HU217036B - Eljárás génexpresszió gátlására alkalmas vegyületek előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány génexpresszió gátlására szőlgáló vegyületek előállításáravőnatkőzik. A találmány szerinti vegyületek körülbelül 6–200 bázisbólálló őligőnűkleő- zid-szekvenciát, és ezeket összekötő hárőmatőmős,nem főszfát típűsú internűkleőzidkötést tartalmaznak, illetvekörülbelül 9–200 bázisból álló őligőnűkleőtid- szekvenciáttartalmaznak, amelynek egyik vagy mindkét végén diőlcsőpőrt található. ŕ

Description

A találmány tárgya génexpresszió gátlására alkalmas vegyületek előállítására szolgáló eljárás.

A találmány szerinti vegyületek egyrészt olyan oligonukleozid-szekvenciák, amelyek körülbelül 6-200 bázisból állnak és egy háromatomos intemukleozidkötést tartalmaznak, másrészt olyan oligonukleozidszekvenciák, amelyek körülbelül 9-200 bázisból állnak, és egyik vagy mindkét végükön diolcsoportot tartalmaznak.

Antiszensz vegyületek az olyan vegyületek, amelyek egy nukleinsavban, RNS-ben vagy DNS-ben levő nukleotidszekvenciához kötődnek vagy hibridizálódnak, így gátolják az említett nukleinsav íünkcióját vagy szintézisét. Mivel az antiszensz vegyületek képesek hibridizálódni mind az RNS-hez, mind a DNS-hez, a génexpresszióba a transzkripció, RNS-feldolgozás vagy a transzláció során avatkozhatnak be.

Az antiszensz molekulákat úgy lehet megtervezni és szintetizálni, hogy azok egy bizonyos gén mRNS-sé való transzkripcióját akadályozzák meg úgy, hogy a genomiális DNS-sel hibridizálódnak és közvetlenül vagy közvetve gátolják az RNS-polimeráz hatását. A DNS megcélzásának az az előnye, hogy csak kis mennyiségű antiszensz vegyületre van szükség a kívánt terápiás hatás eléréséhez. Antiszensz vegyületek tervezhetők és szintetizálhatok olyan célból is, hogy az RNShez hibridizálódjanak, és így gátolják a transzkripció utáni módosító (RNS-feldolgozó), illetve proteinszintetizáló (transzlációs) mechanizmusokat. A megcélzott RNS-ek lehetnek a messenger RNS (mRNS), transzfer RNS (tRNS), riboszomális RNS (rRNS) stb. A feldolgozó és transzlációs mechanizmusok lehetnek például a pre-mRNS hasítása az intronok eltávolítása céljából, az mRNS 5'-terminusának kapcsolása, a hibridizáció megakadályozása és a nukleáz közvetítette mRNS-hidrolízis.

Az antiszensz technikák gyakorlati tudományos fejlődését és terápiás alkalmazását azonban számos technikai probléma akadályozza [Klausner, A.: Biotechnology, 303-304 8, (1990)]. A szintetikus antiszensz molekulák nagyon érzékenyek a megcélzott sejtekben levő nukleázok által okozott gyors lebomlással szemben. Az antiszensz DNS vagy RNS oligonukleotid-szekvenciákat például az exonukleázok a nukleinsavnak akár az 5’-, akár a 3’-végén hatva elbonthatják. Emellett az endonukleázok a DNS-t, illetve az RNS-t az egyes nukleozidok közötti belső foszfodiészter-kötéseknél is hasíthatják. Az ilyen hasítások következtében az adagolt antiszensz vegyületek felezési ideje nagyon rövid, ami nagyobb dózisokat, illetve gyakoribb adagolást tesz szükségessé.

Egy másik probléma az antiszensz DNS, illetve RNS hozzáférhető félautomata DNS-szintetizátorokkal történő előállításának különösen magas költsége. Nemrégen állapították meg, hogy 1 g antiszensz DNS előállításának költsége körülbelül 100 000 dollár [Armstrong, L.: Business Week, 1990. március 5., 89. oldal].

Egy további probléma az antiszensz molekuláknak a testen, illetve sejten belüli kívánt helyre történő szállításával kapcsolatos. Az olyan antiszensz molekuláknak, amelyek a genomiális DNS-t célozzák, be kell jutniuk a sejtmagba (azaz a szereknek át kell hatolniuk a plazmán és a sejtmag membránján). A fokozott membránpermeabilitás (fokozott hidrofobitás) iránti igényt azonban össze kell egyeztetni a testfolyadékok összetevőiben, például plazmában és sejtfolyadékban való vízoldhatósággal (fokozott hidrofílitással).

Egy további probléma az antiszensz molekuláknak a testben szabadon vagy a megcélzott nukleinsavhoz hibridízált formában való stabilitásával kapcsolatos. Az oligonukleotid-szekvenciák, mint például az antiszensz DNS, érzékenyek a királis foszforcentrumok körüli szférikus átrendeződésre.

A gének antiszensz molekulákon keresztül történő megcélzása a humán terápia elkerülhetetlen következő lépése [Armstrong, idézett helyen, 88.]. Az antiszensz technika betegségek kezelésére történő sikeres alkalmazásához azonban a fenti problémákat meg kell oldani.

Olyan antiszensz vegyületek előállításának, amelyek stabilak, nukleázokkal szemben ellenállók, előállításuk olcsó, és amelyek a test bármely részében található nukleinsavcélpontokhoz szállíthatók és hibridizálhatók, egyik megközelítése az, hogy olyan oligonukleozid-szekvenciákat szintetizálunk, amelyek a normális foszfát-cukor vázszerkezetben módosításokat tartalmaznak.

Általánosságban a módosított vázszerkezettel rendelkező oligonukleozid-szekvenciáknak két típusa ismeretes. Az egyik típus a normális intemukleozid-foszfodiészter-kötésben tartalmaz módosításokat. A másik típusban a foszfodiészter-kötéseket nem foszfát intemukleozidkötések helyettesítik [Uhlmann, E. és Peyman, A.: Chemical Reviews, 544-584 (4) 9, (1990)].

Az eddig ismertetett módosított foszfodiészter-kötések foszforo-tioátok, alkil-foszfo-triészterek, metilfoszfonátok és alkil-foszforamidátok.

A foszforo-tioát módosított foszfodiészter-kötések olyan foszfodiészter-kötéseket jelentenek, amelyekben az áthidaló oxigénatomok közül egyet vagy többet kénatom helyettesít. Az ilyen kötések azonban az antiszensz vegyületeknél nem alkalmasak. A királis foszforcentrum a monotioátok szterikus variációját eredményezi. Ezenkívül sem a mono-, sem a ditioátok nem hibridizálódnak szekvenciaspecifikusan, és mindkettő gyorsan kiürül a plazmából. A foszforo-tioátok üveggel és műanyagokkal szembeni nagy aktivitása szintén bonyolulttá és nem elég hatékonnyá teszi ezek szintézisét.

Metil- és etil-foszfotriésztereket úgy állítottak elő, hogy foszfodiészterrel kapcsolt oligonukleozidokat vízmentes metanollal, illetve etanollal reagáltattak [Miller, P. S. és munkatársai: J. Am. Chem. Soc., 6657-6665 93. (1971)].

Az oligodezoxiribonukleotid-etil-foszfotriészterekben jelen levő triészterkötés normál fiziológiás pH-körülmények között stabil, erős savval vagy bázissal azonban hidrolizálható. A metil-foszfotriészterek semleges pH-nál kevésbé stabilak, mint az etil- és más alkil-foszfotriészterek, mivel a triészter metilcsoportja az oldószerrel nukleofil úton kicserélődhet. Úgy tűnik, hogy az oligodezoxiribonukleotid-etil-foszfotriészterek az exonukleázos hidrolízissel szemben teljesen ellenállóak, és

I

HU 217 036 Β a borjúembrió-szérumban és a humán vérszérumban található nukleázok és észterázok nem hidrolizálják [Uhlmann, idézett helyen].

Terápiás potenciál szempontjából a metilfoszfonátok számos jelentős hátránnyal rendelkeznek, így például rosszul oldódnak vízben, királis foszforcentrumot tartalmaznak, a sztereoszelektív szintézist nem képesek kellő mértékben szabályozni, a plazmából gyorsan eltűnnek és a vizeletben kiválasztódnak. Az oligodezoxiribonukleozid-foszforamidátok olyan intemukleozidkö- 10 tést tartalmaznak, amelyekben nitrogén-foszfor-kötés található. Ezek a nukleinsavanalógok előállíthatók foszforamidit intermedierekből vagy H-foszfonát intermedierek primer vagy szekunder aminok jelenlétében végzett oxidációjával. A H-foszfonát-analógok előállítása és az oxidációs reakció a kereskedelemben kapható DNS-szintetizátorokban elvégezhető.

Számos, nem foszfát intemukleozidkötést tartalmazó, nemionos oligonukleozid-szekvenciát, például karbonát-, acetát-, karbamát- és dialkil- vagy diaril-szililszármazékokat szintetizáltak és ismertettek eddig.

A karbonátkötés savas hidrolízissel szemben ellenálló, bázissal azonban könnyen hasítható, ezért speciális elővigyázatossági intézkedések szükségesek ahhoz, hogy a szintézis végén a védőcsoportokat eltávolítsuk.

A karboxi-metil-internukleotid-kötéseket tartalmazó poli(dA)-analógok és a poli(U)-analógok között stabil duplexeket figyeltek meg, más bázisokat azonban még nem tanulmányoztak. így nem ismeretes, hogy a más bázisokkal képzett duplex képződésének valószínűségét a karbonátkötés nem zavatja-e.

Az intemukleozid-karbamátok vízoldhatóbbak, mint más intemukleozidhidak. A karbamátkötések hasznosíthatósága azonban korlátozott, mivel a timin-karbamátok nem hibridizálódnak a komplementer DNS-hez, míg a citozin-karbamátok nem hibridizálódnak a guaninoligomerekhez.

A karbamátkötések - a karbonátkötésekhez hasonlóan - fiziológiás körülmények között stabilak.

A karbonátoktól eltérően azonban a karbamátkötés a bázisos hidrolízissel szemben stabil, ez a tulajdonság egyszerűbbé teszi az olyan oligomerek szintézisét, amelyek ilyen kötést tartalmaznak. A karbamátkötés a nukleázos hidrolízissel szemben ellenálló.

A karbonát- és acetátkötésekhez hasonlóan a karbamátkötés nem hasonlít a foszfodiészter-intemukleotid-kötéshez. A molekuláris modellek azonban arra utalnak, hogy ez a kötés biztosítja, hogy az oligomer olyan formát vegyen fel, ami lehetővé teszi, hogy komplementer nukleinsavakkal hidrogénhidas komplexet képezzen. Egymásnak ellentmondó beszámolók szobiak a karbamát-oligomerek és a komplementer nukleinsavak között kialakult duplexek stabilitásáról. Egy hat timidinegységet tartalmazó, karbamáttal kapcsolt oligomer nem képez komplexet sem A(pA)₅-tel, sem dA(pA)₅-tel. Más- 55 részt egy hat dezoxicitozin-egységet tartalmazó, karbamáttal kapcsolt oligomer stabil komplexet képez d(pG)₆-tal és poli(dG)-vel.

A dialkil- vagy difenil-szilil-oligomer-analógok intemukleozidkötése nagyon hasonlít a normál foszfodi- 60 észter-intemukleotid-kötés tetrahedrális geometriájához. Az oligomereket oldatban állítják elő úgy, hogy a megfelelő védett nukleozid-3’-O-dialkil- vagy difenil-szililkloridot, vagy trifluor-metánszulfonil-származékot egy 5 3’-védett nukleoziddal reagáltatják vízmentes piridinben. Az előbbi úgy állítható elő, hogy 5’-0-tritilnukleozidot dialkil- vagy difenil-diklór-szilánnal vagy bisz(trifluor-metán-szulfonil)-diizopropil-szilánnal reagáltatnak.

Mivel a dialkil- és difenil-szilil-kötés a savas hidrolízisre érzékeny, a szintézishez a védőcsoportokat gondosan kell megválasztani. Sziloxán-intemukleozidkötéseket tartalmazó nukleozid-dimereket és -hexamereket, valamint ezek szintézisét ismertetik Ogilvie, K. K. és Cormier 15 J. F.: Tetrahedron Letters, 4159-4162 (35) 26, (1985); Cormier J. F. és Ogilvie, K. K.: Nucleic Acids Research, 4583-4594 (10) 16, (1988) irodalmi helyeken.

Bár a karbonát-, karbamát- és szililkötéseket tartalmazó oligonukleozid-szekvenciák rendelkeznek a meg20 felelő nukleázrezisztenciával, ami antiszensz reagensekként való alkalmazásukat lehetővé teszi, ilyen funkciójukról még nem számoltak be. Nem számoltak be továbbá még arról sem, hogy ezeket az oligomereket a sejtek tenyészetekben fel tudják-e venni. Ezen oligo25 merek feltételezhető hátránya ebből a szempontból az alacsony vízoldhatóságuk. Nem világos, hogy a biológiai kísérletekben való hatékony alkalmazásukhoz megfelelő koncentrációjú oldatok állíthatók-e elő belőlük, bár az oldhatóságuk feltételezhetően fokozható úgy, 30 hogy a molekulába hidrofil csoportokat vezetünk be.

A fenti hátrányokat és problémákat úgy oldottuk meg, hogy új, stabil, nukleázokkal szemben ellenálló, célspecifikus, lipidoldható oligonukleotidanalóg vegyületeket, ilyen vegyületeket tartalmazó kompozíciókat, a 35 vegyületek előállításához szolgáló intermediereket, valamint a vegyületek szintézisének módszerét dolgoztuk ki.

A találmány tehát olyan nukleotidanalóg vegyületek előállítására vonatkozik, amelyek körülbelül 6-200 bá40 zisból álló oligonukleozid-szekvenciákból állnak, és amelyekben háromatomos intemukleozidkötések találhatók. Az ilyen oligonukleozid-szekvenciák háromatomos intemukleozidkötése a

-D-D-D45 képlettel jellemezhető, ahol D mindegyike egymástól függetlenül CHR, NR⁶ képletű csoport vagy oxigénatom, ahol R jelentése hidrogénatom, OH, SH vagy NH₂ képletű csoport, R⁶ jelentése hidrogénatom vagy egy, vagy két szénatomos alkilcsoport, azzal a megkö50 téssel, hogy csak egy D csoport lehet oxigénatom vagy NR⁶ képletű csoport.

Egy előnyös kiviteli mód szerint az oligonukleozidszekvenciák adenin, citozin, guanin, uracil, timin bázisokat vagy ezek módosulatait tartalmazzák.

Közelebbről a találmány szerinti vegyületek (I) általános képletű oligonukleozid-szekvenciát tartalmaznak, ahol

W jelentése -D-D-D- képletű csoport, ahol D mindegyike egymástól függetlenül CHR vagy NR⁶ képletű csoport vagy oxigénatom, ahol R jelentése hidrogén3

HU 217 036 Β atom, OH, SH vagy NH₂ képletű csoport, R⁶ jelentése hidrogénatom vagy egy, vagy két szénatomos alkilcsoport, azzal a megkötéssel, hogy csak egy D jelenthet oxigénatomot vagy NR⁶ képletű csoportot,

W’ jelentése W vagy (a) képletű csoport,

R¹ jelentése OH, SH, NR²R³ képletű csoport, ahol R² és R³ jelentése hidrogénatom vagy 1-6 szénatomos alkilcsoport vagy NHR⁴ képletű csoport, ahol R⁴ jelentése 1-12 szénatomos acilcsoport,

Y jelentése hidrogénatom vagy hidroxilcsoport,

B jelentése adenin, citozin, guanin, timin, uracil vagy ezek módosulatai, j értéke 1-200, k értéke 0 vagy 1 -197, és q értéke 0 vagy 1-197, azzal a megkötéssel, hogy j+k+q összege körülbelül 4-200.

A találmány szerinti vegyületek olyan oligonukleotid vagy oligonukleozid-szekvenciákat tartalmaznak, amelyek adott esetben diolcsoportot tartalmaznak az egyik vagy mindkét végükön.

A diolok előnyösen 1,2-diolok (glikolok). Glikolok például a polialkilénglikolok, előnyösen polietilénglikolok vagy polipropilénglikolok. Előnyös glikolok a tetraetilénglikol és a hexaetilénglikol. Az alkalmas diolok lehetnek olyan poliolok is, amelyeknek a hidroxilcsoportjai kettő kivételével védettek.

