイゼーションを通して、短鎖ＰＣＲプライマー領域［Ｐａ］の使用を可能にして、これによって、明白に「より長い」プライマー配列の効果的な結果を得ることができる。このより長くかつ不連続なハイブリダイゼーションが、たとえその領域が８塩基ほどの小さい領域であっても、プライマーポリヌクレオチドの第１の領域［Ｐａ］間の結合を効果的に安定化させて、これによってＰＣＲの効率を増大させることができる。
他の実施形態では、プライマーポリヌクレオチドの第１のドメインに相補的である鋳型ポリヌクレオチドの領域とフィクサーポリヌクレオチドは、直接的に隣接する必要はない。本発明は、相補的領域が１０個まで又はそれ以上のヌクレオチドによって分離されている（すなわち不連続的な）実施形態を意図していて、鋳型ポリヌクレオチドへのフィクサーハイブリダイゼーションの際には、増幅される標的鋳型領域をプライマーポリヌクレオチドに近接するように持っていくために、介在する配列がループアウトされる。本態様では、次いでプライマーの組み合わせが、ループアウト構造の内部自己ハイブリダイゼーションの有無にかかわらず、鋳型ポリヌクレオチド内の二次構造を実際に誘導する。
Ｉ．ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ
１つの実施形態では、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドの組み合わせが提供され、第１のポリヌクレオチドは、第１の標的ポリヌクレオチド領域に相補的である第１のドメイン［Ｐａ］と特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン［Ｐｃ］とを含み、第２のポリヌクレオチドは、第２の標的ポリヌクレオチド領域に相補的である第１のドメイン［Ｆｂ］と、第１のポリヌクレオチドの第２のドメインと第２のポリヌクレオチドの第２のドメインが適切な条件下でハイブリダイズするように、第１のポリヌクレオチドの第２のドメインに対して十分に相補的なポリヌクレオチドを含む第２のドメイン［Ｆｄ］とを含む。基本的なポリヌクレオチドの組み合わせの構造的関係が、図１に示されている。
Ａ．三方向接合
三方向接合ポリヌクレオチドの組み合わせでは、プライマーポリヌクレオチドとフィクサーポリヌクレオチドが、第１のポリヌクレオチドの第２のドメイン（スキーム１中のＰｃ）と第２のポリヌクレオチドの第２のドメイン（スキーム１中のＦｄ）との間の相互作用を経て結合され、並びに図２（スキーム２Ａ）に示したように、プライマーオリゴヌクレオチドの第１のドメイン（図１のＰａ）とフィクサーポリヌクレオチドの第１のドメイン（図１のＦｂ）が、標的ポリヌクレオチド内のそれぞれの相補的な領域へとハイブリダイズされる。
Ｂ．三方向超の接合
本発明は、プライマーの組み合わせが２つの三方向接合を含むような別の実施形態を更に意図する（図２、スキーム２Ｂ参照）。これら実施形態のいくつかでは、ドメイン「ｅ」がドメイン［Ｐｃ］に対して相補的であり、ドメイン「ｆ」がドメイン［Ｆｄ］に対して相補的であり、並びにドメイン「ｇ」が第３の標的ポリヌクレオチド領域に対して相補的である。
本発明は、四方向接合を含むポリヌクレオチドの組み合わせを更に意図する。四方向接合ポリヌクレオチドの組み合わせでは、プライマーポリヌクレオチドとフィクサーポリヌクレオチドが、「ステープル」ポリヌクレオチドを経て結合されている。（スキーム３Ａ、下）。ステープルポリヌクレオチドは、プライマーポリヌクレオチドとフィクサーポリヌクレオチドの双方の第２のドメインをハイブリダイズさせることが可能である。ステープルポリヌクレオチドの構造は、適切な条件下でその領域がハイブリダイズし得るように、プライマーポリヌクレオチドの第２のドメイン［Ｐｃ］に対して十分に相補的である第１のドメイン［ｅ］と、適切な条件下で領域がハイブリダイズし得るようにハイブリダイズすることが可能であるフィクサーポリヌクレオチドの第２のドメイン［Ｆｄ］に対して相補的である第２のドメイン［ｆ］とを含む。本実施形態のいくつかの態様では、典型的な条件下で、ＰｃドメインとＦｄドメインとの間のハイブリダイゼーションを許可するために、プライマーポリヌクレオチドの第２のドメインＰｃは、フィクサーポリヌクレオチドの第２のドメインＦｄに対して十分に相補的である必要はない。本態様では、ステープル内の第１のドメイン［ｅ］が、プライマーポリヌクレオチドの第２のドメインＰｃに対して十分に相補的であることによって、並びにステープルの第２のドメイン［ｆ］がフィクサーポリヌクレオチドの第２のドメイン［Ｆｄ］に対して十分に相補的であることによって、図３（スキーム３Ａ）に示されたような、安定な四方向接合の形成が可能となる。
本明細書に記載されたように、ポリヌクレオチドの組み合わせ内で更なる「ステープル」ポリヌクレオチドが意図されていて、これによって、ポリヌクレオチドの組み合わせ中のステープルポリヌクレオチドの数に依存して、複数方向の接合が発生する。スキーム３Ｂは、五方向接合を示していて、当該技術分野の当業者は、五方向以上の接合がどのように構成されるかを容易に理解されることであろう。
更に、「ステープル」ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されたように、修飾核酸を含んでもよい。更なる態様では、「ステープル」ポリヌクレオチドは、標識及び／又はクエンチャーを含んでもよい。これら態様では、標識又はクエンチャーは、「ステープル」ポリヌクレオチドの５’又は３’末端のいずれかにあってもよい。
Ｃ．ブロッカーポリヌクレオチドを含むプライマーの組み合わせ
本発明は、ブロッカーポリヌクレオチドがポリヌクレオチドの組み合わせに含有されるような実施形態も更に意図している。ブロッカーポリヌクレオチドは、第１の標的ポリヌクレオチド領域の５’側直近に配置された標的ポリヌクレオチド領域に相補的である配列を有する。このことは、図４に示されている。いくつかの実施形態では、ブロッカーポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドの第１のドメインに重なっている。言い換えれば、第１のポリヌクレオチドの３’末端におけるヌクレオチドとブロッカーポリヌクレオチドの５’末端におけるヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの同一のヌクレオチドに対して相補的である可能性がある。種々の実施形態では、第１のポリヌクレオチドとブロッカーポリヌクレオチドの重複は、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌ１０クレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、又は１５ヌクレオチドである。関連する実施形態では、第１のポリヌクレオチドの３’末端におけるヌクレオチドと、ブロッカーポリヌクレオチドの５’末端におけるヌクレオチドは異なる。これら実施形態では、第１のポリヌクレオチドの３’末端におけるヌクレオチドは、それらが標的ポリヌクレオチドに対して適切な位置で相補的である場合、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする可能性があり、従って、適切な条件下で、第１のポリヌクレオチドの伸張を許容する（図４ａ参照）。関連する実施形態では、ブロッカーポリヌクレオチドの５’末端におけるヌクレオチドは、それらが非標的ポリヌクレオチドに対して適切な位置で相補的である場合、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする可能性があり、従って、第１のポリヌクレオチドの伸張が遮断される（図４ｂ参照）。種々の実施形態では、ブロッカーポリヌクレオチドの３’末端におけるヌクレオチドは、ポリメラーゼによる伸張を防止するために修飾されている。
いくつかの実施形態では、ブロッカーポリヌクレオチドの重複する配列と第１ポリヌクレオチド（Ｐａ）の第１のドメインは、少なくとも２塩基、少なくとも３塩基、少なくとも４塩基、少なくとも５塩基、少なくとも６塩基、少なくとも７塩基、少なくとも８塩基、少なくとも９塩基、又は少なくとも１０塩基で異なる。異なる塩基は、重複部分のいかなる位置にもあり得る。
Ｄ．プローブポリヌクレオチドを含むプライマーの組み合わせ
本発明は、上記ポリヌクレオチドの組み合わせにプローブポリヌクレオチドが含有されるような実施形態もまた意図している。プローブポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチド領域の５’側に配置された標的ポリヌクレオチド領域に相補的である配列を有する（図５ａ参照）。他の実施形態では、プローブポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドの伸張生成物に相補的である配列を有する（図５ｂ参照）。明らかなように、本プローブポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの相補鎖に相補的であろう。プローブポリヌクレオチドを伴って、プライマーの組み合わせにブロックポリヌクレオチドが含有されるような実施形態では、プローブポリヌクレオチドは、ブロッカーポリヌクレオチドに相補的な標的ポリヌクレオチド領域の５’側に配置された標的ポリヌクレオチド領域に対して相補的である。種々の実施形態では、プローブポリヌクレオチドは、その５’末端に標識を含む。関連した実施形態では、プローブポリヌクレオチドは、その３’末端にクエンチャーを更に含む。更に他の実施形態では、プローブポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、Ｚｅｎクエンチャーのような内部クエンチャーを更に含む。
Ｅ．ユニバーサルクエンチャーを含むプライマーの組み合わせ
種々の実施形態では、プライマーポリヌクレオチドの組み合わせは、ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドを含む。ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドは、それが第２のポリヌクレオチドの第２のドメインにハイブリダイズするように、第２のポリヌクレオチドの第２のドメインに対して相補的である。これらの実施形態では、ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドの第２のドメインがハイブリダイズするところの領域の３’側に配置された第２のポリヌクレオチドの領域に対してハイブリダイズする（図６参照）。ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドは、その３’末端がクエンチャーによって標識されている。
Ｆ．逆方向プライマーを含むプライマーの組み合わせ
本発明は、逆方向プライマーポリヌクレオチドが上記ポリヌクレオチドの組み合わせに含有されるような実施形態を更に意図している。逆方向プライマーは、第１のポリヌクレオチドの伸張によって作り出されたポリヌクレオチド内の領域に対して相補的である(図８ａ参照)。いくつかの実施形態で明らかのように、標的ポリヌクレオチドが二重鎖ポリヌクレオチドの１本鎖である場合、逆方向プライマーは、標的ポリヌクレオチドの相補鎖に対してまた相補的である。いくつかの実施形態では、上述したように、逆方向プライマーは、組み合わされた第１のポリヌクレオチド／第２のポリヌクレオチドである（図８ｂ参照）。
ＩＩ．ポリヌクレオチド
本明細書で使用する、用語「ポリヌクレオチド」は、ブロッカーポリヌクレオチド及びプローブを含むポリヌクレオチド対の組み合わせの構成成分としてか、或いは標的分子としてかのいずれかであり、用語「オリゴヌクレオチド」と互換的に使用される。
本明細書で使用する、用語「ヌクレオチド」又はその複数形は、本明細書で説明したように、或いは当該技術分野で既知であるように、修飾形と互換的である。ある場合には、当業者は、重合化され得るヌクレオチドの修飾と同様に、天然発生型ヌクレオチドを包含する用語「ヌクレオベース」を用いる。
所定の配列のポリヌクレオチドの製造法は、当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（第２版、１９８９年）及びＦ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（編集）、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ」，第１版（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１年）を参照されたい。固相合成法は、オリゴリボヌクレオチドとオリゴデオキシリボヌクレオチドの双方に好適である（ＤＮＡを合成するための周知の方法は、ＲＮＡを合成するためにも又有用である）。オリゴリボヌクレオチドとオリゴデオキシリボヌクレオチドは、酵素的に調製され得る。
種々の態様では、提供された方法は、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、または２つのタイプの組み合わせであるポリヌクレオチドの使用を含む。オリゴヌクレオチドの修飾形は、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチド間架橋結合を有するオリゴヌクレオチドを含むよう意図されている。修飾ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、以下の本明細書に詳細に記載されている。
ＩＩＩ．修飾ポリヌクレオチド
オリゴヌクレオチドの特定の例としては、修飾された骨格を含有するオリゴヌクレオチド、又は非天然ヌクレオチド間結合を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドとしては、リン原子を骨格内に保持するオリゴヌクレオチド及び骨格内にリン原子を有しないオリゴヌクレオチドが挙げられる。その骨格内にリン原子を有しない修飾オリゴヌクレオチドは、「オリゴヌクレオチド」の意味に含まれると考えられる。特定の実施形態では、第１のポリヌクレオチドはホスホロチオエート結合を含む。
リン原子を含有する修飾オリゴヌクレオチド骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラル体ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート及びボラノホスフェートが挙げられ、これらは通常の３’−５’結合、これらの２’−５’結合同類体を有し、並びに１つまたはそれ以上のヌクレオチド間結合が３’〜３’、５’〜５’又は２’〜２’結合であるような逆転した極性を有する。３’側のほとんどのヌクレオチド間結合で単一の３’〜３’結合を含み、すなわち、無塩基部分であり得る単一の逆転したヌクレオシド残基を含む（ヌクレオチドが欠けているか、或いはその規定位置にヒドロキシル基を有する）逆転した極性を有するオリゴヌクレオチドもまた考えられる。塩、混合塩及び遊離酸も更に考えられる。上記リン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許は、その開示が参照により本明細書に組み込まれものとする、米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，４６９，８６３号、同第４，４７６，３０１号、同第５，０２３，２４３号、同５，１７７，１９６号、同第５，１８８，８９７号、同第５，２６４，４２３号、同第５，２７６，０１９号、同第５，２７８，３０２号、同５，２８６，７１７号、同第５，３２１，１３１号、同第５，３９９，６７６号、同第５，４０５，９３９号、同第５，４５３，４９６号、同第５，４５５，２３３号、同第５，４６６，６７７号、同５，４７６，９２５号、同第５，５１９，１２６号、同第５，５３６，８２１号、同第５，５４１，３０６号、同第５，５５０，１１１号、同第５，５６３，２５３号、同第５，５７１，７９９号、同第５，５８７，３６１号、同第５，１９４，５９９号、同第５，５６５，５５５号、同第５，５２７，８９９号、同第５，７２１，２１８号、同第５，６７２，６９７号及び同第５，６２５，０５０号明細書が挙げられる。
その中にリン原子を含有しない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキル又はシクロアルキルヌクレオチド間結合、混合された異種原子及びアルキル又はシクロアルキルヌクレオチド間結合、又は１つまたはそれ以上の短鎖異種原子又は複素環式ヌクレオチド間結合によって形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ結合を有する骨格、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格、ホルムアセチル及びチオホルムアセチリル骨格、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、スルホネート及びスルホンアミド骨格、アミド骨格、及び混合したＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分部分を有する他の骨格が挙げられる。その開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれたものとする、例えば、米国特許第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，２１４，１３４号、同第５，２１６，１４１号、同第５，２３５，０３３号、同第５，２６４，５６２号、同第５，２６４，５６４号、同第５，４０５，９３８号、同第５，４３４，２５７号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７０，９６７号、同第５，４８９，６７７号、同第５，５４１，３０７号、同第５，５６１，２２５号、同第５，５９６，０８６号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６０８，０４６号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６１８，７０４号、同第５，６２３，０７０号、同第５，６６３，３１２号、同第５，６３３，３６０号、同第５，６７７，４３７号、同第５，７９２，６０８号、同第５，６４６，２６９号及び同第５，６７７，４３９号明細書を参照されたい。
更に他の実施形態では、１つ又はそれ以上の糖及び／又は１つ又はそれ以上のヌクレオチド間結合単位が「非天然型」基で置換されているようなオリゴヌクレオチド擬似体を提供する。１つの態様では、本実施形態はペプチド核酸（ＰＮＡ）を意図する。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格が、アミド含有骨格で置換されている。例えば、その開示を参照により本明細書に組み込んだものとする、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号及び同第５，７１９，２６２号明細書、並びにＮｉｅｌｓｅｎら著、１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４、１４９７〜１５００頁を参照されたい。
更に他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格及び異種原子骨格を備えたオリゴヌクレオシドを持ち、米国特許第５，４８９，６７７号及び同第５，６０２，２４０号明細書に記載された、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−， −ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−， −ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−， −ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−及び−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−が挙げられる。また、米国特許第５，０３４，５０６号明細書に記載された、モルホリノ骨格構造を備えたオリゴヌクレオチドも考えられる。
