BR112021013956A2 - Composições de irna de serpinc1 e métodos de uso das mesmas - Google Patents

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Abstract

composições de irna de serpinc1 e métodos de uso das mesmas. a presente invenção refere-se composições farmacêuticas compreendendo um agente irna, por exemplo, agente ácido ribonucleico de filamento duplo (dsrna), e métodos de uso de tais composições para tratar um evento de sangramento em um indivíduo tendo uma hemofilia (por exemplo, com ou sem inibidores).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “COMPO- SIÇÕES DE iRNA DE SERPINC1 E MÉTODOS DE USO DAS MES- MAS”.
PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] O presente pedido reivindica o benefício de prioridade para o Pedido Provisório U.S. No. 62/793.020, depositado em 16 de janeiro de 2019, cujo conteúdo em sua totalidade é aqui incorporado a título de referência.
[0002] O presente pedido está relacionado ao Pedido de Patente Internacional No. PCT/US2018/041400, depositado em 10 de julho de 2018, Pedido de Patente Provisório US No. 62/530.518, depositado em 10 de julho de 2017, Pedido de Patente Provisório US No. 62/599.223, depositado em 15 de dezembro de 2017, Pedido de Patente Provisório US No. 62/614.111, depositado em 5 de janeiro de 2018 e Pedido de Patente Provisório US No. 62/673.424, depositado em 18 de maio de
2018. Os conteúdos em sua totalidade de cada um dos pedidos de pa- tente acima são aqui incorporados a título de referência.
[0003] O presente pedido também está relacionado ao Pedido de Patente US No. 15/371.300, depositado em 7 de dezembro de 2016, Pedido de Patente Internacional No. PCT/US2016/065245, depositado em 7 de dezembro de 2016, Pedido de Patente Provisório US No. 62/264.013, depositado em 7 de dezembro de 2015, Pedido de Patente Provisório US No. 62/315.228, depositado em 30 de março de 2016, Pedido de Patente Provisório US No. 62/366.304, depositado em 25 de julho de 2016 e Pedido de Patente Provisório US No. 62/429.241, depo- sitado em 2 de dezembro de 2016. Os conteúdos de cada um dos pedi- dos de patente acima em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência.
[0004] Ainda, o presente pedido está relacionado ao Pedido de Pa- tente Provisório US No. 61/992.057, depositado em 12 de maio de 2014,
Pedido de Patente Provisório US No. 62/089.018, depositado em 8 de dezembro de 2014, Pedido de Patente Provisório US No. 62/102.281, depositado em 12 de janeiro de 2015 e Pedido de Patente Internacional No. PCT/US2015/030337, depositado em 12 de maio de 2015. Os con- teúdos de cada um dos pedidos de patente acima em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência.
[0005] O presente pedido também está relacionado ao Pedido de Patente Provisório US No. 61/638.952, depositado em 26 de abril de 2012, Pedido de Patente Provisório US No. 61/669.249, depositado em 9 de julho de 2012, Pedido de Patente Provisório US No. 61/734.573, depositado em 7 de dezembro de 2012, Pedido de Patente US No.: 13/837.129, depositado em 15 de março de 2013, agora Patente US No.
9.127.274, Pedido de Patente US No.: 14/806.084, depositado em 22 de julho, 2015, agora Patente US No. 9.376.680, Pedido de Patente US No. 15/070.358, depositado em 15 de março de 2016, Pedido de Pa- tente US No. 15/955.873, depositado em 18 de abril de 2018, Pedido de Patente US No. 16/220.157, depositado em 14 de dezembro de 2018 e Pedido de Patente Internacional No. PCT/US2013/038218, depositado em 25 de abril de 2013. O presente pedido também está relacionado ao Pedido de Patente Internacional No. PCT/US2012/065601, depositado em 16 de novembro de 2012. Os conteúdos de cada um dos pedidos de patente acima em sua totalidade são aqui incorporados a título de refe- rência.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[0006] O presente pedido contém uma Listagem de Sequência que foi apresentada eletronicamente em formato ASCII e é desta maneira aqui incorporada a título de referência em sua totalidade. A dita cópia ASCII, criada em 7 de janeiro de 2020, tem o nome 117811_03020_SL.TXT e tem 20.997 bytes de tamanho.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0007] Serpinc1 é um membro da superfamília de inibidor da serina proteinase (serpina). Serpinc1 é um inibidor da protease plasmática que inibe trombina bem como outras serina proteases ativadas do sistema de coagulação, tais como os fatores X, IX, XI, XII e VII e, então, regula a cascata de coagulação do sangue. A atividade anticoagulante de Ser- pinc1 é aumentada pela presença de heparina e outros glicosaminogli- canos relacionados que catalisam a formação de complexos trom- bina:antitrombina (TAT).
[0008] Distúrbios hemorrágicos, herdados ou adquiridos, são condi- ções nas quais há coagulação sanguínea inadequada. Por exemplo, he- mofilia é um grupo de distúrbios hemorrágicos genéticos hereditários que prejudicam a habilidade do corpo de controlar coagulação do san- gue. Hemofilia A é uma doença genética recessiva ligada ao X que en- volve falta de Fator VIII de coagulação funcional e representa 80% de casos de hemofilia. Hemofilia B é uma doença genética recessiva ligada ao X que envolve falta de Fator IX de coagulação funcional. Ela com- preende aproximadamente 20% de casos de hemofilia. Hemofilia C é uma doença genética autossômica que envolve falta do Fator XI de co- agulação funcional. Hemofilia C não é completamente recessiva, uma vez que indivíduos heterozigotos também mostram aumento de sangra- mento.
[0009] Embora no momento não haja cura para hemofilia, ela pode ser controlada com infusões regulares do fator de coagulação deficiente, por exemplo, fator VIII em hemofilia A. No entanto, alguns hemofílicos desenvolvem anticorpos (inibidores) contra os fatores de substituição dados a eles e, desta maneira, se tornam refratários à reposição de fator de coagulação. Consequentemente, sangramentos em tais indivíduos não podem ser controlados adequadamente.
[0010] Uma antitrombina (AT) de direcionamento terapêutico de
RNAi administrada subcutaneamente, uma vez por mês, investigacio- nal, Fitusiran, foi recentemente desenvolvida para o tratamento de he- mofilias A e B, com e sem inibidores, e composições farmacêuticas es- táveis compreendendo tal agente terapêutico são necessárias na téc- nica como tratamentos alternativos para indivíduos tendo um distúrbio hemorrágico, tal como hemofilia.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0011] A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, no desenvolvimento de composições farmacêuticas estáveis compreen- dendo um agente ácido ribonucleico de filamento duplo (dsRNA) que inibe a expressão de um gene Serpinc1 que tem satabilidade, eficácia, durabilidade e facilidade de administração aperfeiçoadas comparado com outras composições compreendendo um agente dsRNA que inibe a expressão de um gene Serpinc1. Essas composições farmacêuticas são úteis para tratamento de indivíduos com um distúrbio hemorrágico, tal como hemofilia.
[0012] Consequentemente, em um aspecto a presente invenção provê uma composição farmacêutica para inibição da expressão de um gene Serpinc1, compreendendo um agente ácido ribonucleico de fila- mento duplo (dsRNA) a uma concentração de cerca de 50 mg/mL a cerca de 200 mg/mL e solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração de cerca de 1 mM a cerca de 10 mM, em que o pH da composição farmacêutica é adequado para administração subcutâ- nea a um indivíduo, em que o agente dsRNA tem um filamento de senso consistindo na sequência de nucleotídeo de 5'- GfsgsUfuAfaCfaCfCfA- fuUfuAfcUfuCfaAf - 3’ (SEQ ID NO: 941) e um filamento de antissenso consistindo na sequência de nucleotídeo de 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfug- gUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 960), em que a, g, c e u são 2’-O- metila (2’-OMe) A, G, C e U; Af, Gf, Cf e Uf são 2'-fluor A, G, C, U; e s é uma ligação fosforotioato, e em que um ligante é conjugado à extremi- dade 3’ do filamento de senso por meio de um elemento de ligação, e em que o ligante e o elemento de ligação têm a estrutura que segue:
HO OH O H H
HO O N N O AcHN HO
O HO OH O O N O H H H O N N O N
HO O AcHN O
O O O HO OH O HO O N N O
H H AcHN O , em que o agente dsRNA está em uma forma de ácido livre.
[0013] Em outro aspecto a presente invenção provê uma composi- ção farmacêutica para inibição da expressão de um gene Serpinc1 com- preendendo um agente ácido ribonucleico de filamento duplo (dsRNA) a uma concentração de cerca de 50 mg/mL a cerca de 200 mg/mL e solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração de cerca de 1 mM a cerca de 10 mM, em que o pH da composição farma- cêutica é adequado para administração subcutânea a um indivíduo, em que o agente dsRNA tem um filamento de senso consistindo na sequên- cia de nucleotídeo de 5'- GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3’ (SEQ ID NO: 941) e um filamento de antissenso consistindo na sequên- cia de nucleotídeo de 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 960), em que a, g, c, e u são 2’-O-metila (2’-OMe) A, G, C e U; Af, Gf, Cf e Uf são 2'-fluor A, G, C, U; e s é uma ligação fosforotioato, e em que um ligante é conjugado à extremidade 3’ do filamento de senso por meio de um elemento de ligação, e em que o ligante e o elemento de ligação têm a estrutura que segue:
HO OH O H H
HO O N N O AcHN HO
O HO OH O O N O H H H O N N O N
HO O AcHN O
O O O HO OH O HO O N N O
H H AcHN O , em que o agente dsRNA está em uma forma de sal.
[0014] Em um aspecto a presente invenção provê uma composição farmacêutica para inibição da expressão de um gene Serpinc1 compre- endendo um agente ácido ribonucleico de filamento duplo (dsRNA) a uma concentração de cerca de 50 mg/mL a cerca de 200 mg/mL e so- lução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração de cerca de 1 mM a cerca de 10 mM, em que o pH e a osmolalidade da composição farmacêutica são adequados para administração subcutâ- nea a um indivíduo, em que o agente dsRNA tem um filamento de senso consistindo na sequência de nucleotídeo de 5'- GfsgsUfuAfaCfaCfCfA- fuUfuAfcUfuCfaAf - 3’ (SEQ ID NO: 941) e um filamento de antissenso consistindo na sequência de nucleotídeo de 5'- usUfsgAfaGfuAfaAfug- gUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 960), em que a, g, c e u são 2’-O- metila (2'-OMe) A, G, C e U; Af, Gf, Cf e Uf são 2’-flúor A, G, C, U; e s é uma ligação fosforotioato, e em que um ligante é conjugado à extremi- dade 3’ do filamento de senso por meio de um elemento de ligação, e em que o ligante e o elemento de ligação têm a estrutura que segue:
HO OH O H H
HO O N N O AcHN HO
O HO OH O O N O H H H O N N O N
HO O AcHN O
O O O HO OH O HO O N N O
H H AcHN O , em que o agente dsRNA está em uma forma de ácido livre.
[0015] Em outro aspecto a presente invenção provê uma composi- ção farmacêutica para inibição da expressão de um gene Serpinc1 com- preendendo um agente ácido ribonucleico de filamento duplo (dsRNA) a uma concentração de cerca de 50 mg/mL a cerca de 200 mg/mL e solução salina tamponada com fosfato ( PBS) a uma concentração de cerca de 1 mM a cerca de 10 mM, em que o pH e a osmolalidade da composição farmacêutica são adequados para administração subcutâ- nea a um indivíduo, em que o agente dsRNA tem um filamento de senso consistindo na sequência de nucleotídeo de 5'- GfsgsUfuAfaCfaCfCfA- fuUfuAfcUfuCfaAf - 3’ (SEQ ID NO: 941) e um filamento de antissenso consistindo na sequência de nucleotídeo de 5'- usUfsgAfaGfuAfaAfug- gUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 960), em que a, g, c e u são 2’-O- metila (2'-OMe) A, G, C e U; Af, Gf, Cf e Uf são 2’-flúor A, G, C, U; e s é uma ligação fosforotioato, e em que um ligante é conjugado à extremi- dade 3’ do filamento de senso por meio de um elemento de ligação, e em que o ligante e o elemento de ligação têm a estrutura que segue:
HO OH O H H
HO O N N O AcHN HO
O HO OH O O N O H H H O N N O N
HO O AcHN O
O O O HO OH O HO O N N O
H H AcHN O , em que o agente dsRNA está em uma forma de sal.
[0016] A forma de sal do dsRNA pode ser uma forma de sal de só- dio.
[0017] Em uma modalidade, substancialmente todos dos grupos fosfodiéster e/ou fosforotiotato no agente compreendem um contraíon de sódio. Em uma outra modalidade, todos os grupos fosfodiéster e/ou fosforotiotato no agente compreendem um contraíon de sódio.
[0018] A concentração de PBS na composição farmacêutica pode estar entre cerca de 2 mM e cerca de 7 mM; entre cerca de 3 a cerca de 6 mM; ou cerca de 5 mM.
[0019] O pH da composição farmacêutica pode estar entre cerca de 5,0 a cerca de 8,0; entre cerca de 6,0 a cerca de 8,0; entre cerca de 6,5 a cerca de 7,5; ou entre cerca de 6,8 a cerca de 7,2.
[0020] A osmolalidade da composição farmacêutica pode estar en- tre cerca de 50 e cerca de 400 mOsm/kg; entre cerca de 100 e cerca de 400 mOsm/kg; entre cerca de 240 e cerca de 390 mOsm/kg; ou entre cerca de 290 e cerca de 320 mOsm/kg.
[0021] A concentração do agente dsRNA na composição farmacêu- tica pode estar entre cerca de 50 mg/mL e cerca de 150 mg/mL; entre cerca de 80 mg/mL e cerca de 110 mg/mL; ou cerca de 100 mg/mL.
[0022] Em uma modalidade, a composição é estável por entre cerca de 6 meses a cerca de 36 meses quando armazenada a cerca de 2 oC a cerca de 8 oC. Em uma outra modalidade, a composição é estável por cerca de 6 meses a cerca de 36 meses quando armazenada a cerca de 25 oC e 60% de umidade relativa (RH). Em ainda uma outra modalidade, a composição é estável por cerca de 6 meses quando armazenada a cerca de 40 oC e 75% de umidade relativa (RH).
[0023] Em uma outra modalidade, a composição é estável por até cerca de 36 meses quando armazenada a cerca de 2 oC a cerca de 8 o C. Em uma outra modalidade, a composição é estável até cerca de 36 meses quando armazenada a cerca de 25 oC e 60% de umidade relativa (RH). Em ainda uma outra modalidade, a composição é estável até cerca de 6 meses quando armazenada a cerca de 40 oC e 75% de umi- dade relativa (RH).
[0024] Em uma modalidade, a composição compreende não menos do que (NLT) cerca de 95,0% de área de dúplex e não mais do que (NMT) cerca de 5% de área de impurezas totais de dúplex conforme determinado através IPRP-HPLC não desnaturante de pureza.
[0025] Em uma modalidade, a composição compreende não menos do que (NLT) cerca de 85,0% de área total de filamentos simples, con- forme determinado através de AX-HPLC desnaturante de pureza.
[0026] Em uma modalidade, a composição compreende não menos do que (NLT) cerca de 80,0% de área total de filamentos simples, con- forme determinado através de IPRP-HPLC desnaturante de pureza.
[0027] A presente invenção também provê frascos e seringas com- preendendo as composições farmacêuticas da invenção.
[0028] Os frascos podem incluir cerca de 0,5 mL a cerca de 2,0 mL da composição farmacêutica; ou cerca de 0,8 ml da composição farma- cêutica.
[0029] As seringas da invenção podem ser uma seringa de 1 ml; ou uma seringa de 3 ml. Em uma modalidade, a seringa é uma seringa de uso único de 1 ml.
[0030] As seringas da invenção podem incluir uma agulha 29 G; ou uma agulha de 30 G. Em uma modalidade, a agulha é uma agulha 29G.
[0031] Em um aspecto, a presente invenção provê uma composição farmacêutica para inibição da expressão de um gene Serpinc1 compre- endendo um agente ácido ribonucleico de filamento duplo (dsRNA) a uma concentração de cerca de 100 mg/mL e solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração de cerca de 5 mM, em que o pH da composição farmacêutica é cerca de 6,8 a cerca de 7,2, em que o agente dsRNA tem um filamento de senso consistindo na sequência de nucleotídeo de 5'- GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3’ (SEQ ID NO: 941) e um filamento antissenso consistindo na sequência de nucle- otídeo de 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3’ (SEQ ID NO: 960), em que a, g, c e u são 2’-O-metila (2’-OMe) A, G, C e U; Af, Gf, Cf e Uf são 2’-flúor A, G, C, U; e s é uma ligação fosforotioato, e em que um ligante é conjugado à extremidade 3’ do filamento de senso por meio de um elemento de ligação, e em que o ligante e o elemento de ligação têm a estrutura que segue:
HO OH O H H
HO O N N O AcHN HO
O HO OH O O N O H H H O N N O N
HO O AcHN O
O O O HO OH O HO O N N O
H H AcHN O , em que o agente dsRNA está em uma forma de ácido livre.
[0032] Em um outro aspecto, a presente invenção provê uma com- posição farmacêutica para inibição da expressão de um gene Serpinc1 compreendendo um agente ácido ribonucleico de filamento duplo (dsRNA) a uma concentração de cerca de 106 mg/mL e solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração de cerca de 5 mM, em que o pH da composição farmacêutica é cerca de 6,8 a cerca de 7,2, em que o agente dsRNA tem um filamento de senso consistindo na se- quência de nucleotídeo de 5'- GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3’ (SEQ ID NO: 941) e um filamento antissenso consistindo na sequên- cia de nucleotídeo de 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3’ (SEQ ID NO: 960), em que a, g, c e u são 2’-O-metila (2’-OMe) A, G, C e U; Af, Gf, Cf e Uf são 2’-flúor A, G, C, U; e s é uma ligação fosforotio- ato, e em que um ligante é conjugado à extremidade 3’ do filamento de senso por meio de um elemento de ligação, e em que o ligante e o ele- mento de ligação têm a estrutura que segue:
HO OH O H H
HO O N N O AcHN HO
O HO OH O O N O H H H O N N O N
HO O AcHN O
O O O HO OH O HO O N N O
H H AcHN O , em que o agente dsRNA está em uma forma de sal.
[0033] Em um aspecto, a presente invenção provê uma composição farmacêutica para inibição da expressão de um gene Serpinc1 compre- endendo um agente ácido ribonucleico de filamento duplo (dsRNA) a uma concentração de cerca de 100 mg/mL e solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração de cerca de 5 mM, em que o pH da composição farmacêutica é cerca de 6,8 a cerca de 7,2, em que a osmolalidade da composição farmacêutica é cerca de 300 mOsm/kg, em que o agente dsRNA tem um filamento de senso consistindo na se- quência de nucleotídeo de 5'- GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3’ (SEQ ID NO: 941) e um filamento de antissenso consistindo na se- quência de nucleotídeo de 5'- usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 960), em que a, g, c e u são 2’-O-metila (2'-OMe) A, G, C e U; Af, Gf, Cf e Uf são 2’-flúor A, G, C, U; e s é uma ligação fosforo- tioato, e em que um ligante é conjugado à extremidade 3’ do filamento de senso por meio de um elemento de ligação, e em que o ligante e o elemento de ligação têm a estrutura que segue:
HO OH O H H
HO O N N O AcHN HO
O HO OH O O N O H H H O N N O N
HO O AcHN O
O O O HO OH O HO O N N O
H H AcHN O , em que o agente dsRNA está em uma forma de ácido livre.
[0034] Em outro aspecto, a presente invenção provê uma composi- ção farmacêutica para inibição da expressão de um gene Serpinc1 com- preendendo um agente ácido ribonucleico de filamento duplo (dsRNA) a uma concentração de cerca de 106 mg/mL e solução salina tampo- nada com fosfato (PBS) a uma concentração de cerca de 5 mM, em que o pH da composição farmacêutica é cerca de 6,8 a cerca de 7,2, em que a osmolalidade da composição farmacêutica é cerca de 300 mOsm/kg, em que o agente dsRNA tem um filamento de senso consistindo na se- quência de nucleotídeo de 5'- GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf -
3’ (SEQ ID NO: 941) e um filamento de antissenso consistindo na se- quência de nucleotídeo de 5'- usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 960), em que a, g, c e u são 2’-O-metila (2'-OMe) A, G, C e U; Af, Gf, Cf e Uf são 2’-flúor A, G, C, U; e s é uma ligação fosforo- tioato, e em que um ligante é conjugado à extremidade 3’ do filamento de senso por meio de um elemento de ligação, e em que o ligante e o elemento de ligação têm a estrutura que segue:
HO OH O H H
HO O N N O AcHN HO
O HO OH O O N O H H H O N N O N
HO O AcHN O
O O O HO OH O HO O N N O
H H AcHN O , em que o agente dsRNA está em uma forma de sal.
[0035] Em uma modalidade, a forma de sal está em uma forma de sal de sódio.
[0036] Em uma modalidade, substancialmente todos dos grupos fosfodiéster e/ou fosforotiotato no agente compreendem um contraíon de sódio. Em uma outra modalidade, todos os grupos fosfodiéster e/ou fosforotiotato no agente compreendem um contraíon de sódio.
[0037] Em uma modalidade, a composição é estável por entre cerca de 6 meses a cerca de 36 meses quando armazenada a cerca de 2 oC a cerca de 8 oC. Em uma outra modalidade, a composição é estável por entre cerca de 6 meses a cerca de 36 meses quando armazenada a cerca de 25 oC e 60% de umidade relativa (RH). Em ainda uma outra modalidade, a composição é estável por cerca de 6 meses quando ar- mazenada a cerca de 40 oC e 75% de umidade relativa (RH).
[0038] Em uma modalidade, a composição é estável até cerca de 36 meses quando armazenada a cerca de 2 oC a cerca de 8 oC. Em uma outra modalidade, a composição é estável até cerca de 36 meses quando armazenada a cerca de 25 oC e 60% de umidade relativa (RH).
Em ainda uma outra modalidade, a composição é estável por até 6 me- ses quando armazenada a cerca de 40 oC e 75% de umidade relativa (RH).
[0039] Em uma modalidade, a composição compreende não menos do que (NLT) cerca de 95,0% da área de dúplex e não mais do que (NMT) cerca de 5% de área de impurezas totais de dúplex, conforme determinado através de IPRP-HPLC não desnaturante de pureza.
[0040] Em uma modalidade, a composição compreende não menos do que (NLT) cerca de 85,0% de área de filamentos simples totais, con- forme determinado através de AX-HPLC desnaturante de pureza.
[0041] Em uma modalidade, a composição compreende não menos do que (NLT) cerca de 80,0% de área de filamentos simples totais, con- forme determinado através de IPRP-HPLC desnaturante de pureza.
[0042] A presente invenção também provê um frasco compreen- dendo as composições farmacêuticas acima. Os frascos podem incluir cerca de 0,5 mL a cerca de 2,0 mL da composição farmacêutica; ou cerca de 0,8 ml da composição farmacêutica.
[0043] A presente invenção provê ainda uma seringa compreen- dendo as composições farmacêuticas acima.
[0044] As seringas da invenção podem ser uma seringa de 1 ml; ou uma seringa de 3 ml. Em uma modalidade, a seringa é uma seringa de uso único de 1 ml.
[0045] As seringas da invenção podem incluir uma agulha 29 G; ou uma agulha de 30 G. Em uma modalidade, a agulha é uma agulha 29G.
[0046] Em uma modalidade, a seringa é uma seringa pré-cheia.
[0047] Em outro aspecto, a presente invenção provê um frasco de 2 ml compreendendo cerca de 0,8 ml de uma composição farmacêutica para inibição da expressão de um gene Serpinc1, em que a composição farmacêutica compreende um agente ácido ribonucleico de filamento duplo (dsRNA) a uma concentração de cerca de 106 mg/mL e solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração de cerca de 5 mM, em que o pH da composição farmacêutica é cerca de 6,8 a cerca de 7,2, em que a osmolalidade da composição farmacêutica é cerca de 300 mOsm/kg, em que o agente dsRNA tem um filamento de senso con- sistindo na sequência de nucleotídeo de 5'- GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfu- AfcUfuCfaAf - 3’ (SEQ ID NO: 941) e um filamento de antissenso con- sistindo na sequência de nucleotídeo de 5'- usUfsgAfaGfuAfaAfuggUf- gUfuAfaCfcasg – 3’ (SEQ ID NO. 960), em que a, g, c e u são 2’-O- metilaa (2'-OMe) A, G, C e U; Af, Gf, Cf e Uf são 2’-flúor A, G, C, U; e s é uma ligação fosforotioato, e em que um ligante é conjugado à extre- midade 3’ do filamento de senso por meio de um elemento de ligação, e em que o ligante e o elemento de ligação têm a estrutura que segue:
HO OH O H H
HO O N N O AcHN HO
O HO OH O O N O H H H O N N O N
HO O AcHN O
O O O HO OH O HO O N N O
H H AcHN O , em que o agente dsRNA está em uma forma de sal de sódio e todos dos grupos fosfodi- éster e/ou fosforotioato no agente compreende um contraíon de sódio.
[0048] Em outro aspecto, a presente invenção provê uma seringa pré-cheia de uso único de 1 ml compreendendo uma agulha 29G, em que a seringa compreende cerca de 0,8 ml de uma composição farma- cêutica para inibição da expressão de um gene Serpinc1, em que a com- posição farmacêutica compreende um duplo agente ácido ribonucleico de filamento duplo (dsRNA) a uma concentração de cerca de 106 mg/mL e solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concen- tração de cerca de 5 mM, em que o pH da composição farmacêutica é cerca de 6,8 a cerca de 7,2, em que a osmolalidade do a composição farmacêutica é cerca de 300 mOsm/kg, em que o agente dsRNA tem um filamento de senso consistindo na sequência de nucleotídeo de 5'-
GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3’ (SEQ ID NO: 941) e um fi- lamento de antissenso consistindo na sequência de nucleotídeo de 5'- usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3’ (SEQ ID NO: 960), em que a, g, c e u são 2’-O-metilaa (2'-OMe) A, G, C e U; Af, Gf, Cf e Uf são 2’-flúor A, G, C, U; e s é uma ligação fosforotioato, e em que um ligante é conjugado à extremidade 3’ do filamento de senso por meio de um elemento de ligação, e em que o ligante e o elemento de ligação têm a estrutura que segue:
HO OH O H H
HO O N N O AcHN HO
O HO OH O O N O H H H O N N O N
HO O AcHN O
O O O HO OH O HO O N N O
H H AcHN O , em que o agente dsRNA está em uma forma de sal de sódio e todos dos grupos fosfodi- éster e/ou fosforotioato no agente compreendem um contraíon de só- dio.
[0049] Em outro aspecto, a presente invenção provê um frasco de 2 ml compreendendo cerca de 0,8 ml de uma composição farmacêutica para inibição da expressão de um gene Serpinc1, em que a composição farmacêutica compreende um agente ácido ribonucleico de filamento duplo (dsRNA) a uma concentração de cerca de 106 mg/mL e solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração de cerca de 5 mM, em que o pH da composição farmacêutica é cerca de 6,8 a cerca de 7,2, em que a osmolalidade da composição farmacêutica é de cerca de 300 mOsm/kg, em que o agente dsRNA tem a estrutura em que Am, Gm, Cm e Um são 2’-O-metila (2'-OMe) A, G, C e U; Af, Gf, Cf e Uf são 2’-flúor A, G, C, U; s é uma ligação fosforoti- oato; e em que L96 é um ligante e elemento de ligação tendo a estru- tura que segue:
HO OH O H H
HO O N N O AcHN HO
O HO OH O O N O H H H O N N O N
HO O AcHN O
O O O HO OH O HO O N N O
H H AcHN O , em que o agente dsRNA está em uma forma de sal de só- dio e todos dos grupos fosfodiéster e/ou fosforotioato no agente com- preendem um contraíon de sódio.
[0050] Em outro aspecto, a presente invenção provê uma seringa de uso único pré-cheia de 1 ml compreendendo uma agulha 29G, em que a seringa compreende cerca de 0,8 ml de uma composição farma- cêutica para inibição da expressão de um gene Serpinc1, em que a com- posição farmacêutica compreende um ácido ribonucleico de filamento duplo (dsRNA) a uma concentração de cerca de 106 mg/mL e solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração de cerca de 5 mM, em que o pH da composição farmacêutica é cerca de 6,8 a cerca de 7,2, em que a osmolalidade da composição farmacêutica é cerca de 300 mOsm/kg, em que o agente dsRNA tem a estrutura em que Am, Gm, Cm e Um são 2’-O-metila (2'-OMe) A, G, C e U; Af, Gf, Cf e Uf são 2’-flúor A, G, C, U; s é uma ligação fosforoti-
oato; e em que L96 é um ligante e elemento de ligação tendo a estru- tura que segue:
HO OH O H H
HO O N N O AcHN HO
O HO OH O O N O H H H O N N O N
HO O AcHN O
O O O HO OH O HO O N N O
H H AcHN O , em que o agente dsRNA está em uma forma de sal de só- dio e todos dos grupos fosfodiéster e/ou fosforotioato no agente com- preendem um contraíon de sódio.