Az olyan találmány szerinti vegyületek, amelyek az egyik vagy mindkét végükön diolcsoportot tartalmazó oligonukleozid-szekvenciákból állnak, a (II) általános képlettel jellemezhetők, ahol Z jelentése R’ vagy egy (b) általános képletű csoport, ahol

R¹ jelentése OH, SH, NHR²R³ képletű csoport, ahol R² és R³ jelentése hidrogénatom vagy 1 -6 szénatomos alkilcsoport vagy NHR⁴ képletű csoport, ahol R⁴ jelentése 1-12 szénatomos acilcsoport,

R⁵ jelentése hidrogénatom vagy 1-12 szénatomos alkilcsoport,

W, W’, Y, B, j, k és q jelentése a fenti, e és f értéke 0-50, azzal a megkötéssel, hogy e és f közül legalább az egyiknek az értéke 1, m és n értéke 1 -200, és p értéke 2-4.

A találmány szerinti megoldás egyik előnyös megvalósítási módja szerint j+k+q összege körülbelül 9-50 bázis, még előnyösebben körülbelül 12-25 bázis, legelőnyösebben 15-18 bázis. Ezen megvalósítási mód szerint a találmány szerinti vegyületek olyan nukleotidok, amelyek a (ΙΠ) általános képlettel jellemezhetők, ahol R jelentése OH, SH, NR²R³ képletű csoport, ahol R² és

R³ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy 1-6 szénatomos alkilcsoport, vagy NHR⁴ általános képletű csoport, ahol R⁴ jelentése 1-12 szénatomos acilcsoport,

R¹ jelentése hidrogénatom vagy 1-12 szénatomos alkilcsoport, oligo(N) jelentése egy natív vagy módosított, 9-200 bázisból álló oligonukleotid-szekvencia, e és f értéke egymástól függetlenül 0-50, azzal a megkötéssel, hogy legalább az egyikük értéke legalább 1, m és n értéke egymástól függetlenül 1 -200, és p értéke 2-4.

Egy előnyös megvalósítási mód szerint az oligonukleotid-szekvencia a dA, dC, dG és T bármely kombinációjának homopolimer vagy heteropolimer szekvenciája.

Az olyan vegyületek, ahol a glikol polietilénglikol, (IV) általános képlettel jellemezhető oligonukleotidok, ahol

R jelentése OH, SH, NR²R³ általános képletű csoport, ahol

R² és R³ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy 1-6 szénatomos alkilcsoport, vagy NHR⁴ általános képletű csoport, ahol R⁴ jelentése 1-12 szénatomos acilcsoport, oligo(N) jelentése körülbelül 9-50 bázisból álló oligonukleotid-szekvencia, e és f értéke egymástól függetlenül 0-50, azzal a megkötéssel, hogy legalább az egyikük értéke legalább 1, m és n értéke egymástól függetlenül 0-200, azzal a megkötéssel, hogy legalább az egyikük értéke

1-200.

A találmány szerinti oligonukleotidok tartalmazhatnak ismert intemukleozid-kötőcsoportokat, mint például foszfodiészter-, szilil- vagy más ismert kötőcsoportokat, azzal a feltétellel, hogy tartalmazzák a találmány szerinti -D-D-D— kötőcsoport hatásos mennyiségét és/vagy a találmány szerinti diói terminális csoportokat.

A találmány kiterjed az (V) általános képletű nukleozid dimerekre is, ahol

W jelentése -D-D-D- képletű csoport, ahol D mindegyike egymástól függetlenül CHR, NR⁶ általános képletű csoport vagy oxigénatom, ahol R jelentése hidrogénatom, OH, SH vagy NH₂ képletű csoport, R⁶ jelentése hidrogénatom vagy egy vagy két szénatomos alkilcsoport, azzal a megkötéssel, hogy csak egy D képvisel oxigénatomot vagy NR⁶ képletű csoportot,

B jelentése egymástól függetlenül adenin, citozin, guanin, timin, uracil vagy ezek módosulatai,

R⁷ jelentése hidroxil-, t-butil-dimetil-szilil-oxi- vagy foszforamiditcsoport,

R⁸ jelentése hidroxil- vagy t-butil-dimetil-szilil-oxi-csoport.

A találmány tárgya továbbá eljárás oligonukleozidszekvenciákat tartalmazó vegyületek nukleázok által történő lebontásának gátlására. Az eljárás értelmében az említett vegyület 5’- vagy 3’- végére vagy mindkét végére diolcsoportot kapcsolunk. A diolcsoportok kapcsolását úgy végezzük, hogy az oligonukleotid vegyületet egy alkoxi-tritil-diol-cianofoszfinnal, előnyösen dimetoxi-tritil-glikol-cianofoszfinnal vagy monometoxi-tritilglikol-cianofoszfinnal reagáltatjuk.

A találmány tárgya továbbá eljárás natív vagy módosított nukleotidszármazékok nukleázok okozta lebomlásának meggátlására. Az eljárás abban áll, hogy olyan oligonukleozid-szekvenciát készítünk, amely körülbelül 6-200 bázisból áll, és a fenti -D-D-D- képletű intemukleozidkötést tartalmazza.

HU 217 036 Β

A találmány szerinti vegyületek felhasználhatók olyan kompozíciók előállítására, amelyek a génexpreszszió meggátlására alkalmasak, és amelyek körülbelül 6-200 bázisból álló, a fenti háromatomos intemukleozidkötéseket tartalmazó oligonukleozid-szekvenciákat tartalmazzák fiziológiailag elfogadható hordozó mellett. A vegyületek egyik vagy mindkét végükön diolcsoportot tartalmazhatnak. Előnyös diolok a polietilénglikolok.

A génexpresszió gátlására szolgáló eljárás során az ilyen kezelésre szoruló emlősnek körülbelül 6-200 bázisból álló, a fenti háromatomos intemukleozidkötést tartalmazó nukleozidszekvenciából álló vegyületek hatásos mennyiségét adagoljuk. A vegyületek egyik vagy mindkét végükön diolcsoportot tartalmazhatnak. Előnyös diolok a polietilénglikolok.

- A mellékelt 1 a. ábra a (J) képletű nukleozid-aldehid előállításának szintézisútját mutatja;

- az lb. ábra a (K) képletű foszfónium-jodid-nukleozid előállításának szintézisútját mutatja;

- a 2. ábra egy három szénatomos intemukleozidkötéssel összekötött nukleoziddimer előállításának szintézisútját mutatja, amelyben az la., illetve lb. ábra szerinti nukleozid-aldehidet, illetve foszfónium-jodidnukleozidot alkalmazzuk;

- a 3. ábra egy timidindimer előállításának szintézisútját mutatja, amelyben timidin-aldehidet és foszfónium-jodid-timidint alkalmazunk [(J), illetve (K) képletű vegyületek];

- a 4. ábra egy két szénatomot és egy nitrogénatomot tartalmazó, 3’-C-C-N-5’ képletű, intemukleozidkötést tartalmazó nukleoziddimer előállításának szintézisútját mutatja. A dimert úgy állítjuk elő, hogy egy aldehidcsoportot tartalmazó nukleozidot egy amincsoportot tartalmazó nukleoziddal reagáltatunk redukáló körülmények között;

- az 5. ábra egy két szénatomot és egy nitrogénatomot tartalmazó, 3’-N-C-C-5’ képletű intemukleozidkötést tartalmazó nukleoziddimer előállításának szintézisútját mutatja. A dimereket úgy állítjuk elő, hogy egy aldehidcsoportot tartalmazó nukleozidot egy aminocsoportot tartalmazó nukleoziddal reagáltatunk redukáló körülmények között;

- a 6. ábra egy két szénatomot és egy nitrogénatomot tartalmazó, 3’-N-C-C-5’ képletű intemukleozidkötést tartalmazó timidindimer előállításának szintézisútját mutatja. A dimereket úgy állítjuk elő, hogy egy aldehidcsoportot tartalmazó timidint aminocsoportot tartalmazó timidinnel reagáltatunk reduktív körülmények között;

- a 7. ábra egy két szénatomot és egy nitrogénatomot tartalmazó, 3’-N-C-C-5’ képletű intemukleozidkötést tartalmazó timidindimer előállításának szintézisútját mutatja. A dimereket úgy állítjuk elő, hogy egy aldehidcsoportot tartalmazó timidint aminocsoportot tartalmazó timidinnel reagáltatunk reduktív körülmények között.

A találmány szerinti vegyületek olyan olígonukleotid- vagy oligonukleozid-szekvenciák, amelyek nukleázok által okozott lebomlásnak ellenállnak.

A „nukleozid” kifejezésen purin- vagy pirimídinbázis és egy 5 szénatomos cukor (pentóz) kombinációját értjük.

A „nukleotid” kifejezésen egy nukleozid foszforsav-észterét értjük.

Az „oligonukleotid” kifejezésen olyan polinukleotidokat értünk, amelyek csak foszfodiészter-intemukleozidkötéseket tartalmaznak, ilyenek például a natív DNS és RNS.

A nukleozidok például az adenozin (A), guanozin (G), citidin (C), uridin (U), dezoxiadenozin (dA), dezoxiguanozin (dG), dezoxicitidin (dC) és a timidin (T).

A találmány szerinti vegyületek körülbelül 6-200 bázisból álló oligonukleozid-szekvenciák, amelyek foszfodiészter-kötést vagy egy háromatomos intemukleozidkötést tartalmaznak. A háromatomos intemukleozidkötés (-D-D-D-) állhat: 1. három szénatomból, 2. két szénatomból és egy oxigénatomból vagy 3. két szénatomból és egy nitrogénatomból.

Az oligonukleozid-szekvenciák olyan szekvenciák, amelyek natív vagy módosított nukleozidokból állnak. Az „intemukleozidkötés” kifejezésen egy natív vagy módosított nukleozidban levő cukorcsoport hármas szénatomja és a szomszédos nukleozid cukorcsoportjának ötös szénatomja között hidat képező atomokat és molekulákat értjük. A cukorcsoport lehet ribóz vagy dezoxiribóz vagy ezek analógja. A nukleozidok tehát lehetnek A, C, G, U, dA, dC, dG, T vagy ezek módosulatai, például 5-bróm- vagy 5-jód-uracil, 5-metil-citozin, izocitozin (2-amino-4-oxo-pirimidin), izoguanin (2-oxo6-amino-purin), inozin (6-oxo-purin), 5-vinil-uracil és 5-vinil-citozin.

A háromatomos intemukleozidkötés képlete: -D-D-D-, ahol mindegyik D egymástól függetlenül CHR vagy NR⁶ általános képletű csoportot vagy oxigénatomot jelenthet, ahol R jelentése hidrogénatom, OH, SH vagy NH₂ csoport, R⁶ jelentése hidrogénatom vagy egy vagy két szénatomos alkilcsoport, azzal a megkötéssel, hogy legfeljebb egy D jelenthet oxigénatomot vagy NR⁶ képletű csoportot.

A találmány szerinti vegyületek tehát olyan oligonukleozid-szekvenciák, amelyek az (I) általános képlettel jellemezhetők, ahol

W jelentése -D-D-D- képletű csoport, ahol D mindegyike egymástól függetlenül CHR, NR⁶ általános képletű csoport vagy oxigénatom, ahol R jelentése hidrogénatom, OH, SH vagy NH₂ képletű csoport, R⁶ jelentése hidrogénatom vagy egy vagy két szénatomos alkilcsoport, azzal a megkötéssel, hogy csak egy D képvisel oxigénatomot vagy NR⁶ képletű csoportot,

W’ jelentése W vagy (a) képletű csoport,

R¹ jelentése OH, SH, NR²R³ általános képletű csoport, ahol R² és R³ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy 1-6 szénatomos alkilcsoport vagy NHR⁴ általános képletű csoport, ahol R⁴ jelentése 1-12 szénatomos acilcsoport,

Y jelentése hidrogénatom vagy hidroxilcsoport,

B jelentése egymástól függetlenül adenin, citozin, guanin, timin, uracil vagy ezek módosulatai,

HU 217 036 Β j értéke 1-200, k értéke 0 vagy 1 -197, és q értéke 0 vagy 1-197, azzal a megkötéssel, hogy j+k+q összege körülbelül 4-200.

Egy előnyös megvalósítási mód szerint j+k+q összege körülbelül 9-50. Még előnyösebben j+k+q összege körülbelül 12-25, és még ennél is előnyösebben 15-18.

A találmány szerinti vegyületekben az egyik vagy mindkét végen egy diolcsoport található. Előnyös diolok a glikolok vagy más néven 1,2-diolok, amelyek két szomszédos szénatomon két hidroxilcsoportot tartalmaznak. Előnyös glikolok a polialkilénglikolok. Az „alkilén” kifejezésen olyan egyenes vagy elágazó szénláncú csoportokat értünk, amelyek 2-4 szénatomot tartalmaznak, és amelyek adott esetben helyettesítve lehetnek. Ilyen csoportok például az etilén-, propilén- és izobutiléncsoport. Előnyös polialkilénglikolok a polietilénglíkolok, mint például a hexaetilénglikol és a tetraetilénglikol. Alkalmas diolok azok a poliolok is, amelyeknek a hidroxilcsoportjai kettő kivétellel védettek.

A diolok az oligonukleozid 5’- vagy 3’- vagy mindkét végéhez kapcsolódnak egy foszfodiészter-kötésen keresztül. Egy előnyös kiviteli mód szerint a diolok az oligonukleozid-szekvenciának csak az egyik végéhez kapcsolódnak.

A terminális diói a következő csoportok valamelyikéhez kapcsolódik: hidroxil- (OH), szulfhidril- (SH), amino- (NH₂), alkil-amino- (NH-alkil), dialkil-amino(N[alkil]₂) és amidocsoport (NHfacil]).

Ha a találmány szerinti vegyület egyik vagy mindkét végén glikolcsoport van jelen, akkor a találmány szerinti oligonukleozíd-szekvenciát a (II) általános képlet jellemzi, ahol

Z jelentése R’ vagy (b) általános képletű csoport, ahol

R¹ jelentése OH, SH, NHR²R³, ahol R² és R³ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy 1-6 szénatomos alkilcsoport vagy NHR⁴ általános képletű csoport, ahol R⁴ jelentése 1-12 szénatomos acilcsoport,

R⁵ jelentése hidrogénatom vagy 1-12 szénatomos alkilcsoport,

W, W’, Y, B, j, k és q jelentése a fenti, e és f értéke 0-50, azzal a megkötéssel, hogy e és f közül legalább az egyiknek az értéke 1, m és n értéke egymástól függetlenül 1-200, és p értéke 2-4.

Előnyös kiviteli mód szerint m és n értéke egymástól függetlenül 1-6 és j+k+q összege körülbelül 9-50. Egy még előnyösebb kiviteli mód szerint j+k+q összege körülbelül 12-25, még előnyösebben 15-18.

Egy másik előnyös megvalósítási mód szerint a találmány szerinti vegyületek olyan oligonukleotid-szekvenciák, amelyek körülbelül 9-200 bázisból állnak, és diolcsoportot tartalmaznak egyik vagy mindkét végükön. Egy további előnyös kiviteli mód szerint a találmány szerinti vegyületek olyan oligonukleotid-szekvenciák, amelyek körülbelül 9-200 bázisból állnak és egy (-D-D-D-) általános képletű kötést tartalmaznak.

Előnyös diolok a glikolok vagy más néven 1,2-diolok, amelyek két szomszédos szénatomon két hidroxilcsoportot tartalmaznak. Előnyös glikolok a polialkilénglikolok. Az „alkilén” kifejezésen egyenes vagy elágazó szénláncú, 2-4 szénatomos csoportokat értünk, amelyek adott esetben szubsztituenseket is tartalmazhatnak. Ilyen csoportok például az etilén, propilén és butilén. Előnyös polialkilénglikolok a polietilénglikolok. Még előnyösebbek a tetraetilénglikol és a hexaetilénglikol.

A diolok az oligonukleotidok 5’- vagy 3’- vagy mindkét végükhöz kapcsolódhatnak egy foszfodiészterkötésen keresztül. Egy előnyös kiviteli mód szerint a diolok az oligonukleotid-szekvenciának csak az egyik végéhez kapcsolódnak.

A terminális diói egy, a következőkben felsorolt csoporthoz kapcsolódik: hidroxil- (OH), szulfhidril- (SH), amino- (NH₂), alkil-amino- (NH-alkil), dialkil-amino(N[alkil]₂) és amidocsoport (NH[acil]). Az „alkil” kifejezésen egyenes vagy elágazó szénláncú, 1-12 szénatomos csoportokat értünk, amelyek adott esetben helyettesítőket is tartalmazhatnak. Előnyös alkil- és dialkilamino-csoportok például a metil-, etil-, propil-, butil-, pentil-, hexil-, dimetil-, dietil-, dipropil-, dibutil-, dipentil- és dihexil-aminok stb. Az „NH(acil)”, illetve az „amido” kifejezésen egyenes vagy elágazó szénláncú, 1-12 szénatomos, terminális CO-NH₂ csoportot tartalmazó csoportokat értünk. Amidocsoportok például a metánamid, etánamid, propánamid, butánamid, pentánamid, hexánamid, heptánamid, oktánamid, nonánamid, dekánamid, undekánamid és dodekánamid.