種々の形態では、２〜４個、望ましくは３個の基／原子からなるオリゴ中の２つの連続したモノマー間の結合は、−ＣＨ２−，−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＲＨ−，＞Ｃ＝Ｏ，＞Ｃ＝ＮＲＨ，＞Ｃ＝Ｓ，−Ｓｉ（Ｒ”）２−，−ＳＯ−，−Ｓ（Ｏ）２−，−Ｐ（Ｏ）２−，−ＰＯ（ＢＨ３）−，−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−，−Ｐ（Ｓ）２−，−ＰＯ（Ｒ”）−，−ＰＯ（ＯＣＨ３）−,及び−ＰＯ（ＮＨＲＨ）−から選択され，式中ＲＨは水素、及びＣ１−４−アルキルから選択され、並びにＲ”はＣ１−６−アルキル及びフェニルから選択される。このような結合の具体的な例は、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−，−ＣＨ２−ＣＯ−ＣＨ２−，−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−，−Ｏ−ＣＨ2−Ｏ−，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝(連続するモノマーへの結合として用いられる場合、Ｒ５を含む),−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−，−ＮＲＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−，−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−，−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＨ２−，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−，−ＮＲＨ−ＣＯ−Ｏ−，−ＮＲＨ−ＣＯ−ＮＲＨ−， −ＮＲＨ−ＣＳ−ＮＲＨ−，−ＮＲＨ−Ｃ（＝ＮＲＨ）−ＮＲＨ−，−ＮＲH−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−，−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−Ｏ−，−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−，−Ｏ−ＣＯ−ＮＲＨ−，−ＮＲＨ−ＣＯ−ＣＨ２−，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−, −ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−，−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−，−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ＝(連続するモノマーへの結合として用いられる場合、Ｒ５を含む)、−ＣＨ２−Ｏ−ＮＲＨ−，−ＣＯ−ＮＲＨ−ＣＨ２−，−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−，−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＯ−，−Ｏ−ＮＲＨ−ＣＨ２−，−Ｏ−ＮＲＨ，−Ｏ−ＣＨ２−Ｓ−，−Ｓ−ＣＨ２−Ｏ−，−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−，−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−，−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ＝（連続するモノマーへの結合として用いられる場合、Ｒ５を含む）, −Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−，−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−，−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−，−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−，−ＣＨ２−ＳＯ−ＣＨ２−，−ＣＨ２−ＳＯ２−ＣＨ２−，−Ｏ−ＳＯ−Ｏ−，−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−Ｏ−，−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−，−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−ＮＲＨ−,−ＮＲＨ−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−，−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−，−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−，−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−，−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−，−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−，−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−，−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−，−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−，−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−，−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｓ−, −Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−，−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−，−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｓ−，−Ｏ−ＰＯ（Ｒ”）−Ｏ−，−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ３）−Ｏ−，−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ２ＣＨ３）−Ｏ−，−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｒ）−Ｏ−，−Ｏ−ＰＯ（ＢＨ３）−Ｏ−，−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＮ）−Ｏ−，−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＮＲＨＨ−，−ＮＲＨ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−，−Ｏ−Ｐ（Ｏ，ＮＲＨ）−Ｏ−，−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−，−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＣＨ２−，及び−Ｏ−Ｓｉ（Ｒ”）２−Ｏ−から選択され、この−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−，−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−，−Ｓ−ＣＨ２−Ｏ−，−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−Ｏ−Ｐ（−Ｏ，Ｓ）−Ｏ−，−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−，−ＮＲＨＰ（Ｏ）２−Ｏ−，−Ｏ−Ｐ(Ｏ，ＮＲＨ)−Ｏ−，−Ｏ−ＰＯ（Ｒ”）−Ｏ−，−Ｏ−ＰＯ（ＣＨ３）−Ｏ−，及び−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＮ）−Ｏ−の中で、ＲＨは水素、Ｃ１―４―アルキルから選択され、Ｒ”はＣ１−６−アルキル及びフェニルから選択されると考えられる。更なる具体例が、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら著、１９９５年、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ」５：３４３〜３５５頁、及びＳｕｓａｎ Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ及びＫａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ Ａｌｔｍａｎｎ著、１９９７年、「Ｎｅｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」，第２５巻、４４２９〜４４４３頁で提供されている。
オリゴヌクレオチドの更なる他の修飾形態は、その開示がに参照によりその全体が本明細書に組み込まれたものとする、米国特許出願公開第２００４／０２１９５６５号明細書に詳細に記載されている。
修飾オリゴヌクレオチドは、１つまたはそれ以上の置換された糖部分を含有してもよい。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは、２’位置において以下のうちの１つを含む。これらはＯＨ；Ｆ；Ｏ−，Ｓ−、又はＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルキニル；若しくはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルで、この中で、アルキル、アルケニル及びアルキニルはＣ１〜Ｃ１０アルキル、又はＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルで置換されていても置換されていなくてもよい。他の実施形態では、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２を含み、式中、ｎ及びｍは１〜約１０である。他のオリゴヌクレオチドは、２’位置において以下のうちの１つを含み、これらは、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換された低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル又はＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、ａｎ ＲＮＡ開裂基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改善するための基、又はオリゴヌクレオチドの薬動力学的性質を改善するための基、並びに同様な性質を有する他の置換基である。１つの態様では、修飾としては、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、別名２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）又は２’−（ＭＯＥ）（Ｍａｒｔｉｎら著、１９９５年、「Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ」、７８、４８６〜５０４頁）が挙げられ、すなわち、アルコキシアルコキシ基である。他の修飾としては、本明細書の実施例で、以下に記載されたような２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、別名２’−ＤＭＡＯＥ、及び本明細書の実施例で、以下に更に記載されたような２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野では、別名２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチル又は２’−ＤＭＡＥＯＥ）、すなわち２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２が挙げられる。
更に他の修飾として、２’−メトキシ（ ２’−Ｏ−ＣＨ３）、 ２’−アミノプロポキシ（ ２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）及び２’−フルオロ（２’―Ｆ）が挙げられる。 ２’−修飾は、アラビノ（上方）位置にあってもリボ（下方）位置にあってもよい。１つの態様では、 ２’−アラビノ修飾は、２’−Ｆである。同様な修飾は、オリゴヌクレオチドの他の位置において生成されてもよく、例えば、３’末端ヌクレオチド又は２’−５’結合されたオリゴヌクレオチド上の糖の３’位置、及び５’末端ヌクレオチドの５’位置において生成されてもよい。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりのシクロブチル部分のような糖疑似体を有してもよい。例えば、その開示を本明細書に参照によりその全体が組み込まれたものとする、米国特許第４，９８１，９５７号、同第５，１１８，８００号、同第５，３１９，０８０号、同第５，３５９，０４４号、同第５，３９３，８７８号、同第５，４４６，１３７号、同第５，４６６，７８６号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５１９，１３４号、同第５，５６７，８１１号、同第５，５７６，４２７号、同第５，５９１，７２２号、同第５，５９７，９０９号、同第５，６１０，３００号、同第５，６２７，０５３号、同第５，６３９，８７３号、同第５，６４６，２６５号、同第５，６５８，８７３号、同第５，６７０，６３３号、同第５，７９２，７４７号、及び同第５，７００，９２０号明細書を参照されたい。
種々の態様では、糖の修飾は、２’−ヒドロキシル基が糖環の３’又は４’炭素原子に結合されていて、これによって二環式糖部分が形成されるようなロックド核酸（ＬＮＡｓ）を含む。特定の態様における結合は、２’酸素原子と４’炭素原子を架橋しているメチレン（−ＣＨ２−）ｎ基であり、式中、ｎは１又は２である。ＬＮＡｓ及びその調製は、その開示を本明細書に参照によりその全体が引用されたものとする、国際公開第９８／３９３５２号及び国際公開第９９／１４２２６号に記載されている。種々の実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、１つのロックド核酸を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、複数個のロックド核酸を含む。特定の実施形態では、第１のポリヌクレオチドの第１のドメインは、複数個のロックド核酸を含む。より特定な実施形態では、第１のポリヌクレオチドの３’末端におけるヌクレオチドは、１つのロックド核酸を含む。種々の実施形態では、ブロッカーポリヌクレオチドは、１つのロックド核酸を含む。他の実施形態では、ブロッカーポリヌクレオチドは、複数個のロックド核酸を含む。特定の実施形態では、ブロッカーポリヌクレオチドの５’末端におけるヌクレオチドが、１つのロックド核酸を含む。
ポリヌクレオチドは、塩基修飾又は置換もまた含んでよい。本明細書で使用する、「非修飾」又は「天然型」塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を包含する。修飾塩基としては、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン並びにピリミジン塩基の他のアルキル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン並びにチミン、５−ウラシル（疑似ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換されたアデニン及びグアニン、５−ハロ特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換されたウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン及び３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンのような他の合成及び天然型塩基が挙げられる。更なる修飾塩基として、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）のような三環式ピリミジン、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミジド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、置換されたフェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）のようなＧクランプ、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インド−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）が挙げられる。修飾塩基は、プリン又はピリミジン塩基が他の複素環で置換されているような、例えば、７−デアザ−アデニン、７−セアザグアノシン、２−アミノピリジン及び２−ピリドンなどの修飾塩基を含んでもよい。更なる塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８に開示されている修飾塩基、「Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、８５８〜８５９頁、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ， １９９０年に開示されている修飾塩基、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら著、１９９１年、「Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ３０：６１３頁に開示されている修飾塩基、並びにＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．著、第１５章、「Ａｎｔｉｓｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」２８９〜３０２頁、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．及びＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３年に開示されている修飾塩基が挙げられる。これらの塩基のあるものは、結合親和性を増大させるために有用であり、並びに２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンを含有する５−置換されたピリミジン、６−アザピリミジン及びＮ−２、Ｎ−６及び−６置換されたプリンを含む。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６〜１．２℃まで増加させることが確認されていて、特定の態様では、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされている。その開示が参照により本明細書に引用されたものとする、米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，８４５，２０５号、同第５，１３０，３０２号、同第５，１３４，０６６号、同第５，１７５，２７３号、同第５，３６７，０６６号、同第５，４３２，２７２号、同第５，４５７，１８７号、同第５，４５９，２５５号、同第５，４８４，９０８号、同第５，５０２，１７７号、同第５，５２５，７１１号、同第５，５５２，５４０号、同第５，５８７，４６９号、同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号、同第５，６１４，６１７号、同第５，６４５，９８５号、同第５，８３０，６５３号、同第５，７６３，５８８号、同第６，００５，０９６号、同第５，７５０，６９２号及び同第５，６８１，９４１号明細書を参照されたい。
「修飾塩基」又は他の同様な用語は、天然型塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、及び／又はチミン）と対になることができる、及び／又は非天然型塩基と対になることができる組成物を指す。特定の態様では、修飾塩基は、１５、１２、１０、８、６、４又は２℃若しくはそれ未満のＴｍ差を提供する。代表的な修飾塩基は、欧州特許第１０７２６７９号明細書及び国際公開第９７／１２８９６号に記載されている。
