CN113557023A - Serpinc1 iRNA组合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含iRNA药剂的药物组合物，所述iRNA药剂例如双链核糖核酸(dsRNA)药剂；以及使用此类组合物治疗患有血友病的受试者(例如，具有或不具有抑制剂)的出血事件的方法。

Description

Serpinc1 iRNA组合物及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求对2019年1月16日提交的美国临时申请号62/793,020的优先权益，其全部内容通过引用并入本文。
本申请涉及以下申请：2018年7月10日提交的国际申请号PCT/US2018/041400、2017年7月10日提交的美国临时专利申请号：62/530,518、2017年12月15日提交的美国临时专利申请号：62/599,223、2018年1月5日提交的美国临时专利申请号：62/614,111以及2018年5月18日提交的美国临时专利申请号：62/673,424。前述专利申请中每一项的全部内容通过引用并入本文。
本申请还涉及2016年12月7日提交的美国专利申请号：15/371,300、2016年12月7日提交的国际申请号PCT/US2016/065245、2015年12月7日提交的美国临时专利申请号：62/264,013、2016年3月30日提交的美国临时专利申请号：62/315,228、2016年7月25日提交的美国临时专利申请号：62/366,304以及2016年12月2日提交的美国临时专利申请号：62/429,241。前述专利申请中每一项的全部内容通过引用特此并入本文。
另外，本申请涉及2014年5月12日提交的美国临时专利申请号：61/992,057、2014年12月8日提交的美国临时专利申请号：62/089,018、2015年1月12日提交的美国临时专利申请号：62/102,281以及2015年5月12日提交的国际申请号PCT/US2015/030337。前述专利申请中每一项的全部内容通过引用特此并入本文。
本申请还涉及2012年4月26日提交的美国临时专利申请号：61/638,952、2012年7月9日提交的美国临时专利申请号：61/669,249、2012年12月7日提交的美国临时专利申请号：61/734,573、2013年3月15日提交的美国专利申请号：13/837,129(现在的美国专利号：9,127,274)、2015年7月22日提交的美国专利申请号：14/806,084(现在的美国专利号：9,376,680)、2016年3月15日提交的美国专利申请号：15/070,358、2018年4月18日提交的美国专利申请号：15/955,873、2018年12月14日提交的美国专利申请号：16/220,157以及2013年4月25日提交的国际申请号PCT/US2013/038218。本申请还涉及2012年11月16日提交的国际申请号PCT/US2012/065601。前述专利申请中每一项的全部内容通过引用特此并入本文。
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子提交并且通过引用以其整体特此并入的序列表。2020年1月7日创建的所述ASCII副本命名为117811_03020_SL.TXT并且大小为20,997字节。
背景技术
Serpinc1是丝氨酸蛋白酶抑制剂(丝氨酸蛋白酶抑制蛋白)超家族的成员。Serpinc1是一种血浆蛋白酶抑制剂，其抑制凝血酶以及凝血系统中其他激活的丝氨酸蛋白酶，如因子X、IX、XI、XII和VII，并且因此调节凝血级联。Serpinc1的抗凝剂活性被肝素和催化凝血酶:抗凝血酶(TAT)复合物形成的其他相关糖胺聚糖的存在增强。
遗传性或获得性出血障碍是其中存在血液凝固不足的病症。例如，血友病是一类遗传性的遗传出血障碍，其损害身体控制血液凝固或凝血的能力。血友病A是一种隐性X连锁的遗传障碍，其涉及功能性凝固因子VIII的缺乏并且占血友病病例的80％。血友病B是一种隐性X连锁的遗传障碍，其涉及功能性凝固因子IX的缺乏。其占血友病病例的大约20％。血友病C是一种常染色体遗传障碍，其涉及功能性凝固因子XI的缺乏。血友病C并非完全隐性，因为杂合个体也显示增加的出血。
尽管目前不存在血友病的治愈，但是可以通过定期输注缺乏的凝固因子(例如，血友病A中的因子VIII)来控制血友病。然而，一些血友病患者产生针对给予他们的替代因子的抗体(抑制剂)，并且因此变为替代凝血因子难治的。因此，无法适当控制此类受试者的出血。
最近开发出研究性的、一个月一次皮下施用的RNAi治疗性靶向抗凝血酶(AT)非妥西兰(Fitusiran)用于在使用和不使用抑制剂的情况下治疗血友病A和B，并且本领域中需要包含这种治疗药的稳定药物组合物作为患有出血障碍(如血友病)的受试者的替代性治疗。
发明内容
本发明部分是基于包含抑制Serpinc1基因的表达的双链核糖核酸药剂(dsRNA)药剂的稳定药物组合物的发现，如与包含抑制Serpinc1基因的表达的dsRNA药剂的其他组合物相比，所述药物组合物具有改进的稳定性、功效、持久性和易施用性。此类药物组合物可用于治疗患有出血障碍(如血友病)的受试者。
因此，在一方面，本发明提供一种用于抑制Serpinc1基因的表达的药物组合物，其包含浓度为约50mg/mL至约200mg/mL的双链核糖核酸(dsRNA)药剂和浓度为约1mM至约10mM的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其中所述药物组合物的pH适合于皮下施用至受试者，其中所述dsRNA药剂具有由核苷酸序列5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)组成的有义链和由核苷酸序列5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQID NO:960)组成的反义链，其中a、g、c和u是2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf是2'-氟A、G、C、U；并且s是硫代磷酸酯连接，并且其中配体经由接头缀合至所述有义链的3'端，并且其中所述配体和所述接头具有以下结构：
Figure BDA0003257180980000031
其中所述dsRNA药剂呈游离酸形式。
在另一方面，本发明提供一种用于抑制Serpinc1基因的表达的药物组合物，其包含浓度为约50mg/mL至约200mg/mL的双链核糖核酸(dsRNA)药剂和浓度为约1mM至约10mM的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其中所述药物组合物的pH适合于皮下施用至受试者，其中所述dsRNA药剂具有由核苷酸序列5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)组成的有义链和由核苷酸序列5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQID NO:960)组成的反义链，其中a、g、c和u是2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf是2'-氟A、G、C、U；并且s是硫代磷酸酯连接，并且其中配体经由接头缀合至所述有义链的3'端，并且其中所述配体和所述接头具有以下结构：
Figure BDA0003257180980000041
其中所述dsRNA药剂呈盐形式。
在一方面，本发明提供一种用于抑制Serpinc1基因的表达的药物组合物，其包含浓度为约50mg/mL至约200mg/mL的双链核糖核酸(dsRNA)药剂和浓度为约1mM至约10mM的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其中所述药物组合物的pH和渗透压适合于皮下施用至受试者，其中所述dsRNA药剂具有由核苷酸序列5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ IDNO:941)组成的有义链和由核苷酸序列5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)组成的反义链，其中a、g、c和u是2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf是2'-氟A、G、C、U；并且s是硫代磷酸酯连接，并且其中配体经由接头缀合至所述有义链的3'端，并且其中所述配体和所述接头具有以下结构：
Figure BDA0003257180980000042
其中所述dsRNA药剂呈游离酸形式。
在另一方面，本发明提供一种用于抑制Serpinc1基因的表达的药物组合物，其包含浓度为约50mg/mL至约200mg/mL的双链核糖核酸(dsRNA)药剂和浓度为约1mM至约10mM的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其中所述药物组合物的pH和渗透压适合于皮下施用至受试者，其中所述dsRNA药剂具有由核苷酸序列5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ IDNO:941)组成的有义链和由核苷酸序列5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)组成的反义链，其中a、g、c和u是2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf是2'-氟A、G、C、U；并且s是硫代磷酸酯连接，并且其中配体经由接头缀合至所述有义链的3'端，并且其中所述配体和所述接头具有以下结构：
Figure BDA0003257180980000051
其中所述dsRNA药剂呈盐形式。
所述dsRNA的盐形式可以是钠盐形式。
在一个实施方案中，所述药剂中基本上所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯基团都包含钠反离子。在另一实施方案中，所述药剂中的所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯基团都包含钠反离子。
所述药物组合物中的PBS浓度可以为在约2mM与约7mM之间；在约3至约6mM之间；或者约5mM。
所述药物组合物的pH可以为在约5.0至约8.0之间；在约6.0至约8.0之间；在约6.5至约7.5之间；或者在约6.8至约7.2之间。
所述药物组合物的渗透压可以为在约50mOsm/kg与约400mOsm/kg之间；在约100mOsm/kg与约400mOsm/kg之间；在约240mOsm/kg与约390mOsm/kg之间；或者在约290mOsm/kg与约320mOsm/kg之间。
所述药物组合物中dsRNA药剂的浓度可以为在约50mg/mL与约150mg/mL之间；在约80mg/mL与约110mg/mL之间；或者约100mg/mL。
在一个实施方案中，当在约2℃至约8℃下储存时，所述组合物稳定约6个月至约36个月之间。在另一实施方案中，当在约25℃和60％相对湿度(RH)下储存时，所述组合物稳定约6个月至约36个月之间。在又另一实施方案中，当在约40℃和75％相对湿度(RH)下储存时，所述组合物稳定约6个月。
在另一实施方案中，当在约2℃至约8℃下储存时，所述组合物稳定长达约36个月。在另一实施方案中，当在约25℃和60％相对湿度(RH)下储存时，所述组合物稳定长达约36个月。在又另一实施方案中，当在约40℃和75％相对湿度(RH)下储存时，所述组合物稳定长达约6个月。
在一个实施方案中，如通过纯度非变性IPRP-HPLC所确定，所述组合物包含不小于(NLT)约95.0面积％双链体和不大于(NMT)约5面积％双链体总杂质。
在一个实施方案中，如通过纯度变性AX-HPLC所确定，所述组合物包含不小于(NLT)约85.0面积％总单链。
在一个实施方案中，如通过纯度变性IPRP-HPLC所确定，所述组合物包含不小于(NLT)约80.0面积％总单链。
本发明还提供包含本发明的药物组合物的小瓶和注射器。
小瓶可以包括约0.5mL至约2.0ml的药物组合物；或者约0.8ml的药物组合物。
本发明的注射器可以是1ml注射器；或者3ml注射器。在一个实施方案中，注射器是1ml一次性注射器。
本发明的注射器可以包括29G针；或30G针。在一个实施方案中，针是29G针。
在一方面，本发明提供一种用于抑制Serpinc1基因的表达的药物组合物，其包含浓度为约100mg/mL的双链核糖核酸(dsRNA)药剂和浓度为约5mM的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其中所述药物组合物的pH为约6.8至约7.2，其中所述dsRNA药剂具有由核苷酸序列5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)组成的有义链和由核苷酸序列5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)组成的反义链，其中a、g、c和u是2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf是2'-氟A、G、C、U；并且s是硫代磷酸酯连接，并且其中配体经由接头缀合至所述有义链的3'端，并且其中所述配体和所述接头具有以下结构：
Figure BDA0003257180980000061
其中所述dsRNA药剂呈游离酸形式。
在另一方面，本发明提供一种用于抑制Serpinc1基因的表达的药物组合物，其包含浓度为约106mg/mL的双链核糖核酸(dsRNA)药剂和浓度为约5mM的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其中所述药物组合物的pH为约6.8至约7.2，其中所述dsRNA药剂具有由核苷酸序列5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)组成的有义链和由核苷酸序列5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)组成的反义链，其中a、g、c和u是2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf是2'-氟A、G、C、U；并且s是硫代磷酸酯连接，并且其中配体经由接头缀合至所述有义链的3'端，并且其中所述配体和所述接头具有以下结构：
Figure BDA0003257180980000071
其中所述dsRNA药剂呈盐形式。
在一方面，本发明提供一种用于抑制Serpinc1基因的表达的药物组合物，其包含浓度为约100mg/mL的双链核糖核酸(dsRNA)药剂和浓度为约5mM的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其中所述药物组合物的pH为约6.8至约7.2，其中所述药物组合物的渗透压为约300mOsm/kg，其中所述dsRNA药剂具有由核苷酸序列5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)组成的有义链和由核苷酸序列5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)组成的反义链，其中a、g、c和u是2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf是2'-氟A、G、C、U；并且s是硫代磷酸酯连接，并且其中配体经由接头缀合至所述有义链的3'端，并且其中所述配体和所述接头具有以下结构：
Figure BDA0003257180980000072
其中所述dsRNA药剂呈游离酸形式。
在另一方面，本发明提供一种用于抑制Serpinc1基因的表达的药物组合物，其包含浓度为约106mg/mL的双链核糖核酸(dsRNA)药剂和浓度为约5mM的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其中所述药物组合物的pH为约6.8至约7.2，其中所述药物组合物的渗透压为约300mOsm/kg，其中所述dsRNA药剂具有由核苷酸序列5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)组成的有义链和由核苷酸序列5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)组成的反义链，其中a、g、c和u是2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf是2'-氟A、G、C、U；并且s是硫代磷酸酯连接，并且其中配体经由接头缀合至所述有义链的3'端，并且其中所述配体和所述接头具有以下结构：
Figure BDA0003257180980000081
其中所述dsRNA药剂呈盐形式。
在一个实施方案中，所述盐形式是钠盐形式。
在一个实施方案中，所述药剂中基本上所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯基团都包含钠反离子。在另一实施方案中，所述药剂中的所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯基团都包含钠反离子。
在一个实施方案中，当在约2℃至约8℃下储存时，所述组合物稳定约6个月至约36个月之间。在另一实施方案中，当在约25℃和60％相对湿度(RH)下储存时，所述组合物稳定约6个月至约36个月之间。在又另一实施方案中，当在约40℃和75％相对湿度(RH)下储存时，所述组合物稳定约6个月。
在一个实施方案中，当在约2℃至约8℃下储存时，所述组合物稳定长达约36个月。在另一实施方案中，当在约25℃和60％相对湿度(RH)下储存时，所述组合物稳定长达约36个月。在又另一实施方案中，当在约40℃和75％相对湿度(RH)下储存时，所述组合物稳定长达6个月。
在一个实施方案中，如通过纯度非变性IPRP-HPLC所确定，所述组合物包含不小于(NLT)约95.0面积％双链体和不大于(NMT)约5面积％双链体总杂质。
在一个实施方案中，如通过纯度变性AX-HPLC所确定，所述组合物包含不小于(NLT)约85.0面积％总单链。
在一个实施方案中，如通过纯度变性IPRP-HPLC所确定，所述组合物包含不小于(NLT)约80.0面积％总单链。
本发明还提供包含前述药物组合物的小瓶。小瓶可以包括约0.5mL至约2.0ml的药物组合物；或者约0.8ml的药物组合物。
本发明进一步提供包含前述药物组合物的注射器。
本发明的注射器可以是1ml注射器；或者3ml注射器。在一个实施方案中，注射器是1ml一次性注射器。
本发明的注射器可以包括29G针；或30G针。在一个实施方案中，针是29G针。
在一个实施方案中，注射器是预填充的注射器。
在另一方面，本发明提供一种包含约0.8ml的用于抑制Serpinc1基因的表达的药物组合物的2ml小瓶，其中所述药物组合物包含浓度为约106mg/mL的双链核糖核酸(dsRNA)药剂和浓度为约5mM的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其中所述药物组合物的pH为约6.8至约7.2，其中所述药物组合物的渗透压为约300mOsm/kg，其中所述dsRNA药剂具有由核苷酸序列5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)组成的有义链和由核苷酸序列5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)组成的反义链，其中a、g、c和u是2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf是2'-氟A、G、C、U；并且s是硫代磷酸酯连接，并且其中配体经由接头缀合至所述有义链的3'端，并且其中所述配体和所述接头具有以下结构：
Figure BDA0003257180980000091
其中所述dsRNA药剂呈钠盐形式并且所述药剂中的所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯基团都包含钠反离子。
在另一方面，本发明提供一种包含29G针的1ml预填充的一次性注射器，其中所述注射器包含约0.8ml的用于抑制Serpinc1基因的表达的药物组合物，其中所述药物组合物包含浓度为约106mg/mL的双链核糖核酸(dsRNA)药剂和浓度为约5mM的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其中所述药物组合物的pH为约6.8至约7.2，其中所述药物组合物的渗透压为约300mOsm/kg，其中所述dsRNA药剂具有由核苷酸序列5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)组成的有义链和由核苷酸序列5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)组成的反义链，其中a、g、c和u是2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf是2'-氟A、G、C、U；并且s是硫代磷酸酯连接，并且其中配体经由接头缀合至所述有义链的3'端，并且其中所述配体和所述接头具有以下结构：
Figure BDA0003257180980000101
其中所述dsRNA药剂呈钠盐形式并且所述药剂中的所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯基团都包含钠反离子。
在另一方面，本发明提供一种包含约0.8ml的用于抑制Serpinc1基因的表达的药物组合物的2ml小瓶，其中所述药物组合物包含浓度为约106mg/mL的双链核糖核酸(dsRNA)药剂和浓度为约5mM的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其中所述药物组合物的pH为约6.8至约7.2，其中所述药物组合物的渗透压为约300mOsm/kg，其中所述dsRNA药剂具有以下结构
Figure BDA0003257180980000102
其中Am、Gm、Cm和Um是2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf是2'-氟A、G、C、U；s是硫代磷酸酯连接；并且其中L96是具有以下结构的配体和接头：
Figure BDA0003257180980000111
其中所述dsRNA药剂呈钠盐形式并且所述药剂中的所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯基团都包含钠反离子。
在另一方面，本发明提供一种包含29G针的1ml预填充的一次性注射器，其中所述注射器包含约0.8ml的用于抑制Serpinc1基因的表达的药物组合物，其中所述药物组合物包含浓度为约106mg/mL的双链核糖核酸(dsRNA)药剂和浓度为约5mM的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其中所述药物组合物的pH为约6.8至约7.2，其中所述药物组合物的渗透压为约300mOsm/kg，其中所述dsRNA药剂具有以下结构
Figure BDA0003257180980000112
其中Am、Gm、Cm和Um是2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf是2'-氟A、G、C、U；s是硫代磷酸酯连接；并且其中L96是具有以下结构的配体和接头：
Figure BDA0003257180980000113
其中所述dsRNA药剂呈钠盐形式并且所述药剂中的所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯基团都包含钠反离子。
在另一方面，本发明提供一种包含约0.8ml的用于抑制Serpinc1基因的表达的药物组合物的2ml小瓶，其中所述药物组合物包含浓度为约106mg/mL的双链核糖核酸(dsRNA)药剂和浓度为约5mM的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其中所述药物组合物的pH为约6.8至约7.2，其中所述dsRNA药剂具有由核苷酸序列5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)组成的有义链和由核苷酸序列5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)组成的反义链，其中a、g、c和u是2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf是2'-氟A、G、C、U；并且s是硫代磷酸酯连接，并且其中配体经由接头缀合至所述有义链的3'端，并且其中所述配体和所述接头具有以下结构：
Figure BDA0003257180980000121
其中所述dsRNA药剂呈钠盐形式并且所述药剂中的所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯基团都包含钠反离子。