Egy előnyös kiviteli mód szerint a találmány szerinti vegyületek olyan oligonukleotidok, amelyeket a (III) általános képlet szemléltet, ahol

R jelentése OH, SH, NR²R³ képletű csoport, ahol R² és R³ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy 1 -6 szénatomos alkilcsoport vagy NHR⁴ általános képletű csoport, ahol R⁴ jelentése 1-12 szénatomos acilcsoport,

R¹ jelentése hidrogénatom vagy 1-12 szénatomos alkilcsoport, oligo(N) jelentése egy natív vagy módosított, 9-200 bázisból álló oligonukleotid-szekvencia, e és f értéke egymástól függetlenül 0-50, m és n értéke egymástól függetlenül 1 -200, és p értéke 2-4.

Az oligonukleotid-szekvencia előnyösen dA, dC, dG,

T vagy ezek analógjainak bármelyik kombinációját tartalmazó homopolimer vagy heteropolimer szekvencia.

Egy előnyös megvalósítási mód szerint m és n értéke egymástól függetlenül 1-8, még előnyösebben mind m, mind n értéke 4. Az előnyös oligonukleotid-szekvenciák körülbelül 9-50 bázist, előnyösebben 12-25 bázist, még előnyösebben 15-18 bázist tartalmaznak.

Egy előnyös kiviteli mód szerint az antiszensz vegyületek polietilénglikol-csoportokat tartalmaznak mind az 5’-, mind a 3’-végükön, és a (III) általános képlettel jellemezhetők, ahol

R jelentése OH, SH, NR²R³ képletű csoport, ahol R² és R³ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom

I

HU 217 036 Β vagy 1-6 szénatomos alkilcsoport vagy NHR⁴ általános képletű csoport, ahol R⁴ jelentése 1-12 szénatomos arilcsoport,

R¹ jelentése hidrogénatom vagy 1-12 szénatomos alkilcsoport, oligo(N) jelentése egy natív vagy módosított, 9-200 bázisból álló oligonukleotid-szekvencia, e és f értéke egymástól függetlenül 0-50, m és n értéke egymástól függetlenül 1 -200, és p értéke 2-4.

Ha a glikol polietilénglikol, a találmány szerinti vegyületek olyan oligonukleotidok, amelyeket a (IV) általános képlet szemléltet, ahol

R jelentése OH, SH, NR²R³ képletű csoport, ahol R² és R³ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy 1-6 szénatomos alkilcsoport vagy NHR⁴ általános képletű csoport, ahol R⁴ jelentése 1-12 szénatomos arilcsoport,

R¹ jelentése hidrogénatom vagy 1-12 szénatomos alkilcsoport, oligo(N) jelentése körülbelül 9-50 bázisból álló oligonukleotid-szekvencia, és e, f, m és n értéke egymástól függetlenül 1-50.

Egy előnyös kiviteli mód szerint az oligonukleotid dA, dC, dG, T bármilyen kombinációjának homopolimer vagy heteropolimer szekvenciáját tartalmazza.

Egy másik előnyös kiviteli mód szerint a találmány szerinti vegyület polietilénglikolként tetraetilénglikolt (TEG) tartalmaz, és mind m, mind n értéke 4, vagy hexaetilénglikolt tartalmaz, és mind m, mind n értéke 6.

A találmány szerinti vegyületek antiszensz ágensként alkalmazhatók. Az antiszensz ágensek egy célzott nukleinsavban levő komplementer nukleotidszekvenciával hibridizálódnak, és gátolják a megcélzott nukleinsav transzlációs vagy transzkripciós funkcióját. A megcélzott nukleinsav lehet RNS vagy DNS.

A találmány szerinti antiszensz vegyületek olyan, körülbelül 6-200 bázisból álló oligonukleotid-szekvenciák, amelyek adenin (A), citozin (C), guanin (G), uracil (U), timin (T) bázisok, és ezek módosulatai homopolimer vagy heteropolimer szekvenciájából állnak. A kérdéses szekvenciákat a kívánt megcélzott molekula bázisai határozzák meg. A kiválasztott szekvencia a megcélzott nukleinsawal hibridizálódik. Megcélzott nukleinsavak például az MYC onkogén, RAS onkogén és a virális nukleinsavak.

A találmány szerinti vegyületek a következő módszerekkel állíthatók elő:

A) Három szénatomos intemukleozidkötést tartalmazó vegyületek

Az olyan oligonukleozidokat, amelyek három szénatomból álló intemukleozidkötést tartalmaznak, úgy szintetizáljuk, hogy egy aldehidcsoportot tartalmazó nukleozidot Wittig-reakció körülményei között egy ilid funkciós csoportot tartalmazó nukleoziddal reagáltatunk. A nukleozidok ezeket a funkciós csoportokat a 3’-, illetve 6’-helyzetben tartalmazzák.

Egy nukleozid-aldehid és egy foszfónium-jodid-nukleozid kereskedelemben kapható vegyületekből történő szintézisét mutatja be az la. és lb. ábra. Az aldehidet (la. ábra, J vegyület) ismert 3’-allil-3’-dezoxi-5’-O-tercbutil-dimetil-szilil-3’-timidinből (la. ábra, A vegyület) szintetizáljuk. Az allilszármazékot regioszelektív módon, katalitikus mennyiségű ozmium-tetroxiddal és N5 metil-morfolin-oxiddal mint kooxidálószerrel oxidáljuk. A kapott dióit (la. ábra, B vegyület) nátrium-peijodáttal hasítjuk, így az aldehidet majdnem kvantitatív kitermeléssel kapjuk.

A foszfónium-jodid-nukleozidot (l.b. ábra, K ve10 gyület) kereskedelemben kapható 5 ’-tritilezett nukleozidból (lb. ábra, C vegyület) állítjuk elő. A tritilezett nukleozidot a 3’-helyzetben terc-butil-dimetil-szililkloriddal szililezzük, és a tritilcsoportot savas körülmények között hatékonyan eltávolítjuk. A kialakult primer hidroxilcsoportot (lb. ábra, E vegyület) Swem-reakciókörülményei között oxidáljuk, így egy aldehidet kapunk (lb. ábra, F vegyület). A nyers aldehidet azonnal reagáltatjuk a metil-trifenil-foszfónium-bromid ilidszármazékával, így 4’-vinil-4’-dezoxi-3’-terc-butil-dimetil20 szilil-nukleozidot kapunk jó kitermeléssel. A vinilszármazékot regioszelektív módon hidrobórozzuk, így jó kitermeléssel egy primer alkoholt kapunk (lb. ábra, G vegyület). A primer alkoholt azután trifenil-foszfmjodiddal, imidazol jelenlétében a megfelelő jodiddá ala25 kítjuk jó kitermeléssel. Végül a jodidot a kívánt foszfónium-jodid-nukleoziddá alakítjuk trifenil-foszfinnal acetonitrilben.

Az ilidet foszfónium-jodid-nukleozidból állítjuk elő bázisként kálium-terc-butoxidot alkalmazva, majd azon30 nal reagáltatjuk az aldehiddel, és így jó kitermeléssel kapunk Wittig-terméket (2. ábra, 1. vegyület). A kapott terméket 10%-os szénhordozós palládium jelenlétében hidrogénben, atmoszferikus nyomással regioszelektív módon hidrogénezzük, és így a kettős kötést kvantitatív kitermeléssel telítjük. A telített vegyületet (2. ábra, 2. vegyület) tetrabutil-ammónium-fluoriddal deszililezzük, így a dióit kapjuk (2. ábra, 3. vegyület). Ezután a diói 5’-primer hidroxilcsoportját regioszelektív módon dimetoxi-tritil-kloriddal védjük, és a kapott 3’-hidroxil-szár40 mazékot (3. ábra, 4. vegyület) 2-ciano-etil-N,N-diizopropil-klór-foszforamidittal foszforamidit-származékká alakítjuk (3. ábra, 5. vegyület).

A trialkil-szilil-oxi védőcsoportokat tartalmazó nukleozid dimereket vagy hosszabb oligomereket bármely kívánt hosszúságú oligonukleotiddá konjugáljuk. A láncmeghosszabbítás befejezése után az oligomerekről a védőcsoportokat ismert módon eltávolítjuk. Szilárd fázisos szintetizátorban végzett további lánchosszabbításhoz, ahol az oligomereket foszfátkötéssel kapcsoljuk, az oligomerek terminális 5’- és 3’-hidroxilcsoportjait tritilező reagenssel, például dimetoxi-tritil-kloriddal, valamint foszforamidittel alkalmas módon funkciós csoporttá alakítjuk.

B) Két szénatomot és egy oxigénatomot tartalmazó intemukleozidkötést tartalmazó vegyületek

Az olyan oligonukleozid-szekvenciákat, amelyek két szénatomból és egy oxigénatomból álló intemukleozidkötést tartalmaznak, úgy szintetizáljuk, hogy a 3’-szililezett, 5’-toluol-szulfonilezett nukleozidokat 5’-védett nukleozidokkal reagáltatjuk.

I

HU 217 036 Β

A 3’-acetiI-5’-aldehid nukleozidokat kereskedelemben kapható 3’-acetil-nukleozidokból ismert módon állítjuk elő. A 3’-acetil-5’-aldehid nukleozidot azután módosított Wittig-reakcióban 3’-acetil-5’-karbometoxi-metilén-nukleoziddá alakítjuk.

Az 5’-metilén-oldalláncot alkoholban, előnyösen izopropanolban nátrium-bór-hidriddel redukáljuk, majd a 3’-acetil-védőcsoportot alkoholban, előnyösen metanolban nátrium-metoxiddal távolítjuk el. A 3’-hidroxilcsoportot azután szililcsoporttal védjük. Szilil védőcsoportként előnyösen terc-butil-dimetil-szilil-csoportot alkalmazunk.

A 3’-szilil-5’-karbometoxi-metil-nukleozidot azután tetrahidrofuránban (THF) diizobutil-alumínium-hidriddel (DIBAL) a nukleozid 3’-O-szilil-5’-dezoxi-3’-(2”etanol)-származékává redukáljuk. Az 5’-etanolcsoportot piridinben p-toluolszulfonil-kloriddal p-toluolszulfonilcsoporttá alakítjuk. Az 5’-p-toluolszulfonil-nukleozid báziscsoportjának exociklusos aminocsoportját adott esetben ismert módon védjük. Az adenin és citozin exociklusos aminocsoportjának előnyös védőcsoportja a benzoilcsoport. A guanin exociklusos aminocsoportjának előnyös védőcsoportja az izobutilcsoport. A guanint az O⁶-helyzetben szintén védhetjük.

A 3’-O-szilil-5’-O-p-toluolszulfonil-nukleozidot azután 5’-védett nukleoziddal reagáltatjuk, így olyan 3’-O-szilil-5’-védett nukleoziddimert kapunk, amely egy 2 szénatomból és 1 oxigénatomból álló intemukleozidkötést tartalmaz. Az 5’-O-védőcsoport előnyösen tritilcsoport, még előnyösebben dimetoxi-tritil-csoport. A 3’-O-szilil-5’-O-védett nukleozidbázis csoportjának exociklusos aminocsoportját adott esetben védhetjük.

A nukleoziddimerekről a védőcsoportokat eltávolítjuk, és a szilárd fázisú, láncmeghosszabbító foszforamidit-módszerben történő felhasználáshoz egy cianofoszfin-reagenssel, előnyösen 2-ciano-etoxi-diizopropil-amino-foszfinnal reagáltatjuk (Gait, idézett helyen).

A trialkil-szilil-oxi-védőcsoportokat tartalmazó nukleoziddimereket vagy hosszabb oligomereket bármely kívánt hosszúságú oligonukleozidokká konjugáljuk.

A trialkil-szilil-oxi védőcsoportokat tartalmazó nukleoziddimereket vagy hosszabb oligomereket bármely kívánt hosszúságú oligonukleotiddá konjugáljuk. A láncmeghosszabbítás befejezése után az oligomerekről a védőcsoportokat ismert módon eltávolítjuk. Szilárd fázisos szintetizátorban végzett további lánchosszabbításhoz, ahol az oligomereket foszfátkötéssel kapcsoljuk, az oligomerek terminális 5’- és 3’-hidroxilcsoportjait tritilező reagenssel, például dimetoxi-tritil-kloriddal, valamint foszforamidittel alkalmas módon funkciós csoporttá alakítjuk.

C) Két szénatomból és egy nitrogénatomból álló intemukleozidkötéseket tartalmazó vegyületek

A két szénatomból és egy nitrogénatomból álló internukleozidkötéseket tartalmazó oligonukleozid-szekvenciákat úgy szintetizáljuk, hogy az aldehidcsoportokat tartalmazó nukleozidokat redukáló körülmények között amincsoportokat tartalmazó nukleozidokkal reagáltatjuk, amint ezt a 4. ábrán bemutatjuk.

Mind az aldehid-, mind az aminszármazékok kereskedelemben kapható vegyületekből állíthatók elő. Az aldehidszármazékokat 3’-allil-3’-dezoxi-5’-O-terc-butildimetil-szilil-timidinből állítjuk elő. Az allilcsoportot katalitikus mennyiségű ozmium-tetroxiddal, N-metilmorfolin-N-oxid jelenlétében regioszelektív módon oxidáljuk, így egy diolszármazékot kapunk. A diolszármazékot azután nátrium-peijodáttal oxidáljuk, így az aldehidszármazékot majdnem kvantitatív kitermeléssel kapjuk.

Az aminszármazékot kereskedelemben kapható nukleozidokból szintetizáljuk. Általában úgy járunk el, hogy a nukleozid primer hidroxilcsoportját regioszelektív módon p-toluolszulfonil-kloriddal tozilátcsoporttá, majd jodiddá alakítjuk. A jodidszármazék intermedier 3’-hidroxilcsoportját terc-butil-dimetil-szilil-kloriddal védjük, és nátrium-aziddal reagáltatva egy azidocsoportot viszünk be. Az azidocsoportot 10%-os szénhordozós palládiummal hidrogénatmoszférában vagy Raney-nik20 kellel redukciós körülmények között amincsoporttá redukáljuk.

Az aminszármazékot és az aldehidszármazékot azután puffereit körülmények között, nátrium-ciano-bórhidrid jelenlétében kapcsoljuk (reduktív aminálás).

A két szénatomból és egy nitrogénatomból álló internukleozidkötést tartalmazó oligonukleozid dimer jó kitermeléssel képződik. Az oligonukleozidot trifluorecetsavanhidrid-trietil-aminnal reagáltatva védjük a szekunder alifás nitrogént. A védett oligonukleozidról a szililcsoportot tetrabutil-ammónium-fluoriddal távolítjuk el, és a kapott diolszármazék primer hidroxilcsoportját szelektíven védjük dimetoxi-tritil-kloriddal. A szekunder hidroxilcsoportot 2-ciano-etil-N,N-diizopropil-klór-foszforamidittel reagáltatva a kívánt fosz35 foramidittá alakítjuk.

A két szénatomból és egy nitrogénatomból álló intemukleozidkötést tartalmazó oligonukleozidokat úgy szintetizáljuk, hogy az aldehidcsoportot tartalmazó nukleozidokat a 3’- és 5’-helyzetben amincsoportokat tartal40 mazó nukleozidokkal reagáltatjuk redukáló körülmények között, ahogyan az 5. ábrán bemutatjuk.

Az amin- és aldehidszármazékokat kereskedelemben kapható vegyületekből szintetizáljuk. Az aminszármazékot 3-azido-3-dezoxi-timídínből (AZT) szinteti45 záljuk. Az AZT primer hidroxilcsoportját dimetoxi-tritil-kloriddal védjük, és a kapott azidot regioszelektív módon a kívánt aminná alakítjuk 10%-os szénhordozós palládium segítségével vagy Raney-nikkellel hidrogénatmoszérában.

Az aldehidet kereskedelemben kapható 5’-O-dimetoxí-tritil-timidinből szintetizáljuk. A tritilezett timidint terc-butil-szilil-kloriddal szililezzük, és a tritilcsoportot savas körülmények között eltávolítjuk. A kapott primer hidroxilcsoportot Swern-körülmények között aldehidcsoporttá oxidáljuk. A kapott aldehidszármazékot izolálás nélkül azonnal (karbetoxi-metilén)-trifenilfoszforánnal reagáltatjuk, így a telítetlen észtert kapjuk. A telítetlen észtert regioszelektív módon 10%-os szénhordozós palládium jelenlétében hidrogénezzük, így kvantitatív kitermeléssel kapjuk a telített észtert. A te8

I

HU 217 036 Β lített észtert azután diizobutil-alumínium-hidriddel (DIBAL-H) nagy szelektivitással a kívánt aldehiddé alakítjuk.

Az amint és az aldehidet nátrium-ciano-bór-hidrid jelenlétében, reduktív aminálási körülmények között kapcsoljuk. Az egy nitrogénatomból és két szénatomból álló intemukleozidkötést jó kitermeléssel kapjuk. Az oligonukleozid szekunder alifás nitrogénjét trifluorecetsavanhidriddel és trietil-aminnal védjük. A védett dimert vagy hosszabb oligonukleozid-szekvenciát deszililezzük, és a kapott hidroxilcsoportot 2-ciano-etilΝ,Ν-diizopropil-klór-foszforamidittal foszforamidittá alakítjuk.