[0051] Em outro aspecto, a presente invenção provê um frasco de 2 ml compreendendo cerca de 0,8 ml de uma composição farmacêutica para inibição da expressão de um gene Serpinc1, em que a composição farmacêutica compreende um agente ácido ribonucleico de filamento duplo (dsRNA) a uma concentração de cerca de 106 mg/mL e solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração de cerca de 5 mM, em que o pH da composição farmacêutica é cerca de 6,8 a cerca de 7,2, em que o agente dsRNA tem um filamento de senso consistindo na sequência de nucleotídeo de 5'- GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfu- AfcUfuCfaAf - 3’ (SEQ ID NO: 941) e um filamento de antissenso con- sistindo na sequência de nucleotídeo de 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUf- gUfuAfaCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 960), em que a, g, c e u são 2’-O- metila (2’-OMe) A, G, C e U; Af, Gf, Cf e Uf são 2’-flúor A, G, C, U; e s é uma ligação fosforotioato, e em que um ligante é conjugado à extremi- dade 3’ do filamento de senso através de um ligante, e em que o ligante e o elemento de ligação têm a estrutura que segue:
HO OH O H H
HO O N N O AcHN HO
O HO OH O O N O H H H O N N O N
HO O AcHN O
O O O HO OH O HO O N N O
H H AcHN O , em que o agente dsRNA está em uma forma de sal de sódio e todos dos grupos fosfodi- éster e/ou fosforotioato no agente compreendem um contraíon de só- dio.
[0052] Em outro aspecto, a presente invenção provê uma seringa pré-cheia de uso único de 1 ml compreendendo uma agulha 29G, em que a seringa compreende cerca de 0,8 ml de uma composição farma- cêutica para inibição da expressão de um gene Serpinc1, em que a com- posição farmacêutica compreende um agente ácido ribonucleico de fila- mento duplo (dsRNA) a uma concentração de cerca de 106 mg/mL e solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração de cerca de 5 mM, em que o pH da composição farmacêutica é cerca de 6,8 a cerca de 7,2, em que o agente dsRNA tem um filamento de senso consistindo na sequência de nucleotídeo de 5'- GfsgsUfuAfaCfaCfCfA- fuUfuAfcUfuCfaAf - 3’ (SEQ ID NO: 941) e um filamento de antissenso consistindo na sequência de nucleotídeo de 5'- usUfsgAfaGfuAfaAfug- gUfgUAfaCfcsasg – 3’ (SEQ ID NO: 960), em que a, g, c e u são 2’-O- metila (2'-OMe) A, G, C e U; Af, Gf, Cf e Uf são 2’-flúor A, G, C, U; e s é uma ligação fosforotioato, e em que um ligante é conjugado à extremi- dade 3’ do filamento de senso por meio de um elemento de ligação, e em que o ligante e o elemento de ligação têm a estrutura que segue:
HO OH O H H
HO O N N O AcHN HO
O HO OH O O N O H H H O N N O N
HO O AcHN O
O O O HO OH O HO O N N O
H H AcHN O , em que o agente dsRNA está em uma forma de sal de só- dio e todos dos grupos fosfodiéster e/ou fosforotioato no agente com- preendem um contraíon de sódio.
[0053] Em outro aspecto, a presente invenção provê um frasco de 2 ml compreendendo cerca de 0,8 ml de uma composição farmacêutica para inibição da expressão de um gene Serpinc1, em que a composição farmacêutica compreende um agente ácido ribonucleico de filamento duplo (dsRNA) a uma concentração de cerca de 106 mg/mL e solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração de cerca de 5 mM, em que o pH da composição farmacêutica é cerca de 6,8 a cerca de 7,2, em que o agente dsRNA tem a estrutura em que Am, Gm, Cm e Um são 2’-O-metila (2'-OMe) A, G, C e U; Af, Gf, Cf e Uf são 2’-flúor A, G, C, U; s é uma ligação fosforoti- oato; e em que L96 é um ligante e elemento de ligação tendo a estru- tura que segue:
HO OH O H H
HO O N N O AcHN HO
O HO OH O O N O H H H O N N O N
HO O AcHN O
O O O HO OH O
HO O N N O AcHN H H
O em que o agente dsRNA está em uma forma de sal de só- dio e todos dos grupos fosfodiéster e/ou fosforotioato no agente com- preendem um contraíon de sódio.
[0054] Em outro aspecto, a presente invenção provê uma seringa pré-cheia de uso único de 1 ml compreendendo uma agulha 29G, em que a seringa compreende cerca de 0,8 ml de uma composição farma- cêutica para inibição da expressão de um gene Serpinc1, em que a com- posição farmacêutica compreende um agente ácido ribonucleico de fila- mento duplo (dsRNA) a uma concentração de cerca de 106 mg/mL e solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração de cerca de 5 mM, em que o pH da composição farmacêutica é cerca de 6,8 a cerca de 7,2, em que o agente dsRNA tem a estrutura em que Am, Gm, Cm e Um são 2’-O-metila (2'-OMe) A, G, C e U; Af, Gf, Cf e Uf são 2’-flúor A, G, C, U; s é uma ligação fosforotio- ato; e em que L96 é um ligante e elemento de ligação tendo a estru- tura que segue:
HO OH O H H
HO O N N O AcHN HO
O HO OH O O N O H H H O N N O N
HO O AcHN O
O O O HO OH O HO O N N O
H H AcHN O , em que o agente dsRNA está em uma forma de sal de sódio e todos dos grupos fosfodiéster e/ou fosforotioato no agente compre- endem um contraíon de sódio.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0055] A Figura 1 mostra um cromatograma de Cromatografia Lí- quida de Alto Desempenho de Fase Reversa de Par de Íons (IP RP- HPLC) representativo não desnaturante do produto farmacêutico fitusi- ran. Uma leve divisão ocasional do pico do dúplex de fitusiran foi obser- vada devido à resolução parcial de estereoisômeros diferentes de fos- forotioatos no dúplex de siRNA. Análise espectrométrica de massa do pico de fitusiran confirmou a presença das massas esperadas de ambos filamentos simples em razão igual ao longo de todo o pico do dúplex.
[0056] A Figura 2 mostra um cromatograma de Cromatografia Lí- quida de Alto Desempenho de Troca Aniônica (AX-HPLC) desnaturante representativo de filamentos simples em dúplex no produto farmacêu- tico fitusiran.
[0057] A Figura 3 mostra um perfil cromatográfico de Cromatografia Líquida de Alto Desempenho de Fase Reversa de Par de Íons (IP RP- HPLC) desnaturante representativo de filamentos simples em dúplex no produto farmacêutico fitusiran.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0058] A presente invenção provê composições farmacêuticas com- preendendo um agente iRNA que realiza a clivagem mediada por com- plexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) de transcritos de RNA de um gene Serpinc1. A presente invenção é baseada, pelo menos em parte, no desenvolvimento de composições farmacêuticas estáveis compreendendo tais agentes que têm satabilidade, eficácia, durabili- dade e facilidade de administração aperfeiçoadas comparado com ou- tras composições compreendendo um agente dsRNA que inibe a ex- pressão de um Serpinc1 gene. Tais composições farmacêuticas são úteis para inibição da expressão de um gene Serpinc1 e/ou para trata- mento de um indivíduo tendo um distúrbio que se beneficiaria da inibição ou redução da expressão de um gene Serpinc1, por exemplo, um dis- túrbio hemorrágico, tal como hemofilia.
[0059] A descrição detalhada que segue divulga como fazer e usar composições contendo iRNAs para inibir a expressão de um gene Ser- pinc1, bem como composições, usos e métodos para tratamento de in- divíduos com doenças e distúrbios que se beneficiariam da inibição e/ou redução da expressão deste gene. I. Definições
[0060] Para que a presente invenção possa ser mais prontamente compreendida, certos termos são primeiro definidos. Ainda, deve ser observado que sempre que um valor ou faixa de valores de um parâme- tro é mencionado, é pretendido que os valores e faixas intermediários aos valores mencionados também pretendam fazer parte da presente invenção.
[0061] Os artigos "um" e "uma" são usados aqui para se referir a um ou mais de um (isto é, a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, "um elemento" significa um elemento ou mais de um elemento, por exemplo, uma pluralidade de elementos.
[0062] O termo "cerca de" é usado aqui para significar dentro das faixas típicas de tolerâncias na técnica. Por exemplo, "cerca de" pode ser compreendido como cerca de 2 desvios padrão da média. Em certas modalidades, cerca de significa +10%. Em certas modalidades, cerca de significa +5%. Quando cerca de está presente antes de uma série de números ou faixa, é compreendido quer "cerca de" pode modificar cada um dos números na série ou faixa.
[0063] O termo "incluindo" é usado aqui para significar, e é usado intercomutavelmente com, a frase "incluindo, mas não limitado a".
[0064] O termo "ou" é usado aqui para significar, e é usado interco- mutavelmente com, o termo "e/ou", a menos que o contexto indique cla- ramente o contrário.
[0065] O termo "composição farmacêutica", como usado aqui, re- fere-se a uma composição que é útil para tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo, por exemplo, um indivíduo humano.
[0066] O termo "administração farmacêutica" refere-se à adminis- tração de uma composição compreendendo um agente dsRNA, como descrito aqui, a um indivíduo para tratamento de uma doença ou distúr- bio. Deste modo, "adequado para administração farmacêutica" tal como "adequado para administração subcutânea" descreve uma composição compreendendo um agente dsRNA que pode ser usado para tratar uma doença ou distúrbio em um indivíduo através da administração subcu- tânea da composição farmacêutica. Uma composição farmacêutica é adequada para administração farmacêutica, por exemplo, adequada para administração subcutânea.
[0067] O termo "osmolalidade" refere-se ao número de osmoles de soluto por quilograma de solvente. Ele é expresso em termos de os- mol/kg ou Osm/kg. Um “osmole” é uma unidade de medida que des- creve o número de moles de um composto que contribui para a pressão osmótica de uma solução química.
[0068] Como usado aqui, "Serpinc1" refere-se a um polipeptídeo particular expresso em uma célula. Serpinc1 é também conhecido como inibidor da peptidase da serpina, clade C (antitrombina; AT), membro 1; antitrombina III; AT3; antitrombina; e cofator de heparina 1. A sequência de um transcrito de mRNA de Serpinc1 humano pode ser encontrada em, por exemplo, GenBank No. de Acesso GI: 254588059 (NM_000488; SEQ ID NO: 1). A sequência de mRNA de Serpinc1 de Rhesus pode ser encontrada em, por exemplo, GenBank No. de Acesso GI: 157167169 (NM_001104583; SEQ ID NO: 2). A sequência de mRNA de Serpinc1 de camundongo pode ser encontrada, por exemplo, no GenBank No. de Acesso GI: 237874216 (NM_080844; SEQ ID NO: 3). A sequência de mRNA de Serpinc1 de rato pode ser encontrada em, por exemplo, Gen- Bank No. de Acesso GI: 58865629 (NM_001012027; SEQ ID NO: 4).
[0069] O termo "Serpinc1", como usado aqui, também refere-se a um polipeptídeo específico expresso em uma célula através de varia- ções de sequência de DNA de ocorrência natural do gene Serpinc1, tal como um polimorfismo de nucleotídeo único no gene Serpinc1. Vários SNPs dentro do gene Serpinc1 foram identificados e podem ser encon- trados em, por exemplo, NCBI dbSNP (vide, por exemplo, www.ncbi.nlm.nih.gov/snp). Exemplos não limitativos de SNPs dentro do gene Serpinc1 podem ser encontrados em NCBI dbSNP Nos. de acesso rs677; rs5877; rs5878; rs5879; rs941988; rs941989; rs1799876; rs19637711; rs2008946; e rs2227586.
[0070] Como usado aqui, um "indivíduo" é um animal, tal como um mamífero, incluindo um primata (tal como um ser humano, um primata não humano, por exemplo, um macaco e um chimpanzé), um não pri- mata (tal como uma vaca, um porco, um camelo, uma lhama, um cavalo, uma cabra, um coelho, uma ovelha, um hamster, um porquinho-da-ín- dia, um gato, um cachorro, rato, um camundongo, um cavalo e uma ba- leia) ou uma ave (por exemplo, um pato ou um ganso). Em uma moda- lidade, o indivíduo é um ser humano, tal como um ser humano tratado ou avaliado quanto a uma doença, distúrbio ou condição que se benefi- ciaria da redução em expressão de Serpinc1; um humano sob risco de uma doença, distúrbio ou condição que se beneficiaria da redução em expressão de Serpinc1; um ser humano com uma doença, distúrbio ou condição que se beneficiaria da redução em expressão de Serpinc1; e/ou ser humano tratado para uma doença, distúrbio ou condição que se beneficiaria da redução em expressão de Serpinc1 como descrito aqui.
[0071] O termo "inibir", como usado aqui, é usado intercomutavel- mente com "redução", "silenciamento", "regulação negativa", "supres- são" e outros termos semelhantes e inclui qualquer nível de inibição.
[0072] A frase "inibição de expressão de um Serpinc1", como usado aqui, inclui inibição de expressão de qualquer gene Serpinc1 (tal como, por exemplo, um gene Serpinc1 de camundongo, um gene Serpinc1 de rato, um gene Serpinc1 de macaco ou um gene Serpinc1 humano) bem como variantes ou mutantes de um gene Serpinc1 que codifica uma pro- teína Serpinc1.
[0073] "Expressão de inibição de um gene Serpinc1" inclui qualquer nível de inibição de um gene Serpinc1, por exemplo, pelo menos su- pressão parcial da expressão de um gene Serpinc1, tal como uma inibi- ção em pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, em pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91% , pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99%.
[0074] A expressão de um gene Serpinc1 pode ser avaliada com base no nível de qualquer variável associada à expressão do gene Ser-
pinc1, por exemplo, nível de mRNA de Serpinc1, nível de proteína Ser- pinc1 ou, por exemplo, níveis do complexo de trombina:antitrombina como uma medida do potencial de geração de trombina, tempo de san- gramento, tempo de protrombina (PT), contagem de plaquetas e/ou tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT). A inibição pode ser avaliada por uma diminuição em um nível absoluto ou relativo de uma ou mais dessas variáveis comparado com um nível de controle. O nível de controle pode ser qualquer tipo de nível de controle que seja usado na técnica, por exemplo, um nível de linha de base de pré-dose, ou um nível determinado a partir de um indivíduo, célula ou amostra similar que não é tratado ou tratado com um controle (tal como, por exemplo, con- trole somente de tampão ou controle de agente inativo).
[0075] Em uma modalidade, supressão pelo menos parcial da ex- pressão de um gene Serpinc1 é avaliada por uma redução da quanti- dade de mRNA de Serpinc1 que pode ser isolado ou detectado em uma primeira célula ou grupo de células em que um gene Serpinc1 é trans- crito e que foi ou foram tratados de modo que a expressão de um gene Serpinc1 seja inibida, comparado com uma segunda célula ou grupo de células substancialmente idêntico à primeira célula ou grupo de células, mas que foi ou não tratado (células de controle) . O grau de inibição pode ser expresso em termos de (𝑚𝑅𝑁𝐴 𝑒𝑚 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒) − (𝑚𝑅𝑁𝐴 𝑒𝑚 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑑𝑎𝑠) ● 100% (𝑚𝑅𝑁𝐴 𝑒𝑚 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒)
[0076] A frase "contatar uma célula com um agente RNAi", tal como um dsRNA, como usado aqui, inclui contato de uma célula através de qualquer meio possível. Contato de uma célula com um agente RNAi inclui contato de uma célula in vitro com o iRNA ou contato de uma cé- lula in vivo com o iRNA. O contato pode ser feito direta ou indiretamente. Assim, por exemplo, o agente RNAi pode ser posto em contato físico com a célula pelo indivíduo que realiza o método ou, alternativamente, o agente RNAi pode ser posto em uma situação que permitirá ou fará com que ele entre subsequentemente em contato com a célula.
[0077] Contato com uma célula in vitro pode ser feito, por exemplo, incubando a célula com o agente RNAi. O contato de uma célula in vivo pode ser feito, por exemplo, pela injeção do agente RNAi dentro ou pró- ximo do tecido onde a célula está localizada, ou pela injeção do agente RNAi em outra área, por exemplo, a corrente sanguínea ou o espaço subcutâneo, de modo que o agente alcançará subsequentemente o te- cido onde a célula a ser contatada está localizada. Por exemplo, o agente RNAi pode conter e/ou ser acoplado a um ligante, por exemplo, GalNAc3, que direciona o agente RNAi para um sítio de interesse, por exemplo, o fígado. Combinações de métodos de contato in vitro e in vivo também são possíveis. Por exemplo, uma célula também pode ser con- tatada in vitro com um agente RNAi e subsequentemente transplantada em um indivíduo. II. Composição Farmacêutica da Invenção
[0078] A presente invenção provê composições farmacêuticas es- táveis compreendendo um agente ácido ribonucleico de filamento duplo (dsRNA) que inibe expressão de um gene Serpinc1. As composições farmacêuticas da invenção incluem um agente dsRNA, como descrito aqui, e solução salina tamponada com fosfato (PBS), e são adequadas para administração subcutânea a um indivíduo. As composições farma- cêuticas contendo os agentes dsRNA são úteis para tratamento de uma doença ou distúrbio associado à expressão ou atividade de um gene Serpinc1, por exemplo, uma doença associada a Serpinc1, por exem- plo, uma hemofilia. As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas em dosagens suficientes para inibir a expressão de um gene Serpinc1.
[0079] Em uma modalidade, as composições farmacêuticas da in- venção incluem agentes dsRNA da invenção em uma forma de ácido livre. Em uma outra modalidade, as composições farmacêuticas da in- venção incluem agentes dsRNA da invenção em uma forma de sal de sódio. Em certas modalidades, quando os agentes dsRNA da invenção estão na forma de sal de sódio, os íons de sódio estão presentes no agente como contraíons (a fim de manter a neutralidade elétrica), para substancialmente todos dos grupos fosfodiéster e/ou fosforotiotato pre- sentes no agente. Agentes nos quais substancialmente todas das liga- ções fosfodiéster e/ou fosforotioato têm um contraíon de sódio incluem não mais do que 5, 4, 3, 2 ou 1 ligações fosfodiéster e/ou fosforotioato sem um contraíon de sódio. Em algumas modalidades, quando os agen- tes dsRNA da invenção estão na forma de sal de sódio, íons de sódio estão presentes no agente como contraíons para todos dos grupos fos- fodiéster e/ou fosforotiotato presentes no agente.
[0080] As composições farmacêuticas da invenção podem incluir um agente dsRNA a uma concentração de cerca de 50 mg/mL a cerca de 200 mg/mL, cerca de 50 mg/mL a cerca de 150 mg/mL; cerca de 90 mg/mL a cerca de 110 mg/mL, cerca de 90 mg/mL a cerca de 100 mg/mL ou cerca de 80 mg/mL a cerca de 110 mg/mL, por exemplo, cerca de 50 mg/mL, 55 mg/mL, 60 mg/mL, 65 mg/mL, 70 mg/mL, 75 mg/mL, 80 mg/mL, 85 mg/mL, 90 mg/mL, 95 mg/mL, 100 mg/mL, 105 mg/mL, 106 mg/mL, 110 mg/mL, 115 mg/mL, 120 mg/mL, 125 mg/mL, 130 mg/mL, 135 mg/mL, 140 mg/mL, 145 mg/mL, 150 mg/mL, 155 mg/mL, 160 mg/mL, 165 mg/mL, 170 mg/mL, 175 mg/mL, 180 mg/mL, 185 mg/mL, 190 mg/mL, 195 mg/mL ou cerca de 200 mg/mL. Em uma modalidade, as composições farmacêuticas da invenção incluem um agente dsRNA a uma concentração de cerca de 100 mg/mL. Valores intermediários para as faixas e valores mencionados acima também pre- tendem ser parte da presente invenção. Ainda, faixas de valores usando uma combinação de qualquer um dos valores mencionados acima como limites superiores e/ou inferiores devem ser incluídos.
[0081] As composições farmacêuticas da invenção podem incluir PBS. Em uma modalidade, o PBS inclui cloreto de sódio e fosfato de sódio, mas não inclui cloreto de potássio e/ou fosfato de potássio. Em uma outra modalidade, o PBS inclui cloreto de sódio, fosfato de sódio e cloreto de potássio. Em ainda uma outra modalidade, o PBS inclui clo- reto de sódio, fosfato de sódio e fosfato de potássio. Em uma modali- dade, o PBS inclui cloreto de sódio, fosfato de sódio, cloreto de potássio e fosfato de potássio. Em certas modalidades, por exemplo, quando o PBS inclui cloreto de sódio e fosfato de sódio, o PBS pode estar em uma concentração de cerca de 1 mM a cerca de 10 mM; ou cerca de 3 mM a cerca de 6 mM, por exemplo, cerca de 1mM, 1,5 mM, 2 mM, 2,5 mM, 3 mM, 3,5 mM, 4 mM, 4,5 mM, 5 mM, 6,5 mM, 7 mM, 7,5 mM, 9 mM , 8,5 mM, 9 mM, 9,5 mM ou cerca de 10 mM de PBS. Em uma modalidade da invenção, uma composição farmacêutica da invenção tem PBS a uma concentração de cerca de 5 mM (por exemplo, cerca de 0,64 mM de NaH2PO4, cerca de 4,36 mM de Na2HPO4, cerca de 85 mM de NaCl). Valores intermediários para as faixas e valores mencionados acima tam- bém pretendem ser parte da presente invenção. Ainda, faixas de valores usando uma combinação de qualquer um dos valores mencionados acima como limites superiores e/ou inferiores devem ser incluídos.
[0082] Em uma modalidade, as composições farmacêuticas da in- venção são livres de conservantes. Em uma outra modalidade da inven- ção, as composições farmacêuticas da invenção incluem um conser- vante.
[0083] O pH das composições farmacêuticas da invenção são ade- quados para administração subcutânea e podem estar entre cerca de 5,0 a cerca de 8,0, cerca de 5,5 a cerca de 8,0, cerca de 6,0 a cerca de 8,0, cerca de 6,5 a cerca de 8,0, cerca de 7,0 a cerca de 8,0, cerca de 5,0 a cerca de 7,5, cerca de 5,5 a cerca de 7,5, cerca de 6,0 a cerca de 7,5, cerca de 6,5 a cerca de 7,5, cerca de 5,0 a cerca de 7,2, cerca de
5,25 a cerca de 7,2, cerca de 5,5 a cerca de 7,2, cerca de 5,75 a cerca de 7,2, cerca de 6,0 a cerca de 7,2, cerca de 6,5 a cerca de 7,2 ou cerca de 6,8 a cerca de 7,2. Faixas e valores intermediários paras as faixas e valores mencionados acima também pretendem ser parte da presente invenção.
[0084] A osmolalidade das composições farmacêuticas da invenção pode ser adequada para administração subcutânea, tal como, não mais do que, cerca de 400 mOsm/kg, por exemplo, entre 50 e 400 mOsm/kg, entre 75 e 400 mOsm/kg, entre 100 e 400 mOsm/kg, entre 125 e 400 mOsm/kg, entre 150 e 400 mOsm/kg, entre 175 e 400 mOsm/kg, entre 200 e 400 mOsm/kg, entre 250 e 400 mOsm/kg, entre 300 e 400 mOsm/kg, entre 50 e 375 mOsm/kg, entre 75 e 375 mOsm/kg, entre 100 e 375 mOsm/kg, entre 125 e 375 mOsm/kg, entre 150 e 375 mOsm/kg, entre 175 e 375 mOsm/kg, entre 200 e 375 mOsm/kg, entre 250 e 375 mOsm/kg, entre 300 e 375 mOsm/kg, entre 50 e 350 mOsm/kg, entre 75 e 350 mOsm/kg, entre 100 e 350 mOsm/kg, entre 125 e 350 mOsm/kg, entre 150 e 350 mOsm/kg, entre 175 e 350 mOsm/kg, entre 200 e 350 mOsm/kg, entre 250 e 350 mOsm/kg, entre 50 e 325 mOsm/kg, entre 75 e 325 mOsm/kg, entre 100 e 325 mOsm/kg, entre 125 e 325 mOsm/kg, entre 150 e 325 mOsm/kg, entre 175 e 325 mOsm/kg, entre 200 e 325 mOsm/kg, entre 250 e 325 mOsm/kg, entre 300 e 325 mOsm/kg, entre 300 e 350 mOsm/kg, entre 50 e 300 mOsm/kg, entre 75 e 300 mOsm/kg, entre 100 e 300 mOsm/kg, entre 125 e 300 mOsm/kg, entre 150 e 300 mOsm/kg, entre 175 e 300 mOsm/kg, entre 200 e 300 mOsm/kg, entre 250 e 300, entre 50 e 250 mOsm/kg, entre 75 e 250 mOsm/kg, entre 100 e 250 mOsm/kg, entre 125 e 250 mOsm/kg, entre 150 e 250 mOsm/kg, entre 175 e 350 mOsm/kg, entre 200 e 250 mOsm/kg, por exemplo, cerca de 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215,
220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 295, 300, 305, 310, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395 ou cerca de 400 mOsm/kg. Faixas e valo- res intermediários das faixas e valores mencionados acima também pre- tendem ser parte da presente invenção. Ainda, faixas de valores usando uma combinação de qualquer um dos valores mencionados acima como limites superiores e/ou inferiores pretendem ser incluídas.
[0085] As composições farmacêuticas da invenção são fisicamente e quimicamente estáveis.
[0086] Como usado aqui, o termo "estável" refere-se a uma compo- sição farmacêutica e/ou um agente dsRNA dentro de tal composição farmacêutica que retém essencialmente sua estabilidade física e/ou es- tabilidade química e/ou atividade biológica. Várias técnicas analíticas para medição da estabilidade da composição e do agente dsRNA estão disponíveis na técnica e são descritas aqui.
[0087] Uma composição farmacêutica (ou agente dsRNA dentro de tal composição) "retém sua estabilidade física" se ela não mostrar subs- tancialmente quaisquer sinais de, por exemplo, impurezas aumentadas quando do exame visual ou exame de UV de cor e/ou clareza, ou con- forme medido através de, por exemplo Análise de HPLC, por exemplo, IP RP-HPLC desnaturante, IP RP-HPLC não desnaturante e/ou análise AX-HPLC desnaturante.
[0088] Um agente dsRNA "retém sua estabilidade química" em composição farmacêutica se a estabilidade química em um dado mo- mento for tal de modo que o agente dsRNA seja considerado ainda reter sua atividade biológica. A estabilidade química pode ser avaliada atra- vés de, por exemplo, detecção e/ou quantificação de formas quimica- mente alteradas do dúplex de dsRNA e/ou formas quimicamente altera- das do filamento de senso e/ou filamento de antissenso. Alteração quí- mica pode envolver modificação de tamanho e/ou mudança do teor de sódio que pode ser avaliada, por exemplo, pelo tempo de retenção de dúplex e/ou identificação do peso molecular dos filamentos simples for- mando o dúplex usando, por exemplo, IP RP-HPLC não desnaturante, identificação através de temperatura de fusão usando, por exemplo, es- pectrofotometria UV térmica e/ou através do teor de sódio (em uma base anidra) usando, por exemplo, Absorção Atômica com Chama (AAS de chama)/espectrometria de emissão óptica de plasma indutivamente acoplado (ICP-OES).
[0089] Um agente dsRNA "retém sua atividade biológica" em uma composição farmacêutica, se o agente dsRNA em uma composição for biologicamente ativo para seu propósito pretendido. Por exemplo, ativi- dade biológica é retida se a atividade biológica de um agente dsRNA na composição estiver dentro de cerca de 30%, cerca de 20% ou cerca de 10% (dentro dos erros do ensaio) da atividade biológica exibida no mo- mento que a composição foi preparada (por exemplo, conforme deter- minado através de um ensaio de RT-PCR in vitro).
[0090] Por exemplo, em algumas modalidades, as composições da invenção são estáveis por entre cerca de 6 meses a cerca de 36 meses quando armazenadas a cerca de 2 oC a cerca de 8 oC. Em outras mo- dalidades, as composições da invenção são estáveis por entre cerca de 6 meses a cerca de 36 meses quando armazenadas a cerca de 25 oC e 60% de umidade relativa (RH). Em ainda outra modalidade, as compo- sições da invenção são estáveis por cerca de 6 meses quando armaze- nadas a cerca de 40 oC e 75% de umidade relativa (RH).
[0091] Em algumas modalidades, as composições da invenção são estáveis por até cerca de 36 meses quando armazenadas a cerca de 2 o C a cerca de 8 oC. Em outras modalidades, as composições da inven- ção são estáveis por até cerca de 36 meses quando armazenadas a cerca de 25 oC e 60% de umidade relativa (RH). Em ainda outra moda- lidade, as composições da invenção são estáveis por até 6 meses quando armazenadas a cerca de 40 oC e 75% de umidade relativa (RH).
[0092] Em uma modalidade, as composições da invenção compre- endem não menos do que (NLT) cerca de 95,0% de área do dúplex e não mais do que (NMT) cerca de 5% de área de impurezas totais de dúplex, conforme determinado através de IPRP-HPLC não desnatu- rante de pureza. Em uma outra modalidade, as composições farmacêu- ticas da invenção compreendem não menos do que (NLT) cerca de 85,0% de área de filamentos simples totais, conforme determinado atra- vés de AX-HPLC desnaturante de pureza. Em ainda uma outra modali- dade, as composições farmacêuticas da invenção compreendem não menos do que (NLT) cerca de 80,0% de área de filamentos simples total conforme determinado através de IPRP-HPLC desnaturante de pureza.
[0093] Em um aspecto, a presente invenção provê uma composição farmacêutica para inibição de expressão de um gene Serpinc1. A com- posição farmacêutica inclui um agente ácido ribonucleico de filamento duplo (dsRNA) a uma concentração de cerca de 50 mg/mL a cerca de 200 mg/mL e solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma con- centração de cerca de 1 mM a cerca de 10 mM, em que o pH e a osmo- lalidade da composição farmacêutica são adequados para administra- ção subcutânea a um indivíduo, em que o agente dsRNA compreende um filamento de senso e um filamento de antissenso, o filamento de antissenso compreendendo uma região de complementaridade com um mRNA codificando Serpinc1 que compreende pelo menos 15 nucleotí- deos contíguos diferindo em não mais do que 3 nucleotídeos da sequên- cia de nucleotídeo de 5’ - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), em que substancialmente todos os nucleotídeos do filamento de senso e substancialmente todos os nucleotídeos do fila- mento de antissenso são nucleotídeos modificados, em que o filamento de senso é conjugado a um ligante ligado ao terminal 3’ e em que o agente dsRNA está em uma forma de ácido livre.