在另一方面，本发明提供一种包含29G针的1ml预填充的一次性注射器，其中所述注射器包含约0.8ml的用于抑制Serpinc1基因的表达的药物组合物，其中所述药物组合物包含浓度为约106mg/mL的双链核糖核酸(dsRNA)药剂和浓度为约5mM的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其中所述药物组合物的pH为约6.8至约7.2，其中所述dsRNA药剂具有由核苷酸序列5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)组成的有义链和由核苷酸序列5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)组成的反义链，其中a、g、c和u是2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf是2'-氟A、G、C、U；并且s是硫代磷酸酯连接，并且其中配体经由接头缀合至所述有义链的3'端，并且其中所述配体和所述接头具有以下结构：
Figure BDA0003257180980000122
其中所述dsRNA药剂呈钠盐形式并且所述药剂中的所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯基团都包含钠反离子。
在另一方面，本发明提供一种包含约0.8ml的用于抑制Serpinc1基因的表达的药物组合物的2ml小瓶，其中所述药物组合物包含浓度为约106mg/mL的双链核糖核酸(dsRNA)药剂和浓度为约5mM的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其中所述药物组合物的pH为约6.8至约7.2，其中所述dsRNA药剂具有以下结构
Figure BDA0003257180980000131
其中Am、Gm、Cm和Um是2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf是2'-氟A、G、C、U；s是硫代磷酸酯连接；并且其中L96是具有以下结构的配体和接头：
Figure BDA0003257180980000132
其中所述dsRNA药剂呈钠盐形式并且所述药剂中的所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯基团都包含钠反离子。
在另一方面，本发明提供一种包含29G针的1ml预填充的一次性注射器，其中所述注射器包含约0.8ml的用于抑制Serpinc1基因的表达的药物组合物，其中所述药物组合物包含浓度为约106mg/mL的双链核糖核酸(dsRNA)药剂和浓度为约5mM的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其中所述药物组合物的pH为约6.8至约7.2，其中所述dsRNA药剂具有以下结构
Figure BDA0003257180980000133
其中Am、Gm、Cm和Um是2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf是2'-氟A、G、C、U；s是硫代磷酸酯连接；并且其中L96是具有以下结构的配体和接头：
Figure BDA0003257180980000141
其中所述dsRNA药剂呈钠盐形式并且所述药剂中的所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯基团都包含钠反离子。
附图说明
图1描绘非妥西兰药物产品的代表性非变性离子对反相高效液相色谱(IP RP-HPLC)色谱图。由于siRNA双链体中硫代磷酸酯的不同立体异构体的部分拆分，观察到非妥西兰双链体峰的偶然轻度分裂。对非妥西兰峰的质谱分析确认了预期质量的两条单链以等比率遍及整个双链体峰中的存在。
图2描绘非妥西兰药物产品中的呈双链体的单链的代表性变性阴离子交换高效液相色谱(AX-HPLC)色谱图。
图3描绘非妥西兰药物产品中的呈双链体的单链的代表性变性离子对反相高效液相色谱(IP RP-HPLC)色谱图。
具体实施方式
本发明提供包含iRNA药剂的药物组合物，所述iRNA药剂实现RNA诱导的沉默复合物(RISC)介导的对Serpinc1基因的RNA转录物的切割。本发明至少部分是基于包含此类药剂的稳定药物组合物的发现，如与包含抑制Serpinc1基因的表达的dsRNA药剂的其他组合物相比，所述药物组合物具有改进的稳定性、功效、持久性和易施用性。此类药物组合物可用于抑制Serpinc1基因的表达和/或用于治疗患有会受益于抑制或减少Serpinc1基因的表达的障碍(例如，出血障碍，如血友病)的受试者。
以下详细说明公开如何制备和使用含有iRNA的组合物抑制Serpinc1基因的表达，以及用于治疗患有会受益于该基因的表达的抑制和/或减少的疾病和障碍的受试者的组合物、用途和方法。
I.定义
为了可以更容易地理解本发明，首先定义某些术语。另外，应注意，不论何时列举参数的值或值的范围，所列举值中间的值和范围也意图是本发明的部分。
冠词“一个/一种(a)”和“一个/一种(an)”在本文中用于指代所述冠词的一个或超过一个(即，至少一个)语法对象。举例来说，“一种要素”意指一个/一种要素或超过一个/超过一种要素，例如，多个/多种要素。
术语“约”在本文中用于意指在本领域中容差的典型范围内。例如，“约”可以理解为距平均值约2个标准差。在某些实施方案中，约意指+10％。在某些实施方案中，约意指+5％。当约存在于一系列数字或范围之前时，应理解“约”可以修饰所述系列或范围中的每一个数字。
术语“包括”在本文中用于意指短语“包括但不限于”，并且可与所述短语互换使用。
除非上下文另有明确指示，否则术语“或”在本文中用于意指术语“和/或”，并且可与所述术语互换使用。
如本文所用术语“药物组合物”是指用于治疗受试者(例如，人受试者)的疾病或障碍的组合物。
术语“药物施用”是指将如本文所述的包含dsRNA药剂的组合物递送至受试者用于治疗疾病或障碍。因此，“适合于药物施用”(如“适合于皮下施用”)描述包含dsRNA药剂的组合物，其可用于通过所述药物组合物的皮下施用来治疗受试者的疾病或障碍。药物组合物适合于药物施用，例如，适合于皮下施用。
术语“渗透压(osmolality)”是指每千克溶剂中溶质的渗透压摩尔数。其表示为osmol/kg或Osm/kg。“渗透压摩尔”是描述贡献化学溶液的渗透压的化合物的摩尔数的测量单位。
如本文所用，“Serpinc1”是指细胞中表达的特定多肽。Serpinc1也称为丝氨酸蛋白酶抑制蛋白肽酶抑制剂，进化枝C(抗凝血酶；AT)，成员1；抗凝血酶III；AT3；抗凝血酶；和肝素辅因子1。人Serpinc1 mRNA转录物的序列可以发现于例如GenBank登录号GI:254588059(NM_000488；SEQ ID NO:1)。恒河猴Serpinc1 mRNA的序列可以发现于例如GenBank登录号GI:157167169(NM_001104583；SEQ ID NO:2)。小鼠Serpinc1 mRNA的序列可以发现于例如GenBank登录号GI:237874216(NM_080844；SEQ ID NO:3)。大鼠Serpinc1mRNA的序列可以发现于例如GenBank登录号GI:58865629(NM_001012027；SEQ ID NO:4)。
如本文所用术语“Serpinc1”也是指细胞中通过Serpinc1基因的天然存在的DNA序列变异(如Serpinc1基因中的单核苷酸多态性)表达的特定多肽。Serpinc1基因内的多种SNP已经被鉴定并且可以发现于例如NCBI dbSNP(参见例如，www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)。Serpinc1基因内的SNP的非限制性例子可以发现于NCBI dbSNP登录号rs677；rs5877；rs5878；rs5879；rs941988；rs941989；rs1799876；rs19637711；rs2008946；和rs2227586。
如本文所用，“受试者”是动物，如哺乳动物，包括灵长类动物(如人、非人灵长类动物，例如猴子和黑猩猩)、非灵长类动物(如牛、猪、骆驼、骆马、马、山羊、兔子、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠、小鼠、马和鲸)，或者鸟类(例如，鸭子或鹅)。在一个实施方案中，受试者是人，如针对会受益于Serpinc1表达减少的疾病、障碍或病症进行治疗或评估的人类；具有会受益于Serpinc1表达减少的疾病、障碍或病症的风险的人；患有会受益于Serpinc1表达减少的疾病、障碍或病症的人；和/或针对如本文所述的会受益于Serpinc1表达减少的疾病、障碍或病症进行治疗的人类。
如本文所用术语“抑制”可与“减少”、“沉默”、“下调”、“压制”和其他类似术语互换使用，并且包括任何水平的抑制。
如本文所用短语“抑制Serpinc1的表达”包括抑制任何Serpinc1基因(如例如，小鼠Serpinc1基因、大鼠Serpinc1基因、猴Serpinc1基因或人Serpinc1基因)以及编码Serpinc1蛋白的Serpinc1基因的变体或突变体的表达。
“抑制Serpinc1基因的表达”包括任何水平的对Serpinc1基因的抑制，例如，对Serpinc1基因的表达的至少部分压制，如抑制至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。
Serpinc1基因的表达可以基于与Serpinc1基因表达相关的任何变量的水平来评估，所述变量例如Serpinc1 mRNA水平、Serpinc1蛋白水平、或例如作为凝血酶生成潜力的量度的凝血酶:抗凝血酶复合物水平、出血时间、凝血酶原时间(PT)、血小板计数和/或激活的部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)。抑制可以通过与对照水平相比，这些变量中的一种或多种的绝对或相对水平的降低来评估。对照水平可以是本领域中所用的任何类型的对照水平，例如，剂量前基线水平，或者从未处理的或用对照(如例如，仅缓冲液对照或无活性药剂对照)处理的类似受试者、细胞或样品确定的水平。
在一个实施方案中，对Serpinc1基因的表达的至少部分压制是通过Serpinc1mRNA的量的减少来评估，所述Serpinc1 mRNA可以从第一细胞或细胞组分离或检测，在所述第一细胞或细胞组中，如与基本上等同于第一细胞或细胞组但尚未如此处理的第二细胞或细胞组(对照细胞)相比，Serpinc1基因被转录并且其已进行处理使得抑制Serpinc1基因的表达。抑制程度可以表示为
Figure BDA0003257180980000171
如本文所用短语“使细胞与RNAi药剂(如dsRNA)接触”包括通过任何可能的手段接触细胞。使细胞与RNAi药剂接触包括使细胞在体外与iRNA接触或使细胞在体内与iRNA接触。所述接触可以直接或间接进行。因此，例如，进行所述方法的个体可以使RNAi药剂与细胞物理接触，或者可替代地，可以使RNAi药剂处于将允许或导致其随后与细胞接触的情景中。
在体外接触细胞可以例如通过将细胞与RNAi药剂一起孵育来进行。在体内接触细胞可以例如通过以下方式来进行：将RNAi药剂注射至所述细胞所位于的组织中或附近，或者将RNAi药剂注射至另一区域(例如，血流或皮下空间)中，使得所述药剂随后将到达要接触的细胞所位于的组织。例如，RNAi药剂可以含有和/或偶联至将RNAi药剂引导至目的部位(例如，肝)的配体(例如，GalNAc3)。体外与体内接触方法的组合也是可能的。例如，也可以使细胞在体外与RNAi药剂接触，随后将其移植至受试者体内。
II.本发明的药物组合物
本发明提供稳定药物组合物，其包含抑制Serpinc1基因的表达的双链核糖核酸(dsRNA)药剂。本发明的药物组合物包括如本文所述的dsRNA药剂和磷酸盐缓冲盐水(PBS)，并且适合于皮下施用至受试者。含有dsRNA药剂的药物组合物可用于治疗与Serpinc1基因的表达或活性相关的疾病或障碍，例如Serpinc1相关疾病，例如，血友病。本发明的药物组合物可以以足以抑制Serpinc1基因的表达的剂量来施用。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物包括呈游离酸形式的本发明的dsRNA药剂。在另一实施方案中，本发明的药物组合物包括呈钠盐形式的本发明的dsRNA药剂。在某些实施方案中，当本发明的dsRNA药剂呈钠盐形式时，钠离子存在于所述药剂中作为反离子(以维持电中性)，用于所述药剂中存在的基本上所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯基团。其中基本上所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯连接具有钠反离子的药剂包括不大于5、4、3、2或1个没有钠反离子的磷酸二酯和/或硫代磷酸酯连接。在一些实施方案中，当本发明的dsRNA药剂呈钠盐形式时，钠离子存在于所述药剂中作为反离子，用于所述药剂中存在的所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯基团。
本发明的药物组合物可以包括以下浓度的dsRNA药剂：约50mg/mL至约200mg/mL、约50mg/mL至约150mg/mL；约90mg/mL至约110mg/mL、约90mg/mL至约100mg/mL或约80mg/mL至约110mg/mL，例如，约50mg/mL、55mg/mL、60mg/mL、65mg/mL、70mg/mL、75mg/mL、80mg/mL、85mg/mL、90mg/mL、95mg/mL、100mg/mL、105mg/mL、106mg/mL、110mg/mL、115mg/mL、120mg/mL、125mg/mL、130mg/mL、135mg/mL、140mg/mL、145mg/mL、150mg/mL、155mg/mL、160mg/mL、165mg/mL、170mg/mL、175mg/mL、180mg/mL、185mg/mL、190mg/mL、195mg/mL或约200mg/mL。在一个实施方案中，本发明的药物组合物包括浓度为约100mg/mL的dsRNA药剂。上文列举的范围和值中间的值也意图是本发明的部分。另外，意图包括使用任何上文所列举的值的组合作为上限和/或下限的值的范围。
本发明的药物组合物可以包括PBS。在一个实施方案中，PBS包括氯化钠和磷酸钠，但是不包括氯化钾和/或磷酸钾。在另一实施方案中，PBS包括氯化钠、磷酸钠和氯化钾。在又另一实施方案中，PBS包括氯化钠、磷酸钠和磷酸钾。在一个实施方案中，PBS包括氯化钠、磷酸钠、氯化钾和磷酸钾。在某些实施方案中，例如当PBS包括氯化钠和磷酸钠时，PBS的浓度可以为约1mM至约10mM；或者约3mM至约6mM，例如，约1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、5mM、6.5mM、7mM、7.5.mM、9mM、8.5mM、9mM、9.5mM或约10mM PBS。在本发明的一个实施方案中，本发明的药物组合物包含浓度为约5mM的PBS(例如，约0.64mM NaH2PO4、约4.36mM Na2HPO4、约85mM NaCl)。上文列举的范围和值中间的值也意图是本发明的部分。另外，意图包括使用任何上文所列举的值的组合作为上限和/或下限的值的范围。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物不含防腐剂。在本发明的另一实施方案中，本发明的药物组合物包括防腐剂。
本发明的药物组合物的pH适合于皮下施用并且可以为在约5.0至约8.0之间、约5.5至约8.0之间、约6.0至约8.0之间、约6.5至约8.0之间、约7.0至约8.0之间、约5.0至约7.5之间、约5.5至约7.5之间、约6.0至约7.5之间、约6.5至约7.5之间、约5.0至约7.2之间、约5.25至约7.2之间、约5.5至约7.2之间、约5.75至约7.2之间、约6.0至约7.2之间、约6.5至约7.2之间或约6.8至约7.2之间。上文列举的范围和值中间的范围和值也意图是本发明的部分。
本发明的药物组合物的渗透压可以适合于皮下施用，如不超过约400mOsm/kg，例如，在50mOsm/kg与400mOsm/kg之间、在75mOsm/kg与400mOsm/kg之间、在100mOsm/kg与400mOsm/kg之间、在125mOsm/kg与400mOsm/kg之间、在150mOsm/kg与400mOsm/kg之间、在175mOsm/kg与400mOsm/kg之间、在200mOsm/kg与400mOsm/kg之间、在250mOsm/kg与400mOsm/kg之间、在300mOsm/kg与400mOsm/kg之间、在50mOsm/kg与375mOsm/kg之间、在75mOsm/kg与375mOsm/kg之间、在100mOsm/kg与375mOsm/kg之间、在125mOsm/kg与375mOsm/kg之间、在150mOsm/kg与375mOsm/kg之间、在175mOsm/kg与375mOsm/kg之间、在200mOsm/kg与375mOsm/kg之间、在250mOsm/kg与375mOsm/kg之间、在300mOsm/kg与375mOsm/kg之间、在50mOsm/kg与350mOsm/kg之间、在75mOsm/kg与350mOsm/kg之间、在100mOsm/kg与350mOsm/kg之间、在125mOsm/kg与350mOsm/kg之间、在150mOsm/kg与350mOsm/kg之间、在175mOsm/kg与350mOsm/kg之间、在200mOsm/kg与350mOsm/kg之间、在250mOsm/kg与350mOsm/kg之间、在50mOsm/kg与325mOsm/kg之间、在75mOsm/kg与325mOsm/kg之间、在100mOsm/kg与325mOsm/kg之间、在125mOsm/kg与325mOsm/kg之间、在150mOsm/kg与325mOsm/kg之间、在175mOsm/kg与325mOsm/kg之间、在200mOsm/kg与325mOsm/kg之间、在250mOsm/kg与325mOsm/kg之间、在300mOsm/kg与325mOsm/kg之间、在300mOsm/kg与350mOsm/kg之间、在50mOsm/kg与300mOsm/kg之间、在75mOsm/kg与300mOsm/kg之间、在100mOsm/kg与300mOsm/kg之间、在125mOsm/kg与300mOsm/kg之间、在150mOsm/kg与300mOsm/kg之间、在175mOsm/kg与300mOsm/kg之间、在200mOsm/kg与300mOsm/kg之间、在250mOsm/kg与300之间、在50mOsm/kg与250mOsm/kg之间、在75mOsm/kg与250mOsm/kg之间、在100mOsm/kg与250mOsm/kg之间、在125mOsm/kg与250mOsm/kg之间、在150mOsm/kg与250mOsm/kg之间、在175mOsm/kg与350mOsm/kg之间、在200mOsm/kg与250mOsm/kg之间，例如，约50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、295、300、305、310、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395或约400mOsm/kg。上文列举的范围和值中间的范围和值也意图是本发明的部分。另外，意图包括使用任何上文所列举的值的组合作为上限和/或下限的值的范围。
本发明的药物组合物在物理上和在化学上是稳定的。
如本文所用，术语“稳定的”是指药物组合物和/或这种药物组合物内的dsRNA药剂，其基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性。用于测量组合物和其中的dsRNA药剂的稳定性的各种分析技术是本领域中可用的并且描述于本文中。
如果在对颜色和/或澄清度进行目视检查或UV检查时，或者如通过例如HPLC分析(例如，变性IP RP-HPLC、非变性IP RP-HPLC和/或变性AX-HPLC分析)所测量，药物组合物(或这种组合物内的dsRNA药剂)基本上不显示例如增加的杂质的迹象，则其“保持其物理稳定性”。
如果在给定时间的化学稳定性使得dsRNA药剂被认为仍然保持其生物学活性，则所述dsRNA药剂在药物组合物中“保持其化学稳定性”。化学稳定性可以通过例如检测和/或定量dsRNA双链体的化学改变的形式和/或有义链和/或反义链的化学改变的形式来评估。化学改变可以涉及大小修饰和/或钠含量变化，其可以通过例如以下方式来评价：双链体保留时间和/或鉴定形成双链体的单链的分子量，使用例如非变性IP RP-HPLC；通过解链温度来鉴定，使用例如热紫外分光光度法；和/或通过钠含量(基于无水含量)，使用例如火焰原子吸收(火焰AAS)/电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)。
如果组合物中的dsRNA药剂对于其既定目的具有生物学活性，则所述dsRNA药剂在药物组合物中“保持其生物学活性”。例如，如果组合物中的dsRNA药剂的生物学活性在制备组合物时展现的生物学活性的约30％、约20％或约10％内(在测定误差内)(例如，如通过体外RT-PCR测定所确定)，则保持生物学活性。
例如，在一些实施方案中，当在约2℃至约8℃下储存时，本发明的组合物稳定约6个月至约36个月之间。在其他实施方案中，当在约25℃和60％相对湿度(RH)下储存时，本发明的组合物稳定约6个月至约36个月之间。在仍其他实施方案中，当在约40℃和75％相对湿度(RH)下储存时，本发明的组合物稳定约6个月。
在一些实施方案中，当在约2℃至约8℃下储存时，本发明的组合物稳定长达约36个月。在其他实施方案中，当在约25℃和60％相对湿度(RH)下储存时，本发明的组合物稳定长达约36个月。在仍其他实施方案中，当在约40℃和75％相对湿度(RH)下储存时，本发明的组合物稳定长达6个月。
在一个实施方案中，如通过纯度非变性IPRP-HPLC所确定，本发明的组合物包含不小于(NLT)约95.0面积％双链体和不大于(NMT)约5面积％双链体总杂质。在另一实施方案中，如通过纯度变性AX-HPLC所确定，本发明的药物组合物包含不小于(NLT)约85.0面积％总单链。在又另一实施方案中，如通过纯度变性IPRP-HPLC所确定，本发明的药物组合物包含不小于(NLT)约80.0面积％总单链。
在一方面，本发明提供一种用于抑制Serpinc1基因的表达的药物组合物。药物组合物包括浓度为约50mg/mL至约200mg/mL的双链核糖核酸(dsRNA)药剂和浓度为约1mM至约10mM的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其中所述药物组合物的pH和渗透压适合于皮下施用至受试者，其中所述dsRNA药剂包含有义链和反义链，所述反义链包含与编码Serpinc1的mRNA互补的区域，所述区域包含与核苷酸序列5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3'(SEQ ID NO:15)相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，其中所述有义链的基本上所有核苷酸和所述反义链的基本上所有核苷酸是修饰的核苷酸，其中所述有义链与附接在3'末端的配体缀合，并且其中所述dsRNA药剂呈游离酸形式。
在另一方面，本发明提供一种用于抑制Serpinc1基因的表达的药物组合物。药物组合物包括浓度为约50mg/mL至约200mg/mL的双链核糖核酸(dsRNA)药剂和浓度为约1mM至约10mM的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其中所述药物组合物的pH和渗透压适合于皮下施用至受试者，其中所述dsRNA药剂包含有义链和反义链，所述反义链包含与编码Serpinc1的mRNA互补的区域，所述区域包含与核苷酸序列5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3'(SEQ ID NO:15)相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，其中所述有义链的基本上所有核苷酸和所述反义链的基本上所有核苷酸是修饰的核苷酸，其中所述有义链与附接在3'末端的配体缀合，并且其中所述dsRNA药剂呈盐形式。
在一个实施方案中，所述有义链的所有核苷酸和所述反义链的所有核苷酸是修饰的核苷酸。
在一个实施方案中，修饰的核苷酸独立地选自2'-脱氧-2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧-修饰的核苷酸、锁定核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基-修饰的核苷酸、2'-烷基-修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯和包含非天然碱基的核苷酸。
互补性区域可以具有至少17个核苷酸的长度或19个核苷酸的长度。
在一个实施方案中，互补性区域的长度在19与21个核苷酸之间。在另一实施方案中，互补性区域的长度在21与23个核苷酸之间。
在一个实施方案中，每条链的长度不超过30个核苷酸。
双链RNAi药剂的至少一条链可以包含至少1个核苷酸的3'突出端或至少2个核苷酸的3'突出端，例如，2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。在其他实施方案中，RNAi药剂的至少一条链包含至少1个核苷酸的5'突出端。在某些实施方案中，至少条链包含至少2个核苷酸的5'突出端，例如，2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。在仍其他实施方案中，RNAi药剂的一条链的3'端和5'端包含至少1个核苷酸的突出端。