A trialkil-szilil-oxi-védőcsoportokat tartalmazó nukleoziddimereket vagy hosszabb oligomereket bármely kívánt hosszúságú oligonukleotiddá konjugálhatjuk. A láncmeghosszabbítás befejezése után az oligomerekről a védőcsoportokat ismert módon eltávolítjuk. Szilárd fázisos szintetizátorban végzett további lánchosszabbításhoz, ahol az oligomereket foszfátkötéssel kapcsoljuk, az oligomerek terminális 5’- és 3’-hidroxilcsoportjait tritilező reagenssel, például dimetoxi-tritil-kloriddal, valamint foszforamidittel alkalmas módon funkciós csoporttá alakítjuk.

D) Egyik vagy mindkét végükön diolcsoportot tartalmazó vegyületek

Kívánt esetben a szilárd fázisú foszforamidit-módszer módosításaképpen a vegyületek egyik vagy mindkét végéhez diolcsoportot kapcsolhatunk [(Oligonucleotide Synthesis; A Practical Approach, szerk. M. J. Gait, 35-81. oldal, IRL Press, Washington, D. C. (1984)].

Ennek megfelelően a szilárd fázisú módszert úgy módosítjuk, hogy az oligonukleotid egyik vagy mindkét végére diolcsoportot kapcsolunk. A dióit egy alkoxi-tritil-származékkal reagáltatjuk, így tritilezett diolszármazékot kapunk. Diolvegyületként előnyösen glikolt, előnyösebben polialkilénglikolt alkalmazunk. Alkoxi-tritilreagensként előnyösen monometoxi-tritil-kloridot vagy dimetoxi-tritil-kloridot, még előnyösebben dimetoxitritil-kloridot alkalmazunk. A tritilezett diolokat azután egy ciano-foszfin-reagenssel reagáltatjuk, így egy tritildiol-ciano-foszfin-származékot kapunk, amelyet foszforamidit-reagensként (a továbbiakban „diol-foszforamidit-reagens”) alkalmazunk a találmány szerinti vegyületek szilárd fázisú szintézisében.

A szilárd fázisú szintézis első lépéseként a nukleozidot egy szilárd hordozóhoz, előnyösen szabályozott pórusméretű üveghordozóhoz (CPG) kapcsoljuk. A nukleozidot a CPG-hez előnyösen egy a nukleozid3’-hidroxil-helyzeténél levő szukcinátkötésen keresztül kapcsoljuk. A kapcsolást más, az oligonukleotid-szintézisben ismert módszerrel is végezhetjük. A diolcsoport 3'-terminálisra történő kapcsolását úgy is végezhetjük, hogy egy diol-foszforamidit-reagenst kapcsolunk a szilárd hordozóhoz az első nukleozid adagolása előtt. A diol-foszforamidit-reagenst a szilárd hordozóhoz egy szukcínát-, a nukleozid kapcsolásánál alkalmazott kötéssel kapcsoljuk a szilárd hordozóhoz. Az első nukleozíd adagolása előtt a szilárd fázisra bármely mennyiségű dióit helyezhetünk. Előnyösen 1-50 dióit alkalmazunk. Ha a diolokat csak az 5'-terminálishoz kapcsoljuk, akkor a szilárd hordozóra nem helyezünk dióit.

Az első nukleozid vagy a diolok szilárd hordozóhoz való kapcsolása után a lánchosszabbítást a következő lépéssorozattal végezzük: eltávolítjuk az 5’-hidroxilvédőcsoportot (funkcionalízált tritílcsoportot), aktiváljuk az 5’-hidroxilcsoportot egy foszforamidit-reagens, azaz egy 5’-tritil-nukleozid-3’-foszforamídit jelenlétében, az el nem reagált nukleozidot kapcsoljuk és a fosz10 forkötést oxidáljuk.

A kapcsolt nukleozidok 5’-hidroxilcsoportjának védőcsoportját savval, előnyösen triklór-ecetsawal eltávolítjuk.

A módszerben aktiválóreagensként ismert reagense15 két használunk. Előnyös aktiválóreagensek a tetrazol és az aktiválóarany (Beckman Instr. Inc., Palo Alto, CA).

Az aktiválási lépést az adagolt nukleozid-foszforamidit-reagens vagy diol-foszforamidit-reagens jelenlétében végezzük, amely utóbbi reagens helyett az ismert szintézismódszerek szerinti nukleozid-foszforamiditreagenst alkalmazzuk, ha a dióit a polinukleotid terminálisához adagoljuk. Az el nem reagált láncokat egy lezáróreagenssel, például ecetsavanhidriddel és N-metil-imidazollal lezárjuk.

A labilis háromértékű foszforkötést ha stabil, az oligonukleotid ötértékű foszfodiészter-kötésévé oxidáljuk előnyösen jóddal.

Miután a kívánt hosszúságú oligonukleotid-láncot megkaptuk, a foszfát védőcsoportokat eltávolítjuk, a láncokat elválasztjuk a szilárd hordozóról, és a bázisvédőcsoportokat ismert módon eltávolítjuk (Gaits, idézett helyen 67-70. oldal).

Szakember számára kézenfekvő, hogy terminális diolcsoportokat tartalmazó antiszensz oligonukleotidok az oligonukleotidok szintézisének más módszerével is előállíthatok.

A találmány szerinti vegyületek alkalmazhatók emlősöknek örökletes rendellenességeinek vagy megváltozott génexpressziós mechanizmusával kapcsolatos be40 tegségeinek kezelésére. Kísérletek folynak vírusfertőzések, például HÍV, citomegalovlrus, herpesz szimplex, hepatitis B, papilomavírus és pikomavírus, valamint a tüdő-, vastagbél-, méhnyak-, emlő- és petefészekrák, továbbá gyulladásos betegségek és az immunrendszer betegségei, mint például szerzett immunhiányos tünetek (AIDS), hematológiás neoplazma és hiperproliferatív rendellenességek antiszensz terápiájának kidolgozására [Armstrong, idézett helyen 89. oldal; Klausner idézett helyen 303-304. oldal].

A találmány szerinti, a génexpresszió gátlására alkalmas készítmények fiziológiásán elfogadható hordozó mellett körülbelül 6-200 bázisból álló, -D-D-D- képletű intemukleozidkötést tartalmazó, és adott esetben egyik vagy mindkét végükön diolcsoportot tartalmazó oligonukleozid-szekvenciákat tartalmazó vegyületeket, vagy körülbelül 9-200 bázisból álló, és az egyik vagy mindkét végükön diolcsoportot tartalmazó oligonukleozid-szekvenciákból álló vegyületeket tartalmaznak.

A génexpresszió gátlására alkalmas kompozíciók egy vagy több, a találmány szerinti vegyületet tartalmaz9

I

HU 217 036 Β nak egy vagy több nem toxikus, fiziológiásán elfogadható hordozóval, adjuvánssal vagy vivőanyaggal együtt, amelyeket együttesen hordozónak nevezünk, parenterális injekció, szilárd vagy folyékony formában orális adagolásra szolgáló, rektális vagy topikális adagolásra alkalmas formában.

A kompozíciót embereknek és állatoknak adagolhatjuk orálisan, rektálisan, parenterálisan (intravénásán, intramuszkulárisan vagy szubkután), intracisztemálisan, intravaginálisan, intraperitoneálisan, lokálisan (porok, kenőcsök vagy cseppek formájában) vagy szájvagy orrspray formájában.

A parenterális injektálásra szolgáló kompozíciók lehetnek fiziológiásán elfogadható steril vizes vagy nemvizes oldatok, diszperziók, szuszpenziók vagy emulziók, vagy steril porok, steril injektálható oldatok vagy diszperziók formájába történő rekonstituáláshoz. Alkalmas vizes vagy nemvizes hordozók, hígítószerek, oldószerek vagy vivőanyagok például a víz, etanol, poliolok (propilénglikol, polietilénglikol, glicerin stb.), ezek alkalmas elegye, növényi olajok (például olívaolaj) és injektálható szerves észterek, például etil-oleát. A megfelelő folyékonyság például úgy tartható fenn, hogy egy bevonóanyagot, például lecitint alkalmazunk, vagy diszperziók esetén a kívánt részecskeméretet állítjuk be, vagy felületaktív anyagot alkalmazunk.

A kompozíciók tartalmazhatnak további segédanyagokat is, például konzerválóanyagokat, nedvesítőszereket, emulgeálószereket és diszpergálószereket. A mikroorganizmusok hatását különböző antibakteriális és antifungális szerek, például paraben, klór-butanol, fenol, szorbinsav stb. alkalmazásával előzhetjük meg. Kívánt esetben izotóniát biztosító szereket, például cukrokat, nátrium-kloridot stb. is alkalmazhatunk. Az injektálható készítmények meghosszabbított abszorpcióját az abszorpció elnyújtását biztosító szerek, például alumínium-monosztearát és zselatin alkalmazásával biztosíthatjuk.

Kívánt esetben a hatékonyabb eloszlás biztosítására a vegyületeket lassú leadást biztosító vagy célba juttató rendszerekbe, például polimer hordozóba, liposzómákba vagy mikrogömböcskékbe zárhatjuk. Ezeket sterilezhetjük, például baktérium-visszatartó szűrőkön történő szűréssel vagy steril szilárd kompozíciók formájában, amelyek steril vízzel vagy más steril injektálható közeggel oldhatók közvetlenül az alkalmazás előtt.

Orális adagolásra szolgáló szilárd készítmények lehetnek kapszulák, tabletták, pirulák, porok és granulátumok. Ezek készítése során a hatóanyagot legalább egy szokásos inért segédanyaggal (vagy hordozóanyaggal), például nátrium-citráttal vagy dikalcium-foszfáttal, vagy (a) töltőanyaggal, például keményítővel, laktózzal, szacharózzal, glükózzal, mannittal és kovasavval, (b) kötőanyaggal, például karboxi-metil-cellulózzal, algináttal, zselatinnal, poli(vinil-pirrolidon)-nal, szacharózzal és akáciával, (c) nedvesítőszerrel, például glicerinnel, (d) dezintegrálószerrel, például agar-agarral, kalcium-karbonáttal, burgonya- vagy tapiókakeményítővel, alginsawal, szilikátok és nátrium-karbonát bizonyos komplexeivel, (e) oldódáslassítókkal, például paraffinnal, (f) abszorpció-elősegítő szerekkel, például kvaterner amtnónium-származékokkal, (g) nedvesítőszerekkel, például cetil-alkohollal és glicerin-monosztearáttal, (h) abszorbeálószerekkel, például kaolinnal és bentonittal, (i) síko5 sítóanyagokkal, például talkummal, kalcium-sztearáttal, magnézium-sztearáttal, szilárd polietilénglikollal, nátrium-lauril-szulfáttal vagy ezek elegyével keveijük. Kapszulák, tabletták és pirulák esetén az adagolási formák puffért is tartalmazhatnak.

Hasonló típusú szilárd kompozíciókat lágy vagy kemény zselatinkapszulákba is tölthetünk, ilyenkor laktózt vagy tejcukrot, valamint nagy molekulatömegű polietilénglikolokat stb. alkalmazunk ségédanyagként.

A szilárd adagolási formákat, például tablettákat, drazsékat, kapszulákat, pirulákat és granulátumokat bevonatokkal, például enterális bevonatokkal vagy más ismert bevonatokkal láthatjuk el. Ezek tartalmazhatnak opacitást biztosító szereket, és lehetnek olyan kompozíciók is, amelyek a hatóanyagot vagy hatóanyagokat az intesztinális traktus egy bizonyos részén késleltetett módon adják le. E célra alkalmazható kompozíciók a polimerek és a viaszok.

A hatóanyagokat egy vagy több fenti segédanyaggal együtt mikrokapszulázhatjuk is.

Orális adagolásra szolgáló folyékony készítmények lehetnek a fiziológiásán elfogadható emulziók, oldatok, szuszpenziók, szirupok és elixírek. A hatóanyag mellett a folyékony adagolási fonnák tartalmazhatnak szokásosan alkalmazott inért hígítószereket, például vizet vagy más oldószereket, szolubilizálószereket és emulgeátorokat, például etil-alkoholt, izopropil-alkoholt, etil-karbonátot, etil-acetátot, benzil-alkoholt, benzil-benzoátot, propilén-glikolt, 1,3-butilénglikolt, dimetil-formamidot, olajokat, különösen gyapotmagolajat, földimogyoró-ola35 jat, kukoricacsíra-olajat, olívaolajat, ricinusolajat és szezámolajat, glicerint, tetrahidrofúríúril-alkoholt, polietilénglikolokat és szorbitán zsírsavésztereit vagy ezek elegyét.

Az inért hígítóanyagok mellett a kompozíció tartal40 mazhat adjuválószereket is, például nedvesítőszereket, emulgeálószereket és szuszpendálószereket, édesítőszereket és íz- és zamatanyagokat.

A szuszpenziók a hatóanyag mellett tartalmazhatnak szuszpendálószereket, például etoxilezett izosztearil-al45 koholokat, polioxietilén-szorbitot és szorbitán-észtereket, mikrokristályos cellulózt, alumínium-metahidroxidot, bentonitot, agar-agart és tragakantot vagy ezek elegyét.

A rektális adagolásra szánt kompozíciók előnyösen a kúpok, amelyeket úgy állítunk elő, hogy a találmány szerinti vegyületeket alkalmas nem irritáló segédanyagokkal vagy vivőanyagokkal, például kakaóvajjal, políetilénglikollal vagy kúpok készítéséhez alkalmas viaszszal keverjük, amelyek normál hőmérsékleten szilár55 dák, testhőmérsékleten azonban folyékonyak, így a végbélben vagy a hüvelyben megolvadva leadják a hatóanyagot.

A találmány szerinti vegyületek helyi adagolására szolgáló készítmények a kenőcsök, porok, permetek és inhalálószerek. A hatóanyagot steril körülmények kö10

HU 217 036 Β zött fiziológiásán elfogadható vivőanyaggal és szükséges konzerválószerekkel, pufferekkel vagy kívánt esetben hajtóanyagokkal keverjük. Szemgyógyászati készítmények, szemcseppek, porok és oldatok szintén a találmány tárgykörébe tartoznak.

A találmány szerinti vegyületeket liposzómák formájában is adagolhatjuk. Mint ismeretes, a liposzómákat általában foszfolipidekből vagy más lipidekből készítjük. A liposzómákat mono- vagy multilamelláris hidratált folyékony kristályok formájában készítjük, amelyeket vizes közegben diszpergálunk. Bármely nem toxikus, fiziológiásán elfogadható és metabolizálható lipid alkalmazható, amely képes liposzómákat képezni. A találmány szerinti kompozíciók líposzóma formájában a lipoxigenáz gátló vegyületek mellett tartalmazhatnak stabilizálószereket, konzerválószereket, segédanyagokat stb. Lipidként előnyösen foszfolipideket és foszfatidilkolinokat (lecitineket) alkalmazunk, amelyek lehetnek természetes vagy szintetikus eredetűek.

A liposzómákat ismert módon készítjük [lásd például Methods in Cell Biology, szerk. Prescott, XIV. kötet, Academic Press, New York, Ν. Y., 33. oldaltól (1976)].

A találmány szerinti kompozíciók hatóanyag-tartalmát úgy állítjuk be, hogy az az adott kompozíció és adagolási mód esetén a kívánt terápiás hatás biztosítására szolgáló hatékony mennyiséget tartalmazza. Az adagolás mennyisége tehát függ a kívánt terápiás hatástól, az adagolás módjától, a kezelés tartamától és más tényezőktől.

A találmány szerinti vegyületek teljes napi dózisa - egyetlen vagy több adagban - lehet például testtömegkilogrammonként 1 nmol és 5 pmol közötti. A kompozíció adagolási egységei ilyen mennyiséget vagy ennek töredékeit tartalmazhatják. Az adagolás mértéke azonban az egyes betegek esetén különböző tényezőktől függ, így a testtömegtől, általános egészségi állapottól, nemtől, diétától, az adagolás idejétől és módjától, az abszorpció és kiválasztás sebességétől, más hatóanyagokkal való kombinálástól, valamint a kezelendő betegség súlyosságától.

A találmány szerinti megoldást a következő példákkal szemléltetjük a korlátozás szándéka nélkül.

1. példa

5-0 ’-Dimetoxi-tritil-3-Ο ’-t-butil-dimetil-szililtimidin előállítása

5,0 g (9,2 mmol) dimetoxi-tritil-timidint és 1,2 g (18,4 mmol) imidazolt feloldunk 15 ml vízmentes dimetil-formamidban (DMF), és hozzáadjuk 1,7 g (11,7 mmol) terc-butil-dimetil-szilil-kloridhoz. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 4 óra hosszat keverjük, etil-acetáttal hígítjuk és vízzel, telített nátrium-kloriddal mossuk, majd nátrium-szulfáton szárítjuk. A cím szerinti vegyületet kvantitatív kitermeléssel kapjuk.