「ヌクレオ塩基」は、天然型ヌクレオ塩基アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）を意味し、並びにキサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ’，Ｎ’−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン（ｍＣ）、５−（Ｃ３−Ｃ６）−アルキニル−シトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、疑似イソシトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシン及びＢｅｎｎｎｅｒら著、米国特許第５，４３２，２７２号並びにＳｕｓａｎ Ｍ． Ｆｒｅｉｅｒ及びＫａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ Ａｌｔｍａｎｎ著、１９９７年、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２５巻、４４２９〜４４４３頁に記載されている「非天然型」ヌクレオ塩基のような非天然型ヌクレオ塩基を意味する。したがって、用語「ヌクレオ塩基」は、既知のプリン及びピリミジン複素環を含むのみならず、複素環式類似体及びそれらの互変異性体もまた含む。更なる天然型及び非天然型ヌクレオ塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号明細書（Ｍｅｒｉｇａｎら著）、Ｓａｎｇｈｖｉ著、Ｃｈａｐｔｅｒ １５、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ及びＢ．Ｌｅｂｌｅｕ編，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３年、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら著、１９９１年、「Ａｎｇｅｗａｎｄｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３〜７２２頁（特に６２２頁と６２３頁、並びに双方ともに参照によりその全体を本明細書に引用したものとする「Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」，Ｊ．Ｉ．Ｋｒｏｓｃｈｗｉｚ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０年，８５８〜８５９頁、及びＣｏｏｋ著，「Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ」１９９１年，６，５８７〜６０７頁を参照されたい）に開示されているヌクレオ塩基が挙げられる。用語「ヌクレオシド塩基」又は「塩基単位」は、多くの古典的な感覚ではヌクレオシド塩基ではないが、ヌクレオシド塩基として働く特定の「ユニバーサル塩基」を含むヌクレオ塩基のように働く複素環式化合物のような化合物を包含することを更に意図している。特にユニバーサル塩基として既述したヌクレオシド塩基は、３−ニトロピロール、必要に応じて置換されたインドール（例えば、５−ニトロインドール）、並びに必要に応じて置換されたヒポキサンチンなどである。他の望ましいユニバーサル塩基としては、ピロール、ジアゾール又はトリアゾール誘導体で、当該技術分野で既知のユニバーサル塩基を包含する。
ＩＶ．ポリヌクレオチド構造−長さ
１つの態様では、第１のポリヌクレオチドの第１のドメインは、標的ポリヌクレオチド領域に対して相補的である５ヌクレオチドである。種々の態様では、第１のポリヌクレオチドの第１のドメインは、標的ポリヌクレオチド領域に対して相補的である、少なくとも６ヌクレオチド、少なくとも７ヌクレオチド、少なくとも８ヌクレオチド、少なくとも９ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１１ヌクレオチド、少なくとも１２ヌクレオチド、少なくとも１３ヌクレオチド、少なくとも１４ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも１６ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも１８ヌクレオチド、少なくとも１９ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２１ヌクレオチド、少なくとも２２ヌクレオチド、少なくとも２３ヌクレオチド、少なくとも２４ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも２６ヌクレオチド、少なくとも２７ヌクレオチド、少なくとも２８ヌクレオチド、少なくとも２９ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド又はそれ以上のヌクレオチドである。関連する態様では、第１のポリヌクレオチドの第２のドメインは、第２のポリヌクレオチドに対して十分に相補的であり、これによって適切な条件下で、これら２つの相補的配列間のハイブリダイゼーションが可能となるような特徴的なＤＮＡ配列内の１０またはそれ以上のヌクレオチドを含む。種々の態様では、第１のポリヌクレオチドの第２のドメインは、適切な条件下で、２つの相補的配列間のハイブリダイゼーションが許されるように、第２のポリヌクレオチドの第２のドメインに対して十分に相補的である特徴的なＤＮＡ配列の少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４５、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０、少なくとも約２００、少なくとも約２２０、少なくとも約２４０、少なくとも約２６０、少なくとも約２８０、少なくとも約３００、少なくとも約３２０、少なくとも約３４０、少なくとも約３６０、少なくとも約３８０、少なくとも約４００、少なくとも約４２０、少なくとも約４４０、少なくとも約４６０、少なくとも約４８０、少なくとも約５００またはそれ以上のヌクレオチドを含む。
別の実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、約１０ヌクレオチドを含有する第１のドメインを含み、第２のポリヌクレオチドのこの第１のドメインは、第１のポリヌクレオチドの第１のドメインによって識別される標的領域とは異なるような標的ＤＮＡ領域に対して相補的である。種々の態様では、第２のポリヌクレオチドは、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも約１００、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、少なくとも約３５０、少なくとも約４００、少なくとも約４５０、少なくとも約５００、少なくとも約５５０、少なくとも約６００、少なくとも約６５０、少なくとも約７００、少なくとも約７５０、少なくとも約８００、少なくとも約８５０、少なくとも約９００、少なくとも約９５０、少なくとも約１０００、少なくとも約１１００、少なくとも約１２００、少なくとも約１３００、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００、少なくとも約１７００、少なくとも約１８００、少なくとも約１９００、少なくとも約２０００、少なくとも約２１００、少なくとも約２２００、少なくとも約２３００、少なくとも約２４００、少なくとも約２５００、少なくとも約２６００、少なくとも約２７００、少なくとも約２８００、少なくとも約２９００、少なくとも約３０００、少なくとも約３１００、少なくとも約３２００、少なくとも約３３００、少なくとも約３４００、少なくとも約３５００、少なくとも約３６００、少なくとも約３７００、少なくとも約３８００、少なくとも約３９００、少なくとも約４０００、少なくとも約４１００、少なくとも約４２００、少なくとも約４３００、少なくとも約４４００、少なくとも約４５００、少なくとも約４６００、少なくとも約４７００、少なくとも約４８００、少なくとも約４９００、少なくとも約５０００又はそれ以上のヌクレオチドを含有する第１のドメインを含み、第１のポリヌクレオチドの第１のドメインによって識別される標的領域とは異なっている標的ＤＮＡ領域を識別し、かつそれに結合するように、この第２のポリヌクレオチドの第１のドメインは、相補的又は十分に相補的である。
関連する態様では、第２のポリヌクレオチドの第２のドメインは、適切な条件下、ハイブリダイゼーションを許容するために、第１のポリヌクレオチドの第２のドメインに対して十分に相補的である特徴的ＤＮＡ配列の１０ヌクレオチドを含む。種々の態様では、第２のポリヌクレオチドの第２のドメインは、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０、少なくとも約２００、少なくとも約２２０、少なくとも約２４０、少なくとも約２６０、少なくとも約２８０、少なくとも約３００、少なくとも約３２０、少なくとも約３４０、少なくとも約３６０、少なくとも約３８０、少なくとも約４００、少なくとも約４２０、少なくとも約４４０、少なくとも約４６０、少なくとも約４８０、少なくとも約５００又はそれ以上の、適切な条件下、仏の十分に相補的な配列間のハイブリダイゼーションを許容するために、第１のポリヌクレオチドの台２のドメインに十分に相補的である特徴的なＤＮＡ配列のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載された組成物及び方法は、第１及び第２のポリヌクレオチドに関して上記の特徴を備えたポリヌクレオチドの第２のセットを含む。いくつかの実施形態では、複数個のセットが意図されている。第１及び第２のポリヌクレオチドのこれら追加のセットは、第１及び第２のセットに関して説明されたいかなる特徴も有することができる。
図３（スキーム３Ａ及び３Ｂ）で示されたような「ステープル」ポリヌクレオチドは、１つの態様では、少なくとも２０ヌクレオチドを含むと考えられる。他の態様では、「ステープル」ポリヌクレオチドは、少なくとも２１ヌクレオチド、又は少なくとも２２ヌクレオチド、又は少なくとも２３ヌクレオチド、又は少なくとも２４ヌクレオチド、又は少なくとも２５ヌクレオチド、又は少なくとも２６ヌクレオチド、又は少なくとも２７ヌクレオチド、又は少なくとも２８ヌクレオチド、又は少なくとも２９ヌクレオチド、又は少なくとも３０ヌクレオチド、又は少なくとも約３５ヌクレオチド、又は少なくとも約４０ヌクレオチド、又は少なくとも約４５ヌクレオチド、又は少なくとも約５０ヌクレオチド、又は少なくとも約５５ヌクレオチド、又は少なくとも約６０ヌクレオチド、又は少なくとも約６５ヌクレオチド、又は少なくとも約７０ヌクレオチド、又は少なくとも約７５ヌクレオチド、又は少なくとも約８０ヌクレオチド、又は少なくとも約８５ヌクレオチド、又は少なくとも約９０ヌクレオチド、又は少なくとも約９５ヌクレオチド、又は少なくとも約１００ヌクレオチド、又は少なくとも約１５０ヌクレオチド、又は少なくとも約２００ヌクレオチド、又は少なくとも約２５０ヌクレオチド、又は少なくとも約３００ヌクレオチド、又は少なくとも約３５０ヌクレオチド、又は少なくとも約４００ヌクレオチド、又は少なくとも約４５０ヌクレオチド、又は少なくとも約５００ヌクレオチド又はそれ以上のヌクレオチドを含むことができる。
いくつかの実施形態では、ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドは、約５ヌクレオチドの長さ〜約１００塩基の長さである。種々の態様では、ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチドは、適切な条件下、ハイブリダイゼーションを許可するために、第２のポリヌクレオチドの第２のドメインに十分に相補的である特徴的ＤＮＡ配列の少なくとも５ヌクレオチド、又は少なくとも６ヌクレオチド、又は少なくとも７ヌクレオチド、又は少なくとも８ヌクレオチド、又は少なくとも９ヌクレオチド、又は少なくとも１０ヌクレオチド、又は少なくとも１１ヌクレオチド、又は少なくとも１２ヌクレオチド、又は少なくとも１３ヌクレオチド、又は少なくとも１４ヌクレオチド、又は少なくとも１５ヌクレオチド、又は少なくとも１６ヌクレオチド、又は少なくとも１７ヌクレオチド、又は少なくとも１８ヌクレオチド、又は少なくとも１９ヌクレオチド、又は少なくとも２０ヌクレオチド、又は少なくとも２１ヌクレオチド、又は少なくとも２２ヌクレオチド、又は少なくとも２３ヌクレオチド、又は少なくとも２４ヌクレオチド、又は少なくとも２５ヌクレオチド、又は少なくとも２６ヌクレオチド、又は少なくとも２７ヌクレオチド、又は少なくとも２８ヌクレオチド、又は少なくとも２９ヌクレオチド、又は少なくとも３０ヌクレオチド、又は少なくとも３１ヌクレオチド、又は少なくとも３２ヌクレオチド、又は少なくとも３３ヌクレオチド、又は少なくとも３４ヌクレオチド、又は少なくとも３５ヌクレオチド、又は少なくとも約４０ヌクレオチド、又は少なくとも約４５ヌクレオチド、又は少なくとも約５０ヌクレオチド、又は少なくとも約５５ヌクレオチド、又は少なくとも約６０ヌクレオチド、又は少なくとも約６５ヌクレオチド、又は少なくとも約７０ヌクレオチド、又は少なくとも約７５ヌクレオチド、又は少なくとも約８０ヌクレオチド、又は少なくとも約８５ヌクレオチド、又は少なくとも約９０ヌクレオチド、又は少なくとも約９５ヌクレオチド、又は少なくとも約１００ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、プローブポリヌクレオチドは、約５ヌクレオチドの長さ〜約１００塩基の長さである。種々の実施形態では、プローブポリヌクレオチドは、適切な条件下、ハイブリダイゼーションを許可するために、標的ポリヌクレオチド領域に対して十分に相補的であるＤＮＡ配列の、少なくとも５ヌクレオチド、又は少なくとも６ヌクレオチド、又は少なくとも７ヌクレオチド、又は少なくとも８ヌクレオチド、又は少なくとも９ヌクレオチド、又は少なくとも１０ヌクレオチド、又は少なくとも１１ヌクレオチド、又は少なくとも１２ヌクレオチド、又は少なくとも１３ヌクレオチド、又は少なくとも１４ヌクレオチド、又は少なくとも１５ヌクレオチド、又は少なくとも１６ヌクレオチド、又は少なくとも１７ヌクレオチド、又は少なくとも１８ヌクレオチド、又は少なくとも１９ヌクレオチド、又は少なくとも２０ヌクレオチド、又は少なくとも２１ヌクレオチド、又は少なくとも２２ヌクレオチド、又は少なくとも２３ヌクレオチド、又は少なくとも２４ヌクレオチド、又は少なくとも２５ヌクレオチド、又は少なくとも２６ヌクレオチド、又は少なくとも２７ヌクレオチド、又は少なくとも２８ヌクレオチド、又は少なくとも２９ヌクレオチド、又は少なくとも３０ヌクレオチド、又は少なくとも３１ヌクレオチド、又は少なくとも３２ヌクレオチド、又は少なくとも３３ヌクレオチド、又は少なくとも３４ヌクレオチド、又は少なくとも３５ヌクレオチド、又は少なくとも３６ヌクレオチド、又は少なくとも３７ヌクレオチド、又は少なくとも３８ヌクレオチド、又は少なくとも３９ヌクレオチド、又は少なくとも４０ヌクレオチド、又は少なくとも４１ヌクレオチド、又は少なくとも４２ヌクレオチド、又は少なくとも４３ヌクレオチド、又は少なくとも４４ヌクレオチド、又は少なくとも４５ヌクレオチド、又は少なくとも約５０ヌクレオチド、又は少なくとも約５５ヌクレオチド、又は少なくとも約６０ヌクレオチド、又は少なくとも約６５ヌクレオチド、又は少なくとも約７０ヌクレオチド、又は少なくとも約７５ヌクレオチド、又は少なくとも約８０ヌクレオチド、又は少なくとも約８５ヌクレオチド、又は少なくとも約９０ヌクレオチド、又は少なくとも約９５ヌクレオチド、又は少なくとも約１００ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ブロッカーポリヌクレオチドは、約５ヌクレオチドの長さ〜約１００塩基の長さである。種々の態様では、ブロッカーポリヌクレオチドは、適切な条件下、ハイブリダイゼーションを許可するために、標的ポリヌクレオチド領域に十分に相補的であるポリヌクレオチド配列の、少なくとも５ヌクレオチド、又は少なくとも６ヌクレオチド、又は少なくとも７ヌクレオチド、又は少なくとも８ヌクレオチド、又は少なくとも９ヌクレオチド、又は少なくとも１０ヌクレオチド、又は少なくとも１１ヌクレオチド、又は少なくとも１２ヌクレオチド、又は少なくとも１３ヌクレオチド、又は少なくとも１４ヌクレオチド、又は少なくとも１５ヌクレオチド、又は少なくとも１６ヌクレオチド、又は少なくとも１７ヌクレオチド、又は少なくとも１８ヌクレオチド、又は少なくとも１９ヌクレオチド、又は少なくとも２０ヌクレオチド、又は少なくとも２１ヌクレオチド、又は少なくとも２２ヌクレオチド、又は少なくとも２３ヌクレオチド、又は少なくとも２４ヌクレオチド、又は少なくとも２５ヌクレオチド、又は少なくとも２６ヌクレオチド、又は少なくとも２７ヌクレオチド、又は少なくとも２８ヌクレオチド、又は少なくとも２９ヌクレオチド、又は少なくとも３０ヌクレオチド、又は少なくとも３１ヌクレオチド、又は少なくとも３２ヌクレオチド、又は少なくとも３３ヌクレオチド、又は少なくとも３４ヌクレオチド、又は少なくとも３５ヌクレオチド、又は少なくとも３６ヌクレオチド、又は少なくとも３７ヌクレオチド、又は少なくとも３８ヌクレオチド、又は少なくとも３９ヌクレオチド、又は少なくとも４０ヌクレオチド、又は少なくとも約４５ヌクレオチド、又は少なくとも約５０ヌクレオチド、又は少なくとも約５５ヌクレオチド、又は少なくとも約６０ヌクレオチド、又は少なくとも約６５ヌクレオチド、又は少なくとも約７０ヌクレオチド、又は少なくとも約７５ヌクレオチド、又は少なくとも約８０ヌクレオチド、又は少なくとも約８５ヌクレオチド、又は少なくとも約９０ヌクレオチド、又は少なくとも約９５ヌクレオチド、又は少なくとも約１００ヌクレオチドを含む。種々の実施形態では、ブロッカーポリヌクレオチドは、その５’末端にヌクレオチドとして修飾核酸を更に含む。種々の実施形態では、修飾核酸は、ロックド核酸である。いくつかの実施形態では、ブロッカーポリヌクレオチドは、ポリメラーゼによる伸張を防止するために、３’末端にブロッキング基を更に含む。
いくつかの実施形態では、逆方向プライマーポリヌクレオチドは、約５ヌクレオチドの長さ〜約１００塩基の長さである。種々の態様では、逆方向プライマーポリヌクレオチドは、適切な条件下、ハイブリダイゼーションを許可するために、ポリメラーゼ伸張した第１のポリヌクレオチドの領域に十分に相補的であるポリヌクレオチド配列の少なくとも５ヌクレオチド、又は少なくとも６ヌクレオチド、又は少なくとも７ヌクレオチド、又は少なくとも８ヌクレオチド、又は少なくとも９ヌクレオチド、又は少なくとも１０ヌクレオチド、又は少なくとも１１ヌクレオチド、又は少なくとも１２ヌクレオチド、又は少なくとも１３ヌクレオチド、又は少なくとも１４ヌクレオチド、又は少なくとも１５ヌクレオチド、又は少なくとも１６ヌクレオチド、又は少なくとも１７ヌクレオチド、又は少なくとも１８ヌクレオチド、又は少なくとも１９ヌクレオチド、又は少なくとも２０ヌクレオチド、又は少なくとも２１ヌクレオチド、又は少なくとも２２ヌクレオチド、又は少なくとも２３ヌクレオチド、又は少なくとも２４ヌクレオチド、又は少なくとも２５ヌクレオチド、又は少なくとも２６ヌクレオチド、又は少なくとも２７ヌクレオチド、又は少なくとも２８ヌクレオチド、又は少なくとも２９ヌクレオチド、又は少なくとも３０ヌクレオチド、又は少なくとも３１ヌクレオチド、又は少なくとも３２ヌクレオチド、又は少なくとも３３ヌクレオチド、又は少なくとも３４ヌクレオチド、又は少なくとも３５ヌクレオチド、又は少なくとも３６ヌクレオチド、又は少なくとも３７ヌクレオチド、又は少なくとも３８ヌクレオチド、又は少なくとも３９ヌクレオチド、又は少なくとも４０ヌクレオチド、又は少なくとも約４５ヌクレオチド、又は少なくとも約５０ヌクレオチド、又は少なくとも約５５ヌクレオチド、又は少なくとも約６０ヌクレオチド、又は少なくとも約６５ヌクレオチド、又は少なくとも約７０ヌクレオチド、又は少なくとも約７５ヌクレオチド、又は少なくとも約８０ヌクレオチド、又は少なくとも約８５ヌクレオチド、又は少なくとも約９０ヌクレオチド、又は少なくとも約９５ヌクレオチド、又は少なくとも約１００ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドが二重鎖ポリヌクレオチドである場合、逆方向プライマーは、標的ポリヌクレオチドの相補鎖に対して相補的である。いくつかの実施形態では、本明細書で定義したように、逆方向プライマーは、第１及び第２のポリヌクレオチドの組み合わせである。
Ｖ．ポリヌクレオチド塩基構造
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、ＰＮＡ、又はそれらの組み合わせで構成される。他の実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、ＰＮＡ、又はそれらの組み合わせで構成される。
ＶＩ．ポリヌクレオチド構造−ブロッキング基
ポリヌクレオチドの３’領域からのポリメラーゼ伸張が不必要な場合、ブロッキング基が必要に応じて組み込まれる。例えば、別の態様では、第２ポリヌクレオチドの第２のドメインが、核酸を合成可能である酵素による伸張を抑制するために、第２のドメインの３’末端に、ブロッキング基を更に含む。追加的態様では、ユニバーサルクエンチャーは、その３’末端にブロッキング基を含む。他の態様では、ブロッカーポリヌクレオチドは、その３’末端にブロッキング基を含む。ブロッキング基は、限定されるものではないが、３’リン酸塩基、３’アミノ基、ジデオキシヌクレオチド、６個の炭素のグリコールスペーサー（及び１つの態様では、６個の炭素のグリコールスペーサーはヘキサンジオールである）及び逆位デオキシチミジン（ｄＴ）を含む方法の実行で有用である。
ＶＩＩ．ポリヌクレオチド構造−相補性
いくつかの実施形態では、第２ポリヌクレオチドの第２のドメインは、第１のポリヌクレオチドの第２のドメインに対して少なくとも約７０％相補的である。関連する態様では、第２のポリヌクレオチドの第２のドメインは、第１のポリヌクレオチドの第２のドメインに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は約１００％相補的である。
１つの態様では、第３のポリヌクレオチドの第２のドメインは、第４のポリヌクレオチドの第２のドメインに対して、少なくとも約７０％相補的である。関連する態様では、第３のポリヌクレオチドの第２のドメインは、第４のポリヌクレオチドの第２のドメインに対して、少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は約１００％相補的である。
別の態様では、ブロッカーポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド内の配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は約１００％相補的であり、更に別の態様では、プローブポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド内の配列に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は約１００％相補的である。
ＶＩＩＩ．ハイブリダイゼーション条件