在某些实施方案中，配体是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。配体可以是经由单价、二价或三价分支接头附接至RNAi药剂的一个或多个GalNAc。配体可以缀合至双链RNAi药剂的有义链的3'端、双链RNAi药剂的有义链的5'端、双链RNAi药剂的反义链的3'端或双链RNAi药剂的反义链的5'端。
在一些实施方案中，双链RNAi药剂包含多个(例如，2、3、4、5或6个)GalNAc，其各自独立地经由多个单价接头附接至双链RNAi药剂的多个核苷酸。
在某些实施方案中，配体是
Figure BDA0003257180980000231
在一个实施方案中，RNAi药剂经由接头与配体缀合，并且配体和接头与RNAi药剂缀合，如以下示意图中所示
Figure BDA0003257180980000232
并且，其中X是O或S。
在一个实施方案中，X是O。
在一个实施方案中，互补性区域由核苷酸序列5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3'(SEQ ID NO:15)组成。
在一个实施方案中，双链RNAi药剂包含含有核苷酸序列5'-GGUUAACACCAUUUACUUCAA-3'(SEQ ID NO:16)的有义链和含有核苷酸序列5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3'(SEQ ID NO:15)的反义链。
在一个实施方案中，有义链包含5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:13)并且反义链包含5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ IDNO:14)，其中a、c、g和u是2'-O-甲基(2'-OMe)A、C、G或U；Af、Cf、Gf或Uf是2'-氟A、C、G或U；并且s是硫代磷酸酯连接。
在一个实施方案中，有义链包含5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:13)并且反义链包含5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ IDNO:14)，其中a、c、g和u是2'-O-甲基(2'-OMe)A、C、G或U；Af、Cf、Gf或Uf是2'-氟A、C、G或U；并且s是硫代磷酸酯连接；并且其中有义链经由接头与配体缀合，并且配体和接头与RNAi药剂缀合，如以下示意图中所示
Figure BDA0003257180980000241
其中X是O或S。
在一方面，本发明提供一种用于抑制Serpinc1基因的表达的药物组合物。药物组合物包括浓度为约50mg/mL至约200mg/mL的双链核糖核酸(dsRNA)药剂和浓度为约1mM至约10mM的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其中所述药物组合物的pH和渗透压适合于皮下施用至受试者，其中所述dsRNA药剂具有由核苷酸序列5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)组成的有义链和由核苷酸序列5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)组成的反义链，其中a、g、c和u是2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf是2'-氟A、G、C、U；并且s是硫代磷酸酯连接，并且其中配体经由接头缀合至所述有义链的3'端，并且其中所述配体和所述接头具有以下结构：
Figure BDA0003257180980000242
其中所述dsRNA药剂呈游离酸形式。
在另一方面，本发明提供一种用于抑制Serpinc1基因的表达的药物组合物。药物组合物包括浓度为约50mg/mL至约200mg/mL的双链核糖核酸(dsRNA)药剂和浓度为约1mM至约10mM的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其中所述药物组合物的pH和渗透压适合于皮下施用至受试者，其中所述dsRNA药剂具有由核苷酸序列5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)组成的有义链和由核苷酸序列5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)组成的反义链，其中a、g、c和u是2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf是2'-氟A、G、C、U；并且s是硫代磷酸酯连接，并且其中配体经由接头缀合至所述有义链的3'端，并且其中所述配体和所述接头具有以下结构：
Figure BDA0003257180980000251
其中所述dsRNA药剂呈盐形式。
在一方面，本发明提供一种用于抑制Serpinc1基因的表达的药物组合物。所述组合物包括浓度为约100mg/mL的双链核糖核酸(dsRNA)药剂和浓度为约5mM的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其中所述药物组合物的pH为约6.8至约7.2，其中所述药物组合物的渗透压为约300mOsm/kg，其中所述dsRNA药剂具有由核苷酸序列5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)组成的有义链和由核苷酸序列5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)组成的反义链，其中a、g、c和u是2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf是2'-氟A、G、C、U；并且s是硫代磷酸酯连接，并且其中配体经由接头缀合至所述有义链的3'端，并且其中所述配体和所述接头具有以下结构：
Figure BDA0003257180980000252
其中所述dsRNA药剂呈游离酸形式。
在另一方面，本发明提供一种用于抑制Serpinc1基因的表达的药物组合物。药物组合物包括浓度为约106mg/mL的双链核糖核酸(dsRNA)药剂和浓度为约5mM的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其中所述药物组合物的pH为约6.8至约7.2，其中所述药物组合物的渗透压为约300mOsm/kg，其中所述dsRNA药剂具有由核苷酸序列5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)组成的有义链和由核苷酸序列5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)组成的反义链，其中a、g、c和u是2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf是2'-氟A、G、C、U；并且s是硫代磷酸酯连接，并且其中配体经由接头缀合至所述有义链的3'端，并且其中所述配体和所述接头具有以下结构：
Figure BDA0003257180980000261
其中所述dsRNA药剂呈盐形式。
本发明的组合物可以以其本领域公认的用量另外含有在药物组合物中常规发现的其他辅助组分。因此，例如，所述组合物可以含有另外的、相容的、药学活性材料，如例如，止痒药、收敛剂、局部麻醉药或抗炎剂，或者可以含有用于物理配制本发明的组合物的各种剂型的另外的材料，如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，此类材料在添加时不应过度干扰本发明的组合物的组分的生物学活性。可以将配制品灭菌，并且如果需要，将其与不会与所述配制品的一种或多种核酸有害地相互作用助剂混合，所述助剂例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲液、着色剂、调味剂和/或芳香族物质等。
在一些实施方案中，在本发明中为特征的药物组合物包括(a)一种或多种iRNA化合物，以及(b)通过非RNAi机制发挥功能且用于治疗溶血障碍的一种或多种药剂。此类药剂的例子包括但不限于抗炎剂、抗脂肪变性剂、抗病毒剂和/或抗纤维化剂。另外，一般用于保护肝脏的其他物质(如水飞蓟素)也可以与本文所述的iRNA结合使用。用于治疗肝病的其他药剂包括替比夫定、恩替卡韦和蛋白酶抑制剂(如特拉匹韦)以及例如以下文献中披露的其他药剂：Tung等人，美国申请公开号2005/0148548、2004/0167116和2003/0144217；以及Hale等人，美国申请公开号2004/0127488。
此类化合物的毒性和治疗功效可以在细胞培养中或实验动物中通过例如用于确定LD50(对群体的50％致死的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)的标准药学程序来确定。毒性影响与治疗作用之间的剂量比是治疗指数，并且其可以表示为比率LD50/ED50。展现高治疗指数的化合物是优选的。
III.用于本发明的药物组合物中的iRNA
本发明的组合物包括RNAi药剂，其靶向Serpinc1基因并抑制Serpinc1基因在细胞中的表达，所述细胞如患有Serpinc1相关障碍(例如，出血障碍，例如，血友病)的受试者(例如，哺乳动物，如人)体内的细胞。
如本文所用，“靶序列”是指在Serpinc1基因的转录期间形成的mRNA分子(包括作为初级转录产物的RNA加工产物的mRNA)的核苷酸序列的连续部分。在一个实施方案中，所述序列的靶部分将至少长至足以用作在Serpinc1基因的转录期间形成的mRNA分子的核苷酸序列的该部分处或附近进行iRNA引导的切割的底物。
靶序列的长度可以为约9-36个核苷酸，例如，长度为约15-30个核苷酸。例如，靶序列的长度可以为约15-30个核苷酸、15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24,20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个核苷酸。上文列举的范围和长度中间的范围和长度也考虑是本发明的部分。
如本文所用，术语“包含序列的链”是指包含通过使用标准核苷酸命名法提及的序列来描述的核苷酸链的寡核苷酸。
“G”、“C”、“A”、“T”和“U”各自通常代表分别含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸苷和尿嘧啶作为碱基的核苷酸。然而，应理解，术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”也可以是指如下文进一步详述的修饰的核苷酸或代替的替代部分(参见例如，表1)。技术人员充分了解，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可以被其他部分替代，而不显著改变包含带有这种替代部分的核苷酸的寡核苷酸的碱基配对特性。例如，在没有限制的情况下，包含肌苷作为其碱基的核苷酸可以与含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸碱基配对。因此，含有尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以在本发明中为特征的dsRNA的核苷酸序列中被含有例如肌苷的核苷酸替代。在另一个例子中，寡核苷酸中任意位置的腺嘌呤和胞嘧啶可以分别被鸟嘌呤和尿嘧啶替代，以与靶mRNA形成G-U摆动碱基配对。含有此类替代部分的序列适合于在本发明中为特征的组合物和方法。
如本文可互换使用的术语“iRNA”、“RNAi药剂”、“iRNA药剂”、“RNA干扰剂”是指如下药剂，其含有RNA(如该术语在本文中所定义)，并且其经由RNA诱导的沉默复合物(RISC)途径介导RNA转录物的靶向切割。iRNA通过称为RNA干扰(RNAi)的过程引导mRNA的序列特异性降解。iRNA调节(例如，抑制)Serpinc1在细胞(例如，受试者(如哺乳动物受试者)体内的细胞)中的表达。
在一个实施方案中，本发明的RNAi药剂包括与靶RNA序列(例如，Serpinc1靶mRNA序列)相互作用以引导靶RNA的切割的单链RNA。不希望受理论束缚，人们相信，通过称为Dicer的III型内切核酸酶使引入细胞中的长双链RNA分解为siRNA(Sharp等人(2001)GenesDev.15:485)。Dicer，一种核糖核酸酶-III样酶，将dsRNA加工为具有特征性二碱基3'突出端的19-23个碱基对的短干扰RNA(Bernstein等人,(2001)Nature 409:363)。然后将siRNA掺入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，其中一种或多种解旋酶解开siRNA双链体，从而使得互补反义链能够指导靶标识别(Nykanen等人,(2001)Cell107:309)。在与适当靶mRNA结合后，RISC内的一种或多种内切核酸酶切割靶标以诱导沉默(Elbashir等人,(2001)GenesDev.15:188)。因此，在一方面，本发明涉及在细胞内生成的单链RNA(siRNA)，并且其促进形成RISC复合物以实现靶基因(即，Serpinc1基因)的沉默。因此，术语“siRNA”在本文中也用于指代如上所述的RNAi。
在另一实施方案中，RNAi药剂可以是引入细胞或生物体中以抑制靶mRNA的单链siRNA。单链RNAi药剂与RISC内切核酸酶Argonaute 2结合，所述酶随后切割靶mRNA。单链siRNA通常为15-30个核苷酸并且被化学修饰。对单链siRNA的设计和测试描述于美国专利号8,101,348以及Lima等人,(2012)Cell 150:883-894中，所述文献各自的全部内容通过引用特此并入本文。可以使用本文所述的任何反义核苷酸序列作为如本文所述或者如通过Lima等人,(2012)Cell 150；:883-894中所述方法化学修饰的单链siRNA。
在另一实施方案中，用于本发明的组合物、用途和方法中的“iRNA”是双链RNA，并且在本文中称为“双链RNAi药剂”、“双链RNA(dsRNA)分子”、“dsRNA药剂”或“dsRNA”。术语“dsRNA”是指具有双链体结构的核糖核酸分子的复合物，其包含两条反平行且基本上互补的核酸链，称为关于靶RNA(即，Serpinc1基因)具有“有义”和“反义”定向。在本发明的一些实施方案中，双链RNA(dsRNA)通过本文中称为RNA干扰或RNAi的转录后基因沉默机制触发靶RNA(例如，mRNA)的降解。
通常，dsRNA分子的每条链中的大多数核苷酸是核糖核苷酸，但是如本文详细描述，每条链或两条链还可以包括一个或多个非核糖核苷酸，例如，脱氧核糖核苷酸和/或修饰的核苷酸。另外，如本说明书中所用，“RNAi药剂”可以包括具有化学修饰的核糖核苷酸；RNAi药剂可以包括在多个核苷酸处的实质性修饰。
如本文所用，术语“修饰的核苷酸”是指独立地具有修饰的糖部分、修饰的核苷酸间连接和/或修饰的核碱基的核苷酸。因此，术语修饰的核苷酸涵盖例如官能团或原子对核苷间连接、糖部分或核碱基的取代、添加或去除。适合于本发明的药剂中的修饰包括本文公开的或本领域中已知的所有类型的修饰。出于本说明书和权利要求书的目的，如用于siRNA型分子中的任何此类修饰都被“RNAi药剂”所涵盖。
双链体区域可以具有允许期望的靶RNA通过RISC途径发生特异性降解的任何长度，并且长度范围可以为约9至36个碱基对，例如，长度为约15-30个碱基对，例如，长度为约9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个碱基对，如长度为约15-30、15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24,20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个碱基对。上文列举的范围和长度中间的范围和长度也考虑是本发明的部分。
形成双链体结构的两条链可以是一个更大RNA分子的不同部分，或者它们可以是单独的RNA分子。在两条链是一个更大分子的部分，并因此通过一条链的3'端与形成双链体结构的相应另一条链的5'端之间的连续核苷酸链连接的情况下，连接RNA链被称为“发夹环”。发夹环可以包含至少一个不成对核苷酸。在一些实施方案中，发夹环可以包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少20个、至少23个或更多个不成对核苷酸。
在dsRNA的两条基本上互补的链由单独的RNA分子构成的情况下，那些分子不需要但是可以共价连接。在两条链通过除了一条链的3'端与形成双链体结构的相应另一条链的5'端之间的连续核苷酸链以外的方式共价连接的情况下，连接结构被称为“接头”。RNA链可以具有相同或不同的核苷酸数。碱基对的最大数是dsRNA的最短链中的核苷酸数减去双链体中存在的任何突出端。除了双链体结构以外，RNAi可以包含一个或多个核苷酸突出端。
在一个实施方案中，本发明的RNAi药剂是24-30个核苷酸的dsRNA，其与靶RNA序列(例如，Serpinc1靶mRNA序列)相互作用以引导所述靶RNA的切割。不希望受理论束缚，引入细胞中的长双链RNA被称为Dicer的III型内切核酸酶分解为siRNA(Sharp等人(2001)GenesDev.15:485)。Dicer，一种核糖核酸酶-III样酶，将dsRNA加工为具有特征性二碱基3'突出端的19-23个碱基对的短干扰RNA(Bernstein等人,(2001)Nature 409:363)。然后将siRNA掺入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，其中一种或多种解旋酶解开siRNA双链体，从而使得互补反义链能够指导靶标识别(Nykanen等人,(2001)Cell 107:309)。在与适当靶mRNA结合后，RISC内的一种或多种内切核酸酶切割靶标以诱导沉默(Elbashir等人,(2001)GenesDev.15:188)。
如本文所用，术语“核苷酸突出端”是指从iRNA(例如，dsRNA)的双链体结构突出的至少一个不成对核苷酸。例如，当dsRNA的一条链的3'端延伸超出另一条链的5'端时，或者反之亦然，存在核苷酸突出端。dsRNA可以包含至少一个核苷酸的突出端；可替代地，突出端可以包含至少两个核苷酸、至少三个核苷酸、至少四个核苷酸、至少五个核苷酸或更多个核苷酸。核苷酸突出端可以包含核苷酸/核苷类似物(包括脱氧核苷酸/核苷)或由其组成。一个或多个突出端可以位于有义链、反义链或其任何组合上。此外，突出端的一个或多个核苷酸可以存在于dsRNA的反义或有义链的5'端、3'端或两端上。
在一个实施方案中，dsRNA的反义链在3'端和/或5'端具有1-10个核苷酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸)的突出端。在一个实施方案中，dsRNA的有义链在3'端和/或5'端具有1-10个核苷酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸)的突出端。在另一实施方案中，突出端中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸酯替代。
在某些实施方案中，有义链或反义链或二者上的突出端可以包括长于10个核苷酸的延长的长度，例如，长度为10-30个核苷酸、10-25个核苷酸、10-20个核苷酸或10-15个核苷酸。在某些实施方案中，延长的突出端位于双链体的有义链上。在某些实施方案中，延长的突出端存在于双链体的有义链的3'端上。在某些实施方案中，延长的突出端存在于双链体的有义链的5'端上。在某些实施方案中，延长的突出端位于双链体的反义链上。在某些实施方案中，延长的突出端存在于双链体的反义链的3'端上。在某些实施方案中，延长的突出端存在于双链体的反义链的5'端上。在某些实施方案中，延长的突出端中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸酯替代。
“钝的”或“钝端”意指，在双链RNAi药剂的该末端不存在不成对核苷酸，即，无核苷酸突出端。“钝端的”RNAi药剂是在其整个长度上呈双链的dsRNA，即，在分子的任一端没有核苷酸突出端。本发明的RNAi药剂包括在一个末端具有核苷酸突出端(即，具有一个突出端和一个钝端的药剂)或在两个末端具有核苷酸突出端的RNAi药剂。
术语“反义链”或“指导链”是指iRNA(例如，dsRNA)的链，其包括与靶序列(例如，Serpinc1 mRNA)基本上互补的区域。如本文所用，术语“互补性区域”是指反义链上与如本文所定义的序列(例如靶序列，例如，Serpinc1核苷酸序列)基本上互补的区域。在互补性区域与靶序列不完全互补的情况下，错配可能位于分子的内部或末端区域中。通常，大多数容忍的错配位于末端区域中，例如，在iRNA的5'末端和/或3'末端的5、4、3或2个核苷酸内。
如本文所用术语“有义链”或“随从链”是指iRNA的链，其包括与反义链(如该术语在本文中所定义)的区域基本上互补的区域。
如本文所用，术语“切割区”是指位置紧邻切割位点的区域。切割位点是靶标上发生切割的位点。在一些实施方案中，切割区包含在切割位点的任一端上并且紧邻所述切割位点的三个碱基。在一些实施方案中，切割区包含在切割位点的任一端上并且紧邻所述切割位点的两个碱基。在一些实施方案中，切割位点特异性地发生在由反义链的核苷酸10和11结合的位点处，并且切割区包含核苷酸11、12和13。
如本文所用，并且除非另有指示，否则术语“互补的”在用于描述与第二核苷酸序列相关的第一核苷酸序列时是指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些条件下与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并形成双链体结构的能力，如技术人员可理解。此类条件可以是例如严格条件，其中严格条件可以包括：400mM NaCl、40mMPIPES pH 6.4、1mM EDTA，50℃或70℃持续12-16小时，之后洗涤(参见例如，“MolecularCloning:A Laboratory Manual”,Sambrook等人(1989)Cold Spring Harbor LaboratoryPress)。可以应用其他条件，如在生物体内可能遇到的生理相关条件。技术人员将能够根据杂交的核苷酸的最终应用来确定最适合于两个序列的互补性测试的条件集。
iRNA内(例如，如本文所述的dsRNA内)的互补序列包括包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一个或两个核苷酸序列的整个长度上的碱基配对。在本文中，此类序列可以被称为关于彼此“完全互补”。然而，在本文中将第一序列称为关于第二序列“基本上互补”的情况下，两个序列可以是完全互补的，或者它们可以在用于多达30个碱基对的双链体的杂交后形成一个或多个(但通常不超过5、4、3或2个)错配碱基对，同时保留在与其最终应用(例如，通过RISC途径抑制基因表达)最相关的条件下杂交的能力。然而，在将两个寡核苷酸设计为在杂交后形成一个或多个单链突出端的情况下，关于互补性的确定，不应将此类突出端视为错配。例如，出于本文所述的目的，包含一个长度为21个核苷酸的寡核苷酸和另一个长度为23个核苷酸的寡核苷酸的dsRNA(其中较长寡核苷酸包含与较短寡核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列)仍可以被称为“完全互补”。
如本文所用“互补”序列还可以包括非Watson-Crick碱基对和/或从非天然和修饰的核苷酸形成的碱基对，或者完全由其形成，只要满足上文关于其杂交能力的要求即可。此类非Watson-Crick碱基对包括但不限于G:U摆动或胡斯坦碱基配对。
本文中的术语“互补”、“完全互补”和“基本上互补”可以关于dsRNA的有义链与反义链之间或者iRNA药剂的反义链与靶序列之间的碱基匹配来使用，如从其使用的上下文可理解。
如本文所用，与信使RNA(mRNA)的“至少部分基本上互补”的多核苷酸是指与目的mRNA(例如，编码Serpinc1的mRNA)的连续部分基本上互补的多核苷酸。例如，如果序列与编码Serpinc1的mRNA的连续部分基本上互补，则多核苷酸与Serpinc1 mRNA的至少一部分互补。
因此，在一些实施方案中，本文公开的反义链多核苷酸与靶Serpinc1序列完全互补。在其他实施方案中，本文公开的反义链多核苷酸与靶Serpinc1序列基本上互补，并且包含如下连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列在其整个长度上与SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:1的片段的核苷酸序列的对等区域至少约80％互补，如约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约％91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％互补。