2. példa ’-O-t-Butil-dimetil-szilil-timidin előállítása

0,7 g (1,1 mmol) az 1. példa szerint előállított 5O’-dimetoxi-tritil-3-O’-t-butil-dimetil-szilil-timidint 1 óra hosszat szobahőmérsékleten 13 ml 3 tömeg/térfogat%-os metilén-kloridos triklór-ecetsav-oldattal kezelünk. A reakcióelegyet 5 tömeg/térfogat%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal semlegesítjük. A szerves fázist nátrium-szulfáton megszárítjuk. A cím szerinti vegyületet gyorskromatográfiával tisztítjuk, metilénkloridban 0 térfogat%-tól 30 térfogat%-ig változó etilacetát gradienst alkalmazva. Kitermelés: 85%.

3. példa ’-O-t-Butil-dimetil-szilil-timidin-4 ’-aldehid előállítása

Vízmentes metilén-kloridhoz -78 °C-on, erőteljes keverés közben hozzáadunk 2,88 ml (33,0 mmol) oxalilkloridot, majd cseppenként 3,12 ml (4,4 mmol) DMSO-t. 10 perc múlva, cseppenként, 2 perc alatt hozzáadjuk a 2. példa szerint készített 5,6 g (15,7 mmol) alkohol 20 ml diklór-metánnal készült oldatát, és a keverést további 45 percig folytatjuk. Ezután hozzáadunk 8,1 ml (58,1 mmol) trietil-amint, és a keverést további 45 percig folytatjuk. Ezután a reakcióelegyet szobahőmérsékletre hűtjük, és kétszer 10 ml vízzel, majd 10 ml sós vízzel mossuk és nátrium-szulfáton szárítjuk. A kapott nyers aldehidet a következő lépésben felhasználjuk.

4. példa ’-Vinil-5 ’-dezoxi-3 ’-t-butil-dimetil-szilil-timidindezoxi-timidin előállítása

0,7 mmol metil-trifenil-foszfónium-bromid vízmentes tetrahidroíüránnal (THF) készült oldatához 0 °C-on cseppenként hozzáadjuk 0,6 mmol nátrium-bisz(trimetil-szilil-amid) oldatát. 30 perc múlva nitrogénatmoszférában cseppenként hozzáadjuk a megfelelő 4’-aldehid THF-fel készült oldatát. A reakcióelegyet 2 óra hosszat keverjük, majd etil-acetáttal hígítjuk, vízzel, majd sós vízzel mossuk és nátrium-szulfáton megszárítjuk. A cím szerinti vegyületet gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószerként 20 térfogat% etil-acetátot tartalmazó hexánt alkalmazunk. Kitermelés: 55-60%.

5. példa ’-O-t-Butil-dimetil-szilil-timidin-5 ’-dezoxi-5 ’hidroxi-metil-timidin előállítása

2-Metil-2-butén (1,6 ekvivalens, 1,5 ml, 3 mmol) 3 ml vízmentes THF-nal készült 2 mol/l-es oldatához 0 °C-on, nitrogénatmoszférában lassan hozzáadunk 1,6 ekvivalens 1 mólos borán-tetrahidrofurán-komplexet (3 ml, 2 mmol). Az oldatot 10 percig keveijük, majd hozzáadunk 0,7 g (1,9 mmol) a 4. példa szerint készített vinil-timidint 4 ml vízmentes THF-ban. A reakcióelegyet 45 percig keverjük, majd 2 napig hűtőbe helyezzük. A feldolgozást 3,1 ekvivalens 2 mol/l-es nátrium-hidroxid és 3,1 ekvivalens 30 térfogat%-os hidrogén-peroxid vizes oldatával végezzük (amelyet előnyösen úgy készítünk, hogy a hidrogén-peroxidot cseppenként, 0 °C-on, keverés közben 10 perc alatt adjuk hozzá a vizes nátrium-hidroxidhoz). Az oldatot 0 °C-on, egy adagolótölcséren keresztül lassan adjuk hozzá a reakcióelegyhez, majd 1 óra hosszat keveijük, ezután a jeges fürdőt eltávolítjuk, a reakcióelegyet etil-acetáttal hígítjuk, vízzel és telített nátrium-klorid-oldattal mossuk, és nátrium-szul11

I

HU 217 036 Β fáton megszárítjuk. A cím szerinti vegyületet gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószerként etil-acetát 20 térfogat%-ról 80 térfogat%-ra változó gradiensét alkalmazzuk hexánban. Kitermelés: 62%.

6. példa '-Jód-metil-5 ’-dezoxi-3 ’-O-t-butil-dimetil-szililtimidin előállítása

0,3 g (0,9 mmol) az 5. példa szerint előállított 3’O-t-butil-dimetil-szilil-timidin-5 ’ -dezoxi-5 ’ -hidroximetil-timidin 5 ml vízmentes acetonitrillel és 3,4 ml éterrel készült oldatához hozzáadunk 3 ekvivalens (0,7 g, 2,8 mmol) trifenil-foszfint, 4 ekvivalens (0,3 g, 3,7 mmol) imidazolt és 2,2 ekvivalens (0,5 g, 2,8 mmol) jódot. A reakcióelegyet 45 percig keverjük, majd az oldószert ledesztilláljuk. A maradékhoz etil-acetátot adunk, és vízzel, majd telített nátrium-klorid-oldattal mossuk és nátrium-szulfáton megszárítjuk. A cím szerinti vegyületet gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószerként etil-acetát 30 térfogat%-ról 50 térfogat%-ra változó gradiensét tartalmazó hexánt alkalmazunk. Kitermelés: 90%.

7. példa '-O-t-butil-dimetil-szilil-5 ’-dezoxi-5 ’-timidil-metil-foszfónium-jodid előállítása

480 mg (1 mmol) a 6. példa szerint előállított 5’jód-metil-5’-dezoxi-3’-O-t-butil-dimetil-szilil-timidin 5 ml vízmentes cianometánnal készült oldatához keverés közben hozzáadunk 1,57 g (6 mmol) trifenil-foszfint, és az elegyet 12 óra hosszat 90 °C-on visszafolyató hűtő alatt forraljuk. Ezután a reakcióelegyet lehűtjük, és az oldószert eltávolítjuk. A cím szerinti vegyületet gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószerként 5 térfogat% metanolt tartalmazó diklór-metánt használunk. Kitermelés: 95-96%.

8. példa ’-O-t-Butil-dimetil-szilil-3 ’-dezoxi-3 '-(1 ”,2”dihidroxi-3 -propil)-timidin előállítása csepp (2,5 tömeg/térfogat%) ozmium-tetroxid (OsO₄) butanollal készült oldatát keverés közben hozzáadjuk 183 mg (0,5 mmol) 3’-(2”-propenil)-3’-dezoxi-5’O-t-butil-dimetil-szilil-timidin [amelyet C. K. Chu és munkatársai a J. Org. Chem. 54, 2767-2769, (1989)] szerinti módon állítottunk elő, és 53 mg (0,45 mmol) 4-metil-morfolin-N-oxid 5,0 ml vízmentes THF-nal készült oldatához, 0 °C-on. A reakcióelegyet ezután 2,0 ml 10%-os vizes nátrium-meta-biszulfittal hígítjuk, 20 percig keveijük, majd szilícium-oxidon leszűijük és 25 ml etil-acetáttal hígítjuk. A szerves fázist 5 ml vízzel és sós vízzel mossuk, majd nátrium-szulfáton megszárítjuk. Az oldószert eltávolítjuk, és a cím szerinti vegyületet gyors kromatográfiával tisztítjuk.

9. példa ’-O-t-Butil-dimetil-szilil-3 ’-dezoxi-timid-3 ’-ilacetaldehid előállítása

214 mg (1 mmol) nátrium-peijodátot keverés közben hozzáadunk 200 mg (0,5 mmol) a 2. példa szerint előállított timidin-diol 5 ml, 4:1 térfogatarányú THF és víz elegyével készült oldatához. 1 óra múlva a reakcióelegyet 25 ml etil-acetáttal hígítjuk, kétszer 5 ml vízzel, majd sós vízzel mossuk és megszárítjuk. A cím szerinti vegyületet gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószerként 70 térfogat% etil-acetátot tartalmazó hexánt alkalmazunk.

10. példa

Három szén internukleozidkötést tartalmazó timidindimerek előállítása

A 10a-lOe. példák szerinti eljárásokat a 3. ábra mutatja be.

10a. 241 mg (0,326 mmol) a 7. példa szerint előállított foszfónium-jodid 2,0 ml vízmentes THF-nal készült szuszpenziójához keverés közben, nitrogénatmoszférában, -78 °C-on hozzáadunk 0,62 ml, 1,0 mol/l-es, THF-os kálium-tere-butoxid-oldatot (0,62 mmol). 20 perc múlva hozzáadunk 80 mg (0,22 mmol) a 9. példa szerint előállított 3’-acetaldehid-származékot. 60 perc múlva a reakcióelegyet 30 ml etil-acetáttal hígítjuk, kétszer 5 ml vízzel és 5 ml sós vízzel mossuk, majd nátriumszulfáton megszárítjuk. Az oldószert ledesztilláljuk, és az olefinterméket (1. vegyület) gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószerként 70 térfogat% etil-acetátot tartalmazó hexánt alkalmazunk. Kitermelés: 55-60%.

10b. 109 mg 1. vegyület 5 ml metanollal készült oldatához keverés közben 25 °C-on, 1 atmoszféra nyomású hidrogéngázban hozzáadunk 20 mg 10 térfogat%os szénhordozós palládiumot. 4 óra múlva a katalizátort Celite-en leszűrjük, és az oldószert ledesztilláljuk. így a 2. vegyületet kapjuk, amelyet gyorskromatográfiával tisztítunk, eluálószerként 80 térfogat% etil-acetátot tartalmazó hexánt alkalmazunk.

10c. Körülbelül 2,8 ekvivalens tetrabutil-ammóniumfluoridot adunk hozzá 0 °C-on keverés közben 350 ml 2. vegyület 5,0 ml THF-nal készült oldatához. 3 óra múlva az oldószert ledesztilláljuk, és a kapott 3. vegyületet gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószerként 10% metanolt tartalmazó diklór-metánt alkalmazunk.

lOd. Körülbelül 0,05 ekvivalens 4-dimetil-aminopiridint, 1,4 ekvivalens trimetil-amint és 1,2 ekvivalens 4,4’-dimetoxi-tritil-kloridot adunk keverés közben 0,6 mmol 3. vegyület 4,0 ml vízmentes piridinnel készült oldatához. 2 óra múlva a reakcióelegyet 2,0 ml vízzel hígítjuk, majd 2,0 ml etil-acetátot adunk hozzá. A szerves fázist elválasztjuk, sós vízzel mossuk és megszárítjuk. A kapott 4. vegyületet gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószerként 5 térfogat% metanolt tartalmazó metilén-kloridot használunk.

lOe. Körülbelül 2,0 ekvivalens diizopropil-etilamint és 1,0 ml vízmentes diklór-metánt adunk keverés közben 0,5 mmol 4. vegyület oldatához. 30 perc múlva 0,75 ekvivalens 2-ciano-etil-N,N-diizopropil-klór-foszforamiditet adunk az elegyhez cseppenként körülbelül 20 perc alatt, és a keverést további 1 óra hosszat folytatjuk. Ezután az oldószert ledesztilláljuk, és a kapott 5. vegyületet nitrogénatmoszférában gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószerként 1 térfogat% trietil-amint tartalmazó etil-acetátot használunk.

HU 217 036 Β

Az a-d. lépésekben bemutatott eljárásokkal olyan dimereket állítunk elő, amelyek három szénatomos intemukleozidkötéseket tartalmaznak, ahol mind a három szén -CH₂- formában fordul elő.

A szénatomok bármelyike vagy mindegyike adott esetben hidroxilezhető, oly módon, hogy a 3. ábrán bemutatott eljárást a következőképpen módosítjuk. Ozmium-tetroxid terc-butanollal készült 2,5 tömeg/térfogat%-os oldatából 0 °C-on egy cseppet adunk keverés közben az 1. vegyület és 9,1 mg 4-metil-morfolin-Noxid 0,8 ml THF-nal készült oldatához. A reakcióelegyet 24 óra hosszat 0 °C-on tartjuk, majd nátrium-metabiszulfit vizes oldatával hígítjuk, etil-acetátot adunk hozzá és vízzel és sós vízzel mossuk. Az oldószert ledesztilláljuk, és a kapott hidroxilezett dimert vékonyréteg-kromatográfiával tisztítjuk, eluálószerként etil-acetátot használunk. A hidroxilezett dimert ezután védőcsoporttal látjuk el, és az 5’- és 3’-végeket a fenti b-d. lépések szerint módosítjuk.

II. példa

Hidroxilezett, három szénatomos internukleozidkötések előállítása

Az a-d. lépések szerint előállított timidindimer foszforamidit-származékot használtuk módosított szilárd fázisú foszforamiditszintézis-módszerben, és így az 1. táblázat szerinti oligonukleozid-szekvenciákat állítottuk elő.

Az oligodezoxinukleotidokat 3 ’-től 5’ irányban szintetizáltuk.

1. táblázat

Szekvencia	Hivatkozási jel
5’ TpTpTpTpTp[TcT]pTpTpTpTpypypT 3’	1
5’ TpTpTpTpTpTpTp[TcT]pTpTpypypT 3’	2
5’ TpTpTpTpTpTpTpTp[TcT]pypT 3’	3

T=timidin, o

p=O-P-O

I o®, c=-ch₂-ch₂-ch₂-,

Y=tetraetilénglikol

A szintézist azután egy módosított foszforamidit-eljárással folytattuk. A kapcsolt timidin 5’-hidroxilcsoportját triklór-ecetsawal reagáltatva eltávolítottuk az 5’hidroxilcsoport védőcsoportját. A védőcsoport eltávolítása után a kapcsolt timidint aktiválószerrel, tetrazollal és foszforamidit-reagenssel reagáltattuk, amely dímetoxi-tritil-tetraetilénglikol-ciano-foszfm volt. Az aktiválás után az el nem reagált 5’-hidroxilcsoportokat ecetsavanhidriddel és N-metil-imidazollal reagáltattuk. A foszforkötést azután ismert módszerrel jóddal oxidáltuk. Az 1. és 2. szekvencia esetén, amelyek két tetraetilénglikol-maradékot (TEG) tartalmaztak, a védőcsoporteltávolítási, -aktiváló, -kapcsoló és -oxidáló lépéseket megismételtük.

A lánchosszabbítást azután a szokásos, védőcsoporteltávolító, -aktiváló, -kapcsoló és -oxidáló lépések sorozatán keresztül végeztük, azzal a módosítással, hogy az aktiválólépésben egy, az 1 -9. példák szerint előállított három szénatomos kapcsolóval ellátott timidindimert adagoltunk.

A lánc kialakítása végén a timidin oligomereket koncentrált ammónium-hidroxiddal eltávolítottuk a CPGhordozóról. Az oldatot azután 55 °C-on 8-15 óra hoszszat tovább kezeltük a bázisok exociklusos amincsoportján levő összes védőcsoport eltávolítására.

12. példa ’-O-AcetU-5 '-karbometoxi-metil-5 ’-dezoxitimidin előállítása

Körülbelül 0,39 g nátrium-bőr-hidridet adunk 3,17 g 3 ’-O-acetil-5 ’-karbometoxi-metilén-5 ’-dezoxi-timidin 95 ml izopropanollal készült oldatához keverés közben jégfurdőn. Az elegyet 0 °C-on, nitrogénatmoszférában fél óra hosszat, majd szobahőmérsékleten további 4 és fél óra hosszat keveijük. A lehűtött oldatot 20 ml metanollal, majd 30 perc múlva 200 ml desztillált vízzel hígítjuk és etil-acetát részletekkel extraháljuk. Az egyesített szerves extraktumokat sós vízzel mossuk, vízmentes magnézium-szulfáton megszárítjuk, a szárítószert leszűrjük, és az oldószert ledesztilláljuk. így 2,7 g cím szerinti terméket kapunk üvegszerű anyag formájában.

13. példa ’-Karbometoxi-metil-5 ’-dezoxi-timidin előállítása

Körülbelül 10 csepp 25 tömeg/térfogat%-os metanolos nátrium-metoxid-oldatot adunk 2,22 g, a 12. példa szerint előállított 3’-O-acetil-6’-karbometoxi-metil-5’dezoxi-timidin 300 ml vízmentes (semleges alumíniumoxidon átengedett) metanollal készült hideg oldatához, keverés közben. Az elegyet nitrogénatmoszférában, a jégfiirdő újratöltése nélkül, körülbelül 20 óra hosszat keverjük. Ezután kis mennyiségű kationcserélő gyantát (Bio-Rad AG 50WX8) adunk hozzá, és az elegyet 30 percig keverjük. Ezután az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk, így 2,1 g üvegszerű maradékot, amelyet meleg toluollal kezelünk, és lehűtés után leszűrjük és ciklohexánnal kirázzuk, így 1,64 g nyersterméket kapunk fehér, szilárd anyag formájában.

