KR20210116509A - Serpinc1 irna 조성물 및 그의 이용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 iRNA 작용제, 예를 들어, 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제를 포함하는 약학적 조성물 및 (예를 들어, 억제제가 존재 또는 부재하는) 혈우병을 갖는 대상체에서 출혈성 사건을 치료하기 위해 상기 조성물을 이용하는 방법에 관한 것이다.

Description

SERPINC1 IRNA 조성물 및 그의 이용 방법
관련 출원
본 출원은 2019년 1월 16일에 출원된 미국 가출원 제62/793,020호의 우선권을 주장하고, 상기 출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
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본 출원은 또한 2016년 12월 7일에 출원된 미국 특허 출원 제15/371,300호, 2016년 12월 7일에 출원된 국제 출원 제PCT/US2016/065245호, 2015년 12월 7일에 출원된 미국 가출원 제62/264,013호, 2016년 3월 30일에 출원된 미국 가출원 제62/315,228호, 2016년 7월 25일에 출원된 미국 가출원 제62/366,304호, 및 2016년 12월 2일에 출원된 미국 가출원 제62/429,241호에 관한 것이다. 각각의 상기 특허 출원들의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
또한, 본 출원은 2014년 5월 12일에 출원된 미국 가출원 제61/992,057호, 2014년 12월 8일에 출원된 미국 가출원 제62/089,018호, 2015년 1월 12일에 출원된 미국 가출원 제62/102,281호, 및 2015년 5월 12일에 출원된 국제 출원 제PCT/US2015/030337호에 관한 것이다. 각각의 상기 특허 출원들의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
본 출원은 또한 2012년 4월 26일에 출원된 미국 가출원 제61/638,952호, 2012년 7월 9일에 출원된 미국 가출원 제61/669,249호, 2012년 12월 7일에 출원된 미국 가출원 제61/734,573호, 2013년 3월 15일에 출원된 미국 특허 출원 제13/837,129호, 현재 미국 특허 제9,127,274호, 2015년 7월 22일에 출원된 미국 특허 출원 제14/806,084호, 현재 미국 특허 제9,376,680호, 2016년 3월 15에 출원된 미국 특허 출원 제15/070,358호, 2018년 4월 18일에 출원된 미국 특허 출원 제15/955,873호, 2018년 12월 14일에 출원된 미국 특허 출원 제16/220,157호, 및 2013년 4월 25일에 출원된 국제 출원 제PCT/US2013/038218호에 관한 것이다. 본 출원은 또한 2012년 11월 16일에 출원된 국제 출원 제PCT/US2012/065601호에 관한 것이다. 각각의 상기 특허 출원들의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자 제출된 서열 목록을 포함하며, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 2020년 1월 7일자로 만들어진 상기 ASCII 복사물은 117811_03020_SL.TXT로 명명되며, 크기가 20,997 바이트이다.
Serpinc1은 세린 프로테이나제 억제제(serine proteinase inhibitor; serpin) 상과의 구성원이다. Serpinc1은 트롬빈뿐만 아니라 응집(coagulation) 시스템의 다른 활성화 세린 프로테아제, 예를 들어, 인자 X, IX, XI, XII 및 VII을 억제하고, 이에 따라, 혈액 응집 캐스케이드(cascade)를 조절하는 혈장 프로테아제 억제제이다. Serpinc1의 항응집 활성은 헤파린, 및 트롬빈:항트롬빈(TAT) 복합체의 형성을 촉진시키는 기타 관련 글루코사미노글리칸의 존재에 의해 증진된다.
선천적 또는 후천적 출혈성 장애는 부적당한 혈액 응고(clotting)가 일어나는 질병이다. 예를 들어, 혈우병은 신체의 혈액 응고 또는 응집 조절 능력이 손상된 선천적 출혈성 유전 장애의 그룹이다. A형 혈우병은 기능적 응고 인자 VIII의 결여를 수반하는 열성 X 염색체-관련 유전 장애이며, 혈우병 사례의 80%에 상당한다. B형 혈우병은 기능적 응고 인자 IX의 결여를 수반하는 열성 X 염색체-관련 유전 장애이다. B형 혈우병은 혈우병 사례의 대략 20%이다. C형 혈우병은 기능적 응고 인자 XI의 결여를 수반하는 상염색체 유전 장애이다. C형 혈우병은 완전히 열성이 아닌데, 이는 이형접합 개체도 또한 증가된 출혈을 보이기 때문이다.