いくつかの実施形態では、第１及び第２のポリヌクレオチドは、鋳型ポリヌクレオチドの不在下、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、第１及び第２のポリヌクレオチドは、鋳型ポリヌクレオチドの不在下、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない。本明細書で使用する、「ストリンジェントな条件」とは、技術分野における当業者によって経験的に決定され得、例えば、プライマーの長さ、プライマーの相補性、プライマーの濃度、ハイブリダイゼーション緩衝液中の塩濃度（すなわち、イオン強度）、ハイブリダイゼーションが実行される温度、ハイブリダイゼーションが実行される時間の長さ、並びにポリヌクレオチドの表面電荷に影響を及ぼす因子の存在に基づいて変化するであろう。一般的に、ストリンジェントな条件は、ポリヌクレオチドがその相補的配列に、標的上のいずれか他の領域に相対してより高い親和性で、優先的に結合することが可能な条件である。２０塩基を有するポリヌクレオチドのその相補体に対するハイブリダイゼーションのための代表的なストリンジェントな条件としては、限定するものではないが、約５０％のＧ＋Ｃ含量、５０ｍＭの塩（Ｎａ＋）、及び６０℃のアニーリング温度が挙げられる。より長い配列に関しては、より高温において特異的なハイブリダイゼーションが達成される。一般的に、ストリンジェントな条件は、ポリヌクレオチドの融解温度より約５℃低い温度でアニーリングが行われるような条件である。「融解温度」は、標的ポリヌクレオチドに対して相補的であるポリヌクレオチドの５０％が、一定のイオン強度、ｐＨ及びポリヌクレオチド濃度において平衡にあるような温度である。
ＩＸ．使用方法
Ａ．ＰＣＲ
本明細書で記載された標的ポリヌクレオチド増幅法では、第３のポリヌクレオチド及び第４のポリヌクレオチドが、上記のポリヌクレオチドの組み合わせと併用されて用いられると考えられ、第３のポリヌクレオチドは、第１の標的相補体ポリヌクレオチド領域における標的ポリヌクレオチドの相補鎖に対して相補的（第１のポリヌクレオチドの第１のドメインが相補的である鎖に関して）である第１のドメイン［Ｐａ］と、特徴的なポリヌクレオチドを含む第２のドメイン［Ｆｂ］とを含み、第４のポリヌクレオチドは、第２の相補体標的ポリヌクレオチド領域における、標的ポリヌクレオチドの相補体鎖に相補的である（第２のポリヌクレオチドが相補的である鎖に関して）第１のドメイン［Ｆｂ］と、第３のポリヌクレオチドの第２のドメインと第４のポリヌクレオチドの第２のドメインが、適切な条件下でハイブリダイズするために、第３のポリヌクレオチドの第２のドメインに対して十分に相補的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン［Ｆｄ］とを含む。これらの態様のいくつかでは、方法は、標的ポリヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドの相補体を、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドと第３のポリヌクレオチドと第４のポリヌクレオチドとに接触させることを更に含み、これは、第１の標的ポリヌクレオチド領域に対する第１ポリヌクレオチドの第１のドメインの標的ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションと、標的ポリヌクレオチドの第２標的ポリヌクレオチド領域に対する第２ポリヌクレオチドの第１のドメインのハイブリダイゼーションと、標的ポリヌクレオチドの相補鎖の第１の標的ドメインに対する第３のポリヌクレオチドの第１のドメインのハイブリダイゼーションと、第２の相補体標的ポリヌクレオチド領域に対する第４のポリヌクレオチドの第１のドメインのハイブリダイゼーションを許可するために十分な条件下で行われ、並びに方法は、第１のポリヌクレオチドと第３のポリヌクレオチドの伸張を許可する条件下で、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、第１及び第４のポリヌクレオチドの第１のドメイン（すなわち、プライミングドメイン）を伸張させることを含む。
いくつかの態様では、本明細書で上述されたようなブロッキング基が、第２のポリヌクレオチド及び／又は第４のポリヌクレオチドに、その３’末端で取り付けられて、これが、核酸を合成可能である酵素による伸張を遮断する。方法の実行で有用なブロッキング基としては、限定するものではないが、３’リン酸塩基、３’アミノ基、ジデオキシヌクレオチド、及び逆位デオキシチミジン（ｄＴ）が挙げられる。
種々の実施形態では、標的ポリヌクレオチド、標的ポリヌクレオチドの相補体、又はその双方共に、第２のポリヌクレオチドの第１のドメイン及び／又は第４のポリヌクレオチドの第１のドメインの標的ポリヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションによって変性される二次構造を有する。
１つの実施形態では、ポリヌクレオチドの組み合わせは、図７ａ〜ｆ（スキーム４〜９）で示されたように、ＰＣＲで用いるよう意図されている。スキーム４では、プライマーＡ（すなわち、本明細書で記載されたように、第１のポリヌクレオチド）及びＢ（すなわち、本明細書で記載されたように、第３のポリヌクレオチド）が、標的ポリヌクレオチドの反対鎖上で用いられ、これがＷ−（Ｗａｔｓｏｎ）及びＣ−（Ｃｒｉｃｋ）鎖として示されている。図７ｆ（スキーム９）で示されたように、ステップ１２では、標的ポリヌクレオチドの増幅のために、プライマーＡとプライマーＢのみが必要とされる。
本発明のポリヌクレオチドの組み合わせが、所与のＰＣＲアンプリコンの一端または両端のいずれかをプライミングするために用いられ得ることを当業者は理解されるであろう。本明細書で使用する、「アンプリコン」は、増幅技術を用いて合成されたポリヌクレオチドの一部分を意味すると考えられる。本明細書で記載したように、少なくとも１つのプライマーがポリヌクレオチドの組み合わせであるならば、少なくとも１つ以上のポリヌクレオチドの組み合わせを含む本発明の任意の方法が、標準プライマーとポリヌクレオチドの組み合わせの任意の組み合わせを用いる可能性があると考えられる。
Ｂ．単一第２鎖合成
別の実施形態では、第１及び第２のポリヌクレオチドを用いての標的ポリヌクレオチドの増幅の方法が提供され、本方法は、第１のポリヌクレオチドの第１のドメインの標的ポリヌクレオチドの第１の標的ポリヌクレオチド領域に対するハイブリダイゼーション、並びに第２のポリヌクレオチドの第１のドメインの標的ポリヌクレオチドの第２の標的ポリヌクレオチド領域に対するハイブリダイゼーションを許可するのに十分な条件下で、標的ポリヌクレオチドを、本明細書で開示された第１及び第２のポリヌクレオチドに接触させるステップと、第１のポリヌクレオチドの第１のドメインの伸張を許可するような条件下で、第１のポリヌクレオチドの第１のドメイン（すなわち、プライミングドメイン）をＤＮＡポリメラーゼによって伸張させること、とを含む。いくつかの態様では、第１のポリヌクレオチド（それから伸張された関連するポリヌクレオチド生成物を備えた）及び第２のポリヌクレオチドが、次いで標的ポリヌクレオチドから変性されて、第１及び第２のポリヌクレオチドの別のセットが、標的ポリヌクレオチドに対してハイブリダイズすることが許可される。
１つの態様では、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドに順番にハイブリダイズする。別の態様では、第２のポリヌクレオチドの第１のドメインが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする前に、第１のポリヌクレオチドの第１のドメインが標的にハイブリダイズする。更に別の態様では、第１のポリヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする前に、第２のポリヌクレオチドの第１のドメインが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする。別の態様では、第１のポリヌクレオチドの第１のドメインと第２のポリヌクレオチドの第１のドメインが、同時発生的に標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする。
種々の実施形態では、標的ポリヌクレオチドとしては、限定されるものではないが、染色体ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、合成ポリヌクレオチド、単鎖ポリヌクレオチド、又は二重鎖ポリヌクレオチドが挙げられる。１つの態様では、標的が二重鎖ポリヌクレオチドであり、第１のポリヌクレオチドの第１のドメインと第２のポリヌクレオチドの第１のドメインが、二重鎖標的ポリヌクレオチドの同一の鎖にハイブリダイズする。別の態様では、第１のポリヌクレオチドの第２のドメインと第２のポリヌクレオチドの第２のドメインが、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションに先立って、標的ポリヌクレオチドに対してハイブリダイズする。
１つの実施形態では、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドが、同時発生的に標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、並びに第３のポリヌクレオチドと第４のポリヌクレオチドが、同時発生的に標的ポリヌクレオチドの相補体に対してハイブリダイズし、第３のポリヌクレオチドと第４のポリヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドの相補体に対してハイブリダイズするのと同時に、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドに対してハイブリダイズしている。
別の実施形態では、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、第３のポリヌクレオチド及び第４のポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドの相補体に同時にはハイブリダイズしない。
更に別の実施形態では、第１のポリヌクレオチドの第２のドメインと第２のポリヌクレオチドの第２のドメインが、標的ポリヌクレオチドに対してハイブリダイズするのに先立ってハイブリダイズする。別の実施形態では、第３のポリヌクレオチドの第２のドメインと第４のポリヌクレオチドの第２のドメインが、標的ポリヌクレオチドに対してハイブリダイズするのに先立ってハイブリダイズする。
１つの実施形態では、第１ポリヌクレオチドの第２のドメインと第２ポリヌクレオチドの第２のドメインが、標的ポリヌクレオチドに対してハイブリダイズするのに先立ってハイブリダイズし、並びに第３のポリヌクレオチドの第２のドメインと第４のポリヌクレオチドの第２のドメインが、標的ポリヌクレオチドの相補体に対してハイブリダイズするのに先立ってハイブリダイズする。
別の実施形態では、標的ポリヌクレオチドが、第１のポリヌクレオチドの第１のドメインが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする領域において突然変異を含有する。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドの第１のドメインが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする領域に対して完全に相補的である。いくつかの実施形態では、非標的ポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドの第１のドメインが非標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする領域では完全に相補的ではない。別の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、第３のポリヌクレオチドの第１の領域が標的ポリヌクレオチドに対してハイブリダイズする領域で突然変異を含有する。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドの第３のドメインが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする領域では、完全に相補的である。いくつかの実施形態では、非標的ポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドの第３のドメインが非標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする領域で、完全に相補的ではない。いくつかの態様では、突然変異は不安定化突然変異である。関連する態様では、不安定化突然変異は、第１のポリヌクレオチドの伸張、又は第３のポリヌクレオチドの伸張、若しくは双方共の伸張を抑制する。
Ｃ．多重性
１つの実施形態では、核酸を合成可能である酵素による伸張は、第１のポリヌクレオチドの第１のドメインが標的ポリヌクレオチド内の１つ以上の領域に対してハイブリダイズする性質を有するような多重伸張である。関連する実施形態では、核酸を合成可能である酵素による伸張は、第３のポリヌクレオチドの第１のドメインが標的ポリヌクレオチド内の１つ以上の座に対してハイブリダイズする性質を有するような多重伸張である。
関連する実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチド生成物を増幅させるために、少なくとも２つのプライマーを用いて、多重ＰＣＲが行われる。これら実施形態のいくつかの態様では、多重ＰＣＲのために用いられるそれぞれのポリヌクレオチドプライマーは、本明細書に記載されたようなポリヌクレオチドの組み合わせである。他の態様では、多重ＰＣＲのために用いられる少なくとも１つのポリヌクレオチドプライマーが、本明細書で記載されたようなポリヌクレオチドの組み合わせである。
別の実施形態では、ゲノム反復配列に対して向けられている複数のフィクサーポリヌクレオチドを用いて、多重ＰＣＲが実行される。別の実施形態では、フィクサーポリヌクレオチドは、ランダム配列で構成されている。これらの態様のいくつかでは、複数のフィクサーポリヌクレオチドは、約１０のポリヌクレオチド配列を指している。他の態様では、複数のフィクサーポリヌクレオチドは、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、約９５０、約１０００又はそれ以上のポリヌクレオチド配列を指している。これらフィクサーポリヌクレオチド配列は、多数のプライマーポリヌクレオチドが次いで結合し得るようなゲノム内で多数の「固定された」位置を提供し、本明細書に記載したように、プライマーとフィクサーポリヌクレオチドの双方で存在する特徴的な相補的ポリヌクレオチド配列を活用する。
Ｄ．リアルタイムＰＣＲ
標準的三方向接合を備えたプライマーの組み合わせが、リアルタイムＰＣＲのために有用である。希な転写物の解析及び定量化、病原体の検出、突然変異を備える希な癌細胞の診断、又は癌患者における異常な遺伝子メチル化の低レベルは、改善されたリアルタイムＰＣＲアッセイによって解決し得る問題であり、この改善されたリアルタイムＰＣＲアッセイは、高感度及び標的増幅の特異性、標的検出の高特異性、正常なＤＮＡの数千ものコピーの存在下での少数の癌特異的突然変異対立遺伝子又は異常にメチル化したプロモーターを選択的に増幅かつ検出する能力、低コピー数ＲＮＡ転写物の解析及び定量化、現行のリアルタイム熱サイクラーの能力を最大限に利用するための１つのアッセイで４〜５の異なる標的を多重化させる能力である蛍光追跡を併せ持つ。蛍光体が、プライマーポリヌクレオチドの５’末端に配置され、並びにクエンチャーが、フィクサーポリヌクレオチドの３’末端に配置される。この配置では、プライマーとフィクサーポリヌクレオチドがハイブリダイズした場合に、蛍光は検出されない（蛍光体がクエンチャーに隣接して配置されているため）。しかしながら、ＰＣＲ中のプライマーポリヌクレオチドの伸張に続いて、ＰＣＲの変性段階中に、プライマーポリヌクレオチドとフィクサーポリヌクレオチドが離れるようになり、これによって蛍光体とクエンチャーとの間の距離が作り出されて、検出可能な蛍光信号が得られる。
四方向接合を備えたプライマーの組み合わせもまた、リアルタイムＰＣＲのために用いられ得る。プライマーポリヌクレオチドが、その５’末端で蛍光体に標識されて、並びにステープルが、その３’末端でクエンチャーに標識される。フィクサーポリヌクレオチドは非ラベルである。プライマーとフィクサーポリヌクレオチドの双方の第２のドメインは特徴的であるために、ステープルポリヌクレオチドは、「ユニバーサル」ポリヌクレオチドとして使用され得る（図１０；スキーム１０）。
二方向接合とプローブポリヌクレオチドを備えたプライマーの組み合わせもまた、リアルタイムＰＣＲのために用いられ得る。プローブポリヌクレオチドが、その５’末端が蛍光体で標識され、クエンチャーでその３’末端が標識され、並びにいくつかの実施形態では、追加の内部クエンチャーに標識される。第１のポリヌクレオチドが、Ｔａｑポリメラーゼのような５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性を備えたポリメラーゼによって伸張される場合、標識が開裂されて、それ以上消光されることがなくなり、結果的に標識からの信号が増大する。いくつかの実施形態では、プローブポリヌクレオチドは、分子標識プローブである。要するに、分子標識プローブは、それらが相補的であり、標的ポリヌクレオチドの不在下で、ヘアピン構造を形成するような、その５’末端と３’末端に塩基を備えた核酸配列で構成される。分子標識プローブは更に、標的ポリヌクレオチドが存在しない場合に、標識からの検出可能な信号がないように、その３’末端（又は５’末端）にクエンチャーを含み、その５’末端（又は３’末端）に蛍光体を含む。分子標識プローブは更に、標的の存在下で、標的ポリヌクレオチドに対するプローブのハイブリダイゼーションが、ヘアピン構造の分離とクエンチングの損失を引き起こすように、標的ポリヌクレオチドに相補的である配列を含む。
二方向接合とブロッカーポリヌクレオチドを備えたプライマーの組み合わせもまた、リアルタイムＰＣＲのために用いられ得る。プライマーポリヌクレオチド（すなわち「第１のポリヌクレオチド」）が、その５’末端において蛍光体で標識され、並びにフィクサーポリヌクレオチド（すなわち、「第２のポリヌクレオチド」）が、その３’末端においてクエンチャーで標識される。ブロッカーポリヌクレオチドは、第１の標的ポリヌクレオチドの５’領域の直近に位置する標的ポリヌクレオチド領域に対して相補的である（図４に図示）。いくつかの実施形態では、ブロッカーポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドの第１のドメインに重複する。言い換えれば、第１のポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドとブロッカーポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの同一のヌクレオチドに対して相補的であろう。関連する実施形態では、第１のポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドと、ブロッカーポリヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドは異なる。これら実施形態では、適切な位置において、第１のポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドに対して相補的である場合、第１のポリヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドに対してハイブリダイズするであろうし、これによって、適切な条件下での第１のポリヌクレオチドの伸張が許可される(図４ａ参照)。ＰＣＲ中のプライマーポリヌクレオチドの伸張に続いて、ＰＣＲの変性段階中に、プライマーポリヌクレオチドとフィクサーポリヌクレオチドとが離れ離れになり、これによって、蛍光体とクエンチャーとの間の距離が作り出されて、結果的に検出可能な蛍光信号を得る。関連する実施形態では、ブロッカーポリヌクレオチドの５’末端におけるヌクレオチドが、それが適切な位置において非標的ポリヌクレオチドに対して相補的である場合、非標的ポリヌクレオチドに対してハイブリダイズするであろうし、これによって、第１のポリヌクレオチドの伸張が遮断される（図４ｂ参照）。この配置では、プライマーとフィクサーポリヌクレオチドがハイブリダイズする場合、蛍光は全く検出されない（蛍光体がクエンチャーに隣接して配置されているため）。種々の実施形態では、ブロッカーポリヌクレオチドの３’末端におけるヌクレオチドは、ポリメラーゼによる伸張を抑制するように修飾されている。このシステムは、例えば、単一ヌクレオチド多形型のより高感度かつ高特異度での検出を可能にする。
二方向接合、ブロッカーポリヌクレオチド、並びにプローブポリヌクレオチドを備えたプライマーの組み合わせもまた、リアルタイムＰＣＲのための組み合わせで用いられ得る。関連する実施形態では、この組み合わせで用いられる第１のポリヌクレオチドは、その３’末端でのヌクレオチドのような修飾核酸を含み、ブロッカーポリヌクレオチドは、その５’末端でのヌクレオチドのような修飾核酸を含む。このシステムは、例えば、ヌクレオチド多形型のより高感度かつ高特異度での検出を可能にする。