在一个实施方案中，本发明的RNAi药剂包括与反义多核苷酸基本上互补的有义链，所述反义多核苷酸又与靶Serpinc1序列互补，并且其中有义链多核苷酸包含如下连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列在其整个长度上与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:5中任一项的片段的核苷酸序列的对等区域至少约80％互补，如约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约％91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％互补。
能够在体内抑制靶基因(即，Serpinc1基因)的表达的合适的dsRNA药剂包括化学修饰。在本发明的某些方面，本发明的iRNA的基本上所有核苷酸被修饰。在本发明的其他实施方案中，本发明的iRNA的所有核苷酸被修饰。其中“基本上所有核苷酸被修饰”的本发明的iRNA大部分但并非完全被修饰，并且可以包括不超过5、4、3、2或1个未修饰的核苷酸。
用于本发明方法中的iRNA药剂通常包括具有如下区域的RNA链(反义链)，所述区域的长度为约30个核苷酸或更短，例如，长度为15-30、15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24,20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个核苷酸，所述区域与Serpinc1基因的mRNA转录物的至少部分基本上互补。
在其他实施方案中，本发明的双链RNAi药剂的一条或两条链的长度为多达66个核苷酸，例如，长度为36-66、26-36、25-36、31-60、22-43、27-53个核苷酸，其具有与Serpinc1基因的mRNA转录物的至少一部分基本上互补的至少19个连续核苷酸的区域。在一些实施方案中，有义链与反义链形成18-30个连续核苷酸的双链体。
在一些实施方案中，用于本发明方法中的iRNA药剂包括RNA链(反义链)，其长度可以为多达66个核苷酸，例如，长度为36-66、26-36、25-36、31-60、22-43、27-53个核苷酸，其具有与Serpinc1基因的mRNA转录物的至少一部分基本上互补的至少19个连续核苷酸的区域。在一些实施方案中，具有较长长度反义链的此类iRNA药剂可以包括长度为20-60个核苷酸的第二RNA链(有义链)，其中有义链与反义链形成18-30个连续核苷酸的双链体。
RNAi药剂包含有义链和反义链。RNAi药剂的每条链的长度范围可以是12-30个核苷酸。例如，每条链可以具有14-30个核苷酸之间的长度、17-30个核苷酸之间的长度、19-30个核苷酸之间的长度、25-30个核苷酸之间的长度、27-30个核苷酸之间的长度、17-23个核苷酸之间的长度、17-21个核苷酸之间的长度、17-19个核苷酸之间的长度、19-25个核苷酸之间的长度、19-23个核苷酸之间的长度、19-21个核苷酸之间的长度、21-25个核苷酸之间的长度或21-23个核苷酸之间的长度。
有义链与反义链通常形成双链体双链RNA(“dsRNA”)，本文中也称为“RNAi药剂”。RNAi药剂的双链体区域的长度可以为12-30个核苷酸对。例如，双链体区域可以具有14-30个核苷酸对之间的长度、17-30个核苷酸对之间的长度、27-30个核苷酸对之间的长度、17-23个核苷酸对之间的长度、17-21个核苷酸对之间的长度、17-19个核苷酸对之间的长度、19-25个核苷酸对之间的长度、19-23个核苷酸对之间的长度、19-21个核苷酸对之间的长度、21-25个核苷酸对之间的长度或21-23个核苷酸对之间的长度。在另一个例子中，双链体区域的长度选自15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26和27个核苷酸。
在一个实施方案中，RNAi药剂可以在一条或两条链的3'端、5'端或两端含有一个或多个突出端区域和/或封端基团。突出端的长度可以是1-6个核苷酸，例如2-6个核苷酸的长度、1-5个核苷酸的长度、2-5个核苷酸的长度、1-4个核苷酸的长度、2-4个核苷酸的长度、1-3个核苷酸的长度、2-3个核苷酸的长度或1-2个核苷酸的长度。突出端可以是一条链长于另一条链的结果，或者是相同长度的两条链交错的结果。突出端可以与靶mRNA形成错配，或者其可以与所靶向的基因序列互补，或者可以是另一序列。第一链与第二链也可以接合，例如，通过另外的碱基接合以形成发夹，或者通过其他非碱基接头接合。
在一个实施方案中，RNAi药剂的突出端区域中的核苷酸可以各自独立地是修饰的或未修饰的核苷酸，包括但不限于2'-糖修饰的，如2-F、2'-O-甲基胸苷(T)、2'-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷(Teo)、2'-O-甲氧基乙基腺苷(Aeo)、2'-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷(m5Ceo)及其任何组合。例如，TT可以是任一条链上的任一端的突出端序列。突出端可以与靶mRNA形成错配，或者其可以与所靶向的基因序列互补，或者可以是另一序列。
位于RNAi药剂的有义链、反义链或两条链的5'突出端或3'突出端可以被磷酸化。在一些实施方案中，一个或多个突出端区域在两个核苷酸之间含有具有硫代磷酸酯的两个核苷酸，其中所述两个核苷酸可以是相同的或不同的。在一个实施方案中，突出端存在于有义链、反义链或两条链的3'端。在一个实施方案中，此3'突出端存在于反义链中。在一个实施方案中，此3'突出端存在于有义链中。
RNAi药剂可以仅含单一突出端，其可强化RNAi的干扰活性，而不影响其总体稳定性。例如，单链突出端可以位于有义链的3'末端，或者可替代地，位于反义链的3'末端。RNAi还可以具有位于反义链的5'端(或有义链的3'端)的钝端，或反之亦然。通常，RNAi的反义链具有在3'端的核苷酸突出端，并且5'端是钝端。尽管不希望受理论束缚，但在反义链5'端的不对称钝端和反义链的3'端突出端有利于将指导链加载至RISC过程中。
在本发明中为特征的任何核酸可以通过本领域中充分确立的方法来合成和/或修饰，所述方法如以下文献中所述的那些：“Current protocols in nucleic acidchemistry,”Beaucage,S.L.等人(编辑),John Wiley&Sons,Inc.(纽约，纽约州，美国)，所述文献通过引用特此并入本文。修饰包括例如末端修饰，例如，5'端修饰(磷酸化、缀合、反向连接)或3'端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向连接等)；碱基修饰，例如，用稳定碱基、去稳定碱基或与配偶体的扩大库碱基配对的碱基替代、去除碱基(无碱基核苷酸)，或者缀合的碱基；糖修饰(例如，在2'位置或4'位置)或糖的替代；和/或骨架修饰，包括磷酸二酯连接的修饰或替代。用与本文所述的实施方案中的iRNA化合物的具体例子包括但不限于含有修饰的骨架或不含天然核苷间连接的RNA。具有修饰的骨架的RNA尤其包括骨架中没有磷原子的那些。出于本说明书的目的，并且如有时在本领域中所提及，在其核苷间骨架中没有磷原子的修饰的RNA也可以被视为寡核苷。在一些实施方案中，修饰的iRNA将在其核苷间骨架中具有磷原子。
修饰的RNA骨架包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基膦酸酯和其他烷基膦酸酯(包括3'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰基氨基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯和具有正常3'-5'连接的硼烷磷酸酯、这些的2'-5'连接的类似物以及具有反向极性的那些，其中相邻的核苷单元对是3'-5'至5'-3'连接或2'-5'至5'-2'连接。还包括多种盐、混合盐和游离酸形式。
传授上文含磷连接的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,195；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,316；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,625,050；6,028,188；6,124,445；6,160,109；6,169,170；6,172,209；6,239,265；6,277,603；6,326,199；6,346,614；6,444,423；6,531,590；6,534,639；6,608,035；6,683,167；6,858,715；6,867,294；6,878,805；7,015,315；7,041,816；7,273,933；7,321,029；以及美国专利RE39464，所述文献各自的全部内容通过引用特此并入本文。
其中不包括磷原子的修饰的RNA骨架具有由以下形成的骨架：短链烷基或环烷基核苷间连接、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间连接、或者一个或多个短链杂原子或杂环核苷间连接。这些包括具有以下的那些：吗啉基连接(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲乙酰基和硫代甲乙酰基骨架；亚甲基甲乙酰基和硫代甲乙酰基骨架；含有烯烃的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；以及具有混合的N、O、S和CH2组成部分的其他骨架。
传授上文寡核苷的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,64,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；以及5,677,439，所述文献各自的全部内容通过引用特此并入本文。
在其他实施方案中，考虑合适的RNA模拟物用于iRNA中，其中核苷酸单元的糖和核苷间连接(即，骨架)二者被新型基团替代。维持基本单元用于与适当核酸靶化合物杂交。一种此类寡聚化合物，已显示具有极佳杂交特性的RNA模拟物，被称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，RNA的糖骨架被含有酰胺的骨架(特别是氨基乙基甘氨酸骨架)替代。核碱基被保留并且与骨架中酰胺部分的氮杂氮原子直接或间接结合。传授PNA化合物的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,539,082；5,714,331；和5,719,262，所述文献各自的全部内容通过引用特此并入本文。适用于本发明的iRNA中的另外的PNA化合物描述于例如Nielsen等人,Science,1991,254,1497-1500中。
在本发明中为特征的一些实施方案包括具有硫代磷酸酯骨架的RNA和具有杂原子骨架的寡核苷，并且特定地--CH2--NH--CH2-、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI骨架]、上文所提及的美国专利号5,489,677的--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--和--N(CH3)--CH2--CH2--[其中天然磷酸二酯骨架表示为--O--P--O--CH2--]，以及上文所提及的美国专利号5,602,240的酰胺骨架。在一些实施方案中，本文中为特征的RNA具有上文所提及的美国专利号5,034,506的吗啉基骨架结构。
修饰的RNA还可以含有一个或多个取代的糖部分。本文中为特征的iRNA(例如，dsRNA)可以在2'位置包括以下中的一种：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或者O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代的或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。示例性合适的修饰包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2).nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m是1至约10。在其他实施方案中，dsRNA在2'位置包括以下中的一种：C1至C10低碳烷基、取代的低碳烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报告基团、嵌入剂、用于改进iRNA的药代动力学特性的基团，或者用于改进iRNA的药效学特性的基团，以及具有类似特性的其他取代基。在一些实施方案中，修饰包括2'-甲氧基乙氧基(2'-O--CH2CH2OCH3，也称为2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)(Martin等人,Helv.Chim.Acta,1995,78:486-504)，即，烷氧基-烷氧基。另一示例性修饰是2'-二甲基氨基氧基乙氧基，即，O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2'-DMAOE，如下文例子中所述；以及2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基(本领域中也称为2'-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2'-DMAEOE)，即，2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2。
其他修饰包括2'-甲氧基(2'-OCH3)、2'-氨基丙氧基(2'-OCH2CH2CH2NH2)和2'-氟(2'-F)。还可以在iRNA的RNA上的其他位置，特别是3'末端核苷酸上或2'-5'连接的dsRNA中的糖的3'位置以及5'末端核苷酸的5'位置进行类似修饰。iRNA还可以具有糖模拟物(如环丁基部分)代替戊呋喃糖基糖。传授此类修饰的糖结构的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；和5,700,920，其中某些专利是与本申请共有的。每个前述申请的全部内容通过引用特此并入本文。
iRNA还可以包括核碱基(本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所用，“未修饰的”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括其他合成和天然核碱基，如脱氧-胸腺嘧啶(dT)、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和5-卤代胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮基尿嘧啶、6-偶氮基胞嘧啶和6-偶氮基胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代(特别是5-溴)、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。其他核碱基包括美国专利号3,687,808中披露的那些；Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijn,P.编辑Wiley-VCH,2008中披露的那些；The Concise Encyclopedia Of Polymer ScienceAnd Engineering,第858-859页,Kroschwitz,J.L,编辑John Wiley&Sons,1990中披露的那些；Englisch等人,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613中披露的这些；以及Sanghvi,Y S.,第15章,dsRNA Research and Applications,第289-302页,Crooke,S.T.和Lebleu,B.,编辑,CRC Press,1993中披露的那些。这些核碱基中的某些特别可用于增加在本发明中为特征的寡聚化合物的结合亲和力。这些包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已经显示5-甲基胞嘧啶取代将核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.、Crooke,S.T.和Lebleu,B.,编辑,dsRNA Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,第276-278页)并且是示例性碱基取代，甚至更特定地在与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。
传授某些上述修饰的核碱基以及其他修饰的核碱基的制备的代表性美国专利包括但不限于上述美国专利号3,687,808；4,845,205；5,130,30；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,681,941；5,750,692；6,015,886；6,147,200；6,166,197；6,222,025；6,235,887；6,380,368；6,528,640；6,639,062；6,617,438；7,045,610；7,427,672；和7,495,088，所述文献各自的全部内容通过引用特此并入本文。
iRNA的RNA也可以被修饰以包括一个或多个二环糖部分。“二环糖”是通过两个原子的桥接修饰的呋喃糖基环。“二环核苷”(“BNA”)是具有糖部分的核苷，所述糖部分包含连接糖环的两个碳原子的桥，从而形成二环环系统。在某些实施方案中，所述桥连接糖环的4'-碳和2'-碳。因此，在一些实施方案中，本发明的药剂可以包括iRNA的RNA，其还可以被修饰以包括一个或多个锁核酸(LNA)。锁核酸是具有修饰的核糖部分的核苷酸，其中所述核糖部分包含连接2'碳与4'碳的额外桥。换言之，LNA是包含含有4'-CH2-O-2'桥的二环糖部分的核苷酸。此结构将核糖有效“锁定”为3'内结构构象。已经显示将锁核酸添加至siRNA增加血清中的siRNA稳定性，并且降低脱靶效应(Elmen,J.等人,(2005)Nucleic AcidsResearch 33(1):439-447；Mook,OR.等人,(2007)Mol Canc Ther 6(3):833-843；Grunweller,A.等人,(2003)Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193)。
用于本发明的多核苷酸中的二环核苷的例子包括但不限于在4'与2'核糖基环原子之间包含桥的核苷。在某些实施方案中，本发明的反义多核苷酸药剂包括一个或多个包含4'至2'桥的二环核苷。此类4'至2'桥接二环核苷的例子包括但不限于4'-(CH2)—O-2'(LNA)；4'-(CH2)—S-2'；4'-(CH2)2—O-2'(ENA)；4'-CH(CH3)—O-2'(也称为“受限乙基”或“cEt”)和4'-CH(CH2OCH3)—O-2'(及其类似物；参见例如，美国专利号7,399,845)；4'-C(CH3)(CH3)—O-2'(及其类似物；参见例如，美国专利号8,278,283)；4'-CH2—N(OCH3)-2'(及其类似物；参见例如，美国专利号8,278,425)；4'-CH2—O—N(CH3)-2'(参见例如，美国专利公开号2004/0171570)；4'-CH2—N(R)—O-2'，其中R是H、C1-C12烷基或保护基团(参见例如，美国专利号7,427,672)；4'-CH2—C(H)(CH3)-2'(参见例如，Chattopadhyaya等人,J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；以及4'-CH2—C(═CH2)-2'(及其类似物；参见例如，美国专利号8,278,426)。每个前述申请的全部内容通过引用特此并入本文。
传授锁核酸核苷酸的制备的另外的代表性美国专利和美国专利公开案包括但不限于以下：美国专利号6,268,490；6,525,191；6,670,461；6,770,748；6,794,499；6,998,484；7,053,207；7,034,133；7,084,125；7,399,845；7,427,672；7,569,686；7,741,457；8,022,193；8,030,467；8,278,425；8,278,426；8,278,283；US 2008/0039618；和US 2009/0012281，所述文献各自的全部内容通过引用特此并入本文。
可以制备前述二环核苷中的任一个，其具有一种或多种立体化学糖构型，包括例如α-L-呋喃核糖和β-D-呋喃核糖(参见WO 99/14226)。
iRNA的RNA也可以被修饰以包括一个或多个受限乙基核苷酸。如本文所用，“受限乙基核苷酸”或“cEt”是包含含有4'-CH(CH3)-0-2'桥的二环糖部分的锁核酸。在一个实施方案中，受限乙基核苷酸呈S构象，本文称为“S-cEt”。
本发明的iRNA还可以包括一个或多个“构象受限的核苷酸”(“CRN”)。CRN是具有连接核糖的C2'与C4'碳或核糖的C3与-C5'碳的接头的核苷酸类似物。CRN将核糖环锁定为稳定构象并且增加与mRNA的杂交亲和力。接头具有足够长度以将氧置于对于稳定性和亲和力最佳的位置，从而导致较少核糖环皱褶。
传授某些上述CRN的制备的代表性公开案包括但不限于美国专利公开号2013/0190383；和PCT公开案WO 2013/036868，所述文献各自的全部内容通过引用特此并入本文。
本发明的iRNA的一个或多个核苷酸还可以包括羟甲基取代的核苷酸。“羟甲基取代的核苷酸”是无环2'-3'-开环-核苷酸，也称为“解锁核酸”(“UNA”)修饰。
传授UNA的制备的代表性美国公开案包括但不限于美国专利号8,314,227；和美国专利公开号2013/0096289；2013/0011922；和2011/0313020，所述文献各自的全部内容通过引用特此并入本文。
对RNA分子末端的潜在稳定的修饰可以包括N-(乙酰基氨基己酰基)-4-羟脯氨醇(Hyp-C6-NHAc)、N-(己酰基-4-羟脯氨醇)(Hyp-C6)、N-(乙酰基-4-羟脯氨醇)(Hyp-NHAc)、胸苷-2'-0-脱氧胸苷(醚)、N-(氨基己酰基)-4-羟脯氨醇(Hyp-C6-氨基)、2-二十二烷酰基-尿苷-3”-磷酸酯、倒置碱基dT(idT)和其他修饰。这种修饰的公开内容可以发现于PCT公开号WO 2011/005861中。
在本发明的某些方面，本发明的双链RNAi药剂包括如例如以下文献中披露的具有化学修饰的药剂：2011年11月18日提交的美国临时申请号61/561,710，或者2012年11月16日提交的PCT/US2012/065691，每个所述文献的全部内容通过引用并入本文。
本发明的双链RNA(dsRNA)药剂可以任选地与一个或多个配体缀合。配体可以在3'端、5'端或两端附接至有义链、反义链或两条链。例如，配体可以与有义链缀合。在优选实施方案中，配体缀合至有义链的3'端。
在一个实施方案中，配体是碳水化合物缀合物，如单糖。在一个实施方案中，配体是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)GalNAc或GalNAc衍生物。在本发明的某些实施方案中，GalNAc或GalNAc衍生物经由单价接头附接至本发明的iRNA药剂。在一些实施方案中，GalNAc或GalNAc衍生物经由二价接头附接至本发明的iRNA药剂。在本发明的又其他实施方案中，GalNAc或GalNAc衍生物经由三价接头附接至本发明的iRNA药剂。合适的配体披露于例如美国专利申请号15/371,300和美国专利公开号2009/0239814中，每个所述申请的全部内容在其涉及合适的配体时通过引用并入本文。
在一些实施方案中，配体(例如，GalNAc配体)附接至RNAi药剂的3’端。在一个实施方案中，RNAi药剂经由接头与配体(例如，GalNAc配体)缀合，如以下示意图中所示
Figure BDA0003257180980000421
其中X是O或S。在一个实施方案中，X是O。
传授RNA缀合物的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941；6,294,664；6,320,017；6,576,752；6,783,931；6,900,297；7,037,646；8,106,022，所述文献各自的全部内容通过引用特此并入本文。
并非给定化合物中的所有位置都一律进行修饰，并且事实上可以在单一化合物中或甚至在iRNA内的单一核苷处掺入超过一个前述修饰。本发明还包括作为嵌合化合物的iRNA化合物。
在本发明的情况下，“嵌合”iRNA化合物或“嵌合体”是iRNA化合物，优选地dsRNA，其含有两个或更多个化学上不同的区域，每个区域由至少一个单体单元(即，在dsRNA化合物的情况下是核苷酸)构成。这些iRNA通常含有至少一个区域，其中RNA被修饰以赋予iRNA增加的对核酸酶降解的抗性、增加的细胞摄取和/或增加的对靶核酸的结合亲和力。iRNA的另外的区域可以用作能够切割RNA:DNA或RNA:RNA杂合体的酶的底物。举例来说，RNA酶H是细胞内切核酸酶，其切割RNA:DNA双链体的RNA链。因此，激活RNA酶H导致对RNA靶的切割，从而显著增强对基因表达的iRNA抑制的效率。因此，相比于与相同靶区域杂交的硫代磷酸酯脱氧dsRNA，在使用嵌合dsRNA时，用较短的iRNA经常可获得可比较的结果。对RNA靶的切割可以通过凝胶电泳以及(如果需要)本领域中已知的相关核酸杂交技术常规检测。