비록, 현재는 혈우병에 대한 치유법이 존재하지 않지만, 결핍 응고 인자, 예를 들어, A형 혈우병에서 인자 VIII의 규칙적인 주입으로 조절될 수 있다. 그러나, 일부 혈우병에서는 그들에게 제공되는 대체 인자에 대하여 항체(억제제)가 발생되며, 이에 따라, 대체 응고 인자에 대해 불응성이 된다. 따라서, 이러한 대상체에서 출혈은 적절하게 조절될 수 없다.
항트롬빈(AT)을 표적으로 하는 월 1회 피하 투여되는 연구용 RNAi 치료제인 피투시란(Fitusiran)은 억제제가 존재 및 부재하는 A형 혈우병 및 B형 혈우병의 치료를 위해 최근 개발되었으며, 그러한 치료제를 포함하는 안정한 약학적 조성물이 출혈성 장애, 예컨대, 혈우병을 갖는 대상체를 위한 대체 치료로서 당 분야에 필요하다.
본 발명은, 적어도 부분적으로, Serpinc1 유전자의 발현을 억제하는 이중 가닥 리보핵산(double stranded ribonucleic acid; dsRNA) 작용제를 포함하는 다른 조성물과 비교할 때 개선된 안정성, 효능, 내구성, 및 투여 용이성을 갖는 Serpinc1 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA 작용제를 포함하는 안정한 약학적 조성물의 발견을 기초로 한다. 이러한 약학적 조성물은 출혈성 장애, 예컨대, 혈우병을 갖는 대상체를 치료하는 데 유용하다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 약 50 mg/mL 내지 약 200 mg/mL 농도의 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제 및 약 1 mM 내지 약 10 mM 농도의 인산염 완충 염수(PBS)를 포함하는, Serpinc1 유전자의 발현을 억제하기 위한 약학적 조성물로서, 약학적 조성물의 pH는 대상체에게 피하 투여하기에 적합하고, dsRNA 작용제는 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 센스 가닥 및 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 안티센스 가닥을 갖고, a, g, c, 및 u는 2'-O-메틸(2'-OMe) A, G, C, 및 U이고; Af, Gf, Cf, 및 Uf는 2'-플루오로 A, G, C, U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고, 리간드는 링커를 통해 센스 가닥의 3' 말단에 컨쥬게이트되고, 리간드 및 링커는 하기 구조
Figure pct00001
를 갖고, dsRNA 작용제는 유리산 형태인, 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 약 50 mg/mL 내지 약 200 mg/mL 농도의 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제 및 약 1 mM 내지 약 10 mM 농도의 인산염 완충 염수(PBS)를 포함하는, Serpinc1 유전자의 발현을 억제하기 위한 약학적 조성물로서, 약학적 조성물의 pH는 대상체에게 피하 투여하기에 적합하고, dsRNA 작용제는 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 센스 가닥 및 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 안티센스 가닥을 갖고, a, g, c, 및 u는 2'-O-메틸(2'-OMe) A, G, C, 및 U이고; Af, Gf, Cf, 및 Uf는 2'-플루오로 A, G, C, U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고, 리간드는 링커를 통해 센스 가닥의 3' 말단에 컨쥬게이트되고, 리간드 및 링커는 하기 구조
Figure pct00002
를 갖고, dsRNA 작용제는 염 형태인, 약학적 조성물을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 약 50 mg/mL 내지 약 200 mg/mL 농도의 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제 및 약 1 mM 내지 약 10 mM 농도의 인산염 완충 염수(PBS)를 포함하는, Serpinc1 유전자의 발현을 억제하기 위한 약학적 조성물로서, 약학적 조성물의 pH 및 오스몰농도는 대상체에게 피하 투여하기에 적합하고, dsRNA 작용제는 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 센스 가닥 및 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 안티센스 가닥을 갖고, a, g, c, 및 u는 2'-O-메틸(2'-OMe) A, G, C, 및 U이고; Af, Gf, Cf, 및 Uf는 2'-플루오로 A, G, C, U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고, 리간드는 링커를 통해 센스 가닥의 3' 말단에 컨쥬게이트되고, 리간드 및 링커는 하기 구조