[0094] Em outro aspecto, a presente invenção provê uma composi- ção farmacêutica para inibição da expressão de um gene Serpinc1. A composição farmacêutica inclui um agente ácido ribonucleico de fila- mento duplo (dsRNA) a uma concentração de cerca de 50 mg/mL a cerca de 200 mg/mL e solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração de cerca de 1 mM a cerca de 10 mM, em que o pH e a osmolalidade da composição farmacêutica são adequados para admi- nistração subcutânea a um indivíduo, em que o agente dsRNA compre- ende um filamento de senso e um filamento de antissenso, o filamento de antissenso compreendendo uma região de complementaridade com um mRNA codificando Serpinc1 que compreende pelo menos 15 nucle- otídeos contíguos diferindo em não mais do que 3 nucleotídeos da se- quência de nucleotídeo de 5’ - UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG - 3' (SEQ ID NO: 15), em que substancialmente todos os nucleotídeos do filamento de senso e substancialmente todos os nucleotídeos do fila- mento de antissenso são nucleotídeos modificados, em que o filamento de senso é conjugado a um ligante ligado ao terminal 3’, e em que o agente dsRNA está em uma forma de sal.
[0095] Em uma modalidade, todos os nucleotídeos do filamento de senso e todos os nucleotídeos do filamento de antissenso são nucleotí- deos modificados.
[0096] Em uma modalidade, os nucleotídeos modificados são inde- pendentemente selecionados do grupo consistindo em um nucleotídeo modificado com 2'-desoxi-2’-flúor, um nucleotídeo modificado com 2'- desóxi, um nucleotídeo bloqueado, um nucleotídeo abásico, um nucle- otídeo modificado com 2'-amino, um nucleotídeo modificado com 2'-al- quila, um nucleotídeo morfolino, um fosforamidato e uma base não na- tural compreendendo nucleotídeo.
[0097] A região de complementaridade pode ter pelo menos 17 nu- cleotídeos de comprimento ou 19 nucleotídeos de comprimento.
[0098] Em uma modalidade, a região de complementaridade tem entre 19 e 21 nucleotídeos de comprimento. Em uma outra modalidade, a região de complementaridade tem entre 21 e 23 nucleotídeos de com- primento.
[0099] Em uma modalidade, cada filamento não tem mais do que 30 nucleotídeos de comprimento.
[0100] Pelo menos um filamento do agente RNAi de filamento duplo pode compreender uma sobreposição 3’ de pelo menos 1 nucleotídeo ou uma sobreposição 3' de pelo menos 2 nucleotídeos, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 nucleotídeos. Em outras moda- lidades, pelo menos um filamento do agente RNAi compreende uma so- breposição 5’ de pelo menos 1 nucleotídeo. Em certas modalidades, pelo menos um filamento compreendendo uma sobreposição 5’ de pelo menos 2 nucleotídeos, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 nucleotídeos. Em ainda outras modalidades, ambas as extremi- dades 3’ e 5’ de um filamento do agente RNAi compreendem uma so- breposição de pelo menos 1 nucleotídeo.
[0101] Em certas modalidades, o ligante é uma N-acetilgalactosa- mina (GalNAc). O ligante pode ser um ou mais GalNAc ligados ao agente RNAi através de um ligante monovalente, bivalente ou trivalente ramificado. O ligante pode ser conjugado à extremidade 3’ do filamento de senso do agente RNAi de filamento duplo, à extremidade 5’ do fila- mento de senso do agente RNAi de filamento duplo, à extremidade 3’ do filamento de antissenso do agente RNAi de filamento duplo ou à ex- tremidade 5’ do filamento de antissenso do agente RNAi de filamento duplo.
[0102] Em algumas modalidades, os agentes RNAi de filamento du- plo compreendem uma pluralidade, por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou 6, de Gal- NAc, cada um independentemente ligado a uma pluralidade de nucleo- tídeos do agente RNAi de filamento duplo através de uma pluralidade de ligantes monovalentes.
[0103] Em certas modalidades, o ligante é
HO OH O H H
HO O N N O AcHN
O HO OH O O H H
HO O N N O AcHN
O O O HO OH O
HO O N N O AcHN H H O .
[0104] Em uma modalidade, o agente RNAi é conjugado ao ligante por meio de um elemento de ligação e o ligante e elemento de ligação são conjugados ao agente RNAi como mostrado no esquema que segue , em que X é O ou S.
[0105] Em uma modalidade, o X é O,
[0106] Em uma modalidade, a região de complementaridade con- siste na sequência de nucleotídeo de 5’-UUGAAGUAAAUGGU- GUUAACCAG-3’ (SEQ ID NO: 15).
[0107] Em uma modalidade, o agente RNAi de filamento duplo com- preende um filamento de senso compreendendo a sequência de nucle- otídeo de 5'-GGUUAACACCAUUUACUUCAA -3’ (SEQ ID NO: 16) e do filamento de antissenso compreendendo a sequência de nucleotídeo de 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3' (SEQ ID NO: 15).
[0108] Em uma modalidade, o filamento de senso compreende 5'- GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3’ (SEQ ID NO: 13) e o fila- mento de antissenso compreende 5'- usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuA- faCfcsasg - 3' (SEQ ID NO: 14), em que a, c, g e u são 2’-O-metila (2'- OMe) A, C, G ou U; Af, Cf, Gf ou Uf são 2’-flúor A, C, G ou U; e s é uma ligação fosforotioato.
[0109] Em uma modalidade, o filamento de senso compreende 5'- GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3’ (SEQ ID NO: 13) e o fila- mento de antissenso compreende 5'- usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuA- faCfcsasg (SEQ ID NO: 14), em que a, c, g, e u são 2’-O-metila (2'-OMe) A, C, G ou U; Af, Cf, Gf ou Uf são 2’-flúor A, C, G ou U; e s é uma ligação fosforotioato; e em o filamento de senso é conjugado ao ligante por meio de um ligante e o ligante e o elemento de ligação são conjugados ao agente RNAi como mostrado no esquema que segue , em que X é O ou S.
[0110] Em um aspecto, a presente invenção provê uma composição farmacêutica para inibição da expressão de um gene Serpinc1. A com- posição farmacêutica inclui um agente ácido ribonucleico de filamento duplo (dsRNA) a uma concentração de cerca de 50 mg/mL a cerca de 200 mg/mL e solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma con- centração de cerca de 1 mM a cerca de 10 mM, em que o pH e a osmo- lalidade da composição farmacêutica são adequados para administra- ção subcutânea a um indivíduo, em que o agente dsRNA tem um fila-
mento de senso consistindo na sequência de nucleotídeo de 5'- GfsgsU- fuAfaCfaCfCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3’ (SEQ ID NO: 941) e um fila- mento de antissenso consistindo da sequência de nucleotídeo de 5'- usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3’ (SEQ ID NO: 960), em que a, g, c e u são 2’-O-metila (2’-OMe) A, G, C e U ; Af, Gf, Cf e Uf são 2’-flúor A, G, C, U; e s é uma ligação fosforotioato, e em que um ligante é conjugado à extremidade 3’ do filamento de senso por meio de um elemento de ligação, e em que o ligante e o elemento de ligação têm a estrutura que segue:
HO OH O H H
HO O N N O AcHN HO
O HO OH O O N O H H H O N N O N
HO O AcHN O
O O O HO OH O HO O N N O
H H AcHN O , em que o agente dsRNA está em uma forma de ácido livre.
[0111] Em outro aspecto, a presente invenção provê uma composi- ção farmacêutica para inibição da expressão de um gene Serpinc1. A composição farmacêutica inclui um agente ácido ribonucleico de fila- mento duplo (dsRNA) a uma concentração de cerca de 50 mg/mL a cerca de 200 mg/mL e solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração de cerca de 1 mM a cerca de 10 mM, em que o pH e a osmolalidade da composição farmacêutica são adequados para admi- nistração subcutânea a um indivíduo, em que o agente dsRNA tem um filamento de senso consistindo na sequência de nucleotídeo de 5'- GfsgsUfuAfaCfaCfCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3’ (SEQ ID NO: 941) e um filamento de antissenso consistindo na sequência de nucleotídeo de 5'- usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3’ (SEQ ID NO: 960), em que a, g, c e u são 2’-O-metila (2’-OMe) A, G, C e U; Af, Gf, Cf e Uf são 2’-flúor A, G, C, U; e s é uma ligação fosforotioato, e em que um ligante é conjugado à extremidade 3’ do filamento de senso por meio de um elemento de ligação, e em que o ligante e o elemento de ligação têm a estrutura que segue:
HO OH O H H
HO O N N O AcHN HO
O HO OH O O N O H H H O N N O N
HO O AcHN O
O O O HO OH O HO O N N O
H H AcHN O , em que o agente dsRNA está em uma forma de sal.
[0112] Em um aspecto, a presente invenção provê uma composição farmacêutica para inibição da expressão de um gene Serpinc1. As com- posições incluem um agente ácido ribonucleico de filamento duplo (dsRNA) a uma concentração de cerca de 100 mg/mL e solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração de cerca de 5 mM, em que o pH da composição farmacêutica é cerca de 6,8 a cerca de 7,2, em que a osmolalidade da composição farmacêutica é cerca de 300 mOsm/kg, em que o agente dsRNA tem um filamento de senso consis- tindo na sequência de nucleotídeo de 5'- GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfu- AfcUfuCfaAf - 3’ (SEQ ID NO: 941) e um filamento antissenso consis- tindo na sequência de nucleotídeo de 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfu- AfaCfcsasg - 3’ (SEQ ID NO: 960), em que a, g, c e u são 2’-O-metila (2'-OMe) A, G, C e U; Af, Gf, Cf e Uf são 2’-flúor A, G, C, U; e s é uma ligação fosforotioato, e em que um ligante é conjugado à extremidade 3’ do filamento de senso por meio de um elemento de ligação, e em que o ligante e o elemento de ligação têm a estrutura que segue:
HO OH O H H
HO O N N O AcHN HO
O HO OH O O N O H H H O N N O N
HO O AcHN O
O O O HO OH O HO O N N O
H H AcHN O , em que o agente dsRNA está em uma forma de ácido livre.
[0113] Em outro aspecto, a presente invenção provê uma composi- ção farmacêutica para inibição da expressão de um gene Serpinc1. As composições farmacêuticas incluem um agente ácido ribonucleico de filamento duplo (dsRNA) a uma concentração de cerca de 106 mg/mL e solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração de cerca de 5 mM, em que o pH da composição farmacêutica é cerca de 6,8 a cerca de 7.2, em que a osmolalidade da composição farmacêutica é cerca de 300 mOsm/kg, em que o agente dsRNA tem um filamento de senso consistindo na sequência de nucleotídeo de 5'- GfsgsUfuA- faCfaCfCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf - 3’ (SEQ ID NO: 941) e um filamento de antissenso consistindo na sequência de nucleotídeo de 5'-usUfsgA- faGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg - 3’ (SEQ ID NO: 960), em que a, g, c e u são 2’-O-metila (2'-OMe) A, G, C e U; Af, Gf, Cf e Uf são 2’-flúor A, G, C, U; e s é uma ligação fosforotioato, e em que um ligante é conju- gado à extremidade 3’ do filamento de senso por meio de um elemento de ligação, e em que o ligante e o elemento de ligação têm a estrutura que segue:
HO OH O H H
HO O N N O AcHN HO
O HO OH O O N O H H H O N N O N
HO O AcHN O
O O O HO OH O HO O N N O
H H AcHN O , em que o agente dsRNA está em uma forma de sal.
[0114] As composições da presente invenção podem conter ainda outros componentes adjuvantes convencionalmente encontrados em composições farmacêuticas, em seus níveis de uso estabelecidos na técnica. Deste modo, por exemplo, as composições podem conter ma- teriais farmaceuticamente ativos adicionais, compatíveis, tais como, por exemplo, antipruriginosos, adstringentes, anestésicos locais ou agentes anti-inflamatórios, ou podem conter materiais adicionais úteis em formu- lação física de várias formas de dosagem das composições da presente invenção, tais como corantes, agentes aromatizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, agentes espessantes e estabilizantes. No entanto, tais materiais, quando adicionados, não devem interferir inde- vidamente com as atividades biológicas dos componentes das compo- sições da presente invenção. As formulações podem ser esterilizadas e, se desejado, misturadas com agentes auxiliares, por exemplo, lubri- ficantes, conservantes, estabilizantes, agentes umectantes, emulsifi- cantes, sais para influenciar a pressão osmótica, tampões, corantes, aromatizantes e/ou substâncias aromáticas e similar que não interagem prejudicialmente com o(s) ácido(s) nucleico(s) da formulação.
[0115] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas apresentadas na invenção incluem (a) um ou mais compostos de iRNA e (b) um ou mais agentes que funcionam através de um mecanismo não-RNAi e que são úteis no tratamento de um distúrbio hemolítico. Exemplos de tais agentes incluem, mas não estão limitados a, um agente anti-inflamatório, agente anti-esteatose, antiviral e/ou agente an- tifibrose. Ainda, outras substâncias comumente usadas para proteger o fígado, tal como silimarina, também podem ser usadas em conjunto com os iRNAs descritos aqui. Outros agentes úteis para tratamento de doen- ças hepáticas incluem telbivudina, entecavir e inibidores de protease tais como telaprevir e outros divulgados, por exemplo, em Tung e outros, Publicações de Pedido U.S. Nos. 2005/0148548, 2004/0167116 e 2003/0144217; e em Hale e outros, Publicação de Pedido U.S. No. 2004/0127488.
[0116] Toxicidade e eficácia terapêutica de tais compostos podem ser determinadas através de procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de células ou animais experimentais, por exemplo, para deter- minar a LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão de dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expressa como a razão LD50/ED50. Os compostos que exibem índices terapêu- ticos altos são preferidos. III. iRNAs para Uso nas Composições Farmacêuticas da Invenção
[0117] As composições da invenção incluem agentes RNAi que se direcionam a um gene Serpinc1 e inibem a expressão do gene Serpinc1 em uma célula, tal como uma célula dentro de um indivíduo, por exem- plo, um mamífero, tal como um humano com um distúrbio associado a Serpinc1, por exemplo, um distúrbio hemorrágico, por exemplo, hemo- filia.
[0118] Como usado aqui, "sequência-alvo" refere-se a uma porção contígua da sequência de nucleotídeo de uma molécula de mRNA for- mada durante a transcrição de um gene Serpinc1, incluindo mRNA que é um produto do processamento de RNA de um produto de transcrição primário. Em uma modalidade, a porção-alvo da sequência será pelo menos longa o suficiente para servir como um substrato para a clivagem dirigida por iRNA na ou perto daquela porção da sequência de nucleotí- deo de uma molécula de mRNA formada durante a transcrição de um gene Serpinc1.
[0119] A sequência-alvo pode ter de a partir de cerca de 9-36 nu- cleotídeos de comprimento, por exemplo, cerca de 15-30 nucleotídeos de comprimento. Por exemplo, a sequência-alvo pode ser de cerca de 15-30 nucleotídeos, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21 , 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 ou 21-22 nucleotídeos de com-
primento. Faixas e comprimentos intermediários às faixas e comprimen- tos mencionados acima também são compreendidos como parte da in- venção.
[0120] Como usado aqui, o termo "filamento compreendendo uma sequência" refere-se a um oligonucleotídeo compreendendo uma ca- deia de nucleotídeos que é descrita pela sequência referida usando a nomenclatura de nucleotídeos padrão.
[0121] “G”, “C”, “A”, “T” e “U” cada um geralmente representa um nucleotídeo que contém guanina, citosina, adenina, timidina e uracila como uma base, respectivamente. No entanto, será compreendido que o termo "ribonucleotídeo" ou "nucleotídeo" pode também se referir a um nucleotídeo modificado, conforme detalhado abaixo, ou uma porção de substituição substituta (vide, por exemplo, Tabela 1). O versado na téc- nica tem ciência que guanina, citosina, adenina e uracila podem ser substituídas por outras porções sem alterar substancialmente as propri- edades de emparelhamento de base de um oligonucleotídeo compreen- dendo um nucleotídeo carregando tal porção de substituição. Por exem- plo, sem limitação, um nucleotídeo compreendendo inosina como sua base pode emparelhar com nucleotídeos contendo adenina, citosina ou uracila. Portanto, nucleotídeos contendo uracila, guanina ou adenina podem ser substituídos nas sequências de nucleotídeo do dsRNA apre- sentado na invenção através de um nucleotídeo contendo, por exemplo, inosina. Em outro exemplo, adenina e citosina em qualquer lugar no oli- gonucleotídeo podem ser substituídas por guanina e uracila, respectiva- mente, para formar o emparelhamento de base G-U Wobble com o mRNA-alvo. As sequências contendo tais porções de substituição são adequadas para as composições e métodos apresentados na invenção.
[0122] Os termos "iRNA", "agente RNAi", "agente iRNA", "agente de interferência de RNA" como usados intercomutavelmente aqui referem- se a um agente que contém RNA de acordo com o termo definido aqui,
e que faz a mediação da clivagem direcionada de um transcrito de RNA por meio de uma via de complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). iRNA direciona a degradação específica de sequência de mRNA através de um processo conhecido como interferência de RNA (RNAi). O iRNA modula, por exemplo, inibe, a expressão de Serpinc1 em uma célula, por exemplo, uma célula dentro de um indivíduo, como um indivíduo mamífero.
[0123] Em uma modalidade, um agente RNAi da invenção inclui um RNA de filamento simples que interage com uma sequência de RNA alvo, por exemplo, uma sequência de mRNA alvo de Serpinc1, para di- recionar a clivagem do RNA-alvo. Sem desejar ser limitado pela teoria, acredita-se que o RNA de filamento duplo longa introduzido nas células seja dividido em siRNA por uma endonuclease Tipo III conhecida como Dicer (Sharp e outros (2001) Genes Dev. 15: 485). Dicer, uma enzima semelhante à ribonuclease III, processa o dsRNA em RNAs de interfe- rência curtos de 19-23 pares de bases com sobreposições característi- cas de duas bases 3’ (Bernstein e outros, (2001) Nature 409: 363). Os siRNAs são então incorporados a um complexo de silenciamento indu- zido por RNA (RISC), onde uma ou mais helicases desenrolam o dúplex de siRNA, permitindo que o filamento de antissenso complementar guie o reconhecimento do alvo (Nykanen e outros, (2001) Cell 107: 309). Quando da ligação ao mRNA-alvo apropriado, uma ou mais endonu- cleases dentro do RISC clivam o alvo para induzir silenciamento (Elbas- hir e outros, (2001) Genes Dev. 15: 188). Assim, em um aspecto, a in- venção refere-se a um RNA de filamento simples (siRNA) gerado dentro de uma célula e que promove a formação de um complexo RISC para realizar o silenciamento do gene-alvo, isto é, um gene Serpinc1. Conse- quentemente, o termo "siRNA" também é usado aqui para se referir a um RNAi como descrito acima.
[0124] Em uma outra modalidade, o agente RNAi pode ser um siRNA de filamento simples que é introduzido em uma célula ou orga- nismo para inibir um mRNA-alvo. Os agentes RNAi de filamento simples se ligam à endonuclease RISC, Argonaute 2, que então cliva o mRNA- alvo. Os siRNAs de filamento simples têm geralmente 15-30 nucleotí- deos e são quimicamente modificados. O projeto e o teste de siRNAs de filamento simples são descritos na Patente U.S. No. 8.101.348 e em Lima e outros (2012), Cell 150: 883-894, o conteúdo completo de cada um deles é aqui incorporado a título de referência. Qualquer uma das sequências de nucleotídeo de antissenso descritas aqui pode ser usada como um siRNA de filamento simples como descrito aqui ou quimica- mente modificado através dos métodos descritos em Lima e outros, (2012), Cell 150: 883-894.
[0125] Em uma outra modalidade, um "iRNA" para uso nas compo- sições, usos e métodos da invenção é um RNA de filamento duplo e é referido aqui como um "agente RNAi de filamento duplo", "molécula de RNA de filamento duplo (dsRNA)", “Agente dsRNA” ou “dsRNA”. O termo "dsRNA" refere-se a um complexo de moléculas de ácido ribonu- cleico tendo uma estrutura dúplex compreendendo dois filamentos de ácido nucleico antiparalelos e substancialmente complementares, refe- ridos como tendo orientações de "senso" e "antissenso" em relação a um RNA-alvo, isto é, um gene Serpinc1. Em algumas modalidades da invenção, um RNA de filamento duplo (dsRNA) desencadeia a degrada- ção de um RNA alvo, por exemplo, um mRNA, através de um meca- nismo de silenciamento de gene pós-transcripcional referido aqui como interferência de RNA ou RNAi.
[0126] Em geral, a maioria dos nucleotídeos de cada filamento de uma molécula de dsRNA são ribonucleotídeos, mas como descrito em detalhes aqui, cada um ou ambos filamentos também podem incluir um ou mais não ribonucleotídeos, por exemplo, um desoxirribonucleotídeo e/ou um nucleotídeo modificado. Ainda, como usado no presente rela- tório, um “agente RNAi” pode incluir ribonucleotídeos com modificações químicas; um agente RNAi pode incluir modificações substanciais em múltiplos nucleotídeos.
[0127] Como usado aqui, o termo "nucleotídeo modificado" refere- se a um nucleotídeo tendo, independentemente, uma porção açúcar modificada, uma ligação internucleotídeo modificada e/ou uma nucleo- base modificada. Assim, o termo nucleotídeo modificado compreende substituições, adições ou remoção de, por exemplo, um grupo funcional ou átomo, para ligações internucleotídeo, porções açúcar ou nucleoba- ses. As modificações adequadas para uso nos agentes da invenção in- cluem todos os tipos de modificações divulgadas aqui ou conhecidas na técnica. Quaisquer modificações do tipo, como usado em uma molécula do tipo siRNA, são compreendidas por "agente RNAi" para os propósitos do presente relatório e reivindicações.
[0128] A região dúplex pode ser de qualquer comprimento que per- mita degradação específica de um RNA-alvo desejado através de uma via RISC e pode variar de a partir de cerca de 9 a 36 pares de bases de comprimento, por exemplo, cerca de 15-30 pares de bases de compri- mento, por exemplo, cerca de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 pares de bases de comprimento, tal como cerca de 15-30, 15-29, 15-28, 15- 27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15- 17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18- 23, 18-22, 18- 21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19- 22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20- 23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21- 23 ou 21-22 pares de bases de comprimento. Faixas e comprimentos intermediários às faixas e comprimentos mencionados acima também são compreendidos como parte da invenção.
[0129] Os dois filamentos formando a estrutura dúplex podem ser porções diferentes de uma molécula de RNA maior ou eles podem ser moléculas de RNA separadas. Onde os dois filamentos são parte de uma molécula maior e, portanto, estão conectados por uma cadeia inin- terrupta de nucleotídeos entre a extremidade 3’ de um filamento e a ex- tremidade 5’ do respectivo outro filamento formando a estrutura dúplex, a cadeia de RNA de conexão é referida como um "laço grampo-de-ca- belo". Uma alça grampo-de-cabelo pode compreender pelo menos um nucleotídeo não emparelhado. Em algumas modalidades, o loop em gancho pode compreender pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos pelo menos 23 ou mais nucleotídeos não emparelhados.
[0130] Quando os dois filamentos substancialmente complementa- res de um dsRNA são compreendidos por moléculas de RNA separa- das, essas moléculas não precisam, mas podem ser, conectadas cova- lentemente. Onde os dois filamentos são conectados covalentemente por outros meios que não uma cadeia ininterrupta de nucleotídeos entre a extremidade 3’ de um filamento e a extremidade 5’ do respectivo outro filamento formando a estrutura dúplex, a estrutura de conexão é referida como um “elemento de ligação”. Os filamentos de RNA podem ter o mesmo ou um número diferente de nucleotídeos. O número máximo de pares de bases é o número de nucleotídeos no filamento mais curto do dsRNA menos quaisquer sobreposições que estão presentes no dúplex. Em adição à estrutura dúplex, um RNAi pode compreender uma ou mais sobreposições de nucleotídeos.
[0131] Em uma modalidade, um agente RNAi da invenção é um dsRNA de 24-30 nucleotídeos que interage com uma sequência de RNA-alvo, por exemplo, uma sequência de mRNA alvo de Serpinc1, para direcionar a clivagem do RNA alvo. Sem desejar estar limitado pela teoria, o RNA de filamento duplo longa introduzido em células é dividido em siRNA por uma endonuclease Tipo III conhecida como Dicer (Sharp e outros (2001) Genes Dev. 15: 485). Dicer, uma enzima tipo ribonu- clease III, processa o dsRNA em RNAs de interferência curtos de 19-23 pares de bases com sobreposições 3’ características de duas bases (Bernstein e outros, (2001) Nature 409: 363). Os siRNAs são então in- corporados a um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), onde uma ou mais helicases desenrolam o dúplex de siRNA, permitindo que o filamento de antissenso complementar guie o reconhecimento do alvo (Nykanen e outros, (2001) Cell 107: 309). Quando da ligação ao mRNA-alvo apropriado, uma ou mais endonucleases dentro do RISC clivam o alvo para induzir silenciamento (Elbashir e outros, (2001) Ge- nes Dev. 15:188).
[0132] Como usado aqui, o termo "sobreposição de nucleotídeo" re- fere-se a pelo menos um nucleotídeo não emparelhado que se projeta a partir da estrutura dúplex de um iRNA, por exemplo, um dsRNA. Por exemplo, quando uma extremidade 3’ de um filamento de um dsRNA se estende além da extremidade 5’ do outro filamento, ou vice-versa, há uma sobreposição de nucleotídeo. Um dsRNA pode compreender uma sobreposição de pelo menos um nucleotídeo; alternativamente, a sobre- posição pode compreender pelo menos dois nucleotídeos, pelo menos três nucleotídeos, pelo menos quatro nucleotídeos, pelo menos cinco nucleotídeos ou mais. Uma sobreposição de nucleotídeo pode compre- ender ou consistir em um análogo de nucleotídeo/nucleosídeo, incluindo um desoxinucleotídeo/nucleosídeo. A(s) sobreposição(ões) pode(m) es- tar no filamento de senso, no filamento de antissenso ou em qualquer combinação dos mesmos. Além disso, o(s) nucleotídeo(s) de uma so- breposição podem estar presentes na extremidade 5’, extremidade 3' ou em ambas as extremidades de um filamento de antissenso ou senso de um dsRNA.
[0133] Em uma modalidade, o filamento de antissenso de um dsRNA tem uma sobreposição de 1-10 nucleotídeos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos, na extremidade 3’ e/ou na extremi- dade 5’. Em uma modalidade, o filamento de senso de um dsRNA tem uma sobreposição de 1-10 nucleotídeos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 sobreposições, na extremidade 3’ e/ou na extremidade 5’. Em uma outra modalidade, um ou mais dos nucleotídeos na sobreposição são substituídos por um tiofosfato de nucleosídeo.
[0134] Em certas modalidades, a sobreposição no filamento de senso ou antissenso, ou ambas, pode incluir comprimentos estendidos de mais de 10 nucleotídeos, por exemplo, 10-30 nucleotídeos, 10-25 nucleotídeos, 10-20 nucleotídeos ou 10-15 nucleotídeos de compri- mento. Em certas modalidades, uma sobreposição estendida está no filamento de senso do dúplex. Em certas modalidades, uma sobreposi- ção estendida está presente na extremidade 3’ do filamento de senso do dúplex. Em certas modalidades, uma sobreposição estendida está presente na extremidade 5’ do filamento de senso do dúplex. Em certas modalidades, uma sobreposição estendida está no filamento de antis- senso do dúplex. Em certas modalidades, uma sobreposição estendida está presente na extremidade 3’ do filamento de antissenso do dúplex. Em certas modalidades, uma sobreposição estendida está presente na extremidade 5’ do filamento de antissenso do dúplex. Em certas moda- lidades, um ou mais dos nucleotídeos na sobreposição estendida são substituídos por um tiofosfato de nucleosídeo.
[0135] "Cego" ou "extremidade cega" significa que não há nucleotí- deos não emparelhados nessa extremidade do agente RNAi de fila- mento duplo, isto é, nenhuma sobreposição de nucleotídeo. Um agente RNAi de "extremidade cega" é um dsRNA que é de filamento duplo em todo seu comprimento, isto é, sem sobreposições de nucleotídeo em nenhuma extremidade da molécula. Os agentes RNAi da invenção in- cluem agentes RNAi com sobreposições de nucleotídeo em uma extre- midade (isto é, agentes com uma sobreposição e uma extremidade cega) ou com sobreposições de nucleotídeo em ambas as extremida- des.
[0136] O termo "filamento de antissenso" ou "filamento-guia" refere- se ao filamento de um iRNA, por exemplo, um dsRNA, que inclui uma região que é substancialmente complementar a uma sequência-alvo, por exemplo, um mRNA de Serpinc1. Como usado aqui, o termo "região de complementaridade" refere-se à região no filamento de antissenso que é substancialmente complementar a uma sequência, por exemplo, uma sequência-alvo, por exemplo, uma sequência de nucleotídeo Ser- pinc1, como definido aqui. Onde a região de complementaridade não é totalmente complementar à sequência-alvo, as incompatibilidades po- dem estar nas regiões internas ou terminais da molécula. Em geral, as incompatibilidades mais toleradas estão nas regiões terminais, por exemplo, dentro de 5, 4, 3 ou 2 nucleotídeos do terminal 5’ e/ou 3' do iRNA.
[0137] O termo "filamento de senso" ou "filamento passageiro" como usado aqui refere-se ao filamento de um iRNA que inclui uma re- gião que é substancialmente complementar a uma região do filamento de antissenso de acordo com o termo aqui definido.