在某些情况下，iRNA的RNA可以通过非配体基团来修饰。多个非配体分子已经与iRNA缀合以增强iRNA的活性、细胞分布或细胞摄取，并且用于进行此类缀合的程序可在科学文献中获得。此类非配体部分已经包括脂质部分(如胆固醇)(Kubo,T.等人,Biochem.Biophys.Res.Comm.,2007,365(1):54-61；Letsinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86:6553)、胆酸(Manoharan等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1994,4:1053)、硫醚(例如，己基-S-三苯甲基硫醇)(Manoharan等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660:306；Manoharan等人,Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3:2765)、硫代胆固醇(Oberhauser等人,Nucl.Acids Res.,1992,20:533)、脂肪族链(例如，十二烷二醇或十一烷基残基)(Saison-Behmoaras等人,EMBO J.,1991,10:111；Kabanov等人,FEBS Lett.,1990,259:327；Svinarchuk等人,Biochimie,1993,75:49)、磷脂(例如，二-十六烷基-rac-甘油或三乙铵1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-H-膦酸盐)(Manoharan等人,Tetrahedron Lett.,1995,36:3651；Shea等人,Nucl.Acids Res.,1990,18:3777)、多胺或聚乙二醇链(Manoharan等人,Nucleosides&Nucleotides,1995,14:969)、或金刚烷乙酸(Manoharan等人,Tetrahedron Lett.,1995,36:3651)、棕榈基部分(Mishra等人,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264:229)或者十八胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分(Crooke等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277:923)。上文已经列出传授此类RNA缀合物的制备的代表性美国专利。典型缀合方案涉及合成在序列的一个或多个位置带有氨基接头的RNA。然后使用适当的偶合或激活试剂使氨基与要缀合的分子反应。缀合反应可以用仍然与固体支持物结合的RNA进行或在溶液相中切割RNA后进行。通过HPLC纯化RNA缀合物通常提供纯的缀合物。
V.本发明的药物组合物的用途
本发明的药物组合物用于患有可受益于Serpinc1表达减少的障碍的受试者的治疗性和预防性治疗，所述障碍如出血障碍，例如，血友病(例如，血友病A、血友病B或血友病C)。
如本文所用，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指有益或所需结果，包括但不限于一种或多种症状的减轻或改善、减小出血程度、稳定(即，不恶化)出血状态、改善或缓和出血(可检测的或不可检测的)或使出血消退。“治疗”还可以意指如与在不进行治疗的情况下预期的存活相比，延长存活。在本发明的方法中，治疗包括按需治疗和控制出血事件、出血的围手术期管理和常规预防以降低出血事件的频率。
在受试者或疾病标记或症状中Serpinc1的水平的情况下，术语“降低”是指这个水平的统计学上显著的下降。所述下降可以是例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多，并且优选地降低至接受为未患这种障碍的个体的正常范围内的水平。
如本文所用，“预防(prevention)”或“预防(preventing)”在关于其可受益于Sertpinc1基因表达减少的疾病、障碍或病症使用时，是指受试者会患上与这种疾病、障碍或病症相关的症状(例如，如出血的症状)的可能性降低。例如，在具有出血的一种或多种风险因子的个体未患上出血或者所患出血的严重程度相对于具有相同风险因子且未接受如本文所述治疗的群体较低时，患上出血的可能性降低。未患上疾病、障碍或病症、或者与这种疾病、障碍或病症相关的症状的发展降低(例如，按照针对该疾病或障碍的临床上接受的量表，降低至少约10％)、或者展现延迟(例如，延迟数天、数周、数月或数年)的症状，被认为是有效预防。
会受益于Serpinc1基因表达的减少和/或抑制的受试者是患有如本文所述的出血障碍(例如，遗传性出血障碍或获得性出血障碍)的那些。在一个实施方案中，患有遗传性出血障碍的受试者患有血友病，例如，血友病A、B或C。在一个实施方案中，患有遗传性出血障碍(例如，血友病)的受试者是抑制剂受试者(已经变得对替代凝血因子难治的受试者)。在一个实施方案中，抑制剂受试者患有血友病A。在另一个实施方案中，抑制剂受试者患有血友病B。在又另一实施方案中，抑制剂受试者患有血友病C。对可受益于Serpinc1基因表达的减少和/或抑制的受试者的治疗包括治疗性(例如，按需的，例如，受试者正在出血(自发出血或因创伤而出血)且未能凝血)和预防性(例如，受试者没有出血和/或要做手术)治疗。
如本文所用，术语“出血障碍”是导致血液凝固较差和/或过度出血的疾病或病症。出血障碍可以是遗传性障碍，如血友病或血管性血友病，或者是与例如以下相关的获得性障碍：弥漫性血管内凝血、妊娠相关子痫、维生素K缺乏、自身免疫性障碍、发炎性肠病、溃疡性结肠炎、皮肤病障碍(例如，银屑病、天疱疮)、呼吸性疾病(例如，哮喘、慢性阻塞性肺病)、过敏性药物反应(例如，药物(如阿司匹林、肝素和华法林)的结果)、糖尿病、急性乙型肝炎感染、急性丙型肝炎感染、恶性肿瘤或实体瘤(例如，前列腺、肺、结肠、胰腺、胃、胆管、头颈、宫颈、乳房、黑色素瘤、肾和/或血液学恶性肿瘤)。在一个实施方案中，遗传性出血障碍是血友病，例如，血友病A、B或C。在一个实施方案中，患有遗传性出血障碍(例如，血友病)的受试者已经产生对替代凝血疗法的抑制剂(例如，同种抗体抑制剂)，并且在本文中称为“抑制剂受试者”。在一个实施方案中，抑制剂受试者患有血友病A。在另一实施方案中，抑制剂受试者患有血友病B。在又另一实施方案中，抑制剂受试者患有血友病C。
在一个实施方案中，出血障碍是罕见出血障碍(RBD)。RBD可以是获得性RBD或遗传性RBD。遗传性RBD包括与以下相关的障碍：凝血因子纤维蛋白原、FII、FV、合并的FV和FVIII、FVII、FX、FXI、FXIII的缺乏，以及维生素K依赖性因子(VKCFD)的先天性缺乏。它们通常作为常染色体隐性病症传播，但是在一些情况(如FXI和异常纤维蛋白原血症)下可以是常染色体显性的。在大多数群体中报道RBD，其纯合或双重杂合发病率从500,000人中的1人(对于FVII缺乏)至2至3百万人中的1人(对于凝血酶原和FXIII缺乏)变化。相对频率在群体之间变化，在近亲或同族婚姻常见的群体中较高，且特定突变体基因的频率增加。
示例性RBD包括纤维蛋白原缺乏血症(纤维蛋白原；因子I缺乏)；低纤维素原血症(纤维蛋白原；因子I缺乏)；异常纤维蛋白原血症(纤维蛋白原；因子I缺乏)；低异常纤维蛋白原血症(纤维蛋白原；因子I缺乏)；低凝血酶原血症(凝血酶原；因子II缺乏)；凝血酶原缺乏(凝血酶原；因子II缺乏)；血栓形成倾向(凝血酶原；因子II缺乏)；先天性抗凝血酶III缺乏(促凝血酶原激酶；因子III；组织因子)；副血友病(促凝血球蛋白原；因子V；易变因子)；欧伦氏病(促凝血球蛋白原；因子V；易变因子)；活化蛋白C抵抗(促凝血球蛋白原；因子V；易变因子)；亚历山大病(稳定因子前转化素；因子VII)；先天性前转化素/因子VII缺乏(稳定因子前转化素；因子VII)；斯图亚特缺乏(斯图亚特因子；因子X)；先天性因子XIIIa/b缺乏(是纤维蛋白稳定因子；因子XIII)；遗传性因子XIII缺乏(纤维蛋白稳定因子；因子XIII)；以及纤维蛋白稳定因子缺乏(纤维蛋白稳定因子；因子XIII)。
如本文所用“治疗有效量”意图包括RNAi药剂在施用至患有出血障碍和出血的受试者时足以实现对疾病的治疗(例如，通过减小、改善或维持现有疾病或者疾病的一种或多种症状)的量。“治疗有效量”可以根据以下而变化：RNAi药剂、如何施用药剂、疾病及其严重程度，以及要治疗的受试者的病史、年龄、体重、家族史、基因组成、在先或伴随治疗(如果存在)的类型和其他个体特征。
如本文所用“预防有效量”意图包括iRNA在施用至患有出血障碍但未出血的受试者(例如，患有出血障碍并且已排定进行手术的受试者(例如，围手术期治疗))时足以预防或改善疾病或疾病的一种或多种症状的量。改善疾病包括减慢病程或降低迟发疾病的严重程度。“预防有效量”可以根据以下而变化：iRNA、如何施用药剂、疾病的风险程度、以及要治疗的患者的病史、年龄、体重、家族史、基因组成、在先或伴随治疗(如果存在)的类型和其他个体特征。
“治疗有效量”或“预防有效量”还包括RNAi药剂以适用于任何治疗的合理收益/风险比产生一些所需的局部或全身效果的量。用于本发明方法中的iRNA可以以足量施用以产生适用于这种治疗的合理收益/风险比。
“替代因子的推荐治疗有效量”和“旁路剂(bypassing agent)的推荐治疗有效量”分别是替代因子或旁路剂的剂量，其足以生成凝血酶并使出血消退和/或足以在患有出血的受试者中实现血浆因子的峰值水平，所述剂量如由世界血友病联合会(参见例如，Srivastava等人“Guidelines for the Management of Hemophilia”,Hemophilia Epub2012年7月6日；DOI:10.1111/j.1365-2516.2012.02909.x)；ADVATE(抗血友病因子(重组))产品插页；11/2016；以及BeneFIX(凝血因子IX(重组))产品插页；11/2011所提供。前述文献中每一项的全部内容通过引用并入本文。
例如，用于患有轻度出血的受试者的替代因子或旁路剂的推荐剂量是足以实现约10-40IU/dL的峰值血浆因子VIII水平的剂量；用于患有中度出血的受试者的替代因子或旁路剂的推荐剂量是足以实现约30-60IU/dL的峰值血浆因子VIII水平的剂量；用于患有重度出血的受试者的替代因子或旁路剂的推荐剂量是足以实现约60-100IU/dL峰值血浆因子VIII水平的剂量；在围手术期用于受试者的替代因子或旁路剂的推荐剂量是足以实现约30-60IU/dL的峰值血浆因子VIII水平的剂量(参见例如，ADVATE(抗血友病因子(重组))产品插页的表1和表2；11/2016)。
用于患有轻度出血的受试者的替代因子或旁路剂的推荐剂量是足以实现约10-30IU/dL的峰值血浆因子IX水平的剂量；用于患有中度出血的受试者的替代因子或旁路剂的推荐剂量是足以实现约25-50IU/dL的峰值血浆因子IX水平的剂量；用于患有重度出血的受试者的替代因子或旁路剂的推荐剂量是足以实现约50-100IU/dL的峰值血浆因子IX水平的剂量。
本发明的药物组合物的方法和用途通常包括向患有Serpinc1相关疾病(例如，出血障碍，例如，血友病(例如，血友病A、血友病B或血友病C))的受试者施用本发明的药物组合物。在本发明的一些方面，所述方法还包括向受试者施用另外的治疗剂。
因此，在一方面，本发明提供在患有会受益于Serpinc1表达的减少的障碍(例如，出血障碍，例如，血友病)的受试者中预防至少一种症状的方法。所述方法包括向受试者(例如，人)施用本发明的药物组合物，其包含预防有效剂量(例如，约25mg至约100mg的固定剂量，例如，约80mg的固定剂量)的本发明的iRNA药剂(例如，dsRNA)，从而在患有会受益于Serpinc1表达的减少的障碍的受试者中预防至少一种症状。
在另一方面，本发明提供治疗患有会受益于Serpinc1表达的减少的障碍(例如，出血障碍，例如，血友病)的受试者的方法，其包括向受试者(例如，人)施用本发明的药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效剂量(例如，约25mg至约100mg的固定剂量，例如，约80mg的固定剂量)的靶向Serpinc1基因的iRNA药剂或包含靶向Serpinc1基因的iRNA药剂的药物组合物，从而治疗患有会受益于Serpinc1表达的减少的障碍的受试者。
在某些实施方案中，本发明的治疗和预防方法包括向受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含例如将受试者体内的Serpinc1活性降低约75％或更多的量的本发明的iRNA药剂，以及治疗有效量的替代因子或旁路剂，所述治疗有效量如与所述替代因子或旁路剂的推荐治疗有效量(例如，由世界血友病联合会(参见例如，Srivastava等人“Guidelines for the Management of Hemophilia”,Hemophilia Epub 2012年7月6日；DOI:10.1111/j.1365-2516.2012.02909.x)和/或食品药品监督管理局(参见例如，ADVATE(抗血友病因子(重组))产品插页；11/2016；BeneFIX(凝血因子IX(重组))产品插页；11/2011)所推荐)相比有所减少(例如，足以生成凝血酶并使出血消退(形成凝块)的量)。前述文献中每一项的全部内容通过引用并入。
合适的替代因子包括因子VIII(例如，Advate、Eloctate、Haemate、Helixate、Immunate、Octanate、Recombinate和Refacto)或因子IX(例如，Aimafix、Benefix、Immunine和Refacto)。用于本发明方法中的合适的旁路剂包括激活的凝血酶原复合物浓缩物(aPCC)(例如，FEIBA和Prothromplex)和重组因子VIIa(rFVIIa)(例如，NovoSeven)。
替代因子可以是因子VIII，并且在本发明方法中施用至受试者的替代因子的治疗有效量是足以实现约10-100IU/dL(例如，约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或约100IU/dL)的峰值血浆因子VIII水平的剂量。
例如，施用至受试者的因子VIII替代因子的治疗有效量可以是小于约200IU/kg、或小于约190IU/kg、或小于约180IU/kg、或小于约170IU/kg、或小于约160IU/kg、或小于约150IU/kg、或小于约140IU/kg、或小于约130IU/kg、或小于约120IU/kg、或小于约110IU/kg、或小于约100IU/kg、或小于约90IU/kg、或小于约80IU/kg、或小于约70IU/kg、或小于约60IU/kg、或小于约50IU/kg、或小于约40IU/kg、或小于约30IU/kg、或小于约20IU/kg、或小于约10IU/kg。在一个实施方案中，施用至受试者的因子VIII的治疗有效量是替代因子的推荐有效量的约三分之二至约五分之一，如约5至约20IU/kg或约10至约20IU/kg(例如，5、10、15或20IU/kg)的剂量。在一个实施方案中，出血事件是中度出血事件。在另一实施方案中，出血事件是重度出血事件。
替代因子可以是因子IX，并且在本发明方法中施用至受试者的替代因子的治疗有效量是足以实现约10-100IU/dL(例如，约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或约100IU/dL)的峰值血浆因子IX水平的剂量。
例如，因子IX替代因子的治疗有效量可以是小于约200IU/kg、或小于约190IU/kg、或小于约180IU/kg、或小于约170IU/kg、或小于约160IU/kg、或小于约150IU/kg、或小于约140IU/kg、或小于约130IU/kg、或小于约120IU/kg、或小于约110IU/kg、或小于约100IU/kg、或小于约90IU/kg、或小于约80IU/kg、或小于约70IU/kg、或小于约60IU/kg、或小于约50IU/kg、或小于约40IU/kg、或小于约30IU/kg、或小于约20IU/kg、或小于约10IU/kg。在一个实施方案中，施用至受试者的因子IX的治疗有效量是替代因子的推荐有效量的约二分之一至约六分之一，例如，约10至约30IU/kg或约20至约30IU/kg(如约10、15、20、25或30IU/kg)的剂量。在一个实施方案中，出血事件是中度出血事件。在另一实施方案中，出血事件是重度出血事件。
旁路剂可以是aPCC，并且在本发明方法中施用至受试者的旁路剂的治疗有效量是足以生成凝血酶并使出血消退的剂量。
例如，旁路剂aPCC的治疗有效量可以是小于约100U/kg、或小于约90U/kg、或小于约80U/kg、或小于约70U/kg、或小于约60U/kg、或小于约50U/kg、或小于约40U/kg、或小于约30U/kg、或小于约20U/kg、或小于约10U/kg。在一个实施方案中，施用至受试者的aPCC的治疗有效量是替代因子的推荐有效量的约二分之一至约三分之一，例如，约30至约50U/kg(如约30、35、40、45或50U/kg)的剂量。在一个实施方案中，出血事件是中度出血事件。在另一实施方案中，出血事件是重度出血事件。
旁路剂可以是rFVIIa，并且在本发明方法中施用至受试者的旁路剂的治疗有效量是足以生成凝血酶并使出血消退的剂量。
例如，旁路剂rFVIIa的治疗有效量是小于约120μg/kg、或小于约110μg/kg、或小于约100μg/kg、或小于约90μg/kg、或小于约80μg/kg、或小于约70μg/kg、或小于约60μg/kg、或小于约50μg/kg、或小于约40μg/kg、或小于约30μg/kg、或小于约20μg/kg。在一个实施方案中，施用至受试者的rFVIIa的治疗有效量是替代因子的推荐有效量的约二分之一，例如，约45μg/kg的剂量。在一个实施方案中，出血事件是中度出血事件。在另一实施方案中，出血事件是重度出血事件。
在一些实施方案中，将包含dsRNA药剂的药物组合物以固定剂量施用至受试者。“固定剂量”(例如，以mg计的剂量)意指，对所有受试者使用iRNA药剂的一种剂量，不考虑受试者相关的任何特定因素，如体重。在一个特定实施方案中，本发明的iRNA药剂的固定剂量是基于预定体重或年龄。
在一些实施方案中，包含iRNA药剂的药物组合物是以如下固定剂量来施用：在约25mg至约100mg之间，例如，在约25mg至约95mg之间、在约25mg至约90mg之间、在约25mg至约85mg之间、在约25mg至约80mg之间、在约25mg至约75mg之间、在约25mg至约70mg之间、在约25mg至约65mg之间、在约25mg至约60mg之间、在约25mg至约50mg之间、在约50mg至约100mg之间、在约50mg至约95mg之间、在约50mg至约90mg之间、在约50mg至约85mg之间、在约50mg至约80mg之间、在约30mg至约100mg之间、在约30mg至约90mg之间、在约30mg至约80mg之间、在约40mg至约100mg之间、在约40mg至约90mg之间、在约40mg至约80mg之间、在约60mg至约100mg之间、在约60mg至约90mg之间、在约25mg至约55mg之间、在约30mg至约95mg之间、在约30mg至约85mg之间、在约30mg至约75mg之间、在约30mg至约65mg之间、在约30mg至约55mg之间、在约40mg至约95mg之间、在约40mg至约85mg之间、在约40mg至约75mg之间、在约40mg至约65mg之间、在约40mg至约55mg之间或者在约45mg至约95mg之间。
在一些实施方案中，包含iRNA药剂的药物组合物是以如下固定剂量来施用：约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85mg、约90mg、约95mg或约100mg。
在一个实施方案中，将RNAi药剂以约100mg的固定剂量施用至受试者。
在一个实施方案中，将RNAi药剂以将Serpinc1活性降低约75％或更多的剂量施用至受试者。
可以将包含iRNA药剂的药物组合物作为一个或多个剂量施用至受试者。
可以将包含iRNA的药物组合物约每月一次、约每五周一次、约每六周一次、约每2个月一次或每季度一次施用至受试者。
在一些实施方案中，药物组合物的单一剂量可以是长效的，使得以不超过1、2、3、4、5、6、7或8周的间隔施用后续剂量。在本发明的一些实施方案中，本发明的药物组合物的单一剂量是每月一次施用。在一个实施方案中，RNAi药剂的固定剂量适合于每月一次施用至受试者，如每月一次80mg的固定剂量。
本发明的方法和用途包括施用本文所述的组合物，使得靶Serpinc1基因的表达降低，如持续约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或约80天。在一个实施方案中，靶Serpinc1基因的表达降低持续延长的持续时间，例如，至少约七天或更久，例如，约一周、两周、三周、约四周、约5周、约6周、约2个月、约一季度或更长时间。
基因表达的减少可以通过本领域中已知的任何方法来评估。例如，Serpinc1的表达的减少可以通过以下方式来确定：使用对于本领域普通技术人员常规的方法(例如，RNA印迹、qRT-PCR)确定Serpinc1的mRNA表达水平，使用对于本领域普通技术人员常规的方法(如蛋白质印迹、免疫技术)确定Serpinc1的蛋白质水平，和/或确定Serpinc1的生物学活性(如影响与细胞血液凝固机制(或在体内环境中，血液凝固本身)相关的一种或多种分子)。在一个实施方案中，使用例如全血的
Figure BDA0003257180980000511
血栓弹力图分析来确定凝血酶生成时间、凝块形成时间和/或凝固时间以评估Serpinc1表达。
根据本发明的方法和用途的dsRNA的施用可以导致患有Serpinc1相关疾病的患者中此类疾病或障碍的严重程度、体征、症状和/或标记的减少。在此情况下，“减少”意指这种水平在统计学上显著的降低。所述减少可以是例如至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或约100％。
疾病的治疗或预防的功效可以例如通过测量以下来评估：疾病进展、疾病缓解、症状严重程度、出血频率、疼痛减小、生活质量、维持治疗效果所需的药物剂量、疾病标记的水平或对于所治疗或所靶向以供预防的给定疾病适当的任何其他可测量参数。通过测量此类参数中的任一种或参数的任何组合监测治疗或预防的功效完全在本领域技术人员的能力范围内。例如，可以例如通过定期监测凝血酶:抗凝血酶水平来评估对出血障碍的治疗的功效。后期读数与初始读数的比较为医师提供治疗是否有效的指征。通过测量此类参数中的任一种或参数的任何组合监测治疗或预防的功效完全在本领域技术人员的能力范围内。关于靶向Serpinc1的iRNA或其药物组合物的施用，“有效对抗”出血障碍表明，以临床上适当的方式施用导致对至少统计学上大部分的患者的有益效果，如症状改进、治愈、疾病减轻、生命延长、生活质量提高或者通常被熟悉治疗出血障碍和相关病因的医生视为积极的其他效果。
当疾病状态的一种或多种参数存在统计学上显著的改进时，或者根据在原本预期会恶化或发展症状的情况下没有恶化或发展症状，治疗或预防效果是明显的。作为例子，疾病的可测量参数中至少10％，且优选地至少20％、30％、40％、50％或更大的有利变化可以表明有效治疗。还可以使用如本领域中已知的给定疾病的实验动物模型来判断给定iRNA药物或该药物的配制品的功效。在使用实验动物模型时，在观察到标记或症状的统计学上显著的减少时，证明了治疗功效。
可替代地，可以根据如诊断领域技术人员基于临床上接受的疾病严重程度评级量表所确定的疾病严重程度的降低来测量功效。导致例如使用适当量表测量的疾病严重程度减轻的任何积极变化表示使用如本文所述的iRNA或iRNA配制品的充分治疗。
本发明进一步提供用于iRNA或其药物组合物的使用的方法和用途，例如，用于与其他药品和/或其他治疗方法组合，例如，与已知药品和/或已知治疗方法(如例如，当前用于治疗这些障碍的那些)组合，来治疗会受益于Serpinc1表达的减少和/或抑制的受试者(例如，患有出血障碍的受试者)。
例如，在某些实施方案中，靶向Serpinc1的iRNA与例如如本文其他地方所述的用于治疗出血障碍的药剂组合施用。例如，适合于治疗会受益于Serpinc1表达的减少的受试者(例如，患有出血障碍的受试者)的另外的治疗药和治疗方法包括新鲜冷冻血浆(FFP)；重组FVIIa；重组FIX；FXI浓缩物；病毒灭活的含有vWF的FVIII浓缩物；脱敏疗法，其可以包括大剂量的FVIII或FIX，以及类固醇或静脉内免疫球蛋白(IVIG)和环磷酰胺；血浆去除术与免疫抑制和FVIII或FIX输注结合，使用或不使用抗纤溶疗法；免疫耐受性诱导(ITI)，使用或不使用免疫抑制疗法(例如，环磷酰胺、泼尼松和/或抗CD20)；醋酸去氨加压素[DDAVP]；抗纤溶药，如氨基己酸和氨甲环酸；激活的凝血酶原复合物浓缩物(PCC)；抗血友病剂；皮质类固醇；免疫抑制剂；和雌激素。
iRNA和另外的治疗剂和/或治疗可以同时和/或在同一组合中(例如，肠胃外)施用，或者另外的治疗剂可以作为单独组合物的部分或在单独时间和/或通过本领域中已知或本文所述的另一种方法来施用。
VI.本发明的容器
本发明还提供包含本发明的药物组合物的容器，如小瓶、注射器、自动注射器笔或无针施用装置。
在一个实施方案中，本发明的组合物可以用于使用例如预装注射器或自动注射装置进行自身施用。
在一个实施方案中，包含本发明的药物组合物的容器是小瓶。小瓶可以包括约0.5mL至约2.0ml的药物组合物。在一个实施方案中，小瓶包含约0.8ml的药物组合物。在一个实施方案中，小瓶是包含单一剂量的药物组合物的2R小瓶(即，2ml注射小瓶)。在一个实施方案中，2R小瓶包含约0.80ml(例如，约0.96至约1.05mL)的本发明的药物组合物，其包含单一80mg剂量的所述组合物。