Figure pct00003
를 갖고, sRNA 작용제는 유리산 형태인, 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 약 50 mg/mL 내지 약 200 mg/mL 농도의 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제 및 약 1 mM 내지 약 10 mM 농도의 인산염 완충 염수(PBS)를 포함하는, Serpinc1 유전자의 발현을 억제하기 위한 약학적 조성물로서, 약학적 조성물의 pH 및 오스몰농도는 대상체에게 피하 투여하기에 적합하고, dsRNA 작용제는 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 센스 가닥 및 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 안티센스 가닥을 갖고, a, g, c, 및 u는 2'-O-메틸(2'-OMe) A, G, C, 및 U이고; Af, Gf, Cf, 및 Uf는 2'-플루오로 A, G, C, U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고, 리간드는 링커를 통해 센스 가닥의 3' 말단에 컨쥬게이트되고, 리간드 및 링커는 하기 구조
Figure pct00004
를 갖고, dsRNA 작용제는 염 형태인, 약학적 조성물을 제공한다.
dsRNA의 염 형태는 나트륨 염 형태일 수 있다.
일 구현예에서, 작용제에서 실질적으로 모든 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 기는 나트륨 상대이온을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 작용제에서 모든 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 기는 나트륨 상대이온을 포함한다.
약학적 조성물 중 PBS의 농도는 약 2 mM 내지 약 7 mM; 약 3 내지 약 6 mM; 또는 약 5 mM일 수 있다.
약학적 조성물의 pH는 약 5.0 내지 약 8.0; 약 6.0 내지 약 8.0; 약 6.5 내지 약 7.5; 또는 약 6.8 내지 약 7.2일 수 있다.
약학적 조성물의 오스몰농도는 약 50 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg; 약 100 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg; 약 240 mOsm/kg 내지 약 390 mOsm/kg; 또는 약 290 mOsm/kg 내지 약 320 mOsm/kg일 수 있다.
약학적 조성물 중 dsRNA 작용제의 농도는 약 50 mg/mL 내지 약 150 mg/mL; 약 80 mg/mL 내지 약 110 mg/mL; 또는 약 100 mg/mL일 수 있다.
일 구현예에서, 조성물은 약 2℃ 내지 약 8℃에서 저장될 때 약 6개월 내지 약 36개월 동안 안정하다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 약 25℃ 및 60% 상대 습도(RH)에서 저장될 때 약 6개월 내지 약 36개월 동안 안정하다. 추가의 또 다른 구현예에서, 조성물은 약 40℃ 및 75% 상대 습도(RH)에서 저장될 때 약 6개월 동안 안정하다.
또 다른 구현예에서, 조성물은 약 2℃ 내지 약 8℃에서 저장될 때 약 36개월까지 안정하다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 약 25℃ 및 60% 상대 습도(RH)에서 저장될 때 약 36개월까지 안정하다. 추가의 또 다른 구현예에서, 조성물은 약 40℃ 및 75% 상대 습도(RH)에서 저장될 때 약 6개월까지 안정하다.
일 구현예에서, 조성물은 순도 비-변성 IPRP-HPLC에 의해 결정하는 경우 약 95.0 면적% 이상(NLT)의 듀플렉스 및 약 5 면적% 이하(NMT)의 총 듀플렉스 불순물을 포함한다.
일 구현예에서, 조성물은 순도 변성 AX-HPLC에 의해 결정하는 경우 약 85.0 면적% 이상(NLT)의 총 단일 가닥을 포함한다.