いくつかの実施形態では、上記実施形態は、逆方向プライマーを更に含む。逆方向プライマーは、第１のポリヌクレオチドの伸張によって作り出されたポリヌクレオチド内の領域に対して相補的である。図８を参照されたい。これから明らかなように、いくつかの実施形態では、逆方向プライマーは、標的ポリヌクレオチドが二重鎖ポリヌクレオチドの１本の鎖である場合、標的ポリヌクレオチドの相補鎖に対してもまた相補的である。逆方向プライマーの含有は、標的ポリヌクレオチドの増幅を可能にする。種々の態様では、逆方向プライマーの配列が、プライマーの全長にわたって標的配列に対してハイブリダイズするために、その全長にわたって十分に相補的であるようにデザインされる場合、逆方向プライマーは、「単純な」プライマーである。１つの態様におけるこのタイプの単純なプライマーは、標的配列に対して１００％相補的であるが、特定の環境及び条件下では、１００％未満の相補性を備えた単純なプライマーが有用であることを理解されたい。
他の態様では、逆方向プライマーは、第１の反応で用いられたプライマー対の組み合わせ内の第１のポリヌクレオチドの第１のドメインからのポリヌクレオチドの伸張によって産生された配列の領域に対して、特異的に結合するような分離ポリヌクレオチドプライマーである。
種々の態様では、本明細書に記載された方法は、標的ポリヌクレオチドを備えるサンプルからの配列検出に比べて、非標的ポリヌクレオチドを備えたサンプルからの配列検出において変化を提供する。いくつかの態様では、この変化は、非標的ポリヌクレオチドを備えるサンプルからの配列検出に比べて、標的ポリヌクレオチドを備えるサンプルの検出においての増加である。いくつかの態様では、この変化は、非標的ポリヌクレオチドを備えるサンプルからの配列検出に比べて、標的ポリヌクレオチドを備えるサンプルの検出においての減少である。
本明細書に記載したポリヌクレオチドの増大した特異度のために、ＴａｑＭａｎ、分子標識プローブ又はＳｃｏｒｐｉｏｎプライマーを用いて達成される特異度と同等であるが、著しくコストが低減された特異度を達成するために、リアルタイムＰＣＲがＳＹＢＲ緑色染料の存在下で実行され得る。
１つの実施形態では、その５’末端に蛍光分子によって標識されたプライマーポリヌクレオチド（すなわち、「第１のポリヌクレオチド」）と、その３’末端にクエンチャーによって標識された第２のクエンチングポリヌクレオチド（すなわち、「ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチド」）との双方が、ＤＮＡポリメラーゼからの伸張を抑制するために、その３’末端にブロッキング基を含むフィクサーポリヌクレオチド（すなわち、「第２のポリヌクレオチド」）の第２のドメインに対してハイブリダイズされる。この複合体は、この状態では蛍光を有しないが、複合体が、それに続くＤＮＡポリメラーゼによるプライマーポリヌクレオチドの伸張で置き換えられる（変性される）際に、蛍光を発するであろう。
別の実施形態では、その５’末端に蛍光体を含むプライマーポリヌクレオチド（すなわち、「第１のポリヌクレオチド」）が、その３’末端にクエンチャーを含むフィクサーポリヌクレオチド（すなわち、「第２のポリヌクレオチド」）に対してハイブリダイズされている。ハイブリダイズされる際に、複合体は蛍光を有しないが、それに続くＤＮＡポリメラーゼによるプライマーポリヌクレオチドの伸張で置き換えられる（変性される）際に、蛍光を発するであろう。方法の別の態様では、ポリヌクレオチドの２つのセットを用いて、多重リアルタイムＰＣＲが実行され、この中で、それぞれのプライマーセットのうちの１つのポリヌクレオチドが、蛍光体で標識されていて、並びに２つの蛍光体は互いに識別可能である。
別の実施形態では、プライマーポリヌクレオチド（すなわち、「第１のポリヌクレオチド」）は、蛍光体、その３’末端上のクエンチャーを含み、これら２つの標識は、ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチド（すなわち、「プローブポリヌクレオチド」）の伸張部によって分離されている（図９参照）。いくつかの態様では、プローブポリヌクレオチドは、内部Ｚｅｎクエンチャーを更に含む。いくつかの態様では、熱安定性ＲＮアーゼＨによるＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの生成及び分解の際、並びに遊離蛍光体（又はクエンチャー）の溶液への放出の際に、蛍光信号は発生される。
図９Ａは、非特異的ＲＮＡリンカーを備えた、蛍光体−クエンチャーで標識された第１のポリヌクレオチド（プライマーＡ）と、典型的な第２のポリヌクレオチド（フィクサーＡ）を示している。特定の実施形態では、第１のポリヌクレオチド（Ｐ）は、５’側の標識、続いてＲＮＡ配列、続いてクエンチャー、それに続いて本明細書に記載された第１ポリヌクレオチド（Ｐ）の典型的な配列を含む。他の実施形態では、第１のポリヌクレオチド（Ｐ）は、５’側のクエンチャー、続いてＲＮＡ配列、続いて標識、続いて本明細書に記載された第１のポリヌクレオチド（Ｐ）の典型的な配列を含む。図９Ｂは、図９Ａで示された組み合わせのＰＣＲにおける使用を図示している。Ｐと反対の鎖が発生された場合、ＲＮアーゼＨによるＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの開裂が蛍光体（クエンチャー）を放出し、これによって蛍光信号が検出される。
図９Ｃは、部位特異的ＲＮＡ−ＤＮＡリンカーを備えた蛍光体−クエンチャーで標識された第１のポリヌクレオチド（プライマーＡ）と、典型的な第２のポリヌクレオチド（フィクサーＡ）を示している。特定の実施形態では、第１のポリヌクレオチド（Ｐ）は、５’側標識、続いてＰの下流の配列に対して相補的であるＲＮＡ配列、続いてクエンチャー、本明細書に記載された第１のポリヌクレオチド（Ｐ）の典型的な配列を含む。特定の実施形態では、第１のポリヌクレオチド（Ｐ）は、５’側のクエンチャー、続いてＰの下流の配列に対して相補的であるＲＮＡ配列、続いて標識、続いて本明細書に記載された第１のポリヌクレオチド（Ｐ）の典型的な配列を含む。図９Ｄは、図９Ｃで示された組み合わせのＰＣＲにおける使用を図示している。プライマーＡを含むＰＣＲ生成物が変性される場合、ＲＮＡ−ＤＮＡリンカーがプライマーＡの下流の領域にハイブリダイズし、ＲＮアーゼＨがＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを開裂し、蛍光体を放出し、並びに蛍光信号が検出される。
いくつかの実施形態では、リアルタイムＰＣＲアッセイにおける数個の突然変異の同時発生的多重検出のために、１つのフィクサーポリヌクレオチド（すなわち、「第２のポリヌクレオチド」）が、２、３、４、５つ又はそれ以上のプライマーポリヌクレオチド（すなわち、「第１のポリヌクレオチド」）の組み合わせの中で用いられてもよい。
別の実施形態では、例えば、添付文書、４つの蛍光標識されたユニバーサルポリヌクレオチド分子、その３’末端にクエンチャーを含むユニバーサルポリヌクレオチド分子、蛍光標識されたプライマーポリヌクレオチドの組立てのための適切な緩衝液を備えた及びＤＮＡリガーゼを含むキットが提供されている。キットは、必要に応じて、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ及び適切な緩衝液を更に含む。
キットは、ライゲーションを通してポリヌクレオチドを蛍光的に標識付けするために用いられる。１つの態様では、プライマーポリヌクレオチドが、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによってリン酸化されて、続いてフィクサーポリヌクレオチドにハイブリダイズされる。蛍光体をその５’末端に含む第３のポリヌクレオチド（すなわち、蛍光標識されたユニバーサルポリヌクレチド、上記参照）が、同様にフィクサーポリヌクレオチドにハイブリダイズされる。次いで、第３のポリヌクレオチドの３’末端が、プライマーポリヌクレオチドのリン酸化５’末端に連結されて、蛍光標識されたプライマーポリヌクレオチドが生成される。最後に、その３’末端にクエンチャーを含む万能ポリヌクレオチドが、フィクサーポリヌクレオチドにハイブリダイズされて、例えばリアルタイムＰＣＲアッセイで使用可能な状態である、蛍光を有しないポリヌクレオチド複合体が得られる。
Ｅ．プライマー伸張
本明細書で開示されたプライマー組成物は、プライマー伸張を必要とする又は使用するいかなる方法においても用いられ得る。例えば、プライマー伸張は、既知の遺伝子に関するＲＮＡ転写の開始部位を決定するために用いられ得る。本技術は、遺伝子の３’末端に近い領域に相補的である、本明細書に記載された標識付されたプライマーポリヌクレオチドの組み合わせ（一般的に長さ２０〜５０のヌクレオチド）を必要とする。ポリヌクレオチドの組み合わせは、ＲＮＡをアニーリングすることが可能であり、並びに相補体（ｃＤＮＡ）がＲＮＡの５’末端に到達するまで、相補体をＲＮＡに対して合成するために、逆転写酵素が用いられる。ポリアクリルアミドゲル上の生成物を分析することによって、開始部位から標識付されたプライマーまでの距離を表すゲル上の配列の長さとして、転写開始部位を決定することが可能である。
本明細書で記載した進歩したポリヌクレオチド技術は、ＲＮＡ内で遭遇する潜在的な二次構造を克服かつ解決するであろう。
Ｆ．等温ＤＮＡ増幅
等温ＤＮＡ増幅は、本明細書で記載された進歩したポリヌクレオチド技術を用いて、米国特許第７，５７９，１５３号明細書で教示されたように実行されてもよい。つまり、等温ＤＮＡ増幅は、以下の（ｉ）１つの末端にヘアピンを、他の末端にポリヌクレオチドを有し、ＲＮＡポリメラーゼによる合成が、ヘアピンの方向に進むプロモーター配列を識別するように配向されたプロモーター配列がそれらの間に配置された、二重鎖ＤＮＡを提供するステップと、（ｉｉ）二重鎖ＤＮＡを、プロモーター配列を識別するＲＮＡポリメラーゼで転写して、プロモーター配列のコピーとポリヌクレオチドとを含むＲＮＡ転写物を形成させるステップと、（ｉｉｉ）ＲＮＡ転写物から相補的ＤＮＡを生成させるステップと、（ｉｖ）ヘアピンが再構成されるように、相補的ＤＮＡからＲＮＡ転写物の５’末端を取り外すこと、並びに（ｖ）ヘアピンを伸張させて、再構成されたプロモーター配列、再構成されたプロモーター配列を識別するＲＮＡポリメラーゼ、並びに合成ＲＮＡ転写物を含有する二重鎖ＤＮＡを生成させるステップとを含む。好適な実施形態では、相補的ＤＮＡを生成するステップが、前記の相補的ＤＮＡ及び前記のＲＮＡ転写物のヘテロ二重鎖を形成することを含み、前記の取り外すステップが、ヘテロ二重鎖をヘリカーゼで置き換えることを含む。
Ｇ．蛍光インサイテュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
また本明細書で記載された進歩したポリヌクレオチド技術は、ＦＩＳＨを実行するためにも用いられ得る。ＦＩＳＨは、染色体上の特異的ＤＮＡの存在又は不在を検出かつ特定するために用いられる細胞遺伝学的手法である。ＦＩＳＨは、高度の配列同一性を示す染色体の部分にのみ結合するような蛍光プローブを用いる。蛍光プローブがどこで染色体に結合したかを見出すために、蛍光顕微鏡が用いられ得る。ＦＩＳＨは、遺伝子カウンセリング、医薬及び種属同定分野での用途のために、ＤＮＡ中の特異的特徴を見つけ出すために頻繁に用いられる。ＦＩＳＨは、組織サンプル内の特異的ｍＲＮＡを検出かつ特定するためにも用いられ得る。このように、細胞及び組織内の遺伝子発現の空間的−時間的パターンを限定することに役立つ。
Ｈ．ライゲーションプローブ
また、本明細書で記載された進歩したポリヌクレオチド技術は、ライゲーションプローブを用いる多重ＰＣＲを実行するために用いられ得る。ライゲーションプローブは、当該技術分野の当業者には既知である。簡単に言うと、ライゲーションプローブは、それぞれがＰＣＲプライマー配列を含有する、２つの分離したオリゴヌクレオチドで構成される。これら２つの半プローブが、共にそれらの隣接する標的にハイブリダイズする場合にのみ、それらはライゲーションされ得る。ライゲーションされたプローブのみが、ＰＣＲ中で指数関数的に増幅される。したがって、プローブライゲーション生成物の数は、サンプル内の標的配列の数に依存する。
いくつかの実施形態では、２つのライゲーションプローブは、約１〜５０ヌクレオチドによって分離されていて、ライゲーションに先立って、第１のプローブが、鎖置換活性を欠如しているＤＮＡ熱安定性ポリメラーゼによって伸張される。鎖置換活性を欠如しているＤＮＡ熱安定性ポリメラーゼとしては、限定されるものではないが、Ｐｆｕポリメラーゼが挙げられる。伸張された鎖が、第２のライゲーションプローブの５’−リン酸塩基に到達する際に、重合化が停止し、かつニックが作り出される。このニックは、反応混合物中に存在する熱安定性リガーゼによって封鎖され得、単一の反応形態で全反応が発生することを可能にする。
Ｉ．次世代配列決定（ＮＧＳ）
本発明のポリヌクレオチドの組み合わせは、ＮＧＳ用途においても用いられ得る。図１５に示したように、ＤＮＡプローブの順序的ライゲーションによる配列決定の代わりに、本明細書で開示されたプライマーの組み合わせが、ライゲーションなしの順序的なハイブリダイゼーションで用いられ得る。ＮＧＳ技法の概要に関しては、本明細書にその全体を参照による組み込まれた、Ｍｏｒｏｚｏｖａら著、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ９２（５）：２５５〜６４頁、２００８年を参照されたい。ＮＧＳは、当該技術分野の当業者には容易に理解されるであろうし、以下の実施例２に記載された１つの実施形態で例示されている。
Ｘ．酵素
いくつかの態様では、伸張が核酸を合成可能である酵素によって実行され、それがリアルタイムで定量される。本発明の実行において有用である酵素としては、限定されるものではないが、ＤＮＡポリメラーゼ（熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを挙げることができる）、ＲＮＡポリメラーゼ、及び逆転写酵素が挙げられる。本発明を実行するための用いられ得る酵素の非限定的な例としては、限定されるものではないが、Ｄｅｅｐ ＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＬｏｎｇＡｍｐ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ（登録商標）ＩＩ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｐｈｉｒｅ（登録商標） Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｃｒｉｍｓｏｎ ＬｏｎｇＡｍｐ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ ＥＸＴ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＬｏｎｇＡｍｐ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｗｉｔｈＳｔａｎｄａｒｄ Ｔａｑ（Ｍｇ−ｆｒｅｅ）Ｂｕｆｆｅｒ、Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｗｉｔｈ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ、Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｗｉｔｈ ＴｅｒｍｏＰｏｌ Ｂｕｆｆｅｒ、Ｃｒｉｍｓｏｎ Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｃｒｉｍｓｏｎ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｗｉｔｈ（Ｍｇ−ｆｒｅｅ）Ｂｕｆｆｅｒ、Ｐｈｉｒｅ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＶｅｎｔＲ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＶｅｎｔＲ（ｅｘｏ−） ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｐｈｉｒｅ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｈｅｍｏ ＫｌｅｎＴａｑ（登録商標）、Ｄｅｅｐ ＶｅｎｔＲ（ｅｘｏ−） ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｄｅｅｐ ＶｅｎｔＲ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ ＥＸＴ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｈｅｍｏ Ｋｌｅｎ Ｔａｑ，ＬｏｎｇＡｍｐ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＡＭＶ Ｆｉｒｓｔ Ａｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ、ＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ Ｍ−ＭｕｌＶ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ、Ｂｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｆｕｌｌ Ｌｅｎｇｔｈ，Ｂｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ，Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｗｉｔｈＴｈｅｒｍｏＰｏｌ Ｂｕｆｆｅｒ、９°Ｎｍ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｃｒｉｍｓｏｎ ＴａｑＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｃｒｉｍｓｏｎ ＴａｑＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｗｉｔｈ（Ｍｇ−ｆｒｅｅ）Ｂｕｆｆｅｒ、Ｄｅｅｐ ＶｅｎｔＲ（ｅｘｏ−） ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｄｅｅｐ ＶｅｎｔＲ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ ＥＸＴ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ ＩＩ Ｈｏｔ ＳｔａｒｔＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｈｅｍｏ ＫｌｅｎＴａｑ，Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ−ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＶ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（登録商標）γ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＩ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＩＩＩ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＶｅｎｔＲ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＶｅｎｔＲ（ｅｘｏ−） ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｂｓｕ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ、Ｌａｒｇｅ（Ｋｌｅｎｏｗ）Ｆｒａｇｍｅｎｔ，Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（３’→５’ｅｘｏ−），ｐｈｉ２９ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔ４ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔ７ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ）、Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ａｎｄ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌｙ（Ａ）Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｍ−ＭｕｌＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ｐひ６ ＲｎａＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＲｄＲＰ）、Ｐｏｌｙ（Ｕ）Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＳＰ６ＲＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ、及びＴ７ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅが挙げられる。
