JP2022517270A - Ｓｅｒｐｉｎｃ１ ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤を含む医薬組成物およびそのような組成物を使用して（例えばインヒビターのあるまたはない）血友病を有する対象における出血イベントを処置する方法に関する。

Description

関連出願
本出願は、２０１９年１月１６日に出願された、米国仮特許出願第６２／７９３，０２０号の優先権の利益を主張し、その内容全体を参照によって本明細書に組み入れる。
本出願は、２０１８年７月１０日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４１４００号、２０１７年７月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／５３０，５１８号、２０１７年１２月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／５９９，２２３号、２０１８年１月５日に出願された米国仮特許出願第６２／６１４，１１１号、および２０１８年５月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／６７３，４２４号に関連する。上述の特許出願のそれぞれの内容全体を参照によって本明細書に組み入れる。
本出願はまた、２０１６年１２月７日に出願された米国特許出願第１５／３７１，３００号、２０１６年１２月７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５２４５号、２０１５年１２月７日に出願された米国仮特許出願第６２／２６４，０１３号、２０１６年３月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／３１５，２２８号、２０１６年７月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／３６６，３０４号および２０１６年１２月２日に出願された米国仮特許出願第６２／４２９，２４１号に関連する。上述の特許出願のそれぞれの内容全体を参照によって本明細書に組み入れる。
さらに、本出願は、２０１４年５月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／９９２，０５７号、２０１４年１２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／０８９，０１８号、２０１５年１月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／１０２，２８１号および２０１５年５月１２日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３０３３７号に関連する。上述の特許出願のそれぞれの内容全体を参照によって本明細書に組み入れる。
本出願はまた、２０１２年４月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／６３８，９５２号、２０１２年７月９日に出願された米国仮特許出願第６１／６６９，２４９号、２０１２年１２月７日に出願された米国仮特許出願第６１／７３４，５７３号、２０１３年３月１５日に出願された米国特許出願第１３／８３７，１２９号、現在の米国特許第９，１２７，２７４号、２０１５年７月２２日に出願された米国特許出願第１４／８０６，０８４号、現在の米国特許第９，３７６，６８０号、２０１６年３月１５日に出願された米国特許出願第１５／０７０，３５８号、２０１８年４月１８日に出願された米国特許出願第１５／９５５，８７３号、２０１８年１２月１４日に出願された米国特許出願第１６／２２０，１５７号および２０１３年４月２５日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３８２１８号に関連する。本出願はまた、２０１２年１１月１６日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６５６０１号に関連する。上述の特許出願のそれぞれの内容全体を参照によって本明細書に組み入れる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体を参照によって組み入れる。２０２０年１月７日作成の前記ＡＳＣＩＩコピーは、名称１１７８１１＿０３０２０＿ＳＬ．ＴＸＴであり、サイズは２０，９９７バイトである。
Ｓｅｒｐｉｎｃ１は、セリンプロテイナーゼインヒビター（ｓｅｒｐｉｎ）スーパーファミリーの一員である。Ｓｅｒｐｉｎｃ１は、トロンビンならびに凝血系の他の活性化セリンプロテアーゼ、例えば第Ｘ因子、第ＩＸ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子および第ＶＩＩ因子を阻害することにより、血液凝血カスケードを調節する血漿プロテアーゼインヒビターである。Ｓｅｒｐｉｎｃ１の抗凝固活性は、ヘパリンおよびトロンビン：抗トロンビン（ＴＡＴ）複合体の形成を触媒する他の関連するグリコサミノグリカンの存在により増強される。
出血障害は、遺伝性または後天性のいずれであっても、不十分な血液凝固が存在する症状である。例えば血友病は、血液凝固または凝血を制御する身体の能力を損なわせる遺伝性の遺伝学的出血障害の群である。血友病Ａは、機能的な凝固第ＶＩＩＩ因子の欠損を伴う劣性Ｘ－連鎖遺伝学的障害であり、血友病症例の８０％を示す。血友病Ｂは、機能的な凝固第ＩＸ因子の欠損を伴う劣性Ｘ－連鎖遺伝学的障害である。これは血友病症例の約２０％を含む。血友病Ｃは、機能的な凝固第ＸＩ因子の欠損を伴う常染色体遺伝学的障害である。血友病Ｃは完全には劣性ではなく、ヘテロ接合型の個体も出血の増加を示す。
血友病については現在治療法が存在しないが、欠損している凝固因子、例えば血友病Ａにおいては第ＶＩＩＩ因子の定期的な輸注により制御することができる。しかし、いくつかの血友病は、投与された補充因子に対する抗体（インヒビター）を産生することにより、補充凝血因子に対して不応性になる。したがって、そのような対象における出血は適当に制御することができない。
治験的に１か月に１回皮下投与される、抗トロンビン（ＡＴ）を標的とするＲＮＡｉ治療剤フィツシランは近年、インヒビターのあるおよびない血友病ＡおよびＢの処置のために開発されており、そのような治療剤を含む安定な医薬組成物は、出血障害、例えば血友病を有する対象の代替的な処置として当技術分野において必要とされている。
本発明は、少なくとも部分的に、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤を含む他の組成物と比較して、安定性、効能、耐久性および投与のしやすさが改善されている、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ剤を含む安定な医薬組成物の発見に基づいている。そのような医薬組成物は、出血障害、例えば血友病を有する対象の処置に有用である。
したがって、一態様において、本発明は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であって、約５０ｍｇ／ｍＬから約２００ｍｇ／ｍＬの濃度の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤および約１ｍＭから約１０ｍＭの濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む医薬組成物を提供し、ここで、医薬組成物のｐＨは、対象への皮下投与に適切であり、ｄｓＲＮＡ剤は、５’－ＧｆｓｇｓＵｆｕＡｆａＣｆａＣｆＣｆＡｆｕＵｆｕＡｆｃＵｆｕＣｆａＡｆ－３’（配列番号９４１）のヌクレオチド配列からなるセンス鎖および５’－ｕｓＵｆｓｇＡｆａＧｆｕＡｆａＡｆｕｇｇＵｆｇＵｆｕＡｆａＣｆｃｓａｓｇ－３’（配列番号９６０）のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖を有し、ここで、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、Ｃｆ、およびＵｆは２’－フルオロＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕであり；ｓはホスホロチオエート結合であり、ここで、リガンドはリンカーを介してセンス鎖の３’末端にコンジュゲートしており、リガンドおよびリンカーは次の構造を有し：
Figure 2022517270000001
 ここで、ｄｓＲＮＡ剤は遊離酸形態である。
他の態様において、本発明は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であって、約５０ｍｇ／ｍＬから約２００ｍｇ／ｍＬの濃度の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤および約１ｍＭから約１０ｍＭの濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む医薬組成物を提供し、ここで、医薬組成物のｐＨは、対象への皮下投与に適切であり、ｄｓＲＮＡ剤は、５’－ＧｆｓｇｓＵｆｕＡｆａＣｆａＣｆＣｆＡｆｕＵｆｕＡｆｃＵｆｕＣｆａＡｆ－３’（配列番号９４１）のヌクレオチド配列からなるセンス鎖および５’－ｕｓＵｆｓｇＡｆａＧｆｕＡｆａＡｆｕｇｇＵｆｇＵｆｕＡｆａＣｆｃｓａｓｇ－３’（配列番号９６０）のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖を有し、ここで、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、Ｃｆ、およびＵｆは２’－フルオロＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕであり；ｓはホスホロチオエート結合であり、リガンドはリンカーを介してセンス鎖の３’末端にコンジュゲートしており、リガンドおよびリンカーは次の構造を有し：
Figure 2022517270000002
 ここで、ｄｓＲＮＡ剤は塩形態である。
一態様において、本発明は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であって、約５０ｍｇ／ｍＬから約２００ｍｇ／ｍＬの濃度の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤および約１ｍＭから約１０ｍＭの濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む医薬組成物を提供し、ここで、医薬組成物のｐＨおよびモル浸透圧濃度は対象への皮下投与に適切であり、ｄｓＲＮＡ剤は、５’－ＧｆｓｇｓＵｆｕＡｆａＣｆａＣｆＣｆＡｆｕＵｆｕＡｆｃＵｆｕＣｆａＡｆ－３’（配列番号９４１）のヌクレオチド配列からなるセンス鎖および５’－ｕｓＵｆｓｇＡｆａＧｆｕＡｆａＡｆｕｇｇＵｆｇＵｆｕＡｆａＣｆｃｓａｓｇ－３’（配列番号９６０）のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖を有し、ここで、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、Ｃｆ、およびＵｆは２’－フルオロＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕであり；ｓはホスホロチオエート結合であり、リガンドはリンカーを介してセンス鎖の３’末端にコンジュゲートしており、リガンドおよびリンカーは以下の構造を有し：
Figure 2022517270000003
 ここで、ｄｓＲＮＡ剤は遊離酸形態である。
他の態様において、本発明は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であって、約５０ｍｇ／ｍＬから約２００ｍｇ／ｍＬの濃度の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤および約１ｍＭから約１０ｍＭの濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む医薬組成物を提供し、ここで、医薬組成物のｐＨおよびモル浸透圧濃度は対象への皮下投与に適切であり、ｄｓＲＮＡ剤は、５’－ＧｆｓｇｓＵｆｕＡｆａＣｆａＣｆＣｆＡｆｕＵｆｕＡｆｃＵｆｕＣｆａＡｆ－３’（配列番号９４１）のヌクレオチド配列からなるセンス鎖および５’－ｕｓＵｆｓｇＡｆａＧｆｕＡｆａＡｆｕｇｇＵｆｇＵｆｕＡｆａＣｆｃｓａｓｇ－３’（配列番号９６０）のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖を有し、ここで、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、Ｃｆ、およびＵｆは２’－フルオロＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕであり；ｓはホスホロチオエート結合であり、リガンドはリンカーを介してセンス鎖の３’末端にコンジュゲートしており、リガンドおよびリンカーは次の構造を有し：
Figure 2022517270000004
 ここで、ｄｓＲＮＡ剤は塩形態である。
ｄｓＲＮＡの塩形態は、ナトリウム塩形態であってもよい。
一実施形態において、剤中のホスホジエステルおよび／またはホスホロチオエート基の実質的に全てはナトリウム対イオンを含む。他の実施形態において、剤中のホスホジエステルおよび／またはホスホロチオエート基は全て、ナトリウム対イオンを含む。
医薬組成物中のＰＢＳの濃度は、約２ｍＭと約７ｍＭとの間；約３から約６ｍＭの間；または約５ｍＭであってもよい。
医薬組成物のｐＨは、約５．０から約８．０の間；約６．０から約８．０の間；約６．５から約７．５の間；または約６．８から約７．２の間であってもよい。
医薬組成物のモル浸透圧濃度は、約５０と約４００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間；約１００と約４００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間；約２４０と約３９０ｍＯｓｍ／ｋｇとの間；または約２９０と約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇとの間であってもよい。
医薬組成物中のｄｓＲＮＡ剤の濃度は、約５０ｍｇ／ｍＬと約１５０ｍｇ／ｍＬとの間；約８０ｍｇ／ｍＬと約１１０ｍｇ／ｍＬとの間；または約１００ｍｇ／ｍＬであってもよい。
一実施形態において、組成物は約２℃から約８℃で保存した場合に約６か月から約３６か月安定である。他の実施形態において、組成物は約２５℃および６０％の相対湿度（ＲＨ）で保存した場合に約６か月から約３６か月安定である。さらに他の実施形態において、組成物は約４０℃および７５％の相対湿度（ＲＨ）で保存した場合に約６か月安定である。
他の実施形態において、組成物は約２℃から約８℃で保存した場合に最長約３６か月安定である。他の実施形態において、組成物は約２５℃および６０％の相対湿度（ＲＨ）で保存した場合に最長約３６か月安定である。さらに他の実施形態において、組成物は約４０℃および７５％の相対湿度（ＲＨ）で保存した場合に最長約６か月安定である。
一実施形態において、組成物は純度非変性ＩＰＲＰ－ＨＰＬＣによって決定される、少なくとも（ＮＬＴ）約９５．０面積％の二重鎖および多くとも（ＮＭＴ）約５面積％の二重鎖の総不純物を含む。
一実施形態において、組成物は純度変性ＡＸ－ＨＰＬＣによって決定される、少なくとも（ＮＬＴ）約８５．０面積％の総一本鎖を含む。
一実施形態において、組成物は純度変性ＩＰＲＰ－ＨＰＬＣによって決定される、少なくとも（ＮＬＴ）約８０．０面積％の総一本鎖を含む。
本発明はまた、本発明の医薬組成物を含むバイアルおよびシリンジを提供する。
バイアルは、約０．５ｍＬから約２．０ｍｌの医薬組成物；または約０．８ｍｌの医薬組成物を含んでいてもよい。
本発明のシリンジは、１ｍｌシリンジ；または３ｍｌシリンジであってもよい。一実施形態において、シリンジは１ｍｌ使い捨てシリンジである。
本発明のシリンジは、２９Ｇニードル；または３０Ｇニードルを含んでいてもよい。一実施形態において、ニードルは２９Ｇニードルである。
一態様において、本発明は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であって、約１００ｍｇ／ｍＬの濃度の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤および約５ｍＭの濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む医薬組成物を提供し、ここで、医薬組成物のｐＨは約６．８から約７．２であり、ｄｓＲＮＡ剤は５’－ＧｆｓｇｓＵｆｕＡｆａＣｆａＣｆＣｆＡｆｕＵｆｕＡｆｃＵｆｕＣｆａＡｆ－３’（配列番号９４１）のヌクレオチド配列からなるセンス鎖および５’－ｕｓＵｆｓｇＡｆａＧｆｕＡｆａＡｆｕｇｇＵｆｇＵｆｕＡｆａＣｆｃｓａｓｇ－３’（配列番号９６０）のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖を有し、ここで、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、Ｃｆ、およびＵｆは２’－フルオロＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕであり；ｓはホスホロチオエート結合であり、リガンドはリンカーを介してセンス鎖の３’末端にコンジュゲートしており、リガンドおよびリンカーは次の構造を有し：
Figure 2022517270000005
 ここで、ｄｓＲＮＡ剤は遊離酸形態である。
他の態様において、本発明は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であって、約１０６ｍｇ／ｍＬの濃度の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）および約５ｍＭの濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む医薬組成物を提供し、ここで、医薬組成物のｐＨは約６．８から約７．２であり、ｄｓＲＮＡ剤は５’－ＧｆｓｇｓＵｆｕＡｆａＣｆａＣｆＣｆＡｆｕＵｆｕＡｆｃＵｆｕＣｆａＡｆ－３’（配列番号９４１）のヌクレオチド配列からなるセンス鎖および５’－ｕｓＵｆｓｇＡｆａＧｆｕＡｆａＡｆｕｇｇＵｆｇＵｆｕＡｆａＣｆｃｓａｓｇ－３’（配列番号９６０）のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖を有し、ここで、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、Ｃｆ、およびＵｆは２’－フルオロＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕであり；ｓはホスホロチオエート結合であり、リガンドはリンカーを介してセンス鎖の３’末端にコンジュゲートしており、リガンドおよびリンカーは次の構造を有し：
Figure 2022517270000006
 ここで、ｄｓＲＮＡ剤は塩形態である。
一態様において、本発明は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であって、約１００ｍｇ／ｍＬの濃度の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤および約５ｍＭの濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む医薬組成物を提供し、ここで、医薬組成物のｐＨは約６．８から約７．２であり、医薬組成物のモル浸透圧濃度は約３００ｍＯｓｍ／ｋｇであり、ｄｓＲＮＡ剤は５’－ＧｆｓｇｓＵｆｕＡｆａＣｆａＣｆＣｆＡｆｕＵｆｕＡｆｃＵｆｕＣｆａＡｆ－３’（配列番号９４１）のヌクレオチド配列からなるセンス鎖および５’－ｕｓＵｆｓｇＡｆａＧｆｕＡｆａＡｆｕｇｇＵｆｇＵｆｕＡｆａＣｆｃｓａｓｇ－３’（配列番号９６０）のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖を有し、ここで、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、Ｃｆ、およびＵｆは２’－フルオロＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕであり；ｓはホスホロチオエート結合であり、リガンドはリンカーを介してセンス鎖の３’末端にコンジュゲートしており、リガンドおよびリンカーは次の構造を有し：
Figure 2022517270000007
 ここで、ｄｓＲＮＡ剤は遊離酸形態である。
他の態様において、本発明は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であって、約１０６ｍｇ／ｍＬの濃度の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤および約５ｍＭの濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む医薬組成物を提供し、ここで、医薬組成物のｐＨは約６．８から約７．２であり、医薬組成物のモル浸透圧濃度は約３００ｍＯｓｍ／ｋｇであり、ｄｓＲＮＡ剤は５’－ＧｆｓｇｓＵｆｕＡｆａＣｆａＣｆＣｆＡｆｕＵｆｕＡｆｃＵｆｕＣｆａＡｆ－３’（配列番号９４１）のヌクレオチド配列からなるセンス鎖および５’－ｕｓＵｆｓｇＡｆａＧｆｕＡｆａＡｆｕｇｇＵｆｇＵｆｕＡｆａＣｆｃｓａｓｇ－３’（配列番号９６０）のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖を有し、ここで、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、Ｃｆ、およびＵｆは２’－フルオロＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕであり；ｓはホスホロチオエート結合であり、リガンドはリンカーを介してセンス鎖の３’末端にコンジュゲートしており、リガンドおよびリンカーは次の構造を有し：
Figure 2022517270000008
 ここで、ｄｓＲＮＡ剤は塩形態である。
一実施形態において、塩形態はナトリウム塩形態である。
一実施形態において、剤中のホスホジエステルおよび／またはホスホロチオエート基の実質的に全てはナトリウム対イオンを含む。他の実施形態において、剤中のホスホジエステルおよびホスホロチエート基は全て、ナトリウム対イオンを含む。
一実施形態において、組成物は約２℃から約８℃で保存した場合に約６か月から約３６か月の間安定である。他の実施形態において、組成物は約２５℃および６０％の相対湿度（ＲＨ）で保存した場合に約６か月から約３６か月の間安定である。さらに他の実施形態において、組成物は約４０℃および７５％の相対湿度（ＲＨ）で保存した場合に約６か月安定である。
一実施形態において、組成物は約２℃から約８℃で保存した場合に最長約３６か月安定である。他の実施形態において、組成物は約２５℃および６０％の相対湿度（ＲＨ）で保存した場合に最長約３６か月安定である。さらに他の実施形態において、組成物は約４０℃および７５％の相対湿度（ＲＨ）で保存した場合に最長６か月安定である。
一実施形態において、組成物は、純度非変性ＩＰＲＰ－ＨＰＬＣによって決定される、少なくとも（ＮＬＴ）約９５．０面積％の二重鎖および多くとも（ＮＭＴ）約５面積％の二重鎖の総不純物を含む。
一実施形態において、組成物は、純度変性ＡＸ－ＨＰＬＣによって決定される、少なくとも（ＮＬＴ）約８５．０面積％の総一本鎖を含む。
一実施形態において、組成物は、純度変性ＩＰＲＰ－ＨＰＬＣによって決定される、少なくとも（ＮＬＴ）約８０．０面積％の総一本鎖を含む。
本発明はまた、上述の医薬組成物を含むバイアルを提供する。バイアルは、約０．５ｍＬから約２．０ｍｌの医薬組成物；または約０．８ｍｌの医薬組成物を含んでいてもよい。
本発明は、上述の医薬組成物を含むシリンジをさらに提供する。
本発明のシリンジは、１ｍｌシリンジ；または３ｍｌシリンジであってよい。一実施形態において、シリンジは１ｍｌ使い捨てシリンジである。
本発明のシリンジは、２９Ｇニードル；または３０Ｇニードルを含んでいてもよい。一実施形態において、ニードルは２９Ｇニードルである。
一実施形態において、シリンジは事前充填シリンジである。
他の態様において、本発明は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害するための約０．８ｍｌの医薬組成物を含む２ｍｌバイアルを提供し、ここで、医薬組成物は、約１０６ｍｇ／ｍＬの濃度の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤および約５ｍＭの濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含み、医薬組成物のｐＨは約６．８から約７．２であり、医薬組成物のモル浸透圧濃度は約３００ｍＯｓｍ／ｋｇであり、ｄｓＲＮＡ剤は、５’－ＧｆｓｇｓＵｆｕＡｆａＣｆａＣｆＣｆＡｆｕＵｆｕＡｆｃＵｆｕＣｆａＡｆ－３’（配列番号９４１）のヌクレオチド配列からなるセンス鎖および５’－ｕｓＵｆｓｇＡｆａＧｆｕＡｆａＡｆｕｇｇＵｆｇＵｆｕＡｆａＣｆｃｓａｓｇ－３’（配列番号９６０）のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖を有し、ここで、ａ、ｇ、ｃ，およびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ，およびＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、Ｃｆ，およびＵｆは２’－フルオロＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕであり；ｓはホスホロチオエート結合であり、リガンドはリンカーを介してセンス鎖の３’末端にコンジュゲートしており、リガンドおよびリンカーは次の構造を有し：
Figure 2022517270000009
 ここで、ｄｓＲＮＡ剤はナトリウム塩形態であり、剤中のホスホジエステルおよび／またはホスホロチオエート基は全て、ナトリウム対イオンを含む。
他の態様において、本発明は、２９Ｇニードルを含む１ｍｌ事前充填使い捨てシリンジを提供し、ここで、シリンジは、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害するための約０．８ｍｌの医薬組成物を含み、医薬組成物は、約１０６ｍｇ／ｍＬの濃度の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤および約５ｍＭの濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含み、医薬組成物のｐＨは約６．８から約７．２であり、医薬組成物のモル浸透圧濃度は約３００ｍＯｓｍ／ｋｇであり、ｄｓＲＮＡ剤は５’－ＧｆｓｇｓＵｆｕＡｆａＣｆａＣｆＣｆＡｆｕＵｆｕＡｆｃＵｆｕＣｆａＡｆ－３’（配列番号９４１）のヌクレオチド配列からなるセンス鎖および５’－ｕｓＵｆｓｇＡｆａＧｆｕＡｆａＡｆｕｇｇＵｆｇＵｆｕＡｆａＣｆｃｓａｓｇ－３’（配列番号９６０）のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖を有し、ここで、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、Ｃｆ、およびＵｆは２’－フルオロＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕであり；ｓはホスホロチオエート結合であり、リガンドはリンカーを介してセンス鎖の３’末端にコンジュゲートしており、リガンドおよびリンカーは次の構造を有し：
Figure 2022517270000010
 ここで、ｄｓＲＮＡ剤はナトリウム塩形態であり、剤中のホスホジエステルおよび／またはホスホロチオエート基は全て、ナトリウム対イオンを含む．