일 구현예에서, 조성물은 순도 변성 IPRP-HPLC에 의해 결정하는 경우 약 80.0 면적% 이상(NLT)의 총 단일 가닥을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 약학적 조성물을 포함하는 바이알 및 시린지를 제공한다.
바이알은 약 0.5 ml 내지 약 2.0 ml의 약학적 조성물; 또는 약 0.8 ml의 약학적 조성물을 포함할 수 있다.
본 발명의 시린지는 1 ml 시린지; 또는 3 ml 시린지일 수 있다. 일 구현예에서, 시린지는 1 ml 일회용 시린지이다.
본 발명의 시린지는 29G 니들; 또는 30G 니들을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 니들은 29G 니들이다.
일 양태에서, 본 발명은 약 100 mg/mL 농도의 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제 및 약 5 mM 농도의 인산염 완충 염수(PBS)를 포함하는, Serpinc1 유전자의 발현을 억제하기 위한 약학적 조성물로서, 약학적 조성물의 pH는 약 6.8 내지 약 7.2이고, dsRNA 작용제는 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 센스 가닥 및 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 안티센스 가닥을 갖고, a, g, c, 및 u는 2'-O-메틸(2'-OMe) A, G, C, 및 U이고; Af, Gf, Cf, 및 Uf는 2'-플루오로 A, G, C, U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고, 리간드는 링커를 통해 센스 가닥의 3' 말단에 컨쥬게이트되고, 리간드 및 링커는 하기 구조
Figure pct00005
를 갖고, dsRNA 작용제는 유리산 형태인, 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 약 106 mg/mL 농도의 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제 및 약 5 mM 농도의 인산염 완충 염수(PBS)를 포함하는, Serpinc1 유전자의 발현을 억제하기 위한 약학적 조성물로서, 약학적 조성물의 pH는 약 6.8 내지 약 7.2이고, dsRNA 작용제는 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 센스 가닥 및 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 안티센스 가닥을 갖고, a, g, c, 및 u는 2'-O-메틸(2'-OMe) A, G, C, 및 U이고; Af, Gf, Cf, 및 Uf는 2'-플루오로 A, G, C, U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고, 리간드는 링커를 통해 센스 가닥의 3' 말단에 컨쥬게이트되고, 리간드 및 링커는 하기 구조
Figure pct00006
를 갖고, dsRNA 작용제는 염 형태인, 약학적 조성물을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 약 100 mg/mL 농도의 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제 및 약 5 mM 농도의 인산염 완충 염수(PBS)를 포함하는, Serpinc1 유전자의 발현을 억제하기 위한 약학적 조성물로서, 약학적 조성물의 pH는 약 6.8 내지 약 7.2이고, 약학적 조성물의 오스몰농도는 약 300 mOsm/kg이고, dsRNA 작용제는 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 센스 가닥 및 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 안티센스 가닥을 갖고, a, g, c, 및 u는 2'-O-메틸(2'-OMe) A, G, C, 및 U이고; Af, Gf, Cf, 및 Uf는 2'-플루오로 A, G, C, U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고, 리간드는 링커를 통해 센스 가닥의 3' 말단에 컨쥬게이트되고, 리간드 및 링커는 하기 구조
Figure pct00007
를 갖고, dsRNA 작용제는 유리산 형태인, 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 약 106 mg/mL 농도의 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제 및 약 5 mM 농도의 인산염 완충 염수(PBS)를 포함하는, Serpinc1 유전자의 발현을 억제하기 위한 약학적 조성물로서, 약학적 조성물의 pH는 약 6.8 내지 약 7.2이고, 약학적 조성물의 오스몰농도는 약 300 mOsm/kg이고, dsRNA 작용제는 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 센스 가닥 및 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 안티센스 가닥을 갖고, a, g, c, 및 u는 2'-O-메틸(2'-OMe) A, G, C, 및 U이고; Af, Gf, Cf, 및 Uf는 2'-플루오로 A, G, C, U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고, 리간드는 링커를 통해 센스 가닥의 3' 말단에 컨쥬게이트되고, 리간드 및 링커는 하기 구조
Figure pct00008
를 갖고, dsRNA 작용제는 염 형태인, 약학적 조성물을 제공한다.