ＸＩ．標識いくつかの態様では、第１のポリヌクレオチドは標識を含む。他の態様では、本明細書に記載された方法で用いられる任意のポリヌクレオチドは、標識を含む。いくつかの態様では、標識は蛍光体である。蛍光分子でオリゴヌクレオチドを標識付し、蛍光を測定する方法は、当業者に周知である。本発明の実行のために有用な蛍光標識としては、限定されるものではないが、１，８−ＡＮＳ（１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸）、１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸（１、８−ＡＮＳ）、５−（及びー６）−カルボキシ−２’，７’−ジクロロフルオレセイン ｐＨ９．０、５−ＦＡＭ ｐＨ９．０、５−ＲＯＸ（５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、トリエチルアンモニウム塩）、５−ＲＯＸ ｐＨ７．０、５−ＴＡＭＲＡ、５−ＴＡＭＲＡ ｐＨ７．０、５−ＴＡＭＲＡ−ＭｅＯＨ、６ＪＯＥ、６，８−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン ｐＨ９．０、６−カルボキシローダミン ６Ｇ ｐＨ７．０、６−カルボキシローダミン ６Ｇ塩化物、６−ＨＥＸ，ＳＥ ｐＨ９．０、６−ＴＥＴ，ＳＥ ｐＨ９．０、７−アミノ−４−メチルクマリン ｐＨ７．０、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン ｐＨ９．０、Ａｌｅｘａ ３５０、Ａｌｅｘａ ４０５、Ａｌｅｘａ ４３０、Ａｌｅｘａ ４８８、Ａｌｅｘａ ５３２、Ａｌｅｘａ ５４６、Ａｌｅｘａ ５５５、Ａｌｅｘａ ５６８、Ａｌｅｘａ ５９４、Ａｌｅｘａ ６４７、Ａｌｅｘａ ６６０、Ａｌｅｘａ ６８０、Ａｌｅｘａ ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｒ ４３０抗体複合体 ｐＨ７．２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗体複合体 ｐＨ８．０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヒドラジド−水、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２抗体複合体 ｐＨ７．２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５抗体複合体 ｐＨ７．２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８抗体複合体 ｐＨ７．２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６１０ Ｒ−フィコエリスリン ストレプトアビジン ｐＨ７．２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０抗体複合体 ｐＨ７．２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０抗体複合体 ｐＨ７．２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００抗体複合体 ｐＨ７．２、アロフィコシアニン ｐＨ７．５、ＡＭＣＡ複合体、アミノクマリン、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）、Ａｔｔｏ ６４７、ＢＣＥＣＦ ｐＨ５．５、ＢＣＥＣＦ ｐＨ９．０、ＢＦＰ（青色蛍光タンパク質）、ＢＯ−ＰＲＯ−１−ＤＮＡ、ＢＯ−ＰＲＰ−３−ＤＮＡ、ＢＯＢＯ−１−ＤＮＡ、ＢＯＢＯ−３−ＤＮＡ、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５−Ｘ，ＭｅＯＨ，ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ複合体、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ，ＭｅＯＨ、Ｂｏｄｉｐｙ Ｒ６Ｇ ＳＥ、ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇ，ＭｅＯＨ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ−Ｘ抗体複合体 ｐＨ７．２、Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲ−Ｘ複合体、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ−Ｘ，ＭｅＯＨ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ−Ｘ，ＳＥ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ−Ｘファラシジン ｐＨ７．０、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ−Ｘ，ＭｅＯＨ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ−Ｘ，ＳＥ、ＢＯＲＲＯ−１、ＢＯＰＲＯ−３、カルセイン、カルセイン ｐＨ９．０、カルシウムクリムソン、カルシウムクリムソンＣａ２＋、カルシウムグリーン、カルシウムグリーン−１ Ｃａ２＋、カルシウムオレンジ、カルシウムオレンジＣａ２＋、カルボキシナフトフルオレセイン ｐＨ１０．０、カスケードブルー、カスケードブルーＢＳＡ ｐＨ７．０、カスケードイエロー、カスケードイエロー抗体複合体 ｐＨ８．０、ＣＦＤＡ、ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）、ＣＩ−ＮＥＲＦ ｐＨ２．５、ＣＩ−ＮＥＲＦ ｐＨ６．０、シトリン、クマリン、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＣｙＱＵＡＮＴ ＧＲ−ＤＮＡ、ダンシルカダベリン、ダンシルカダベリン，ＭｅＯＨ、ＤＡＰＩ、ＤＡＰＩ−ＤＮＡ、ダポキシ（２−アミノエチル）スルホンアミド、ＤＤＡＯ ｐＨ９．０、Ｄｉ−８ ＡＮＥＰＰＳ、Ｄｉ−ＡＮＥＰＰＳ−リピッド、ＤｉＩ、ＤｉＯ、ＤＭ−ＮＥＲＦ ｐＨ４．０、ＤＭ−ＮＥＲＦ ｐＨ７．０、ＤｓＲｅｄ、ＤＴＡＦ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｅＣＦＰ（強化シアン蛍光タンパク質）、ｅＧＦＰ（強化緑色蛍光タンパク質）、エオシン、エオシン抗体複合体 ｐＨ８．０、エリスロシン−５−イソチオシアネート ｐＨ９．０、臭化エチジウム、エチジウムホモ二量体、エチジウムホモ二量体−１−ＤＮＡ、ｅＹＦＰ（強化黄色蛍光タンパク質）、ＦＤＡ、ＦＩＴＣ、ＦＩＴＣ抗体複合体 ｐＨ８．０、ＦｌＡｓＨ、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−３ Ｃａ２＋、Ｆｌｕｏ−４、Ｆｌｕｏｒ−Ｒｕｂｙ、フルオレセイン、フルオレセイン ０．１Ｍ ＮａＯＨ、フルオレセイン抗体複合体 ｐＨ８．０、フルオレセインデキストラン ｐＨ８．０、フルオレセイン ｐＨ９．０、フルオロ−エメラルド、ＦＭ１−４３、ＦＭ１−４３リピッド、ＦＭ４−６４、２％ＣＨＡＰＳ、Ｆｕｒａ Ｒｅｄ Ｃａ２＋、Ｆｕｒａ Ｒｅｄ，高Ｃａ、Ｆｕｒａ Ｒｅｄ，低Ｃａ、Ｆｕｒａ−２ Ｃａ２＋、Ｆｕｒａ−２，高Ｃａ、Ｆｕｒａ−２，無Ｃａ、ＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）、ＨｃＲｅｄ、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８−ＤＮＡ、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、Ｉｎｄｏ−１ Ｃａ２＋、Ｉｎｄｏ−１，Ｃａフリー、Ｉｎｄｏ−１，Ｃａ飽和、ＪＣ−１、ＪＣ−１ ｐＨ８．２、リサミンローダミン、ＬＯＬＯ−１−ＤＮＡ、ルシファーイエロー，ＣＨ、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒブルー、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒブルー ｐＨ５．０、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒグリーン、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒグリーン ｐＨ５．０、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒイエロー ｐＨ３．０、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒイエローｐＨ９．０、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒブルー、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒグリーン、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒレッド、マグネシウムグリーン、マグネシウムグリーン Ｍｇ２＋、マグネシウムオレンジ、Ｍａｒｉｎａブルー、ｍＢａｎａｎａ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒグリーン、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒグリーン ＦＭ，ＭｅＯＨ、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒオレンジ、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒオレンジ，ＭｅＯＨＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒレッド、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒレッド，ＭｅＯＨ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＰｌｕｍ、ｍＲＦＰ、ｍＳｔｒａｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ＮＢＤ−Ｘ、ＮＢＤ−Ｘ，ＭｅＯＨ、ＮｅｕｒｏＴｒａｃｅ ５００／５２５、緑色蛍光Ｎｉｓｓｌ ｓｔａｉｎ−ＲＮＡ、Ｎｉｌｅブルー，ＥｔＯＨ、Ｎｉｌｅレッド、Ｎｉｌｅレッド−リピッド、Ｎｉｓｓｌ、Ｏｒｅｇｏｎグリーン４８８、Ｏｒｅｇｏｎグリーン４８８抗体複合体 ｐＨ８．０、Ｏｒｅｇｏｎグリーン５１４、Ｏｒｅｇｏｎグリーン５１４抗体複合体 ｐＨ８．０、Ｐａｃｉｆｉｃブルー、Ｐａｃｉｆｉｃブルー抗体複合体 ｐＨ８．０、フィコエリスリン、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−１−ＤＮＡ、ＰＯ−ＰＲＯ−３、ＰＯ−ＰＲＯ−３−ＤＮＡ、ＰＯＰＯ−１、ＰＯＰＯ−１−ＤＮＡ、ＰＯＰＯ−３、ヨウ化プロピジウム、ヨウカプロピジウム−ＤＮＡ、Ｒ−フィコエリスリン ｐＨ７．５、ＲｅＡｓＨ、レソルフィン、レソルフィン ｐＨ９．０、Ｒｈｏｄ−２、Ｒｈｏｄ−２ Ｃａ２＋、ローダミン、ローダミン１１０、ローダミン１１０ｐＨ７．０、ローダミン１２３、ＭｅＯＨ、ローダミングリーン、ローダミンファロイジン ｐＨ７．０、ローダミンレッド−Ｘ抗体複合体 ｐＨ８．０、ローダミングリーン ｐＨ７．０、Ｒｈｏｄｏｌグリーン抗体複合体 ｐＨ８．０、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＳＢＦＩ−Ｎａ＋、ナトリウムグリーンＮａ＋、スルフォローダミン１０１、ＳＹＢＲグリーンＩ、ＳＹＰＲＯルビー、ＳＹＴＯ １３−ＤＮＡ、ＳＹＴＯ ４５−ＤＮＡ、ＳＹＴＯブルー−ＤＮＡ、テトラメチルローダミン抗体複合体 ｐＨ８．０、テトラメチルローダミンデキストラン ｐＨ７．０、Ｔｅｘａｓレッド−Ｘ抗体複合体 ｐＨ７．２、ＴＯ−ＰＲＯ−１−ＤＮＡ、ＴＯ−ＰＲＯ−３−ＤＮＡ、ＴＯＴＯ−１−ＤＮＡ、ＴＯＴＯ−３−ＤＮＡ、ＴＲＩＴＣ、Ｘ−Ｒｈｏｄ−１ Ｃａ２＋、ＹＯ−ＰＲＯ−１−ＤＮＡ、ＹＯ−ＰＲＯ−３−ＤＮＡ、ＹＯＹＯ−１−ＤＮＡ、及びＹＯＹＯ−３−ＤＮＡなどが挙げられる。
ハイブリダイゼーションの際に、検出可能な信号又は検出可能な信号中の変化を提供するような化学発光分子、並びに放射活性分子などのような、蛍光分子より他の標識が用いられ得る。
いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドが、標識の蛍光信号を減衰するクエンチャーを含む。他の実施形態では、第４のポリヌクレオチドが、標識の蛍光信号を減衰させるクエンチャーを含む。本発明の方法の実行での使用のために意図されるクエンチャーとしては、限定されるものではないが、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅクエンチャー１、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅクエンチャー−２、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＲＱ、Ｚｅｎクエンチャー、及びＤａｂｃｙｌ．Ｇ−ｂａｓｅが挙げられる。
ＸＩＩ．修飾ポリヌクレオチドの組み合わせ
修飾特性を備えた部分的な二重鎖プライマーの組み合わせは、（１）基本的なプライマーポリヌクレオチドと基本的なフィクサーポリヌクレオチドのような２つのポリヌクレオチドによってと、（２）修飾プライマーポリヌクレオチドと基本的なフィクサーポリヌクレオチドのような２つのポリヌクレオチドによってと、（３）修飾プライマーポリヌクレオチドと修飾フィクサーポリヌクレオチドのような２つのポリヌクレオチドによってと、（４）基本的なプライマーポリヌクレオチドと、基本的なフィクサーポリヌクレオチドと、アンチプライマーポリヌクレオチドとのような３つのポリヌクレオチドによってと、並びに（５）修飾プライマーポリヌクレオチドと、基本的なフィクサーポリヌクレオチドと、アンチプライマーポリヌクレオチドとの３つのポリヌクレオチドによってと、とで形成され得る。
部分的に二重鎖のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの直線状部分内又はループ領域内に配置され得るようなその単鎖領域によってのみ、ゲノムＤＮＡに対するハイブリダイゼーションを開始することができる。
ポリヌクレオチドの単鎖領域内の非完全配列相補性（単一のヌクレオチドミスマッチを含む）は、ハイブリダイゼーションの開始を減速させることによって、ハイブリダイゼーションの効率を著しく低減させる。
ポリヌクレオチドの二重鎖領域内の非完全配列相補性は、鎖置換ハイブリダイゼーション及び鋳型ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチドの結合を妨害するはずである。
基本的なポリヌクレオチドよりは鋳型ポリヌクレオチド内の変化により感受性が高い修飾ポリヌクレオチドは、より特異的なＰＣＲ方式の診断的アッセイの開発及び例えば癌組織内での希少なＤＮＡ突然変異の高感度ＰＣＲ検出のために用いられ得る。
図１１（スキーム１１）は、非共有結合されたアンチプライマー（ＡＰ）を備える基本的プライマー及びフィクサーポリヌクレオチドを使用する３つの例を示している。
別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、基本的プライマーポリヌクレオチド（「ＰＯ」）と修飾フィクサーポリヌクレオチド構造（「Ｆ１〜Ｆ４」）で構成されてもよい（図１２；スキーム１２参照）。修飾フィクサーは左側に示されていて、それと共に完全なポリヌクレオチドの組み合わせ（基本的プライマーと修飾フィクサーポリヌクレオチド）が右側に示されている。
ステム−ループ構造（スキーム１２の１〜４）を含む修飾ポリヌクレオチドの組み合わせは、鋳型ポリヌクレオチドへの結合の際に、特異性の増大したレベルを提供するために用いられてもよい。これら態様では、単鎖領域（すなわち、ループ構造）が鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズする。配列内で１００％の相補性であれば、このハイブリダイゼーションは、フィクサーポリヌクレオチドの完全に相補的なステム部分を効果的に置換するであろう。関連する態様では、プライマーポリヌクレオチドは、完全にハイブリダイズされたフィクサーポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。修飾フィクサーポリヌクレオチドの単鎖ループ領域又は二重鎖ステム領域内におけるいかなる突然変異も、そのハイブリダイゼーション効率を低減するであろうし、結果的にポリヌクレオチドの組み合わせのプライミング効率も低減するであろう。別の実施形態では、ポリヌクレオチドの組み合わせは、修飾プライマーポリヌクレオチド（「Ｐ１］）と基本的なポリヌクレオチド（「Ｆ］）とから構成されてもよい（図１３ａ；スキーム１３参照）。スキーム１３では、修飾プライマーポリヌクレオチドが左側に示され、それと共に完全なポリヌクレオチドの組み合わせ（修飾プライマーポリヌクレオチドと基本的フィクサーポリヌクレオチド）が右側に示されている。この実施形態では、プライマー１の５’セグメントをその３’セグメントにハイブリダイズさせるように、単鎖ＤＮＡリンカー（例えばポリｄＴなどで構成されている）が十分に長くあるべきである。
別の実施形態では、ポリヌクレオチドの組み合わせは、修飾プライマーポリヌクレオチド（プライマー１、Ｐ１）と修飾フィクサーポリヌクレオチドとによって構成されてもよい（スキーム１４参照）。このような２つの例は、図１２ｂ（スキーム１４）に示されていて、図１２（スキーム１２）からのフィクサーポリヌクレオチドＦ１及びＦ４と共に示されている。
別の実施形態では、修飾プライマー構造を備えたポリヌクレオチドの組み合わせは、非共有的に結合されたアンチプライマーを更に含む。１つの態様では、ポリヌクレオチドの組み合わせは、修飾プライマーポリヌクレオチド、基本的なフィクサーポリヌクレオチド及びアンチプライマーを含むように形成されてもよい。種々の態様では、アンチプライマーは、ポリヌクレオチドの基見合わせの異なる領域にハイブリダイズされてもよい（図１２ｃ；スキーム１5参照）。
アンチプライマーは、鋳型ポリヌクレオチドへのフィクサーポリヌクレオチドの第１のドメインの結合の特異性を更に増大させるように働く。ここでは、１００％相補的鋳型ポリヌクレオチド領域のみが、アンチプライマーによってカバーされていない短いポリヌクレオチド領域に対して効果的にハイブリダイズするであろう。フィクサーポリヌクレオチドの第１のドメインが鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズするので、鋳型領域がフィクサーポリヌクレオチドに１００％相補的であれば、それはアンチプライマーを置換するであろう。このことが、フィクサーポリヌクレオチド単独の場合に対する非常に高いレベルの特異性を提供する。
本明細書の全体にわたって引用された引用文献は、本明細書に示された方法に例示的方法又は他の詳細な補足を提供する限りにおいて、全てが特に参照により本明細書に組み込まれる。
プライマー又はプライマーの組み合わせが「順」又は「逆」方向として指示されて場合、これら表示は、ＰＣＲ反応及びプライマーと鋳型との間の関係の説明で用いられる任意の慣習であることを、当業者は理解されるであろう。したがって、当業者には明らかなように、それを１８０°反転させることによってＰＣＲ概略図の方向を変えることによって、「順方向」プライマーが「逆方向」プライマーになり、並びに「逆方向」プライマーが「順方向」プライマーになり、例えば順方向プライマー又は逆方向プライマーとしての１つのプライマーの組み合わせの表示などは、構造又は特別なプライマーの組み合わせの使用に関する制限ではない。
実施例１
本発明のポリヌクレオチドの組み合わせを用いる基本的な単一塩基突然変異検出ＰＣＲ
その最も基本的な形態の１つでは、２つのポリヌクレオチドの組み合わせを用いて、ＰＣＲが実行される。１つのポリヌクレオチドの組み合わせは「順方向」複合体であり、並びに他方は「逆方向」複合体である。それぞれのポリヌクレオチドの組み合わせは、２つのポリヌクレオチド、プライマー及びフィクサーで構成される。プライマー及びフィクサーポリヌクレオチドは、スキーム２（図２）で示したように、互いに対して並びに鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドに対してハイブリダイズすることが可能である。
突然変異検出の場合には、順方向及び／又は逆方向プライマーポリヌクレオチドは、標的ＤＮＡポリヌクレオチド内の野生型配列からの変異体を識別することが可能である配列を含有する。プライマーポリヌクレオチド配列が野生型配列に向けられれば、次いでプライマーポリヌクレオチドは、ただ単に野生型鋳型に効果的に結合するであろうし、逆もまた同様である。この結果は、変異体配列がただ１つの塩基位置で野生型配列と異なっているためであり、本明細書に記載されたポリヌクレオチドの組み合わせの態様では、鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズするプライマーポリヌクレオチドの第１のドメインは短い（５〜３０ヌクレオチド）。ミスマッチがある場合、プライマーオリゴヌクレオチド結合が不安定になり、結果的にＤＮＡ合成をプライミングすることができないために、この長さは変異体と野生型配列との識別を可能にする。