他の態様において、本発明は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害するための約０．８ｍｌの医薬組成物を含む２ｍｌバイアルを提供し、ここで、医薬組成物は約１０６ｍｇ／ｍＬの濃度の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤および約５ｍＭの濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含み、医薬組成物のｐＨは約６．８から約７．２であり、医薬組成物のモル浸透圧濃度は約３００ｍＯｓｍ／ｋｇであり、ｄｓＲＮＡ剤は次の構造を有し
Figure 2022517270000011
 式中、Ａｍ、Ｇｍ、ＣｍおよびＵｍは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、ＣおよびＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、ＣｆおよびＵｆは２’－フルオロＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕであり；ｓはホスホロチオエート結合であり；Ｌ９６は次の構造を有するリガンドおよびリンカーであり：
Figure 2022517270000012
 ここで、ｄｓＲＮＡ剤はナトリウム塩形態であり、剤中のホスホジエステルおよび／またはホスホロチオエート基は全て、ナトリウム対イオンを含む。
他の態様において、本発明は、２９Ｇニードルを含む１ｍｌ事前充填使い捨てシリンジを提供し、ここで、シリンジは、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害するための約０．８ｍｌの医薬組成物を含み、医薬組成物は、約１０６ｍｇ／ｍＬの濃度の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤および約５ｍＭの濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含み、医薬組成物のｐＨは約６．８から約７．２であり、医薬組成物のモル浸透圧濃度は約３００ｍＯｓｍ／ｋｇであり、ｄｓＲＮＡ剤は構造
Figure 2022517270000013
 を有し、
式中、Ａｍ、Ｇｍ、ＣｍおよびＵｍは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、ＣおよびＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、ＣｆおよびＵｆは２’－フルオロＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕであり；ｓはホスホロチオエート結合であり；Ｌ９６は次の構造を有するリガンドおよびリンカーであり：
Figure 2022517270000014
 ここで、ｄｓＲＮＡ剤はナトリウム塩形態であり、剤中のホスホジエステルおよび／またはホスホロチオエート基は全て、ナトリウム対イオンを含む。
他の態様において、本発明は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害するための約０．８ｍｌの医薬組成物を含む２ｍｌバイアルを提供し、ここで、医薬組成物は、約１０６ｍｇ／ｍＬの濃度の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤および約５ｍＭの濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含み、医薬組成物のｐＨは約６．８から約７．２であり、ｄｓＲＮＡ剤は、５’－ＧｆｓｇｓＵｆｕＡｆａＣｆａＣｆＣｆＡｆｕＵｆｕＡｆｃＵｆｕＣｆａＡｆ－３’（配列番号９４１）のヌクレオチド配列からなるセンス鎖および５’－ｕｓＵｆｓｇＡｆａＧｆｕＡｆａＡｆｕｇｇＵｆｇＵｆｕＡｆａＣｆｃｓａｓｇ－３’（配列番号９６０）のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖を有し、ここで、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、Ｃｆ、およびＵｆは２’－フルオロＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕであり；ｓはホスホロチオエート結合であり、リガンドはリンカーを介してセンス鎖の３’末端にコンジュゲートしており、リガンドおよびリンカーは次の構造を有し：
Figure 2022517270000015
 ここで、ｄｓＲＮＡ剤はナトリウム塩形態であり、剤中のホスホジエステルおよび／またはホスホロチオエート基は全て、ナトリウム対イオンを含む。
他の態様において、本発明は、２９Ｇニードルを含む１ｍｌ事前充填使い捨てシリンジを提供し、ここで、シリンジは、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害するための約０．８ｍｌの医薬組成物を含み、医薬組成物は、約１０６ｍｇ／ｍＬの濃度の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤および約５ｍＭの濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含み、医薬組成物のｐＨは約６．８から約７．２であり、ｄｓＲＮＡ剤は、５’－ＧｆｓｇｓＵｆｕＡｆａＣｆａＣｆＣｆＡｆｕＵｆｕＡｆｃＵｆｕＣｆａＡｆ－３’（配列番号９４１）のヌクレオチド配列からなるセンス鎖および５’－ｕｓＵｆｓｇＡｆａＧｆｕＡｆａＡｆｕｇｇＵｆｇＵｆｕＡｆａＣｆｃｓａｓｇ－３’（配列番号９６０）のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖を有し、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、Ｃｆ、およびＵｆは２’－フルオロＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕであり；ｓはホスホロチオエート結合であり、リガンドはリンカーを介してセンス鎖の３’末端にコンジュゲートしており、リガンドおよびリンカーは次の構造を有し：
Figure 2022517270000016
 ここで、ｄｓＲＮＡ剤はナトリウム塩形態であり、剤中のホスホジエステルおよび／またはホスホロチオエート基は全て、ナトリウム対イオンを含む。
他の態様において、本発明は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害するための約０．８ｍＬの医薬組成物を含む２ｍＬバイアルを提供し、ここで、医薬組成物は、約１０６ｍｇ／ｍＬの濃度の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤および約５ｍＭの濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含み、医薬組成物のｐＨは約６．８から約７．２であり、ｄｓＲＮＡ剤は構造
Figure 2022517270000017
 を有し、
式中、Ａｍ、Ｇｍ、Ｃｍ、およびＵｍは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、Ｃｆ、およびＵｆは２’－フルオロＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕであり；ｓはホスホロチオエート結合であり；Ｌ９６は次の構造を有するリガンドおよびリンカーであり：
Figure 2022517270000018
 ここで、ｄｓＲＮＡ剤はナトリウム塩形態であり、剤中のホスホジエステルおよび／またはホスホロチオエート基は全て、ナトリウム対イオンを含む。
他の態様において、本発明は、２９Ｇニードルを含む１ｍｌ事前充填使い捨てシリンジを提供し、ここで、シリンジは、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害するための約０．８ｍｌの医薬組成物を含み、医薬組成物は、約１０６ｍｇ／ｍＬの濃度の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤および約５ｍＭの濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含み、医薬組成物のｐＨは約６．８から約７．２であり、ｄｓＲＮＡ剤は構造
Figure 2022517270000019
 を有し、
式中、Ａｍ、Ｇｍ、Ｃｍ、およびＵｍは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、Ｃｆ、およびＵｆは２’－フルオロＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕであり；ｓはホスホロチオエート結合であり；Ｌ９６は次の構造を有するリガンドおよびリンカーであり：
Figure 2022517270000020
 ここで、ｄｓＲＮＡ剤はナトリウム塩形態であり、剤中のホスホジエステルおよび／またはホスホロチオエート基は全て、ナトリウム対イオンを含む。
フィツシラン製剤の代表的な非変性イオン対逆相高速液体クロマトグラフィー（ＩＰ ＲＰ－ＨＰＬＣ）クロマトグラムを示す。フィツシラン二重鎖ピークの偶然のわずかな開裂が、ｓｉＲＮＡ二重鎖中のホスホロチオエートの異なる立体異性体の部分的な分解により観察された。フィツシランピークの質量分析解析により、二重鎖ピーク全体を通して等しい比率で両方の一本鎖の予期される質量の存在が確認された。 フィツシラン製剤中の二重鎖中の一本鎖の代表的な変性アニオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＸ－ＨＰＬＣ）クロマトグラムを示す。 フィツシラン製剤中の二重鎖中の一本鎖の代表的な変性イオン対逆相高速液体クロマトグラフィー（ＩＰ ＲＰ－ＨＰＬＣ）クロマトグラムプロファイルを示す。
本発明は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）介在性切断をもたらすｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物を提供する。本発明は、少なくとも部分的に、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ剤を含む他の組成物と比較して、安定性、効能、耐久性および投与しやすさが改善されているそのような剤を含む安定な医薬組成物の発見に基づいている。そのような医薬組成物は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現の阻害および／またはＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現の阻害または低下から利益を得るであろう障害、例えば出血障害、例えば血友病を有する対象を処置するのに有用である。
以下の詳細な説明は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害するｉＲＮＡを含む組成物の作製方法および使用方法ならびにこの遺伝子の発現の阻害および／または低下から利益を得るであろう疾患および障害を有する対象を処置するための組成物、使用および方法を開示する。
Ｉ．定義
本発明がより容易に理解されるために、特定の用語を最初に定義する。さらに、パラメーターの値または値の範囲が記載されている場合はいずれも、記載する値の中間の値または範囲もまたは本発明の一部であると意図されていることは留意されるべきである。
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書中において、１つまたは１つよりも多い（すなわち少なくとも１つ）冠詞の文法的な目的語を指すように使用される。例えば「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または１つを超える要素、例えば複数の要素を意味する。
用語「約」は、本明細書中において、当技術分野における許容の典型的な範囲内にあることを意味する。例えば、「約」は、平均から約２の標準偏差と理解される。特定の実施形態において、約は＋１０％を意味する。特定の実施形態において、約は＋５％を意味する。約が、一連の数または範囲の前に存在する場合、「約」は、一連の数または範囲のそれぞれを改変することができると理解される。
用語「含む」は、本明細書中において、「非限定的に含む」という句を意味し、これと互換可能に使用される。
用語「または」は本明細書中において、明らかに異なると示さない限り、用語「および／または」を意味し、これと互換可能に使用される。
本明細書中において使用する用語「医薬組成物」は、対象、例えばヒト対象における疾患または障害を処置するのに有用な組成物を指す。
用語「医薬品投与」は、ｄｓＲＮＡ剤を含む組成物の、疾患または障害を処置するための対象への送達を指す。したがって、「医薬品投与に適切」、例えば「皮下投与に適切」は、医薬組成物の皮下投与により対象における疾患または障害を処置するために使用し得るｄｓＲＮＡ剤を含む組成物を記載している。医薬組成物は、医薬品投与に適切、例えば皮下投与に適切である。
用語「モル浸透圧濃度」は、溶媒１ｋｇ当たりの溶質のオスモルの数を指す。これは、ｏｓｍｏｌ／ｋｇまたはＯｓｍ／ｋｇを単位として表される。「オスモル」は、化学溶液の浸透圧に寄与する化合物のモル数を記載する測定単位である。
本明細書中において使用する、「Ｓｅｒｐｉｎｃ１」は、細胞内に発現する特定のポリペプチドを指す。Ｓｅｒｐｉｎｃ１は、セルピンペプチダーゼインヒビター、クレードＣ（抗トロンビン；ＡＴ）、メンバー１；抗トロンビンＩＩＩ；ＡＴ３；抗トロンビン；およびヘパリンコファクター１としても知られる。ヒトＳｅｒｐｉｎｃ１ ｍＲＮＡ転写物の配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：２５４５８８０５９（ＮＭ＿０００４８８；配列番号１）に見られる。アカゲザルＳｅｒｐｉｎｃ１ ｍＲＮＡの配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：１５７１６７１６９（ＮＭ＿００１１０４５８３；配列番号２）に見られる。マウスＳｅｒｐｉｎｃ１ ｍＲＮＡの配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：２３７８７４２１６（ＮＭ＿０８０８４４；配列番号３）に見られる。ラットＳｅｒｐｉｎｃ１ ｍＲＮＡの配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：５８８６５６２９（ＮＭ＿００１０１２０２７；配列番号４）に見られる。
本明細書中で使用する用語「Ｓｅｒｐｉｎｃ１」はまた、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の天然起源のＤＮＡ配列変異、例えばＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子中の一塩基多型により、細胞中で発現する特定のポリペプチドも指す。Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子内において多数のＳＮＰが特定されており、例えばＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰにおいて見られる（例えばｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｎｐを参照のこと）。Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子内のＳＮＰの非限定的な例は、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰ受託番号ｒｓ６７７；ｒｓ５８７７；ｒｓ５８７８；ｒｓ５８７９；ｒｓ９４１９８８；ｒｓ９４１９８９；ｒｓ１７９９８７６；ｒｓ１９６３７７１１；ｒｓ２００８９４６；およびｒｓ２２２７５８６において見られる。
本明細書中で使用する、「対象」は動物、例えば哺乳類、例えば霊長類（例えばヒト、非ヒト霊長類、例えばサルおよびチンパンジー）、非霊長類（例えばウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウス、ウマおよびクジラ）または鳥（例えばアヒルまたはガチョウ）である。一実施形態において、対象はヒト、Ｓｅｒｐｉｎｃ１発現の低下から利益を得るであろう疾患、障害または症状について処置または評価をされているヒト；Ｓｅｒｐｉｎｃ１発現の低下から利益を得るであろう疾患、障害または症状について危険性があるヒト；Ｓｅｒｐｉｎｃ１発現の低下から利益を得るであろう疾患、障害または症状を有するヒト；および／または本明細書中に記載する、Ｓｅｒｐｉｎｃ１発現の低下から利益を得るであろう疾患、障害または症状について処置されているヒトである。
本明細書中で使用する用語「阻害する」は、「低下させる」、「サイレンシングする」、「下方制御する」、「抑制する」および他の類似の用語と互換可能に使用され、任意のレベルの阻害を含む。
本明細書中で使用する句「Ｓｅｒｐｉｎｃ１の発現を阻害する」は、任意のＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子（例えばマウスＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子、ラットＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子、サルＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子またはヒトＳｅｒｐｉｎｃ１）ならびにＳｅｒｐｉｎｃ１タンパク質をコードするＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子のバリアントもしくは変異体の発現の阻害を含む。
「Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害する」は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の任意のレベルの阻害、例えばＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制、例えば少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の阻害を含む。
Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子発現に関連する任意の変数のレベル、例えばＳｅｒｐｉｎｃ１ ｍＲＮＡレベル、Ｓｅｒｐｉｎｃ１タンパク質レベル、または例えば、トロンビン産生の潜在能力の指標としてのトロンビン：抗トロンビン複合体レベル、出血時間、プロトロンビン時間（ＰＴ）、血小板数および／または活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）に基づいて評価される。阻害は、これらの変数の１つまたはそれ以上の絶対または相対レベルの、対照レベルと比較した低下によって評価される。対照レベルは、当技術分野で使用されている任意の種類の対照レベル、例えば投与前のベースラインレベルまたは処置されていないか、もしくは対照（例えば緩衝液のみの対照または非活性剤対照）で処置された類似の対象、細胞もしくはサンプルから決定されたレベルであってもよい。
一実施形態において、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子が転写され、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現が阻害されるように処置されている第１の細胞または細胞群において単離または検出されるＳｅｒｐｉｎｃ１ ｍＲＮＡの量が、実質的に第１の細胞または細胞群と同一であるが、そのような処置を受けていない第２の細胞または細胞群（対照細胞）と比較して低下していることにより評価される。阻害の程度は、
Figure 2022517270000021
 から表される。
本明細書中で使用する、ｄｓＲＮＡのような「ＲＮＡｉ剤に細胞を接触させる」という句は、任意の可能な手段により細胞を接触させることを含む。ＲＮＡｉ剤に細胞を接触させることは、インビトロでｉＲＮＡに細胞を接触させること、またはｉＲＮＡにインビボで細胞を接触させることを含む。接触は、直接的または間接的に行われる。したがって、例えばＲＮＡｉ剤は、方法を実施する個体によって物理的に細胞に接触させても、あるいは、ＲＮＡｉ剤が、その後細胞と接触することが可能になる、もしくは引き起こされる状況におかれてもよい。
インビトロで細胞を接触させることは、例えば細胞をＲＮＡｉ剤とインキュベートすることにより行われる。インビボで細胞を接触させることは、例えば細胞が位置する組織内に、またはその付近にＲＮＡｉ剤を注射するか、または他の領域、例えば血流もしくは皮下空間にＲＮＡｉ剤を注射することにより、剤が接触する細胞が位置する組織にその後に到達するように行われる。例えば、ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤を目的の部位、例えば肝臓に向かわせるリガンド、例えばＧａｌＮＡｃ３を含むか、および／または結合していてもよい。インビトロおよびインビボの接触方法の組合せも可能である。例えば、細胞はインビトロでＲＮＡｉ剤と接触し、次いで対象へ移植してもよい。
ＩＩ．本発明の医薬組成物
本発明は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤を含む安定な医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、本明細書中に記載するｄｓＲＮＡ剤およびリン酸緩衝生理食塩水を含み、対象への皮下投与に適切である。ｄｓＲＮＡ剤を含む医薬組成物は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現または活性に関連する疾患または障害、例えばＳｅｒｐｉｎｃ１関連疾患、例えば血友病を処置するのに有用である。本発明の医薬組成物は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害するのに十分な用量で投与される。
一実施形態において、本発明の医薬組成物は、遊離酸形態の本発明のｄｓＲＮＡ剤を含む。他の実施形態において、本発明の医薬組成物は、ナトリウム塩形態の本発明のｄｓＲＮＡ剤を含む。特定の実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡ剤がナトリウム塩形態である場合、ナトリウムイオンは、剤中に存在するホスホジエステルおよび／またはホスホロチオエート基の実質的に全てについて、対イオンとして（電気的な中立性を維持するために）剤中に存在する。実質的に全てのホスホジエステルおよび／またはホスホロチオエート結合がナトリウム対イオンを有する剤は、多くとも５、４、３、２または１つのナトリウム対イオンを持たないホスホジエステルおよび／またはホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡ剤がナトリウム塩形態である場合、ナトリウムイオンは、剤中に存在するホスホジエステルおよび／またはホスホロチオエート結合の全てについての対イオンとして剤中に存在する。
本発明の医薬組成物は、ｄｓＲＮＡ剤を約５０ｍｇ／ｍＬから約２００ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬから約１５０ｍｇ／ｍＬ；約９０ｍｇ／ｍＬから約１１０ｍｇ／ｍＬ、約９０ｍｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬ、または約８０ｍｇ／ｍＬから約１１０ｍｇ／ｍＬ、例えば約５０ｍｇ／ｍＬ、５５ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、６５ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、８５ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、９５ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１０５ｍｇ／ｍＬ、１０６ｍｇ／ｍＬ、１１０ｍｇ／ｍＬ、１１５ｍｇ／ｍＬ、１２０ｍｇ／ｍＬ、１２５ｍｇ／ｍＬ、１３０ｍｇ／ｍＬ、１３５ｍｇ／ｍＬ、１４０ｍｇ／ｍＬ、１４５ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、１５５ｍｇ／ｍＬ、１６０ｍｇ／ｍＬ、１６５ｍｇ／ｍＬ、１７０ｍｇ／ｍＬ、１７５ｍｇ／ｍＬ、１８０ｍｇ／ｍＬ、１８５ｍｇ／ｍＬ、１９０ｍｇ／ｍＬ、１９５ｍｇ／ｍＬまたは約２００ｍｇ／ｍＬの濃度で含んでいてもよい。一実施形態において，本発明の医薬組成物は、ｄｓＲＮＡ剤を約１００ｍｇ／ｍＬの濃度で含む。上記の範囲および値の中間の値もまた本発明の一部であると意図されている。さらに、上限および／または下限としての上記の任意の値の組合せを用いた値の範囲も含まれると意図されている。
本発明の医薬組成物はＰＢＳを含んでいてもよい。一実施形態において、ＰＢＳは塩化ナトリウムおよびリン酸ナトリウムを含むが、塩化カリウムおよび／またはリン酸カリウムを含まない。他の実施形態において、ＰＢＳは、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムおよび塩化カリウムを含む。さらに他の実施形態において、ＰＢＳは塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カリウムを含む。一実施形態において、ＰＢＳは塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、塩化カリウムおよびリン酸カリウムを含む。特定の実施形態において、例えばＰＢＳが塩化ナトリウムおよびリン酸ナトリウムを含む場合、ＰＢＳは約１ｍＭから約１０ｍＭ；または約３ｍＭから約６ｍＭ、例えば約１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、２．５ｍＭ。３ｍＭ、３．５ｍＭ、４ｍＭ、４．５ｍＭ、５ｍＭ、６．５ｍＭ、７ｍＭ、７．５．ｍＭ、８ｍＭ、８．５ｍＭ、９ｍＭ、９．５ｍＭまたは約１０ｍＭＰＢＳの濃度であってもよい。本発明の一実施形態において、本発明の医薬組成物は、約５ｍＭ（例えば約０．６４ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、約４．３６ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、約８５ｍＭ ＮａＣｌ）の濃度のＰＢＳ。上記の範囲および値の中間の値も本発明の一部であると意図されている。さらに、上限および／または下限としての上記の任意の値の組合せを用いた値の範囲も含まれると意図されている。
一実施形態において、本発明の医薬組成物は保存剤不含有である。本発明の他の実施形態において、本発明の医薬組成物は保存剤を含む。
本発明の医薬組成物のｐＨは皮下投与に適切であり、約５．０から約８．０、約５．５から約８．０、約６．０から約８．０、約６．５から約８．０、約７．０から約８．０、約５．０から約７．５、約５．５から約７．５、約６．０から約７．５、約６．５から約７．５、約５．０から約７．２、約５．２５から約７．２、約５．５から約７．２、約５．７５から約７．２、約６．０から約７．２、約６．５から約７．２、または約６．８から約７．２であってもよい。上記の範囲および値の中間の範囲および値もまた本発明の一部であると意図されている。