在一个实施方案中，本发明的容器包含注射器，如预填充的注射器。在一个实施方案中，预填充的注射器包括防针刺伤安全特征(PFS-S)。合适的注射器可以是1ml注射器或3ml注射器，并且包括29G针或30G针。在一个实施方案中，注射器是具有29G或30G针的一次性3ml玻璃注射器。在一个实施方案中，预填充的注射器包含约0.80ml(例如，约0.84ml，或0.8至0.84ml)的本发明的药物组合物，其包含将单一80mg剂量的所述组合物。
本发明的示例性预填充的注射器可以包括注射器，如具有29G X 1/2"针的BDNeopak；刚性针罩(RNS)；柱塞，如具有FluroTec涂层的BD 4023柱塞；安全系统，如BDUltraSafelm Plus；柱塞杆，如BD UltraSafe的被动式柱塞杆；以及手指凸缘，如BDUltraSaferm被动式附加指。
VII.本发明的试剂盒
本发明还提供包含药物组合物的试剂盒。此类试剂盒包括包含本发明的药物组合物的一个或多个小瓶或者一个或多个预填充的注射器以及使用说明书，例如，用于施用预防或治疗有效量的一种或多种RNAi药剂的说明书。所述试剂盒可以任选地进一步包含用于施用RNAi药剂的构件(例如，注射装置)，或者用于测量对Serpinc1的抑制的构件(例如，用于测量对Serpinc1mRNA、Serpinc1蛋白和/或Serpinc1活性的抑制的构件)。用于测量对Serpinc1的抑制的此类构件可以包含用于从受试者获得样品(如例如，血浆样品)的构件。本发明的试剂盒可以任选地进一步包含用于确定治疗有效量或预防有效量的构件。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本领域所属领域普通技术人员的一般理解相同的含义。尽管与本文所述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料可以用于在本发明中为特征的iRNA和方法的时间或测试中，但合适的方法和材料描述于下文中。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其整体并入本文。另外，材料、方法和例子仅为说明性，并且不意图具有限制性。
通过以下实施例进一步说明本发明，所述实施例不应被视为限制性的。在本申请通篇中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容以及图示都是通过引用特此并入。
实施例
表1：用于核酸序列表示中的核苷酸单体的缩写。应理解，这些单体在存在于寡核苷酸中时通过5'-3'-磷酸二酯键互相连接。
Figure BDA0003257180980000541
Figure BDA0003257180980000551
实施例1：非妥西兰药物产品
非妥西兰药物产品(非妥西兰)是用于皮下施用的在5mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)中含有100mg/mL非妥西兰(等效于106mg/mL非妥西兰钠)的无菌溶液。药物产品是作为2R I型玻璃小瓶中的0.8mL溶液商业供应的，所述小瓶具有特氟纶涂布的丁基橡胶塞和中心撕裂封口。药物产品不含防腐剂并且意图用于一次性使用。
非妥西兰药物产品的组成归纳于表2中。
表2：非妥西兰药物产品的组成
Figure BDA0003257180980000561
a如果特定批次需要进行pH调整，仅使用氢氧化钠(USP、Ph.Eur.)和磷酸(USP、Ph.Eur.)。缩写：PBS＝磷酸盐缓冲溶液；BP＝英国药典；Ph.Eur.＝欧洲药典；USP＝美国药典；q.s.＝足量
下文显示的非妥西兰的化学结构使用扩展结构式来表示，其显示磷酸骨架。碱基对形成中涉及的碱基用虚线连接。下文还呈现含有GalNAc的配体L96的结构以及将所述配体缀合至有义链的3'端的接头。非妥西兰双链体(AD-57213)的双链体和两条单链(AD-116858，有义链；A-116861，反义链)的分子式和分子量也提供于下表中。
非妥西兰的扩展结构式
Figure BDA0003257180980000571
Af、Cf、Gf、Uf＝2’-F核糖核苷
Am、Cm、Gm、Um＝2’-OMe核糖核苷
Figure BDA0003257180980000572
分子式和分子量
Figure BDA0003257180980000573
实施例2：非妥西兰配制品开发
非妥西兰配制品设计用于皮下施用。设计用于皮下施用的配制品不应过酸或过碱，以避免增加的刺激和化学不相容性的风险。在适当考虑张力、pH和粘度的情况下，将配制品设计为尽可能地与生理接近。100mg/mL非妥西兰药物产品的水溶液的pH从5.0至6.8变化。钠反荷离子与阴离子型磷酸二酯的存在贡献一定量的渗透压，其取决于水溶液的浓度。在100mg/mL原料药的靶配制品中，反荷离子产生大约118mOsm/kg溶液。为了维持药物产品的等渗性和缓冲容量，将原料药溶解于5mM磷酸盐缓冲盐水(0.64mM NaH2PO4、4.36mMNa2HPO4、84mM NaCl)中。
上述药物产品配制品具有以下物理化学特性：约6.8至约7.2的pH；约300mOsm/kg的渗透压；和约1.038g/mL的密度。
非妥西兰药物产品制造由以下组成：将所需量的粉末化(冻干的)非妥西兰原料药溶解于5mM磷酸盐缓冲盐水中，并用氢氧化钠或磷酸将pH调整至大约7.0，之后进行无菌过滤和填充。
在早期开发(包括非临床研究和1/2期临床研究)中使用的药物产品是作为每小瓶标称0.5mL中的100mg/mL(非妥西兰钠)溶液来供应。用于3期研究中并且意图用于商业生产的药物产品是作为每小瓶标称0.8mL中的100mg/mL(非妥西兰游离酸，等效于106mg/mL非妥西兰钠)来供应。下表归纳非妥西兰药物产品配制品的差异。
Figure BDA0003257180980000581
实施例3：对非妥西兰药物产品的分析性分析
对非妥西兰药物产品进行各种分析性评价以证实，所述药物产品在物理上和化学上稳定。
外观
以黑色和白色背景在漫射均匀照明下目视检查非妥西兰药物产品的颜色、均匀性和颗粒物。
在所有不同批次中用相同的视觉测试对非妥西兰药物产品进行外观测试，并且结果符合“基本上无颗粒的透明、无色至浅黄色溶液”的规范。
通过双链体保留时间得到的身份
通过非变性IP RP-HPLC以及非妥西兰参考标准品分析非妥西兰药物产品，并且将样品的双链体保留时间与参考标准品的双链体保留时间作比较。迄今制造的所有非妥西兰药物产品批次都符合“保留时间与参考标准品的保留时间一致”的规范，从而确认其身份是退火的siRNA双链体。
通过UV对非妥西兰药物产品的测定
使用UV吸光度来确定非妥西兰药物产品中的非妥西兰的测定(mg/mL)。用UV分光光度计在260nm下测量适当稀释的药物产品在0.9％盐水中的吸光度。
C＝(A×F×M)/(ε×b)，
其中A是测量的吸光度，F是稀释因子，b是小池的路径长度(1cm)，ε是双链体参考标准品的摩尔吸光系数，M是分子量，并且C是浓度(mg/mL)。为了解释双链体纯度，针对其纯度因子(乘以(非变性IP-RP HPLC面积％)/100)来校正给定药物产品的非妥西兰测定结果。
非妥西兰药物产品的测定(mg/mL)是从UV分光光度法确定，并且针对来自非变性IP RP-HPLC方法的双链体纯度进行校正，并基于双链体的H形式(游离酸)的浓度报告结果。所有结果都在90至110mg/mL(以游离酸形式测量)的规范限内，其中平均测定值为101.5mg/mL且标准差为3.4％。结果显示在所测试的所有非妥西兰批的测定值之间的良好可比性。
非妥西兰药物产品的pH
直接测量非妥西兰药物产品的pH。观察到非妥西兰药物产品批的比较pH结果是7.1的pH，其标准差为0.0。所有结果都符合非妥西兰药物产品的pH的6.0-8.0的当前规范。对非妥西兰药物产品批次的pH数据的分析表明非妥西兰批之间的高度可比性。
非妥西兰药物产品的渗透压
非妥西兰药物产品的渗透压是基于凝固点降低的原理。渗透压报告为mOsm/kg值。因为配制品具有来自磷酸钠缓冲液和非妥西兰双链体的固定盐浓度，观察到的渗透压值仅显示窄范围。非妥西兰药物产品批次的渗透压结果的范围为297-310(mOsm/kg)，平均值为304mOsm/kg并且标准差为5.3％。所有结果都在非妥西兰药物产品的渗透压的240-390mOsm/kg的规范内。
非妥西兰药物产品中的颗粒物
通过光阻法针对每个容器的不可见颗粒物数量分析非妥西兰药物产品，并且以每个容器的颗粒(≥10μm和≥25μm)的总数来报告结果。对于非妥西兰药物产品中≥10μm的颗粒，观察到的范围为约29-588个颗粒(≥10μm)，平均值为约188个颗粒并且标准差为268.2％。所有结果都在非妥西兰药物产品的每个容器NMT 6,000的规范内。
对于≥25μm的颗粒，观察到的范围为约0-46个颗粒，平均值为约13个颗粒并且标准差为22.4％。所有结果都在菲图斯兰药物产品的每个容器NMT600的规范内。
非妥西兰药物产品在容器中的体积
测量包含非妥西兰药物产品的容器中的体积，其中将规范限设为不小于(NLT)0.8mL。在不同非妥西兰药物产品批中观察到的容器中的体积在非妥西兰药物产品批次之间显示良好的可比性程度，其标准差为0.0。
非妥西兰药物产品批次中的细菌内毒素和无菌度
非妥西兰药物产品的所有批次都符合针对细菌内毒素的微生物安全性测试标准(不大于(NMT)约100内毒素单位(EU)/mL)，从而显示对非妥西兰药物产品工艺及其微生物安全性概况的适当控制。
通过非变性离子对反相高效液相色谱(IP RP-HPLC)得到的双链体纯度
非变性IP RP-HPLC从任何残余单链解析双链体。通过这种方法确定双链体的面积百分比纯度。通过保留时间确立的非妥西兰药物产品中的原料药的身份与双链体参考标准品的身份一致。
使用非变性IPRP HPLC方法与质谱串联(ESI-MS)来鉴定药物产品中的组成单链(即有义链和反义链)。在从残余单链解析双链体峰时，通过这种方法确定双链体纯度。非妥西兰药物产品的代表性IP RP色谱图显示于图1中。
固定相：Waters XBridge C8 2.1×50柱，2.5μm粒径。
流动相A：95mM 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP)、16mM三乙胺(TEA)、5μM乙二胺四乙酸(EDTA)，在水中。
流动相B：含有5μM EDTA的100％甲醇。
流速：0.25mL/min。
柱温：15℃
梯度：
时间(min) ％A ％B
初始 80 20
1.00 80 20
15.25 35 65
15.75 20 80
16.75 20 80
17.00 80 20
24.00 80 20
检测：在260nm下进行UV，并且对于700至2700Da以负离子模式进行MS
样品制备：在1X PBS中制备样品至约0.1mg/mL单链中间体和0.2mg/mL双链体原料药(非妥西兰)的浓度。
注射体积为20μL。
检测限：使用色谱软件来积分并报告所有≥0.05面积％的峰。
纯度计算：通过色谱软件计算主双链体峰的面积％并报告为双链体纯度。还报告残余单链和其他杂质的面积％。
身份：通过液相色谱质谱(LC-MS)使用色谱软件依据从双链体峰光谱的解卷积确定的分子量确立在同一双链体峰下存在的组成单链(即有义链和反义链)的身份。
通过非变性IP RP-HPLC得到的非妥西兰药物产品的非变性谱确认了药物产品以其双链体形式的存在。双链体纯度指示非妥西兰药物产品中退火的双链体siRNA的百分比。对于此研究中包括的药物产品批次，双链体纯度值在约98.9-99.5面积％的范围内。数据分析得到约99.2％的平均(n＝4)纯度和约0.3％的标准差，并且显示，对于此报告中比较的所有非妥西兰药物产品批次，双链体纯度值彼此一致且类似。
通过非变性离子对反相高效液相色谱(IP RP-HPLC)得到的总杂质
通过非变性IP RP-HPLC得到的非双链体(未退火的)杂质报告为所有≥0.050面积％的(非双链体)峰之和。对于此研究中包括的非妥西兰药物产品的所有批次，观察到通过非变性IP RP-HPLC得到的总杂质的结果在2％内并且符合NMT 10.0面积％的规范。通过非变性IP RP-HPLC得到的总杂质的平均值(n＝4)为0.85％，且标准差为0.3％。总之，结果显示，在此报告中检查的非妥西兰药物产品批在指定的(单链)与非指定的杂质二者的方面具有极为类似的谱。
通过变性阴离子交换高效液相色谱(AX-HPLC)得到的纯度
为了确定药物产品中单链的纯度，进行变性AX-HPLC分析。
反义链的多个峰的存在是由于硫代磷酸酯非对映异构体所致。非妥西兰药物产品的代表性AX-HPLC色谱图显示于图2中。
固定相：Dionex DNAPac PA200柱，4x 250mm
流动相A：20mM磷酸钠，10％ACN，pH 11
流动相B：20mM磷酸钠，1M NaBr，10％ACN，pH 11
梯度：
时间(min) ％A ％B
初始 65 35
26.00 36.5 63.5
27.00 0 100
29.00 0 100
30.00 65 35
35.00 65 35
检测限：使用色谱软件来积分并报告所有≥0.05面积％的峰。
纯度计算：通过色谱软件计算每个主峰(有义和反义)的面积％，并且将有义链和反义链面积％之和报告为纯度。高于0.050面积％的杂质的面积％之和报告为总杂质。
身份：通过比较测试样品的保留时间与相应参考标准品的保留时间来确认单链身份。
AX-HPLC使非妥西兰双链体变性以形成组成有义和反义单链。通过这种方法确定单链的面积百分比纯度。
变性AX-HPLC方法测量构成非妥西兰双链体的单独单链的纯度。单链面积百分比之和表示非妥西兰药物产品的变性纯度。在此研究中对非妥西兰批的有义链和反义链的面积％之和的分析得到94.2面积％的平均值(n＝4)，且标准差为0.8％。来自代表性非妥西兰药物产品批次的所有结果都符合NLT85.0面积％的规范，并且指示非妥西兰药物产品的总体可比较纯度结果。
通过变性阴离子交换高效液相色谱(AX-HPLC)得到的总杂质
对于所有NLT 0.050面积％的杂质之和，数据分析得到5.6％的平均值(n＝4)，且标准差为0.7％。结果显示，此报告中包括的非妥西兰批次的总杂质值是一致的且可比较的。
通过变性离子对反相高效液相色谱(IP RP-HPLC)得到的纯度
IP RP-HPLC使非妥西兰双链体变性以形成组成有义和反义单链。通过这种方法确定单链面积百分比纯度。
变性IP RP-HPLC方法与AX-HPLC是正交的，并且测量药物产品中构成非妥西兰双链体的单独单链的纯度。单链面积百分比之和比表示非妥西兰药物产品的变性IP RP-HPLC纯度。
还进行变性IP RP-HPLC分析以确定药物产品中单链的纯度。
固定相：Waters XBridge C18(OST或XP)2.1×50柱，2.5μm粒径。
流动相A：550mM1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(HFIP)、13mM三甲胺(TEA)和5M乙二胺四乙酸(EDTA)，在90：10水：甲醇中。
流动相B：100％甲醇
流速：0.40mL/min。
柱温：80℃
梯度：
时间(min) ％A ％B
初始 94 6
2.0 94 6
35.0 82.5 17.5
40.0 56.5 43.5
40.5 30 70
42.5 30 70
43.0 94 6
49.0 94 6
检测：在260nm下进行UV，并且对于700至2700Da以负离子模式进行MS
样品制备：在1X PBS中制备样品至约0.1mg/mL单链中间体和0.2mg/mL双链体原料药(非妥西兰)的浓度。
注射体积为25μL。
检测限：使用色谱软件来积分并报告所有≥0.05面积％的峰。
纯度计算：通过色谱软件计算主双链体峰的面积％并报告为双链体纯度。还报告残余单链和其他杂质的面积％。
非妥西兰药物产品的代表性变性IP RP-HPLC色谱图显示于图3中。
在此研究中对非妥西兰批的有义链和反义链的面积％之和的分析得到88.7面积％的平均值(n＝4)，且标准差为1.4％。非妥西兰药物产品批的所有结果都符合NLT 80.0面积％的规范，并且显示在分析变异性内的非妥西兰药物产品批的可比较纯度结果。
通过变性离子对反相高效液相色谱(IP RP-HPLC)得到的总杂质
对于所有NLT 0.050面积％的杂质之和，数据分析得到11.0％的平均值(n＝4)，且标准差为1.5％。结果显示，此报告中包括的所有非妥西兰批次的总杂质值是一致的且可比较的。
实施例4：非妥西兰药物产品的容器封闭系统和相容性
选择用于非妥西兰药物产品的容器封闭系统以保护无菌产品免受微生物污染。通过在≥300℃下干热≥5分钟将小瓶灭菌并去热原。将丁基橡胶封口在121-125℃下高压灭菌≥60分钟。
将丁基橡胶塞通过高压釜经由验证的循环进行蒸汽灭菌。所有组分都是用于肠胃外产品的标准物料。使用储存在相同容器封闭系统中的药物产品进行非妥西兰药物产品稳定性研究。配制非妥西兰用于皮下注射。基于估计的要施用的计算剂量，将使用1mL或3mL注射器。测试两种注射器类型与非妥西兰的相容性，一种具有聚碳酸酯构建材料，并且第二种具有聚丙烯构建材料。将小瓶中填充的100mg/mL药物产品抽吸至注射器中。将一组填充的注射器在25℃下孵育8h，并将另一组填充的注射器在2-8℃下孵育48h，与对照一起孵育。孵育后，通过AX-HPLC测试药物产品的测定和纯度，并且与装入小瓶的药物产品相比较。在标签要求和纯度方面，在对照药物产品与在两种注射器类型中孵育的药物产品之间没有差异，表明非妥西兰与既定注射装置的相容性，如下表3中所示。
表3：相容性数据
Figure BDA0003257180980000641
缩写：AX-HPLC＝阴离子交换高效液相色谱；NA＝不适用；小瓶中的对照＝计划用于临床研究的小瓶中的非妥西兰药物产品。
1在此研究时，测定值以非妥西兰钠表示。
还评价用如表3中所示相同构建材料的注射器，使用更大号(更窄的孔)针来提取和分配未稀释的药物产品二者。分析两种注射器类型和两种分配速率。结果显示于表4中并且证实，在与29G或30G针一起使用时，非妥西兰药物产品的完整性保持完整。
表4：另外的相容性数据
Figure BDA0003257180980000651
缩写：AX-HPLC＝阴离子交换高效液相色谱；小瓶中的对照＝计划用于临床研究的小瓶中的非妥西兰药物产品。
实施例5：对非妥西兰药物产品的储存稳定性分析
在推荐的2-8℃的储存条件下以及在一个或多个加速条件下收集非妥西兰药物产品的储存稳定性数据。根据人用药物注册技术要求国际协调会(ICH)指南Q1A(R2)来设计稳定性研究，并将样品储存在与用于储存临床材料的容器封闭件(即，具有特氟纶面的丁基橡胶塞的2mL USP I型玻璃小瓶)相同的容器封闭件中。收集稳定性数据，如表5中所示。
表5：非妥西兰药物产品的稳定性方案
Figure BDA0003257180980000661
s-对在2℃-8℃和25℃±2℃/60±5％RII下储存的样品进行测试
A-对在40℃±2℃/75±5％RH下储存的样品进行测试
缩写：AX-HPLC＝阴离子交换HPLC；IPRP-HPLC＝离子对反相HPLc
使用以下分析程序评价非妥西兰药物产品的稳定性趋势：视觉外观、通过UV分光光度法测定、pH、渗透压、通过非变性IPRP-HPLC得到的双链体纯度以及如通过两种正交方法测量的单链纯度：通过变性AX HPLC得到的纯度和通过变性IPRP-HPLC得到的纯度。
为了进一步阐明药物产品的热稳定性，几项稳定性研究包括在25℃/60％RH下对药物产品的长期评估，以及在40℃/75％RH下进行的6个月加速老化研究。收集另外的数据(即，在25℃/60％RH下超过6个月，并且所有数据在40℃/75％RH下收集)以评价药物产品用于在ICH Zone II气候条件下长期储存的适合性。
非妥西兰药物产品三个代表性批(P02314、P02715和P07916)的储存稳定性数据提供于表6-表14中，并且归纳于下文中。
在推荐的2-8℃的储存条件下，已经收集非妥西兰药物产品的长达36个月的稳定性数据。在2-8℃储存期间没有鉴定出任何参数的显著变化，表明该条件适合于药物产品的长期储存。另外，在25℃/60％RH下储存期间，或者甚至在40℃/75％RH下储存期间，没有观察到显著变化。基于此，以及对药物产品用于在ICH Zone II气候条件(即，25℃/60％RH)下长期储存的适合性的评价，36个月的货架期被分配给在2-8℃下储存的非妥西兰药物产品，并且通过自最后一次更新的时间起收集的另外的数据进一步确认。
Figure BDA0003257180980000681
Figure BDA0003257180980000691
Figure BDA0003257180980000701
Figure BDA0003257180980000711
Figure BDA0003257180980000721
Figure BDA0003257180980000731
Figure BDA0003257180980000741
Figure BDA0003257180980000751
Figure BDA0003257180980000761
Figure BDA0003257180980000771
Figure BDA0003257180980000781
Figure BDA0003257180980000791
Figure BDA0003257180980000801
Figure BDA0003257180980000811
Figure BDA0003257180980000821
序列表
<110> 建新公司
<120> Serpinc1 iRNA组合物及其使用方法
<130> 117811-03020
<140>
<141>
<150> 62/793,020
<151> 2019-01-16
<160> 16
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 1599
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
tctgccccac cctgtcctct ggaacctctg cgagatttag aggaaagaac cagttttcag 60
gcggattgcc tcagatcaca ctatctccac ttgcccagcc ctgtggaaga ttagcggcca 120
tgtattccaa tgtgatagga actgtaacct ctggaaaaag gaaggtttat cttttgtcct 180
tgctgctcat tggcttctgg gactgcgtga cctgtcacgg gagccctgtg gacatctgca 240
cagccaagcc gcgggacatt cccatgaatc ccatgtgcat ttaccgctcc ccggagaaga 300
aggcaactga ggatgagggc tcagaacaga agatcccgga ggccaccaac cggcgtgtct 360
gggaactgtc caaggccaat tcccgctttg ctaccacttt ctatcagcac ctggcagatt 420
ccaagaatga caatgataac attttcctgt cacccctgag tatctccacg gcttttgcta 480
tgaccaagct gggtgcctgt aatgacaccc tccagcaact gatggaggta tttaagtttg 540
acaccatatc tgagaaaaca tctgatcaga tccacttctt ctttgccaaa ctgaactgcc 600
gactctatcg aaaagccaac aaatcctcca agttagtatc agccaatcgc ctttttggag 660
acaaatccct taccttcaat gagacctacc aggacatcag tgagttggta tatggagcca 720
agctccagcc cctggacttc aaggaaaatg cagagcaatc cagagcggcc atcaacaaat 780
gggtgtccaa taagaccgaa ggccgaatca ccgatgtcat tccctcggaa gccatcaatg 840
agctcactgt tctggtgctg gttaacacca tttacttcaa gggcctgtgg aagtcaaagt 900
tcagccctga gaacacaagg aaggaactgt tctacaaggc tgatggagag tcgtgttcag 960
catctatgat gtaccaggaa ggcaagttcc gttatcggcg cgtggctgaa ggcacccagg 1020
tgcttgagtt gcccttcaaa ggtgatgaca tcaccatggt cctcatcttg cccaagcctg 1080
agaagagcct ggccaaggta gagaaggaac tcaccccaga ggtgctgcaa gagtggctgg 1140
atgaattgga ggagatgatg ctggtggtcc acatgccccg cttccgcatt gaggacggct 1200
tcagtttgaa ggagcagctg caagacatgg gccttgtcga tctgttcagc cctgaaaagt 1260
ccaaactccc aggtattgtt gcagaaggcc gagatgacct ctatgtctca gatgcattcc 1320
ataaggcatt tcttgaggta aatgaagaag gcagtgaagc agctgcaagt accgctgttg 1380