[0138] Como usado aqui, o termo "região de clivagem" refere-se a uma região que está localizada imediatamente adjacente ao sítio de cli- vagem. O sítio de clivagem é o sítio no alvo em que ocorre clivagem. Em algumas modalidades, a região de clivagem compreende três bases em qualquer extremidade do, e imediatamente adjacente ao, sítio de clivagem. Em algumas modalidades, a região de clivagem compreende duas bases em qualquer extremidade do, e imediatamente adjacente ao, sítio de clivagem. Em algumas modalidades, o sítio de clivagem ocorre especificamente no sítio ligado pelos nucleotídeos 10 e 11 do filamento de antissenso e a região de clivagem compreende os nucleo- tídeos 11, 12 e 13.
[0139] Como usado aqui, e a menos que de outro modo indicado, o termo "complementar", quando usado para descrever uma primeira se- quência de nucleotídeo em relação a uma segunda sequência de nucle- otídeo, refere-se à habilidade de um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo compreendendo a primeira sequência de nucleotídeo em hibridizar e formar um estrutura dúplex sob certas condições com um oligonucleotí- deo ou polinucleotídeo compreendendo a segunda sequência de nucle- otídeo, como será compreendido pelo versado. Tais condições podem ser, por exemplo, condições rigorosas, onde condições rigorosas po- dem incluir: NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6,4, EDTA 1 mM, 50 oC ou 70 oC por 12-16 horas seguido por lavagem (vide, por exemplo, "Mole- cular cloning: A Laboratory Manual”, Sambrook e outros (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Outras condições, tais como condi- ções fisiologicamente relevantes que podem ser encontradas dentro de um organismo, podem ser aplicadas. O versado será capaz de determi- nar o conjunto de condições mais apropriadas para um teste de com- plementaridade de duas sequências de acordo com a aplicação final dos nucleotídeos hibridizados.
[0140] Sequências complementares dentro de um iRNA, por exem- plo, dentro de um dsRNA como descrito aqui, incluem emparelhamento de bases do oligonucleotídeo ou polinucleotídeo compreendendo uma primeira sequência de nucleotídeo com um oligonucleotídeo ou polinu- cleotídeo compreendendo uma segunda sequência de nucleotídeo em todo o comprimento de uma ou ambas sequências de nucleotídeos. Tais sequências podem ser referidas como "totalmente complementares" umas em relação às outras aqui. No entanto, onde uma primeira se- quência é referida como "substancialmente complementar" em relação a uma segunda sequência aqui, as duas sequências podem ser total- mente complementares ou podem formar um ou mais, mas geralmente não mais do que 5, 4, 3 ou 2, pares de bases incompatíveis quando da hibridização para um dúplex de até 30 pares de bases, enquanto man- tendo a habilidade de hibridizar sob as condições mais relevantes para sua aplicação final, por exemplo, inibição da expressão gênica por meio de uma via RISC. No entanto, onde dois oligonucleotídeos são projeta- dos para formar, quando da hibridização, uma ou mais sobreposições de filamento simples, tais sobreposições não devem ser consideradas como incompatibilidades no que diz respeito à determinação de com- plementaridade. Por exemplo, um dsRNA compreendendo um oligonu- cleotídeo de 21 nucleotídeos de comprimento e um outro oligonucleotí- deo de 23 nucleotídeos de comprimento, em que o oligonucleotídeo mais longo compreende uma sequência de 21 nucleotídeos que é total- mente complementar ao oligonucleotídeo mais curto, pode ainda ser re- ferido como "totalmente complementar" para os propósitos descritos aqui.
[0141] Sequências "complementares", como aqui usado, também podem incluir, ou ser formadas inteiramente a partir de, pares de bases não Watson-Crick e/ou pares de bases formados a partir de nucleotí- deos não naturais e modificados, na medida em que as exigências acima em relação à sua capacidade de hibridizar é cumprida. Esses pa- res de bases não Watson-Crick incluem, mas não estão limitados a, em- parelhamento de bases G:U Wobble ou Hoogstein.
[0142] Os termos "complementar", "totalmente complementar" e "substancialmente complementar" aqui podem ser usados com relação à correspondência de base entre o filamento de senso e o filamento de antissenso de um dsRNA, ou entre o filamento de antissenso de um agente iRNA e uma sequência-alvo, como será compreendido a partir do contexto de seu uso.
[0143] Como usado aqui, um polinucleotídeo que é "substancial- mente complementar a pelo menos parte de" um RNA mensageiro (mRNA) refere-se a um polinucleotídeo que é substancialmente com- plementar a uma porção contígua do mRNA de interesse (por exemplo, um mRNA codificando Serpinc1). Por exemplo, um polinucleotídeo é complementar a pelo menos uma parte de um mRNA de Serpinc1 se a sequência for substancialmente complementar a uma porção não inter- rompida de um mRNA codificando Serpinc1.
[0144] Deste modo, em algumas modalidades, os polinucleotídeos de filamento de antissenso divulgados aqui são totalmente complemen- tares à sequência-alvo de Serpinc1. Em outras modalidades, os polinu- cleotídeos de filamento de antissenso divulgados aqui são substancial- mente complementares à sequência-alvo de Serpinc1 e compreendem uma sequência de nucleotídeo contígua que é pelo menos cerca de 80% complementar em seu comprimento para a região equivalente da se- quência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1, ou um fragmento de SEQ ID NO: 1, tal como cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99% complementar.
[0145] Em uma modalidade, um agente RNAi da invenção inclui um filamento de senso que é substancialmente complementar a um polinu- cleotídeo de antissenso que, por sua vez, é complementar a uma se- quência Serpinc1 alvo, e em que o polinucleotídeo do filamento de senso compreende uma sequência de nucleotídeo contígua que é pelo menos cerca de 80% complementar ao longo de todo o seu compri- mento para a região equivalente da sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 5, ou um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NO: 5, tal como cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99% complementar.
[0146] Os agentes dsRNA adequados capazes de inibir a expres- são de um gene-alvo (isto é, um gene Serpinc1) in vivo incluem modifi- cações químicas. Em certos aspectos da invenção, substancialmente todos os nucleotídeos de um iRNA da invenção são modificados. Em outras modalidades da invenção, todos os nucleotídeos de um iRNA da invenção são modificados. Os iRNAs da invenção em que "substancial- mente todos os nucleotídeos são modificados" são amplamente, mas não totalmente, modificados e podem incluir não mais do que 5, 4, 3, 2 ou 1 nucleotídeos não modificados.
[0147] Os agentes iRNA para uso nos métodos da invenção geral- mente incluem um filamento de RNA (o filamento de antissenso) tendo uma região que tem cerca de 30 nucleotídeos ou menos de compri- mento, por exemplo, 15-30, 15-29, 15-28, 15- 27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19- 27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 ou 21-22 nucleotídeos de comprimento, cuja região é substancialmente complementar a pelo menos parte de um transcrito de mRNA de um gene Serpinc1.
[0148] Em outras modalidades, um ou ambos filamentos dos agen- tes RNAi de filamento duplo da invenção têm até 66 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, 36-66, 26-36, 25-36, 31-60, 22-43, 27-53 nucleotídeos de comprimento, com uma região de pelo menos 19 nu- cleotídeos contíguos que é substancialmente complementar a pelo me- nos uma parte de um transcrito de mRNA de um gene Serpinc1. Em algumas modalidades, os filamentos de senso e antissenso formam um dúplex de 18-30 nucleotídeos contíguos.
[0149] Em algumas modalidades, os agentes iRNA para uso nos métodos da invenção incluem um filamento de RNA (o filamento de an- tissenso) que pode ter até 66 nucleotídeos de comprimento, por exem- plo, 36-66, 26-36, 25-36, 31-60, 22-43, 27-53 nucleotídeos de compri- mento, com uma região de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos que é substancialmente complementar a pelo menos uma parte de um trans- crito de mRNA de um gene Serpinc1. Em algumas modalidades, tais agentes de iRNA tendo filamentos de antissenso de comprimento mais longo podem incluir um segundo filamento de RNA (o filamento de senso) de 20-60 nucleotídeos de comprimento em que os filamentos de senso e antissenso formam um dúplex de 18-30 nucleotídeos contíguos.
[0150] O agente RNAi compreende um filamento de senso e um fi- lamento de antissenso. Cada filamento do agente RNAi pode variar de 12-30 nucleotídeos de comprimento. Por exemplo, cada filamento pode ter entre 14-30 nucleotídeos de comprimento, 17-30 nucleotídeos de comprimento, 19-30 nucleotídeos de comprimento, 25-30 nucleotídeos de comprimento, 27-30 nucleotídeos de comprimento, 17-23 nucleotí- deos de comprimento, 17-21 nucleotídeos de comprimento, 17-19 nu- cleotídeos de comprimento, 19-25 nucleotídeos de comprimento, 19-23 nucleotídeos de comprimento, 19-21 nucleotídeos de comprimento, 21- 25 nucleotídeos de comprimento ou 21-23 nucleotídeos de compri- mento.
[0151] O filamento de senso e o filamento de antissenso normal- mente formam um RNA de filamento duplo dúplex ("dsRNA"), também referido aqui como um "agente RNAi". A região dúplex de um agente RNAi pode ter 12-30 pares de nucleotídeos de comprimento. Por exem- plo, a região dúplex pode ter entre 14-30 pares de nucleotídeos de com- primento, 17-30 pares de nucleotídeos de comprimento, 27-30 pares de nucleotídeos de comprimento, 17-23 pares de nucleotídeos de compri- mento, 17-21 pares de nucleotídeos de comprimento, 17-19 pares de nucleotídeos de comprimento, 19-25 pares de nucleotídeos de compri- mento, 19-23 pares de nucleotídeos de comprimento, 19-21 pares de nucleotídeos de comprimento, 21-25 pares de nucleotídeos de compri- mento ou 21-23 pares de nucleotídeos de comprimento. Em um outro exemplo, a região dúplex é selecionada de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 e 27 nucleotídeos de comprimento.
[0152] Em uma modalidade, o agente RNAi pode conter uma ou mais regiões de sobreposição e/ou grupos de capeamento na extremi- dade 3’, extremidade 5’ ou ambas as extremidades de um ou ambos filamentos. A sobreposição pode ter 1-6 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, 2-6 nucleotídeos de comprimento, 1-5 nucleotídeos de comprimento, 2-5 nucleotídeos de comprimento, 1-4 nucleotídeos de comprimento, 2-4 nucleotídeos de comprimento, 1-3 nucleotídeos de comprimento, 2-3 nucleotídeos de comprimento ou 1-2 nucleotídeos de comprimento. As sobreposições podem ser o resultado de um filamento ser mais longo do que o outro, ou o resultado de dois filamentos do mesmo comprimento serem escalonados. A sobreposição pode formar uma incompatibilidade com o mRNA-alvo ou pode ser complementar às sequências gênicas sendo direcionadas ou pode ser uma outra sequên- cia. Os primeiro e segundo filamentos também podem ser unidos, por exemplo, por bases adicionais para formar um grampo-de-cabelo ou por outros ligantes não básicos.
[0153] Em uma modalidade, os nucleotídeos na região de sobrepo- sição do agente RNAi podem ser, cada um, independentemente um nu- cleotídeo modificado ou não modificado incluindo, mas não se limitando a, modificado com 2'-açúcar, tal como, 2-F, 2’-O-metila, timidina (T), 2`- O-metoxietil-5-metiluridina (Teo), 2`-O-metoxietiladenosina (Aeo), 2`-O- metoxietil-5-metilcitidina (m5Ceo) e quaisquer combinações dos mes- mos. Por exemplo, TT pode ser uma sequência de sobreposição para qualquer uma das extremidades de qualquer filamento. A sobreposição pode formar uma incompatibilidade com o mRNA-alvo ou pode ser com- plementar às sequências gênicas sendo direcionadas ou pode ser outra sequência.
[0154] As sobreposições 5’ ou 3' no filamento de senso, filamento de antissenso ou ambos filamentos do agente RNAi podem ser fosfori- ladas. Em algumas modalidades, a(s) região(ões) de sobreposição con- tém dois nucleotídeos tendo um fosforotioato entre os dois nucleotídeos, onde os dois nucleotídeos podem ser iguais ou diferentes. Em uma mo- dalidade, a sobreposição está presente na extremidade 3’ do filamento de senso, do filamento de antissenso ou ambos filamentos. Em uma modalidade, esta sobreposição 3’ está presente no filamento de antis- senso. Em uma modalidade, esta sobreposição 3’ está presente no fila- mento de senso.
[0155] O agente RNAi pode conter apenas uma única sobreposição, que pode fortalecer a atividade de interferência do RNAi, sem afetar sua estabilidade geral. Por exemplo, a sobreposição de filamento simples pode estar localizada na extremidade 3'-terminal do filamento de senso ou, alternativamente, na extremidade 3'-terminal do filamento de antis- senso. O RNAi também pode ter uma extremidade cega, localizada na extremidade 5’ do filamento de antissenso (ou na extremidade 3' do fi- lamento de senso) ou vice-versa. Em geral, o filamento de antissenso do RNAi tem uma sobreposição de nucleotídeo na extremidade 3’ e a extremidade 5’ é cega. Não desejando ser limitado pela teoria, a extre- midade cega assimétrica na extremidade 5’ do filamento de antissenso e a sobreposição da extremidade 3' do filamento de antissenso favore- cem o carregamento do filamento-guia no processo RISC.
[0156] Qualquer um dos ácidos nucleicos apresentados na inven- ção pode ser sintetizado e/ou modificado através de métodos bem es- tabelecidos na técnica, tais como aqueles descritos em "Current proto-
cols in nucleic acid chemistry", Beaucage, S.L. e outros (Eds.), John Wi- ley & Sons, Inc., New York, NY, USA, que é aqui incorporado a título de referência. As modificações incluem, por exemplo, modificações de ex- tremidade, por exemplo, modificações da extremidade 5’ (fosforilação, conjugação, ligações invertidas) ou modificações da extremidade 3' (conjugação, nucleotídeos de DNA, ligações invertidas, etc.); modifica- ções de bases, por exemplo, substituição com bases estabilizadoras, bases desestabilizadoras ou bases que emparelham com um repertório expandido de parceiros, remoção de bases (nucleotídeos abásicos) ou bases conjugadas; modificações de açúcar (por exemplo, na posição 2’ou posição 4') ou substituição do açúcar; e/ou modificações da estru- tura principal, incluindo modificação ou substituição das ligações fosfo- diéster. Exemplos específicos de compostos de iRNA úteis nas modali- dades aqui descritas incluem, mas não estão limitados a, RNAs con- tendo estruturas principais modificadas ou sem ligações internucleosí- deo naturais. Os RNAs com estruturas principais modificadas incluem, entre outros, aqueles que não possuem um átomo de fósforo na estru- tura principal. Para os propósitos do presente pedido, e como às vezes referido na técnica, RNAs modificados que não têm um átomo de fósforo em sua estrutura internucleotídeo também podem ser considerados oli- gonucleosídeos. Em algumas modalidades, um iRNA modificado terá um átomo de fósforo em sua estrutura principal internucleosídeo.
[0157] Estruturas principais de RNA modificado incluem, por exem- plo, fosforotioatos, fosforotioatos quirais, fosforoditioatos, fosfotriéste- res, aminoalquilfosforotriésteres, metila e outros fosfonatos de alquila, incluindo fosfonatos de 3’-alquileno e fosfonatos quirais, fosfinatos, fos- foramidatos incluindo 3-amino fosforamidato e aminoalquilfosforamida- tos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres e boranofosfatos tendo ligações normais 3'-5’, análogos ligados 2'-5'
desses e aqueles tendo polaridade invertida em que os pares adjacen- tes de unidades de nucleosídeo estão ligados 3'-5’ a 5'-3’ ou 2'-5’ a 5'- 2'. Vários sais, sais mistos e formas de ácido livre também estão incluí- dos.
[0158] Patentes U.S. representativas que ensinam a preparação das ligações contendo fósforo acima incluem, mas não estão limitadas a, Patentes U.S. Nos. 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243;
5.177.195; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717;
5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677;
5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.316; 5.550.111; 5.563.253;
5.571.799; 5.587.361; 5.625.050; 6.028.188; 6.124.445; 6.160.109;
6.169.170; 6.172.209; 6.239.265; 6.277.603; 6.326.199; 6.346.614;
6.444.423; 6.531.590; 6.534.639; 6.608.035; 6.683.167; 6.858.715;
6.867.294; 6.878.805; 7.015.315; 7.041.816; 7.273.933; 7.321.029; e Patente US RE39464, os conteúdos de cada um são aqui incorporados a título de referência.
[0159] As estruturas principais de RNA modificado que não incluem um átomo de fósforo nela têm estruturas principais que são formadas por ligações internucleosídeos de alquila ou cicloalquila de cadeia curta, heteroátomos mistos e ligações internucleosídeos de alquila ou cicloal- quila ou uma ou mais ligações internucleosídeos de heteroatômicas ou heterocíclicas de cadeia curta. Essas incluem aquelas tendo ligações morfolino (formadas em parte a partir da porção açúcar de um nucleo- sídeo); estruturas principais de siloxana; estruturas principais de sulfeto, sulfóxido e sulfona; estruturas principais de formacetila e tioformacetila; estruturas principais de metileno formacetila e tioformacetila; estruturas principais contendo alceno; estruturas principais de sulfamato; estrutu- ras principais de metilenoimino e metilenoidrazino; estruturas principais de sulfonato e sulfonamida; estruturas principais de amida; e outros tendo partes componentes N, O, S e CH2 misturadas.
[0160] As Patentes U.S. representativas que ensinam a preparação dos oligonucleosídeos acima incluem, mas não estão limitadas a, Pa- tentes U.S. Nos. 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134;
5.216.141; 5.235.033; 5.64.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257;
5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086;
5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312;
5.633.360; 5.677.437; e 5.677.439, os conteúdos de cada uma são aqui incorporados a título de referência.
[0161] Em outras modalidades, miméticos de RNA adequados são compreendidos para uso em iRNAs, em que ambos o açúcar e a ligação internucleosídeo, isto é, a estrutura principal, das unidades de nucleotí- deos são substituídos por grupos novos. As unidades de base são man- tidas para hibridização com um composto alvo de ácido nucleico apro- priado. Um composto oligomérico do tipo, um mimético de RNA que foi mostrado ter excelentes propriedades de hibridização, é referido como um ácido nucleico peptídico (PNA). Em compostos PNA, a estrutura principal de açúcar de um RNA é substituída por uma estrutura principal contendo amida, em particular uma estrutura principal de aminoetilgli- cina. As nucleobases são retidas e são ligadas diretamente ou indireta- mente aos átomos de nitrogênio aza da porção amida da estrutura prin- cipal. As Patentes U.S. representativas que ensinam a preparação de compostos PNA incluem, mas não estão limitadas a, Patentes U.S. Nos.
5.539.082; 5.714.331; e 5.719.262, os conteúdos de cada uma são aqui incorporados a título de referência. Compostos PNA adicionais adequa- dos para uso nos iRNAs da invenção são descritos em, por exemplo, Nielsen e outros, Science, 1991, 254, 1497-1500.
[0162] Algumas modalidades apresentadas na invenção incluem RNAs com estruturas principais de fosforotioato e oligonucleosídeos com estruturas principais de heteroátomo e, em particular --CH2-NH- CH2-, --CH2--N(CH3)-- CH2 - [conhecido como uma estrutura principal de metileno (metilimino) ou MMI], --CH2--O-N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)- -N(CH3)--CH2-- e --N(CH3)-- CH2--CH2-- [em que a estrutura principal fosfodiéster nativa é representada como --O--P--O--CH2--] da Patente US No. 5.489.677 referida acima, e as estruturas principais de amida da Patente US No. 5.602.240 mencionada acima. Em algumas modalida- des, os RNAs apresentados aqui têm estruturas principais de morfolino da Patente U.S. No. 5.034.506 acima referida.
[0163] Os RNAs modificados também podem conter uma ou mais porções açúcar substituídas. Os iRNAs, por exemplo, dsRNAs, apre- sentados aqui podem incluir um dos que seguem na posição 2': OH; F; O-, S- ou N-alquila; O-, S- ou N-alquenila; O-, S- ou N-alquinila; ou O- alquil-O-alquila, em que as alquila, alquenila e alquinila podem ser C1 a C10 alquila substituídas ou não substituídas ou C2 a C10 alquenila e al- quinila. Modificações adequadas exemplares incluem O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2).nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 e O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, onde n e m são de a partir de 1 a cerca de 10. Em outras modalidades, os dsRNAs incluem um dos seguintes na posi- ção 2': C1 a C10 alquila inferior, alquila, alcarila, aralquila, O-alcarila ou O-aralquila, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquila, heterocicloalcarila, aminoalqui- lamino, polialquilamino, silila substituída, um grupo de clivagem de RNA, um grupo repórter, um intercalador, um grupo para melhorar as proprie- dades farmacocinéticas de um iRNA ou um grupo para melhoramento das propriedades farmacodinâmicas de um iRNA e outros substituintes tendo propriedades similares. Em algumas modalidades, a modificação inclui um 2'-metoxietoxi (2'-O--CH2CH2OCH3, também conhecido como 2'-O-(2-metoxietila) ou 2'-MOE) (Martin e outros, Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504), isto é, um grupo alcóxi-alcóxi. Uma outra modificação exemplar é 2'-dimetilaminooxietóxi, isto é, um grupo O(CH2)2ON(CH3)2, também conhecido como 2'-DMAOE, conforme descrito nos exemplos abaixo, e 2'-dimetilaminoetoxietóxi (também conhecido na técnica como 2'-O-dimetilaminoetoxietila ou 2'-DMAEOE), isto é, 2'-O--CH2--O--CH2-- N(CH2)2.
[0164] Outras modificações incluem 2'-metóxi (2'-OCH3), 2'-amino- propóxi (2'-OCH2CH2CH2NH2) e 2’-flúor (2'-F). Modificações semelhan- tes também podem ser feitas em outras posições no RNA de um iRNA, particularmente na posição 3’ do açúcar no nucleotídeo 3' terminal ou em dsRNAs 2'-5’ ligados e na posição 5’ do nucleotídeo 5’ terminal. Os iRNAs também podem ter miméticos de açúcar, tais como porções ci- clobutila no lugar do açúcar pentofuranosila. Patentes U.S. representa- tivas que ensinam a preparação de tais estruturas de açúcar modifica- das incluem, mas não estão limitadas a, Patentes U.S. Nos. 4.981.957;
5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786;
5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909;
5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; e
5.700.920, alguns dos quais são de propriedade comum com o presente pedido. Todo o conteúdo de cada um dos acima é aqui incorporado a título de referência.
[0165] Um iRNA também pode incluir modificações ou substituições de nucleobase (muitas vezes referidas na técnica simplesmente como "base"). Como usado aqui, nucleobases "não modificadas" ou "naturais" incluem as bases de purina adenina (A) e guanina (G) e as bases piri- midina timina (T), citosina (C) e uracila (U). Nucleobases modificadas incluem outras nucleobases sintéticas e naturais tais como desoxi-ti- mina (dT), 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hi- poxantina, 2-aminoadenina, 6-metila e outros derivados alquila de ade- nina e guanina, 2-propila e outros derivados alquila de adenina e gua- nina, 2-tiouracila, 2-tiotimina e 2-tiocitosina, 5-halouracila e citosina, 5- propinil uracila e citosina, 6-azo uracila, citosina e timina, 5 -uracila
(pseudouracila), 4-tiouracila, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquila, 8-hidro- xila e outras adeninas e guaninas8-substituídas, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometila e outras uracilas e citosinas 5-substituídas, 7- metilguanina e 7-metiladenina, 8-azaguanina e 8-azaadenina, 7-desa- zaguanina e 7-daazaadenina e 3-desazaguanina e 3-desazaadenina. Nucleobases adicionais incluem aquelas divulgadas na Pat. No.
3.687.808, aquelas divulgadas em Modified Nucleosides in Biochemis- try, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008; aquelas divulgadas em The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990, aquelas divulgadas por Englisch e outros, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, e aquelas divulgadas por Sanghvi, Y. S., Capítulo 15, dsRNA Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, S.T. e Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993. Algumas destas nucleobases são particularmente úteis para aumentar a afini- dade de ligação dos compostos oligoméricos apresentados na inven- ção. Essas incluem pirimidinas 5-substituídas, 6-azapirimidinas e N-2, N-6 e 0-6 purinas substituídas, incluindo 2-aminopropiladenina, 5-propi- niluracila e 5-propinilcitosina. Substituições 5-metilcitosina foram mos- tradas aumentar a estabilidade do dúplex de ácido nucleico em 0,6-1,2 °C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. e Lebleu, B., Eds., DsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) e são substituições de base exemplares, ainda mais particularmente quando combinadas com modificações de açúcar 2'-O-metoxietila.
[0166] Patentes U.S. representativas que ensinam a preparação de algumas das nucleobases modificadas mencionadas acima, bem como outras nucleobases modificadas, incluem, mas não estão limitadas às, Patentes U.S. Nos. 3.687.808, 4.845.205; 5,130,30; 5.134.066;
5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908;
5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121, 5.596.091;
5.614.617; 5.681.941; 5.750.692; 6.015.886; 6.147.200; 6.166.197;
6.222.025; 6.235.887; 6.380.368; 6.528.640; 6.639.062; 6.617.438;
7.045.610; 7.427.672; e 7.495.088 mencionadas acima, os conteúdos de cada um são aqui incorporados a título de referência.
[0167] O RNA de um iRNA pode também ser modificado para incluir uma ou mais porções açúcar bicíclicas. Um “açúcar bicíclico” é um anel furanosila modificado pela ligação de dois átomos. Um "nucleosídeo bi- cíclico" ("BNA") é um nucleosídeo tendo uma fração açúcar compreen- dendo uma ponte conectando dois átomos de carbono do anel de açú- car, dessa maneira formando um sistema de anel bicíclico. Em certas modalidades, a ponte conecta o carbono 4 'e o carbono 2' do anel de açúcar. Assim, em algumas modalidades, um agente da invenção que pode incluir o RNA de um iRNA também pode ser modificado para incluir um ou mais ácidos nucleicos bloqueados (LNA). Um ácido nucleico blo- queado é um nucleotídeo tendo uma porção ribose modificada em que a porção ribose compreende uma ponte extra conectando os carbonos 2’e 4'. Em outras palavras, um LNA é um nucleotídeo compreendendo uma fração açúcar bicíclica compreendendo uma ponte 4'-CH2-O-2’. Essa estrutura "bloqueia" efetivamente a ribose na conformação estru- tural 3'-endo. A adição de ácidos nucleicos bloqueados a siRNAs foi mostrada aumentar a estabilidade do siRNA no soro e reduzir os efeitos fora do alvo (Elmen, J. e outros, (2005) Nucleic Acids Research 33 (1):439-447; Mook, O.R. e outros, (2007) Mol. Canc. Ther. 6(3):833-843; Grunweller, A. e outros, (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185- 3193).
[0168] Exemplos de nucleosídeos bicíclicos para uso nos polinucle- otídeos da invenção incluem, sem limitação, nucleosídeos compreen- dendo uma ponte entre os átomos do anel ribosila 4 'e 2'. Em certas modalidades, os agentes polinucleotídeo de antissenso da invenção in- cluem um ou mais nucleosídeos bicíclicos compreendendo uma ponte
4′ a 2’. Exemplos de tais nucleosídeos bicíclicos em ponte 4' a 2' in- cluem, mas não estão limitados a, 4 '- (CH2)—O-2' (LNA); 4′-(CH2)—S- 2’; 4'-(CH2)2—O-2'(ENA); 4′-CH(CH3)—O-2’ (também referido como "etila restrita" ou "cEt") e 4′-CH(CH2OCH3)—O-2’ (e seus análogos; vide, por exemplo, Patente US No. 7.399.845); 4'-C(CH3) (CH3)—O-2’(e seus análogos; vide, por exemplo, Patente US No. 8.278.283); 4'-CH2— N(OCH3)-2' (e seus análogos; vide, por exemplo, Patente US No.
8.278.425); 4′-CH2—O—N(CH3)-2’ (vide, por exemplo, Publicação de Patente U.S. No. 2004/0171570); 4′-CH2—N(R)—O-2’, em que R é H, C1-C12 alquila ou um grupo de proteção (vide, por exemplo, Patente U.S. No. 7.427.672); 4'-CH2—C(H)(CH3)-2' (vide, por exemplo, Chattopad- hyaya e outros, J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); e 4′-CH2—C(═CH2)- 2’ (e seus análogos; vide, por exemplo, Patente US No. 8.278.426). Os conteúdos de cada um dos acima são aqui incorporados a título de re- ferência.
[0169] Patentes U.S. e Publicações de Patentes US representativas adicionais que ensinam a preparação de nucleotídeos de ácido nucleico bloqueados incluem, mas não estão limitados ao, o que segue: Patentes U.S. Nos. 6.268.490; 6.525.191; 6.670.461; 6.770.748; 6.794.499;
6.998.484; 7.053.207; 7.034.133; 7.084.125; 7.399.845; 7.427.672;
7.569.686; 7.741.457; 8.022.193; 8.030.467; 8.278.425; 8.278.426;
8.278.283; US 2008/0039618; e US 2009/0012281, os conteúdos de cada um dos acima são aqui incorporados a título de referência..
[0170] Qualquer um dos nucleosídeos bicíclicos acima pode ser preparado tendo uma ou mais configurações estereoquímicas de açúcar incluindo, por exemplo, α-L-ribofuranose e β-D-ribofuranose (vide WO 99/14226).
[0171] O RNA de um iRNA também pode ser modificado para incluir um ou mais nucleotídeos de etila restritos. Como usado aqui, um "nu-
cleotídeo de etila restrito" ou "cEt" é um ácido nucleico bloqueado com- preendendo uma porção de açúcar bicíclica compreendendo uma ponte 4'-CH(CH3)-0-2’. Em uma modalidade, um nucleotídeo de etila restrito está na conformação S referida aqui como "S-cEt".