일 구현예에서, 염 형태는 나트륨 염 형태이다.
일 구현예에서, 작용제에서 실질적으로 모든 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 기는 나트륨 상대이온을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 작용제에서 모든 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 기는 나트륨 상대이온을 포함한다.
일 구현예에서, 조성물은 약 2℃ 내지 약 8℃에서 저장될 때 약 6개월 내지 약 36개월 동안 안정하다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 약 25℃ 및 60% 상대 습도(RH)에서 저장될 때 약 6개월 내지 약 36개월 동안 안정하다. 추가의 또 다른 구현예에서, 조성물은 약 40℃ 및 75% 상대 습도(RH)에서 저장될 때 약 6개월 동안 안정하다.
일 구현예에서, 조성물은 약 2℃ 내지 약 8℃에서 저장될 때 약 36개월까지 안정하다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 약 25℃ 및 60% 상대 습도(RH)에서 저장될 때 약 36개월까지 안정하다. 추가의 또 다른 구현예에서, 조성물은 약 40℃ 및 75% 상대 습도(RH)에서 저장될 때 약 6개월까지 안정하다.
일 구현예에서, 조성물은 순도 비-변성 IPRP-HPLC에 의해 결정하는 경우 약 95.0 면적% 이상(NLT)의 듀플렉스 및 약 5 면적% 이하(NMT)의 총 듀플렉스 불순물을 포함한다.
일 구현예에서, 조성물은 순도 변성 AX-HPLC에 의해 결정하는 경우 약 85.0 면적% 이상(NLT)의 총 단일 가닥을 포함한다.
일 구현예에서, 조성물은 순도 변성 IPRP-HPLC에 의해 결정하는 경우 약 80.0 면적% 이상(NLT)의 총 단일 가닥을 포함한다.
본 발명은 또한 상기 약학적 조성물을 포함하는 바이알을 제공한다. 바이알은 약 0.5 ml 내지 약 2.0 ml의 약학적 조성물; 또는 약 0.8 ml의 약학적 조성물을 포함할 수 있다.
본 발명은 추가로 상기 약학적 조성물을 포함하는 시린지를 제공한다.
본 발명의 시린지는 1 ml 시린지; 또는 3 ml 시린지일 수 있다. 일 구현예에서, 시린지는 1 ml 일회용 시린지이다.
본 발명의 시린지는 29G 니들; 또는 30G 니들을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 니들은 29G 니들이다.
일 구현예에서, 시린지는 프리-필드 시린지이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 Serpinc1 유전자의 발현을 억제하기 위한 약 0.8 ml의 약학적 조성물을 포함하는 2 ml 바이알로서, 약학적 조성물은 약 106 mg/mL 농도의 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제 및 약 5 mM 농도의 인산염 완충 염수(PBS)를 포함하고, 약학적 조성물의 pH는 약 6.8 내지 약 7.2이고, 약학적 조성물의 오스몰농도는 약 300 mOsm/kg이고, dsRNA 작용제는 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 센스 가닥 및 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 안티센스 가닥을 갖고, a, g, c, 및 u는 2'-O-메틸(2'-OMe) A, G, C, 및 U이고; Af, Gf, Cf, 및 Uf는 2'-플루오로 A, G, C, U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고, 리간드는 링커를 통해 센스 가닥의 3' 말단에 컨쥬게이트되고, 리간드 및 링커는 하기 구조
Figure pct00009
를 갖고, dsRNA 작용제는 나트륨 염 형태이고, 작용제에서 모든 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 기는 나트륨 상대이온을 포함하는, 바이알을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 29G 니들을 포함하는 1 ml 프리-필드 일회용 시린지로서, 시린지는 Serpinc1 유전자의 발현을 억제하기 위한 약 0.8 ml의 약학적 조성물을 포함하고, 약학적 조성물은 약 106 mg/mL 농도의 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제 및 약 5 mM 농도의 인산염 완충 염수(PBS)를 포함하고, 약학적 조성물의 pH는 약 6.8 내지 약 7.2이고, 약학적 조성물의 오스몰농도는 약 300 mOsm/kg이고, dsRNA 작용제는 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 센스 가닥 및 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 안티센스 가닥을 갖고, a, g, c, 및 u는 2'-O-메틸(2'-OMe) A, G, C, 및 U이고; Af, Gf, Cf, 및 Uf는 2'-플루오로 A, G, C, U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고, 리간드는 링커를 통해 센스 가닥의 3' 말단에 컨쥬게이트되고, 리간드 및 링커는 하기 구조