tgattgctgg ccgttcgcta aaccccaaca gggtgacttt caaggccaac aggcctttcc 1440
tggtttttat aagagaagtt cctctgaaca ctattatctt catgggcaga gtagccaacc 1500
cttgtgttaa gtaaaatgtt cttattcttt gcacctcttc ctatttttgg tttgtgaaca 1560
gaagtaaaaa taaatacaaa ctacttccat ctcacatta 1599
<210> 2
<211> 1545
<212> DNA
<213> 恒河猴(Macaca mulatta)
<400> 2
ggcacgagga ccatctccac ttgcccagcc ctgtggaaga ttagcgacca tgtattccaa 60
tgtgatagga accgtagcct ctggaaaaag gaaggtttat cttctgtcct tgctgctcat 120
tggcctctgg gactgtatga cctgtcacgg gagccctgtg gacatctgca cagccaagcc 180
gcgggacatt cccatgaatc ccatgtgcat ttaccgctcc ccggagaaga aggcaactga 240
ggatgagggc tcagaacaga agatccccga ggccaccaac cggcgcgtct gggaactgtc 300
caaggccaat tcccgctttg ctaccacttt ctatcagcac ctggcagatt ccaagaacga 360
caaggataac attttcctgt cacccctgag tgtctccacg gcttttgcta tgaccaagct 420
gggtgcctgt aatgacaccc tcaagcaact gatggaggta tttaagtttg acaccatatc 480
tgagaaaaca tctgatcaga tccacttctt ctttgccaaa ctgaactgcc gactctatcg 540
aaaagccaac aaatcctcca agttagtatc agccaatcgc ctttttggag acaaatccct 600
taccttcaat gagacctacc aggacatcag tgagttggta tacggagcca agctccagcc 660
cctggacttc aaggaaaatg cagagcaatc cagagcggcc atcaacaaat gggtgtccaa 720
taagaccgaa ggccgaatca ccgatgtcat tcccccggaa gccatcaacg agctcactgt 780
tctggtgctg gttaacacca tttacttcaa gggcctgtgg aagtcaaagt ttagccctga 840
gaacacaagg atggaaccgt tctacaaggc tgatggagag tcgtgttcag cgtctatgat 900
gtaccaggaa ggcaagttct gttatcggcg cgtggctgaa ggcacccagg tgcttgagtt 960
gcccttcaag ggtgatgaca tcaccatggt gctcatcctg cccaagcctg agaagagcct 1020
gaccaaggtg gagcaggaac tcaccccaga ggtgctgcag gagtggctgg atgagttgga 1080
ggagatgatg ctggtggttc acatgccccg cttccgcatt gaggacggct tcagtttgaa 1140
ggagcagctg caagacatgg gccttgtcga tctgttcagc cctgaaaagt ccaaactccc 1200
aggtattgtt gcagaaggcc gggatgacct ctatgtctcc gatgcattcc ataaggcatt 1260
tcttgaggta aatgaagaag gcagtgaagc agctgcaagt accgccattg ggattgctgg 1320
ccgttcgcta aaccccaaca gggtgacctt caaggccaac aggcctttcc tggtttttat 1380
aagagaagtt cctctgaaca ctattatctt catgggcaga gtagccaacc cttgtgtgag 1440
ctaaactgtt cttattcttt gtacctcttc ctattttggt ttgtgaatag aagtaaaaat 1500
aaatacaact actcccatct tacattaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1545
<210> 3
<211> 2171
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 3
ataggtaatt ttagaaatag atctgatttg tatctgagac attttagtga agtggtgaga 60
tataagacat aatcagaaga catatctacc tgaagacttt aaggggagag ctccctcccc 120
cacctggcct ctggacctct cagatttagg ggaaagaacc agttttcgga gtgatcgtct 180
cagtcagcac catctctgta ggagcatcgg ccatgtattc ccctggggca ggaagtgggg 240
ctgctggtga gaggaagctt tgtctcctct ctctgctcct catcggtgcc ttgggctgtg 300
ctatctgtca cggaaaccct gtggacgaca tctgcatagc gaagccccga gacatccccg 360
tgaatccctt gtgcatttac cgctcccctg ggaagaaggc caccgaggag gatggctcag 420
agcagaaggt tccagaagcc accaaccggc gggtctggga actgtccaag gccaattcgc 480
gatttgccac taacttctac cagcacctgg cagactccaa gaatgacaac gacaacattt 540
tcctgtcacc cttgagcatc tccactgctt ttgctatgac caagctgggt gcctgtaacg 600
acactctcaa gcagctgatg gaggttttta aatttgatac catctccgag aagacatccg 660
accagatcca cttcttcttt gccaaactga actgccgact ctatcgaaaa gccaacaagt 720
cctctgactt ggtatcagcc aaccgccttt ttggagacaa atccctcacc ttcaacgaga 780
gctatcaaga tgttagtgag gttgtctatg gagccaagct ccagcccctg gacttcaagg 840
agaatccgga gcaatccaga gtgaccatca acaactgggt agctaataag actgaaggcc 900
gcatcaaaga tgtcatccca cagggcgcca ttaacgagct cactgccctg gttctggtta 960
acaccattta cttcaagggc ctgtggaagt caaagttcag ccctgagaac acaaggaagg 1020
aaccgttcta taaggtcgat gggcagtcat gcccagtgcc tatgatgtac caggaaggca 1080
aattcaaata ccggcgcgtg gcagagggca cccaggtgct agagctgccc ttcaaggggg 1140
atgacatcac catggtgctc atcctgccca agcctgagaa gagcctggcc aaggtggagc 1200
aggagctcac cccagagctg ctgcaggagt ggctggatga gctgtcagag actatgcttg 1260
tggtccacat gccccgcttc cgcaccgagg atggcttcag tctgaaggag cagctgcaag 1320
acatgggcct cattgatctc ttcagccctg aaaagtccca actcccaggg atcgttgctg 1380
gaggcaggga cgacctctat gtctccgacg cattccacaa agcatttctt gaggtaaatg 1440
aggaaggcag tgaagcagca gcgagtactt ctgtcgtgat tactggccgg tcactgaacc 1500
ccaatagggt gaccttcaag gccaacaggc ccttcctggt tcttataagg gaagttgcac 1560
tgaacactat tatattcatg gggagagtgg ctaatccttg tgtgaactaa aatattctta 1620
atctttgcac cttttcctac tttggtgttt gtgaatagaa gtaaaaataa atacgactgc 1680
cacctcacga gaatggactt ttccacttga agacgagaga ctggagtaca gatgctacac 1740
cacttttggg caagtgaagg gggagcagcc agccacggtg gcacaaacct atatcctggt 1800
gcttttgaag gtagaagcag ggcggtcagg agttaaggcc agttgaggct gggctgcaga 1860
gtgaaagacc atgtctcaag atggtctttc tcctccccaa agtagaaaag aaaaccataa 1920
aaacaagagg taaatatatt actatttcat cttagaggat agcaggcatc ttgaaagggt 1980
agagggacct taaattctca ttattgcccc catactacaa actaaaaaac aaacccgaat 2040
caatctccca taaagacaga gattcaaata agagtattaa acgttttatt tctcaaacca 2100
ctcacatgca taatgttctt atacacagtg tcaaaataaa gagaaatgca tttttataca 2160
aaaaaaaaaa a 2171
<210> 4
<211> 1561
<212> DNA
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 4
cggagggatt gctcagcact gtctccacgg cttctctgca gaagcgtcca ccatgtattc 60
cccgggaata ggaagtgcgg ttgctggaga gaggaagctt tgtctcctct ctctgctact 120
cattggtgcc ttgggctgtg ctgtctgtca tggaaaccct gtggacgaca tctgcatagc 180
gaagccccga gacatccccg tgaaccccat gtgcatttac cgctcccctg cgaagaaggc 240
cacggaggag gatgtcctag agcagaaggt tccggaagcc accaaccggc gggtctggga 300
actgtccaag gccaattctc gatttgccac taacttctat cagcacctgg cagactccaa 360
gaacgacaac gacaacattt tcctgtcacc cttgagcatc tccacggcgt ttgctatgac 420
caagctgggt gcttgtaata acaccctcaa gcagctgatg gaggttttta aatttgatac 480
catctccgag aagacatccg accagatcca cttcttcttt gccaaactga actgccgact 540
ctatcgaaaa gccaacaagt cctctaactt ggtgtcagcc aaccgccttt ttggagacaa 600
atcccttacc ttcaatgaga gctatcaaga cgttagtgag attgtctatg gagccaagct 660
tcagcccctg gacttcaagg agaatccgga gcaatccaga gtgaccatca acaactgggt 720
agctaataag actgaaggcc gcatcaaaga cgtcatcccc caaggagcca ttgatgagct 780
cactgccctg gtgctggtta acaccattta cttcaagggc ctgtggaagt caaagttcag 840
ccctgagaac acaaggaagg aaccattcca caaagttgat gggcagtcat gcctggtgcc 900
catgatgtac caggaaggca aattcaaata caggcgtgtg ggagagggta cccaggtgct 960
agagatgccc ttcaaggggg acgacatcac catggtgctc atcctgccca agcctgagaa 1020
gagcctggct aaggtggagc aggaactcac cccggagctg ctgcaggagt ggctggatga 1080
gctgtcggag gtcatgcttg tggtccacgt gccccgcttc cgcatcgagg acagcttcag 1140
tctgaaggag cagctgcaag acatgggcct tgttgatctc ttcagccctg agaagtccca 1200
actcccaggg atcattgctg aaggcaggga cgacctcttt gtctccgatg cattccacaa 1260
agcgtttctt gaggtaaatg aggaaggcag tgaagcagca gcgagtactt ctgtcgtgat 1320
tactggccgg tcactgaacc ccagtagggt gaccttcaag gccaacaggc ccttcctggt 1380
tcttataagg gaagtcgcac tgaacactat tatattcatg gggagagtgt ctaatccttg 1440
tgtgaactaa aatattctta atctttgcac cttttcctat ctcggtgttt gttaatggaa 1500
gtaaaaataa atatgactgc cacctcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1560
a 1561
<210> 5
<211> 1599
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
taatgtgaga tggaagtagt ttgtatttat ttttacttct gttcacaaac caaaaatagg 60
aagaggtgca aagaataaga acattttact taacacaagg gttggctact ctgcccatga 120
agataatagt gttcagagga acttctctta taaaaaccag gaaaggcctg ttggccttga 180
aagtcaccct gttggggttt agcgaacggc cagcaatcac aacagcggta cttgcagctg 240
cttcactgcc ttcttcattt acctcaagaa atgccttatg gaatgcatct gagacataga 300
ggtcatctcg gccttctgca acaatacctg ggagtttgga cttttcaggg ctgaacagat 360
cgacaaggcc catgtcttgc agctgctcct tcaaactgaa gccgtcctca atgcggaagc 420
ggggcatgtg gaccaccagc atcatctcct ccaattcatc cagccactct tgcagcacct 480
ctggggtgag ttccttctct accttggcca ggctcttctc aggcttgggc aagatgagga 540
ccatggtgat gtcatcacct ttgaagggca actcaagcac ctgggtgcct tcagccacgc 600
gccgataacg gaacttgcct tcctggtaca tcatagatgc tgaacacgac tctccatcag 660
ccttgtagaa cagttccttc cttgtgttct cagggctgaa ctttgacttc cacaggccct 720
tgaagtaaat ggtgttaacc agcaccagaa cagtgagctc attgatggct tccgagggaa 780
tgacatcggt gattcggcct tcggtcttat tggacaccca tttgttgatg gccgctctgg 840
attgctctgc attttccttg aagtccaggg gctggagctt ggctccatat accaactcac 900
tgatgtcctg gtaggtctca ttgaaggtaa gggatttgtc tccaaaaagg cgattggctg 960
atactaactt ggaggatttg ttggcttttc gatagagtcg gcagttcagt ttggcaaaga 1020
agaagtggat ctgatcagat gttttctcag atatggtgtc aaacttaaat acctccatca 1080
gttgctggag ggtgtcatta caggcaccca gcttggtcat agcaaaagcc gtggagatac 1140
tcaggggtga caggaaaatg ttatcattgt cattcttgga atctgccagg tgctgataga 1200
aagtggtagc aaagcgggaa ttggccttgg acagttccca gacacgccgg ttggtggcct 1260
ccgggatctt ctgttctgag ccctcatcct cagttgcctt cttctccggg gagcggtaaa 1320
tgcacatggg attcatggga atgtcccgcg gcttggctgt gcagatgtcc acagggctcc 1380
cgtgacaggt cacgcagtcc cagaagccaa tgagcagcaa ggacaaaaga taaaccttcc 1440
tttttccaga ggttacagtt cctatcacat tggaatacat ggccgctaat cttccacagg 1500
gctgggcaag tggagatagt gtgatctgag gcaatccgcc tgaaaactgg ttctttcctc 1560
taaatctcgc agaggttcca gaggacaggg tggggcaga 1599
<210> 6
<211> 1545
<212> DNA
<213> 恒河猴(Macaca mulatta)
<400> 6
tttttttttt ttttttttta atgtaagatg ggagtagttg tatttatttt tacttctatt 60
cacaaaccaa aataggaaga ggtacaaaga ataagaacag tttagctcac acaagggttg 120
gctactctgc ccatgaagat aatagtgttc agaggaactt ctcttataaa aaccaggaaa 180
ggcctgttgg ccttgaaggt caccctgttg gggtttagcg aacggccagc aatcccaatg 240
gcggtacttg cagctgcttc actgccttct tcatttacct caagaaatgc cttatggaat 300
gcatcggaga catagaggtc atcccggcct tctgcaacaa tacctgggag tttggacttt 360
tcagggctga acagatcgac aaggcccatg tcttgcagct gctccttcaa actgaagccg 420
tcctcaatgc ggaagcgggg catgtgaacc accagcatca tctcctccaa ctcatccagc 480
cactcctgca gcacctctgg ggtgagttcc tgctccacct tggtcaggct cttctcaggc 540
ttgggcagga tgagcaccat ggtgatgtca tcacccttga agggcaactc aagcacctgg 600
gtgccttcag ccacgcgccg ataacagaac ttgccttcct ggtacatcat agacgctgaa 660
cacgactctc catcagcctt gtagaacggt tccatccttg tgttctcagg gctaaacttt 720
gacttccaca ggcccttgaa gtaaatggtg ttaaccagca ccagaacagt gagctcgttg 780
atggcttccg ggggaatgac atcggtgatt cggccttcgg tcttattgga cacccatttg 840
ttgatggccg ctctggattg ctctgcattt tccttgaagt ccaggggctg gagcttggct 900
ccgtatacca actcactgat gtcctggtag gtctcattga aggtaaggga tttgtctcca 960
aaaaggcgat tggctgatac taacttggag gatttgttgg cttttcgata gagtcggcag 1020
ttcagtttgg caaagaagaa gtggatctga tcagatgttt tctcagatat ggtgtcaaac 1080
ttaaatacct ccatcagttg cttgagggtg tcattacagg cacccagctt ggtcatagca 1140
aaagccgtgg agacactcag gggtgacagg aaaatgttat ccttgtcgtt cttggaatct 1200
gccaggtgct gatagaaagt ggtagcaaag cgggaattgg ccttggacag ttcccagacg 1260
cgccggttgg tggcctcggg gatcttctgt tctgagccct catcctcagt tgccttcttc 1320
tccggggagc ggtaaatgca catgggattc atgggaatgt cccgcggctt ggctgtgcag 1380
atgtccacag ggctcccgtg acaggtcata cagtcccaga ggccaatgag cagcaaggac 1440
agaagataaa ccttcctttt tccagaggct acggttccta tcacattgga atacatggtc 1500
gctaatcttc cacagggctg ggcaagtgga gatggtcctc gtgcc 1545
<210> 7
<211> 2171
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 7
tttttttttt ttgtataaaa atgcatttct ctttattttg acactgtgta taagaacatt 60
atgcatgtga gtggtttgag aaataaaacg tttaatactc ttatttgaat ctctgtcttt 120
atgggagatt gattcgggtt tgttttttag tttgtagtat gggggcaata atgagaattt 180
aaggtccctc taccctttca agatgcctgc tatcctctaa gatgaaatag taatatattt 240
acctcttgtt tttatggttt tcttttctac tttggggagg agaaagacca tcttgagaca 300
tggtctttca ctctgcagcc cagcctcaac tggccttaac tcctgaccgc cctgcttcta 360
ccttcaaaag caccaggata taggtttgtg ccaccgtggc tggctgctcc cccttcactt 420
gcccaaaagt ggtgtagcat ctgtactcca gtctctcgtc ttcaagtgga aaagtccatt 480