本発明の医薬組成物のモル浸透圧濃度は、皮下投与に適切なもの、例えば約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下、例えば５０と４００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、７５と４００ ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、１００と４００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、１２５と４００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、１５０と４００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、１７５と４００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、２００と４００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、２５０と４００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、３００と４００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、５０と３７５ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、７５と３７５ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、１００と３７５ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、１２５と３７５ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、１５０と３７５ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、１７５と３７５ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、２００と３７５ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、２５０と３７５ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、３００と３７５ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、５０と３５０ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、７５と３５０ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、１００と３５０ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、１２５と３５０ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、１５０と３５０ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、１７５と３５０ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、２００と３５０ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、２５０と３５０ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、５０と３２５ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、７５と３２５ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、１００と３２５ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、１２５と３２５ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、１５０と３２５ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、１７５と３２５ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、２００と３２５ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、２５０と３２５ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、３００と３２５ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、３００と３５０ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、５０と３００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、７５と３００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、１００と３００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、１２５と３００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、１５０と３００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、１７５と３００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、２００と３００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、２５０と３００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、５０と２５０ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、７５と２５０ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、１００と２５０ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、１２５と２５０ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、１５０と２５０ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、１７５と３５０ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、２００と２５０ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、例えば約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９５、３００、３０５、３１０、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５または約４００ｍＯｓｍ／ｋｇであり得る。上記の範囲および値の中間の範囲および値もまた本発明の一部であると意図されている。さらに、上限および／または下限としての上記の任意の値の組合せを用いた範囲は含まれると意図されている。
本発明の医薬組成物は物理学的および化学的に安定である。
本明細書中で使用する用語「安定な」は、その物理学的安定性および／または化学的安定性および／または生物学的安定性を本質的に維持する医薬組成物および／またはそのような医薬組成物内のｄｓＲＮＡ剤を指す。組成物およびその中のｄｓＲＮＡ剤の安定性を測定するための種々の分析技術が当技術分野において利用可能であり、本明細書中に記載されている。
医薬組成物（またはそのような組成物中のｄｓＲＮＡ剤）は、例えば色および／または透明性の外観検査およびＵＶ検査の際に、または例えばＨＰＬＣ分析、例えば変性ＩＰ ＲＰ－ＨＰＬＣ、非変性ＩＰ ＲＰ－ＨＰＬＣおよび／または変性ＡＸ－ＨＰＬＣ分析で測定される、例えば不純物の増加の兆候を実質的に全く示さない場合に、「その物理学的安定性を保持」している。
ｄｓＲＮＡ剤は、所与の時間における化学的安定性が、ｄｓＲＮＡがその生物学的安定性を未だに保持していると考えられるようなものである場合、医薬組成物において「その化学的安定性を保持」している。化学的安定性は、例えばｄｓＲＮＡ二重鎖の化学的に変化した形態および／またはセンス鎖および／もしくはアンチセンス鎖の化学的に変化した形態を検出および／または定量化することにより評価される。化学的な変化は、例えば二重鎖保持時間および／または、例えば非変性ＩＰ ＲＰ－ＨＰＬＣを用いた二重鎖を形成する一本鎖の分子量の特定、例えば熱ＵＶ分光光度測定を用いた融解温度および／または、例えばフレーム原子吸光分析（フレームＡＡＳ）／誘導結合プラズマ発光分析（ＩＣＰ－ＯＥＳ）を用いたナトリウム含量（無水物に基づく）による特定によって評価される、サイズ改変および／またはナトリウム含量変化を伴っていてもよい。
ｄｓＲＮＡ剤は、組成物中のｄｓＲＮＡ剤が意図する目的について生物学的に活性である場合、医薬組成物中で「その生物学的活性を保持」している。例えば、組成物中のｄｓＲＮＡ剤の生物学的活性が、組成物の調製時に示された生物学的活性の約３０％、約２０％または約１０％内（アッセイの誤差内）である場合（例えばインビトロＲＴ－ＰＣＲアッセイによって決定される）、生物学的活性は保持されている。
例えば、いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、約２℃から約８℃で保存した場合に約６か月から約３６か月の間安定である。他の実施形態において、本発明の組成物は、約２５℃および６０％の相対湿度（ＲＨ）で保存した場合に約６か月から約３６か月の間安定である。さらに他の実施形態において、本発明の組成物は約４０℃および７５％の相対湿度（ＲＨ）で保存した場合に約６か月安定である。
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、約２℃から約８℃で保存した場合に最長約３６か月安定である。他の実施形態において、本発明の組成物は、約２５℃および６０％の相対湿度（ＲＨ）で保存した場合に最長約３６か月安定である。さらに他の実施形態において、本発明の組成物は、約４０℃および７５％の相対湿度（ＲＨ）で保存した場合に最長６か月安定である。
一実施形態において、本発明の組成物は、純度非変性ＩＰＲＰ－ＨＰＬＣによって決定される、少なくとも（ＮＬＴ）約９５．０面積％の二重鎖および多くとも（ＮＭＴ）約５面積％の二重鎖の総不純物を含む。他の実施形態において、本発明の医薬組成物は、純度変性ＡＸ－ＨＰＬＣによって決定される、少なくとも（ＮＬＴ）約８５．０面積％の総一本鎖を含む。さらに他の実施形態において、本発明の医薬組成物は、純度変性ＩＰＲＰ－ＨＰＬＣによって決定される、少なくとも（ＮＬＴ）約８０．０面積％の総一本鎖を含む。
一態様において、本発明はＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物を提供する。医薬組成物は、約５０ｍｇ／ｍＬから約２００ｍｇ／ｍＬの濃度の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤および約１ｍＭから約１０ｍＭの濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含み、ここで、医薬組成物のｐＨおよびモル浸透圧濃度は対象への皮下投与に適切であり、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、５’－ＵＵＧＡＡＧＵＡＡＡＵＧＧＵＧＵＵＡＡＣＣＡＧ－３’（配列番号１５）のヌクレオチド配列から３ヌクレオチド以下が異なっている少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含む、Ｓｅｒｐｉｎｃ１をコードするｍＲＮＡに相補性の領域を含み、センス鎖の実質的に全てのヌクレオチドおよびアンチセンス鎖の実質的に全てのヌクレオチドは改変ヌクレオチドであり、センス鎖は、３’－末端に結合しているリガンドにコンジュゲートしており、ｄｓＲＮＡ剤は遊離酸形態である。
他の態様において、本発明はＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物を提供する。医薬組成物は、約５０ｍｇ／ｍＬから約２００ｍｇ／ｍＬの濃度の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤および約１ｍＭから約１０ｍＭの濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含み、ここで、医薬組成物のｐＨおよびモル浸透圧濃度は対象への皮下投与に適切であり、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、５’－ＵＵＧＡＡＧＵＡＡＡＵＧＧＵＧＵＵＡＡＣＣＡＧ－３’（配列番号１５）のヌクレオチド配列から３ヌクレオチド以下が異なっている少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含む、Ｓｅｒｐｉｎｃ１をコードするｍＲＮＡに相補性の領域を含み、センス鎖の実質的に全てのヌクレオチドおよびアンチセンス鎖の実質的に全てのヌクレオチドは改変ヌクレオチドであり、センス鎖は、３’－末端に結合しているリガンドにコンジュゲートしており、ｄｓＲＮＡ剤は塩形態である。
一実施形態において、センス鎖の全てのヌクレオチドおよびアンチセンス鎖の全てのヌクレオチドは改変ヌクレオチドである。
一実施形態において、改変ヌクレオチドは独立して、２’－デオキシ－２’－フルオロ改変ヌクレオチド、２’－デオキシ改変ヌクレオチド、ロックヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ改変ヌクレオチド、２’－アルキル改変ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、および非天然塩基含有ヌクレオチドからなる群から選択される。
相補性の領域は、少なくとも１７ヌクレオチドの長さまたは１９ヌクレオチドの長さであってもよい。
一実施形態において、相補性の領域は、１９と２１ヌクレオチドとの間の長さである。他の実施形態において、相補性の領域は、２１と２３ヌクレオチドとの間の長さである。
一実施形態において、各鎖は、３０ヌクレオチド以下の長さである。
二本鎖ＲＮＡｉ剤の少なくとも１つの鎖は、少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングまたは少なくとも２ヌクレオチド、例えば２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５ヌクレオチドの３’オーバーハングを含んでいてもよい。他の実施形態において、ＲＮＡｉ剤の少なくとも１つの鎖は少なくとも１ヌクレオチドの５’オーバーハングを含む。特定の実施形態において、少なくとも１つの鎖は、少なくとも２ヌクレオチド、例えば２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５ヌクレオチドの５’オーバーハングを含む。さらに他の実施形態において、ＲＮＡｉ剤の１つの鎖の３’末端および５’末端はともに、少なくとも１ヌクレオチドのオーバーハングを含む。
特定の実施形態において、リガンドはＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。リガンドは、一価、二価または三価の分岐リンカーを介してＲＮＡｉ剤に結合した１つまたはそれ以上のＧａｌＮａｃであってもよい。リガンドは、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の３’末端、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’末端、二本鎖ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖の３’末端または二本鎖ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖の５’末端にコンジュゲートしていてもよい。
いくつかの実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、複数の一価リンカーを介して二本鎖ＲＮＡｉの複数のヌクレオチドにそれぞれ独立して結合した、複数、例えば２、３、４、５または６つのＧａｌＮＡｃを含む。
特定の実施形態において、リガンドは、
Figure 2022517270000022
 である。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤はリンカーを介してリガンドにコンジュゲートしており、リガンドおよびリンカーは、次の図式
Figure 2022517270000023
 に示すようにＲＮＡｉ剤にコンジュゲートしており、
式中、ＸはＯまたはＳである。
一実施形態において、ＸはＯである。
一実施形態において、相補性の領域は、５’－ＵＵＧＡＡＧＵＡＡＡＵＧＧＵＧＵＵＡＡＣＣＡＧ－３’（配列番号１５）のヌクレオチド配列からなる。
一実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、５’－ＧＧＵＵＡＡＣＡＣＣＡＵＵＵＡＣＵＵＣＡＡ－３’（配列番号１６）のヌクレオチド配列を含むセンス鎖および５’－ＵＵＧＡＡＧＵＡＡＡＵＧＧＵＧＵＵＡＡＣＣＡＧ－３’（配列番号１５）のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。
一実施形態において、センス鎖は、５’－ＧｆｓｇｓＵｆｕＡｆａＣｆａＣｆＣｆＡｆｕＵｆｕＡｆｃＵｆｕＣｆａＡｆ－３’（配列番号１３）を含み、アンチセンス鎖は５’－ｕｓＵｆｓｇＡｆａＧｆｕＡｆａＡｆｕｇｇＵｆｇＵｆｕＡｆａＣｆｃｓａｓｇ－３’（配列番号１４）を含み、ここで、ａ、ｃ、ｇ、およびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；Ａｆ、Ｃｆ、ＧｆまたはＵｆは２’－フルオロＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり；ｓはホスホロチオエート結合である。
一実施形態において、センス鎖は５’－ＧｆｓｇｓＵｆｕＡｆａＣｆａＣｆＣｆＡｆｕＵｆｕＡｆｃＵｆｕＣｆａＡｆ－３’（配列番号１３）を含み、アンチセンス鎖は５’－ｕｓＵｆｓｇＡｆａＧｆｕＡｆａＡｆｕｇｇＵｆｇＵｆｕＡｆａＣｆｃｓａｓｇ－３’（配列番号１４）を含み、ここで、ａ、ｃ、ｇ、およびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵであり；Ａｆ、Ｃｆ、ＧｆまたはＵｆは２’－フルオロＡ、Ｃ、ＧまたはＵであり；ｓはホスホロチオエート結合であり；センス鎖はリンカーを介してリガンドにコンジュゲートしており、リガンドおよびリンカーは、次の図式
Figure 2022517270000024
 に示すようにＲＮＡｉ剤にコンジュゲートしており
式中、ＸはＯまたはＳである。
一態様において、本発明は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物を提供する。医薬組成物は、約５０ｍｇ／ｍＬから約２００ｍｇ／ｍＬの濃度の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤および約１ｍＭから約１０ｍＭの濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含み、ここで、医薬組成物のｐＨおよびモル浸透圧濃度は対象への皮下投与に適切であり、ｄｓＲＮＡ剤は、５’－ＧｆｓｇｓＵｆｕＡｆａＣｆａＣｆＣｆＡｆｕＵｆｕＡｆｃＵｆｕＣｆａＡｆ－３’（配列番号９４１）のヌクレオチド配列からなるセンス鎖および５’－ｕｓＵｆｓｇＡｆａＧｆｕＡｆａＡｆｕｇｇＵｆｇＵｆｕＡｆａＣｆｃｓａｓｇ－３’（配列番号９６０）のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖を有し、ここで、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、Ｃｆ、およびＵｆは２’－フルオロＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕであり；ｓはホスホロチオエート結合であり、リガンドはリンカーを介してセンス鎖の３’末端にコンジュゲートしており、リガンドおよびリンカーは次の構造を有し：
Figure 2022517270000025
 ここで、ｄｓＲＮＡ剤は遊離酸形態である。
他の態様において、本発明は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物を提供する。医薬組成物は、約５０ｍｇ／ｍＬから約２００ｍｇ／ｍＬの濃度の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤および約１ｍＭから約１０ｍＭの濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含み、ここで医薬組成物のｐＨおよびモル浸透圧濃度は対象への皮下投与に適切であり、ｄｓＲＮＡ剤は、５’－ＧｆｓｇｓＵｆｕＡｆａＣｆａＣｆＣｆＡｆｕＵｆｕＡｆｃＵｆｕＣｆａＡｆ－３’（配列番号９４１）のヌクレオチド配列からなるセンス鎖および５’－ｕｓＵｆｓｇＡｆａＧｆｕＡｆａＡｆｕｇｇＵｆｇＵｆｕＡｆａＣｆｃｓａｓｇ－３’（配列番号９６０）のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖を有し、ここで、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、Ｃｆ、およびＵｆは２’－フルオロＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕであり；ｓはホスホロチオエート結合であり、リガンドはリンカーを介してセンス鎖の３’末端にコンジュゲートしており、リガンドおよびリンカーは次の構造を有し：
Figure 2022517270000026
 ここで、ｄｓＲＮＡ剤は塩形態である。
一態様において、本発明はＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物を提供する。組成物は、約１００ｍｇ／ｍＬの濃度の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤および約５ｍＭの濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含み、ここで、医薬組成物のｐＨは約６．８から約７．２であり、医薬組成物のモル浸透圧濃度は約３００ｍＯｓｍ／ｋｇであり、ｄｓＲＮＡ剤は５’－ＧｆｓｇｓＵｆｕＡｆａＣｆａＣｆＣｆＡｆｕＵｆｕＡｆｃＵｆｕＣｆａＡｆ－３’（配列番号９４１）のヌクレオチド配列からなるセンス鎖および５’－ｕｓＵｆｓｇＡｆａＧｆｕＡｆａＡｆｕｇｇＵｆｇＵｆｕＡｆａＣｆｃｓａｓｇ－３’（配列番号９６０）のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖を有し、ここで、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、Ｃｆ、およびＵｆは２’－フルオロＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕであり；ｓはホスホロチオエート結合であり、リガンドはリンカーを介してセンス鎖の３’末端にコンジュゲートしており、リガンドおよびリンカーは次の構造を有し：
Figure 2022517270000027
 ここで、ｄｓＲＮＡ剤は遊離酸形態である。
他の態様において，本発明はＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物を提供する。医薬組成物は、約１０６ｍｇ／ｍＬの濃度の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤および約５ｍＭの濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含み、ここで、医薬組成物のｐＨは約６．８から約７．２であり、医薬組成物のモル浸透圧濃度は約３００ｍＯｓｍ／ｋｇであり、ｄｓＲＮＡ剤は５’－ＧｆｓｇｓＵｆｕＡｆａＣｆａＣｆＣｆＡｆｕＵｆｕＡｆｃＵｆｕＣｆａＡｆ－３’（配列番号９４１）のヌクレオチド配列からなるセンス鎖および５’－ｕｓＵｆｓｇＡｆａＧｆｕＡｆａＡｆｕｇｇＵｆｇＵｆｕＡｆａＣｆｃｓａｓｇ－３’（配列番号９６０）のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖を有し、ここで、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、Ｃｆ、およびＵｆは２’－フルオロＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕであり；ｓはホスホロチオエート結合であり、リガンドはリンカーを介してセンス鎖の３’末端にコンジュゲートしており、リガンドおよびリンカーは次の構造を有し：
Figure 2022517270000028
 ここで、ｄｓＲＮＡ剤は塩形態である。
本発明の組成物は、医薬組成物中に慣用的に見られる他の添加成分をその当技術分野で確立された使用レベルでさらに含んでいてもよい。そのため、例えば組成物はさらなる適合性の薬学的に活性な物質、例えばかゆみ止め、収れん剤、局所麻酔薬または抗炎症剤を含んでいても、または本発明の組成物の種々の剤形を物理的に配合するのに有用なさらなる物質、例えば色素、香味剤、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤および安定化剤を含んでいてもよい。しかし、添加した場合、そのような物質は本発明の組成物の成分の生物学的活性に過度に干渉するべきではない。配合物は安定化させてよく、所望により、配合物の核酸と有害に相互作用しない、補助剤、例えば潤滑剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝剤、着色剤、香味剤および／または芳香物質等と混合してもよい。
いくつかの実施形態において、本発明において特徴付ける医薬組成物は、（ａ）１つまたはそれ以上のｉＲＮＡ化合物および（ｂ）非ＲＮＡｉ機構により機能し、溶血性障害を処置するのに有用な１つまたはそれ以上の剤を含む。そのような剤の例としては、非限定的に、抗炎症剤、抗脂肪症剤、抗ウイルスおよび／または抗線維化剤が挙げられる。さらに、肝臓を保護するのに一般的に使用される他の物質、例えばシリマリンは、本明細書中に記載するｉＲＮＡと組み合わせて使用してもよい。肝臓疾患を処置するのに有用な他の剤としては、テルビブジン、エンテカビルおよびプロテアーゼインヒビター、例えばテラプレビル、および例えばＴｕｎｇら、米国特許出願公開第２００５／０１４８５４８号、第２００４／０１６７１１６号および第２００３／０１４４２１７号；ならびにＨａｌｅら、米国特許出願公開第２００４／０１２７４８８号に開示されている他のものが挙げられる。
そのような化合物の毒性および治療効能は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手法、例えばＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するための手法により決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比率は治療指数であり、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表される。高い治療指数を示す化合物が好ましい。
ＩＩＩ．本発明の医薬組成物における使用のためのｉＲＮＡ
本発明の組成物は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子を標的とし、細胞内、例えば対象、例えば哺乳類、例えばＳｅｒｐｉｎｃ１関連障害、例えば出血障害、例えば血友病を有するヒトの細胞におけるＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害するＲＮＡｉ剤を含む。