[0172] Um iRNA da invenção também pode incluir um ou mais "nu- cleotídeos conformacionalmente restritos" ("CRN"). CRN são análogos de nucleotídeos com um ligante conectando os carbonos C2' e C4' de ribose ou os carbonos C3 e -C5’ de ribose. O CRN trava o anel ribose em uma conformação estável e aumenta a afinidade de hibridização com mRNA. O elemento de ligação tem comprimento suficiente para pôr o oxigênio em uma posição ótima para estabilidade e afinidade resul- tando em menos enrugamento do anel de ribose.
[0173] Publicações representativas que ensinam a preparação de alguns dos CRN mencionados acima incluem, mas não estão limitadas a, Publicação de Patente US No. 2013/0190383; e publicação PCT WO 2013/036868, os conteúdos de cada uma são aqui incorporados a título de referência.
[0174] Um ou mais dos nucleotídeos de um iRNA da invenção tam- bém podem incluir um nucleotídeo substituído com hidroximetila. Um "nucleotídeo substituído com hidroximetila" é um 2'-3'-seco-nucleotídeo acíclico, também referido como uma modificação de "ácido nucleico desbloqueado" ("UNA").
[0175] Publicações U.S. representativas que ensinam a preparação de UNA incluem, mas não estão limitadas a, Patente US No. 8.314.227; e Publicação de Patente US No. 2013/0096289; 2013/0011922; e 2011/0313020, os conteúdos de cada uma são aqui incorporados a tí- tulo de referência.
[0176] Modificações potencialmente estabilizadoras para as extre- midades de moléculas de RNA podem incluir N-(acetilaminocaproil)-4- hidroxiprolinol (Hyp-C6-NHAc), N-(caproil-4-hidroxiprolinol (Hyp-C6), N-
(acetil-4-hidroxiprolinol (Hyp-NHAc), timidina-2'-0-desoxitimidina (éter), N-(aminocaproil)-4-hidroxiprolinol (Hyp-C6-amino), 2-docosanoil-uri- dina-3"-fosfato, base invertida dT ( idT) e outros. Descrição dessa mo- dificação pode ser encontrada na Publicação PCT No. WO 2011/005861.
[0177] Em certos aspectos da invenção, os agentes RNAi de fila- mento duplo da invenção incluem agentes com modificações químicas como divulgado, por exemplo, no Pedido Provisório US No. 61/561.710, depositado em 18 de novembro de 2011, ou no PCT/US2012/065691, depositado em 16 de novembro de 2012, os conteúdos de cada um são aqui incorporados a título de referência.
[0178] Os agentes RNA de filamento duplo (dsRNA) da invenção podem ser opcionalmente conjugados a um ou mais ligantes. O ligante pode ser ligado ao filamento de senso, filamento de antissenso ou am- bos filamentos, na extremidade 3’, extremidade 5’ ou em ambas extre- midades. Por exemplo, o ligante pode ser conjugado ao filamento de senso. Em modalidades preferidas, o ligante é conjugado à extremidade 3’ do filamento de senso.
[0179] Em uma modalidade, o ligante é um conjugado de carboi- drato, tal como um monossacarídeo. Em uma modalidade, o ligante é um derivado de N-acetilgalactosamina (GalNAc) GalNAc ou GalNAc. Em certas modalidades da invenção, o GalNAc ou derivado de GalNAc é ligado a um agente iRNA da invenção por meio de um elemento de ligação monovalente. Em algumas modalidades, o GalNAc ou derivado de GalNAc é ligado a um agente iRNA da invenção por meio de um ligante bivalente. Em ainda outras modalidades da invenção, o GalNAc ou derivado de GalNAc é ligado a um agente iRNA da invenção por meio de um ligante trivalente. Ligantes adequados são divulgados, por exem- plo, no Pedido de Patente U.S. No. 15/371.300 e na Publicação de Pa- tente U.S. No. 2009/0239814, os conteúdos de cada um uma vez que eles referem-se a ligantes adequados são incorporados aqui a título de referência.
[0180] Em algumas modalidades, o ligante, por exemplo, ligante GalNAc, é ligado à extremidade 3’ do agente RNAi. Em uma modali- dade, o agente RNAi é conjugado ao ligante por meio de um ligante, por exemplo, ligante GalNAc, como mostrado no esquema que segue em que X é O ou S. Em uma modalidade, X é O.
[0181] As Patentes U.S. representativas que ensinam a preparação de conjugados de RNA incluem, mas não estão limitadas a, Pat. U.S. Nos. 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313;
5.545.730; 5.552.538; 5.578.717. 5.580.731; 5.591.584; 5.109.124;
5.118.802; 5.138.045; 5.414.077; 5.486.603; 5.512.439; 5.578.718;
5.608.046; 4.587.044; 4.605.735; 4.667.025; 4.762.779; 4.789.737;
4.824.941; 4.835.263; 4.876.335; 4.904.582; 4.958.013; 5.082.830;
5.112.963; 5.214.136; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.245.022;
5.254.469; 5.258.506; 5.262.536; 5.272.250; 5.292.873; 5.317.098;
5.371.241. 5.391.723; 5.416.203. 5.451.463; 5.510.475; 5.512.667;
5.514.785; 5.565.552; 5.567.810; 5.574.142; 5.585.481; 5.587.371;
5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 e 5.688.941; 6.294.664;
6.320.017; 6.576.752; 6.783.931; 6.900.297; 7.037.646; 8.106.022, os conteúdos de cada um em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência.
[0182] Não é necessário que todas as posições em um determinado composto sejam uniformemente modificadas e, de fato, mais de uma das modificações mencionadas acima pode ser incorporada em um único composto ou mesmo em um único nucleosídeo dentro de um iRNA. A presente invenção também inclui compostos de iRNA que são compostos quiméricos.
[0183] Compostos de iRNA "quiméricos" ou "quimeras", no contexto da presente invenção, são compostos de iRNA, preferivelmente dsR- NAs, que contêm duas ou mais regiões quimicamente distintas, cada uma formada por pelo menos uma unidade de monômero, isto é, um nucleotídeo no caso de um composto de dsRNA. Esses iRNAs contêm tipicamente pelo menos uma região em que o RNA é modificado de modo a conferir ao iRNA resistência maior à degradação de nuclease, absorção celular aumentada e/ou afinidade de ligação aumentada com o ácido nucleico alvo. Uma região adicional do iRNA pode servir como substrato para enzimas capazes de clivar híbridos de RNA:DNA ou RNA:RNA. A título de exemplo, a RNase H é uma endonuclease celular que cliva o filamento de RNA de um dúplex RNA:DNA. Ativação da RNase H, portanto, resulta na clivagem do RNA-alvo, dessa maneira aumentando bastante a eficiência de inibição de iRNA de expressão de gene. Consequentemente, resultados comparáveis podem frequente- mente ser obtidos com iRNAs mais curtos quando dsRNAs quiméricos são usados, comparado com dsRNAs de desóxi fosforotioato hibridi- zando para a mesma região-alvo. A clivagem do RNA alvo pode ser ro- tineiramente detectada através de eletroforese em gel e, se necessário, técnicas de hibridização de ácido nucleico associadas conhecidas no campo.
[0184] Em certos casos, o RNA de um iRNA pode ser modificado por um grupo não ligante. Uma série de moléculas não ligantes foi con- jugada a iRNAs a fim de aumentar a atividade, distribuição celular ou absorção celular do iRNA, e procedimentos para realizar tais conjuga- ções estão disponíveis na literatura científica.
Tais porções não ligantes incluem porções lipídicas, tais como colesterol (Kubo, T. e outros, Bio- chem.
Biophys.
Res.
Comm., 2007, 365(1):54-61; Letsinger e outros, Proc.
Natl . Acad.
Sci.
USA, 1989, 86:6553), ácido cólico (Manoharan e outros, Bioorg.
Med.
Chem.
Lett., 1994, 4:1053), um tioéter, por exem- plo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan e outros, Ann.
NY Acad.
Sci., 1992, 660:306; Manoharan e outros, Bioorg.
Med.
Chem.
Let., 1993, 3: 2765), um tiocolesterol (Oberhauser e outros, Nucl.
Acids Res., 1992, 20: 533), uma cadeia alifática, por exemplo, resíduos de dodecanodiol ou unde- cila (Saison-Behmoaras e outros, EMBO J., 1991, 10: 111; Kabanov e outros, FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk e outros, Biochimie, 1993, 75:49), um fosfolipídeo, por exemplo, di-hexadecil-rac-glicerol ou trietilamônio 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato (Manoharan e outros, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea e outros, Nucl.
Acids Res., 1990, 18:3777), uma cadeia de poliamina ou polietilenoglicol (Ma- noharan e outros, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969) ou ácido adamantano acético (Manoharan e outros, Tetrahedron Lett., 1995, 36: 3651), uma porção palmitila (Mishra e outros, Biochim.
Biophys.
Acta, 1995, 1264: 229) ou uma porção de octadecilamina ou hexilamino-car- bonil-oxicolesterol (Crooke e outros, J.
Pharmacol.
Exp.
Ther., 1996, 277:923). As patentes representativas dos Estados Unidos que ensinam a preparação de tais conjugados de RNA foram listadas acima.
Os pro- tocolos de conjugação típicos envolvem a síntese de um RNA carre- gando um elemento de ligação amino em uma ou mais posições da se- quência.
O grupo amino é então reagido com a molécula sendo conju- gada usando acoplamento ou reagentes de ativação apropriados.
A re- ação de conjugação pode ser realizada com o RNA ainda ligado ao apoio sólido ou após a clivagem do RNA, em fase de solução.
Purifica-
ção do conjugado de RNA através de HPLC normalmente provê o con- jugado puro. V. Usos das Composições Farmacêuticas da Invenção
[0185] As composições farmacêuticas da invenção são úteis para tratamento terapêutico e profilático de indivíduos tendo um distúrbio que se beneficiaria da redução na expressão de Serpinc1, tal como um dis- túrbio hemorrágico, por exemplo, uma hemofilia (por exemplo, hemofilia A, hemofilia B ou hemofilia C).
[0186] Como usado aqui, os termos "tratando" e "tratamento" refe- rem-se a um resultado benéfico ou desejado incluindo, mas não limitado a, alívio ou melhora de um ou mais sintomas, diminuição da extensão de sangramento, estado estabilizado (isto é, sem piora) de sangra- mento, melhora ou paliação de sangramento, seja detectável ou não detectável, ou parada do sangramento. "Tratamento" pode também sig- nificar prolongamento da sobrevida comparado com a sobrevida espe- rada na ausência de tratamento. Nos métodos da invenção, tratamento inclui tratamento sob demanda e controle de episódios de sangramento, gerenciamento perioperatório de sangramento e profilaxia de rotina para reduzir a frequência dos episódios de sangramento.
[0187] O termo "inferior" no contexto do nível de um Serpinc1 em um indivíduo ou um marcador de doença ou sintoma refere-se a uma diminuição estatisticamente significante em tal nível. A diminuição pode ser, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou mais e é prefe- rencialmente baixo para um nível aceito como dentro da faixa de normal para um indivíduo sem tal distúrbio.
[0188] Como usado aqui, "prevenção" ou "prevenir", quando usado em referência a uma doença, distúrbio ou condição dos mesmos, que se beneficiaria de uma redução em expressão de um gene Sertpinc1, refere-se a uma redução na probabilidade que um indivíduo vá desen- volver um sintoma associado a tal doença, distúrbio ou condição, por exemplo, um sintoma tal como um sangramento. A probabilidade de de- senvolver um sangramento é reduzida, por exemplo, quando um indiví- duo tendo um ou mais fatores de risco para um sangramento não con- segue desenvolver um sangramento ou desenvolve um sangramento com menos gravidade em relação a uma população com os mesmos fatores de risco e não recebendo tratamento conforme descrito aqui. A falha em desenvolver uma doença, distúrbio ou condição, ou a redução no desenvolvimento de um sintoma associado a tal doença, distúrbio ou condição (por exemplo, em pelo menos cerca de 10% em uma escala clinicamente aceita para essa doença ou distúrbio), ou a exibição de sintomas tardios (por exemplo, dias, semanas, meses ou anos) é consi- derada uma prevenção eficaz.
[0189] Os indivíduos que se beneficiariam de uma redução e/ou ini- bição de expressão de Serpinc1gene são aqueles que têm um distúrbio hemorrágico, por exemplo, um distúrbio hemorrágico hereditário ou um distúrbio hemorrágico adquirido como descrito aqui. Em uma modali- dade, um indivíduo tendo um distúrbio hemorrágico hereditário tem uma hemofilia, por exemplo, hemofilia A, B ou C. Em uma modalidade, um indivíduo tendo um distúrbio hemorrágico hereditário, por exemplo, uma hemofilia, é um indivíduo inibidor (um indivíduo que se tornou refratário aos fatores de coagulação de reposição). Em uma modalidade, o indiví- duo inibidor tem hemofilia A. Em uma outra modalidade, o indivíduo ini- bidor tem hemofilia B. Em ainda uma outra modalidade, o indivíduo ini- bidor tem hemofilia C. Tratamento de um indivíduo que se beneficiaria de uma redução e/ou inibição de expressão do gene Serpinc1 inclui tra-
tamentos terapêutico (por exemplo, sob demanda, por exemplo, o indi- víduo está sangrando (sangramento espontâneo ou sangramento como resultado de trauma) e falha em coagular) e profilático (por exemplo, o indivíduo não está sangrando e/ou será submetido à cirurgia).
[0190] Como usado aqui, o termo "distúrbio hemorrágico" é uma do- ença ou distúrbio que resulta em má coagulação do sangue e/ou san- gramento excessivo. Um distúrbio hemorrágico pode ser um distúrbio hereditário, tal como hemofilia ou doença de von Willebrand, ou um dis- túrbio adquirido, associado a, por exemplo, coagulação intravascular disseminada, eclâmpsia associada à gravidez, deficiência de vitamina K, um distúrbio autoimune, doença inflamatória intestinal, colite ulcera- tiva, um distúrbio dermatológico (por exemplo, psoríase, pênfigo), uma doença respiratória (por exemplo, asma, doença pulmonar obstrutiva crônica), uma reação alérgica a medicamentos, por exemplo, o resul- tado de medicamentos, tais como aspirina, heparina e warfarina, diabe- tes, infecção aguda por hepatite B, infecção aguda por hepatite C, uma malignidade ou tumor sólido (por exemplo, próstata, pulmão, cólon, pân- creas, estômago, ducto biliar, cabeça e pescoço, colo do útero, mama, melanoma, rim e/ou uma malignidade hematológica). Em uma modali- dade, um distúrbio hemorrágico hereditário é uma hemofilia, por exem- plo, hemofilia A, B ou C. Em uma modalidade, um indivíduo tendo um distúrbio hemorrágico hereditário, por exemplo, uma hemofilia, desen- volveu inibidores, por exemplo, inibidores de aloanticorpos, para tera- pias de coagulação de reposição e é referido aqui como um "indivíduo inibidor". Em uma modalidade, o indivíduo inibidor tem hemofilia A. Em uma outra modalidade, o indivíduo inibidor tem hemofilia B. Em ainda uma outra modalidade, o indivíduo inibidor tem hemofilia C.
[0191] Em uma modalidade, um distúrbio hemorrágico é um distúr- bio hemorrágico raro (RBD). Um RBD pode ser um RBD adquirido ou um RBD hereditário. RBDs hereditários incluem distúrbios associados deficiências dos fatores de coagulação fibrinogênio, FII, FV, FV e FVIII, FVII, FX, FXI, FXIII combinados e deficiência congênita de fatores de- pendentes de vitamina K (VKCFDs). Eles são geralmente transmitidos como condições autossômicas recessivas embora, em alguns casos, tais como FXI e a disfibrinogenemia, possam ser autossômicos domi- nantes. Os RBDs são relatados na maioria das populações, com inci- dência homozigota ou heterozigota dupla variando de 1 em 500.000 para deficiência de FVII a 1 em 2 a 3 milhões para deficiências de pro- trombina e FXIII. A frequência relativa varia entre as populações, sendo maior onde os casamentos consanguíneos ou endogâmicos são co- muns, com frequência aumentada de genes mutantes específicos.
[0192] RBDs exemplares incluem afibrinogenemia (fibrinogênio; de- ficiência de Fator I); hipofibrinogenemia (fibrinogênio; deficiência do fa- tor I); disfibrinogenemia (fibrinogênio; deficiência do fator I); hipodisfibri- nogenemia (fibrinogênio; deficiência do fator I); hipoprotrombinemia (protrombina; deficiência do Fator II); deficiência de protrombina (pro- trombina; deficiência de Fator II); trombofilia (protrombina; deficiência de Fator II); deficiência congênita de antitrombina III (tromboplastina; Fator III; fator tecidual); paraemofilia (proacelerina; Fator V; fator lábil); Do- ença de Owren (proaccelerina; Fator V; fator lábil); resistência à proteína C ativada (proacelerina; Fator V; fator lábil); Doença de Alexander (fator estável proconvertina; Fator VII); deficiência congênita de proconver- tina/Fator VII (fator estável proconvertina; Fator VII); Deficiência de Stu- art-Prower (fator de Stuart-Prower; Fator X); deficiência congênita de Fator XIIIa/b (é o fator estabilizador da fibrina; Fator XIII); deficiência hereditária de Fator XIII (fator de estabilização de fibrina; Fator XIII); e deficiência de fator de estabilização de fibrina (fator de estabilização de fibrina; Fator XIII).
[0193] "Quantidade terapeuticamente eficaz", como usado aqui,
pretende incluir a quantidade de um agente RNAi que, quando adminis- trado a um indivíduo tendo um distúrbio hemorrágico e sangramento, é suficiente para realizar o tratamento da doença (por exemplo, dimi- nuindo, melhorando ou manutenção da doença existente ou um ou mais sintomas da doença). A "quantidade terapeuticamente eficaz" pode va- riar dependendo do agente RNAi, como o agente é administrado, a do- ença e sua gravidade e a história, idade, peso, história familiar, compo- sição genética, os tipos de tratamentos anteriores ou concomitantes, se houver, e outras características individuais do indivíduo a ser tratado.
[0194] "Quantidade profilaticamente eficaz", como usado aqui, pre- tende incluir a quantidade de um iRNA que, quando administrado a um indivíduo tendo um distúrbio hemorrágico, mas sem sangramento, por exemplo, um indivíduo tendo um distúrbio hemorrágico e programado para cirurgia (por exemplo, perioperatório tratamento), é suficiente para prevenir ou melhorar a doença ou um ou mais sintomas da doença. A melhora da doença inclui retardar o curso da doença ou reduzir a gravi- dade da doença se desenvolvendo posteriormente. A "quantidade pro- filaticamente eficaz" pode variar dependendo do iRNA, como o agente é administrado, o grau de risco de doença e a história, idade, peso, his- tória familiar, composição genética, os tipos de tratamentos anteriores ou concomitantes, se houver, e outras características individuais do pa- ciente a ser tratado.
[0195] Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quantidade profilaticamente eficaz" também inclui uma quantidade de um agente RNAi que produz algum efeito local ou sistêmico desejado em uma ra- zão benefício/risco razoável aplicável a qualquer tratamento. O iRNA usado nos métodos da presente invenção pode ser administrado em uma quantidade suficiente para produzir uma razão benefício/risco ra- zoável aplicável a tal tratamento.
[0196] A "quantidade terapeuticamente eficaz recomendada de um fator de substituição" e a "quantidade terapeuticamente eficaz recomen- dada de um agente de bypass" são as doses de fator de substituição ou agente de bypass, respectivamente, suficientes para gerar trombina e remediar um sangramento e/ou suficiente para atingir um nível de pico do fator plasmático em um indivíduo com sangramento como provido pela World Federation of Hemophilia (vide, por exemplo, Srivastava e outros “Guidelines for the Management of Hemophilia”, Hemophilia Epub 6 de julho de 2012; DOI: 10.1111/j.1365-2516.2012.02909.x; bula do produto ADVATE (fator anti-hemofílico (Recombinante)); 11/2016; e bula do produto BeneFIX (fator IX de coagulação (Recombinante); 11/2011. Os conteúdos de cada um dos acima são aqui incorporados a título de referência.
[0197] Por exemplo, a dose recomendada de fator de substituição ou agente de bypass para um indivíduo tendo um pequeno sangramento é a dose suficiente para atingir um nível de Fator VIII plasmático de pico de cerca de 10-40 UI/dL; a dose recomendada de fator de substituição ou agente de bypass para um indivíduo tendo um sangramento mode- rado é a dose suficiente para atingir um nível de Fator VIII plasmático máximo de cerca de 30-60 UI/dL; a dose recomendada de fator de subs- tituição ou agente de bypass para um indivíduo com um sangramento grande é a dose suficiente para atingir um pico de nível de Fator VIII no plasma de cerca de 60-100 UI/dL; a dose recomendada de fator de substituição ou agente de bypass para um indivíduo no perioperatoria- mente é a dose suficiente para atingir um nível de Fator VIII plasmático de pico de cerca de 30-60 UI/dL (vide, por exemplo, Tabelas 1 e 2 da bula do produto ADVATE (Fator Anti-hemofílico (Recombinante)); 11/2016).
[0198] A dose recomendada de fator de substituição ou agente de bypass para um indivíduo tendo um sangramento pequeno é a dose su- ficiente para atingir um nível de Fator IX plasmático de pico de cerca de
10-30 UI/dL; a dose recomendada de fator de substituição ou agente de bypass para um indivíduo tendo sangramento moderado é a dose sufi- ciente para atingir um nível plasmático de Fator IX de cerca de 25-50 UI/dL; a dose recomendada de fator de substituição ou agente de bypass para um indivíduo com um sangramento grande é a dose sufici- ente para atingir um nível plasmático de Fator IX de cerca de 50-100 UI/dL.
[0199] Os métodos e usos das composições farmacêuticas da in- venção geralmente incluem administração a um indivíduo tendo uma doença associada a Serpinc1, por exemplo, um distúrbio hemorrágico, por exemplo, uma hemofilia (por exemplo, hemofilia A, hemofilia B ou hemofilia C), uma composição farmacêutica da invenção. Em alguns as- pectos da invenção, os métodos incluem ainda a administração ao indi- víduo de um agente terapêutico adicional.
[0200] Desta maneira, em um aspecto, a invenção provê métodos de prevenção de pelo menos um sintoma em um indivíduo tendo um distúrbio que se beneficiaria de redução em expressão de Serpinc1, por exemplo, um distúrbio hemorrágico, por exemplo, uma hemofilia. Os métodos incluem administrar ao indivíduo, por exemplo, um ser hu- mano, uma composição farmacêutica da invenção compreendendo uma dose profilaticamente eficaz, por exemplo, uma dose fixa de cerca de 25 mg a cerca de 100 mg, por exemplo, uma dose fixa de cerca de 80 mg, do agente iRNA, por exemplo, dsRNA, da invenção, dessa maneira evitando pelo menos um sintoma no indivíduo tendo um distúrbio que se beneficiaria da redução em expressão de Serpinc1.
[0201] Em outro aspecto, a presente invenção provê métodos de tratamento de um indivíduo tendo um distúrbio que se beneficiaria da redução em expressão de Serpinc1, por exemplo, um distúrbio hemor- rágico, por exemplo, uma hemofilia, que inclui administração ao indiví- duo, por exemplo, um humano, de uma composição farmacêutica da invenção compreendendo uma dose terapeuticamente eficaz, por exemplo, uma dose fixa de cerca de 25 mg a cerca de 100 mg, por exemplo, uma dose fixa de cerca de 80 mg, de um agente iRNA se di- recionado a um gene Serpinc1 ou uma composição farmacêutica com- preendendo um agente iRNA direcionado a um gene Serpinc1, dessa maneira tratando o indivíduo tendo um distúrbio que se beneficiaria da redução em expressão de Serpinc1.
[0202] Em certas modalidades, os métodos terapêuticos e profiláti- cos da invenção incluem a administração ao indivíduo de uma compo- sição farmacêutica compreendendo um agente iRNA da invenção, por exemplo, em uma quantidade que reduz a atividade de Serpinc1 no in- divíduo em cerca de 75% ou mais, e um fator de reposição ou um agente de bypass em uma quantidade terapeuticamente eficaz que é reduzida comparado com a quantidade terapeuticamente eficaz recomendada do fator de reposição ou agente de bypass, por exemplo, recomendado pela World Federation of Hemophilia (vide, por exemplo, Srivastava, e outros “Guidelines for the Management of Hemophilia", Hemophilia Epub 6 de julho de 2012; DOI:10.1111/j.1365-2516.2012.02909.x) e/ou Food and Drug Administration ((vide, por exemplo, bula do produto AD- VATE (Fator Anti-hemofílico (Recombinante)); 11/2016; bula do produto BeneFIX (Fator de Coagulação IX (Recombinante); 11/2011) (por exem- plo, uma quantidade suficiente para gerar trombina e remediar um san- gramento (formar um coágulo). Os conteúdos de cada um dos os acima são aqui incorporados a título de referência.
[0203] Fatores de reposição adequados incluem Fator VIII, por exemplo, Advate, Eloctate, Haemate, Helixate, Imunate, Octanate, Re- combinate e Refacto ou Fator IX, por exemplo, Aimafix, Benefix, Immu- nine e Refacto. Agentes de bypass adequados para uso nos métodos da invenção incluem concentrados de complexo de protrombina ativada (aPCC), por exemplo, FEIBA e Prothromplex, e Fator recombinante VIIa
(rFVIIa), por exemplo, NovoSeven.
[0204] O fator de reposição pode ser Fator VIII e a quantidade tera- peuticamente eficaz do fator de reposição administrado ao indivíduo nos métodos da invenção é uma dose suficiente para atingir um nível de Fator VIII plasmático de pico de cerca de 10-100 UI/dL, por exemplo, cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou cerca de 100 UI/dL.
[0205] Por exemplo, a quantidade terapeuticamente eficaz de fator de reposição de Fator VIII administrado ao indivíduo pode ser menos do que cerca de 200 UI/kg, ou menos do que cerca de 190 UI/kg ou menos do que cerca de 180 UI/kg ou menos do que cerca de 170 UI/kg ou menos do que cerca de 160 UI/kg ou menos do que cerca de 150 UI/kg ou menos do que cerca de 140 UI/kg ou menos do que cerca de 130 UI/kg ou menos do que cerca de 120 UI/kg ou menos do que cerca de 110 UI/kg ou menos do que cerca de 100 UI/kg ou menos do que cerca de 90 UI/kg ou menos do que cerca de 80 UI/kg ou menos do que cerca de 70 UI/kg ou menos do que cerca de 60 UI/kg ou menos do que cerca de 50 UI/kg ou menos do que cerca de 40 UI/kg ou menos do que cerca de 30 UI/kg ou menos do que cerca de 20 UI/kg ou menos do que cerca de 10 UI/kg. Em uma modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz de Fator VIII administrada ao indivíduo é cerca de uma vez e meia a cerca de cinco vezes menos do que a quantidade eficaz recomendada do fator de substituição, tal como uma dose de cerca de 5 a cerca de 20 UI/kg ou cerca de 10 a cerca de 20 UI/kg, por exemplo, 5, 10, 15 ou 20 UI/kg. Em uma modalidade, o evento de sangramento é um evento de sangramento moderado. Em uma outra modalidade, o evento de san- gramento é um evento de sangramento grande.
[0206] O fator de reposição pode ser Fator IX e a quantidade tera- peuticamente eficaz do fator de reposição administrado ao indivíduo nos métodos da invenção é uma dose suficiente para atingir um nível de
Fator IX plasmático de pico de cerca de 10-100 UI/dL, por exemplo, cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou cerca de 100 UI/dL.
[0207] Por exemplo, a quantidade terapeuticamente eficaz de fator de reposição de Fator IX pode ser menos do que cerca de 200 UI/kg ou menos do que cerca de 190 UI/kg ou menos do que cerca de 180 UI/kg ou menos do que cerca de 170 UI/kg ou menos do que cerca de 160 UI/kg ou menos do que cerca de 150 UI/kg ou menos do que cerca de 140 UI/kg ou menos do que cerca de 130 UI/kg ou menos do que cerca de 120 UI/kg ou menos do que cerca de 110 UI/kg ou menos do que cerca de 100 UI/kg ou menos do que cerca de 90 UI/kg ou menos do que cerca de 80 UI/kg ou menos do que cerca de 70 UI/kg ou menos do que cerca de 60 UI/kg ou menos do que cerca de 50 UI/kg ou menos do que cerca de 40 UI/kg ou menos do que cerca de 30 UI/kg ou menos do que cerca de 20 UI/kg ou menos do que cerca de 10 UI/kg. Em uma modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz de Fator IX adminis- trada ao indivíduo é cerca de duas vezes a cerca de seis vezes menos do que a quantidade eficaz recomendada do fator de substituição, por exemplo, uma dose de cerca de 10 a cerca de 30 UI/kg ou cerca de 20 a cerca de 30 UI/kg, tal como cerca de 10, 15, 20, 25 ou 30 UI/kg. Em uma modalidade, o evento de sangramento é um evento de sangra- mento moderado. Em uma outra modalidade, o evento de sangramento é um evento de sangramento grande.
[0208] O agente de bypass pode ser aPCC e a quantidade terapeu- ticamente eficaz do agente de bypass administrado ao indivíduo nos métodos da invenção é uma dose suficiente para gerar trombina e re- mediar um sangramento.
[0209] Por exemplo, a quantidade terapeuticamente eficaz do agente de bypass aPCC pode ser menos do que cerca de 100 U/kg ou menos do que cerca de 90 U/kg ou menos do que cerca de 80 U/kg ou menos do que cerca de 70 U/kg ou menos do que cerca de 60 U/kg ou menos do que cerca de 50 U/kg ou menos do que cerca de 40 U/kg ou menos do que cerca de 30 U/kg ou menos do que cerca de 20 U/kg ou menos do que cerca de 10 U /kg. Em uma modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz de aPCC administrada ao indivíduo é cerca de duas vezes a cerca de três vezes menos do que a quantidade eficaz recomendada do fator de reposição, por exemplo, uma dose de cerca de 30 a cerca de 50 U/kg, tal como cerca de 30, 35, 40, 45 ou 50 U/kg. Em uma modalidade, o evento hemorrágico é um evento hemorrágico moderado. Em uma outra modalidade, o evento hemorrágico é um evento de sangramento importante.