ctcgtgaggt ggcagtcgta tttattttta cttctattca caaacaccaa agtaggaaaa 540
ggtgcaaaga ttaagaatat tttagttcac acaaggatta gccactctcc ccatgaatat 600
aatagtgttc agtgcaactt cccttataag aaccaggaag ggcctgttgg ccttgaaggt 660
caccctattg gggttcagtg accggccagt aatcacgaca gaagtactcg ctgctgcttc 720
actgccttcc tcatttacct caagaaatgc tttgtggaat gcgtcggaga catagaggtc 780
gtccctgcct ccagcaacga tccctgggag ttgggacttt tcagggctga agagatcaat 840
gaggcccatg tcttgcagct gctccttcag actgaagcca tcctcggtgc ggaagcgggg 900
catgtggacc acaagcatag tctctgacag ctcatccagc cactcctgca gcagctctgg 960
ggtgagctcc tgctccacct tggccaggct cttctcaggc ttgggcagga tgagcaccat 1020
ggtgatgtca tcccccttga agggcagctc tagcacctgg gtgccctctg ccacgcgccg 1080
gtatttgaat ttgccttcct ggtacatcat aggcactggg catgactgcc catcgacctt 1140
atagaacggt tccttccttg tgttctcagg gctgaacttt gacttccaca ggcccttgaa 1200
gtaaatggtg ttaaccagaa ccagggcagt gagctcgtta atggcgccct gtgggatgac 1260
atctttgatg cggccttcag tcttattagc tacccagttg ttgatggtca ctctggattg 1320
ctccggattc tccttgaagt ccaggggctg gagcttggct ccatagacaa cctcactaac 1380
atcttgatag ctctcgttga aggtgaggga tttgtctcca aaaaggcggt tggctgatac 1440
caagtcagag gacttgttgg cttttcgata gagtcggcag ttcagtttgg caaagaagaa 1500
gtggatctgg tcggatgtct tctcggagat ggtatcaaat ttaaaaacct ccatcagctg 1560
cttgagagtg tcgttacagg cacccagctt ggtcatagca aaagcagtgg agatgctcaa 1620
gggtgacagg aaaatgttgt cgttgtcatt cttggagtct gccaggtgct ggtagaagtt 1680
agtggcaaat cgcgaattgg ccttggacag ttcccagacc cgccggttgg tggcttctgg 1740
aaccttctgc tctgagccat cctcctcggt ggccttcttc ccaggggagc ggtaaatgca 1800
caagggattc acggggatgt ctcggggctt cgctatgcag atgtcgtcca cagggtttcc 1860
gtgacagata gcacagccca aggcaccgat gaggagcaga gagaggagac aaagcttcct 1920
ctcaccagca gccccacttc ctgccccagg ggaatacatg gccgatgctc ctacagagat 1980
ggtgctgact gagacgatca ctccgaaaac tggttctttc ccctaaatct gagaggtcca 2040
gaggccaggt gggggaggga gctctcccct taaagtcttc aggtagatat gtcttctgat 2100
tatgtcttat atctcaccac ttcactaaaa tgtctcagat acaaatcaga tctatttcta 2160
aaattaccta t 2171
<210> 8
<211> 1561
<212> DNA
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 8
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttgaggt ggcagtcata tttattttta 60
cttccattaa caaacaccga gataggaaaa ggtgcaaaga ttaagaatat tttagttcac 120
acaaggatta gacactctcc ccatgaatat aatagtgttc agtgcgactt cccttataag 180
aaccaggaag ggcctgttgg ccttgaaggt caccctactg gggttcagtg accggccagt 240
aatcacgaca gaagtactcg ctgctgcttc actgccttcc tcatttacct caagaaacgc 300
tttgtggaat gcatcggaga caaagaggtc gtccctgcct tcagcaatga tccctgggag 360
ttgggacttc tcagggctga agagatcaac aaggcccatg tcttgcagct gctccttcag 420
actgaagctg tcctcgatgc ggaagcgggg cacgtggacc acaagcatga cctccgacag 480
ctcatccagc cactcctgca gcagctccgg ggtgagttcc tgctccacct tagccaggct 540
cttctcaggc ttgggcagga tgagcaccat ggtgatgtcg tcccccttga agggcatctc 600
tagcacctgg gtaccctctc ccacacgcct gtatttgaat ttgccttcct ggtacatcat 660
gggcaccagg catgactgcc catcaacttt gtggaatggt tccttccttg tgttctcagg 720
gctgaacttt gacttccaca ggcccttgaa gtaaatggtg ttaaccagca ccagggcagt 780
gagctcatca atggctcctt gggggatgac gtctttgatg cggccttcag tcttattagc 840
tacccagttg ttgatggtca ctctggattg ctccggattc tccttgaagt ccaggggctg 900
aagcttggct ccatagacaa tctcactaac gtcttgatag ctctcattga aggtaaggga 960
tttgtctcca aaaaggcggt tggctgacac caagttagag gacttgttgg cttttcgata 1020
gagtcggcag ttcagtttgg caaagaagaa gtggatctgg tcggatgtct tctcggagat 1080
ggtatcaaat ttaaaaacct ccatcagctg cttgagggtg ttattacaag cacccagctt 1140
ggtcatagca aacgccgtgg agatgctcaa gggtgacagg aaaatgttgt cgttgtcgtt 1200
cttggagtct gccaggtgct gatagaagtt agtggcaaat cgagaattgg ccttggacag 1260
ttcccagacc cgccggttgg tggcttccgg aaccttctgc tctaggacat cctcctccgt 1320
ggccttcttc gcaggggagc ggtaaatgca catggggttc acggggatgt ctcggggctt 1380
cgctatgcag atgtcgtcca cagggtttcc atgacagaca gcacagccca aggcaccaat 1440
gagtagcaga gagaggagac aaagcttcct ctctccagca accgcacttc ctattcccgg 1500
ggaatacatg gtggacgctt ctgcagagaa gccgtggaga cagtgctgag caatccctcc 1560
g 1561
<210> 9
<211> 16
<212> PRT
<213> 未知的
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“未知的描述：RFGF肽”
<400> 9
Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
1 5 10 15
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知的
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“未知的描述：RFGF类似物肽”
<400> 10
Ala Ala Leu Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 11
<211> 13
<212> PRT
<213> 人免疫缺陷病毒
<400> 11
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
1 5 10
<210> 12
<211> 16
<212> PRT
<213> 果蝇属物种（Drosophila sp.）
<400> 12
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
<210> 13
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 13
gguuaacacc auuuacuuca a 21
<210> 14
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 14
uugaaguaaa ugguguuaac cag 23
<210> 15
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 15
uugaaguaaa ugguguuaac cag 23
<210> 16
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400> 16
gguuaacacc auuuacuuca a 21

Claims (55)

1.一种用于抑制Serpinc1基因的表达的药物组合物，其包含浓度为约50mg/mL至约200mg/mL的双链核糖核酸(dsRNA)药剂和浓度为约1mM至约10mM的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，
其中所述药物组合物的pH和渗透压适合于皮下施用至受试者，其中所述dsRNA药剂具有由核苷酸序列5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)组成的有义链和由核苷酸序列5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)组成的反义链，
其中a、g、c和u是2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf是2'-氟A、G、C、U；并且s是硫代磷酸酯连接，并且
其中配体经由接头缀合至所述有义链的3'端，并且其中所述配体和所述接头具有以下结构：
Figure FDA0003257180970000011
其中所述dsRNA药剂呈游离酸形式。
2.一种用于抑制Serpinc1基因的表达的药物组合物，其包含浓度为约50mg/mL至约200mg/mL的双链核糖核酸(dsRNA)药剂和浓度为约1mM至约10mM的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，
其中所述药物组合物的pH和渗透压适合于皮下施用至受试者，其中所述dsRNA药剂具有由核苷酸序列5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)组成的有义链和由核苷酸序列5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)组成的反义链，
其中a、g、c和u是2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf是2'-氟A、G、C、U；并且s是硫代磷酸酯连接，并且
其中配体经由接头缀合至所述有义链的3'端，并且其中所述配体和所述接头具有以下结构：
Figure FDA0003257180970000021
其中所述dsRNA药剂呈盐形式。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述盐形式是钠盐形式。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述药剂中基本上所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯基团都包含钠反离子。
5.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述药剂中的所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯基团都包含钠反离子。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的药物组合物，其中PBS的浓度在约2mM与约7mM之间。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中PBS的浓度为约3至约6mM。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中PBS的浓度为约5mM。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物的pH在约5.0至约8.0之间。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其中所述组合物的pH在约6.0至约8.0之间。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述组合物的pH在约6.5至约7.5之间。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述组合物的pH在约6.8至约7.2之间。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物的渗透压在约50mOsm/kg与约400mOsm/kg之间。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述组合物的渗透压在约100mOsm/kg与约400mOsm/kg之间。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述组合物的渗透压在约240mOsm/kg与约390mOsm/kg之间。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述组合物的渗透压在约290mOsm/kg与约320mOsm/kg之间。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物中所述dsRNA药剂的浓度在约50mg/mL与约150mg/mL之间。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述药物组合物中所述dsRNA药剂的浓度在约80mg/mL与约110mg/mL之间。
19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述药物组合物中所述dsRNA药剂的浓度为约100mg/mL。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的药物组合物，其中当在约2℃至约8℃下储存时，所述组合物稳定长达约36个月。
21.根据权利要求1-19中任一项所述的药物组合物，其中当在约25℃和60％相对湿度(RH)下储存时，所述组合物稳定长达约36个月。
22.根据权利要求1-19中任一项所述的药物组合物，其中当在约40℃和75％相对湿度(RH)下储存时，所述组合物稳定长达约6个月。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的药物组合物，其中如通过纯度非变性IPRP-HPLC所确定，所述组合物包含不小于(NLT)约90.5面积％双链体和不大于(NMT)约5面积％单链。
24.根据权利要求1-22中任一项所述的药物组合物，其中如通过纯度变性AX-HPLC所确定，所述组合物包含不小于(NLT)约85.0面积％总单链。
25.根据权利要求1-22中任一项所述的药物组合物，其中如通过纯度变性IPRP-HPLC所确定，所述组合物包含不小于(NLT)约80.0面积％总单链。
26.一种小瓶，其包含根据权利要求1-25中任一项所述的药物组合物。
27.根据权利要求26所述的小瓶，其中所述小瓶包含约0.5mL至约2.0ml的所述药物组合物。
28.根据权利要求27所述的小瓶，其中所述小瓶包含约0.8ml的所述药物组合物。
29.一种注射器，其包含根据权利要求1-25中任一项所述的药物组合物。
30.根据权利要求29所述的注射器，其中所述注射器是1ml注射器。
31.根据权利要求29所述的注射器，其中所述注射器是3ml注射器。
32.根据权利要求29-31中任一项所述的注射器，其中所述注射器包含29G针。
33.根据权利要求29-31中任一项所述的注射器，其中所述注射器包含30G针。
34.一种用于抑制Serpinc1基因的表达的药物组合物，其包含浓度为约100mg/mL的双链核糖核酸(dsRNA)药剂和浓度为约5mM的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，
其中所述药物组合物的pH为约6.8至约7.2，
其中所述药物组合物的渗透压为约300mOsm/kg，
其中所述dsRNA药剂具有由核苷酸序列5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)组成的有义链和由核苷酸序列5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)组成的反义链，
其中a、g、c和u是2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf是2'-氟A、G、C、U；并且s是硫代磷酸酯连接，并且
其中配体经由接头缀合至所述有义链的3'端，并且其中所述配体和所述接头具有以下结构：
Figure FDA0003257180970000041
其中所述dsRNA药剂呈游离酸形式。
35.一种用于抑制Serpinc1基因的表达的药物组合物，其包含浓度为约106mg/mL的双链核糖核酸(dsRNA)药剂和浓度为约5mM的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，
其中所述药物组合物的pH为约6.8至约7.2，
其中所述药物组合物的渗透压为约300mOsm/kg，
其中所述dsRNA药剂具有由核苷酸序列5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)组成的有义链和由核苷酸序列5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)组成的反义链，
其中a、g、c和u是2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf是2'-氟A、G、C、U；并且s是硫代磷酸酯连接，并且
其中配体经由接头缀合至所述有义链的3'端，并且其中所述配体和所述接头具有以下结构：
Figure FDA0003257180970000051
其中所述dsRNA药剂呈盐形式。
36.根据权利要求35所述的药物组合物，其中所述盐形式是钠盐形式。
37.根据权利要求36所述的药物组合物，其中所述药剂中基本上所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯基团都包含钠反离子。
38.根据权利要求36所述的药物组合物，其中所述药剂中的所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯基团都包含钠反离子。
39.一种用于抑制Serpinc1基因的表达的药物组合物，其包含浓度为约100mg/mL的双链核糖核酸(dsRNA)药剂和浓度为约5mM的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，
其中所述药物组合物的pH为约6.8至约7.2，
其中所述dsRNA药剂具有由核苷酸序列5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)组成的有义链和由核苷酸序列5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)组成的反义链，
其中a、g、c和u是2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf是2'-氟A、G、C、U；并且s是硫代磷酸酯连接，并且
其中配体经由接头缀合至所述有义链的3'端，并且其中所述配体和所述接头具有以下结构：
Figure FDA0003257180970000052
其中所述dsRNA药剂呈游离酸形式。
40.一种用于抑制Serpinc1基因的表达的药物组合物，其包含浓度为约106mg/mL的双链核糖核酸(dsRNA)药剂和浓度为约5mM的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，
其中所述药物组合物的pH为约6.8至约7.2，
其中所述dsRNA药剂具有由核苷酸序列5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)组成的有义链和由核苷酸序列5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)组成的反义链，
其中a、g、c和u是2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf是2'-氟A、G、C、U；并且s是硫代磷酸酯连接，并且
其中配体经由接头缀合至所述有义链的3'端，并且其中所述配体和所述接头具有以下结构：
Figure FDA0003257180970000061
其中所述dsRNA药剂呈盐形式。
41.根据权利要求34-40中任一项所述的药物组合物，其中当在约2℃至约8℃下储存时，所述组合物稳定长达约36个月。
42.根据权利要求34-40中任一项所述的药物组合物，其中当在约25℃和60％相对湿度(RH)下储存时，所述组合物稳定长达约36个月。
43.根据权利要求34-40中任一项所述的药物组合物，其中当在约40℃和75％相对湿度(RH)下储存时，所述组合物稳定长达约6个月。
44.根据权利要求34-40中任一项所述的药物组合物，其中如通过纯度非变性IPRP-HPLC所确定，所述组合物包含不小于(NLT)约95.0面积％双链体和不大于(NMT)约5面积％单链。
45.根据权利要求34-44中任一项所述的药物组合物，其中如通过纯度变性AX-HPLC所确定，所述组合物包含不小于(NLT)约85.0面积％总单链。
46.根据权利要求34-44中任一项所述的药物组合物，其中如通过纯度变性IPRP-HPLC所确定，所述组合物包含不小于(NLT)约80.0面积％总单链。
47.一种小瓶，其包含根据权利要求34-46中任一项所述的药物组合物。
48.根据权利要求47所述的小瓶，其中所述小瓶包含约0.5mL至约2.0ml的所述药物组合物。
49.根据权利要求48所述的小瓶，其中所述小瓶包含约0.8ml的所述药物组合物。
50.一种注射器，其包含根据权利要求34-46中任一项所述的药物组合物。
51.根据权利要求50所述的注射器，其中所述注射器是1ml注射器。
52.根据权利要求50所述的注射器，其中所述注射器是3ml注射器。
53.根据权利要求50-52中任一项所述的注射器，其中所述注射器包含29G针。
54.根据权利要求50-52中任一项所述的注射器，其中所述注射器包含30G针。
55.根据权利要求50-52中任一项所述的注射器，其中所述注射器是预填充的注射器。
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