本明細書中で使用する「標的配列」は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の転写の間に形成されるｍＲＮＡ分子、例えば一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡのヌクレオチド配列の連続する部分を指す。一実施形態において、配列の標的部分は、少なくとも、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の転写の間に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の部分またはその近傍でｉＲＮＡ依存性切断の基質として作用するのに十分な長さである。
標的配列は、約９～３６ヌクレオチドの長さ、例えば約１５～３０ヌクレオチドの長さであってもよい。例えば、標的配列は、約１５～３０ヌクレオチド、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４，２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３または２１～２２ヌクレオチドの長さであってもよい。上述する範囲および長さの中間の範囲および長さもまた本発明の一部と考えられる。
本明細書中で使用する用語「配列を含む鎖」は、標準的なヌクレオチド命名法を用いて、参照される配列により記載されるヌクレオチド鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」および「Ｕ」はそれぞれ一般的に、塩基としてそれぞれグアニン、シトシン、アデニン、チミジンおよびウラシルを含むヌクレオチドを意味する。しかし、用語「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」はまた、下記にさらに詳述するように改変ヌクレオチド、または代理置換部分も指していてよいことは理解されるであろう（例えば表１参照）。当業者は、グアニン、シトシン、アデニンおよびウラシルは、そのような置換部分を保有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成性質を実質的に変更することなく、他の部分に置換されていてよいことは十分承知している。例えば、非限定的に、塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシンまたはウラシルを含むヌクレオチドと塩基対を形成することができる。したがって、ウラシル、グアニンまたはアデニンを含むヌクレオチドは、本発明において特徴付けるｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列において、例えばイノシンを含むヌクレオチドによって置換される。他の例において、オリゴヌクレオチド中のアデニンおよびシトシンは、いずれの場所においても、それぞれグアニンおよびウラシルと置換され、標的ｍＲＮＡとのＧ－Ｕゆらぎ塩基対を形成してもよい。そのような置換部分を含む配列は、本発明において特徴付ける組成物および方法に適切である。
本明細書中において互換可能に使用する用語「ｉＲＮＡ」、「ＲＮＡｉ剤」、「ｉＲＮＡ剤」、「ＲＮＡ干渉剤」は、本明細書中で定義される用語であるＲＮＡを含む、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を介してＲＮＡ転写物の標的化した切断を介在する剤を指す。ｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られるプロセスを介してｍＲＮＡの配列特異的な分解を誘導する。ｉＲＮＡは、細胞、例えば対象、例えば哺乳類対象内の細胞においてＳｅｒｐｉｎｃ１の発現を調節、例えば阻害する。
一実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、標的ＲＮＡ配列、例えばＳｅｒｐｉｎｃ１標的ｍＲＮＡ配列と相互作用し、標的ＲＮＡの切断を引き起こす一本鎖ＲＮＡを含む。理論に縛られることを望むものではないが、細胞に導入された長い二本鎖ＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒとして知られているＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによりｓｉＲＮＡに分解されると考えられている（Ｓｈａｒｐら（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４８５）。Ｄｉｃｅｒは、リボヌクレアーゼ－ＩＩＩ様酵素であり、ｄｓＲＮＡを特徴的な２塩基の３’オーバーハングを有する１９～２３塩基対の短い干渉ＲＮＡにプロセシングする（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、（２００１）Ｎａｔｕｒｅ４０９：３６３）。ｓｉＲＮＡは次いでＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に取り込まれ、ここで１つまたはそれ以上のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二重鎖をほどき、相補的なアンチセンス鎖が標的認識をガイドすることが可能になる（Ｎｙｋａｎｅｎら、（２００１）Ｃｅｌｌ１０７：３０９）。適当な標的ｍＲＮＡへの結合時に、ＲＩＳＣ内の１つまたはそれ以上のエンドヌクレアーゼが標的を切断し、サイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８）。したがって、一態様において、本発明は、細胞内で生成され、ＲＩＳＣ複合体の形成を促進し、標的遺伝子、すなわちＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子のサイレンシングを引き起こす一本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に関する。したがって、用語「ｓｉＲＮＡ」はまた、本明細書中において、上記のＲＮＡｉを指すのにも用いられる。
他の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、標的ｍＲＮＡを阻害するために細胞または生物に導入される一本鎖ｓｉＲＮＡであってもよい。一本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼＡｒｇｏｎａｕｔｅ２に結合し、これは次いで標的ｍＲＮＡを切断する。一本鎖ｓｉＲＮＡは一般的に１５～３０ヌクレオチドであり、化学的に改変されている。一本鎖ｓｉＲＮＡの設計および試験は、米国特許第８，１０１，３４８号およびＬｉｍａら、（２０１２）Ｃｅｌｌ１５０：８８３～８９４に記載されており、それぞれの内容全体を参照によって本明細書に組み入れる。本明細書中に記載する任意のアンチセンスヌクレオチド配列は、本明細書に記載するように一本鎖ｓｉＲＮＡとして使用しても、またはＬｉｍａら、（２０１２）Ｃｅｌｌ１５０；：８８３～８９４に記載されている方法により化学的に改変されて使用してもよい。
他の実施形態において、本発明の組成物、使用および方法において使用するための「ｉＲＮＡ」は、二本鎖ＲＮＡであり、本明細書中において「二本鎖ＲＮＡｉ剤」、「二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子」、「ｄｓＲＮＡ剤」または「ｄｓＲＮＡ」と称される。用語「ｄｓＲＮＡ」は、標的ＲＮＡ、すなわちＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子について「センス」および「アンチセンス」配向を有すると称される、２つの逆平行であり実質的に相補的な核酸鎖を含む二重鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体を指す。本発明のいくつかの実施形態において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、本明細書中においてＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉと称される転写後遺伝子サイレンシング機構を介した、標的ＲＮＡ例えばｍＲＮＡの分解を引き起こす。
一般的に、ｄｓＲＮＡ分子の各鎖のヌクレオチドの大部分はリボヌクレオチドであるが、本明細書中に詳述するように、鎖のいずれかまたは両方はまた、１つまたはそれ以上の非リボヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチドおよび／または改変ヌクレオチドを含んでいてもよい。さらに、本明細書において使用する「ＲＮＡｉ剤」は、化学的な改変を有するリボヌクレオチドを含んでいてもよく；ＲＮＡｉ剤は、複数のヌクレオチドにおいて実質的な改変を含んでいてもよい。
本明細書中で使用する用語「改変ヌクレオチド」は、独立して改変糖部分、改変ヌクレオチド間結合および／または改変核酸塩基を有するヌクレオチドを指す。したがって、用語、改変ヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合、糖部分または核酸塩基に対する、例えば官能基または原子の置換、付加または除去を包含する。本発明の剤において使用するための適切な改変は、本明細書中に開示するか、または当技術分野において公知の全ての種類の改変を含む。ｓｉＲＮＡ型分子において使用するそのような改変は、いずれも本明細書および特許請求の範囲の目的のために「ＲＮＡｉ剤」に包含される。
二重鎖領域は、ＲＩＳＣ経路を介する所望の標的ＲＮＡの特異的な分解を可能にする任意の長さであってよく、約９から３６塩基対の長さ、例えば約１５～３０塩基対の長さ、例えば約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５または３６塩基対の長さ、例えば約１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４，２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３または２１～２２塩基対の長さの範囲であってもよい。上述の範囲および長さの中間の範囲および長さもまた本発明の一部と考えられる。
二重鎖構造を形成する２つの鎖は、１つのより大きいＲＮＡ分子の異なる部分であっても、別個のＲＮＡ分子であってもよい。２つの鎖が１つのより大きい分子の一部であり、そのために二重鎖構造を形成する一方の鎖の３’－末端およびそれぞれの他方の５’－末端の間の中断されていない鎖によって結合している場合、結合しているＲＮＡ鎖を「ヘアピンループ」と称する。ヘアピンループは、少なくとも１つの非対合ヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、ヘアピンループは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも２３またはそれ以上の非対合ヌクレオチドを含んでいてもよい。
ｄｓＲＮＡの２つの実質的に相補的な鎖が、別個のＲＮＡ分子により構成される場合、これらの分子は、必ずしも共有結合していなくてよいが、共有結合していてもよい。２つの鎖は、二重鎖構造を形成する一方の鎖の３’－末端およびそれぞれの他方の鎖の５’－末端の間の中断されていないヌクレオチド鎖以外の手段で共有結合しており、結合構造を「リンカー」と称する。ＲＮＡ鎖は、同じまたは異なる数のヌクレオチドを有していてよい。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの最短鎖から二重鎖中に存在する任意のオーバーハングを差し引いたヌクレオチドの数である。二重鎖構造に加えて、ＲＮＡｉは、１つまたはそれ以上のヌクレオチドオーバーハングを含んでいてもよい。
一実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、標的ＲＮＡ配列、例えばＳｅｒｐｉｎｃ１標的ｍＲＮＡ配列と相互作用し、標的ＲＮＡの切断へと向かわされる、２４～３０ヌクレオチドのｄｓＲＮＡである。理論に縛られることを望むものではないが、細胞に導入された長い二本鎖ＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒとして知られるＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによりｓｉＲＮＡに分解される（Ｓｈａｒｐら（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４８５）。Ｄｉｃｅｒは、リボヌクレアーゼ－ＩＩＩ様酵素であり、ｄｓＲＮＡを、特徴的な２塩基の３’オーバーハングを有する１９～２３塩基対の短い干渉ＲＮＡにプロセシングする（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、（２００１）Ｎａｔｕｒｅ４０９：３６３）。次いでｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に取り込まれ、ここで１つまたはそれ以上のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二重鎖をほどき、相補的なアンチセンス鎖が標的認識をガイドすることが可能になる（Ｎｙｋａｎｅｎら、（２００１）Ｃｅｌｌ１０７：３０９）。適当な標的ｍＲＮＡへの結合時に、ＲＩＳＣ内の１つまたはそれ以上のエンドヌクレアーゼが標的を切断し、サイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８）。
本明細書中で使用する用語「ヌクレオチドオーバーハング」は、ｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡの二重鎖構造から突出する少なくとも１つの非対合ヌクレオチドを指す。例えば、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３’－末端が他方の鎖の５’－末端を超えて伸長する場合、またはその逆の場合に、ヌクレオチドオーバーハングが存在する。ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを含んでいてもよく；あるいはオーバーハングは少なくとも２つのヌクレオチド、少なくとも３つのヌクレオチド、少なくとも４つのヌクレオチド、少なくとも５つのヌクレオチドまたはそれ以上を含んでいてもよい。ヌクレオチドオーバーハングは、ヌクレオチド／ヌクレオシド類似体、例えばデオキシヌクレオチド／ヌクレオシドを含んでいても、またはこれらからなっていてもよい。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖またはそれらの任意の組合せの上にあってよい。さらに、オーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖またはセンス鎖のいずれかの５’－末端、３’－末端または両方の末端の上に存在していてもよい。
一実施形態において、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は３’－末端および／または５’－末端に、１～１０のヌクレオチド、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のヌクレオチドオーバーハングを有する。一実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は３’－末端および／または５’－末端に、１～１０のヌクレオチド、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のヌクレオチドオーバーハングを有する。他の実施形態において、オーバーハング内の１つまたはそれ以上のヌクレオチドは、ヌクレオシドチオホスフェートに置換されている。
特定の実施形態において、センス鎖もしくはアンチセンス鎖またはその両方上のオーバーハングは、１０ヌクレオチドより長い、例えば１０～３０ヌクレオチド、１０～２５ヌクレオチド、１０～２０ヌクレオチドまたは１０～１５ヌクレオチドの長さの伸長を含んでいてもよい。特定の実施形態において、伸長オーバーハングは二重鎖のセンス鎖上にある。特定の実施形態において、伸長オーバーハングは、二重鎖のセンス鎖の３’末端上に存在する。特定の実施形態において、伸長オーバーハングは、二重鎖のセンス鎖の５’末端上に存在する。特定の実施形態において、伸長オーバーハングは二重鎖のアンチセンス鎖上にある。特定の実施形態において、伸長オーバーハングは、二重鎖のアンチセンス鎖の３’末端上に存在する。特定の実施形態において、伸長オーバーハングは、二重鎖のアンチセンス鎖の５’末端上に存在する。特定の実施形態において、伸長オーバーハング内の１つまたはそれ以上のヌクレオチドはヌクレオシドチオホスフェートに置換されている。
「平滑」または「平滑末端」は、二本鎖ＲＮＡｉ剤の当該末端において非対合ヌクレオチドが存在しないこと、すなわちヌクレオチドオーバーハングがないことを意味する。「平滑末端」ＲＮＡｉ剤は、その長さ全体を通して二本鎖である、すなわち分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングがないｄｓＲＮＡである。本発明のＲＮＡｉ剤は、一方の末端にヌクレオチドオーバーハングを有するＲＮＡｉ剤（すなわち１つのオーバーハングおよび１つの平滑末端を有する剤）または両方の末端にヌクレオチドオーバーハングを有する剤を含む。
用語「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」は、標的配列、例えばＳｅｒｐｉｎｃ１ ｍＲＮＡに実質的に相補的である領域を含む、ｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡの鎖を指す。本明細書中で使用する用語「相補性の領域」は、配列、例えば標的配列、例えば本明細書中に定義するＳｅｒｐｉｎｃ１ヌクレオチド配列に実質的に相補的であるアンチセンス鎖上の領域を指す。相補性の領域が標的配列に完全に相補的ではない場合、ミスマッチが分子の内部または末端領域内に存在し得る。一般的に、最も許容されるミスマッチは、末端領域、例えばｉＲＮＡの５’－および／または３’－末端の５、４、３または２ヌクレオチド中にある。
本明細書中で使用する用語「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」は、本明細書中で定義する用語であるアンチセンス鎖の領域に実質的に相補的である領域を含むｉＲＮＡの鎖を指す。
本明細書中で使用する用語「切断領域」は、切断部位にすぐに隣接して位置する領域を指す。切断部位は、切断が生じる標的上の部位である。いくつかの実施形態において、切断領域は切断部位のいずれか一端に、およびすぐに隣接した３塩基を含む。いくつかの実施形態において、切断領域は切断部位のいずれか一端に、およびすぐに隣接した２塩基を含む。いくつかの実施形態において、切断部位はアンチセンス鎖のヌクレオチド１０および１１に結合される部位において特異的に生じ、切断領域は、ヌクレオチド１１、１２および１３を含む。
特に断らない限り、本明細書中で使用する用語「相補的」は、第１のヌクレオチド配列を第２のヌクレオチド配列と関連して記載するのに使用する場合に、当業者が理解するように、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、特定の条件下において第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズし、二重鎖構造を形成する能力を指す。そのような条件は、例えば、ストリンジェント条件であってよく、ここでストリンジェント条件は：４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２～１６時間、それに次ぐ洗浄を含んでいてもよい（例えば“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。他の条件、例えば生物内で遭遇し得る生理学的に関連する条件を適用してもよい。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終的な適用に応じて、２つの配列の相補性の試験に最も適当な条件のセットを決定することができる。
ｉＲＮＡ、例えば本明細書中に記載するｄｓＲＮＡ内の相補的配列は、一方または両方のヌクレオチド配列の長さ全体にわたる、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドへの塩基対形成を含む。そのような配列は、本明細書中において、互いに対して「完全に相補的」であると称される。しかしながら、本明細書中において第１の配列が第２の配列に対して「実質的に相補的」であると称される場合、２つの配列は、完全に相補的であっても、または最長３０塩基対の二重鎖のハイブリダイズ時に、その最終的な適用、例えばＲＩＳＣ経路を介した遺伝子発現の阻害に最も関連する条件下におけるハイブリダイズ能を保持しながら、１つまたはそれ以上であるが、一般的には多くとも５、４、３または２つのミスマッチ塩基対を形成していてもよい。しかし、２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズ時に１つまたはそれ以上の一本鎖オーバーハングを形成するように設計される場合、そのようなオーバーハングは、相補性の決定についてミスマッチとみなされるべきではない。例えば２１ヌクレオチドの長さの１つのオリゴヌクレオチドおよび２３ヌクレオチドの長さの他のオリゴヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡは、より長いオリゴヌクレオチドが、より短いオリゴヌクレオチドに完全に相補的である２１ヌクレオチドの配列を含む場合であっても、本明細書中に記載する目的について「完全に相補的」であると称される。
本明細書中で使用する「相補的」配列はまた、ハイブリダイズ能に関する上述の要件が満たされている限り、非ワトソンクリック塩基対および／または非天然および改変ヌクレオチドから形成された塩基対を含んでいても、これらから全体が形成されていてもよい。そのような非ワトソンクリック塩基対としては、非限定的にＧ：Ｕゆらぎまたはフーグスティーン塩基対が挙げられる。
本明細書中において、用語「相補的」、「完全に相補的」および「実質的に相補的」は、使用の文脈から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間、またはｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖と標的配列との間の塩基マッチングに関して使用される。
本明細書中で使用される、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の「少なくとも一部に実質的に相補的」であるポリヌクレオチドは、目的のｍＲＮＡ（例えばＳｅｒｐｉｎｃ１をコードするｍＲＮＡ）の連続する部分に実質的に相補的であるポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、配列がＳｅｒｐｉｎｃ１をコードするｍＲＮＡの中断されていない部分に実質的に相補的である場合、Ｓｅｒｐｉｎｃ１ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である。
したがって、いくつかの実施形態において、本明細書中に開示されるアンチセンス鎖ポリヌクレオチドは、標的Ｓｅｒｐｉｎｃ１配列に完全に相補的である。他の実施形態において、本明細書中に開示されるアンチセンス鎖ポリヌクレオチドは、標的Ｓｅｒｐｉｎｃ１配列に実質的に相補的であり、その全体の長さにわたって配列番号１または配列番号１の断片のヌクレオチド配列の対応する領域に少なくとも約８０％、例えば約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％相補的である連続ヌクレオチド配列を含む。
一実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、アンチセンスポリヌクレオチドに実質的に相補的であるセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は標的Ｓｅｒｐｉｎｃ１配列に相補的であり、ここで、センス鎖ポリヌクレオチドは、その長さ全体にわたって配列番号５または配列番号５の任意の１つの断片のヌクレオチド配列の対応する領域に少なくとも約８０％相補的である、例えば約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％相補的である連続ヌクレオチド配列を含む。
インビボで標的遺伝子（すなわちＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子）の発現を阻害することができる適切なｄｓＲＮＡ剤は、化学改変を含む。本発明の特定の態様において、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの実質的に全ては改変されている。本発明の他の実施形態において、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドは全て改変されている。「ヌクレオチドの実質的に全てが改変されている」本発明のｉＲＮＡは、大部分改変されているが、全体は改変されておらず、多くとも５、４、３、２または１つの非改変ヌクレオチドを含んでいてもよい。
本発明の方法で使用するためのｉＲＮＡ剤は、一般的に約３０ヌクレオチドまたはそれ以下の長さ、例えば１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４，２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３または２１～２２ヌクレオチドの長さの領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）であって、その領域が実質的にＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的であるＲＮＡ鎖を含む。
他の実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤の１つまたは両方の鎖は、最長６６ヌクレオチドの長さ、例えば３６～６６、２６～３６、２５～３６、３１～６０、２２～４３、２７～５３ヌクレオチドの長さであって、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である少なくとも１９の連続ヌクレオチドの領域を有する。いくつかの実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、１８～３０の連続ヌクレオチドの二重鎖を形成する。
いくつかの実施形態において、本発明の方法において使用するためのｉＲＮＡ剤は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である少なくとも１９の連続ヌクレオチドの領域を有する、最長６６ヌクレオチドの長さ、例えば３６～６６、２６～３６、２５～３６、３１～６０、２２～４３、２７～５３の長さであってよいＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含む。いくつかの実施形態において、より長いアンチセンス鎖を有するそのようなｉＲＮＡ剤は、２０～６０ヌクレオチドの長さの第２のＲＮＡ鎖（センス鎖）を含んでいてよく、センス鎖およびアンチセンス鎖は１８～３０の連続ヌクレオチドの二重鎖を形成する。
ＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。ＲＮＡｉ剤の各鎖は、１２～３０ヌクレオチドの長さの範囲であってよい。例えば各鎖は１４～３０ヌクレオチドの長さ、１７～３０ヌクレオチドの長さ、１９～３０ヌクレオチドの長さ、２５～３０ヌクレオチドの長さ、２７～３０ヌクレオチドの長さ、１７～２３ヌクレオチドの長さ、１７～２１ヌクレオチドの長さ、１７～１９ヌクレオチドの長さ、１９～２５ヌクレオチドの長さ、１９～２３ヌクレオチドの長さ、１９～２１ヌクレオチドの長さ、２１～２５ヌクレオチドの長さまたは２１～２３ヌクレオチドの長さであってよい。