Figure pct00010
를 갖고, dsRNA 작용제는 나트륨 염 형태이고, 작용제에서 모든 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 기는 나트륨 상대이온을 포함하는, 시린지를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 Serpinc1 유전자의 발현을 억제하기 위한 약 0.8 ml의 약학적 조성물을 포함하는 2 ml 바이알로서, 약학적 조성물은 약 106 mg/mL 농도의 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제 및 약 5 mM 농도의 인산염 완충 염수(PBS)를 포함하고, 약학적 조성물의 pH는 약 6.8 내지 약 7.2이고, 약학적 조성물의 오스몰농도는 약 300 mOsm/kg이고, dsRNA 작용제는 하기 구조
Figure pct00011
를 갖고, Am, Gm, Cm, 및 Um은 2'-O-메틸(2'-OMe) A, G, C, 및 U이고; Af, Gf, Cf, 및 Uf는 2'-플루오로 A, G, C, U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고; L96은 하기 구조
Figure pct00012
를 갖는 리간드 및 링커이고, dsRNA 작용제는 나트륨 염 형태이고, 작용제에서 모든 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 기는 나트륨 상대이온을 포함하는, 바이알을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 29G 니들을 포함하는 1 ml 프리-필드 일회용 시린지로서, 시린지는 Serpinc1 유전자의 발현을 억제하기 위한 약 0.8 ml의 약학적 조성물을 포함하고, 약학적 조성물은 약 106 mg/mL 농도의 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제 및 약 5 mM 농도의 인산염 완충 염수(PBS)를 포함하고, 약학적 조성물의 pH는 약 6.8 내지 약 7.2이고, 약학적 조성물의 오스몰농도는 약 300 mOsm/kg이고, dsRNA 작용제는 하기 구조
Figure pct00013
를 갖고, Am, Gm, Cm, 및 Um은 2'-O-메틸(2'-OMe) A, G, C, 및 U이고; Af, Gf, Cf, 및 Uf는 2'-플루오로 A, G, C, U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고; L96은 하기 구조
Figure pct00014
를 갖는 리간드 및 링커이고, dsRNA 작용제는 나트륨 염 형태이고, 작용제에서 모든 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 기는 나트륨 상대이온을 포함하는, 시린지를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 Serpinc1 유전자의 발현을 억제하기 위한 약 0.8 ml의 약학적 조성물을 포함하는 2 ml 바이알로서, 약학적 조성물은 약 106 mg/mL 농도의 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제 및 약 5 mM 농도의 인산염 완충 염수(PBS)를 포함하고, 약학적 조성물의 pH는 약 6.8 내지 약 7.2이고, dsRNA 작용제는 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 센스 가닥 및 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 안티센스 가닥을 갖고, a, g, c, 및 u는 2'-O-메틸(2'-OMe) A, G, C, 및 U이고; Af, Gf, Cf, 및 Uf는 2'-플루오로 A, G, C, U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고, 리간드는 링커를 통해 센스 가닥의 3' 말단에 컨쥬게이트되고, 리간드 및 링커는 하기 구조
Figure pct00015