第１の工程は、反応容器内で試薬を組み立てることである。試薬は、順方向及び逆方向ポリヌクレオチド組み合わせ複合体、鋳型ＤＮＡポリヌクレオチド、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、でオキシヌクレオチド基質、及び適切な緩衝液を含む。当業者によって容易に決定される最適な条件を用いて、当該技術分野で周知の方法に従って、ＰＣＲが行われた。
プライマーポリヌクレオチドがどのようにデザインされるか（すなわち、変異体又は野生型対立遺伝子を検出するためにそれらがどのようにデザインされるか）に依存して、得られたＰＣＲ生成物は、サンプルが変異体を含有するか又は野生型対立遺伝子を含有するか（又は双方とも含有するか）に関する情報を提供する。
図１４（スキーム１６）は、２つのシナリオを示している。上部シナリオでは、プライマーポリヌクレオチドの第１のドメインが、鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドに対して１００％相補的であり、伸張が起こり、生成物を生じる。
下部シナリオでは、プライマーポリヌクレオチドの第１のドメインが、鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドに対してミスマッチを含有し、プライマーポリヌクレオチドの短い第１のドメイン内の不安定性のために、伸張がブロックされている。この不安定性が、ＰＣＲの非常に低い効率をもたらし、検出可能な生成物をわずかに生産するか又は全く生産しない結果となる。
次世代配列決定
次世代配列決定（ＮＧＳ）を行うためのポリヌクレオチドの組み合わせの使用は、プローブライゲーション及又はポリメラーゼ伸張のいずれも用いることなく実行される（図１５；スキーム１７）。
初めに、第１のフィクサーポリヌクレオチドと４つの蛍光標識付けされたポリヌクレオチドの混合物とが、ポリヌクレオチド鋳型にハイブリダイズされる。ポリヌクレオチドが結合した鋳型が、次いで洗浄され、信号が読み取られる。
次いで、蛍光標識が開裂され、混合物が再度洗浄される。次に４つの２蛍光標識付されたポリヌクレオチドの混合物が、鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズされて、混合物が洗浄され、信号が再度読み取られる。
鋳型の末端が到達されるまで、初めの２つの工程が繰り返される。ついで、第１のフィクサーポリヌクレオチドとすべてハイブリダイズされたポリヌクレオチドが、鋳型ポリヌクレオチドから剥ぎ取られる。この工程の次に、第１のフィクサーポリヌクレオチドから上流の単一の塩基にハイブリダイズする第２のフィクサーポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションが続く。
前と同じように、４つの蛍光標識付されたポリヌクレオチドの混合物が、鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズされて、混合物が洗浄され、信号が読み取られる。次いで、蛍光標識が開裂され、混合物が洗浄され、並びに４つの蛍光標識付されたポリヌクレオチドが再びハイブリダイズされる。混合物が次いで洗浄されて、信号が読み取られる。
これらの工程は、鋳型ポリヌクレオチドが到達するまで繰り返される。このように、ＤＮＡポリメラーゼを用いることなく、ＤＮＡ配列が得られる。
染料色素ＳＹＴＯ９の存在下における定量的ＰＣＲ
材料
基質：ラムダＤＮＡ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＃Ｎ３０１１Ｓ
Ｐ１０−３５（配列番号４）（すなわち、「第１のポリヌクレオチド」）
Ｆ１０−２３（配列番号３）（すなわち、「第２のポリヌクレオチド」）
順方向プライマー１０−１５（配列番号１）
逆方向プライマー１０−１７（配列番号２）
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＃Ｍ０３２０Ｌ
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ８．３＠２５℃
ｄＮＴＰｓ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃１０２９７０２８
ＳＹＴＯ９緑色蛍光核酸染料Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃Ｓ３４８５４
方法
増幅を５０μｌ容量のアリコート中、三組で実施した。
通常の増幅反応は、２ｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液１２．５μｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、通常の順方向プライマー１０−１５（配列番号１）２００ｎＭ、通常の逆方向プライマー１０−１７（配列番号２）２００ｎＭ、ｄＮＴＰｓ ２００μＭ、Ｔａｑポリメラーゼ１単位、ラムダＤＮＡ ０．１ｎｇ、及びＳＹＴＯ９ ２ｕＭから構成された。以下の熱的サイクリングプロファイルを用いて、ＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ中で増幅が行われた。１サイクルが９４℃で２分間、続いて５０サイクルが９４℃で１５秒及び６６℃で１分２０秒間。
プライマー組み合わせｐ１０−３５及びｆ１０−２３の増幅混合物は、２ｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液１２．５μｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、通常の順方向プライマー１０−１５（配列番号１）２００ｎＭ、Ｐ１０−３５（配列番号４）２００ｎＭ、Ｆ１０−２３（配列番号３）４００μＭ、ｄＮＴＰｓ ２００μＭ、Ｔａｑポリメラーゼ１単位、ラムダＤＮＡ ０．１ｎｇ、及びＳＹＴＯ９ ２ｕＭから構成された。増幅パラメータは、通常のプライマー増幅と同様であった。
結果
２つの通常のプライマー、１０−１５（配列番号１）及び１０−１７（配列番号２）を使用した反応に関する平均の増幅曲線と、順方向の通常のプライマー１０−１５（配列番号１）、Ｐ１０−３５（配列番号４）及びＦ１０−２３（配列番号３）を使用した反応に関する平均の増幅曲線が、図１６に示されている。結果は、Ｐ１０−３５／Ｆ１０−２３ペアを含有するアッセイが通常のプライマーを含有するアッセイとほぼ同じように行われたことを示唆している。
蛍光体標識付されたプライマー組み合わせとクエンチャー標識フィクサーを使用した定量的ＰＣＲアッセイ
材料
基質：ラムダＤＮＡ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ＃Ｎ３０１１Ｓ
５’−フルオレセイン標識Ｐ１０−７４（配列番号１０）（すなわち、「標識を含む第１のポリヌクレオチド」）
３’−Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋクエンチャー標識Ｆ１０−７３（配列番号９）（すなわち「標識を含む第２のポリヌクレオチド」）
順方向プライマー１０−１５（配列番号１）
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＃Ｍ０３２０Ｌ
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、５０ｍＭ ＫＣｌｐＨ８．３＠２５℃
Ｖｅｎｔ（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＃Ｍ０２５７Ｌ
ｄＮＴＰｓ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃１０２９７０１８
方法
Ｐ１０−７４による増幅反応は、２ｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液１２．５μｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、通常の順方向プライマー１０−１５（配列番号１）２００ｎＭ、Ｐ１０−７４（配列番号１０）２００ｎＭ及びＦ１０−７３（配列番号９）４００ｎＭ、ｄＮＴＰｓ ２００μＭ、Ｔａｑポリメラーゼ１単位、ラムダＤＮＡ ０．１ｎｇを含有した。以下の熱的サイクリングプロファイルを用いて、ＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ中で増幅が行われた。１サイクルが９４℃で２分間、続いて５０サイクルが９４℃で１５秒間及び６６℃で１分２０秒間、及び「読取り」サイクルが６０℃で１０秒間。いくつかの反応が、Ｖｅｎｔ（エキソ−）ポリメラーゼ０．２単位が更に供給された。
結果
増幅リアルタイムＰＣＲ曲線が図１７に示されている。蛍光体標識Ｐ１０−７４によるアッセイは、Ｖｅｎｔ（エキソ−）ポリメラーゼの添加によりわずかに改善された、適度に強い信号を発生した。
結論
標識及びクエンチャーを備えたＰ１０−７４／Ｆ１０−７３ペアによるｑＰＣＲアッセイは、それぞれ診断適用のための新規なツールを提示している。
蛍光体標識付プライマー及びユバーサルプライマーを使用するｑＰＣＲアッセイ
材料
基質：ラムダＤＮＡＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＃Ｎ３０１１Ｓ
３’蛍光体標識及び保護された結合を備えたＰ１０−１０４（配列番号１３）（すなわち「標識を含む第１のポリヌクレオチド」）
Ｆ１０−７９（配列番号１１）（すなわち、「第２のポリヌクレオチド」）
クエンチャーオリゴヌクレオチド１０−８０（配列番号１２）（すなわち、「ユニバーサルクエンチャーポリヌクレオチド」）
順方向プライマー１０−１５（配列番号１）
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＃Ｍ０３２０Ｌ
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＫｃｌｐＨ８．３＠２５℃
Ｖｅｎｔ（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＃Ｍ０２５７Ｌ
ｄＮＴＰｓ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃１０２９７０１８
方法
増幅が、２ｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液１２．５μｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、通常の順方向プライマー１０−１５（配列番号１）２００ｎＭ、Ｐ１０−１０４（配列番号１３）２００ｎＭ、Ｆ１０−７９（配列番号１１）クエンチャー１０−８０（配列番号１２）６００ｎＭ、ｄＮＴＰｓ ２００μＭ、Ｔａｑポリメラーゼ１単位、及びラムダＤＮＡを含む２５μｌ容量のアリコートにて三組で実施された。以下の熱的サイクリングプロファイルを用いて、ＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ中で増幅が行われた。１サイクルが９４℃で２分間、続いて５０サイクルが９４℃で１５秒間及び６６℃で１分２０秒間、更に「読取り」サイクルが６０℃で１０秒間。いくつかの反応では、Ｖｅｎｔ（エキソ−）ポリメラーゼの０．２単位が更に補充された。
結果
平均の増幅リアルタイムＰＣＲ曲線が図１８に示されている。蛍光体標識Ｐ１０−１０４とユニバーサルクエンチャーオリゴヌクレオチド１０−８０を使用したアッセイは、Ｖｅｎｔ（エキソ−）ポリメラーゼの添加によって著しく改善された強い信号を発生した。
結論
蛍光体標識Ｐ１０−１０４及びユニバーサルクエンチャーを使用したｑＰＣＲアッセイは、診断的用途のための新規なｑＰＣＲツールを提示する。これは、ユニバーサルクエンチャー分子の使用のために、実施例４で記載された方法よりも、複数のアッセイをデザインすることがより安価である。
ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ染料を使用したＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ突然変異アッセイ
材料
０．１ｘＴＥ緩衝液：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ＝８．０
ゲノムＤＮＡ単離キット：Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ ＃６９５０４
野生型ヒトゲノムＤＮＡ鋳型：ＰｒｏｍｅｇａヒトゲノムＤＮＡ ＃Ｇ１４７１
変異体鋳型：新鮮に回収したＳＷ４８０結腸直腸腺癌細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２２８）から単離した（Ｇ１２Ｖ）ゲノムＤＮＡ
オリゴヌクレオチド：
ｋｒａｓ通常の順方向プライマー１０−５３（配列番号６）
ｋｒａｓＧ１２Ｖ通常の逆方向プライマー１０−４８（配列番号５）
ｋｒａｓＰ１０−５６（配列番号８）（すなわち「第１のポリヌクレオチド」）
ｋｒａｓＦ１０−５４（配列番号７）（すなわち、「第２のポリヌクレオチド」）
リアルタイムＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ混合物：ＢｉｏＲａｄ ＩＱ ＳＵＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ＃１７０−８８８２
方法
ゲノムＤＮＡ単離：製造業者のプロトコルに従って、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔを用いて、Ｋｒａｓ Ｇ１２ＶヒトゲノムＤＮＡを、新鮮に回収したＳＷ４８０細胞から単離し、０．１ｘＴＥ緩衝液中に濃度１０ｎｇ／μｌで再懸濁し、小分けし、使用するまで−２０℃にて保存した。
鋳型調製：リアルタイムＰＣＲ反応のためのゲノムＤＮＡ鋳型を生成するために、変異体ｋｒａｓのコピーの数が、総ＤＮＡの５０ｎｇ当たり１〜１４，０００個のコピーで変化するように、Ｐｒｏｍｅｇａ ＷＴゲノムＤＮＡが、表示量のｋｒａｓＧ１２ＶゲノムＤＮＡでスパイクされて、次いで鋳型ＤＮＡが小分けされ、使用するまで−１０℃で保存された。
リアルタイム増幅反応：増幅が、２ｘ ＢｉｏＲａｄ ＩＱ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ １２．５μｌ、順方向プライマー１０−５３（配列番号６）２００ｎＭ、通常のＰＣＲ反応のための通常の逆方向プライマー１０−４８（配列番号５）２００ｎＭ又はプライマー組み合わせの増幅反応のためのｋｒａｓ Ｐ１０−５６（配列番号８）２００ｎＭ及びプライマー組み合わせの増幅反応のためのｋｒａｓＦ１０−５４（配列番号７）４００ｎＭ、並びにＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍを用いる鋳型ＤＮＡ ５０ｎｇを含む２５μｌのアリコート中、三組で行われた。以下の熱的サイクリングを用いて増幅が実施された。１サイクルは９４℃で３分間、続く６０サイクルは９４℃で１５秒間及び６６℃で１分２０秒間。
結果
変異体対立遺伝子Ｇ１２Ｖの５０％（７，０００個の変異体のＤＮＡコピー）、１０％（１，４００個の変異体のＤＮＡコピー）、１％（１４０個の変異体のＤＮＡコピー）、０．１％（１４個の変異体のＤＮＡコピー）、０．０１％（１個の変異体のＤＮＡコピー）、及び０％を含有する通常のＤＮＡサンプル５０ｎｇに関する平均のプライマー組み合わせのｑＰＣＲ曲線が図１９ａに示されている。図１９ｂは、通常のプライマーを用いての同一のＤＮＡサンプルの解析を示している。どちらも、プライマーは、ｋｒａｓ Ｐ１０−５６又は通常のプライマーの３’末端に位置する塩基によるミスマッチを識別するようデザインされた。
結論
プライマー組み合わせＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ突然変異アッセイは、１４，０００個の正常のＤＮＡ配列の混合物中に存在する単一コピー変異体対立遺伝子を検出可能であったが、一方通常のプライマーを使用したアッセイは、変異体ＤＮＡの１４０個のコピー（１％）の検出にとどまった。プライマー組み合わせが希少突然変異検出に用いられた場合は、通常のプライマーを使用した場合と比較して、感度で１００倍の改善が見られた。単一の変異体対立遺伝子から発生する信号は、バクグラウンド（２〜３サイクル差）から識別され得る。
固定サンプルによるプライマー組み合わせ及びＳｙｂｒＧｒｅｅｎを用いる突然変異の検出
材料
ＷＴ ｋｒａｓ ＨＴ２９結腸直腸腺癌細胞ＡＴＣＣ ＃ＨＴＢ−３８
Ｇ１２ＶゲノムＤＮＡが新鮮に回収されたＳＷ４８０結腸直腸腺癌細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２２８）から単離された。
方法
細胞固定化：ＨＴ２９細胞（ｋｒａｓＷＴ ＤＮＡ由来）又はＳＷ４８０細胞（ｋｒａｓ Ｇ１２Ｖ ＤＮＡ由来）をトリプシン処理し、氷冷したＰＢＳ中で３回洗浄し、４％ホルムアルデヒド中で、室温で１０分間固定し、再度ＰＢＳ中で４回洗浄した。最後の洗浄後、実施例５に記載されたプロトコルに従って、細胞ペレットが、ＤＮＡを単離するために用いられた。
鋳型調製及びＤＮＡ増幅：実施例に記載されたものと同様である。
結果
変異体対立遺伝子Ｇ１２Ｖの１００％（１４，０００個の変異体のＤＮＡコピー）、５０％（７，０００個の変異体のＤＮＡコピー）、１０％（１，４００個の変異体のＤＮＡコピー）、１％（１４０個の変異体のＤＮＡコピー）、０，１％（１４個の変異体のＤＮＡコピー）、０．０１％（１個の変異体のＤＮＡコピー）、及び０％を含む固定ＤＮＡサンプルに関する平均のプライマー組み合わせｑＰＣＲ曲線が図２０に示されている。非固定サンプルによる結果と同様に、検出限界は０．０１％又は１個の変異体ＤＮＡ分子であった。
結論
プライマー組み合わせＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ突然変異ｑＰＣＲアッセイの感度および選択性は、細胞の固定化によって影響されず、このことは、本アッセイの実際の臨床サンプルへの実用性を示唆している。単一の変異体対立遺伝子から発生する信号は、バックグラウンド（３サイクル差）から識別され得る。
プライマー組み合わせ及びプローブポリヌクレオチドを使用するＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖアッセイ
材料
鋳型ＤＮＡ：
Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｇ１４７１からの野生型ヒトゲノムＤＮＡ、ＳＷ４８０細胞から単離された変異体Ｇ１２Ｖ ＤＮＡ（実施例６参照）
オリゴ：
ｋｒａｓ通常の順方向プライマー１０−１７８（配列番号１６）、
ｋｒａｓ Ｇ１２Ｖ Ｐ１０−１７１（配列番号１４）（すなわち、「第１のポリヌクレオチド」）、
ｋｒａｓ Ｆ１０−１７４（配列番号１５）（すなわち、「第２のポリヌクレオチド」）、
ｋｒａｓ特異的Ｚｅｎ二重クエンチャー型プローブ１０−１８５（配列番号１９）（すなわち、「標識及びクエンチャーを含むプローブポリヌクレオチド」）。
リアルタイムｑＰＣＲ混合物：ＢｉｏＲａｄ ＩＱ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ＃１７０−８８６２
方法
リアルタイム増幅反応：増幅が、２ｘ ＢｉｏＲａｄ ＩＱ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ １２．５μｌ、順方向プライマー１０−１７８（配列番号１６）２００ｎＭ、ｋｒａｓ Ｇ１２Ｖ Ｐ１０−１７１（配列番号１４）２００ｎＭ、ｋｒａｓ Ｆ１０−１７４（配列番号１５）４００ｎＭ、プローブ１０−１８５（配列番号１９）２５０ｎＭ、並びにＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍを用いる鋳型ＤＮＡ ５０ｎｇを含む２５μｌのアリコート中、三組で行われた。以下の熱的サイクリングプロファイルを用いて、増幅が行われた。１サイクルは９４℃で３分間、続いて６０サイクルが９４℃で１０秒間及び６６．５℃で１分２０秒間。
結果
変異体対立遺伝子Ｇ１２Ｖの１００％（１４，０００個の変異体のＤＮＡコピー）、５０％（７，０００個の変異体のＤＮＡコピー）、１０％（１，４００個の変異体のＤＮＡコピー）、１％（１４０個の変異体のＤＮＡコピー）、０，１％（１４個の変異体のＤＮＡコピー）、０．０１％（１個の変異体のＤＮＡコピー）、及び０％を含むＤＮＡサンプルに関する平均のプライマー組み合わせｑＰＣＲ曲線が図２１に示されている。実施例６及び７に記載された結果と同様に、プローブポリヌクレオチドを用いての検出限界は、０．０１％又は１個の変異体ＤＮＡ分子であった。信号強度は、変異体ＤＮＡの低い量（０．１％及び０．０１％）で低下した。
結論
プライマー組み合わせＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ変異体ｑＰＣＲアッセイの感度は、プローブポリヌクレオチドを用いることからは著しく改善しなかった。単一の変異体対立遺伝子から発生する信号は、バックグラウンド（６５サイクルまでの平坦な線）から識別され得、プローブポリヌクレオチド含有アッセイで良好な選択性を示している。
プライマー組み合わせ、プローブポリヌクレオチド、及びブリッカーポリヌクレオチドを使用するＫＲＳ Ｇ１２Ｖアッセイ
材料
鋳型ＤＮＡ：
Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｇ１４７１からの野生型ヒトゲノムＤＮＡ、ＳＷ４８０細胞から単離した変異体Ｇ１２Ｖ ＤＮＡ（実施例６参照）