センス鎖およびアンチセンス鎖は、典型的には二重鎖の二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）を形成し、これは本明細書中において「ＲＮＡｉ剤」とも称される。ＲＮＡｉ剤の二重鎖領域は、１２～３０ヌクレオチド対の長さであってもよい。例えば、二重鎖領域は１４～３０ヌクレオチド対の長さ、１７～３０ヌクレオチド対の長さ、２７～３０ヌクレオチド対の長さ、１７～２３ヌクレオチド対の長さ、１７～２１ヌクレオチド対の長さ、１７～１９ヌクレオチド対の長さ、１９～２５ヌクレオチド対の長さ、１９～２３ヌクレオチド対の長さ、１９～２１ヌクレオチド対の長さ、２１～２５ヌクレオチド対の長さまたは２１～２３ヌクレオチド対の長さであってもよい。他の例において、二重鎖領域は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６および２７ヌクレオチドの長さから選択される。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、１つまたは両方の鎖の３’末端、５’末端または両方の末端に１つまたはそれ以上のオーバーハング領域および／またはキャッピング基を含んでいてもよい。オーバーハングは、１～６ヌクレオチドの長さ、例えば２～６ヌクレオチドの長さ、１～５ヌクレオチドの長さ、２～５ヌクレオチドの長さ、１～４ヌクレオチドの長さ、２～４ヌクレオチドの長さ、１～３ヌクレオチドの長さ、２～３ヌクレオチドの長さまたは１－２ヌクレオチドの長さであってもよい。オーバーハングは、一方の鎖が他方よりも長いことの結果であっても、または同じ長さの２つの鎖がねじれていることの結果であってもよい。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとミスマッチを形成しても、または標的とする遺伝子配列に相補的であってもまたは他の配列であってもよい。第１の鎖および第２の鎖はまた、例えばさらなる塩基によって接合してヘアピンを形成しても、または他の非塩基リンカーによって接合してもよい。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤のオーバーハング領域中のヌクレオチドは、それぞれ独立して改変または非改変ヌクレオチド、例えば非限定的には２’－糖改変、例えば２－Ｆ、２’－Ｏ－メチル、チミジン（Ｔ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）およびそれらの任意の組合せであってもよい。例えば、ＴＴは、いずれかの鎖のいずれかの末端についてのオーバーハング配列であってもよい。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとミスマッチを形成しても、または標的とする遺伝子配列に相補的であってもまたは他の配列であってもよい。
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖、アンチセンス鎖または両方の鎖の５’－または３’－オーバーハングは、リン酸化されていてもよい。いくつかの実施形態において、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエートを有する２つのヌクレオチドを含み、ここで２つのヌクレオチドは同一であっても異なっていてもよい。一実施形態において、オーバーハングはセンス鎖、アンチセンス鎖または両方の鎖の３’－末端に存在する。一実施形態において、この３’－オーバーハングはアンチセンス鎖に存在する。一実施形態において、この３’－オーバーハングはセンス鎖に存在する。
ＲＮＡｉ剤は、単一のオーバーハングのみを含んでいてもよく、これは全体の安定性に影響を与えることなくＲＮＡｉの干渉活性を強化し得る。例えば一本鎖オーバーハングは、センス鎖の３’－末端あるいは、アンチセンス鎖の３’－末端に位置していてもよい。ＲＮＡｉはまた、アンチセンス鎖の５’－末端（もしくはセンス鎖の３’末端）またはその反対に位置する平滑末端を有していてもよい。一般的に、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖は、３’－末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、５’－末端は平滑である。理論に縛られることを望むものではないが、非対称的なアンチセンス鎖の５’－末端の平滑末端およびアンチセンス鎖の３’－末端オーバーハングは、ＲＩＳＣプロセスへのガイド鎖のローディングに好都合である。
本発明において特徴付ける任意の核酸は、当技術分野でよく確立されている方法、例えば「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，」Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ら（編）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳＡに記載されている方法により合成および／または改変することができ、当該文献を参照によって本明細書に組み入れる。改変としては、例えば末端改変、例えば５’－末端改変（リン酸化、コンジュゲーション、逆連結）または３’－末端改変（コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、逆連結等）；塩基改変、例えば安定化塩基、不安定化塩基またはパートナーの拡張レパートリーと塩基対を形成する塩基による置換、塩基の除去（脱塩基ヌクレオチド）またはコンジュゲートした塩基；糖改変（例えば２’位または４’位における）または糖の置換；および／または骨格改変、例えばホスホジエステル結合の改変または置換が挙げられる。本明細書中に記載する実施形態において有用であるｉＲＮＡ化合物の具体的な例としては、非限定的には、改変骨格を含むか、または天然のヌクレオシド間結合を含まないＲＮＡが挙げられる。改変骨格を有するＲＮＡとしては、とりわけ、骨格にリン原子を有さないものが挙げられる。本明細書の目的のために、および当技術分野において時折参照されるように、ヌクレオシド間骨格にリン原子を有さない改変ＲＮＡもまた、オリゴヌクレオシドと考えてもよい。いくつかの実施形態において、改変ｉＲＮＡはそのヌクレオシド間骨格にリン原子を有する。
改変ＲＮＡ骨格としては、例えば通常の３’－５’結合を有するホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート、例えば３’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミデート、例えば３’－アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステルおよびボラノホスフェート、これらの２’－５’結合類似体および、ヌクレオシドユニットの隣接対が３’－５’から５’－３’または２’－５’から５’－２’に連結されている逆転極性を有するものが挙げられる。種々の塩、混合塩および遊離酸形態もまた含まれる。
上述のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許としては、非限定的に、米国特許第３，６８７，８０８号；第４，４６９，８６３号；第４，４７６，３０１号；第５，０２３，２４３号；第５，１７７，１９５号；第５，１８８，８９７号；第５，２６４，４２３号；第５，２７６，０１９号；第５，２７８，３０２号；第５，２８６，７１７号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号；第５，４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２３３号；第５，４６６，６７７号；第５，４７６，９２５号；第５，５１９，１２６号；第５，５３６，８２１号；第５，５４１，３１６号；第５，５５０，１１１号；第５，５６３，２５３号；第５，５７１，７９９号；第５，５８７，３６１号；第５，６２５，０５０号；第６，０２８，１８８号；第６，１２４，４４５号；第６，１６０，１０９号；第６，１６９，１７０号；第６，１７２，２０９号；第６，２３９，２６５号；第６，２７７，６０３号；第６，３２６，１９９号；第６，３４６，６１４号；第６，４４４，４２３号；第６，５３１，５９０号；第６，５３４，６３９号；第６，６０８，０３５号；第６，６８３，１６７号；第６，８５８，７１５号；第６，８６７，２９４号；第６，８７８，８０５号；第７，０１５，３１５号；第７，０４１，８１６号；第７，２７３，９３３号；第７，３２１，０２９号；および米国特許ＲＥ３９４６４が挙げられ、それぞれの内容全体を参照によって本明細書に組み入れる。
その中にリン酸原子を含まない改変ＲＮＡ骨格は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合したヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合または１つまたはそれ以上の短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環式ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ結合（部分的にヌクレオシドの糖部から形成されている）を有するもの；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；および混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成要素部分を含む他のものを含む。
上述のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許としては、非限定的に、米国特許第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５号；第５，１８５，４４４号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５，２３５，０３３号；第５，６４，５６２号；第５，２６４，５６４号；第５，４０５，９３８号；第５，４３４，２５７号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，５４１，３０７号；第５，５６１，２２５号；第５，５９６，０８６号；第５，６０２，２４０号；第５，６０８，０４６号；第５，６１０，２８９号；第５，６１８，７０４号；第５，６２３，０７０号；第５，６６３，３１２号；第５，６３３，３６０号；第５，６７７，４３７号；および第５，６７７，４３９号が挙げられ、それぞれの内容全体を参照によって本明細書に組み入れる。
他の実施形態において、適切なＲＮＡ模倣物がｉＲＮＡにおける使用について考慮されており、ここでヌクレオチドユニットの糖およびヌクレオシド間結合、すなわち骨格は新規の基により置換されている。塩基ユニットは、適当な核酸標的化合物とのハイブリダイズのために維持されている。１つのそのようなオリゴマー化合物である、優れたハイブリダイズ性質を有することが示されているＲＮＡ模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物において、ＲＮＡの糖骨格は、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格により置換されている。核酸塩基は保持されており、直接的または間接的に骨格のアミド部のアザ窒素原子に結合している。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、非限定的に、米国特許第５，５３９，０８２号；第５，７１４，３３１号；および第５，７１９，２６２号が挙げられ、それぞれの内容全体を参照によって本明細書に組み入れる。本発明のｉＲＮＡにおいて使用するのに適切なさらなるＰＮＡ化合物は、例えばＮｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１、２５４、１４９７～１５００に記載されている。
本発明において特徴付けるいくつかの実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するＲＮＡおよびヘテロ原子骨格、特に上記で参照する米国特許第５，４８９，６７７号の－－ＣＨ２－－ＮＨ－－ＣＨ２－、－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ３）－－Ｏ－－ＣＨ２－－［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格としても知られる］、－－ＣＨ２－－Ｏ－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－、－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ３）－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－および－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－ＣＨ２－－［ここで天然のホスホジエステル骨格は－－Ｏ－－Ｐ－－Ｏ－－ＣＨ２－－として表される］および上記で参照する米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格を有するオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書において特徴付けるＲＮＡは、上記で参照する米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有する。
改変ＲＮＡはまた、１つまたはそれ以上の置換糖部分を含むことができる。本明細書中において特徴付けるｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡは、２’位に以下：ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－もしくはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－もしくはＮ－アルキニル；またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルの１つを含んでいてもよく、ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のＣ１からＣ１０アルキルまたはＣ２からＣ１０アルケニルおよびアルキニルであってよい。例示的な適切な改変としては、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）．ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２が挙げられ、ここで、ｎおよびｍは、１から約１０である。他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、２’位に以下：Ｃ１からＣ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリルもしくはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、ｉＲＮＡの薬物動態性質を改善するための基、またはｉＲＮＡの薬力学的性質を改善するための基および類似の性質を有する他の置換基の１つを含む。いくつかの実施形態において、改変は２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９９５、７８：４８６～５０４）すなわちアルコキシ－アルコキシ基を含む。他の例示的な改変は、本明細書中の実施例において下記に示す、２’－ジメチルアミノキシエトキシ、すなわち２’－ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基および２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野において２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’－ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち２’－Ｏ－－ＣＨ２－－Ｏ－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ２）２である。
他の改変としては、２’－メトキシ（２’－ＯＣＨ３）、２’－アミノプロポキシ（２’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）および２’－フルオロ（２’－Ｆ）が挙げられる。類似の改変もまた、ｉＲＮＡのＲＮＡ上の他の位置、特に３’末端ヌクレオチドの３’位または２’－５’結合ｄｓＲＮＡにおいて、および５’末端ヌクレオチドの５’位においてなされていてよい。ｉＲＮＡはまた、ペントフラノシル糖の代わりに糖模倣物、例えばシクロブチル部分を有していてもよい。そのような改変糖構造の調製を教示する代表的な米国特許としては、非限定的に、米国特許第４，９８１，９５７号；第５，１１８，８００号；第５，３１９，０８０号；第５，３５９，０４４号；第５，３９３，８７８号；第５，４４６，１３７号；第５，４６６，７８６号；第５，５１４，７８５号；第５，５１９，１３４号；第５，５６７，８１１号；第５，５７６，４２７号；第５，５９１，７２２号；第５，５９７，９０９号；第５，６１０，３００号；第５，６２７，０５３号；第５，６３９，８７３号；第５，６４６，２６５号；第５，６５８，８７３号；第５，６７０，６３３号；および第５，７００，９２０号が挙げられ、これらの特定のものは、本出願と所有が共通している。上述のそれぞれの内容全体を、参照によって本明細書に組み入れる。
ｉＲＮＡはまた、核酸塩基（当技術分野においては、単純に「塩基」と称することがしばしばである）改変または置換を含んでいてもよい。本明細書中で使用する「非改変」または「天然」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。改変核酸塩基は、他の合成および天然の核酸塩基、例えばデオキシチミン（ｄＴ）、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、５－プロピニルウラシルおよびシトシン、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよび他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチルおよび他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニンおよび３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンを含む。さらなる核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．編 Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ、２００８に記載されているもの；Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８５８～８５９ページ、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ編 Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９０に記載されているもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０、６１３に記載されているものならびにＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ Ｓ．、第１５章、ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２８９～３０２ページ、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３に記載されているものを含む。これらの核酸塩基の特定のものは、本発明において特徴付けるオリゴマー化合物の結合親和性を上昇させるのに特に有用である。これらは、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジンならびにＮ－２、Ｎ－６およびＯ－６置換プリン、例えば２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシンを含む。５－メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６～１．２℃上昇させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．編、ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、１９９３、２７６～２７８ページ）、２’－Ｏ－メトキシエチル糖改変と組み合わせた場合はさらに、特に例示的な塩基置換である。
上述の改変核酸塩基ならびに他の改変核酸塩基の調製を教示する代表的な米国特許としては、非限定的に、上述の米国特許第３，６８７，８０８号、第４，８４５，２０５号；第５，１３０，３０号；第５，１３４，０６６号；第５，１７５，２７３号；第５，３６７，０６６号；第５，４３２，２７２号；第５，４５７，１８７号；第５，４５９，２５５号；第５，４８４，９０８号；第５，５０２，１７７号；第５，５２５，７１１号；第５，５５２，５４０号；第５，５８７，４６９号；第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号；第５，６１４，６１７号；第５，６８１，９４１号；第５，７５０，６９２号；第６，０１５，８８６号；第６，１４７，２００号；第６，１６６，１９７号；第６，２２２，０２５号；第６，２３５，８８７号；第６，３８０，３６８号；第６，５２８，６４０号；第６，６３９，０６２号；第６，６１７，４３８号；第７，０４５，６１０号；第７，４２７，６７２号；および第７，４９５，０８８号が挙げられ、それぞれの内容全体を参照によって本明細書に組み入れる。
ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、１つまたはそれ以上の二環式糖部分を含むように改変されていてもよい。「二環式糖」は、２つの原子の架橋により改変されているフラノシル環である。「二環式ヌクレオシド」（「ＢＮＡ」）は、糖環の２つの炭素原子を結合する架橋を含む糖部分を有することにより、二環式環系を形成するヌクレオシドである。特定の実施形態において、架橋は糖環の４’－炭素および２’－炭素を結合する。したがって、いくつかの実施形態において本発明の剤は、１つまたはそれ以上のロック核酸（ＬＮＡ）を含むように改変されていてもよいｉＲＮＡのＲＮＡを含んでいてもよい。ロック核酸は、リボース部分が２’および４’炭素を結合する過剰な架橋を含む、改変リボース部分を有するヌクレオチドである。言い換えれば、ＬＮＡは４’－ＣＨ２－Ｏ－２’架橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオチドである。この構造は、３’－末端構造的立体構造においてリボースを有効に「ロック」する。ロック核酸のｓｉＲＮＡへの付加は、血清中のｓｉＲＮＡ安定性を上昇させ、オフターゲット効果を低下させることが示されている（Ｅｌｍｅｎ，Ｊ．ら、（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ３３（１）：４３９～４４７；Ｍｏｏｋ，ＯＲ．ら、（２００７）Ｍｏｌ Ｃａｎｃ Ｔｈｅｒ ６（３）：８３３～８４３；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ，Ａ．ら、（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ３１（１２）：３１８５～３１９３）。
本発明のポリヌクレオチドにおいて使用するための二環式ヌクレオシドの例は、非限定的には、４’および２’リボシル環原子間に架橋を含むヌクレオシドを含む。特定の実施形態において、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド剤は、４’から２’の架橋を含む１つまたはそれ以上の二環式ヌクレオシドを含む。そのような４’から２’に架橋された二環式ヌクレオシドの例としては、非限定的には４’－（ＣＨ２）－Ｏ－２’（ＬＮＡ）；４’－（ＣＨ２）－Ｓ－２’；４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’（ＥＮＡ）；４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’（「拘束エチル」または「ｃＥｔ」とも称する）および４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）－Ｏ－２’（およびその類似体；例えば米国特許第７，３９９，８４５号参照）；４’－Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）－Ｏ－２’（およびその類似体；例えば米国特許第８，２７８，２８３号参照）；４’－ＣＨ２－Ｎ（ＯＣＨ３）－２’（およびその類似体；例えば米国特許第８，２７８，４２５号参照）；４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－２’（例えば米国特許公開第２００４／０１７１５７０号参照）；４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’が挙げられ、ここで、Ｒは、Ｈ、Ｃ１－Ｃ１２アルキルまたは保護基（例えば米国特許第７，４２７，６７２号参照）；４’－ＣＨ２－Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）－２’（例えばＣｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００９、７４、１１８～１３４参照）；および４’－ＣＨ２－Ｃ（＝ＣＨ２）－２’（およびその類似体；例えば米国特許第８，２７８，４２６参照）が挙げられる。上述のそれぞれの内容全体を参照によって本明細書に組み入れる。
ロック核酸ヌクレオチドの調製を教示するさらなる代表的な米国特許および米国特許公開としては、非限定的には、以下：米国特許第６，２６８，４９０号；第６，５２５，１９１号；第６，６７０，４６１号；第６，７７０，７４８号；第６，７９４，４９９号；第６，９９８，４８４号；第７，０５３，２０７号；第７，０３４，１３３号；第７，０８４，１２５号；第７，３９９，８４５号；第７，４２７，６７２号；第７，５６９，６８６号；第７，７４１，４５７号；第８，０２２，１９３号；第８，０３０，４６７号；第８，２７８，４２５号；第８，２７８，４２６号；第８，２７８，２８３号；米国特許公開第２００８／００３９６１８号；および米国特許公開第２００９／００１２２８１号が挙げられ、それぞれの内容全体を参照によって本明細書に組み入れる。
上述の二環式ヌクレオシドはいずれも、例えばα－Ｌ－リボフラノースおよびβ－Ｄ－リボフラノースを含む１つまたはそれ以上の立体化学糖構成を有するように調製してもよい（国際公開第９９／１４２２６号参照）。
ｉＲＮＡのＲＮＡは、１つまたはそれ以上の拘束されたエチルヌクレオチドを含むように改変されていてもよい。本明細書中で使用する「拘束されたエチルヌクレオチド」または「ｃＥｔ」は４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’架橋を含む二環式糖部分を含むロック核酸である。一実施形態において、拘束されたエチルヌクレオチドは、本明細書中において「Ｓ－ｃＥｔ」と称するＳ立体化学構造にある。