A cím szerinti terméket tovább tisztítjuk szilikagélen etil-acetáttal eluálva, majd etil-acetát és hexán elegyéből átkristályosítva, és így fehér kristályos anyagot kapunk.

14. példa ’-O-t-Butil-dimetil-szilil-5 ’-(2 ”-hidroxi-etil)timidin előállítása

Körülbelül 19 ml tetrahidrofurános (THF), 1 mol/1es diizobutil-alumínium-hidridet adunk nitrogénatmoszférában, keverés közben 1,88 g 3’-O-terc-butil-dimetilszilil-5’-karboetoxi-metil-5’-dezoxitimidin 40 ml THF-fel készült -40 °C és -30 °C hőmérsékletű oldatához. A reakció hőmérsékletét lassan hagyjuk -20 °C-ra

HU 217 036 Β emelkedni. Ezután az elegyet 3,5 ml metanollal hígítjuk, miközben a hőmérséklet -10 °C-ra emelkedik. Az elegyhez hozzáadjuk körülbelül 18 ml víz és 36 ml THF elegyét, mire a hőmérséklet +10 °C-ra emelkedik. A THF nagy részét csökkentett nyomáson eltávolítjuk, és a maradékot körülbelül kétszeres térfogatú vízzel hígítjuk. A vizes fázist néhányszor etil-acetát és kloroform 1:1 térfogatarányú elegyével extraháljuk. Az egyesített extraktumokat hideg 2 n sósavval és sós vízzel mossuk, vízmentes magnézium-szulfáton megszárítjuk és leszűrjük. Az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk, így 1,6 g cím szerinti terméket kapunk.

15. példa '-O-t-Butif-dimetil-szilil-5 ‘-(2 ”-jód-etil)-5 ’dezoxitimidin előállítása g p-toluolszulfonil-kloridot hozzáadunk 1 g, a 14. példa szerint előállított 3’-O-terc-butil-dimetíl-szilil-5’(2”-hidroxi-etil)-5’-dezoxitimidin 25-30 ml vízmentes piridinnel készült oldatához, és az elegyet ledugaszolva körülbelül 19 óra hosszat 5 °C-on tartjuk. Ezután az elegyet körülbelül 200 ml jeges vízbe öntjük és éterrel néhányszor extraháljuk. Az egyesített szerves extraktumokat hideg 2 n sósavval, vízzel, majd sós vízzel mossuk. A mosott extraktumokat vízmentes nátrium-szulfáton megszárítjuk és leszűijük. Az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk, így 1,24 g üvegszerű terméket kapunk. 0,54 g kapott p-toluolszulfonil-származékot és 0,38 g nátrium-jodidot feloldunk 50 ml vízmentes (4A molekulaszitán átengedett) acetonban 3 nap alatt, majd az utolsó napon keverés közben hozzáadunk további 0,19 g nátrium-jodidot. A reakcióelegyet leszűijük és az oldószert ledesztilláljuk, így a nyersterméket kapjuk, amelyet kromatográfiásan 85 g szilikagélen 25 térfogat% etil-acetátot tartalmazó hexánnal eluálva tisztítunk. Az oldószert ledesztilláljuk, így 0,4 g kívánt terméket kapunk.

16. példa ’-Karbometoxi-metilén-5 ’-dezoxitimidin előállítása

Körülbelül 10 csepp 25 tömeg/térfogat%-os metanolos nátrium-metoxidot keverés közben hozzáadunk 1,5 g 3’-O-acetil-5’-karbometoxi-metilén-5’-dezoxitimidin 150 ml vízmentes (semleges alumínium-oxidon átengedett) metanollal készült oldatához. Az elegyet szobahőmérsékleten nitrogénatmoszférában további 6 óra hosszat keveijük. Ezután kis mennyiségű kationcserélő gyantát (Bio-Rad AG 50WX8) adunk az elegyhez, és 10 percig keverjük. Az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk, így 1,3 g fehér, szilárd terméket kapunk. A kapott maradékot meleg toluollal kétszer trituráljuk, majd forró etanollal felvesszük, leszűrjük, és így szárítás után 0,85 g cím szerinti terméket kapunk fehér kristályos anyag formájában.

17. példa ’-O-t-Butil-dimetil-szilil-5 '-(2 ’’-hidroxi-etilén)5 '-dezoxitimidin előállítása

2,96 mg 5’-karbetoxi-metilén-5’-dezoxitimidin oldatát nitrogénatmoszférában, keverés közben cseppenként hozzáadjuk 205 mg imidazol és 227 mg terc-butildimetil-szilil-klorid 1 ml vízmentes dimetil-formamiddal készült hideg (jeges vizes fürdőn hűtött) oldatához. Az adagolás befejezése után az elegyet eltávolítjuk a jégfürdőből, és a keverést szobahőmérsékleten 2 óra hosszat, majd 35 °C-on további 2 óra hosszat, és végül 40 °C-on fél óra hosszat folytatjuk. Ezután az elegyet 2 ml metanollal, majd 2-3-szoros térfogatú vízzel hígítjuk. A vizes fázist etil-acetáttal néhányszor extraháljuk. Az egyesített szerves fázisokat vízzel, telített nátriumhidrogén-karbonát-oldattal és sós vízzel mossuk, vízmentes magnézium-szulfáton megszárítjuk és leszűrjük. Az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk, így 0,40 g 3’-O-t-butil-dimetil-szilil-5’-karbometoxi-metilén-5’-dezoxitimidint kapunk.

0,37 g kapott termék 10 ml vízmentes tetrahidrofuránnal készült, -30-tól -35 °C-ra lehűtött oldatához -30 °C alatti hőmérsékleten cseppenként hozzáadjuk 4 ml diizobutil-alumínium-hidrid 1 mol/l-es tetrahidrofurános oldatát. Az adagolás befejezése után a reakcióelegyet nitrogénatmoszférában további két óra hoszszat keverjük, miközben a belső hőmérsékletet -30 °C és -20 °C között tartjuk. Ezután a reakcióelegyhez hozzáadunk 0,8 ml metanolt, majd 4 ml víz és 8 ml tetrahidrofurán elegyét. A tetrahidrofurán nagy részét csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A vizes maradékot körülbelül kétszeres térfogatú vízzel hígítjuk és etilacetáttal néhányszor extraháljuk. Az egyesített szerves extraktumokat hideg 1 n sósavval és sós vízzel mossuk, vízmentes magnézium-szulfáton megszárítjuk és leszűijük. A szűrletet ledesztílláljuk, így 0,267 g cím szerinti vegyületet kapunk. Ennek egy részét kromatográfiásan szilikagélen tisztítjuk, eluálószerként 50 térfogat% etil-acetátot tartalmazó hexánt használunk, így analitikai tisztaságú terméket kapunk.

18. példa szén—1 oxigén internukleozidkötést tartalmazó timidindimerek előállítása

a) lépés: 5’-O-tritil-timidin oldatához keverés közben 0 °C-on ekvimoláris mennyiségű bázist és 3’-O-tercbutil-dimetil-szilil-5 ’-(2”-jód-etil)-5 ’-dezoxitimidint adunk. A reakció lefolyását vékonyréteg-kromatográfiával (TLC) követjük. A reakció befejezése után a kívánt dimert izoláljuk és gyorskromatográfiával tisztítjuk.

b) lépés: 3’-O-terc-butil-dimetil-szilil-5’-(2”-hidroxi-etil)-5’-dezoxitimidin oldatához keverés közben -5 °C-on hozzáadunk 2 ekvivalens bázist, és az elegyet szárazra pároljuk. A maradékot DMF-ban oldjuk, és 1 ekvivalens 5’-dimetoxi-tritil-2’,3’-ciklotimidint adunk hozzá. A reakcióelegyet körülbelül 40 °C-on melegítjük, és a kívánt dimer képződését TLC-vel követjük. A reakció befejezése után a kívánt dimert izoláljuk és gyorskromatográfiával tisztítjuk.

19. példa

A védőcsoport eltávolítása a 18. példa szerinti dimer 3 '-végéről

A 3’-terc-butil-dimetil-szilil-csoportot a védett dinierekről úgy távolítjuk el, hogy a 18. példa szerinti dimer

HU 217 036 Β

THF-nal készült oldatát 0 °C-on 2,8 ekvivalens tetrabutil-ammónium-fluoriddal kezeljük. A reakció befejezése után általában (körülbelül 3 óra) az oldószert eltávolítjuk, és a kívánt dimert izoláljuk és gyorskromatográfiával tisztítjuk.

20. példa

Az automatizált szintézishez alkalmas funkcionalizált dimer egység előállítása

A 19. példa szerinti dimer terméket diklór-metánban oldjuk, és hozzáadunk 2 ekvivalens diizopropiletil-amint. Az elegyet 30 percig keverjük, majd körülbelül 20 perc alatt cseppenként hozzáadunk 0,75 ekvivalens 2-ciano-etil-N,N-diizopropil-klór-foszforamiditot. A keverést 1 óra hosszat folytatjuk, majd az oldószert ledesztilláljuk, és a kapott funkcionalizált dimert izoláljuk és gyorskromatográfiával oszlopon tisztítjuk, eluálószerként inért atmoszférában etil-acetátot alkalmazunk.

21. példa ’-t-Butil-dimetil-szilil-3 ’-dezoxi-3 ’-(l ”,2 ”dihidroxi-3 ”-propil)-timidin előállítása

Ozmium-tetroxid (OsO₄) butanolos, 2,5 tömeg/térfogat%-os oldatából 4 cseppet 0 °C-on keverés közben hozzáadunk 183 mg (0,5 mmol) irodalmi módszerek szerint készített 3’-(2”-propenil)-3’-dezoxi-5’-O-tercbutil-dimetil-szilil-timidin és 53 mg (0,45 mmol) 4-metil-morfolin-N-oxid 5,0 ml vízmentes THF-nal készült oldatához. A reakcióelegyet ezután 2 ml 10 tömeg/térfogat%-os vizes nátrium-metabiszulfittal hígítjuk, 20 percig keverjük, majd szilícium-dioxidon leszűrjük, és 25 ml etil-acetáttal hígítjuk. A szerves fázist 5 ml vízzel és sós vízzel mossuk, majd nátrium-szulfáton megszárítjuk. Az oldószert ledesztilláljuk, és a cím szerinti terméket gyorskromatográfiávál tisztítjuk.

22. példa ’-Dezoxi-timid-3-il-acetaldehid-5 ’-O-t-butildimetil-szilil-timidin előállítása

214 mg (1 mmol) nátrium-perjodátot hozzáadunk 200 mg (0,5 mmol) a 21. példa szerinti módon készített timidindiol 5 ml THF és víz 4:1 térfogatarányú elegyével készült oldatához, keverés közben. Egy óra múlva a reakcióelegyet 25 ml etil-acetáttal hígítjuk, kétszer 5 ml vízzel és sós vízzel mossuk, majd megszárítjuk. A cím szerinti terméket gyorskromatográfiával, 70 térfogat% etil-acetátot tartalmazó hexánnal eluálva tisztítjuk.

23. példa ’-O-(p-toluol-szulfonil)-timidin előállítása g (82,6 mmol) timidin 200 ml vízmentes piridinnel készült oldatához keverés közben 0 °C-on nitrogénatmoszférában hozzáadunk 47,2 g (247,6 mmol) p-toluolszulfonil-kloridot. 3 óra múlva a reakcióelegyet jégre öntjük és etil-acetáttal extraháljuk. Az oldószert ledesztilláljuk, és a terméket etil-acetát és metanol 1:1 térfogatarányú elegyéből kristályosítjuk. A cím szerinti terméket fehér kristályos tennék formájában 70-75% kitermeléssel kapjuk.

24. példa '-Jód-5 ’-dezoxitimidin előállítása

10,65 g (26,9 mmol) a 23. példa szerinti módon készített timidin-tozilát 75 ml vízmentes acetonnal készült oldatához keverés közben hozzáadunk 10 g (66,7 mmol) nátrium-jodídot, és az elegyet 16 óra hosszat visszafolyató hűtő alatt forraljuk. Az oldószert ledesztilláljuk, és a maradékot etil-acetáttal hígítjuk. A szerves fázist kétszer 20 ml vízzel és 10 ml sós vízzel mossuk, majd nátrium-szulfáton megszárítjuk. A cím szerinti terméket metanolból kristályosítjuk, így fehér kristályos terméket kapunk 90-95%-os kitermeléssel.

25. példa ’-O-t-Butil-dimetil-szilil-5 '-jód-5 ’-dezoxitimidin előállítása

8,0 g (24,7 mmol) a 24. példa szerinti módon készített timidin-jodid vízmentes DMF-nal készült oldatához keverés közben hozzáadunk 4,2 g (61,7 mmol) imidazolt. 5 perc múlva hozzáadunk 4,47 g (29,64 mmol) terc-butil-dimetil-szilil-kloridot, és az elegyet 4 óra hosszat keveijük. Ezután a reakcióelegyet 250 ml etilacetáttal hígítjuk, kétszer 100 ml vízzel és 50 ml sós vízzel mossuk, majd nátrium-szulfáton megszárítjuk. A cím szerinti terméket gyorskromatográfiával, eluálószerként 60 térfogat% etil-acetátot tartalmazó hexánt alkalmazva tisztítjuk, így a terméket 92%-os kitermeléssel kapjuk.

26. példa ’-O-t-Butil-dimetil-szilil-5 ’-azido-5 ’-dezoxitimidin előállítása

10,8 g (20 mmol) a 25. példa szerinti módon előállított 3 ’-O-t-Butil-dimetil-szilil-5 ’-j ód-5 ’-dezoxitimidin 50 ml vízmentes DMF-nal készült oldatához keverés közben hozzáadunk 3,9 g (60 mmol) nátrium-azidot, és az elegyet 0 °C-on 12 óra hosszat keverjük. Ezután a reakcióelegyet 200 ml etil-acetáttal hígítjuk, kétszer 50 ml vízzel és 50 ml sós vízzel mossuk, majd nátriumszulfáton megszárítjuk. A cím szerinti terméket gyorskromatográfiával, 50 térfogat% etil-acetátot tartalmazó hexánnal eluálva tisztítjuk, így a terméket 90%-os kitermeléssel kapjuk.

27. példa '-O-t-Butil-dimetil-szilil-5 ’-amino-5 ’-dezoxitimidin előállítása

5,0 g (13,1 mmol) a 26. példa szerinti módon előállított timidin-azid metanollal készült oldatához keverés közben, nitrogénatmoszférában hozzáadunk 200 mg 10 tömeg%-os szénhordozós palládiumot. Ezután a nitrogéngázt eltávolítjuk és hidrogéngázzal cseréljük ki. A gáz leszívatását és cseréjét kétszer ismételjük, majd a keverést 1 atmoszféra hidrogénnyomás mellett 12 óra hosszat folytatjuk. Ezután a hidrogéngázt eltávolítjuk, a katalizátort Celite-en leszűqük és az oldószert vákuumban ledesztilláljuk. A nyersterméket gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószerként 5—10 térfogat% metanolt tartalmazó diklór-metánt alkalmazunk. így a cím szerinti terméket 85-87% kitermeléssel kapjuk.

HU 217 036 Β

28. példa ’-Azido-3 '-dezoxi-5 ’-O-dimetoxi-tritil-timidin előállítása

2,67 g (10 mmol) 3’-azido-3’-dezoxitimidin 50 ml vízmentes piridinnel készült oldatához keverés közben rendre hozzáadunk 61 mg (0,5 mmol) 4-dimetilamino-piridint, 1,9 ml (14 mmol) trietil-amint és 4,1 g (12 mmol) 4,4’-dimetoxi-tritil-kloridot. Három óra múlva hozzáadunk 30 ml vizet, és 250 ml etil-acetáttal extraháljuk. A szerves fázist elválasztjuk, 50 ml sós vízzel mossuk és nátrium-szulfáton megszárítjuk. A cím szerinti terméket gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószerként 5 ml metanolt tartalmazó metilén-kloridot alkalmazunk, így a terméket 80-85% kitermeléssel kapjuk.

29. példa '-Amino-3 ’-dezoxi-5 ’-O-dimetoxi-tritil-timidin előállítása

3,99 g (40 mmol) a 28. példa szerinti módon készített timidin-azid metanollal készült oldatához keverés közben, argonatmoszférában hozzáadunk 200 mg 10 tömeg%-os szénhordozós palládiumot. Az argongázt vákuummal eltávolítjuk, és hidrogént vezetünk a helyére. Ezt az eljárást kétszer ismételjük, majd a keverést 1 atmoszféra hidrogénnyomáson 12 óra hosszat folytatjuk. Ezután a hidrogéngázt eltávolítjuk, és a katalizátort Celite-en leszűijük, és az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A nyersterméket gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószerként 5 térfogat% metanolt tartalmazó metilén-kloridot használunk, így a cím szerinti terméket 90-93%-os kitermeléssel kapjuk.