[0210] O agente de bypass pode ser rFVIIa e a quantidade terapeu- ticamente eficaz do agente de bypass administrado ao indivíduo nos métodos da invenção é uma dose suficiente para gerar trombina e re- mediar um sangramento.
[0211] Por exemplo, a quantidade terapeuticamente eficaz do agente de bypass rFVIIa é menos do que cerca de 120 μg/kg ou menos do que cerca de 110 μg/kg ou menos do que cerca de 100 μg/kg ou menos do que cerca de 90 μg/kg ou menos do que cerca de 80 μg/kg ou menos do que cerca de 70 μg/kg ou menos do que cerca de 60 μg/kg ou menos do que cerca de 50 μg/kg ou menos do que cerca de 40 μg/kg ou menos do que cerca de 30 μg/kg ou menos do que cerca de 20 μg/kg. Em uma modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz de rFVIIa administrada ao indivíduo é cerca de duas vezes menor do que a quan- tidade eficaz recomendada do fator de substituição, por exemplo, uma dose de cerca de 45 μg/kg. Em uma modalidade, o evento hemorrágico é um evento de sangramento moderado. Em uma outra modalidade, o evento hemorrágico é um evento hemorrágico grande.
[0212] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica compreendendo o agente dsRNA é administrada a um indivíduo em uma dose fixa. Uma "dose fixa" (por exemplo, uma dose em mg) signi- fica que uma dose de um agente iRNA é usada para todos os indivíduos, independentemente de quaisquer fatores específicos relacionados ao indivíduo, tal como peso. Em uma modalidade particular, uma dose fixa de um agente iRNA da invenção é baseada em um peso ou idade pre- determinado.
[0213] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica com- preendendo o agente iRNA é administrada em uma dose fixa de cerca de 25 mg a cerca de 100 mg, por exemplo, entre cerca de 25 mg a cerca de 95 mg, entre cerca de 25 mg a cerca de 90 mg, entre cerca de 25 mg a cerca de 85 mg, entre cerca de 25 mg a cerca de 80 mg, entre cerca de 25 mg a cerca de 75 mg, entre cerca de 25 mg a cerca de 70 mg, entre cerca de 25 mg a cerca de 65 mg, entre cerca de 25 mg a cerca de 60 mg , entre cerca de 25 mg a cerca de 50 mg, entre cerca de 50 mg a cerca de 100 mg, entre cerca de 50 mg a cerca de 95 mg, entre cerca de 50 mg a cerca de 90 mg, entre cerca de 50 mg a cerca de 85 mg, entre cerca de 50 mg a cerca de 80 mg, entre cerca de 30 mg a cerca de 100 mg, entre cerca de 30 mg a cerca de 90 mg, entre cerca de 30 mg a cerca de 80 mg, entre cerca de 40 mg a cerca de 100 mg, entre cerca de 40 mg a cerca de 90 mg, entre cerca de 40 mg a cerca de 80 mg, entre cerca de 60 mg a cerca de 100 mg, entre cerca de 60 mg a cerca de 90 mg, entre cerca de 25 mg a cerca de 55 mg, entre cerca de 30 mg a cerca de 95 mg, entre cerca de 30 mg a cerca de 85 mg, entre cerca de 30 mg a cerca de 75 mg, entre cerca de 30 mg a cerca de 65 mg, entre cerca de 30 mg a cerca de 55 mg, entre cerca de 40 mg a cerca de 95 mg, entre cerca de 40 mg a cerca de 85 mg, entre cerca de 40 mg a cerca de 75 mg, entre cerca de 40 mg a cerca de 65 mg, entre cerca de 40 mg a cerca de 55 mg ou entre cerca de 45 mg a cerca de 95 mg.
[0214] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica com- preendendo o agente iRNA é administrada em uma dose fixa de cerca de 25 mg, cerca de 30 mg, cerca de 35 mg, cerca de 40 mg, cerca de 45 mg, cerca de 50 mg, cerca de 55 mg, cerca de 60 mg, cerca de 65 mg, cerca de 70 mg, cerca de 75 mg, cerca de 80 mg, cerca de 85 mg, cerca de 90 mg, cerca de 95 mg ou cerca de 100 mg.
[0215] Em uma modalidade, o agente RNAi é administrado ao indi- víduo em uma dose fixa de cerca de 100 mg.
[0216] Em uma modalidade, o agente RNAi é administrado ao indi- víduo em uma dose que diminui a atividade de Serpinc1 em cerca de 75% ou mais.
[0217] Uma composição farmacêutica compreendendo o agente iRNA pode ser administrada a um indivíduo como uma ou mais doses.
[0218] Uma composição farmacêutica compreendendo o iRNA pode ser administrada ao indivíduo cerca de uma vez por mês, cerca de uma vez a cada cinco semanas, cerca de uma vez a cada seis semanas, cerca de uma vez a cada 2 meses ou uma vez por trimestre.
[0219] Em algumas modalidades, uma dose única das composições farmacêuticas pode ser de longa duração, de modo que doses subse- quentes sejam administradas em intervalos de não mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 semanas. Em algumas modalidades da invenção, uma única dose das composições farmacêuticas da invenção é administrada uma vez por mês. Em uma modalidade, a dose fixa do agente RNAi é adequada para administração ao indivíduo uma vez por mês, tal como uma dose fixa de 80 mg uma vez por mês.
[0220] Os métodos e usos da invenção incluem administração de uma composição descrita aqui de modo que a expressão do gene-alvo Serpinc1 seja diminuída, tal como por cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47,
48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ou cerca de 80 dias. Em uma modalidade, expressão do gene-alvo Serpinc1 é diminuída por uma longa duração, por exemplo, pelo menos cerca de sete dias ou mais, por exemplo, cerca de uma semana, duas semanas, três semanas, cerca de quatro semanas, cerca de 5 semanas, cerca de 6 semanas, cerca de 2 meses, cerca de um quarto ou mais.
[0221] A redução em expressão de gene pode ser avaliada por quaisquer métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, uma redução em expressão de Serpinc1 pode ser determinada determinando o nível de expressão de mRNA de Serpinc1 usando métodos de rotina para um versado na técnica, por exemplo, Northern blotting, qRT-PCR, determi- nando o nível de proteína de Serpinc1 usando métodos de rotina para um versado na técnica, tais como Western blotting, técnicas imunológi- cas e/ou determinando uma atividade biológica de Serpinc1, tal como afetando uma ou mais moléculas associadas ao mecanismo de coagu- lação de sangue celular (ou em uma configuração in vivo, própria coa- gulação do sangue). Em uma modalidade, o tempo de geração de trom- bina, o tempo de formação de coágulo e/ou tempo de coagulação são determinados para avaliar expressão de Serpinc1 usando, por exemplo, análise de Tromboelastometria ROTEM® de sangue integral.
[0222] Administração do dsRNA de acordo com os métodos e usos da invenção pode resultar em uma redução da gravidade, sinais, sinto- mas e/ou marcadores de tais doenças ou distúrbios em um paciente com uma doença associada a Serpinc1. Por “redução” neste contexto quer dizer uma diminuição estatisticamente significante em tal nível. A redução pode ser, por exemplo, pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou cerca de 100%.
[0223] Eficácia de tratamento ou prevenção de doença pode ser avaliada, por exemplo, medindo a progressão da doença, remissão da doença, gravidade dos sintomas, frequência de sangramentos, redução de dor, qualidade de vida, dose de um medicamento necessária para sustentar o efeito do tratamento, nível de um marcador de doença ou qualquer outro parâmetro mensurável apropriado para uma determi- nada doença sendo tratada ou direcionada para prevenção. Está dentro da habilidade de um versado na técnica monitorar a eficácia do trata- mento ou prevenção medindo qualquer um de tais parâmetros, ou qual- quer combinação de parâmetros. Por exemplo, a eficácia do tratamento de um distúrbio hemorrágico pode ser avaliada, por exemplo, por moni- toramento periódico dos níveis de trombina:antitrombina. Comparações das leituras posteriores com as leituras iniciais provê ao médico uma indicação de se o tratamento é eficaz. Está dentro da habilidade de um versado na técnica monitorar a eficácia do tratamento ou prevenção me- dindo qualquer um de tais parâmetros, ou qualquer combinação de pa- râmetros. Em conexão com a administração de um iRNA direcionado a Serpinc1 ou composição farmacêutica do mesmo, "eficaz contra" um distúrbio hemorrágico indica que administração de uma maneira clinica- mente apropriada resulta em um efeito benéfico para pelo menos uma fração estatisticamente significante de pacientes, tal como uma melhora de sintomas, uma cura, uma redução na doença, extensão da vida, me- lhora na qualidade de vida ou outro efeito geralmente reconhecido como positivo por médicos familiarizados com o tratamento de distúrbios he- morrágicos e as causas relacionadas.
[0224] Um tratamento ou efeito preventivo é evidente quando há uma melhora estatisticamente significante em um ou mais parâmetros do estado da doença, ou por uma falha em piorar ou desenvolver sinto- mas onde de outra forma seriam previstos. Como um exemplo, uma mu- dança favorável de pelo menos 10% em um parâmetro mensurável da doença e, de preferência, pelo menos 20%, 30%, 40%, 50% ou mais pode ser indicativo de tratamento eficaz. A eficácia para um dado fár- maco de iRNA ou formulação desse fármaco também pode ser avaliada usando um modelo animal experimental para a dada doença como co- nhecido na técnica. Ao usar um modelo animal experimental, a eficácia do tratamento é evidenciada quando uma redução estatisticamente sig- nificante em um marcador ou sintoma é observada.
[0225] Alternativamente, a eficácia pode ser medida por uma redu- ção na gravidade da doença como determinado por um especialista na técnica de diagnóstico com base em uma escala de graduação de gra- vidade de doença clinicamente aceita. Qualquer mudança positiva re- sultando em, por exemplo, diminuição da gravidade de doença medida usando a escala apropriada representa o tratamento adequado usando um iRNA ou uma formulação de iRNA como descrito aqui.
[0226] A invenção provê ainda métodos e usos para o uso de um iRNA ou uma composição farmacêutica do mesmo, por exemplo, para tratamento de um indivíduo que se beneficiaria da redução e/ou inibição da expressão de Serpinc1, por exemplo, um indivíduo tendo um distúr- bio hemorrágico, em combinação com outros produtos farmacêuticos e/ou outros métodos terapêuticos, por exemplo, com produtos farma- cêuticos conhecidos e/ou métodos terapêuticos conhecidos, tais como, por exemplo, aqueles que são atualmente usados para o tratamento desses distúrbios.
[0227] Por exemplo, em certas modalidades, um iRNA se direcio- nado a Serpinc1 é administrado em combinação com, por exemplo, um agente útil em tratamento de um distúrbio hemorrágico como descrito em outro lugar aqui. Por exemplo, agentes terapêuticos e métodos tera- pêuticos adicionais adequados para o tratamento de um indivíduo que se beneficiaria da redução na expressão de Serpinc1, por exemplo, um indivíduo tendo um distúrbio hemorrágico, incluem plasma fresco con- gelado (FFP); FVIIa recombinante; FIX recombinante; concentrados de
FXI; concentrados de FVIII contendo vWF, inativados por vírus; terapia de dessensibilização que pode incluir doses grandes de FVIII ou FIX, juntamente com esteroides ou imunoglobulina intravenosa (IVIG) e ci- clofosfamida; plasmaferese em conjunto com imunossupressão e infu- são de FVIII ou FIX, com ou sem terapia antifibrinolítica; indução de to- lerância imune (ITI), com ou sem terapia imunossupressora (por exem- plo, ciclofosfamida, prednisona e/ou anti-CD20); acetato de desmopres- sina [DDAVP]; antifibrinolíticos, tais como ácido aminocaproico e ácido tranexâmico; concentrado de complexo de protrombina ativado (PCC); agentes anti-hemofílicos; corticosteróides; agentes imunossupressores; e estrogênios.
[0228] O iRNA e um agente terapêutico adicional e/ou tratamento podem ser administrados ao mesmo tempo e/ou na mesma combina- ção, por exemplo, parenteralmente, ou o agente terapêutico adicional pode ser administrado como parte de uma composição separada ou em momentos separados e/ou através de um outro método conhecido na técnica ou descrito aqui. VI. Recipientes da Invenção
[0229] A presente invenção também provê recipientes, tais como frascos, seringas, canetas autoinjetoras ou dispositivos de administra- ção sem agulha, compreendendo uma composição farmacêutica da in- venção.
[0230] Em uma modalidade, as composições da invenção podem ser usadas para autoadministração usando, por exemplo, uma seringa pré-carregada ou um dispositivo de injeção automático.
[0231] Em uma modalidade, um recipiente compreendendo uma composição farmacêutica da invenção é um frasco. O frasco pode incluir cerca de 0,5 mL a cerca de 2,0 mL da composição farmacêutica. Em uma modalidade, o frasco compreende cerca de 0,8 ml da composição farmacêutica. Em uma modalidade, o frasco é um frasco 2R (isto é, um frasco de injeção de 2 ml) compreendendo uma dose única da compo- sição farmacêutica. Em uma modalidade, o frasco de 2R compreende cerca de 0,80 mL (por exemplo, cerca de 0,96 a cerca de 1,05 mL) de uma composição farmacêutica da invenção compreendendo uma dose única de 80 mg da composição.
[0232] Em uma modalidade, um recipiente da invenção compre- ende uma seringa, tal como uma seringa pré-cheia. Em uma modali- dade, a seringa pré-cheia inclui um recurso de segurança para preven- ção de lesões por agulha (PFS-S). Seringas adequadas podem ser se- ringas de 1 ml ou seringas de 3 ml e incluem uma agulha 29 G ou uma agulha 30 G. Em uma modalidade, a seringa é uma seringa de vidro de 3 ml para uso único com uma agulha de 29 G ou 30 G. Em uma moda- lidade, a seringa pré-cheia compreende cerca de 0,80 ml (por exemplo, cerca de 0,84 ml ou 0,8 a 0,84 ml) de uma composição farmacêutica da invenção compreendendo uma dose única de 80 mg da composição.
[0233] Um exemplo de seringa pré-cheia da invenção pode incluir uma seringa, tal como uma BD Neopak com agulha de 29G X 1/2 ”; proteção de agulha rígida (RNS); um êmbolo, tal como um êmbolo BD 4023 com revestimento FluroTec; um sistema de segurança, tal como um BD UltraSafelm Plus; uma haste de êmbolo, tal como uma BD Ultra- Safe' Passive Plunger Rod; e um flange de dedo, tal como um BD Ultra- Saferm Passive Add-on Finger. VII. Estojos da Invenção
[0234] A presente invenção também provê estojos compreendendo uma composição farmacêutica. Esses estojos incluem um ou mais fras- cos ou uma ou mais seringas pré-cheias compreendendo uma compo- sição farmacêutica da invenção e instruções de uso, por exemplo, ins- truções para administração de uma quantidade profilaticamente ou te- rapeuticamente eficaz de um(s) agente(s) RNAi. Os estojos podem op- cionalmente compreender ainda meios para administrar o agente RNAi
(por exemplo, um dispositivo de injeção) ou meios para medição da ini- bição de Serpinc1 (por exemplo, meios para medição da inibição de mRNA de Serpinc1, proteína Serpinc1 e/ou atividade de Serpinc1). Tais meios para medição da inibição de Serpinc1 podem compreender um meio para obtenção de uma amostra de um indivíduo tal como, por exemplo, uma amostra de plasma. Os estojos da invenção podem opci- onalmente compreender ainda meios para determinar a quantidade te- rapeuticamente eficaz ou profilaticamente eficaz.
[0235] A menos que de outro modo definido, todos os termos técni- cos e científicos usados no aqui têm o mesmo significado como comu- mente compreendido por um versado na técnica à qual a presente in- venção pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalen- tes aos descritos aqui possam ser usados na prática ou teste dos iRNAs e métodos apresentados na invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patentes, pa- tentes e outras referências aqui mencionadas são incorporadas aqui a título de referência em sua totalidade. Ainda, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitantes.
[0236] A presente invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exem- plos que não devem ser interpretados como limitantes. O conteúdo de todas as referências, patentes e pedidos de patentes publicados citados ao longo do presente pedido, bem como as Figuras, são incorporados aqui a título de referência.
EXEMPLOS Tabela 1: Abreviações de monômeros de nucleotídeos usados em re- presentação de sequência de ácido nucleico. Será compreendido que esses monômeros, quando presentes em um oligonucleotídeo, estão mutuamente ligados por ligações 5'-3'-fosfodiéster.
Abreviação Nucleotídeo(s) A Adenosina-3’-fosfato Af 2’-fluoradenosina-3’-fosfato Afs 2’-fluoradenosina-3’-fosforotioato As adenosina-3’-fosforotioato C citidina-3’-fosfato Cf 2’-fluorcitidina-3’-fosfato Cfs 2’-fluorcitidina-3’-fosforotioato Cs citidina-3’-fosforotioato G guanosina-3’-fosfato Gf 2’-fluorguanosina-3’-fosfato Gfs 2’-fluorguanosina-3’-fosforotioato Gs guanosina-3’-fosforotioato T 5’-metiluridina-3’-fosfato Tf 2’-fluor-5-metiluridina-3’-fosfato Tfs 2’-fluor-5-metiluridina-3’-fosforotioato Ts 5-metiluridina-3’-fosforotioato U uridina-3’-fosfato Uf 2’-fluoruridina-3’-fosfato Ufs 2’-fluoruridina -3’-fosforotioato Us uridina-3’-fosforotioato N qualquer nucleotídeo (G, A, C, T ou U) a 2'-O-metiladenosina-3’-fosfato as 2'-O-metiladenosina-3’-fosforotioato c 2'-O-metilcitidina-3’-fosfato cs 2'-O-metilcitidina-3’-fosforotioato g 2'-O-metilguanosina-3’-fosfato gs 2'-O-metilguanosina-3’- fosforotioato t 2’-O-metil-5-metiluridina-3’-fosfato
Abreviação Nucleotídeo(s) ts 2’-O-metil-5-metiluridina-3’-fosforotioato u 2'-O-metiluridina-3’-fosfato us 2'-O-metiluridina-3’-fosforotioato s ligação fosforotioato L96 N-[tris(GalNAc-alquila)-amidodecanoil)]-4-hidroxyprolinol Hyp-(GalNAc-alquila)3 Exemplo 1: Produto Farmacêutico Fitusiran
[0237] O produto farmacêutico fitusiran (Fitusiran) é uma solução estéril contendo 100 mg/mL de fitusiran (equivalente a 106 mg/mL de fitusiran sódico) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) 5 mM para administração subcutânea. O medicamento é comercialmente for- necido como uma solução de 0,8 mL em frasco de vidro 2R Tipo I com rolha de borracha de butila revestida de teflon e lacre central sobre os selos. O produto farmacêutico não contém conservantes e é de uso único.
[0238] As composições do produto farmacêutico fitusiran são suma- rizadas na Tabela 2. Tabela 2: Composições de Produto Farmacêutico Fitusiran Componente, grau Concentração (mg/mL) Por frasco Função (mg)a fitusiran (cGMP) 100 80 Ingrediente Ativo PBS: Monoidrato de Fosfato Monossódico (BP, USP) 0,0885 0,0708 Sal Tampão Heptaidrato de Fosfato Dissódico (USP) Cloreto de Sódio (Ph. Eur., BP, JP, USP) 1,169 0,9352 Sal Tampão Água para Injeção (Ph. Eur., USP) 4,909 3,9272 Sal Tampão q.s. q.s. Diluente a Hidróxido de sódio (USP, Ph. Eur.) e ácido fosfórico (USP, Ph. Eur.) são usados apenas se o ajuste do pH for necessário para um lote par- ticular. Abreviações: PBS = Solução Salina Tamponada com Fosfato; BP = Farmacopeia Britânica; Ph. Eur. = Farmacopeia Europeia; USP = Farmacopeia dos Estados Unidos; q.s. = quantidade suficiente
[0239] A estrutura química do Fitusiran, mostrada abaixo, é repre- sentada usando uma fórmula estrutural expandida mostrando a estru- tura principal do fosfato. As bases envolvidas em formação de par de bases são conectadas por uma linha pontilhada. A estrutura de L96, o ligante contendo GalNAc e o elemento de ligação conjugando o ligante com a extremidade 3’ do filamento de senso também é apresentada abaixo. As fórmulas e massas moleculares do dúplex e dos dois fila- mentos simples (AD-116858, filamento de senso; A-116861, filamento de antissenso) do dúplex de Fitusiran (AD-57213) também são providas na Tabela abaixo.
Fórmula estrutural expandida de fitusiran Af, Cf, Gf, Uf = ribonucleosídeos 2’-F Am, Cm, Gm, Um = ribonucleosídeos 2’-OMe
[0240] Fórmula molecular e massa molecular
[0241] Fitusiran A-116858 A-116861 (Dúplex) (Filamento de senso) (Filamento de antissentido) Fórmula molecular sal de sódio Fórmula molecular ácido livre Peso molecular sal de sódio Peso molecular ácido livre
Exemplo 2: Desenvolvimento de Formulação de Fitusiran
[0242] A formulação de fitusiran foi planejada para administração subcutânea. Formulações planejadas para administração subcutânea não devem ser muito ácidas ou muito alcalinas para evitar o risco de irritação aumentada e incompatibilidade química. Com a devida consi- deração de tonicidade, pH e viscosidade, a formulação foi planejada para ser o mais próximo possível do fisiológico. O pH de soluções aquo- sas do produto farmacêutico fitusiran a 100 mg/mL varia de 5,0 a 6,8. A presença de contraíons de sódio com fosfodiéster aniônico contribui com uma certa quantidade de osmolalidade que é dependente da con- centração da solução aquosa. Na formulação-alvo de 100 mg/mL da substância farmacêutica, os contraíons dão origem a uma solução de aproximadamente 118 mOsm/kg. Para manter a isotonicidade e a capa- cidade tampão do produto farmacêutico, a substância farmacêutica foi dissolvida em solução salina tamponada com fosfato 5 mM (0,64 mM de NaH2PO4, 4,36 mM de Na2HPO4, NaCl 84 mM).
[0243] A formulação do produto farmacêutico descrita acima tem as propriedades físico-químicas que seguem: pH de cerca de 6,8 a cerca de 7,2; Osmolalidade de cerca de 300 mOsm/kg; e uma Densidade de cerca de 1,038 g/mL.
[0244] A fabricação do produto farmacêutico fitusiran consistia em dissolver a quantidade necessária da substância farmacêutica fitusiran em pó (liofilizado) em solução salina tamponada com fosfato 5 mM e ajustar o pH com hidróxido de sódio ou ácido fosfórico para aproxima- damente 7,0, seguido por filtração estéril e enchimento.
[0245] O produto farmacêutico usado em desenvolvimento inicial, incluindo estudos não clínicos e clínicos de Fase 1/2, foi provido como uma solução de 100 mg/mL (fitusiran sódico) em 0,5 mL nominal por frasco. O produto farmacêutico usado no estudo de Fase 3 e destinado à produção comercial é fornecido como 100 mg/mL (ácido livre de fitu- siran, equivalente a 106 mg/mL de fitusiran sódico) em 0,8 mL nominal por frasco. A tabela abaixo sumariza as diferenças nas formulações de produto farmacêutico Fitusiran. Lote do Produto Escala de Concentração Volume de Farmacêutico Fabricação [mg/mL] Enchimento Nominal [L] [mL] Desenvolvimento e lotes clínicos Cerca de 1,5 100 (fitusiran sódico) equivalente a 0,5 (Fases 1 e 2) 94 (ácido livre de fitusiran) Lotes clínicos para Fase 3 (fabri- Cerca de 1,5 100 (ácido livre de fitusiran) equi- 0,8 cante AMRI) valente a 106 (fitusiran sódico) Lotes clínicos para Fase 3 (fabri- Cerca de 5,0 100 (ácido livre de fitusiran) equi- 0,8 cante Vetter Pharma) valente a 106 (fitusiran sódico) Exemplo 3: Análises Analíticas de Produto Farmacêutico Fitusiran
[0246] Várias avaliações analíticas do produto farmacêutico fitusi- ran foram realizadas para demonstrar que o produto farmacêutico era fisicamente e quimicamente estável. Aparência
[0247] O produto farmacêutico fitusiran foi examinado visualmente quanto à cor, homogeneidade e material particulado contra um fundo preto e branco sob iluminação uniforme difusa.
[0248] O teste de aparência para o produto farmacêutico fitusiran foi realizado com o mesmo teste visual em lotes diferentes e os resultados atenderam à especificação de "solução clara, incolor a amarelo claro essencialmente livre de particulados”. Identidade por Tempo de Retenção de Dúplex
[0249] O produto farmacêutico fitusiran foi analisado através de IP RP-HPLC não desnaturante junto com um padrão de referência de fitu- siran e o tempo de retenção de dúplex da amostra foi comparado com aquele do padrão de referência. Todos os lotes de produto farmacêutico fitusiran fabricados até o momento atenderam à especificação de “tempo de retenção consistente com o do padrão de referência”, confir- mando sua identidade como dúplexes de siRNA anelados. Ensaio do produto farmacêutico fitusiran por UV
[0250] O método de absorbância de UV foi usado para a determina- ção de ensaio (mg/mL) de fitusiran no produto farmacêutico fitusiran. A absorbância de um produto farmacêutico diluído adequadamente em solução salina a 0,9% é medida com um espectrofotômetro de UV a 260 nm. C = (A × F × M)/(ε × b), onde A é a absorbância medida, F é o fator de diluição, b é o comprimento do caminho da célula (1 cm), ε é a absortividade molar do padrão de referência de dúplex, M é o peso molecular e C é a con- centração (mg/mL). Para contabilizar a pureza de dúplex, o resultado do ensaio de fitusiran para um dado produto farmacêutico é corrigido por seu fator de pureza (multiplicado por (% de área de HPLC IP-RP não desnaturante)/100).
[0251] O Ensaio do produto farmacêutico fitusiran (mg/mL) foi de- terminado a partir de espectrofotometria de UV e corrigido para pureza de dúplex a partir do método IP RP-HPLC não desnaturante e os resul- tados são relatados com base na concentração da forma H (livre ácido) do dúplex. Todos os resultados estavam dentro dos limites de especifi- cação de 90 a 110 mg/mL (medidos como forma de ácido livre), com um valor de ensaio médio de 101,5 mg/mL e um desvio padrão de 3,4%. Os resultados mostraram boa comparabilidade entre os valores de ensaio de todos os lotes de fitusiran testados. pH do Produto Farmacêutico Fitusiran
[0252] O pH do produto farmacêutico fitusiran foi medido direta- mente. Os resultados comparativos de pH para os lotes do produto far- macêutico fitusiran foram observados como sendo pH de 7,1 com um desvio padrão de 0,0. Todos os resultados atenderam à especificação atual de 6,0 - 8,0 para pH do produto farmacêutico fitusiran. Análise dos dados de pH para os lotes de produto farmacêutico fitusiran indicou um grau alto de comparabilidade entre os lotes de fitusiran.
Osmolalidade de Produto Farmacêutico Fitusiran
[0253] A osmolalidade do produto farmacêutico fitusiran é baseada no princípio da depressão do ponto de congelamento. A osmolalidade foi relatada como valor de mOsm/kg. Uma vez que a formulação tem concentrações de sal fixas do tampão de fosfato de sódio e do dúplex de fitusiran, os valores de osmolalidade observados mostraram apenas uma faixa estreita. Os resultados de osmolalidade para os lotes de pro- duto farmacêutico fitusiran variaram de 297-310 (mOsm/kg), uma média de 304 mOsm/kg e um desvio padrão de 5,3%. Todos os resultados estavam dentro da especificação de 240-390 mOsm/kg para osmolali- dade do produto farmacêutico fitusiran. Matéria Particulada em Produto Farmacêutico Fitusiran
[0254] O produto farmacêutico fitusiran foi analisado quanto ao nú- mero de matéria particulada subvisível por recipiente através do método de obscurecimento por luz e os resultados foram relatados em número total de partículas (≥10 μm e ≥25 μm) por recipiente. Para partículas ≥10 μm no produto farmacêutico fitusiran, a faixa observada foi de cerca de 29-588 partículas (≥10 μm), uma média de cerca de 188 partículas e um desvio padrão de 268,2%. Todos os resultados estavam dentro das es- pecificações de NMT 6.000 por recipiente do produto farmacêutico fitu- siran.
[0255] Para partículas ≥25 μm, a faixa observada foi de cerca de 0- 46 partículas, uma média de cerca de 13 partículas e um desvio padrão de 22,4%. Todos os resultados estavam dentro das especificações do NMT 600 por recipiente de produto farmacêutico fitusiran. Volume em recipiente para Produto Farmacêutico Fitusiran
[0256] O volume em recipientes compreendendo o produto farma- cêutico fitusiran foi medido com um limite de especificação definido para não menos do que (NLT) 0,8 mL. O volume em recipientes observado nos diferentes lotes do produto farmacêutico fitusiran mostrou um bom grau de comparabilidade entre os lotes do produto farmacêutico fitusiran com desvio padrão de 0,0. Endotoxinas Bacterianas e Esterilidade em Lotes de Produto Farma- cêutico Fitusiran
[0257] Todos os lotes de produto farmacêutico fitusiran atenderam aos critérios de teste de segurança microbiana para endotoxinas bacte- rianas (não mais que (NMT) 100 unidades de endotoxina (EU)/mL), demons- trando controle adequado para o processo de produto farmacêutico fi- tusiran e seu perfil de segurança microbiana. Pureza de Dúplex através de Cromatografia Líquida de Alto Desempe- nho de Par de Íons de Fase Reversa Não Desnaturante (IP RP-HPLC)
[0258] IP RP-HPLC não desnaturante determina o dúplex de qual- quer filamento simples residual. A pureza percentual da área do dúplex é determinada através desse método. A identidade da substância far- macêutica no produto farmacêutico fitusiran foi estabelecida pelo tempo de retenção consistente com aquele do padrão de referência de dúplex.