本発明のｉＲＮＡはまた、１つまたはそれ以上の「立体構造的に制限されたヌクレオチド」（「ＣＲＮ」）を含んでいてもよい。ＣＲＮは、リボースのＣ２’およびＣ４’炭素またはリボースのＣ３および－Ｃ５’炭素を結合するリンカーを有するヌクレオチド類似体である。ＣＲＮは、リボース環を安定な立体構造にロックし、ｍＲＮＡへのハイブリダイズ親和性を上昇させる。リンカーは、リボース環のパッカリングをもたらしにくくする、安定性および親和性について最適な位置に酸素を配置するのに十分な長さである。
上記のＣＲＮの特定のものの調製を教示する代表的な出版物としては、非限定的に、米国特許公開第２０１３／０１９０３８３号；およびＰＣＴ公開国際公開第２０１３／０３６８６８号が挙げられ、それぞれの内容全体を参照によって本明細書に組み入れる。
本発明のｉＲＮＡの１つまたはそれ以上のヌクレオチドはまた、ヒドロキシメチル置換ヌクレオチドを含んでいてもよい。「ヒドロキシメチル置換ヌクレオチド」は、非環式２’－３’－セコ－ヌクレオチドであり、「非ロック核酸」（「ＵＮＡ」）改変とも称する。
ＵＮＡの調製を教示する代表的な米国出版物としては、非限定的に、米国特許第８，３１４，２２７号；および米国特許公開第２０１３／００９６２８９号；第２０１３／００１１９２２号；および第２０１１／０３１３０２０号が挙げられ、それぞれの内容全体を参照によって本明細書に組み入れる。
ＲＮＡ分子の末端に対する潜在的な安定化改変としては、Ｎ－（アセチルアミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－ＮＨＡｃ）、Ｎ－（カプロイル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６）、Ｎ－（アセチル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－ＮＨＡｃ）、チミジン－２’－Ｏ－デオキシチミジン（エーテル）、Ｎ－（アミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－アミノ）、２－ドコサノイル－ウリジン－３”－ホスフェート、逆位塩基ｄＴ（ｉｄＴ）等が挙げられる。この改変の開示は、ＰＣＴ公開国際公開第２０１１／００５８６１号に見られる。
本発明の特定の態様において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、例えば２０１１年１１月１８日に出願された、米国仮特許出願第６１／５６１，７１０号、または２０１２年１１月１６日に出願された第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６５６９１号に開示されている化学的改変を有する剤を含み、それぞれの内容全体を参照によって本明細書に組み入れる。
本発明の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤は、場合により１つまたはそれ以上のリガンドにコンジュゲートしていてもよい。リガンドは、３’－末端、５’－末端または両方の末端においてセンス鎖、アンチセンス鎖または両方の鎖に結合していてもよい。例えば、リガンドは、センス鎖にコンジュゲートしていてよい。好ましい実施形態において、リガンドはセンス鎖の３’－末端にコンジュゲートしている。
一実施形態において、リガンドは炭水化物コンジュゲート、例えば単糖である。一実施形態において、リガンドはＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）またはＧａｌＮＡｃ誘導体である。本発明の特定の実施形態において、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、一価のリンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合している。いくつかの実施形態において、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、二価のリンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合している。本発明のさらに他の実施形態において、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、三価のリンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合している。適切なリガンドは、例えば米国特許出願第１５／３７１，３００号および米国特許公開第２００９／０２３９８１４号に開示されており、適切なリガンドに関連する、それぞれの内容全体を参照によって本明細書に組み入れる。
いくつかの実施形態において、リガンド、例えばＧａｌＮＡｃリガンドは、ＲＮＡｉ剤の３’末端に結合している。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、次の図式
Figure 2022517270000029
 に示すように、リンカーを介してリガンド、例えばＧａｌＮＡｃリガンドにコンジュゲートしており、
式中、ＸはＯまたはＳである。一実施形態において、ＸはＯである。
ＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許としては、非限定的に、米国特許第４，８２８，９７９号；第４，９４８，８８２号；第５，２１８，１０５号；第５，５２５，４６５号；第５，５４１，３１３号；第５，５４５，７３０号；第５，５５２，５３８号；第５，５７８，７１７、第５，５８０，７３１号；第５，５９１，５８４号；第５，１０９，１２４号；第５，１１８，８０２号；第５，１３８，０４５号；第５，４１４，０７７号；第５，４８６，６０３号；第５，５１２，４３９号；第５，５７８，７１８号；第５，６０８，０４６号；第４，５８７，０４４号；第４，６０５，７３５号；第４，６６７，０２５号；第４，７６２，７７９号；第４，７８９，７３７号；第４，８２４，９４１号；第４，８３５，２６３号；第４，８７６，３３５号；第４，９０４，５８２号；第４，９５８，０１３号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，２４５，０２２号；第５，２５４，４６９号；第５，２５８，５０６号；第５，２６２，５３６号；第５，２７２，２５０号；第５，２９２，８７３号；第５，３１７，０９８号；第５，３７１，２４１、５，３９１，７２３号；第５，４１６，２０３号、第５，４５１，４６３号；第５，５１０，４７５号；第５，５１２，６６７号；第５，５１４，７８５号；第５，５６５，５５２号；第５，５６７，８１０号；第５，５７４，１４２号；第５，５８５，４８１号；第５，５８７，３７１号；第５，５９５，７２６号；第５，５９７，６９６号；第５，５９９，９２３号；第５，５９９，９２８および５，６８８，９４１号；第６，２９４，６６４号；第６，３２０，０１７号；第６，５７６，７５２号；第６，７８３，９３１号；第６，９００，２９７号；第７，０３７，６４６号；第８，１０６，０２２号が挙げられ、それぞれの内容全体を参照によって本明細書に組み入れる。
所与の化合物の全ての位置が均一に改変されている必要はなく、実際、１を超える上述の改変が単一の化合物またはｉＲＮＡ内の単一のヌクレオシドにおいても取り込まれる。本発明はまた、キメラ化合物であるｉＲＮＡ化合物を含む。
本発明の文脈において、「キメラ」ｉＲＮＡ化合物または「キメラ」は、少なくとも１つのモノマーユニット、すなわちｄｓＲＮＡ化合物の場合はヌクレオチドからそれぞれなる、２つまたはそれ以上の化学的に異なる領域を含むｉＲＮＡ化合物、好ましくはｄｓＲＮＡである。これらのｉＲＮＡは、典型的には、ｉＲＮＡにヌクレアーゼ分解に対する耐性の上昇、細胞取込みの上昇および／または標的核酸への結合親和性の上昇を付与するようにＲＮＡが改変されている、少なくとも１つの領域を含む。ｉＲＮＡのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素の基質として作用し得る。例えば、ＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮａｓｅＨの活性化は、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それにより遺伝子発現のｉＲＮＡ阻害の効能を大幅に増強する。結果として、キメラｄｓＲＮＡを使用した場合に、同一の標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、より短いｉＲＮＡにより同等の結果が得られることがしばしばである。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動および、必要な場合は、当技術分野で公知の関連する核酸ハイブリダイズ技術によって日常的に検出される。
特定の例において、ｉＲＮＡのＲＮＡは、非リガンド基によって改変されていてもよい。多数の非リガンド分子が、ｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞取込みを増強するためにコンジュゲートされており、そのようなコンジュゲーションを実施するための手順は、科学的文献において入手可能である。そのような非リガンド部分は、脂質部分、例えばコレステロール（Ｋｕｂｏ，Ｔ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、２００７、３６５（１）：５４～６１；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８９、８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１９９４、４：１０５３）、チオエーテル、例えばヘキシル－Ｓ－トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９２、６６０：３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．、１９９３、３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．、１９９２、２０：５３３）、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９９１、１０：１１１；Ｋａｂａｎｏｖら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１９９０、２５９：３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、１９９３、７５：４９）、リン脂質、例えばジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９９５、３６：３６５１；Ｓｈｅａら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．、１９９０、１８：３７７７）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９５、１４：９６９）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１９９５、３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９９５、１２６４：２２９）またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、１９９６、２７７：９２３）を含んでいる。そのようなＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許は上に列挙した。典型的なコンジュゲーションプロトコルは、配列の１つまたはそれ以上の位置にアミノリンカーを保有するＲＮＡの合成を伴う。次いでアミノ基を適当なカップリングまたは活性化試薬を用いてコンジュゲートした分子と反応させる。コンジュゲーション反応は、固体支持体に結合したままであるＲＮＡとともに、または液相においてＲＮＡの切断後に実施してもよい。典型的に、ＨＰＬＣによるＲＮＡコンジュゲートの精製により純粋なコンジュゲートが得られる。
Ｖ．本発明の医薬組成物の使用
本発明の医薬組成物は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１発現の低下から利益を得るであろう障害、例えば出血障害、例えば血友病（例えば血友病Ａ、血友病Ｂまたは血友病Ｃ）を有する対象の治療的および予防的処置に有用である。
本明細書中で使用する用語「処置する」または「処置」は、非限定的に、１つまたはそれ以上の症候の軽減または寛解、出血度の低下、出血状態の安定化（すなわち悪化しない）、検出可能でも検出不能であっても、出血の寛解または緩和または出血の解決を含む、有益または所望の結果を指す。「処置」はまた、処置を行わない場合に予期される生存と比較して、生存を延長することを意味し得る。本発明の方法において、処置は、要求に応じた処置および出血エピソードの制御、出血の周術期管理および出血エピソードの頻度を低下させるための日常的な予防を含む。
対象におけるＳｅｒｐｉｎｃ１のレベルまたは疾患マーカーもしくは症候の文脈における用語「より低い」は、そのようなレベルの統計学的に有意な低下を指す。低下は、例えば少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上であってよく、そのような障害を有していない個体の正常の範囲内と受け入れられるレベルまで低下することが好ましい。
本明細書中で使用する、「予防」または「予防する」は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現の低下から利益を得るであろう疾患、障害またはその症状に関して使用する場合、対象がそのような疾患、障害または症状に関連する症候、例えば出血のような症候を発症する可能性の低下を指す。出血を発症する可能性は、例えば出血に関する１つまたはそれ以上の危険性因子を有する個体が、出血を発症しないか、または同じ危険性因子を有し、本明細書に記載する処置を受けていない集団と比較して重症度が低い出血を発症するいずれかの場合に低下している。疾患、障害もしくは症状を発症しないこと、または疾患、障害もしくは症状に関連する症候の発症の低下（例えば前記疾患または障害について臨床的に認可されている尺度について少なくとも約１０％）または症候の遅延が示されること（例えば日単位、週単位、月単位または年単位）は有効な予防と考えられる。
Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子発現の低下および／または阻害から利益を得るであろう対象は、出血障害、例えば本明細書中に記載する遺伝性出血障害または後天性出血障害を有する対象である。一実施形態において、遺伝性出血障害を有する対象は、血友病、例えば血友病Ａ、ＢまたはＣを有する。一実施形態において、遺伝性出血障害、例えば血友病を有する対象はインヒビター対象（補充凝血因子に不応性になっている対象）である。一実施形態において、インヒビター対象は血友病Ａを有する。他の実施形態において、インヒビター対象は血友病Ｂを有する。さらに他の実施形態において、インヒビター対象は血友病Ｃを有する。Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子発現の低下および／または阻害から利益を得るであろう対象の処置は、治療的（例えば必要に応じて、例えば対象が出血（自発的出血または外傷の結果としての出血）しており、凝固することができない）処置および予防的（例えば対象は出血していない、および／または外科手術を受けることになっている）処置を含む。
本明細書中において使用する用語「出血障害」は、不十分な血液凝固および／または過剰な出血をもたらす疾患または障害である。出血障害は、遺伝性障害、例えば血友病またはフォンヴィレブランド病である場合も、または、例えば播種性血管内凝血、妊娠関連子癇、ビタミンＫ欠乏、自己免疫障害、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、皮膚科学的障害（例えば乾癬、天疱瘡）、呼吸器疾患（例えば喘息、慢性閉塞性肺疾患）、アレルギー性薬物反応、例えばアスピリン、ヘパリンおよびワルファリンのような投薬の結果、糖尿病、急性Ｂ型肝炎感染、急性Ｃ型肝炎感染、悪性もしくは固形腫瘍（例えば前立腺、肺、結腸、すい臓、胃、胆管、頭頚部、頸部、乳房、黒色腫、腎臓および／または血液学的悪性腫瘍）に関連する後天性障害である場合もある。一実施形態において、遺伝性出血障害は血友病、例えば血友病Ａ、ＢまたはＣである、一実施形態において、遺伝性出血障害、例えば血友病を有する対象は、補充凝血療法に対するインヒビター、例えば同種抗体インヒビターを生じ、本明細書中において「インヒビター対象」と称される。一実施形態において、インヒビター対象は血友病Ａを有する。他の実施形態において、インヒビター対象は血友病Ｂを有する。さらに他の実施形態において、インヒビター対象は血友病Ｃを有する。
一実施形態において、出血障害は希少出血障害（ＲＢＤ）である。ＲＢＤは、後天性ＲＢＤであってもまたは遺伝性ＲＢＤであってもよい。遺伝性ＲＢＤは、凝血因子フィブリノーゲン、ＦＩＩ、ＦＶ、組み合わせたＦＶおよびＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩＩならびにビタミンＫ依存性因子（ＶＫＣＦＤ）の先天性欠損に関連する障害を含む。それらは一般的に常染色体劣性条件として伝えられるが、いくつかの場合、例えばＦＸＩおよび異常フィブリノーゲン血症は常染色体優性であり得る。ＲＢＤは、ほとんどの集団において、ＦＶＩＩ欠損についての５００，０００中１からプロトロンビンおよびＦＸＩＩＩ欠損についての２百万から３百万中１まで変動する、ホモ接合型または二重ヘテロ接合型発症率で報告されている。相対頻度は集団間で変動し、血族婚または族内婚姻が一般的である場合により高くなり、特定の変異遺伝子の頻度が上昇する。
例示的なＲＢＤとしては、無フィブリノーゲン血症（フィブリノーゲン；第Ｉ因子欠損）；低フィブリノーゲン血症（フィブリノーゲン；第Ｉ因子欠損）；異常フィブリノーゲン血症（フィブリノーゲン；第Ｉ因子欠損）；低異常フィブリノーゲン血症（フィブリノーゲン；第Ｉ因子欠損）；低プロトロンビン血症（プロトロンビン；第ＩＩ因子欠損）；プロトロンビン欠損（プロトロンビン；第ＩＩ因子欠損）；栓友病（プロトロンビン；第ＩＩ因子欠損）；先天性抗トロンビンＩＩＩ欠損（トロンボプラスチン；第ＩＩＩ因子；組織因子）；パラ血友病（プロアクセレリン；第Ｖ因子；不安定因子）；オーレン病（プロアクセレリン；第Ｖ因子；不安定因子）；活性化プロテインＣ抵抗性（プロアクセレリン；第Ｖ因子；不安定因子）；アレキサンダー病（安定因子プロコンバーチン；第ＶＩＩ因子）；先天性プロコンバーチン／第ＶＩＩ因子欠損（安定因子プロコンバーチン；第ＶＩＩ因子）；スチュアート－プロワー欠損（スチュアート－プロワー因子；第Ｘ因子）；先天性第ＸＩＩＩａ／ｂ因子欠損（フィブリン安定化因子；第ＸＩＩＩ因子である）；遺伝性第ＸＩＩＩ因子欠損（フィブリン安定化因子；第ＸＩＩＩ因子）；およびフィブリン安定化因子欠損（フィブリン安定化因子；第ＸＩＩＩ因子）が挙げられる。
本明細書中で使用する「治療的有効量」は、出血障害および出血を有する対象に投与した際に、疾患の処置（例えば既存の疾患または疾患の１つまたはそれ以上の症候を軽減、寛解または維持することによる）をもたらすのに十分なＲＮＡｉ剤の量を含むことが意図されている。「治療的有効量」は、ＲＮＡｉ剤、剤が投与される方法、疾患およびその重症度および処置する対象の病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、存在する場合は先行するもしくは同時の処置の種類、および他の個々の特徴に依存して変動し得る。
本明細書中で使用する「予防的有効量」は、出血障害を有するが出血していない対象、例えば出血障害を有しており外科手術が予定されている対象に投与される際に（例えば周術期処置）、疾患または疾患の１つまたはそれ以上の症候を予防または寛解させるのに十分なｉＲＮＡの量を含むことが意図されている。
疾患の寛解は、疾患の経過を遅延化または後期発症疾患の重症度を低下させることを含む。「予防的有効量」は、ｉＲＮＡ、剤が投与される方法、疾患の危険性の程度および処置する対象の病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、存在する場合は先行するもしくは同時の処置の種類、および処置する対象の他の個々の特徴に依存して変動し得る。
「治療的有効量」または「予防的有効量」はまた、任意の処置に対して適用可能な合理的な利益／危険性比率で、いくつかの所望の局所的または全身性の効果をもたらすＲＮＡｉ剤の量を含む。本発明の方法において使用されるｉＲＮＡは、そのような処置に対して適用可能な合理的な利益／危険性比率をもたらすのに十分な量で投与してもよい。
「補充因子の推奨治療的有効量」および「バイパス剤の推奨治療的有効量」は、血友病の世界連合に示される、出血を有する対象においてトロンビンを産生し、出血を解決するのに十分なおよび／または、血漿因子のピークレベルを達成するのに十分な、補充因子またはバイパス剤それぞれの用量である（例えば、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら、「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ」、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｅｐｕｂ ６ Ｊｕｌｙ ２０１２；ＤＯＩ：１０．１１１１／ｊ．１３６５－２５１６．２０１２．０２９０９．ｘ；ＡＤＶＡＴＥ（抗血友病因子（組換え））添付文書；１１／２０１６；およびＢｅｎｅＦＩＸ（凝血第ＩＸ因子（組換え）添付文書；１１／２０１１を参照のこと。前述のそれぞれの内容全体を参照によって本明細書に組み入れる。
例えば、軽度の出血を有する対象についての補充因子またはバイパス剤の推奨用量は、ピーク血漿第ＶＩＩＩ因子レベル約１０～４０ＩＵ／ｄＬを達成するのに十分な用量であり；中度の出血を有する対象についての補充因子またはバイパス剤の推奨用量は、ピーク血漿第ＶＩＩＩ因子レベル約３０～６０ＩＵ／ｄＬを達成するのに十分な用量であり；重度の出血を有する対象についての補充因子またはバイパス剤の推奨用量は、ピーク血漿第ＶＩＩＩ因子レベル約６０～１００ＩＵ／ｄＬを達成するのに十分な用量であり；周術期の対象についての補充因子またはバイパス剤の推奨用量は、ピーク血漿第ＶＩＩＩ因子レベル約３０～６０ＩＵ／ｄＬを達成するのに十分な用量である（例えばＡＤＶＡＴＥ（抗血友病因子（組換え））添付文書；１１／２０１６の表１および２を参照のこと）。
軽度の出血を有する対象についての補充因子またはバイパス剤の推奨用量は、ピーク血漿第ＩＸ因子レベル約１０～３０ＩＵ／ｄＬを達成するのに十分な用量であり；中度の出血を有する対象についての補充因子またはバイパス剤の推奨用量は、ピーク血漿第ＩＸ因子レベル約２５～５０ＩＵ／ｄＬを達成するのに十分な用量であり；重度の出血を有する対象についての補充因子またはバイパス剤の推奨用量は、ピーク血漿第ＩＸ因子レベル約５０～１００ＩＵ／ｄＬを達成するのに十分な用量である。
本発明の方法および医薬組成物の使用は、一般的にＳｅｒｐｉｎｃ１－関連障害、例えば出血障害、例えば血友病（例えば血友病Ａ、血友病Ｂまたは血友病Ｃ）を有する対象に、本発明の医薬組成物を投与することを含む。本発明のいくつかの態様において、前記方法は、さらなる治療剤を対象に投与することをさらに含む。
したがって、一態様において、本発明は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１発現の低下から利益を得るであろう障害、例えば出血障害、例えば血友病を有する対象における少なくとも１つの症候を予防する方法を提供する。前記方法は、対象、例えばヒトに、本発明のｉＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡを予防的有効量、例えば約２５ｍｇから１００ｍｇの固定用量、例えば約８０ｍｇの固定用量で含む本発明の医薬組成物を投与することにより、Ｓｅｒｐｉｎｃ１発現の低下から利益を得るであろう障害を有する対象における少なくとも１つの症候を予防することを含む。
他の態様において、本発明は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１発現の低下から利益を得るであろう障害、例えば出血障害、例えば血友病を有する対象を処置する方法であって、対象、例えばヒトに、治療的有効量、例えば約２５から約１００ｍｇの固定用量、例えば約８０ｍｇの固定用量で、Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む本発明の医薬組成物か、またはＳｅｒｐｉｎｃ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物を投与し、それによりＳｅｒｐｉｎｃ１発現の低下から利益を得るであろう障害を有する対象を処置することを含む、方法を提供する。
特定の実施形態において、本発明の治療的方法および予防的方法は、例えば対象におけるＳｅｒｐｉｎｃ１活性を約７５％またはそれ以上低下させる量の本発明のｉＲＮＡ剤および、例えば血友病の世界連合（例えばＳｒｉｖａｓｔａｖａら、「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ」、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｅｐｕｂ ６ Ｊｕｌｙ ２０１２；ＤＯＩ：１０．１１１１／ｊ．１３６５－２５１６．２０１２．０２９０９．ｘ）および／または食品医薬品局（（例えばＡＤＶＡＴＥ（抗血友病因子（組換え））添付文書；１１／２０１６；ＢｅｎｅＦＩＸ（凝血第ＩＸ因子（組換え）添付文書；１１／２０１１参照）により推奨されている補充因子またはバイパス剤の推奨治療的有効量（例えばトロンビンを産生し、出血を解決する（血餅を形成する）のに十分な量）と比較して、低下している治療的有効量の補充因子またはバイパス剤を含む医薬組成物を対象に投与することを含む。上述のそれぞれの内容全体を参照によって本明細書に組み入れる。
適切な補充因子としては、第ＶＩＩＩ因子、例えばＡｄｖａｔｅ、Ｅｌｏｃｔａｔｅ、Ｈａｅｍａｔｅ、Ｈｅｌｉｘａｔｅ、Ｉｍｍｕｎａｔｅ、Ｏｃｔａｎａｔｅ、ＲｅｃｏｍｂｉｎａｔｅおよびＲｅｆａｃｔｏ、または第ＩＸ因子、例えばＡｉｍａｆｉｘ、Ｂｅｎｅｆｉｘ、ＩｍｍｕｎｉｎｅおよびＲｅｆａｃｔｏが挙げられる。本発明の方法において使用するための適切なバイパス剤としては、例えばＦＥＩＢＡおよびＰｒｏｔｈｒｏｍｐｌｅｘならびに組換え第ＶＩＩａ因子（ｒＦＶＩＩａ）、例えばＮｏｖｏＳｅｖｅｎを含む活性化プロトロンビン濃縮物（ａＰＣＣ）が挙げられる。
補充因子は第ＶＩＩＩ因子であってもよく、本発明の方法において対象に投与される補充因子の治療的有効量は、ピーク血漿第ＶＩＩＩ因子レベル約１０～１００ＩＵ／ｄＬ、例えば約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または約１００ＩＵ／ｄＬを達成するのに十分な用量である。
例えば、対象に投与される第ＶＩＩＩ補充因子の治療的有効量は、約２００ＩＵ／ｋｇ未満、または約１９０ＩＵ／ｋｇ未満、または約１８０ＩＵ／ｋｇ未満、または約１７０ＩＵ／ｋｇ未満、または約１６０ＩＵ／ｋｇ未満、または約１５０ＩＵ／ｋｇ未満、または約１４０ＩＵ／ｋｇ未満、または約１３０ＩＵ／ｋｇ未満、または約１２０ＩＵ／ｋｇ未満、または約１１０ＩＵ／ｋｇ未満、または約１００ＩＵ／ｋｇ未満、または約９０ＩＵ／ｋｇ未満、または約８０ＩＵ／ｋｇ未満、または約７０ＩＵ／ｋｇ未満、または約６０ＩＵ／ｋｇ未満、または約５０ＩＵ／ｋｇ未満、または約４０ＩＵ／ｋｇ未満、または約３０ＩＵ／ｋｇ未満、または約２０ＩＵ／ｋｇ未満、または約１０ＩＵ／ｋｇ未満であってもよい。一実施形態において、対象に投与される第ＶＩＩＩ因子の治療的有効量は、補充因子の推奨有効量の約１．５分の１から約５分の１、例えば約５から約２０ＩＵ／ｋｇまたは約１０から約２０ＩＵ／ｋｇ、例えば５、１０、１５または２０ＩＵ／ｋｇの用量である。一実施形態において、出血イベントは中度の出血イベントである。他の実施形態において、出血イベントは重度の出血イベントである。