'H-NMR (300 MHz, CDClj δ: 7,61 (s, 1H), 7,60-7,21 (m, 1H), 6,83-6,87 (m, 3H), 6,85 (t, J=8,5 Hz, 1H), 3,80 (s, 6H), 3,81-3,73 (m, 2H), 3,53-3,49 (m, 1H), 3,38-3,33 (m, 1H), 2,36-2,33 (m, 1H), 2,25-2,20 (m, 1H), 1,51 (s, 3H);

IRneatvmax: 3020,2962,1697, 1605,1512,1246, 1030 cm '.

30. példa ’-O ’-Dimetoxi-3-O-t-butil-dimetil-szilil-timidin előállítása

5,0 g (9,2 mmol) dimetoxi-tritil-timidint és 1,2 g (18,4 mmol) imidazolt feloldunk 15 ml vízmentes DMF-ben, és hozzáadunk 1,7 g (11,5 mmol) terc-butildimetil-szilil-kloridot. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 4 óra hosszat keveijük, majd etil-acetáttal hígítjuk, és vízzel, telített nátrium-kloriddal mossuk, majd nátrium-szulfáton megszárítjuk. A terméket kvantitatív kitermeléssel kapjuk.

31. példa ’-O ’-t-Butil-dimetil-szilil-timidin előállítása

0,7 g (1,1 mmol), a 30. példa szerinti módon előállított 5’-O’-dimetoxi-3-O-t-butil-dimetil-szilil-timidint 1 óra hosszat szobahőmérsékleten 13 ml 3 tömeg/térfogat%-os metilén-kloridos triklór-ecetsav-oldattal kezelünk. A reakcióelegyet ezután 5 tömeg/térfogat%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal semlegesítjük. A szerves fázist nátrium-szulfáton megszárítjuk. A cím szerinti terméket gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószerként 0-30 térfogat% lineáris gradiens etil-acetátot tartalmazó metilén-kloridot használunk. A terméket 85%-os kitermeléssel kapjuk.

32. példa ’-O ’-t-Butil-dimetil-szilil-5 ’-karbetoxi-metilén-5 ’dezoxitimidin előállítása

Vízmentes metilén-kloridhoz keverés közben -78 °C-on hozzáadunk 2,88 ml (33,0 mmol) oxalil-kloridot, majd cseppenként 3,12 ml (44 mmol) DMSO-t. 10 perc múlva cseppenként 2 perc alatt hozzáadunk 5,6 g (15,7 mmol), a 31. példa szerinti módon készített timidinalkoholt 20 ml diklór-metánban, majd a keverést 45 percig folytatjuk. Ezután hozzáadunk 8,1 ml (58,1 mmol) trietil-amint, és a keverést további 30 percig folytatjuk. Ezután a reakcióelegyet 30 perc alatt -23 °C-ra hűtjük. Ezután hozzáadunk 10,94 g (31,4 mmol) karbetoxi-metilén-trifenil-foszforánt, és a reakcióelegyet 12 óra hosszat szobahőmérsékleten keverjük. Ezután a reakcióelegyet kétszer 125 ml vízzel és 50 ml sós vízzel mossuk, majd nátrium-szulfáton megszárítjuk. A nyersterméket gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószerként 20 térfogat%ról lineárisan 40 térfogat%-ra változó mennyiségű etilacetátot tartalmazó hexánt alkalmazunk, így a transz- és cisz-izomert 3:1 arányban kapjuk. Az egyesített kitermelés körülbelül 72-76%.

IR neat vmax: 3205, 3180, 2982, 2964, 1698, 1490, 1274 cm ';

'H-NMR (300 MHz, CDC1₃) δ: 7,04 (s, 1H), 6,87 (dd, J=15,6 és 5,4 Hz, 1H), 6,23 (t, J=6,7 Hz, 1H), 6,03 (dd, J= 15,6 és 1,6 Hz, 1H), 4,33-4,28 (m, 1H), 4,14 (q, J=71 Hz, 2H), 4,16-4,12 (m, 1H), 2,28-2,19 (m, 1H), 2,09-1,98 (m, 1H), 1,87 (s, 3H), 1,23 (t, J=7,l Hz 3H), 0,81 (s, 9H), 0,01 (s, 6H);

Elemanalízis a C₂₀H₃₂O₆N₂Si összegképletre:

C (%) H (%) N (%) számított: 56,58, 7,60, 6,60, talált: 56,36, 7,30, 6,60.

33. példa ’-O ’-t-Butil-dimetil-szilil-5 ’-karbetoxi-metil-5 ’dezoxitimidin előállítása

4,24 g (10 mmol) a 32. példa szerinti módon készített telítetlen timidin-észter etil-acetáttal készült oldatához keverés közben, nitrogénatmoszférában hozzáadunk 200 mg 10 tömeg%-os szénhordozós palládiumot. A nitrogéngázt vákuummal eltávolítjuk és hidrogént vezetünk a helyére. Ezt az eljárást kétszer ismételjük, majd a keverést 1 atmoszféra hidrogénnyomás alatt 16 óra hosszat folytatjuk. Ezután a katalizátort Celiteen leszűrjük, és az oldószert vákuumban ledesztilláljuk. A terméket hexán és etil-acetát 1:1 térfogatarányú elegyéből kristályosítjuk. így a cím szerinti terméket 95%os kitermeléssel kapjuk.

IR neat max: 3180, 2925, 2950, 1696, 1486, 1260, 1240 cm';

'H-NMR (300 MHz, CDClj δ: 7,20 (s, 1H), 6,11 (t, J=6,6 Hz, 1H), 4,07 (q, J=7,l Hz, 2H), 4,03-3,98 (m, 1H), 3,73-7,69 (m, 1H), 2,51-2,32 (m, 2H),

HU 217 036 Β

2,24-2,15 (m, IH), 1,18 (t, J=7,l Hz, 3H), 0,81 (s, 9H), 0,01 (s, 6H);

Elemanalízis a C_2üH₃₄O₆N₂Si összegképletre:

	C (%)	H (%)	N (%)
számított:	56,31,	8,03,	6,57,
talált:	55,91,	7,74,	6,50.

34. példa ’-O ’-t-Butil-dimetil-szilil-5 ’-dezoxi-timid-5-ilacetaldehid előállítása

3,41 g (8 mmol), a 33. példa módon készített timidin-észter 60 ml vízmentes diklór-metánnal készült oldatához keverés közben -78 °C-on 3 perc alatt cseppenként hozzáadunk 16,4 ml (16,4 mmol) 1,0 mol/l-es hexános DiBAL-H-oldatot. 20 perc múlva a reakcióelegyet 300 ml etil-acetáttal hígítjuk és 50 ml telített nátrium-kálium-tartaráttal kétszer mossuk. A szerves fázist 25 ml sós vízzel mossuk, majd nátrium-szulfát felett szárítjuk. A cím szerinti terméket gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószerként 50-70 térfogat% etilacetátot tartalmazó hexánt alkalmazunk, így a terméket 85-87%-os kitermeléssel kapjuk.

35. példa ’-C-C-N-5 ’-internukleozidkötést tartalmazó dezoxitimidin dimer előállítása (3. ábra)

A) lépés: 1,07 g (3 mmol), a 27. példa szerinti módon készített timidin-amin és 1,38 g (3,6 mmol), a 22. példa szerinti módon készített timidin-aldehid 50 ml etanollal és 10 ml vizes NaH₂PO₄—NaOH-pufferoldattal (pH = 5,5) készült oldatához keverés közben 5 °C-on, egy óra alatt cseppenként hozzáadunk 12 ml (12 mmol) 1,0 mol/l-es THF-os NaCNBH₃-oldatot. A reakcióelegyet további 4 óra hosszat keverjük, majd 2,50 ml etilacetáttal hígítjuk. A reakcióelegyet kétszer 40 ml vízzel és 25 ml sós vízzel mossuk, majd nátrium-szulfát felett szárítjuk. A 6. ábra szerinti 1. vegyületet gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószerként először etil-acetátot, majd 5-ről lineárisan 8 térfogat%-ra változó metanoltartalmú diklór-metánt alkalmazunk, a terméket 62-64%-os kitermeléssel kapjuk.

'H-NMR (300 MHz, CDC1₃) δ: 7,60 (s, IH), 7,19 (s, IH), 6,18 (t, J=3,9 Hz, IH), 6,08 (t, J=3,9 Hz, IH), 4,29-4,23 (m, IH), 4,15-3,98 (m, IH), 3,91-1,85 (m, IH), 3,70-3,78 (m, 2H), 2,95-2,87 (m, IH), 2,84-2,66 (m, 3H), 2,35-2,05 (m, 5H), 1,94 (s, 3H), 1,93 (s, 3H), 1,80-1,63 (m, IH), 1,55-1,45 (m, IH), 0,93 (s, 9H), 0,69 (s, 9H), 0,11 (s, 6H), 0,07 (s, 6H).

B) lépés: 166 mg (0,23 mmol), a 6. ábra szerinti 1. vegyületet hozzáadunk 0,32 ml (2,3 mmol) trifluorecetsav-anhidrid és 0,64 ml (4,6 mmol) trietil-amin 5 ml diklór-metánnal készült oldatához, keverés közben. Két óra múlva a reakcióelegyet 5 ml vizes nátriumhidrogén-karbonát-oldattal hígítjuk, és 25 ml etil-acetátot adunk hozzá. A szerves fázist kétszer 10 ml vízzel és 5 ml sós vízzel mossuk, majd nátrium-szulfáton megszárítjuk. A kapott 6. ábra szerinti 2. vegyületet gyorskromatográfiávai tisztítjuk, eluálószerként 7 térfogat% metanolt tartalmazó diklór-metánt alkalmazunk, a terméket 91 -93%-os kitermeléssel kapjuk.

C) lépés: 164 mg (0,2 mmol) 2. vegyület 4 ml THFnal készült oldatához keverés közben, 0 °C-on hozzáadunk 0,8 mmol tetrabutil-ammónium-fluoridot. Két óra múlva az oldószert ledesztilláljuk, és a 6. ábra szerinti 3. vegyületet gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószerként 5-8 térfogat% metanolt tartalmazó diklór-metánt használunk, a terméket 90%-os kitermeléssel kapjuk.

D) lépés: 151 mg (0,26 mmol) 3. vegyület 3,0 ml vízmentes piridinnel készült oldatához keverés közben hozzáadunk 1,6 mg (0,0128 mmol) 4,4-dimetil-aminopiridint és 0,057 ml (0,42 mmol) trietil-amint. Öt perc múlva hozzáadunk 121 mg (0,358 mmol) dimetoxitritil-kloridot, és a keverést tovább folytatjuk. Két óra múlva a reakcióelegyet 25 ml etil-acetáttal hígítjuk és kétszer 10 ml vízzel és 5 ml sós vízzel mossuk, majd nátrium-szulfáton megszárítjuk. A nyersterméket gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószerként 7 térfogat% metanolt tartalmazó diklór-metánt alkalmazunk, így a

3. ábra szerinti 4. vegyületet 85-87%-os kitermeléssel kapjuk.

E) lépés: 0,15 ml (0,67 mmol) vízmentes diizopropil-etil-amint hozzáadunk 150 mg (0,168 mmol) 4. vegyület 0,5 ml vízmentes diklór-metánnal készült oldatához. Ezután a lombikot rázzuk, hogy az alkohol feloldódjon, és 20 másodperc alatt hozzáadunk 0,056 ml (0,25 mmol) 2-ciano-etil-N,N-diizopropil-klór-foszforamiditot. 45 perc múlva a reakcióelegyet 1 ml metanollal, majd 50 ml etil-acetáttal hígítjuk, és hozzáadunk 1,0 ml trietil-amint, majd kétszer 5,0 ml 10 tömeg/térfogat%-os vizes kálium-karbonáttal, és 5,0 ml sós vízzel mossuk, majd nátrium-szulfát felett szárítjuk. A nyersterméket gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószerként etil-acetátot alkalmazunk, így a 6. ábra szerinti 5. vegyületet 70-75%-os kitermeléssel kapjuk.

36. példa '-N-C-C—5 ’-internukleozidkötést tartalmazó dezoxitimidin dimer előállítása (4. ábra)

A) lépés: 2,72 g (5 mmol), a 29. példa szerinti amin és 2,29 g (6 mmol), a 34. példa szerinti eljárással előállított aldehid 50 ml etanollal és 10 ml vizes pufferoldattal (pH=5,5, NaH₂PO₄-NaOH) oldatához keverés közben 5 °C-on egy óra alatt cseppenként hozzáadunk 12 ml (12 mmol) 1,0 mol/l-es THF-os NaCNBH₃-oldatot. A reakcióelegyet további 4 óra hosszat keverjük, majd 250 ml etil-acetáttal hígítjuk. Ezután a reakcióelegyet kétszer 60 ml vízzel és sós vízzel mossuk, majd nátriumszulfát felett szárítjuk. A kapott, 7. ábra szerinti 1. vegyületet gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószerként először etil-acetátot, majd 5 térfogat% metanolt tartalmazó diklór-metánt alkalmazunk. A terméket 72-74%os kitermeléssel kapjuk.

'H-NMR (300 MHz, CDC1₃) δ: 7,56 (m, IH), 7,36-7,34 (m, 2H), 7,29-7,15 (m, 8H), 7,03 (s, IH), 6,77 (m, 3H), 6,20 (t, J=6,0 Hz, IH), 6,08 (t, J=6,7 Hz, IH), 4,01-3,97 (m, 2H), 3,84-3,72 (m, IH), 3,72 (s, 6H), 3,71-3,63 (m, IH), 3,48-3,32 (m, 2H), 3,30-3,22 (m, IH), 7,52 (m, 2H), 2,27-2,14 (m, 3H), 2,08-1,97 (m, IH), 1,83 (s, 3H), 1,67-1,48 (m, 3H), 1,43 (s, 3H), 1,22-1,15 (m, IH), 0,82 (s, 9H), 0,01 (s, 6H).

HU 217 036 Β

B) lépés: 0,32 ml (2,3 mmol) trifluor-ecetsavanhidrid 0,64 ml (4,6 mmol) trietil-amin 5,0 ml diklórmetánnal készült oldatához hozzáadunk 200 mg (0,23 mmol) 7. ábra szerinti 1. vegyületet. Két óra múlva a reakcióelegyet 5,0 ml vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és 25 ml etil-acetáttal hígítjuk. A szerves fázist kétszer 10 ml vízzel és 5 ml sós vízzel mossuk, majd nátrium-szulfát felett szárítjuk. A kapott, 7. ábra szerinti 2. vegyületet gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószerként 7 térfogat% metanolt tartalmazó diklórmetánt használunk. A terméket 89-91%-os kitermeléssel kapjuk.

C) lépés: 180 mg (0,2 mmol) 2. vegyület 4,0 ml THF-fel készült oldatához keverés közben, 0 °C-on hozzáadunk 0,4 ml (0,4 mmol) 1,0 mol/l-es THF-os tetrabutil-ammónium-fluoridot. Két óra múlva az oldószert ledesztilláljuk, és a terméket gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószerként 5 térfogat%-ról lineárisan 8 térfogat%-ra változó mennyiségű metanolt tartalmazó diklórmetánt használunk, a 7. ábra szerinti 3. vegyületet 89%os kitermeléssel kapjuk.

D) lépés: 0,15 ml (0,67 mmol) vízmentes diizopropil-etil-amint hozzáadunk 150 mg (0,168 mmol) 3. vegyülethez, majd ehhez hozzáadunk 0,5 ml vízmentes diklór-metánt. A lombikot rázzuk, hogy az alkohol feloldódjék, majd 20 másodperc alatt hozzáadunk 0,056 ml (0,25 mmol) 2-ciano-etil-N,N-diizopropil-klór-foszforamiditot. 45 perc múlva a reakcióelegyet 0,1 ml metanollal és 50 ml etil-acetáttal hígítjuk, és hozzáadunk 1,0 ml trietil-amint, majd kétszer 5,0 ml 10 tömeg/térfogat%-os vizes kálium-karbonáttal és 5,0 ml sós vízzel mossuk, majd nátrium-szulfát felett szárítjuk. A kapott

4. vegyületet gyorskromatográfiával tisztítjuk, eluálószerként etil-acetátot használunk, a terméket 70-75%-os kitermeléssel kapjuk.

37. példa ’-N-C-C-5 ’-internukleozidkötéseket tartalmazó dezoxitimidin oligomerek szintézise

A fenti a-d) lépésekkel előállított timidindimer foszforamidit-származékokat alkalmazzuk módosított szilárd fázisú foszforamiditszintézis-módszerben, és a 2. táblázatban felsorolt oligonukleozid-szekvenciákat állítjuk elő.