[0259] O método de IPRP HPLC não desnaturante foi usado para identificação dos filamentos simples constituintes, filamentos de senso e antissenso no produto farmacêutico em conjunto com espectrometria de massa (ESI-MS). Como o pico do dúplex foi determinado a partir do filamento simples residual, a pureza do dúplex foi determinada através desse método. Um cromatograma IP RP representativo do produto far- macêutico fitusiran é mostrado na Figura 1. Fase estacionária: coluna Waters XBridge C8 2,1×50, tamanho de par- tícula 2,5 μm. Fase móvel A: 95 mM 1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol (HFIP), 16 mM trietilamina (TEA), ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) 5 µM em água. Fase móvel B: metanol 100% com EDTA 5 µM.
Taxa de fluxo: 0,25 mL/min. Temperatura da coluna: 15oC Gradiente: Tempo (min) %A %B Inicial 80 20 1,00 80 20 15,25 35 65 15,75 20 80 16,75 20 80 17,00 80 20 24,00 80 20 Detecção: UV a 260 nm e MS em modo de íon negativo por 700 a 2700 Da Preparação da amostra: a amostra foi preparada em PBS 1X a uma concentração de ~ 0,1 mg/mL para intermediários de fila- mento simples e 0,2 mg/mL para a substância de fármaco de dúplex (fitusiran). O volume de injeção é de 20 μL. Limites de detecção: software de cromatografia foi usado para integrar e relatar todos os picos ≥ a 0,05% de área. Cálculo de pureza: a% de área do pico de dúplex principal foi calculada pelo software de cromatografia e relatado como pureza de dúplex. % de área de filamento simples residual e outras impurezas também foram relatadas. Identidade: a identidade dos filamentos simples constituin- tes, senso e antissenso presentes sob o mesmo pico de dúplex, foi es- tabelecida pelo peso molecular determinado a partir da deconvolução dos espectros de pico de dúplex através de espectrometria de massa de cromatografia líquida (LC-MS) usando software cromatográfico.
[0260] O perfil não desnaturante do produto farmacêutico fitusiran através de IP RP-HPLC não desnaturante confirmou a presença do pro- duto farmacêutico na sua forma de dúplex. A pureza do dúplex indicou a porcentagem de siRNA dúplex anelado no produto farmacêutico fitu- siran. Para os lotes de produto farmacêutico incluídos neste estudo, os valores de pureza do dúplex estavam na faixa de cerca de 98,9 - 99,5% de área. Análise dos dados proveu uma pureza média (n = 4) de cerca de 99,2% com um desvio padrão de cerca de 0,3% e mostrou que os valores de pureza de dúplex eram consistentes e similares uns aos ou- tros para todos os lotes de produtos farmacêuticos fitusiran comparados neste relatório. Total de Impurezas através de Cromatografia Líquida de Alto Desem- penho de Fase Reversa de Par de Íons Não desnaturante (IP RP- HPLC)
[0261] As impurezas de não dúplex (não aneladas) através de IP RP-HPLC não desnaturante foram relatadas como a soma de todos os picos (não dúplex) ≥0,050% de área. Os resultados para as impurezas totais através da IP RP-HPLC não desnaturante foram observados como estando dentro de 2% e atenderam à especificação de NMT de 10,0% de área para todos os lotes do produto farmacêutico fitusiran in- cluído neste estudo. O valor médio (n = 4) para as impurezas totais atra- vés de IP RP-HPLC não desnaturante foi 0,85% com um desvio padrão de 0,3%. No geral, os resultados mostraram que os lotes do produto farmacêutico fitusiran examinados nesse relatório tinham perfis muito semelhantes em termos de impurezas especificadas (filamentos sim- ples) e não especificadas. Pureza através de cromatografia líquida de alto desempenho de troca aniônica desnaturante (AX-HPLC)
[0262] A fim de determinar a pureza dos filamentos simples no pro- duto farmacêutico, foi realizada análise AX-HPLC desnaturante.
[0263] A presença de múltiplos picos para o filamento de antissenso foi devido aos diastereômeros de fosforotioato. Um cromatograma AX- HPLC representativo de produto farmacêutico fitusiran é mostrado na Figura 2. Fase estacionária: coluna Dionex DNA Pac PA200, 4 x 250 mm Fase móvel A: Fosfato de sódio 20 mM, ACN 10%, pH 11 Fase móvel B: Fosfato de sódio 20 mM, NaBr 1M, ACN 10%, pH 11 Gradiente: Tempo (min) %A %B Inicial 65 35 26,00 36,5 63,5 27,00 0 100 29,00 0 100 30,00 65 35 35,00 65 35 Limites de detecção: software de cromatografia foi usado para integrar e relatar todos os picos ≥ a 0,05% de área Cálculo de pureza: a % da área de cada um dos picos prin- cipais (senso e antissenso) foi calculada através de software de cro- matografia e a soma da porcentagem de área dos filamentos de senso e antissenso foi relatada como pureza. A soma da % de área de impu- rezas acima de 0,050% de área foi relatada como impurezas totais. Identidade: a identidade de filamento simples foi confirmada comparando os tempos de retenção da amostra de teste com aqueles do padrão de referência correspondente
[0264] AX-HPLC desnatura o dúplex de Fitusiran para formar os fi- lamentos simples de senso e antissenso constituintes. A pureza percen- tual da área dos filamentos simples foi determinada através desse mé- todo.
[0265] O método desnaturante de AX-HPLC mede a pureza das dos filamentos simples individuais compreendendo o dúplex de fitusiran. A soma das percentagens de área de filamentos simples representa a pu- reza desnaturante do produto farmacêutico fitusiran. Análise da soma da % de área dos filamentos de senso e antissenso para os lotes de fitusiran nesse estudo resultou em um valor médio (n = 4) de 94,2% da área com um desvio padrão de 0,8%. Todos os resultados dos lotes do produto farmacêutico fitusiran representativos atenderam à especifica- ção de NLT 85,0% de área e indicaram resultados de pureza compará- veis gerais para o produto farmacêutico fitusiran. Impurezas Totais através de Cromatografia Líquida de Alto Desempe- nho de Troca Aniônica Desnaturante (AX-HPLC)
[0266] A análise dos dados provê um valor médio (n = 4) de 5,6% para a soma de todas as impurezas NLT 0,050% de área com um desvio padrão de 0,7%. Os resultados mostram que o valor de impurezas totais para os lotes de fitusiran incluídos neste relatório é consistente e com- parável. Pureza através de Cromatografia Líquida de Alto Desempenho de Fase Reversa de Par de Íons Desnaturante (IP RP-HPLC)
[0267] IP RP-HPLC desnatura o dúplex de Fitusiran para formar os filamentos simples de senso e antissenso constituintes. A pureza per- centual de área dos filamentos simples é determinada através desse método.
[0268] O método de IP RP-HPLC desnaturante é ortogonal ao AX- HPLC e mede a pureza dos filamentos simples individuais compreen- dendo o dúplex de fitusiran no produto farmacêutico. A soma das per- centagens de área de filamentos simples representa a pureza de IP RP- HPLC desnaturante do produto farmacêutico fitusiran.
[0269] Análise através de IP RP-HPLC desnaturante foi realizada para determinar a pureza dos filamentos simples no produto farmacêu- tico. Fase estacionária: coluna Waters XBridge C18 (OST ou XP)
2,1 × 50, tamanho de partícula 2,5 μm.
Fase móvel A: 550 mM 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP), 13 mM de trimetilamina (TEA) e 5 M de ácido etilenodiaminote- traacético (EDTA) em 90:10 de água:metanol.
Fase móvel B: metanol 100% Taxa de fluxo: 0,40 mL/min.
Temperatura da coluna: 80 ° C Gradiente: Tempo (min) %A %B Inicial 94 6 2,0 94 6 35,0 82,5 17,5 40,0 56,5 43,5 40,5 30 70 42,5 30 70 43,0 94 6 49,0 94 6 Detecção: UV a 260 nm e MS em modo de íon negativo por 700 a 2700 Da Preparação da amostra: a amostra foi preparada em PBS 1X a uma concentração de ~ 0,1 mg/mL para intermediários de fila- mento simples e 0,2 mg/mL para a substância farmacêutica de dúplex (fitusiran). O volume de injeção foi de 25 μL.
Limites de detecção: software de cromatografia foi usado para integrar e relatar todos os picos ≥ a 0,05% de área.
Cálculo de pureza: a % de área do pico dúplex principal foi calculada através de software de cromatografia e relatada como pu- reza de dúplex.
As % de área de filamento simples residual e outras impurezas também foram relatadas.
[0270] Um perfil cromatográfico de IP RP-HPLC desnaturante re- presentativo de produto farmacêutico fitusiran é mostrado na Figura 3.
[0271] A análise da soma da % de área dos filamentos de senso e antissenso para os lotes de fitusiran nesse estudo resultou em um valor médio (n = 4) de 88,7% de área com um desvio padrão de 1,4%. Todos os resultados para os lotes de produto farmacêutico fitusiran atenderam à especificação de NLT de 80,0% de área e mostraram, dentro da vari- abilidade analítica, resultados de pureza comparáveis para os lotes do produto farmacêutico fitusiran. Total de Impurezas através de Cromatografia Líquida de Alto Desem- penho de Fase Reversa de Par de Íons Desnaturante (IP RP-HPLC)
[0272] Análise dos dados provê um valor médio (n = 4) de 11,0% para a soma de todas as impurezas NLT de 0,050% de área com um desvio padrão de 1,5%. Os resultados mostram que o valor de impure- zas totais para todos os lotes de fitusiran incluídos neste relatório é con- sistente e comparável. Exemplo 4: sistema de fechamento de recipiente e compatibili- dade de produto farmacêutico fitusiran
[0273] O sistema de fechamento de recipiente para o produto far- macêutico fitusiran foi escolhido para proteger o produto estéril de con- taminação microbiológica. Os frascos são esterilizados e despirogena- dos por calor seco a ≥ 300°C por ≥ 5 minutos. As vedações de borracha de butila são autoclavadas a 121-125°C por ≥ 60 minutos.
[0274] As rolhas de borracha de butila são esterilizadas a vapor em autoclave por meio de um ciclo validado. Todos os componentes são itens padrão para produtos parenterais. Os estudos de estabilidade de produto farmacêutico fitusiran são conduzidos usando o produto farma- cêutico armazenado em um sistema de fechamento de recipiente idên- tico.
[0275] Fitusiran é formulado para injeção subcutânea. Com base nas doses calculadas estimadas a serem administradas, serão utiliza- das seringas de 1 mL ou 3 mL. Dois tipos de seringa, um com material de construção em policarbonato e o segundo com material de constru- ção em polipropileno, foram testados quanto à compatibilidade com fi- tusiran. O medicamento, 100 mg/mL enchido nos frascos, foi colocado nas seringas. Um conjunto de seringas cheias foi incubado a 25 °C por 8 h e um outro conjunto de seringas cheias foi incubado a 2-8 °C por 48 h junto com os controles. Após a incubação, o produto farmacêutico foi testado quanto ao ensaio e pureza através de AX-HPLC e comparado com o produto farmacêutico em frasco. Não houve nenhuma diferença entre o produto farmacêutico de controle e o produto farmacêutico incu- bado nos dois tipos de seringa em termos de declaração do rótulo e pureza, indicando compatibilidade de fitusiran com os dispositivos de injeção pretendidos, conforme mostrado abaixo na Tabela 3. Tabela 3: Dados de compatibilidade Descrição Material de Tempo de In- Temperatura Ensaio Pureza o 1 Construção cubação (hr) ( C) (mg/mL) AX-HPLC (% área) Controle em NA T0 2-8 99,2 89,6 frasco Seringa de 1 mL Policarbo- 8 25 100 89,8 nato Seringa de 3 mL Polipropileno 8 25 99,7 89,6 Seringa de 1 mL Policarbo- 48 2-8 98,2 89,8 nato Seringa de 3 mL Polipropileno 48 2-8 98,7 89,7 Controle em NA 48 2-8 99,4 89,7 frasco Abreviações: AX-HPLC = cromatografia líquida de alto desempenho de troca aniônica; NA = não aplicável; Controle em frasco = produto far- macêutico fitusiran no frasco pretendido para estudo clínico. 1 No momento desse estudo, os valores de ensaio foram expressos em fitusiran sódico
[0276] O uso de agulhas de calibre maior (calibre mais estreito) para extração e aplicação do produto farmacêutico não diluído, com as serin- gas dos mesmos materiais de construção como mostrado na Tabela 3, também foi avaliado. Foram analisados dois tipos de seringa e duas ta- xas de aplicação. Os resultados são mostrados na Tabela 4 e demons- tram que a integridade do produto farmacêutico fitusiran permanece in- tacta quando usado com agulhas de 29 ou 30 G. Tabela 4: Dados adicionais de compatibilidade IP RP-HPLC não desnaturante AX-HPLC Descrição Ensaio, mg/mL Pureza do dúplex, % área Soma de impurezas ≥ Soma de % de área para 0,050% de área filamentos de senso e an- tissenso Controle em frasco 99,3 98,7 1,3 89,0 Seringa Luer-Lok™, apli- 100,4 98,7 1,3 88,9 cação lenta Seringa Luer-Lok™, apli- 99,7 98,7 1,2 89,0 cação rápida Seringa de insulina, apli- 99,2 98,7 1,3 88,8 cação lenta Seringa de insulina, apli- 99,8 98,7 1,3 89,0 cação rápida Abreviações: AX-HPLC = cromatografia líquida de alto desempenho de troca aniônica; Controle em frasco = produto farmacêutico fitusiran nos frascos pretendido para estudo clínico. Exemplo 5: Análises de estabilidade sob armazenamento do pro- duto farmacêutico fitusiran
[0277] Dados de estabilidade sob armazenamento para o produto farmacêutico fitusiran foram coletados na condição de armazenamento recomendada de 2-8 °C e em uma ou mais condições aceleradas. Os estudos de estabilidade foram elaborados de acordo com a International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registra- tion of Pharmaceuticals for Human use (ICH) Guideline Q1A (R2) e as amostras foram armazenadas em um recipiente idêntico ao usado para armazenamento de material clínico (isto é, frasco de vidro USP Tipo I de 2 mL com tampa de borracha de butila revestida com Teflon). Dados de estabilidade foram coletados conforme mostrado na Tabela 5. Tabela 5: Protocolo de Estabilidade para Produto Farmacêutico Fitusiran
Atributo Critérios de Aceitação Tempo de armazenamento (meses) 0 1 3 6 9 12 18 24 36 Aparência Solução transparente, incolor a S SA SA SA S S S S S amarelo claro essencialmente livre de particulados IPRP-HPLC não desnaturante s SA SA SA S S S S S de pureza Dúplex NLT 90% de área Filamentos simples NMT 5,0% de área Soma de % de área relatada (X,X) Impurezas de picos de todos os picos ≥ 0,050% de área AX-HPLC desnaturante de pu- S SA SA SA S S S S S reza Filamentos Simples Totais NLT 85,0% de área Soma de % de área relatada (X,X) Impurezas de picos de todos os picos ≥ 0,050% de área IRPR-HPLC desnaturante de pu- S SA SA SA S S S S S reza Filamentos Simples Totais NLT 80,0% de área Soma de % de área relatada (0,0) Impurezas de picos de todos os picos ≥ 0,050% de área Ensaio 90 a 110 mg/mL S SA SA SA S S S S S Osmolalidade 240-390 mg/mL S SA SA SA S S S S S pH 6,0 ...8,0 S SA SA SA S S S S S Matéria particulada S A S S S ≥ 10 μ NMT 6.000 por recipiente ≥ 25 μ NMT 600 por recipiente Endotoxinas bacterianas NMT 100 UE/mL S A S S S esterilidade De acordo com a farmacopeia atual S A Integridade do fechamento do Nenhuma evidência de ingresso de S S S recipiente corante S – Teste realizado para amostras armazenadas a 2-8º C e 25 ± 2º C/60 ± 5% RH A – Teste realizado para amostras armazenadas a 40º C ± 2º C/75 ± 5% RH Abreviações: AX-HPLC =HPLC de troca aniônica; IPRP-HPLC = HPLC de fase reversa de par iônico
[0278] A estabilidade do produto farmacêutico fitusiran foi avaliada quanto às tendências usando os procedimentos analíticos que seguem: aparência visual, ensaio através de espectrofotometria UV, pH, osmola- lidade, pureza do dúplex através de IPRP-HPLC não desnaturante e pu- reza de filamento simples medida através de dois métodos ortogonais: pureza através de AX HPLC desnaturante e pureza através de IPRP- HPLC desnaturante.
[0279] A fim de elucidar mais a estabilidade térmica do produto far- macêutico, vários estudos de estabilidade incluíram avaliação a longo prazo do produto farmacêutico a 25 °C/60% RH, bem como um estudo de envelhecimento acelerado de 6 meses realizado a 40 ° C/75% RH. Dados adicionais (isto é, além de 6 meses a 25 °C/60% RH e todos os dados coletados a 40 °C/75% RH) foram coletados a fim de avaliar a adequabilidade do medicamento para armazenamento a longo prazo na condição climáticas de Zona II ICH.
[0280] Os dados de estabilidade sob armazenamento para três lo- tes representativos do produto farmacêutico fitusiran (P02314, P02715 e P07916) são dados nas Tabelas 6-14 e sumarizados abaixo.
[0281] Na condição de armazenamento recomendada de 2-8 °C, até 36 meses de dados de estabilidade para o produto farmacêutico fi- tusiran foram coletados. Quaisquer mudanças significantes foram iden- tificadas para qualquer parâmetro durante armazenamento a 2-8 °C, in- dicando que essa condição é adequada para armazenamento a longo prazo do produto farmacêutico. Além disso, quaisquer mudanças signi- ficantes foram observadas durante armazenamento a 25 °C/60% RH ou mesmo durante armazenamento a 40 °C/75% RH. Com base nisso, e uma avaliação da adequabilidade do medicamento para armazena- mento a longo prazo na condição climática da Zona II ICH (isto é, 25°C/60% RH), uma vida útil de 36 meses foi atribuída ao produto far- macêutico fitusiran armazenado a 2-8°C, e confirmado mais por dados adicionais coletados desde o momento da última atualização. Tabela 6 – Estabilidade a Longo Prazo 5ºC lote P02314 Produto Fitusiran – solução para injeção – 100 mg/mL No. do lote: P02314 farmacêutico Tamanho do lote: 1,0 L Fabricante: AMRI Recipiente/veda- Frasco ção: Condição de +5º C± 3º C armazenamento: Orientação de Na vertical armazenamento: Item de teste Critérios de Tempo aceitação Resultados 3 meses 6 meses 9 meses 12 18 24 36 iniciais meses meses meses meses Aparência Solução trans- Aprovado Aprovado Aprovado Aprovado Aprovado Aprovado Aprovado Aprovado (inspeção visual) parente, incolor a amarelo claro essencialmente livre de particu- lados Pureza do dúplex NLT % de área 99,2 98,8 99,1 99,1 99,2 99,1 99,2 99,2 (IPRP HPLC UV 90% (não desnaturante) Filamentos simples Dados relatados 0,4 0,4 0,3 0,4 0,4 0,6 0,8 0,5 (% área) Impurezas Soma de % de 0,4 0,6 0,4 0,4 0,3 0,4 0,0 0,3 área relatada de todos os picos ≥0,20% de área Pureza AX HPLC UV (desnaturante) Filamento de senso Dados relatados 42,2 42,2 43,6 43,1 43,9 45,8 43,8 43,1 Filamento de antis- (% de área) 48,7 48,5 50,1 50,2 50,9 51,9 50,9 50,5 senso 90,9 90,7 93,7 93,3 94,8 97,7 94,7 93,6 Filamentos simples totais Impurezas Soma de % de área relatada de 6,9 7,5 5,7 5,6 4,8 3,5 5,3 5,1 todos os picos ≥0,20% de área Pureza (IPRP HPLC UV (desnaturante)) Filamento de senso Dados relatados 40,3 39,1 40,7 41,1 42,3 39,7 41,2 40,9 Filamento de antis- (% de área) 47,8 47,8 47,6 49,1 48,1 46,2 48,5 47,6 senso 88,1 86,9 88,3 90,2 90,4 85,9 89,7 88,5 Filamentos Simples Totais Impurezas Soma de % de área relatada de 10,1 11,8 10,9 8,4 8,9 13,1 9,5 10,5 todos os picos ≥0,20% de área Ensaio (Absorção 90 a 110 mg/mL 100 101 97 100 98 99 98 103 de UV) pH (Ph.
Eur. 2.2.3, Dados 6,9 7,0 6,9 6,9 6,8 6,9 6,9 7,1 USP <791>) relatados Osmolalidade (Ph.
Dados 292 290 292 294 287 291 292 292 Eur. 2.2.35, USO relatados <785>) (mOsm/kg) Matéria particula-da NMT 6.000 por 21 NS NS NS NS NS NS 80 (USP <788>) recipiente ≥ 10 μ NMT 600 por re- 0 NS NS NS NS NS NS 2 ≥ 25 μ cipiente Endotoxinas bacteri- NMT 100 70 NS NS NS NS NS NS 51 anas EU/mL Esterilidade Em Aprovado NS NS NS Aprovado NS Aprovado Aprovado conformidade
Abreviações: NS = Não programado; ND = Não detectado Tabela 7 – Estabilidade a Longo Prazo 25º C/60% RH lote P02314 Produto Fitusiran – solução para injeção – 100 mg/mL No. do lote: P02314 farmacêutico Tamanho do lote: 1,0 L Fabricante: AMRI Recipiente/ve- Frasco dação: Condição de +25º C± 2º C, 60%±5% RH armazena- mento: Orientação de Na vertical armazena- mento: Item de teste Critérios de acei- Tempo tação Resultados 3 6 9 12 18 24 36 iniciais meses meses meses meses meses meses meses Aparência Solução transpa- Aprovado Aprovado Aprovado Aprovado Aprovado Aprovado Aprovado Aprovado (inspeção visual) rente, incolor a amarelo claro es- sencialmente livre de particulados Pureza do dú- NLT % de área 99,2 98,8 99,0 99,1 99,3 99,2 99,2 99,2 plex (IPRP HPLC 90% UV (não desna- turante) Dados relatados (% 0,4 0,4 0,4 0,5 0,4 0,8 0,8 0,5
Filamentos sim- área) ples Soma de % de 0,4 0,6 0,5 0,4 0,3 0,0 0,0 0,3 área relatada de to- Impurezas dos os picos ≥0,20% de área Pureza AX HPLC UV (desnatu- rante) Dados relatados (% 42,2 42,2 42,9 43,0 43,6 46,2 44,3 43,1 Filamento de de área) 48,7 48,5 49,7 50,1 51,0 51,4 50,7 50,5 senso 90,9 90,8 92,6 93,1 94,8 97,6 95,0 93,6 Filamento de an- tissenso Filamentos sim- Soma de % de ples totais área relatada de to- 6,9 7,6 7,5 5,7 4,8 1,9 5,1 4,9 Impurezas dos os picos ≥0,20% de área Pureza (IPRP HPLC UV (des- naturante)) Dados relatados (% 40,3 39,1 41,5 41,1 42,2 39,6 41,2 37,8 Filamento de de área) 47,8 47,9 48,7 49,1 48,0 46,1 48,6 47,8 senso 88,1 87,0 90,2 90,2 90,2 85,7 89,8 85,6 Filamento de an- tissenso Filamentos Sim- Soma de % de ples Totais área relatada de to- 10,1 11,7 8,9 8,6 9,1 13,4 9,5 13,0 Impurezas dos os picos ≥0,20% de área Ensaio (Absor- 90 a 110 mg/mL 100 101 97 100 99 99 98 107 ção de UV) pH (Ph. Eur. Dados relatados 6,9 6,9 6,9 6,9 6,9 6,9 6,8 7,0
2.2.3, USP <791>) Osmolalidade Dados relatados 292 291 293 296 292 294 294 294 (Ph. Eur. 2.2.35, (mOsm/kg) USO <785>) Matéria particula- NMT 6.000 por re- 21 NS NS NS NS NS NS 90 da (USP <788>) cipiente ≥ 10 μ NMT 600 por reci- 0 NS NS NS NS NS NS 0 ≥ 25 μ piente Endotoxinas bac- NMT 100 EU/mL 70 NS NS NS NS NS NS 26 terianas Esterilidade Em conformidade Aprovado NS NS NS Aprovado NS Aprovado Aprovado Abreviações: NS = Não programado; ND = Não detectado Tabela 8 – Estabilidade acelerada batelada P02314 Produto farmacêutico Fitusiran – solução para injeção – 100 mg/mL No. do lote: P02314 Tamanho do lote: 1,0 L Fabricante: AMRI Recipiente/vedação: Frasco Condição de +40º C± 2º C, 75%±5% RH armazenamento: Orientação de Na vertical armazenamento: Item de teste Critérios de aceitação Tempo Resultados iniciais 3 meses 6 meses Aparência Solução transparente, incolor a amarelo claro essencialmente Aprovado Aprovado Aprovado (inspeção visual) livre de particulados Pureza do dúplex NLT % de área 90% 99,2 98,8 99,1 (IPRP HPLC UV (não desnaturante) Filamentos simples Dados relatados (% área) 0,4 0,4 0,4 Impurezas Soma de % de área relatada de todos os picos ≥0,20% de 0,4 0,7 0,4 área Pureza AX HPLC UV (desnaturante) Filamento de senso Dados relatados (% de área) 42,2 42,1 43,1 Filamento de antis- 48,7 48,7 50,3 senso 90,9 90,8 93,4 Filamentos simples to- Soma de % de área relatada de todos os picos ≥0,20% de 6,9 7,2 6,8 tais área Impurezas Pureza (IPRP HPLC UV (desnaturante))
Filamento de senso Dados relatados (% de área) 40,3 38,9 41,4 Filamento de antis- 47,8 47,9 49,6 senso 88,1 86,8 91,0 Filamentos Simples To- Soma de % de área relatada de todos os picos ≥0,20% de tais área 10,1 12,1 8,0 Impurezas Ensaio (Absorção de 90 a 110 mg/mL 100 100 97 UV) pH (Ph. Eur. 2.2.3, Dados relatados 6,9 6,9 6,8 USP <791>) Osmolalidade (Ph. Eur. Dados relatados (mOsm/kg) 292 292 295
2.2.35, USO <785>) Matéria particula-da NMT 6.000 por recipiente 21 NS 20 (USP <788>) NMT 600 por recipiente ≥ 10 μ 0 NS 0 ≥ 25 μ Endotoxinas bacteria- NMT 100 EU/mL 70 NS 33 nas Esterilidade Em conformidade Aprovado NS Aprovado Abreviações: NS = Não programado Tabela 9 – Estabilidade a Longo Prazo 5º C lote P02715 Produto farmacêu- Fitusiran – solução para injeção – 100 mg/mL No. do lote: P02715 tico Tamanho do lote: 1,4 L Fabricante: AMRI Recipiente/veda- Frasco ção: Condição de +5º C± 3º C armazenamento: Orientação de Invertido armazenamento: Item de teste Critérios de Tempo aceitação Resultados 1 3 6 9 12 18 24 36 iniciais mês meses meses meses meses meses meses meses Aparência Solução trans- Aprovado Apro- Aprovado Aprovado Aprovado Aprovado Aprovado Aprovado Aprovado (inspeção visual) parente, incolor vado a amarelo claro essencialmente livre de particu- lados Pureza do dúplex NLT % de área 99,2 99,1 99,2 99,3 99,2 99,1 98,5 99,1 99,1 (IPRP HPLC UV 90% (não desnaturante) Filamentos simples 0,5 0,9 0,8 0,7 0,8 0,9 0,6 0,5 0,5 Impurezas Dados relatados (% área) Soma de % de 0,3 ND ND ND ND ND 0,9 0,3 0,3 área relatada de todos os picos ≥0,20% de área Pureza AX HPLC UV (desnaturante) Filamento de senso Dados relatados 43,9 44,2 44,4 44,1 43,4 42,8 42,9 43,1 42,6 Filamento de antis- (% de área) 50,0 50,8 50,6 50,8 49,9 49,3 50,0 50,5 49,8 senso 93,9 95,0 95,0 94,9 93,3 92,1 92,9 93,6 92,4 Filamentos simples Soma de % de 5,6 4,9 4,3 4,9 5,7 6,5 6,0 5,2 6,6 totais área relatada de Impurezas todos os picos ≥0,20% de área Pureza (IPRP HPLC UV (desnaturante)) Filamento de senso Dados relatados 41,0 40,5 40,6 41,8 41,1 41,2 40,3 42,5 38,9 Filamento de antis- (% de área) 47,7 47,6 48,0 48,0 49,0 48,5 46,7 47,7 45,7 senso 88,7 88,1 88,6 89,8 90,1 89,7 87,0 90,2 84,6 Filamentos Simples Soma de % de 10,3 10,7 10,8 8,7 8,1 9,4 11,7 9,0 13,4 Totais área relatada de Impurezas todos os picos ≥0,20% de área Ensaio (Absorção 90 a 110 mg/mL 99 NTa 96 97 100 100 96 108 101 de UV) pH (Ph. Eur. 2.2.3, Dados relatados 6,9 7,0 6,9 6,9 6,9 7,0 7,0 6,9 6,9 USP <791>) Osmolalidade (Ph. Dados relatados 295 292 291 290 293 292 292 291 291 Eur. 2.2.35, USO (mOsm/kg) <785>)
Matéria particula-da NMT 6.000 por 50 NS NS NS NS 12 NS 827 10 (USP <788>) recipiente ≥ 10 μ NMT 600 por re- 2 NS NS NS NS 0 NS 37 0 ≥ 25 μ cipiente Endotoxinas bacteri- NMT 100 41 NS NS NS NS 25 NS 37 37 anas EU/mL Esterilidade Em conformi- Aprovado NS NS NS NS NS NS NS Aprovado dade Integridade de Fe- Nenhuma evi- NS NS NS NS NS Aprovado Aprovado Aprovado NS chamento do recipi- dência de in- ente gresso de co- rante
Abreviações: NS = Não programado; ND = Não detectado; NT = Não testado a vide desvio AMRI D33015 Tabela 10 – Estabilidade a Longo Prazo 25º C/60% RH lote P02715 Produto farmacêu- Fitusiran – solução para injeção – 100 mg/mL No. do lote: P02715 tico Tamanho do lote: 1,4 L Fabricante: AMRI Recipiente/veda- Frasco ção: Condição de +25º C± 2º C/60%±5% RH armazenamento: Orientação de Invertido armazenamento: Item de teste Critérios de Tempo aceitação Resultados 1 3 6 9 12 18 24 36 iniciais mês meses meses meses meses meses meses meses
Aparência Solução trans- Aprovado Apro- Aprovado Aprovado Aprovado Aprovado Aprovado Aprovado Apro- (inspeção visual) parente, incolor vado vado a amarelo claro essencialmente livre de particu- lados Pureza do dúplex NLT % de área 99,2 99,1 99,3 99,3 99,1 99,2 98,5 99,1 99,1 (IPRP HPLC UV 90% (não desnaturante) Filamentos simples 0,5 0,8 0,7 0,7 0,9 0,8 0,6 0,5 0,5 Impurezas Dados relatados (% área) 0,3 ND <0,20 <0,20 <0,20 ND 0,9 0,3 0,3 Soma de % de área relatada de todos os picos ≥0,20% de área Pureza AX HPLC UV (desnaturante) Filamento de senso Dados relatados 43,9 44,0 44,2 43,7 43,5 42,9 42,9 43,1 42,7 Filamento de antis- (% de área) 50,0 50,9 50,6 50,9 49,8 50,2 50,2 50,6 50,1 senso 93,9 94,9 94,8 94,6 93,3 93,1 93,1 93,7 92,8 Filamentos simples Soma de % de 5,6 4,9 4,8 5,3 5,2 55,5 5,5 4,7 5,5 totais área relatada de Impurezas todos os picos ≥0,20% de área Pureza (IPRP HPLC UV (desnaturante)) Filamento de senso Dados relatados 41,0 40,6 40,8 41,1 41,2 41,0 40,6 42,5 39,0 Filamento de antis- (% de área) 47,7 47,7 48,2 48,4 49,1 48,3 47,0 47,9 46,0 senso 88,7 88,3 89,0 89,5 90,3 89,3 87,6 90,4 85,0 Filamentos Simples Soma de % de 10,3 10,5 10,2 9,2 9,0 9,5 11,5 9,0 12,9 Totais área relatada de Impurezas todos os picos ≥0,20% de área Ensaio (Absorção 90 a 110 mg/mL 99 NT 98 97 100 101 98 107 102 de UV) pH (Ph.