補充因子は第ＩＸ因子であってもよく、本発明の方法において対象に投与される補充因子の治療的有効量は、ピーク血漿第ＩＸ因子レベル約１０～１００ＩＵ／ｄＬ、例えば約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または約１００ＩＵ／ｄＬを達成する用量である。
例えば、第ＩＸ因子補充因子の治療的有効量は、約２００ＩＵ／ｋｇ未満、または約１９０ＩＵ／ｋｇ未満、または約１８０ＩＵ／ｋｇ未満、または約１７０ＩＵ／ｋｇ未満、または約１６０ＩＵ／ｋｇ未満、または約１５０ＩＵ／ｋｇ未満、または約１４０ＩＵ／ｋｇ未満、または約１３０ＩＵ／ｋｇ未満、または約１２０ＩＵ／ｋｇ未満、または約１１０ＩＵ／ｋｇ未満、または約１００ＩＵ／ｋｇ未満、または約９０ＩＵ／ｋｇ未満、または約８０ＩＵ／ｋｇ未満、または約７０ＩＵ／ｋｇ未満、約６０ＩＵ／ｋｇ未満、または約５０ＩＵ／ｋｇ未満、または約４０ＩＵ／ｋｇ未満、または約３０ＩＵ／ｋｇ未満、または約２０ＩＵ／ｋｇ未満、または約１０ＩＵ／ｋｇ未満であってもよい。一実施形態において、対象に投与される第ＩＸ因子の治療的有効量は、補充因子の推奨有効量の約２分の１から約６分の１、例えば約１０から約３０ＩＵ／ｋｇまたは約２０から約３０ＩＵ／ｋｇ、例えば約１０、１５、２０、２５または３０ＩＵ／ｋｇである。一実施形態において、出血イベントは、中度の出血イベントである。他の実施形態において、出血イベントは重度の出血イベントである。
バイパス剤はａＰＣＣであってよく、本発明の方法において対象に投与されるバイパス剤の治療的有効量は、トロンビンを産生し、出血を解決するのに十分な用量である。
例えば、バイパス剤ａＰＣＣの治療的有効量は、約１００Ｕ／ｋｇ未満、または約９０Ｕ／ｋｇ未満、または約８０Ｕ／ｋｇ未満、または約７０Ｕ／ｋｇ未満、または約６０Ｕ／ｋｇ未満、または約５０Ｕ／ｋｇ未満、または約４０Ｕ／ｋｇ未満、または約３０Ｕ／ｋｇ未満、または約２０Ｕ／ｋｇ未満、または約１０Ｕ／ｋｇ未満であってもよい。一実施形態において、対象に投与されるａＰＣＣの治療的有効量は、補充因子の推奨有効量の約２分の１から約３分の１、例えば約３０から約５０Ｕ／ｋｇ、例えば３０、３５、４０、４５または５０Ｕ／ｋｇの用量である。一実施形態において、出血イベントは、中度の出血イベントである。他の実施形態において、出血イベントは重度の出血イベントである。
バイパス剤は、ｒＦＶＩＩａであってもよく、本発明の方法において対象に投与されるバイパス剤の治療的有効量は、トロンビンを産生し、出血を解決するのに十分な用量である。
例えば、バイパス剤ｒＦＶＩＩａの治療的有効量は、約１２０μｇ／ｋｇ未満、または約１１０μｇ／ｋｇ未満、または約１００μｇ／ｋｇ未満、または約９０μｇ／ｋｇ未満、または約８０μｇ／ｋｇ未満、または約７０μｇ／ｋｇ未満、または約６０μｇ／ｋｇ未満、または約５０μｇ／ｋｇ未満、または約４０μｇ／ｋｇ未満、または約３０μｇ／ｋｇ未満、または約２０μｇ／ｋｇ未満である。一実施形態において、対象に投与されるｒＦＶＩＩａの治療的有効量は、補充因子の推奨用量の約２分の１、例えば約４５μｇ／ｋｇの用量である。一実施形態において、出血イベントは中度の出血イベントである。他の実施形態において、出血イベントは重度の出血イベントである。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤を含む医薬組成物は、固定用量で対象に投与される。「固定用量」（例えばｍｇ単位の用量）は、１用量のｉＲＮＡ剤が、任意の特定の対象関連因子、例えば体重にかかわらず全ての対象に用いられることを意味する。特定の一実施形態において、本発明のｉＲＮＡ剤の固定用量は、事前に決定した体重または年齢に基づく。
いくつかの実施形態において、ｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物は、約２５ｍｇから約１００ｍｇの間、例えば約２５ｍｇから約９５ｍｇの間、約２５ｍｇから約９０ｍｇの間、約２５ｍｇから約８５ｍｇの間、約２５ｍｇから約８０ｍｇの間、約２５ｍｇから約７５ｍｇの間、約２５ｍｇから約７０ｍｇの間、約２５ｍｇから約６５ｍｇの間、約２５ｍｇから約６０ｍｇの間、約２５ｍｇから約５０ｍｇの間、約５０ｍｇから約１００ｍｇの間、約５０ｍｇから約９５ｍｇの間、約５０ｍｇから約９０ｍｇの間、約５０ｍｇから約８５ｍｇの間、約５０ｍｇから約８０ｍｇの間、約３０ｍｇから約１００ｍｇの間、約３０ｍｇから約９０ｍｇの間、約３０ｍｇから約８０ｍｇの間、約４０ｍｇから約１００ｍｇの間、約４０ｍｇから約９０ｍｇの間、約４０ｍｇから約８０ｍｇの間、約６０ｍｇから約１００ｍｇの間、約６０ｍｇから約９０ｍｇの間、約２５ｍｇから約５５ｍｇの間、約３０ｍｇから約９５ｍｇの間、約３０ｍｇから約８５ｍｇの間、約３０ｍｇから約７５ｍｇの間、約３０ｍｇから約６５ｍｇの間、約３０ｍｇから約５５ｍｇの間、約４０ｍｇから約９５ｍｇの間、約４０ｍｇから約８５ｍｇの間、約４０ｍｇから約７５ｍｇの間、約４０ｍｇから約６５ｍｇの間、約４０ｍｇから約５５ｍｇの間、または約４５ｍｇから約９５ｍｇの間の固定用量で投与される。
いくつかの実施形態において、ｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物は、約２５ｍｇ、約３０ｍｇ、約３５ｍｇ、約４０ｍｇ、約４５ｍｇ、約５０ｍｇ、約５５ｍｇ、約６０ｍｇ、約６５ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、約８０ｍｇ、約８５ｍｇ、約９０ｍｇ、約９５ｍｇ、または約１００ｍｇの固定用量で投与される。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は約１００ｍｇの固定用量で対象に投与される。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤はＳｅｒｐｉｎｃ１活性を約７５％またはそれ以上低下させる用量で対象に投与される。
ｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物は、１つまたはそれ以上の用量として対象に投与される。
ｉＲＮＡを含む医薬組成物は、約１か月に１回、約５週間ごとに１回、約６週間ごとに１回、約２か月ごとに１回または四半期に１回対象に投与される。
いくつかの実施形態において、医薬組成物の単回用量は、後続の用量が長くとも１、２、３、４、５、６、７または８週間の間隔で投与されるように長時間持続性であってもよい。本発明のいくつかの実施形態において、医薬組成物の単回用量は１か月に１回投与される。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤の固定用量は、１か月に１回、例えば８０ｍｇの固定用量で１か月に１回対象に投与するのに適切である。
本発明の方法および使用は、本明細書中に記載する組成物を、標的Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現が低下するように、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９または約８０日間、投与することを含む。一実施形態において、標的Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現は、延長期間、例えば少なくとも約７日またはそれ以上、例えば約１週間、２週間、３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約２か月、約四半期またはそれ以上低下する。
遺伝子発現の低下は、当技術分野で公知の任意の方法により評価できる。例えば、Ｓｅｒｐｉｎｃ１の発現の低下は、当業者には日常的な方法、例えばノーザンブロッティング、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いてＳｅｒｐｉｎｃ１のｍＲＮＡ発現レベルを決定すること、当業者には日常的な方法、例えばウェスタンブロッティング、免疫学的な技術を用いてＳｅｒｐｉｎｃ１のタンパク質レベルを決定することおよび／またＳｅｒｐｉｎｃ１の生物学的な活性、例えば細胞の血液凝固機構に関連する（またはインビボ条件においては、血液凝固自体における）１つまたはそれ以上の分子への影響を決定することによって決定される。一実施形態において、トロンビン産生時間、血餅形成時間および／または凝固時間を決定し、例えば全血のＲＯＴＥＭ（登録商標）Ｔｈｒｏｍｂｏｅｌａｓｔｏｍｅｔｒｙ分析を用いて、Ｓｅｒｐｉｎｃ１発現を評価する。
本発明の方法および使用によるｄｓＲＮＡの投与は、Ｓｅｒｐｉｎｃ１関連疾患を有する患者におけるそのような疾患または障害の重症度、兆候、症候および／またはマーカーの低下をもたらし得る。この文脈において「低下」は、そのようなレベルの統計学的に有意な低下を意味する。低下は、例えば少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または約１００％であってもよい。
疾患の処置または予防の効能は、例えば、疾患進行、疾患寛解、症候重症度、出血の頻度、疼痛の低下、クオリティオブライフ、処置効果を維持するのに必要な投薬の用量、疾患マーカーのレベルまたは、処置されているか、もしくは予防のための標的となっている所与の疾患に適当な任意の他の測定可能なパラメーターを測定することにより評価される。そのようなパラメーターの任意の１つまたはパラメーターの任意の組合せを測定することによって、処置または予防の効能をモニタリングすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、出血障害の処置効能は、例えばトロンビン：抗トロンビンレベルを周期的にモニタリングすることにより評価される。後期の読み取り値を初期の読み取り値と比較することにより、医師に、処置が有効であるかどうかの指標が提供される。そのようなパラメーターの任意の１つまたはパラメーターの組合せを測定することによって、処置または予防の効能をモニタリングすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。Ｓｅｒｐｉｎｃ１を標的とするｉＲＮＡまたはその医薬組成物を投与することに関連する、出血障害「に対して有効である」とは、臨床的に適当な方法での投与が患者の少なくとも統計学的に有意な割合において、有益な効果、例えば症候の改善、治癒、疾患の低減、寿命延長、クオリティオブライフの改善または出血障害および関連する原因の処置に精通している医師により陽性と一般的に認識される他の効果をもたらすことを示す。
処置または予防効果は、疾患状態の１つまたはそれ以上のパラメーターに統計学的に有意な改善がある場合、またはそうでなければ予期されるであろう症候の悪化または進行が見られないことにより明らかである。例として、疾患の測定可能なパラメーターの少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上の好ましい変化は、有効な処置を示すものであり得る。所与のｉＲＮＡ薬またはかかる薬物の配合物はまた、当技術分野で公知の、所与の疾患についての実験動物モデルを用いて判断される。実験動物モデルを用いる際、処置の効能は、マーカーまたは症候の統計学的に有意な低下が観察される場合に証明される。
あるいは、効能は、臨床的に承認されている疾患重症度評価尺度に基づいて診断分野の当業者が決定するように、疾患の重症度の低下により測定される。例えば、適当な尺度を用いて測定した、疾患の重症度の低減をもたらす任意の陽性の変化は、本明細書中に記載するｉＲＮＡまたはｉＲＮＡ配合物を用いた適切な処置を表す。
本発明はさらに、Ｓｅｒｐｉｎｃ１発現の低下および／または阻害から利益を得るであろう対象、例えば出血障害を有する対象を処置するための、他の医薬品および／または他の治療方法、例えば公知の医薬品および／または公知の治療方法、例えばそのような障害を処置するために現在使用されているものと組み合わせた、ｉＲＮＡまたはその医薬組成物の使用のための方法および使用を提供する。
例えば、特定の実施形態において、Ｓｅｒｐｉｎｃ１を標的とするｉＲＮＡを、例えば本明細書中の他の箇所に記載する、出血障害を処置するのに有用な剤と組み合わせて投与する。例えば、Ｓｅｒｐｉｎｃ１発現の低下から利益を得るであろう対象、例えば出血障害を有する対象を処置するのに適切なさらなる治療剤および治療方法は、新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）；組換えＦＶＩＩａ；組換えＦＩＸ；ＦＸＩ濃縮物；ウイルス不活化ｖＷＦ－含有ＦＶＩＩＩ濃縮物；ステロイドまたは静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）およびシクロフォスファミドとともに高用量のＦＶＩＩＩまたはＦＩＸを含んでいてもよい脱感作療法；免疫抑制およびＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ輸注と組み合わせた、抗線維素溶解療法と組み合わせたか、または組み合わせない血漿交換；免疫抑制療法（例えばシクロフォスファミド、プレドニゾンおよび／または抗ＣＤ２０）を伴う、または伴わない免疫寛容導入（ＩＴＩ）；デスモプレシンアセテート［ＤＤＡＶＰ］；抗線維素溶解薬、例えばアミノカプロン酸およびトラネキサム酸；活性プロトロンビン複合体濃縮製物（ＰＣＣ）；抗血友病剤；コルチコステロイド；免疫抑制剤；およびエストロゲンを含む。
ｉＲＮＡおよびさらなる治療剤および／または処置は、同時および／または同一の組合せで、例えば非経口的に投与しても、またはさらなる治療剤は、別個の組成物の一部として、または別個の時点および／または当技術分野で公知であるか、もしくは本明細書に記載されている他の方法により投与してもよい。
ＶＩ．本発明の容器
本発明はまた、本発明の医薬組成物を含む容器、例えばバイアル、シリンジ、オートインジェクターペンまたはニードルのない投与デバイスを提供する。
一実施形態において、本発明の組成物は、例えば事前充填シリンジまたは自動注射デバイスを用いた自己投与に使用される。
一実施形態において、本発明の医薬組成物を含む容器はバイアルである。バイアルは、約０．５ｍＬから約２．０ｍｌの医薬組成物を含んでいてもよい。一実施形態において、バイアルは約０．８ｍｌの医薬組成物を含む。一実施形態において、バイアルは単回用量の医薬組成物を含む２Ｒバイアル（すなわち２ｍｌ注射バイアル）である。一実施形態において、２Ｒバイアルは、単回用量８０ｍｇの組成物を含む本発明の医薬組成物約０．８０ｍｌ（例えば約０．９６から約１．０５ｍＬ）を含む。
一実施形態において、本発明の容器は、シリンジ、例えば事前充填シリンジを含む。一実施形態において、事前充填シリンジは、針刺し防止安全機能（ＰＦＳ－Ｓ）を含む。適切なシリンジは１ｍｌシリンジまたは３ｍｌシリンジであってよく、２９Ｇニードルまたは３０Ｇニードルを含んでいてもよい。一実施形態において、シリンジは２９Ｇまたは３０Ｇニードルを備えた使い捨て３ｍｌガラスシリンジである。一実施形態において、事前充填シリンジは、単回用量８０ｍｇの組成物を含む本発明の医薬組成物約０．８０ｍｌ（例えば約０．８４ｍｌまたは０．８から０．８４ｍｌ）を含む。
例示的な本発明の事前充填シリンジは、シリンジ、例えば２９Ｇ Ｘ １／２”ニードルを備えたＢＤ Ｎｅｏｐａｋ；リジッドニードルシールド（ＲＮＳ）；プランジャ、例えばＦｌｕｒｏＴｅｃコーティングを有するＢＤ４０２３プランジャ；安全システム、例えばＢＤ ＵｌｔｒａＳａｆｅｌｍ Ｐｌｕｓ；プランジャロッド、例えばＢＤ ＵｌｔｒａＳａｆｅの受動プランジャロッド；およびフィンガーフランジ、例えばＢＤ ＵｌｔｒａＳａｆｅｒｍ受動アドオンフィンガーを含んでいてもよい。
ＶＩＩ．本発明のキット
本発明はまた、医薬組成物を含むキットを提供する。そのようなキットは、本発明の医薬組成物と、使用のための指示書、例えば予防的または治療的有効量のＲＮＡｉ剤を投与するための指示書とを含む、１つまたはそれ以上のバイアルまたは１つまたはそれ以上の事前充填シリンジを含む。前記キットは、場合によりＲＮＡｉ剤を投与するための手段（例えば注射デバイス）またはＳｅｒｐｉｎｃ１の阻害を測定するための手段（例えばＳｅｒｐｉｎｃ１ ｍＲＮＡ、Ｓｅｒｐｉｎｃ１タンパク質および／またはＳｅｒｐｉｎｃ１活性の阻害を測定するための手段）をさらに含んでいてよい。Ｓｅｒｐｉｎｃ１の阻害を測定するためのそのような手段は、対象からサンプル、例えば血漿サンプルを得るための手段を含んでいてもよい。本発明のキットは、場合により治療的有効または予防的有効量を決定するための手段をさらに含んでいてもよい。
特に断らない限り、本明細書中で使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野において当業者が通常理解するのと同一の意味を有する。本明細書中に記載するものと類似または相当する方法および材料を本発明において特徴付けるｉＲＮＡおよび方法の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料は以下に記載する。本明細書中で言及する全ての出版物、特許出願および他の参照文献は、その全体を参照によって本明細書に組み入れる。さらに、材料、方法および実施例は例示に過ぎず、限定することを意図するものではない。
本発明は、限定的なものと解釈されるべきではない次の実施例においてさらに例示される。本出願を通じて引用される全ての参照文献、特許および公開特許出願ならびに図面は、参照によって組み入れる。
Figure 2022517270000030
実施例１：フィツシラン製剤
フィツシラン製剤（フィツシラン）は、１００ｍｇ／ｍＬのフィツシラン（１０６ｍｇ／ｍＬフィツシランナトリウムに相当）を５ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に含む皮下投与用の無菌性液剤である。前記製剤は、一般的にテフロンコートブチルゴムストッパおよび中央テアオーバーシールを有する２ＲタイプＩガラスバイアル中の０．８ｍＬ液剤として商業的に供給される。製剤は、保存剤を含まず、単回使用を意図されている。
フィツシラン製剤の組成は表２に概略する。
Figure 2022517270000031
以下に示すフィツシランの化学構造は、ホスフェート骨格を示す拡張構造式を用いて表す。塩基対形成に関連する塩基は、点線により結合される。ＧａｌＮＡｃ含有リガンドであるＬ９６、およびリガンドをセンス鎖の３’－末端にコンジュゲートするリンカーの構造も以下に示す。フィツシラン二重鎖（ＡＤ－５７２１３）の二重鎖および一本鎖（ＡＤ－１１６８５８、センス鎖；Ａ－１１６８６１、アンチセンス鎖）の分子式および質量もまた下記表に示される。
Figure 2022517270000032
実施例２：フィツシラン配合物開発
フィツシラン配合物は、皮下投与用に設計された。皮下投与用に設計された配合物は、刺激および化学的不適合性の上昇の危険性を避けるために、過度に酸性または過度に塩基性であってはならない。浸透圧、ｐＨおよび粘性を相応に考慮して、配合物は可能な限り生理学的に近いように設計した。１００ｍｇ／ｍＬのフィツシラン製剤の水性液剤のｐＨは５．０から６．８まで変動する。アニオン性ホスホジエステルを有するナトリウム対イオンの存在は、水性液剤の濃度に依存する特定量のモル浸透圧濃度に寄与する。１００ｍｇ／ｍＬの原薬の標的配合物において、対イオンは、約１１８ｍＯｓｍ／ｋｇ液剤を生じさせる。製剤の等張性および緩衝能を維持するために、原薬を５ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（０．６４ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、４．３６ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、８４ｍＭ ＮａＣｌ）に溶解した。
上述の製剤配合物は次の物理化学的な性質：ｐＨ約６．８から約７．２；モル浸透圧濃度約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ；および密度約１．０３８ｇ／ｍＬを有する。
フィツシラン製剤の製造は、必要量の粉末化（凍結乾燥）フィツシラン原薬を５ｍＭリン酸緩衝生理食塩水に溶解し、ｐＨを水酸化ナトリウムまたはリン酸によって約７．０に調整した後、無菌ろ過および充填することからなっていた。
初期開発、例えば非臨床および第１／２相臨床試験において用いる製剤は、バイアル当たり名目０．５ｍＬ中の１００ｍｇ／ｍＬ（フィツシランナトリウム）液剤として供給された。第３相試験において使用される、商業生産を意図している製剤は、バイアル当たり名目０．８ｍＬ中の１００ｍｇ／ｍＬ（フィツシラン遊離酸、１０６ｍｇ／ｍＬフィツシランナトリウムに相当）として供給された。下記の表は、フィツシラン製剤配合物の差異を概略する。
Figure 2022517270000033
実施例３：フィツシラン製剤の解析的分析
フィツシラン製剤の種々の解析的評価は、製剤が物理学的および化学的に安定であることを示すために実施した。
外観
フィツシラン製剤を拡散均等照射の下で黒色と白色との背景に対する色、均質性および粒子状物質について視覚的に検査した。
フィツシラン製剤についての外観試験を、異なるバッチ間で同じ視覚的試験を用いて実施し、結果は、「本質的に粒子を含まない透明の無色から薄黄色の溶液」の規格を満たしていた。
二重鎖保持時間の特定
フィツシラン製剤をフィツシラン参照標準とともに非変性ＩＰ ＲＰ－ＨＰＬＣにより分析し、サンプルの二重鎖保持時間を参照標準と比較した。現在までに製造した全てのフィツシラン製剤バッチは、「参照標準と一致する保持時間」の規格を満たしており、このことは、それらのアニールしたｓｉＲＮＡ二重鎖としての同一性を確認するものである。
ＵＶによるフィツシラン製剤のアッセイ
ＵＶ吸収法を、フィツシラン製剤中のフィツシランのアッセイ（ｍｇ／ｍＬ）を決定するために使用した。０．９％生理食塩水に適切に希釈した製剤の吸光度を、２６０ｎｍにおいてＵＶ分光光度計を用いて測定した。
Ｃ＝（Ａ×Ｆ×Ｍ）／（ε×ｂ）
式中、Ａは測定した吸光度であり、Ｆは希釈因数であり、ｂはセルのパス長さ（１ｃｍ）であり、εは二重鎖参照標準のモル吸光率であり、Ｍは分子量であり、Ｃは濃度（ｍｇ／ｍＬ）である。二重鎖純度を説明するために、所与の製剤についてのフィツシランアッセイ結果を、純度因子について補正した（（非変性ＩＰ－ＲＰ ＨＰＬＣ面積％）／１００を乗算する）。
フィツシラン製剤のアッセイ（ｍｇ／ｍＬ）をＵＶ分光光度計から決定し、非変性ＩＰ ＲＰ－ＨＰＬＣ方法から二重鎖純度について補正し、結果を二重鎖のＨ－形態（遊離酸）の濃度に基づいて報告する。全ての結果は９０から１１０ｍｇ／ｍＬの規格限界内（遊離酸形態として測定）にあり、平均アッセイ値は１０１．５ｍｇ／ｍＬであり、標準偏差は３．４％であった。結果は、試験した全てのフィツシランロットのアッセイ値間で良好な同等性を示した。
フィツシラン製剤のｐＨ
フィツシラン製剤のｐＨを直接測定した。フィツシラン製剤ロットについての比較ｐＨ結果は、ｐＨ７．１であり、標準偏差０．０であると観察された。全ての結果は、フィツシラン製剤についてのｐＨ６．０～８．０の現在の規格を満たした。フィツシラン製剤バッチについてのｐＨデータの分析により、フィツシランロット間の高度の同等性が示された。
フィツシラン製剤のモル浸透圧濃度
フィツシラン製剤のモル浸透圧濃度は、凝固点降下の原理に基づいている。モル浸透圧濃度はｍＯｓｍ／ｋｇ値として報告された。配合物はリン酸ナトリウム緩衝液から固定された塩濃度およびフィツシラン二重鎖を有し、観察されたモル浸透圧濃度値は狭い範囲のみを示した。フィツシラン製剤バッチについてのモル浸透圧濃度の結果は２９７～３１０（ｍＯｓｍ／ｋｇ）の範囲にあり、平均は３０４ｍＯｓｍ／ｋｇであり、標準偏差５．３％であった。全ての結果はフィツシラン製剤のモル浸透圧濃度についての２４０～３９０ｍＯｓｍ／ｋｇの規格内にあった。
フィツシラン製剤中の粒子状物質
フィツシラン製剤を、光オブスキュレーション法により容器当たりの肉眼では見えない粒子状物質の数について分析し、結果を容器当たりの粒子の総数（≧１０μｍおよび≧２５μｍ）で報告した。フィツシラン製剤中の１０μｍ以上の粒子について、観察された範囲は約２９～５８８粒子（≧１０μｍ）であり、平均は約１８８粒子であり、標準偏差は２６８．２％であった。全ての結果は、フィツシラン製剤の容器当たりのＮＭＴ６，０００の規格内にあった。
２５μｍ以上の粒子について、観察された範囲は約０～４６粒子であり、平均は約１３粒子であり、標準偏差は２２．４％であった。全ての結果は、フィツシラン製剤の容器当たりＮＭＴ６００の規格内にあった。
フィツシラン製剤についての容器内容積
フィツシラン製剤を含む溶液中の容積は、少なくとも（ＮＬＴ）０．８ｍＬに設定した規格限界で測定した。異なるフィツシラン製剤ロット中で観察された容器中の容積は、標準偏差０．０でフィツシラン製剤バッチ間の良好な程度の同等性を示した。
フィツシラン製剤バッチ中の細菌エンドトキシンおよび無菌性
フィツシラン製剤の全てのバッチは、細菌エンドトキシンについての微生物安全性試験基準（多くとも（ＮＭＴ）１００エンドトキシンユニット（ＥＵ）／ｍＬ）を満たし、このことはフィツシラン製剤プロセスについての適当な制御およびその微生物安全性プロファイルを示した。
非変性イオン対逆相高速液体クロマトグラフィー（ＩＰ ＲＰ－ＨＰＬＣ）による二重鎖純度
非変性ＩＰ ＲＰ－ＨＰＬＣは、任意の残留一本鎖から二重鎖を分解している。二重鎖の面積％純度はこの方法により決定される。フィツシラン製剤中の原薬の同一性を二重鎖参照標準と一致する保持時間により確立した。
非変性ＩＰＲＰ ＨＰＬＣ法を、質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）と並行して製剤中の構成一本鎖、センス鎖およびアンチセンス鎖の特定に使用した。二重鎖ピークを残留一本鎖から分解し、二重鎖純度をこの方法により決定した。フィツシラン製剤の代表的なＩＰ ＲＰクロマトグラムを図１に示す。
固定相：Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ８ ２．１×５０カラム、２．５μｍ粒子サイズ。
移動相Ａ：水中の９５ｍＭ１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール（ＨＦＩＰ）、１６ｍＭトリエチルアミン（ＴＥＡ）、５μＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）。
移動相Ｂ：５μＭ ＥＤＴＡを含む１００％メタノール。
流速：０．２５ｍＬ／分。
カラム温度：１５℃
勾配：
Figure 2022517270000034
検出：２６０ｎｍにおけるＵＶおよび７００から２７００Ｄａの陰イオンモードのＭＳ
サンプル調製：サンプルを１Ｘ ＰＢＳ中で、一本鎖中間体について約０．１ｍｇ／ｍＬおよび二重鎖原薬（フィツシラン）について０．２ｍｇ／ｍＬの濃度になるように調製した。
注射容積は２０μＬである。
検出限界：クロマトグラフィーソフトウェアを≧０．０５面積％の全てのピークを一体化し報告するために使用した。
純度算出：主要二重鎖ピークの面積％をクロマトグラフィーソフトウェアにより算出し、二重鎖純度として報告した。残留一本鎖および他の不純物の面積％を同様に報告した。
同一性：同一の二重鎖ピーク下で存在する構成一本鎖、センスおよびアンチセンスの同一性を、クロマトグラフィーソフトウェアを用いた液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）による二重鎖ピークスペクトルの逆重畳積分から決定した分子量により確立した。
非変性ＩＰ ＲＰ－ＨＰＬＣによるフィツシラン製剤の非変性プロファイルにより、二重鎖形態の製剤の存在が確認された。二重鎖純度は、フィツシラン製剤中のアニールした二重鎖ｓｉＲＮＡのパーセント比率を示していた。本試験に含まれる製剤バッチについての、二重鎖純度値は、約９８．９～９９．５面積％の範囲にあった。データの分析により、標準偏差約０．３％の、平均（ｎ＝４）純度約９９．２％が得られ、二重鎖純度が、この報告において比較した全てのフィツシラン製剤バッチについてお互いに一致しており類似していることが示された。
非変性イオン対逆相高速液体クロマトグラフィー（ＩＰ ＲＰ－ＨＰＬＣ）による総不純物