2. táblázat

Szekvencia	Hivatkozási jel
5’ TpTpTpTpTpTpTpTp[TnT]pT 3’	4
5’ TpTpTpTpTp[TnT]pTpTpTpT 3’	5
5’ [TnTJpTpTpTpTpTpTpTpTpT 3’	6

T=timidin,

O

II p=O-P-O

I ο^θ, n=3’-N-C-C-5’

Az oligonukleozid-szekvenciákat 3’-5’ irányban szintetizáljuk.

Kezdőlépésként CPG-hordozóra 5’-dimetoxi-tritildezoxitimidint kapcsolunk, 3 ’-szukcinátkötésen keresztül. A kapcsolt timidin-5’-0-dimetoxi-tritil-csoportját triklór-ecetsawal kezeljük, azaz az 5 ’-hidroxilcsoportról eltávolítjuk a védőcsoportot.

A láncmeghosszabbítást azután a szokásos lépéssorozattal végezzük, éspedig védőcsoport-eltávolítás, -aktiválás, -kapcsolás és -oxidálás, azzal a módosítással, hogy egy aktiválási lépésben a lánc kívánt helyén egy, a 30-37. példa szerinti módszerrel előállított -N-C-Ckapcsolt timidindimert adagolunk.

A lánckapcsolás végén a timidinoligomereket a CPG-hordozóról koncentrált ammónium-hidroxiddal távolítjuk el. Az oldatot azután 8-15 óra hosszat 55 °C-on tovább kezeljük az összes, a bázisok exociklusos aminjain jelen levő védőcsoportok eltávolítására.

38. példa

Tetraetilénglikol-terminálissal ellátott anti-RAS onkogén DNS előállítása

A) lépés: Dimetoxi-tritil-tetraetilénglikol (DMTTEG) előállítása

Fölöslegben vett (körülbelül 100 ml) tetraetilénglikolt (TEG) összekeverünk 7 ml (5,1 g; 40 mmol) Hunig-féle bázissal egy gömblombikban. Körülbelül 3,08 g (10 mmol) dimetoxi-tritil-kloridot (DMTC1) adunk a TEG-elegyhez, és a DMTC1-TEG elegyet állandó keverés közben szobahőmérsékleten tartjuk (körülbelül 25 °C-on) 8-12 óra hosszat.

B) lépés: Dimetoxi-tritil-tetraetilénglikol-cianofoszfin (DMTTEGCP) g, az a) lépésben kapott DMTTEG-t elkeverünk 20 ml vízmentes diklór-metánnal. Az elegyhez hozzáadunk körülbelül 6,2 ml Hunig-féle bázist, majd cseppenként klór-foszfin-elegyet adunk hozzá a DMTTEGCP kialakítására. A klór-foszfin-elegyet úgy készítjük, hogy 1,67 g 2-ciano-etil-N,N-diizopropilklór-foszforamiditot feloldunk 5 ml vízmentes diklórmetánban.

C) lépés: TEG-terminálissal ellátott anti-RAS onkogén DNS készítése

A 3. táblázatban felsorolt oligodezoxinukleotidokat készítjük módosított szilárd fázisú foszforamidit módszerrel (Gait, id. h.). Az oligonukleotidokat 3’-5’ irányban szintetizáljuk.

3. táblázat

Szekvencia	Hivatkozási jel
5’ X GGA GCT GGT GGC GTA X (A) 3’	7
5’ XX GGA GCT GGT GGC GTA XX (A) 3’	8
5’ X CCT CGA CCA CCG CAT X (A) 3’	9
5’ XX CCT CGA CCA CCG CAT XX (A) 3’	10
5’ CCT CGA CCA CCG CAT 3’	11

XTEG

I

HU 217 036 Β

A, C, G és T jelentése adenil-, citidil-, guanidil- és timidilsavak dezoxinukleotidjai.

Adenozin- (7,8,9,10) vagy timidin- (11) nukleozidot kapcsolunk a CPG szilárd hordozóhoz, szukcinátkötéseken keresztül (Gait, id. h.). (All. szekvenciát a szokásos szilárd fázisú foszforamidit-módszerrel szintetizáltuk. A 7., 8., 9. és 10. szekvenciát módosított foszforamiditmódszerrel szintetizáltuk.) A kapcsolt adenozinnukleozid 5’-hidroxilcsoport] át triklór-ecetsawal kezeltük, hogy eltávolítsuk az 5’-hidroxilcsoport védőcsoportját. A védőcsoport eltávolítása után a kapcsolt adenozin nukleozidot aktiválószerrel, tetrazollal és foszforamidit-reagenssel reagáltatjuk, amely utóbbi DMTTEGCP-t tartalmaz, és a fenti a) és b) lépéssel állítjuk elő. Az aktiválási lépés után a nem reagált 5’-hidroxilcsoportokat ecetsavanhidriddel és N-metil-imidazollal kapcsoljuk. A foszforkötéseket azután ismert módszerrel jóddal oxidáljuk.

A két TEG csoportot tartalmazó 8. és 10. szekvencia esetén a védőcsoport-eltávolítást, -aktiválást, -kapcsolást és -oxidálást megismételjük. A láncmeghosszabbítást a fent ismertetett védőcsoport-eltávolítás, -aktiválás, -kapcsolás és -oxidálás lépések sorozatával végezzük, azzal a módosítással, hogy az aktiválási lépésben a kívánt nukleozid foszforamidit-reagenst használjuk DMTTEGCP helyett. Az utolsó kívánt nukleozid kapcsolása után egy vagy két TEG-maradékot kapcsolunk az 5'-terminálishoz ugyanúgy, mint a 3'-terminálishoz történő TEGkapcsolás esetén.

A lánc elkészítése után a DNS-szálat koncentrált ammónium-hidroxiddal távolítjuk el a CPG-hordozóról. Az oldatot azután további 8-15 óra hosszat 55 °Con keverjük a bázisok exociklusos aminjain levő védőcsoportok eltávolítására.

39. példa

Hexaetilénglikol-terminussal (HEG) ellátott antiRAS onkogén DNS előállítása

A terméket a 38. példa szerinti módon állítjuk elő. HEG és DMTC1 reagáltatásával DMTHEG-t állítunk elő, amelyet azután ciano-foszfinnal reagáltatunk, így DMTHEGCP-t kapunk, amelyet a módosított szilárd fázisú foszforamiditszintézis-módszerben alkalmazunk [38. példa C) lépés] a cím szerinti termék előállítására. A kapott nukleotidok szekvenciáját a 4. táblázat tartalmazza.

4. táblázat

X=HEG

A, C, G és T jelentése adenil-, citidil-, guanidil- és timidilsavak dezoxinukleotidjai.

40. példa

TEG-terminussal ellátott anti-RAS onkogén DNS nukleáz-rezisztenciája

A 4. táblázatban felsorolt oligonukleotidokat vízben oldjuk. A DNS-koncentrációkat a minták 260 nm-nél mért abszorbanciájával határozzuk meg (szobahőmérsékleten Perkin Elmer Lambda 4C spektrofotométer segítségével), számított extinkciós koefficienst alkalmazunk [Cantor és Warsaw módszere: CRC Handbook of

Biochemistry and Molecular Biology, 3. kiadás, 1. kötet, CRC Press, 589. oldal (1975)].

vagy 7 μιηοΐ/ΐ oligonukleotidot inkubálunk 2 óra hosszat 37 °C-on RPMI 1640 tápközegben, amely 20 mmol/1 N-(2-hidroxi-etil)-piperazin-N’-(2-etán15 szulfonsav)-at (pH=7,4) és 10% boíjúembrió-szérumot (FCS, GIBCO Laboratories, Grand Island, NY) tartalmaz. FCS-t alkalmazás előtt 56 °C-on fél óra hosszat hővel inaktiváljuk. Ezután a mintákat jégre helyezzük, és kloroform és izoamil-alkohol 24:1 térfogatarányú elegyével extrahálva proteinmentesítjük. A mintákat ezután -20 °C-on tároljuk vagy egy hűtött (4 °C-os) WISP (Waters) HPLC autoinjektorra töltjük.

Az oligonukleotid hidrolízisét úgy követjük nyomon, hogy méijük az eltűnt kiindulási vegyület mennyiségét.

Az oligonukleotidokat (a reakcióelegyból) egy LKB Ultrachrome GTi kettős pumpás kromatográfiás rendszeren választjuk el, amely egy rögzített hullámhosszú detektorral (260 nm) és adatrögzítő integrátorral van felszerelve, és egy A pufferrel (1 mmol/1 EDTA; 15 mmol/1 nátrium-foszfát, pH=8,5) kiegyenlített GenPak FAX (Waters) anioncserélőgyanta-oszlopot tartalmaz. Az oszlop hőmérsékletét 60 °C-on tartjuk. 50 μΐ mintatérfogattal dolgozunk. Az oligonukleotidokat 0%-ról 100%-ra változó lineáris B puffer gradienssel eluáljuk 60 perc alatt (B puffer: 0,5 mol/1 nátrium-kloridot tartalmazó A puffer). Az eluálási sebesség 1 ml/perc.

Két óra hosszat boíjúembrió-szérummal asszociált exonukleáz jelenlétében végzett inkubálás után nem figyelhető meg a 7. és 10. vegyület bomlása (5. táblázat, bomlási %, nagy csúcs). Ugyanilyen inkubálás után a 9. és 8. vegyületből 87,0%, illetve 82,1% maradt. Összehasonlításképpen, all. oligomemek mindössze 24,7%-a maradt meg ugyanilyen inkubálási idő után.

5. táblázat

Minta- szám	Nagyobb csúcs alatti terület, 0,0 perc	Nagyobb csúcs alatti terület, 2,0 óra	Bomlási %, nagyobb csúcs
7.	0,2325	0,3663	0,0
9.	0,3744	0,3258	13,0
8.	0,2164	0,1777	17,9
10.	0,3642	0,3697	0,0
11.	1,2861	0,3177	75,3

A táblázatból látható, hogy mind a négy TEG-oligomer ellenállt az FCS-kapcsolatos exonukleázos hidrolízisnek. A bisz-di-TEG-oligomerek (7. és 10.) telje60 sen ellenálltak a hidrolízisnek. Az oligodezoxinukleo19

HU 217 036 Β tidok TEG-származékai tehát szignifikánsan jobban ellenállnak az exonukleázos hidrolízisnek, mint a nem módosított vegyületek.

41. példa

A TEG-antiszensz oligomerekproteinexpressziót és humántumorsejtvonal-növekedést gátló képessége és a perifériás vérlimfociták PHA-stimuláló képessége

Ismeretes, hogy a c-myc onkogén iniciációs kodon területének megfelelő antiszensz oligonukleotidok képesek gátolni a c-myc protein expresszióját a PHA-val stimulált perifériás vérlimfocitákban (PBL), ami azt eredményezi, hogy blokkolódik a sejtek fejlődése a sejtciklus S-fázisába [Heikkila, R. és munkatársai: Natúré, 328, 445-449 (1987)]. A c-myc-nek megfelelő antiszensz DNS in vitro szintén gátolja a HL-60 humán eritroleukémia sejtek növekedését [Wickstrom, E.L. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA,85, 1028-1032 (1988)]. Előállítottuk a 6. táblázatban megadott szekvenciákat, és az alábbi módszerekkel vizsgáltuk.

6. táblázat

5’ AAC GTT GAG GGG CAT 3'

5’XX AAC GTT GAG GGG CAT XX A 3’ (X=TEG)

A) Módosított (TEG-gel) és nem módosított CMYC antiszensz DNS PHA-val stimulált PBL a sejtciklus S-fázisába való fejlődésére gyakorolt hatásának összehasonlítása

Humán PBL-t stimuláltunk 48 óra hosszat a 6. táblázatban megadott szekvencia jelenlétében, illetve anélkül PHA-val. Átfolyásos citometrikus módszerrel mértük a kezeletlen kontrollra vonatkoztatva a sejtek azon százalékát, amelyek a sejtciklus S-fázisában voltak. Az eredményeket a 7. táblázat tartalmazza.

7. táblázat

Oligonukleotid	Koncent- ráció [μπι]	Kontroll S-fázis
-		100
5’ AAC GTT GAG GGG CAT 3’	30 60	75±6 9±10
5’ XX AAC GTT GAG GGG	30	80±4
CAT XX A 3’	60	< 6

A táblázatban látható, hogy akár a 3’-, akár az 5'-végen jelen levő TEG nem változtatja meg az antiszensz DNS inhibitor hatását.

B) Módosított (TEG-gel) és nem módosított C-MYC antiszensz DNS MOLT-4 humán T-sejt leukémiasejtekben történő C-MYC protein expressziójára gyakorolt hatásának összehasonlítása

Aszinkron módon exponenciálisan növekedő MOLT4-sejteket inkubáltunk 8 óra hosszat 60 pmol/l c-myc-nek megfelelő antiszensz DNS jelenlétében, illetve anélkül. A sejteket azután 45 percig inkubáltuk ³⁵S-metionin jelenlétében, és a c-myc protein-tartalmat c-myc antitesttel történő radioimmun kicsapással határoztuk meg. Az eredményeket a 8. táblázat tartalmazza.

8. táblázat

Oligonukleotid	Koncent- ráció [gm]	C-MYC protein %-os csökkenése
-		0
5’ AAC GTT GAG GGG CAT 3’	60	61,0 ±2,6
5’ XX AAC GTT GAG GGG CAT XX A 3’	60	67,9±0,7

A TEG-et tartalmazó antiszensz DNS kissé hatéko25 nyabb volt, mint a nem módosított antiszensz DNS.

C) Módosított (TEG-gel) és nem módosított C-MYC antiszensz DNS humán CCRF-CEM T-sejt leukémiasejtek in vitro növekedésének gátlására kifejtett hatásának összehasonlítása

Aszinkron módon exponenciálisan növekedő CCRFCEM-sejteket 48 óra hosszat inkubáltunk antiszensz DNS jelenlétében, illetve anélkül, majd minden vizsgált csoportban meghatároztuk a sejtszámot. Ezután meghatároztuk a sejtek növekedésének 50%-os gátlásához szükséges antiszensz DNS-koncentrációt (IC₅₀). Az 5. táblázatban megadott, mind a módosított, mind a nem módosított antiszensz DNS 40 pmol/l IC₅₀ koncentrációt mutatott.

Az adatok tehát azt mutatják, hogy az antiszensz

DNS akár 3’-, akár 5'-végén jelen levő TEG nem befolyásolja az antiszensz DNS hibridizálóképességét, és így a célzott nukleinsav funkciójának gátlását.

42. példa

Exonukleázokkal szemben stabil további oligonukleotidok

A 38. példa szerinti módon további, a 9. táblázatban megadott, exonukleázokkal szemben stabil oligonukleotidokat szintetizáltunk.

Claims (4)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás vegyületek nukleázok által okozott lebomlásának gátlására, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleozid-szekvenciát állítunk elő, amely 6-200 bázisból áll, és egy -D-D-D- általános képletű, háromatomos intemukleozidkötést tartalmaz, ahol

D jelentése CHR, NR⁶ általános képletű csoport vagy oxigénatom, ahol R jelentése hidrogénatom, OH, SH vagy NH₂ képletű csoport, R⁶ jelentése hidrogénatom vagy egy vagy két szénatomos alkilcsoport, azzal a megkötéssel, hogy egyszerre csak egy D képviselhet oxigénatomot, vagy NR⁶ általános képletű csoportot.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (I) általános képletű oligonukleozid-szekvenciát állítunk elő, ahol

W jelentése -D-D-D- képletű csoport, ahol D mindegyike egymástól függetlenül CHR vagy NR⁶ képletű csoport vagy oxigénatom, ahol R jelentése hidrogénatom, hidroxilcsoport, tiocsoport vagy aminocsoport, R⁶ jelentése hidrogénatom vagy egy vagy két szénatomos alkilcsoport, azzal a megkötéssel, hogy csak egy D jelenthet oxigénatomot vagy NR⁶ képletű csoportot,

W’ jelentése W vagy (a) képletű csoport,

R¹ jelentése OH, SH, NR²R³ képletű csoport, ahol R² és

R³ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy 1 -6 szénatomos alkilcsoport, vagy NHR⁴ képletű csoport, ahol R⁴ jelentése 1-12 szénatomos acilcsoport,

Y jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy hidroxilcsoport,

B jelentése egymástól függetlenül adenin, citozin, guanin, timin, uracil vagy ezek módosulatai, j értéke 1 -200, k értéke 0 vagy 1 -197, és q értéke 0 vagy 1-197, azzal a megkötéssel, hogy j+k+q összege 4-200.

3. Eljárás nukleotid- vagy oligonukleozid-szekvenciák stabilizálására, azzal jellemezve, hogy a nukleotidvagy oligonukleozid-szekvencia egyik vagy mindkét végére polialkilénglikol-csoportot kapcsolunk.

4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vegyület 5’-terminálisának védelmére tritil-diolciano-foszfint alkalmazunk.