オリゴ：
ｋｒａｓ Ｐ１０−１８４（配列番号１８）（すなわち、「第１のポリヌクレオチド」）、
ｋｒａｓ Ｆ１０−１８２（配列番号１７）（すなわち、「第２のポリヌクレオチド」）、
ｋｒａｓ特異的Ｚｅｎ二重クエンチャー型プローブ１０−２１０（配列番号２１）（すなわち、「プローブポリヌクレオチド」）、
ｋｒａｓ通常逆方向プライマー１０−２０８（配列番号２０）（すなわち、「逆方向プライマー」）、
ブロッキングオリゴ１０−２１３（配列番号２２）（すなわち、「ブリッキングポリヌクレオチド」）
リアルタイムｑＰＣＲ混合物：ＢＩＯＲａｄ ＩＱ Ｓｐｅｒｍｉｘ ＃１７０−８８６２
方法
リアルタイム増幅反応：増幅が、２ｘ ＢｉｏＲａｄ ＩＱ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ １２．５μｌ、ｋｒａｓ Ｐ１０−１８４（配列番号１８）２００ｎＭ、ｋｒａｓ Ｆ１０−１８２（配列番号１７）５０ｎＭ、逆方向プライマー１０−２０８（配列番号２０）２００ｎＭ、プローブポリヌクレオチド１０−２１０（配列番号２１）２５０ｎＭ、ブロッキングオリゴ１０−２１３（配列番号２２）２０００ｎＭ、並びにＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍを用いる鋳型ＤＮＡ ５０ｎｇを含む２５μｌのアリコート中、三組で行われた。以下の熱的サイクリングプロファイルを用いて、増幅が行われた。１サイクルは９４℃で３分間、続いて６０サイクルが９４℃で１０秒間及び６５℃で１分間。
結果
変異体対立遺伝子Ｇ１２Ｖの１００％（１４，０００個の変異体のＤＮＡコピー）、５０％（７，０００個の変異体のＤＮＡコピー）、１０％（１，４００個の変異体のＤＮＡコピー）、１％（１４０個の変異体のＤＮＡコピー）、０，１％（１４個の変異体のＤＮＡコピー）、０．０１％（１個の変異体のＤＮＡコピー）、及び０％を含むＤＮＡサンプルに関する平均のプライマー組み合わせｑＰＣＲ曲線が図２２に示されている。
結論
ブロッカーオリゴヌクレオチド１０−２１３（配列番号２２）（プローブポリヌクレオチドと組み合わせての）の添加は、アッセイの特性を著しく改善した。実施例４，５及び６に記載された結果と同様に、ＴａｑＭａｎプローブとブロッカーとを用いた検出限界は０．０１％であるか、又は１個の変異体ＤＮＡ分子であったが、実施例６に記載したアッセイよりも単一の変異体の検出に関して、選択性において〜１００〜１０００倍の改善があった（単一の変異体コピーと１４，０００個の正常なＤＮＡ分子から発生するバックグラウンドとの間で５〜７サイクル差）。
プローブポリヌクレオチド、ブロッカーポリヌクレオチド、及び３’側塩基ＬＮＡ修飾を使用してのプライマー組み合わせＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖアッセイ
材料
鋳型ＤＮＡ：
Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｇ１４７１からの野生型ヒトゲノムＤＮＡ、ＳＷ４８０細胞から単離した変異体Ｇ１２Ｖ ＤＮＡ（実施例６参照）。
オリゴ：
３’ＬＮＡ（配列番号２３）を伴うｋｒａｓ Ｐ１０−２３６（すなわち、「その３’末端においてロックされた核酸を含む第１のポリヌクレオチド」）、
ｋｒａｓ Ｆ１０−１８２（配列番号１７）（すなわち、「第２のポリヌクレオチド」）、
ｋｒａｓ特異的Ｚｅｎ二重クエンチャー型プローブ１０−２１０（配列番号２１）（すなわち、「プローブポリヌクレオチド」）、
ｋｒａｓ通常逆方向プライマー１０−２０８（配列番号２０）（すなわち、「逆方向プライマー」）、
ブロッキングオリゴ１０−２１３（配列番号２２）（すなわち、「ブロッキングポリヌクレオチド」）。
リアルタイムｑＰＣＲ混合物：ＢｉｏＲａｄ ＩＱ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ＃１７０−８８６２
方法
リアルタイム増幅反応：増幅が、２ｘ ＢｉｏＲａｄ ＩＱ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ １２．５μｌ、ｋｒａｓ Ｐ１０−２３６（配列番号２３）２００ｎＭ、ｋｒａｓ Ｆ１０−１８２（配列番号１７）５０ｎＭ、逆方向プライマー１０−２０８（配列番号２０）２００ｎＭ、プローブポリヌクレオチド１０−２１０（配列番号２１）２５０ｎＭ、ブロッキングオリゴ１０−２１３（配列番号２２）２０００ｎＭ、並びにＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍを用いる鋳型ＤＮＡ ５０ｎｇを含む２５μｌのアリコート中、三組で行われた。以下の熱的サイクリングプロファイルを用いて、増幅が行われた。１サイクルは９４℃で３分間、続いて６０サイクルが９４℃で１０秒間及び６５℃で１分間。
結果
変異体対立遺伝子Ｇ１２Ｖの１％（１４０個の変異体のＤＮＡコピー）及び０％を含むＤＮＡサンプルに関する平均のプライマー組み合わせｑＰＣＲ曲線が、図２３に示されている。
結論
プローブポリヌクレオチド、ブロッカーポリヌクレオチド及びＰ１０−２３６の３’側塩基ＬＮＡ修飾を伴うプライマー組み合わせＫＲＡＳｇ１２Ｖアッセイは、先の実施例と比べて、最良の感度（単一変異体対立遺伝子）及び最良の選択性（１４，０００個の野生型ＤＮＡ分子からの信号なし）を示した。
ＷＴ ＤＮＡの１４，０００個のコピー当たりＧ１２Ｖ ＤＮＡの０．５個のコピーにおける改善されたＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖアッセイを用いた単一突然変異検出：１６サンプルの
解析
材料実施例１０と同様である。
方法
鋳型調製：
０．５コピーＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＤＮＡ鋳型を生成するために、先に単離されたＳＷ４８０ゲノムＤＮＡを、ＰｒｏｍｅｇａヒトゲノムＤＮＡ １０ｎｇ／μｌで希釈し、ＷＴ ＤＮＡの１０μｌ当たり１ＳＷ４８０ＤＮＡ分子の最終濃度にした。
リアルタイム増幅反応：
増幅が、増幅混合物組成物及び実施例１０に記載されたプロトコルを用いて、０．５コピーＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ＤＮＡ鋳型の５μｌで、１６アリコート中にて実行された。
結果
実施例１０からの改善されたＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ｑＰＣＲ突然変異アッセイを用いた１６回の反復実験、並びにＷＴ ＤＮＡ ｎｏ１４，０００コピー当たり０．５コピーＧ１２Ｖ ＤＮＡを（統計的に）含むサンプルが、図２４ａに示されている。スパイクされ希釈されたＤＮＡサンプルの５０〜６０％（１６回中８〜１０回）が単一変異体ＤＮＡの信号の存在を示唆し、スパイクされ希釈されたＤＮＡサンプルの４０〜５０％（１６回中６〜８回）が信号を示さず、統計的予測と一致した。
実施例１０からの改善されたＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ ｑＰＣＲ突然変異アッセイを用いた１６回の反復実験、並びにＷＴ ＤＮＡの１４，０００個のコピーを含む（変異体ＤＮＡが無添加）サンプルが、図２４ｂに示されている。ＷＴ ＤＮＡサンプルの９４％（１６回中１５回）が信号を示さず、このことは、改善されたＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖプライマー組み合わせｑＰＣＲ突然変異アッセイによる単一変異体ＤＮＡ検出の非常に高い選択性を示唆している。
結論
プローブポリヌクレオチド、ブロッカー及び３’側修飾されたＬＮＡ塩基を伴うプライマー組み合わせＧ１２Ｖアッセイは、１０，０００個以上余りの非変異体ＤＮＡ分子中の単一変異体対立遺伝子の検出に関して、１００％の感受性及び９４〜１００％の選択性を有した。Ｇ１２Ｖアッセイのこのようなパラメータは、診断的アッセイのほとんどの要求特性を満足させるものである。本アッセイは、ＣＲＣ及びＮＳＣＬＣ患者の効果的かつ非侵襲的管理にとって、血液中を循環する希少な癌細胞の検出のために理想的に有用である。

Claims (17)

  1. 第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであって、
    前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に完全に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、ここで、Ｐａは、非標的ポリヌクレオチドに完全に相補的ではない配列を有し、ここで、前記Ｐａの長さが８〜９ヌクレオチドであり、
    前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、Ｐａよりも長く、かつ、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｆｂ）と、ＰａがＴ１にハイブリダイズし、かつＦｂがＴ２にハイブリダイズする場合にＰｃとＦｄがハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含む、ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであり、
    前記標的ポリヌクレオチドにおける前記第１の領域（Ｔ１）内の配列が、非標的ポリヌクレオチドにおける第１の領域（Ｔ１＊）内の配列と１塩基異なる、ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
  2. 第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであって、
    前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に完全に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、ここで、Ｐａは、非標的ポリヌクレオチドに完全に相補的ではない配列を有し、ここで、前記Ｐａの長さが８〜９ヌクレオチドであり、
    前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、Ｐａよりも長く、かつ、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｆｂ）と、ＰａがＴ１にハイブリダイズし、かつＦｂがＴ２にハイブリダイズする場合にＰｃとＦｄがハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含む、ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであり、
    Ｐ及び／又はＦが、修飾核酸を更に含み、そして、
    前記標的ポリヌクレオチドにおける前記第１の領域（Ｔ１）内の配列が、非標的ポリヌクレオチドにおける第１の領域（Ｔ１＊）内の配列と１塩基異なる、前記ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
  3. 第１のポリヌクレオチドと、第２のポリヌクレオチドと、ブロッカーポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであり、
    前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に完全に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、ここで、Ｐａは、非標的ポリヌクレオチドに完全に相補的ではない配列を有し、ここで、前記Ｐａの長さが８〜９ヌクレオチドであり、
    前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、Ｐａよりも長く、かつ、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｆｂ）と、ＰａがＴ１にハイブリダイズし、かつＦｂがＴ２にハイブリダイズする場合にＰｃとＦｄがハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含み、
    前記標的ポリヌクレオチドにおける前記第１の領域（Ｔ１）内の配列が、非標的ポリヌクレオチドにおける第１の領域（Ｔ１＊）内の配列と１塩基異なり、そして、
    前記ブロッカーポリヌクレオチドが、Ｔ１とＴ２の５’側に存在する第３の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ３）に相補的であるヌクレオチド配列を含む、前記ポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
  4. Ｐの３’末端におけるヌクレオチドと前記ブロッカーポリヌクレオチドの５’末端におけるヌクレオチドが重複する、請求項３に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
  5. 前記ブロッカーポリヌクレオチドが、Ｐａの全長にわたってＰａに重複する配列を有する、請求項４に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
  6. 前記Ｐの３’末端における前記ヌクレオチドと前記ブロッカーポリヌクレオチドの５’末端における前記ヌクレオチドが異なる、請求項４に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
  7. 第１のポリヌクレオチドと、第２のポリヌクレオチドと、プローブポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドプライマーの組み合わせであって、
    前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に完全に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｐａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｐｃ）とを含み、ここで、Ｐａは、非標的ポリヌクレオチドに完全に相補的ではない配列を有し、ここで、前記Ｐａの長さが８〜９ヌクレオチドであり、
    前記第２のポリヌクレオチド（Ｆ）が、Ｐａよりも長く、かつ、第２の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ２）に相補的である配列を有する第１のドメイン（Ｆｂ）と、ＰａがＴ１にハイブリダイズし、かつＦｂがＴ２にハイブリダイズする場合にＰｃとＦｄがハイブリダイズするようにＰｃに対して十分に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（Ｆｄ）とを含み、
    前記標的ポリヌクレオチドにおける前記第１の領域（Ｔ１）内の配列が、非標的ポリヌクレオチドにおける第１の領域（Ｔ１＊）内の配列と１塩基異なり、そして、
    前記プローブポリヌクレオチドが、Ｔ１とＴ２の５’側に存在する第３の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ４）に相補的であるヌクレオチド配列を含む、前記ポリヌクレオチドプ
    ライマーの組み合わせ。
  8. ブロッカーポリヌクレオチドを更に含み、前記ブロッカーポリヌクレオチドが、Ｔ１及びＴ２の５’側に存在し、かつＴ４の３’側に存在する第４の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ３）に相補的であるヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
  9. 請求項１〜８のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせが、逆方向プライマーを更に含み、前記逆方向プライマーが、Ｔ１に対してハイブリダイズする配列を含むポリヌクレオチド鎖に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む、請求項１〜８のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
  10. ＤＮＡポリメラーゼからの伸張をブロックする、Ｆにその３’末端において結合されているブロッキング基を更に含む、請求項１〜８のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
  11. ＰａがＴ１に対して完全に相補的であり、Ｐａがサンプル中の非標的ポリヌクレオチドに対して完全に相補的ではない、請求項１〜１０のうちのいずれか一項に記載されたプライマーの組み合わせを使用して、サンプル中の標的ポリヌクレオチドの存在を検出する方法であって、
    前記方法が、
    標的ポリヌクレオチドが前記サンプル中に存在する場合、前記標的ポリヌクレオチドに対して相補的であるＰａからの配列の伸張を許容する条件下で、前記サンプルを、前記プライマーの組み合わせとポリメラーゼとに接触させるステップと、
    検出が前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドの存在を示すような、Ｐａから伸長した前記配列を検出するステップとを含む、方法。
  12. 請求項１〜１０のうちのいずれか一項に記載のプライマーの組み合わせを用いて、サンプル中の標的ポリヌクレオチド上で、ポリメラーゼ伸張を開始する方法であって、Ｐが、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に完全に相補的である第１のドメイン（Ｐａ）を含み、Ｐａが、前記サンプル中の非標的ポリヌクレオチドに対して完全に相補的ではなく、前記サンプルが、（ｉ）Ｐａ内の配列と完全に相補的である第１の領域内の配列（Ｔ１）を有する標的ポリヌクレオチドと、（ｉｉ）Ｐａに完全に相補的ではない第１の領域内の配列（Ｔ１＊）を有する非標的ポリヌクレオチドとの混合物を含み、
    ここで、前記方法が、
    前記標的ポリヌクレオチドが前記サンプル中に存在する場合、前記標的ポリヌクレオチドに相補的であるＰａからの配列の伸張を許容する条件下で、前記サンプルを前記プライマーの組み合わせとポリメラーゼとに接触させるステップを含む、方法。
  13. 請求項１〜１０のうちのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせを用いて、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを増幅させる方法であって、前記第１のポリヌクレオチド（Ｐ）が、第１の標的ポリヌクレオチド領域（Ｔ１）に対して完全に相補的である第１のドメイン（Ｐａ）を含み、Ｐａが、前記サンプル中の非標的ポリヌクレオチドに対して完全に相補的ではなく、
    ここで、前記方法が、
    （ａ）前記標的ポリヌクレオチドが前記サンプル中に存在する場合、前記標的ポリヌクレオチドに相補的であるＰａからの配列の伸張を許容する条件下で、前記サンプルを前記プライマーの組み合わせとポリメラーゼとに接触させるステップと、
    （ｂ）前記標的ポリヌクレオチドからの前記Ｐａから伸張した配列を変性させるステップと、
    （ｃ）前記標的ポリヌクレオチドを増幅させるために、ステップ（ｂ）中の前記Ｐａから伸張した配列内の領域に対して相補的な配列を有する逆方向プライマーの存在下で、ステップ（ａ）を繰り返すステップとを含む方法であり、
    Ｔ１が前記Ｐａ内の配列に対して完全に相補的である場合に、前記標的ポリヌクレオチドの伸張及び増幅が起こるが、前記標的ポリヌクレオチドの前記第１の領域が、前記Ｐａ内の配列に対して完全に相補的ではない場合に、伸長及び増幅は効率が落ちるか又は全く起こらない、前記方法。
  14. 前記逆方向プライマーが、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含むプライマーの組み合わせであり、
    前記第１のポリヌクレオチド（ＰＰ）が、ステップ（ａ）の前記Ｐａから伸張した配列内の第１の領域（ＴＴ１）に完全に相補的である配列を有する第１のドメイン（ＰＰａ）と、特徴的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（ＰＰｃ）とを含み、
    前記第２のポリヌクレオチド（ＦＦ）が、ステップ（ａ）の前記Ｐａから伸張した配列内の第２の領域（ＴＴ２）に対して相補的である第１のドメイン（ＦＦｂ）と、ＰＰｃとＦＦｄが適切な条件下でハイブリダイズするように、ＰＰｃに対して十分に相補的なポリヌクレオチド配列を含む第２のドメイン（ＦＦｄ）とを含む、請求項１３に記載の方法。
  15. Ｐの３’末端におけるヌクレオチドと、前記ブロッカーポリヌクレオチド内のヌクレオチドとが異なるものである、請求項３に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
  16. 前記ブロッカーポリヌクレオチドが非標的ポリヌクレオチドに完全に相補的であり、かつ前記標的ポリヌクレオチドに対するミスマッチを含む、請求項３に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
  17. ＤＮＡポリメラーゼからの伸長を妨害する、その３’末端で前記ブロッカーに結合したブロッキング基をさらに含む、請求項３に記載のポリヌクレオチドプライマーの組み合わせ。
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