Eur. 2.2.3, Dados relatados 6,9 7,0 6,9 6,9 6,9 6,9 6,9 6,9 6,9 USP <791>) Osmolalidade (Ph.
Dados relatados 295 293 291 293 294 292 292 295 294 Eur. 2.2.35, USO (mOsm/kg) <785>) Matéria particula-da NMT 6.000 por 50 NS NS NS NS 28 NS 12 7
(USP <788>) recipiente ≥ 10 μ NMT 600 por re- 2 NS NS NS NS 0 NS 0 0 ≥ 25 μ cipiente Endotoxinas bacteri- NMT 100 41 NS NS NS NS 15 NS 21 21 anas EU/mL Esterilidade Em conformi- Aprovado NS NS NS NS NS NS NS Apro- dade vado Integridade de Fe- Nenhuma evi- NS NS NS NS NS Aprovado NS Aprovado NS chamento do recipi- dência de in- ente gresso de co- rante Abreviações: NS = Não programado; ND = Não detectado; NT = Não testado a vide desvio AMRI D33015 Tabela 11 – Estabilidade acelerada batelada P02315 Produto Fitusiran – solução para injeção – 100 mg/mL No. do lote: P02715 farmacêutico Tamanho do lote: 1,4 L Fabricante: AMRI Recipiente/vedação: Frasco Condição de +40º C± 2º C, 75%±5% RH armazenamento: Orientação de Na vertical armazenamento: Item de teste Critérios de aceitação Tempo Resultados iniciais 1 3 6 mês meses meses Aparência Solução transparente, incolor a amarelo claro essencialmente Aprovado Aprovado Aprovado Aprovado (inspeção visual) livre de particulados Pureza do dúplex NLT % de área 90% 99,2 99,1 99,3 99,4 (IPRP HPLC UV (não desnaturante) Dados relatados (% área) Filamentos simples Soma de % de área relatada de todos os picos ≥0,20% de 0,5 0,5 0,9 0,7 Impurezas área 0,3 ND ND ND Pureza AX HPLC UV Dados relatados (% de área) 43,9 44,1 43,8 43,7 (desnaturante) 50,0 50,9 50,8 51,3 Filamento de senso Soma de % de área relatada de todos os picos ≥0,20% de 93,9 95,0 94,6 95,0 Filamento de antis- área senso 5,6 4,9 5,0 4,8 Filamentos simples to- tais Impurezas Pureza (IPRP HPLC Dados relatados (% de área) 41,0 40,7 41,0 41,0 UV (desnaturante)) 47,7 47,8 48,6 48,0 Filamento de senso Soma de % de área relatada de todos os picos ≥0,20% de 88,7 88,5 89,6 89,0 Filamento de antis- área senso 10,3 10,1 10,0 10,0 Filamentos Simples To- tais Impurezas Ensaio (Absorção de 90 a 110 mg/mL 99 NT 98 97 UV) pH (Ph. Eur. 2.2.3, Dados relatados 6,9 7,0 6,8 6,8 USP <791>) Osmolalidade (Ph. Eur. Dados relatados (mOsm/kg) 295 292 293 296
2.2.35, USO <785>) Matéria particula-da NMT 6.000 por recipiente 50 NS NS 22 (USP <788>) NMT 600 por recipiente 2 NS ≥ 10 μ NS 1 ≥ 25 μ Endotoxinas bacteria- NMT 100 EU/mL 41 NS NS 7 nas Esterilidade Em conformidade Aprovado NS NS Aprovado Abreviações: NS = Não programado Tabela 12 – Estabilidade a Longo Prazo 5º C lote P07916
Produto farma- Fitusiran – solução para injeção – 100 mg/mL No. do lote: P07916 cêutico Tamanho do lote: 2,0 L Fabricante: AMRI Recipiente/ve- Frasco dação: Condição de +5º C± 3º C armazena- mento: Orientação de Invertido armazena- mento: Item de teste Critérios de Tempo aceitação Resultados 1 mês 3 6 9 12 18 24 36 iniciais meses meses meses meses meses meses meses Aparência (ins- Solução transpa- Aprovado Apro- Aprovado Aprovado Aprovado Aprovado Aprovado Aprovado Aprovado peção visual) rente, incolor a vado amarelo claro es- sencialmente livre de particulados Pureza do dú- NLT % de área 90 98,5 98,5 98,5 98,5 98,6 98,6 98,5 plex (IPRP HPLC UV (não desna- turante) Dados relatados (% 0,7 0,6 0,7 0,7 0,7 0,7 Filamentos sim- área) 0,7 ples Soma de % de área relatada de to- 0,8 0,9 0,9 0,8 0,7 0,8 Impurezas dos os picos 0,9 ≥0,20% de área Pureza AX HPLC 44,5 44,5 45,0 44,9 44,5 44,3 44,2 UV (desnatu- 50,3 50,3 50,8 50,7 50,4 50,1 50,0 rante) Dados relatados (% 94,7 94,7 96,8 95,5 94,8 94,4 94,3 Filamento de de área) senso 5,1 5,1 4,0 4,2 4,9 5,6 5,6 Não disponível ainda Filamento de an- Soma de % de tissenso área relatada de to- Filamentos sim- dos os picos ples totais ≥0,20% de área Impurezas Pureza (IPRP 42,0 41,8 42,5 43,7 40,6 40,6 41,7 HPLC UV (des- 46,9 48,5 48,7 77,9 46,0 46,0 46,3 naturante)) Dados relatados (% 88,9 90,3 91,2 91,6 86,6 86,7 88,0 Filamento de de área) senso 10,9 9,2 8,6 8,2 13,2 13,0 11,9 Filamento de an- Soma de % de tissenso área relatada de to- Filamentos Sim- dos os picos ples Totais ≥0,20% de área Impurezas Ensaio (Absor- 90 a 110 mg/mL 100 100 101 101 102 101 101 ção de UV) pH (Ph. Eur. Dados relatados 7,1 7,0 7,0 7,0 7,1 7,0 7,0
2.2.3, USP <791>) Osmolalidade Dados relatados 307 308 306 306 309 308 307 (Ph. Eur. 2.2.35, (mOsm/kg) USO <785>) Matéria particula- NMT 6.000 por re- 22 NS NS NS NS 31 NS da (USP <788>) cipiente ≥ 10 μ NMT 600 por reci- 1 NS NS NS NS 2 NS ≥ 25 μ piente Endotoxinas bac- NMT 100 EU/mL 0,6 NS NS NS NS <0,1 NS terianas Esterilidade Em conformidade Aprovado NS NS NS NS NS NS Integridade de Nenhuma evidên- NS NS NS NS NS APROVADO NS Fechamento do cia de ingresso de recipiente corante Abreviações: NS = Não programado; ND = Não detectado Tabela 13 – Estabilidade a Longo Prazo 25º C/60% RH lote P07916 Produto farmacêutico Fitusiran – solução para injeção – 100 mg/mL No. do lote: P07916 Tamanho do lote: 2,0 L Fabricante: AMRI Recipiente/vedação: Frasco Condição de +25º C± 2º C/60%±5% RH armazenamento: Orientação de Invertido armazenamento: Item de teste Critérios de Tempo aceitação Resulta- 1 mês 3 meses 6 meses 9 meses 12 meses 18 meses 24 meses 36 dos inici- me- ais ses Aparência Solução transpa- Aprovado Apro- Aprovado Aprovado Aprovado Aprovado Aprovado (inspeção visual) rente, incolor a vado amarelo claro es- sencialmente li- vre de particula- dos Pureza do dúplex NLT % de área 98,5 98,6 98,6 98,4 98,6 98,5 98,4 (IPRP HPLC UV (não 90 desnaturante) Filamentos simples 0,7 0,7 0,6 0,7 0,7 0,7 0,7 Dados relatados Impurezas (% área) 0,9 0,8 0,8 0,9 0,7 0,7 0,9 Soma de % de área relatada de todos os picos ≥0,20% de área Pureza AX HPLC UV Dados relatados 44,5 44,6 45,0 44,7 44,5 44,3 44,2 (desnaturante) (% de área) 50,3 50,6 50,8 50,7 50,4 50,0 50,1 Não disponível ainda Filamento de senso 94,7 95,2 95,8 95,4 94,9 94,2 94,3 Filamento de antis- Soma de % de 5,1 4,6 4,1 4,3 4,8 5,7 5,5 senso área relatada de Filamentos simples to- todos os picos tais ≥0,20% de área Impurezas Pureza (IPRP HPLC Dados relatados 42,0 42,1 42,8 44,2 40,2 40,2 41,7 UV (desnaturante)) (% de área) 46,9 49,3 48,9 48,3 45,5 45,8 46,4 Filamento de senso 88,9 91,4 91,6 92,5 85,8 86,0 88,1 Filamento de antis- Soma de % de 10,9 8,2 8,2 7,3 14,0 13,8 11,8 senso área relatada de Filamentos Simples To- todos os picos tais ≥0,20% de área Impurezas Ensaio (Absorção de 90 a 110 mg/mL 100 100 101 101 98 100 101 UV) pH (Ph. Eur. 2.2.3, Dados relatados 7,1 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 USP <791>) Osmolalidade (Ph. Eur. Dados relatados 307 308 308 309 310 310 309
2.2.35, USO <785>) (mOsm/kg) Matéria particula-da NMT 6.000 por 22 NS NS NS NS 209 NS (USP <788>) recipiente ≥ 10 μ NMT 600 por re- 1 NS NS NS 6 NS ≥ 25 μ cipiente NS Endotoxinas bacteria- NMT 100 EU/mL 0,6 NS NS NS NS <0,1 NS nas Esterilidade Em conformi- Aprovado NS NS NS NS NS NS dade Integridade de Fecha- Nenhuma evi- NS NS NS NS NS Aprovado NS mento do recipiente dência de in- gresso de co- rante Abreviações: NS = Não programado; ND = Não detectado Tabela 14 – Estabilidade acelerada batelada P07916 Produto Fitusiran – solução para injeção – 100 mg/mL No. do lote: P07916 farmacêutico Tamanho do lote: 2,0 L Fabricante: AMRI Recipiente/vedação: Frasco Condição de +40º C± 2º C, 75%±5% RH armazenamento: Orientação de Na vertical armazenamento: Item de teste Critérios de aceitação Tempo Resultados iniciais 1 mês 3 meses 6 meses Aparência Solução transparente, incolor a amarelo claro essenci- Aprovado (inspeção visual) almente livre de particulados Pureza do dúplex (IPRP NLT % de área 90% 98,5 98,6 98,6 98,5 HPLC UV (não desnaturante) Filamentos simples
Impurezas Dados relatados (% área) 0,7 0,8 0,7 0,8 Soma de % de área relatada de todos os picos ≥0,20% 0,9 0,7 0,7 0,7 de área Pureza AX HPLC UV (desna- turante) Filamento de senso Dados relatados (% de área) 44,5 44,4 44,8 44,5 Filamento de antissenso 50,3 50,3 50,9 50,6 Filamentos simples totais 94,7 94,7 95,7 95,1 Impurezas Soma de % de área relatada de todos os picos ≥0,20% 5,1 5,1 4,1 4,6 de área Pureza (IPRP HPLC UV (des- naturante)) Filamento de senso Dados relatados (% de área) 42,0 42,1 42,7 44,2 Filamento de antissenso 46,9 48,7 48,9 48,5 Filamentos Simples Totais 88,9 90,8 91,6 92,7 Impurezas Soma de % de área relatada de todos os picos ≥0,20% 10,9 8,9 8,1 7,2 de área Ensaio (Absorção de UV) 90 a 110 mg/mL 100 100 102 98 pH (Ph. Eur. 2.2.3, USP Dados relatados 7,1 6,9 7,0 6,8 <791>) Osmolalidade (Ph. Eur. Dados relatados (mOsm/kg) 307 308 308 310
2.2.35, USO <785>) Matéria particulada (USP <788>) ≥ 10 μ NMT 6.000 por recipiente 22 NS NS 22 ≥ 25 μ NMT 600 por recipiente 1 NS NS 3 Endotoxinas NMT 100 EU/mL 0,6 NS NS <0,1 bacterianas Esterilidade Em conformidade Aprovado NS NS Aprovado Abreviações: NS = Não programado

Claims (55)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição farmacêutica para inibição de expressão de um gene Serpinc1, caracterizada pelo fato de que compreende um agente ácido ribonucleico de filamento duplo (dsRNA) em uma concen- tração de cerca de 50 mg/mL a cerca de 200 mg/mL e solução salina tamponada com fosfato (PBS) em uma concentração de cerca de 1 mM a cerca de 10 mM, em que o pH e a osmolalidade da composição farmacêutica são adequados para administração subcutânea a um indivíduo, em que o agente dsRNA tem um filamento de senso consis- tindo na sequência de nucleotídeo de 5’- GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfu- AfcUfuCfaAf – 3’ (SEQ ID NO:941) e um filamento de antissenso con- sistindo na sequência de nucleotídeo de 5’- usUfsgAfaGfuAfaAfuggUf- gUfuAfaCfcsasg – 3’ (SEQ ID NO:960), em que a, g, c e u são 2’-O-metila (2’-OMe) A, G, C e U; Af, Gf, Cf e Uf são 2’-flúor A, G, C, U; e s é uma ligação fosforotioato, e em que um ligante é conjugado à extremidade 3’ do filamento de senso por meio de um elemento de ligação, e em que o ligante e o elemento de ligação têm a estrutura que segue:
HO OH
O H H
HO O N N O AcHN HO
O
HO OH O
O N
O H H H
O N N O N
HO O AcHN O
O O O
HO OH
O
HO O N N O
H H AcHN O , em que o agente dsRNA está em forma de ácido livre.
2. Composição farmacêutica para inibição da expressão de um gene Serpinc1, caracterizada pelo fato de que compreende um agente ácido ribonucleico de filamento duplo (dsRNA) em uma concen- tração de cerca de 50 mg/mL a cerca de 200 mg/mL e solução salina tamponada com fosfato (PBS) em uma concentração de cerca de 1 mM a cerca de 10 mM, em que o pH e a osmolalidade da composição farmacêutica são adequados para administração subcutânea a um indivíduo, em que o agente dsRNA tem um filamento de senso consis- tindo na sequência de nucleotídeo de 5’- GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfu- AfcUfuCfaAf – 3’ (SEQ ID NO:941) e um filamento de antissenso con- sistindo na sequência de nucleotídeo de 5’- usUfsgAfaGfuAfaAfuggUf- gUfuAfaCfcsasg – 3’ (SEQ ID NO:960), em que a, g, c e u são 2’-O-metila (2’-OMe) A, G, C e U; Af, Gf, Cf e Uf são 2’-flúor A, G, C, U; e s é uma ligação fosforotioato, e em que um ligante é conjugado à extremidade 3’ do filamento de senso por meio de um elemento de ligação, e em que o ligante e o elemento de ligação têm a estrutura que segue:
HO OH
O H H
HO O N N O AcHN HO
O
HO OH O
O N
O H H H
O N N O N
HO O AcHN O
O O O
HO OH
O
HO O N N O
H H AcHN O , em que o agente dsRNA está em uma forma de sal.
3. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a forma de sal é uma forma de sal de sódio.
4. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que substancialmente todos os grupos fos- fodiéster e/ou fosforotioato no agente compreendem um contraíon de sódio.
5. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que os grupos fosfodiéster e/ou fosforotio- ato no agente compreendem um contraíon de sódio.
6. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a concentração de PBS é entre cerca de 2 mM e cerca de 7 mM.
7. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a concentração de PBS é cerca de 3 a cerca de 6 mM.
8. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a concentração de PBS é cerca de 5 mM.
9. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o pH da com- posição é entre cerca de 5,0 a cerca de 8,0.
10. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 9, caracterizada pelo fato de que o pH da composição é entre cerca de 6,0 a cerca de 8,0.
11. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 10, caracterizada pelo fato de que o pH da composição é entre cerca de 6,5 a cerca de 7,5.
12. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 11, caracterizada pelo fato de que o pH da composição é entre cerca de 6,8 a cerca de 7,2.
13. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que a osmolalidade da composição é entre 50 e cerca de 400 mOsm/kg.
14. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 13, caracterizada pelo fato de que a osmolalidade da composição é entre cerca de 100 e cerca de 400 mOsm/kg.
15. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 14, caracterizada pelo fato de que a osmolalidade da composição é entre cerca de 240 e cerca de 390 mOsm/kg.
16. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 15, caracterizada pelo fato de que a osmolalidade da composição é entre cerca de 290 e cerca de 320 mOsm/kg.
17. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada pelo fato de que a concentra- ção do agente dsRNA na composição farmacêutica é entre cerca de 50 mg/mL e cerca de 150 mg/mL.
18. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 17, caracterizada pelo fato de que a concentração do agente dsRNA na composição farmacêutica é entre cerca de 80 mg/mL e cerca de 110 mg/mL.
19. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 18, caracterizada pelo fato de que a concentração do agente dsRNA na composição farmacêutica é cerca de 100 mg/mL.
20. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizada pelo fato de que a composição é estável por até cerca de 36 meses quando armazenada em cerca de 2º C a cerca de 8ºC.
21. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizada pelo fato de que a composição é estável por até cerca de 36 meses quando armazenada em cerca de 25º C e umidade relativa (RH) de 60%.
22. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizada pelo fato de que a composição é estável por até cerca de 6 meses quando armazenada em cerca de 40º C e umidade relativa (RH) de 75%.
23. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizada pelo fato de que a composição compreende não menos do que (NLT) cerca de 90,5% de área de fila-
mentos dúplex e não mais do que (NMT) cerca de 5% de área de sim- ples conforme determinado através de IPRP-HPLC não desnaturante de pureza.
24. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizada pelo fato de que a composição compreende não menos do que (NLT) cerca de 85,0% de área de fila- mentos simples totais conforme determinado através de AX-HPLC des- naturante de pureza.
25. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizada pelo fato de que a composição compreende não menos do que (NLT) cerca de 80,0% de área de fila- mentos simples totais conforme determinado através de IPRP-HPLC desnaturante de pureza.
26. Frasco, caracterizado pelo fato de que compreende a composição farmacêutica, como definida em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 25.
27. Frasco, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que compreende cerca de 0,5 mL a cerca de 2,0 mL da composição farmacêutica.
28. Frasco, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que compreende cerca de 0,8 ml da composição farmacêu- tica.
29. Seringa, caracterizada pelo fato de que compreende a composição farmacêutica, como definida em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 25.
30. Seringa, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que é uma seringa de 1 ml.
31. Seringa, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que é uma seringa de 3 ml.
32. Seringa, de acordo com qualquer uma das reivindicações
29 a 31, caracterizada pelo fato de que compreende uma agulha de 29 G.
33. Seringa, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 31, caracterizada pelo fato de que compreende uma agulha de 30 G.
34. Composição farmacêutica para inibição de expressão de um gene Serpinc1, caracterizada pelo fato de que compreende um agente ácido ribonucleico de filamento duplo (dsRNA) em uma concen- tração de cerca de 100 mg/mL e solução salina tamponada com fosfato (PBS) em uma concentração de cerca de 5 mM, em que o pH da composição farmacêutica é cerca de 6,8 a cerca de 7,2, em que a osmolalidade da composição farmacêutica é cerca de 300 mOsm/g, em que o agente dsRNA tem um filamento de senso consis- tindo na sequência de nucleotídeo de 5’- GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfu- AfcUfuCfaAf – 3’ (SEQ ID NO:941) e um filamento de antissenso con- sistindo na sequência de nucleotídeo de 5’- usUfsgAfaGfuAfaAfuggUf- gUfuAfaCfcsasg – 3’ (SEQ ID NO:960), em que a, g, c e u são 2′-O-metila (2′-OMe) A, G, C e U; Af, Gf, Cf e Uf são 2′-flúor A, G, C, U; e s é uma ligação fosforotio- ato, e em que o ligante é conjugado à extremidade 3’ do fila- mento de senso por meio de um elemento de ligação, e em que o li- gante e o elemento de ligação têm a estrutura que segue:
HO OH
O H H
HO O N N O AcHN HO
O
HO OH O
O N
O H H H
O N N O N
HO O AcHN O
O O O
HO OH
O
HO O N N O
H H AcHN O , em que o agente dsRNA está em forma de ácido livre.
35. Composição farmacêutica para inibição da expressão de um gene Serpinc1, caracterizada pelo fato de que compreende um agente ácido ribonucleico de filamento duplo (dsRNA) em uma concen- tração de cerca de 106 mg/mL e solução salina tamponada com fosfato (PBS) em uma concentração de cerca de 5 mM, em que o pH da composição farmacêutica é cerca de 6,8 a cerca de 7,2, em que a osmolalidade da composição farmacêutica é cerca de 300 mOsm/kg, em que o agente dsRNA tem um filamento de senso consis- tindo na sequência de nucleotídeo de 5’- GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfu- AfcUfuCfaAf – 3’ (SEQ ID NO:941) e o filamento de antissenso consis- tindo na sequência de nucleotídeo de 5’- usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfu- AfaCfcsasg – 3’ (SEQ ID NO:960), em que a, g, c e u são 2’-O-metila (2’-OMe) A, G, C e U, Af, Gf, Cf e Uf são 2’-flúor A, G, C, U; e s é uma ligação fosforotioato, e em que o ligante é conjugado à extremidade 3’ do mesmo filamento por meio de um elemento de ligação, e em que o ligante e o elemento de ligação têm a estrutura que segue:
HO OH
O H H
HO O N N O AcHN HO
O
HO OH O
O N
O H H H
O N N O N
HO O AcHN O
O O O
HO OH
O
HO O N N O
H H AcHN O , em que o agente dsRNA está em uma forma de sal.
36. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 35, caracterizada pelo fato de que a forma de sal é uma forma de sal de sódio.
37. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 36, caracterizada pelo fato de que substancialmente todos os gru- pos fosfodiéster e/ou fosforotioato no agente compreendem um contra- íon de sódio.
38. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 36, caracterizada pelo fato de que todos os grupos fosfodiéster e/ou fosforotioato no agente compreendem um contraíon de sódio.
39. Composição farmacêutica para inibição da expressão de um gene Serpinc1, caracterizada pelo fato de que compreende um agente ácido ribonucleico de filamento duplo (dsRNA) em uma concen- tração de cerca de 100 mg/mL e solução salina tamponada com fosfato (PBS) em uma concentração de cerca de 5 mM, em que o pH da composição farmacêutica é cerca de 6,8 a cerca de 7,2, em que o agente dsRNA tem um filamento de senso consis- tindo na sequência de nucleotídeo de 5’- GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfu- AfcUfuCfaAf – 3’ (SEQ ID NO:941) e um filamento de antissenso con- sistindo na sequência de nucleotídeo de 5’- usUfsgAfaGfuAfaAfuggUf- gUfuAfaCfcsasg – 3’ (SEQ ID NO:960), em que a, g, c e u são 2’-O-metila (2’-OMe) A, G, C e U; Af, Gf, Cf e Uf são 2’-fluor A, G, C, U; e s é uma ligação fosforotioato, e em que um ligante é conjugado à extremidade 3’ do filamento de senso por meio de um elemento de ligação, e em que o ligante e o elemento de ligação têm a estrutura que segue:
HO OH
O H H
HO O N N O AcHN HO
O
HO OH O
O N
O H H H
O N N O N
HO O AcHN O
O O O
HO OH
O
HO O N N O
H H AcHN O , em que o agente dsRNA está em uma forma de ácido livre.
40. Composição farmacêutica para inibição da expressão de um gene Serpinc1, caracterizada pelo fato de que compreende um agente ácido ribonucleico de filamento duplo (dsRNA) em uma concen- tração de cerca de 106 mg/mL e solução salina tamponada com fosfato (PBS) em uma concentração de cerca de 5 mM, em que o pH da composição farmacêutica é cerca de 6,8 a cerca de 7,2, em que o agente dsRNA tem um filamento de senso consis- tindo na sequência de nucleotídeo de 5’- GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfu- AfcUfuCfaAf – 3’ (SEQ ID NO:941) e um filamento de antissenso con- sistindo na sequência de nucleotídeo de 5’- usUfsgAfaGfuAfaAfuggUf- gUfuAfaCfcsasg – 3’ (SEQ ID NO:960), em que a, g, c e u são 2’-O-metila (2’-OMe) A, G, C e U; Af, Gf,, Cf e Uf são 2’-flúor A, G, C, U; e s é uma ligação fosforotioato, e em que um ligante é conjugado à extremidade 3’ do filamento de senso por meio de um elemento de ligação, e em que o ligante e o elemento de ligação têm a estrutura que segue:
HO OH
O H H
HO O N N O AcHN HO
O
HO OH O
O N
O H H H
O N N O N
HO O AcHN O
O O O
HO OH
O
HO O N N O
H H AcHN O , em que o agente dsRNA está em uma forma de sal.
41. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 40, caracterizada pelo fato de que a composição é estável por até cerca de 36 meses quando armazenada em cerca de 2ºC a cerca de 8ºC.
42. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 40, caracterizada pelo fato de que a composição é estável por até cerca de 36 meses quando armazenada em cerca de
25ºC e umidade relativa (RH) de 60%.
43. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 40, caracterizada pelo fato de que a composição é estável por até cerca de 6 meses quando armazenada em cerca de 40ºC e umidade relativa (RH) de 75%.
44. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 40, caracterizada pelo fato de que a composição compreende não menos do que (NLT) cerca de 95,0% de área de fila- mentos dúplex e não mais do que (NMT) cerca de 5% de área de sim- ples conforme determinado através de IPRP-HPLC não desnaturante de pureza.
45. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 44, caracterizada pelo fato de que a composição compreende não menos do que (NLT) cerca de 85,0% de área de fila- mentos simples totais conforme determinado através de AX-HPLC des- naturante de pureza.
46. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 44, caracterizada pelo fato de que a composição compreende não menos do que (NLT) cerca de 80,0% de área de fila- mentos simples totais conforme determinado através de IPRP-HPLC desnaturante de pureza.
47. Frasco, caracterizado pelo fato de que compreende a composição farmacêutica, como definida em qualquer uma das reivindi- cações 34 a 46.
48. Frasco, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o frasco compreende cerca de 0,5 mL a cerca de 2,0 mL da composição farmacêutica.
49. Frasco, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que o frasco compreende cerca de 0,8 ml da composição farmacêutica.
50. Seringa, caracterizada pelo fato de que compreende a composição farmacêutica, como definida em qualquer uma das reivindi- cações 34 a 46.
51. Seringa, de acordo com a reivindicação 50, caracterizada pelo fato de que a seringa é uma seringa de 1 ml.
52. Seringa, de acordo com a reivindicação 50, caracterizada pelo fato de que a seringa é uma seringa de 3 ml.
53. Seringa, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 52, caracterizada pelo fato de que a seringa compreende uma agu- lha de 29 G.
54. Seringa, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 52, caracterizada pelo fato de que a seringa compreende uma agu- lha de 30 G.
55. Seringa, de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 52, caracterizada pelo fato de que a seringa é uma seringa pré- enchida.
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