非変性ＩＰ ＲＰ－ＨＰＬＣによる非二重鎖（非アニール）不純物を、≧０．０５０面積％の全て（非二重鎖）のピークの合計として報告した。非変性ＩＰ ＲＰ－ＨＰＬＣによる総不純物についての結果は、２％以内にあることが観察され、本試験に含まれるフィツシラン製剤の全てのバッチについてＮＭＴ１０．０面積％の規格を満たしていた。非変性ＩＰ ＲＰ－ＨＰＬＣによる総不純物についての平均値（ｎ＝４）は０．８５％であり、標準偏差は０．３％であった。全体的に、結果は、本報告で試験したフィツシラン製剤ロットは特定（一本鎖）および非特定不純物の両方の観点から非常に類似したプロファイルを有していた。
変性アニオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＸ－ＨＰＬＣ）による純度
製剤中の一本鎖の純度を決定するために、変性ＡＸ－ＨＰＬＣ分析を実施した。
アンチセンス鎖についての複数のピークの存在は、ホスホロチオエートジアステレオマーによるものであった。フィツシラン製剤の代表的なＡＸ－ＨＰＬＣクロマトグラムを図２に示す。
固定相：Ｄｉｏｎｅｘ ＤＮＡ Ｐａｃ ＰＡ２００カラム、４ｘ２５０ｍｍ
移動相Ａ：２０ｍＭリン酸ナトリウム、１０％ＡＣＮ、ｐＨ１１
移動相Ｂ：２０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ ＮａＢｒ、１０％ＡＣＮ、ｐＨ１１
勾配：
Figure 2022517270000035
検出限界：クロマトグラフィーソフトウェアを≧０．０５面積％の全てのピークを一体化し報告するために使用した。
純度算出：主要ピークのそれぞれの面積％をクロマトグラフィーソフトウェアにより算出し、センス鎖およびアンチセンス鎖の面積％の合計を純度として報告した。０．０５０面積％を上回る不純物の面積％の合計を総不純物として報告した。
同一性：一本鎖同一性を、試験サンプルの保持時間を相当する参照標準と比較することにより確認した。
ＡＸ－ＨＰＬＣは、フィツシラン二重鎖を変性させて構成センスおよびアンチセンス一本鎖を形成する。一本鎖の面積％純度をこの方法により決定した。
変性ＡＸ－ＨＰＬＣ法はフィツシラン二重鎖を含む個々の一本鎖の純度を測定する。一本鎖面積％の合計は、フィツシラン製剤の変性純度を表す。本試験におけるフィツシランロットのセンスおよびアンチセンス鎖の面積％の合計の分析により、標準偏差０．８％の平均値（ｎ＝４）９４．２面積％が得られた。代表的なフィツシラン製剤バッチからの全ての結果は、ＮＬＴ８５．０面積％の規格を満たしており、フィツシラン製剤についての全体的に同等の純度結果を示していた。
変性アニオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＸ－ＨＰＬＣ）による総不純物
データの分析から、標準偏差０．７％の全不純物ＮＬＴ０．０５０面積％の合計についての平均値（ｎ＝４）５．６％が得られた。結果は、本報告に含まれるフィツシランバッチについての総不純物値が一致しており同等であることを示した。
変性イオン対逆相高速液体クロマトグラフィー（ＩＰ ＲＰ－ＨＰＬＣ）による純度
ＩＰ ＲＰ－ＨＰＬＣは、フィツシラン二重鎖を変性し、構成センスおよびアンチセンス一本鎖を形成する。一本鎖の面積％純度はこの方法により決定される。
変性ＩＰ ＲＰ－ＨＰＬＣ法はＡＸ－ＨＰＬＣに対して直交性であり、製剤中のフィツシラン二重鎖を含む個々の一本鎖の純度を測定する。一本鎖面積％の合計は、フィツシラン製剤の変性ＩＰ ＲＰ－ＨＰＬＣ純度を表す。
変性ＩＰ ＲＰ－ＨＰＬＣ分析をまた行って、製剤中の一本鎖の純度を決定した。
固定相：Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８（ＯＳＴまたはＸＰ）２．１×５０カラム、２．５μｍ粒子サイズ。
移動相Ａ：９０：１０ 水：メタノール中の５５０ｍＭ １，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール（ＨＦＩＰ）、１３ｍＭトリメチルアミン（ＴＥＡ）および５Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）
移動相Ｂ：１００％メタノール
流速：０．４０ｍｌ／分
カラム温度：８０℃
勾配：
Figure 2022517270000036
検出：２６０ｎｍにおけるＵＶおよび７００から２７００Ｄａの陰イオンモードのＭＳ
サンプル調製：サンプルを１ＸＰＢＳ中で、一本鎖中間体について約０．１ｍｇ／ｍＬおよび二重鎖原薬（フィツシラン）について０．２ｍｇ／ｍＬの濃度になるように調製した。
注射容積は２５μＬであった。
検出限界：クロマトグラフィーソフトウェアを用いて≧０．０５面積％の全てのピークを一体化し報告するために使用した。
純度算出：主要二重鎖の面積％をクロマトグラフィーソフトウェアにより算出し、二重鎖純度として報告した。残留一本鎖および他の不純物の面積％を同様に報告した。
フィツシラン製剤の代表的な変性ＩＰ ＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラフィープロファイルを図３に示す。
本試験のフィツシランロットについてのセンスおよびアンチセンス鎖の面積％の合計の分析により、標準偏差１．４％の平均値（ｎ＝４）８８．７面積％が得られた。フィツシラン製剤ロットについての全ての結果は、ＮＬＴ８０．０面積％の規格を満たしており、解析的な可変性内でフィツシラン製剤ロットについて同等の純度結果を示した。
変性イオン対逆相高速液体クロマトグラフィー（ＩＰ ＲＰ－ＨＰＬＣ）による総不純物
データの分析により、全不純物ＮＬＴ０．０５０面積％の合計について平均値（ｎ＝４）１１．０％が得られ、標準偏差は１．５％であった。結果は、本報告に含まれる全てのフィツシランバッチについての総不純物値は一致しており同等であることを示している。
実施例４：フィツシラン製剤の容器閉鎖系および適合性
フィツシラン製剤についての容器閉鎖系は、微生物混入から無菌性製品を保護するために選択した。バイアルは３００℃以上で５分間以上、乾熱により滅菌し、発熱物質除去した。ブチルゴムシールを１２１～１２５℃で６０分間以上オートクレーブした。
ブチルゴムストッパを検証されたサイクルのオートクレーブにより滅菌した。全ての成分は非経口製品についての標準的な物品である。フィツシラン製剤安定性試験は、同一容器閉鎖系で保存した製剤を用いて行った。
フィツシランは、皮下注射用に配合されている。投与する推定算出用量に基づいて、１ｍｌまたは３ｍＬシリンジが使用される。一方は構成材料がポリカルボネートであり、他方は構成材料がポリプロピレンである２種類のシリンジを、フィツシランとの適合性について試験した。バイアル中に１００ｍｇ／ｍＬで充填した製剤をシリンジ中に引き入れた。充填したシリンジの１セットは、２５℃で８時間インキュベートし、充填したシリンジの他のセットを対照とともに２～８℃で４８時間インキュベートした。インキュベート後、製剤をＡＸ－ＨＰＬＣによってアッセイおよび純度について試験し、バイアル化薬剤と比較した。下記表３に示すように、ラベルクレームと純度という観点からは、対照製剤と２種類のシリンジ中でインキュベートした製剤との間に差異はなく、このことはフィツシランが意図する注射デバイスと適合性であることを示した。
Figure 2022517270000037
非希釈製剤の抽出および分注の両方のために、表３に示すものと同一の構成材料のシリンジとともに、より大きいゲージ（口径がより狭い）のニードルの使用も評価した。２種類のシリンジおよび２つの分注速度を分析した。結果は表４に示し、フィツシラン製剤の一体性は、２９または３０Ｇニードルを用いた場合には維持されていることが示された。
Figure 2022517270000038
実施例５：フィツシラン製剤の保存安定性分析
フィツシラン製剤についての保存安定性データを２～８℃の推奨保存条件および１つまたはそれ以上の加速条件において収集した。安定性試験は、医薬品規制調和国際会議（ＩＣＨ）ガイドラインＱ１Ａ（Ｒ２）にしたがって設計し、サンプルは、臨床材料の保存に使用されたものと同一の容器閉鎖で保存された（すなわちテフロン表面ブチルゴムストッパを備えた２ｍＬ ＵＳＰタイプＩガラスバイアル）。安定性データは表５に示すように収集した。
Figure 2022517270000039
フィツシラン製剤の安定性は、次の分析手順：視覚的外観、ＵＶ分光測定によるアッセイ、ｐＨ、モル浸透圧濃度、非変性ＩＰＲＰ－ＨＰＬＣによる二重鎖純度および２つの直交的な方法：変性ＡＸ ＨＰＬＣによる純度および変性ＩＰＲＰ－ＨＰＬＣによる純度により測定される、一本鎖純度を用いて傾向について評価した。
製剤の熱安定性をさらに解明するために、いくつかの安定性試験は、２５℃／６０％ＲＨにおける製剤の長期評価ならびに４０℃／７５％ＲＨにおいて実施した６か月の加速劣化試験を含んでいた。ＩＣＨゾーンＩＩ気候条件における長期保存について薬剤の適正を評価するために、さらなるデータ（すなわち２５℃／６０％ＲＨにおける６か月超および４０℃／７５％ＲＨにおいて収集した全てのデータ）を収集した。
フィツシラン製剤の３つの代表的なロット（Ｐ０２３１４，Ｐ０２７１５、およびＰ０７９１６）についての保存安定性データを表６－１４に示し、下記に概略する。
２～８℃の推奨保存条件において、フィツシラン製剤についての最長３６か月の安定性データを収集した。２～８℃における保存の間、いずれのパラメーターについても有意な変化は特定されず、このことは、この条件が製剤の長期間保存に適切であることを示している。さらに２５℃／６０％ＲＨにおける保存の間、または４０℃／７５％ＲＨにおける保存の間すら、有意な変化は観察されなかった。このことおよびＩＣＨゾーンＩＩ気候条件（すなわち２５℃／６０％ＲＨ）における長期保存についての製剤の適性の評価に基づいて、３６か月の貯蔵寿命を２～８℃で保存されるフィツシラン製剤に割り当て、最終アップデート時から収集しているさらなるデータによりさらに確認した。
Figure 2022517270000040
Figure 2022517270000041
Figure 2022517270000042
Figure 2022517270000043
Figure 2022517270000044
Figure 2022517270000045
Figure 2022517270000046
Figure 2022517270000047
Figure 2022517270000048
Figure 2022517270000049
Figure 2022517270000050
Figure 2022517270000051
Figure 2022517270000052
Figure 2022517270000053
Figure 2022517270000054

Claims (55)

  1. Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であって、約５０ｍｇ／ｍＬから約２００ｍｇ／ｍＬの濃度の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤および約１ｍＭから約１０ｍＭの濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含み、
    該医薬組成物のｐＨおよびモル浸透圧濃度は対象への皮下投与に適切であり、
    該ｄｓＲＮＡ剤は５’－ＧｆｓｇｓＵｆｕＡｆａＣｆａＣｆＣｆＡｆｕＵｆｕＡｆｃＵｆｕＣｆａＡｆ－３’（配列番号９４１）のヌクレオチド配列からなるセンス鎖および５’－ｕｓＵｆｓｇＡｆａＧｆｕＡｆａＡｆｕｇｇＵｆｇＵｆｕＡｆａＣｆｃｓａｓｇ－３’（配列番号９６０）のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖を有し、
    ここで、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、ＣおよびＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、Ｃｆ、およびＵｆは２’－フルオロＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕであり；ｓはホスホロチオエート結合であり、
    リガンドはリンカーを介してセンス鎖の３’末端にコンジュゲートしており、該リガンドおよび該リンカーは次の構造を有し：
    Figure 2022517270000055
     ここで、該ｄｓＲＮＡ剤は遊離酸形態である、前記医薬組成物。
  2. Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であって、約５０ｍｇ／ｍＬから約２００ｍｇ／ｍＬの濃度の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤および約１ｍＭから約１０ｍＭの濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含み、
    該医薬組成物のｐＨおよびモル浸透圧濃度は対象への皮下投与に適切であり、
    該ｄｓＲＮＡ剤は５’－ＧｆｓｇｓＵｆｕＡｆａＣｆａＣｆＣｆＡｆｕＵｆｕＡｆｃＵｆｕＣｆａＡｆ－３’（配列番号９４１）のヌクレオチド配列からなるセンス鎖および５’－ｕｓＵｆｓｇＡｆａＧｆｕＡｆａＡｆｕｇｇＵｆｇＵｆｕＡｆａＣｆｃｓａｓｇ－３’（配列番号９６０）のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖を有し、
    ここで、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、Ｃｆ、およびＵｆは２’－フルオロＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕであり；ｓはホスホロチオエート結合であり、
    リガンドはリンカーを介してセンス鎖の３’末端にコンジュゲートしており、該リガンドおよび該リンカーは次の構造を有し：
    Figure 2022517270000056
     ここで、該ｄｓＲＮＡ剤は塩形態である、前記医薬組成物。
  3. 塩形態はナトリウム塩形態である、請求項２に記載の医薬組成物。
  4. 剤中のホスホジエステルおよび／またはホスホロチオエート基の実質的に全てはナトリウム対イオンを含む、請求項３に記載の医薬組成物。
  5. 剤中のホスホジエステルおよび／またはホスホロチオエート基は全て、ナトリウム対イオンを含む、請求項３に記載の医薬組成物。
  6. ＰＢＳの濃度は約２ｍＭから約７ｍＭの間である、請求項１から４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  7. ＰＢＳの濃度は約３から約６ｍＭである、請求項６に記載の医薬組成物。
  8. ＰＢＳの濃度は約５ｍＭである、請求項７に記載の医薬組成物。
  9. 組成物のｐＨは約５．０から約８．０の間である、請求項１から８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  10. 組成物のｐＨは約６．０から約８．０の間である、請求項９に記載の医薬組成物。
  11. 組成物のｐＨは約６．５から約７．５の間である、請求項１０に記載の医薬組成物。
  12. 組成物のｐＨは約６．８から約７．２の間である、請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. 組成物のモル浸透圧濃度は約５０と約４００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間である、請求項１から１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  14. 組成物のモル浸透圧濃度は約１００と約４００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間である、請求項１３に記載の医薬組成物。
  15. 組成物のモル浸透圧濃度は約２４０と約３９０ｍＯｓｍ／ｋｇとの間である、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 組成物のモル浸透圧濃度は約２９０と約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇとの間である、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 医薬組成物中のｄｓＲＮＡ剤の濃度は約５０ｍｇ／ｍＬと約１５０ｍｇ／ｍＬとの間である、請求項１から１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  18. 医薬組成物中のｄｓＲＮＡ剤の濃度は約８０ｍｇ／ｍＬと約１１０ｍｇ／ｍＬとの間である、請求項１７に記載の医薬組成物。
  19. 医薬組成物中のｄｓＲＮＡ剤の濃度は約１００ｍｇ／ｍＬである、請求項１８に記載の医薬組成物。
  20. 約２℃から約８℃で保存した場合に最長約３６か月安定である、請求項１から１９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  21. 約２５℃および６０％の相対湿度（ＲＨ）で保存した場合に最長約３６か月安定である、請求項１から１９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  22. 約４０℃および７５％の相対湿度（ＲＨ）で保存した場合に最長約６か月安定である、請求項１から１９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  23. 純度非変性ＩＰＲＰ－ＨＰＬＣによって決定される、少なくとも（ＮＬＴ）約９０．５面積％の二重鎖および多くとも（ＮＭＴ）約５面積％の一本鎖を含む、請求項１から２２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  24. 純度変性ＡＸ－ＨＰＬＣによって決定される、少なくとも（ＮＬＴ）約８５．０面積％の総一本鎖を含む、請求項１から２２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  25. 純度変性ＩＰＲＰ－ＨＰＬＣによって決定される、少なくとも（ＮＬＴ）約８０．０面積％の総一本鎖を含む、請求項１から２２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  26. 請求項１から２５のいずれか１項に記載の医薬組成物を含むバイアル。
  27. 約０．５ｍＬから約２．０ｍｌの医薬組成物を含む、請求項２６に記載のバイアル。
  28. 約０．８ｍＬの医薬組成物を含む、請求項２７に記載のバイアル。
  29. 請求項１から２５のいずれか１項に記載の医薬組成物を含むシリンジ。
  30. １ｍｌシリンジである、請求項２９に記載のシリンジ。
  31. ３ｍｌシリンジである、請求項２９に記載のシリンジ。
  32. ２９Ｇニードルを含む、請求項２９から３１のいずれか１項に記載のシリンジ。
  33. ３０Ｇニードルを含む、請求項２９から３１のいずれか１項に記載のシリンジ。
  34. Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であって、約１００ｍｇ／ｍＬの濃度の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤および約５ｍＭの濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含み、
    該医薬組成物のｐＨは約６．８から約７．２であり、
    該医薬組成物のモル浸透圧濃度は約３００ｍＯｓｍ／ｋｇであり、
    該ｄｓＲＮＡ剤は５’－ＧｆｓｇｓＵｆｕＡｆａＣｆａＣｆＣｆＡｆｕＵｆｕＡｆｃＵｆｕＣｆａＡｆ－３’（配列番号９４１）のヌクレオチド配列からなるセンス鎖および５’－ｕｓＵｆｓｇＡｆａＧｆｕＡｆａＡｆｕｇｇＵｆｇＵｆｕＡｆａＣｆｃｓａｓｇ－３’（配列番号９６０）のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖を有し、
    ここで、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、Ｃｆ、およびＵｆは２’－フルオロＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕであり；ｓはホスホロチオエート結合であり、
    リガンドはリンカーを介してセンス鎖の３’末端にコンジュゲートしており、該リガンドおよび該リンカーは次の構造を有し：
    Figure 2022517270000057
     ここで、該ｄｓＲＮＡ剤は遊離酸形態である、前記医薬組成物。
  35. Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であって、約１０６ｍｇ／ｍＬの濃度の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤および約５ｍＭの濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含み、
    該医薬組成物のｐＨは約６．８から約７．２であり、
    該医薬組成物のモル浸透圧濃度は約３００ｍＯｓｍ／ｋｇであり、
    該ｄｓＲＮＡ剤は５’－ＧｆｓｇｓＵｆｕＡｆａＣｆａＣｆＣｆＡｆｕＵｆｕＡｆｃＵｆｕＣｆａＡｆ－３’（配列番号９４１）のヌクレオチド配列からなるセンス鎖および５’－ｕｓＵｆｓｇＡｆａＧｆｕＡｆａＡｆｕｇｇＵｆｇＵｆｕＡｆａＣｆｃｓａｓｇ－３’（配列番号９６０）のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖を有し、
    ここで、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、Ｃｆ、およびＵｆは２’－フルオロＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕであり；ｓはホスホロチオエート結合であり、
    リガンドはリンカーを介してセンス鎖の３’末端にコンジュゲートしており、該リガンドおよび該リンカーは次の構造を有し：
    Figure 2022517270000058
     ここで、該ｄｓＲＮＡ剤は塩形態である、前記医薬組成物。
  36. 塩形態はナトリウム塩形態である、請求項３５に記載の医薬組成物。
  37. 剤中のホスホジエステルおよび／またはホスホロチオエート基の実質的に全てはナトリウム対イオンを含む、請求項３６に記載の医薬組成物。
  38. 剤中のホスホジエステルおよび／またはホスホロチオエート基は全て、ナトリウム対イオンを含む、請求項３６に記載の医薬組成物。
  39. Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であって、約１００ｍｇ／ｍＬの濃度の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤および約５ｍＭの濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含み、
    該医薬組成物のｐＨは約６．８から約７．２であり、
    該ｄｓＲＮＡ剤は５’－ＧｆｓｇｓＵｆｕＡｆａＣｆａＣｆＣｆＡｆｕＵｆｕＡｆｃＵｆｕＣｆａＡｆ－３’（配列番号９４１）のヌクレオチド配列からなるセンス鎖および５’－ｕｓＵｆｓｇＡｆａＧｆｕＡｆａＡｆｕｇｇＵｆｇＵｆｕＡｆａＣｆｃｓａｓｇ－３’（配列番号９６０）のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖を有し、
    ここで、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、Ｃｆ、およびＵｆは２’－フルオロＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕであり；ｓはホスホロチオエート結合であり、
    リガンドはリンカーを介してセンス鎖の３’末端にコンジュゲートしており、該リガンドおよび該リンカーは次の構造を有し：
    Figure 2022517270000059
     ここで、該ｄｓＲＮＡ剤は遊離酸形態である、前記医薬組成物。
  40. Ｓｅｒｐｉｎｃ１遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であって、約１０６ｍｇ／ｍＬの濃度の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤および約５ｍＭの濃度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含み、
    該医薬組成物のｐＨは約６．８から約７．２であり、
    該ｄｓＲＮＡ剤は５’－ＧｆｓｇｓＵｆｕＡｆａＣｆａＣｆＣｆＡｆｕＵｆｕＡｆｃＵｆｕＣｆａＡｆ－３’（配列番号９４１）のヌクレオチド配列からなるセンス鎖および５’－ｕｓＵｆｓｇＡｆａＧｆｕＡｆａＡｆｕｇｇＵｆｇＵｆｕＡｆａＣｆｃｓａｓｇ－３’（配列番号９６０）のヌクレオチド配列からなるアンチセンス鎖を有し、
    ここで、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、Ｃｆ、およびＵｆは２’－フルオロＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕであり；ｓはホスホロチオエート結合であり、
    リガンドはリンカーを介してセンス鎖の３’末端にコンジュゲートしており、該リガンドおよび該リンカーは次の構造を有し：
    Figure 2022517270000060
     ここで、ｄｓＲＮＡ剤は塩形態である、前記医薬組成物。
  41. 約２℃から約８℃で保存した場合に最長約３６か月安定である、請求項３４から４０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  42. 約２５℃および６０％の相対湿度（ＲＨ）で保存した場合に最長約３６か月安定である、請求項３４から４０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  43. 約４０℃および７５％の相対湿度（ＲＨ）で保存した場合に最長約６か月安定である、請求項３４から４０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  44. 純度非変性ＩＰＲＰ－ＨＰＬＣによって決定される、少なくとも（ＮＬＴ）約９５．０面積％の二重鎖および多くとも（ＮＭＴ）約５面積％の一本鎖を含む、請求項３４から４０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  45. 純度変性ＡＸ－ＨＰＬＣによって決定される、少なくとも（ＮＬＴ）約８５．０面積％の総一本鎖を含む、請求項３４から４４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  46. 純度変性ＩＰＲＰ－ＨＰＬＣによって決定される、少なくとも（ＮＬＴ）約８０．０面積％の総一本鎖を含む、請求項３４から４４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  47. 請求項３４から４６のいずれか１項に記載の医薬組成物を含むバイアル。
  48. 約０．５ｍＬから約２．０ｍｌの医薬組成物を含む、請求項４７に記載のバイアル。
  49. 約０．８ｍｌの医薬組成物を含む、請求項４８に記載のバイアル。
  50. 請求項３４から４６のいずれか１項の医薬組成物を含むシリンジ。
  51. １ｍｌシリンジである、請求項５０に記載のシリンジ。
  52. ３ｍｌシリンジである、請求項５０に記載のシリンジ。
  53. ２９Ｇニードルを含む、請求項５０から５２のいずれか１項に記載のシリンジ。
  54. ３０Ｇニードルを含む、請求項５０から５２のいずれか１項に記載のシリンジ。
  55. 事前充填されている、請求項５０から５２のいずれか１項に記載のシリンジ。
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