를 갖고, dsRNA 작용제는 나트륨 염 형태이고, 작용제에서 모든 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 기는 나트륨 상대이온을 포함하는, 바이알을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 29G 니들을 포함하는 1 ml 프리-필드 일회용 시린지로서, 시린지는 Serpinc1 유전자의 발현을 억제하기 위한 약 0.8 ml의 약학적 조성물을 포함하고, 약학적 조성물은 약 106 mg/mL 농도의 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제 및 약 5 mM 농도의 인산염 완충 염수(PBS)를 포함하고, 약학적 조성물의 pH는 약 6.8 내지 약 7.2이고, dsRNA 작용제는 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 센스 가닥 및 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 안티센스 가닥을 갖고, a, g, c, 및 u는 2'-O-메틸(2'-OMe) A, G, C, 및 U이고; Af, Gf, Cf, 및 Uf는 2'-플루오로 A, G, C, U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고, 리간드는 링커를 통해 센스 가닥의 3' 말단에 컨쥬게이트되고, 리간드 및 링커는 하기 구조
Figure pct00016
를 갖고, dsRNA 작용제는 나트륨 염 형태이고, 작용제에서 모든 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 기는 나트륨 상대이온을 포함하는, 시린지를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 Serpinc1 유전자의 발현을 억제하기 위한 약 0.8 ml의 약학적 조성물을 포함하는 2 ml 바이알로서, 약학적 조성물은 약 106 mg/mL 농도의 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제 및 약 5 mM 농도의 인산염 완충 염수(PBS)를 포함하고, 약학적 조성물의 pH는 약 6.8 내지 약 7.2이고, dsRNA 작용제는 하기 구조
Figure pct00017
를 갖고, Am, Gm, Cm, 및 Um은 2'-O-메틸(2'-OMe) A, G, C, 및 U이고; Af, Gf, Cf, 및 Uf는 2'-플루오로 A, G, C, U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고; L96은 하기 구조
Figure pct00018
를 갖는 리간드 및 링커이고, dsRNA 작용제는 나트륨 염 형태이고, 작용제에서 모든 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 기는 나트륨 상대이온을 포함하는, 바이알을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 29G 니들을 포함하는 1 ml 프리-필드 일회용 시린지로서, 시린지는 Serpinc1 유전자의 발현을 억제하기 위한 약 0.8 ml의 약학적 조성물을 포함하고, 약학적 조성물은 약 106 mg/mL 농도의 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제 및 약 5 mM 농도의 인산염 완충 염수(PBS)를 포함하고, 약학적 조성물의 pH는 약 6.8 내지 약 7.2이고, dsRNA 작용제는 하기 구조
Figure pct00019
를 갖고, Am, Gm, Cm, 및 Um은 2'-O-메틸(2'-OMe) A, G, C, 및 U이고; Af, Gf, Cf, 및 Uf는 2'-플루오로 A, G, C, U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고; L96은 하기 구조
Figure pct00020
를 갖는 리간드 및 링커이고, dsRNA 작용제는 나트륨 염 형태이고, 작용제에서 모든 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 기는 나트륨 상대이온을 포함하는, 시린지를 제공한다.
도 1은 피투시란 의약품의 대표적인 비-변성 이온-쌍 역상 고성능 액체 크로마토그래피(IP RP-HPLC) 크로마토그램을 도시한 것이다. siRNA 듀플렉스에서 포스포로티오에이트의 상이한 입체이성질체의 부분적 분해로 인해 피투시란 듀플렉스 피크의 간헐적인 약간의 분할이 관찰되었다. 피투시란 피크의 질량 분광기 분석은 전체 듀플렉스 피크에 걸쳐 동등한 비율로 예상 질량의 둘 모두의 단일 가닥의 존재를 확인시켜 주었다.
도 2는 피투시란 의약품의 듀플렉스에서 단일 가닥의 대표적인 변성 음이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피(AX-HPLC) 크로마토그램을 도시한 것이다.
도 3은 피투시란 의약품의 듀플렉스에서 단일 가닥의 대표적인 변성 이온-쌍 역상 고성능 액체 크로마토그래피(IP RP-HPLC)의 크로마토그래피 프로파일을 도시한 것이다.
본 발명은 Serpinc1 유전자의 RNA 전사물의 RNA-유도 침묵화 복합체(RNA-induced silencing complex; RISC)-매개 절단을 초래하는 iRNA 작용제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명은, 적어도 부분적으로, Serpinc1 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA 작용제를 포함하는 다른 조성물과 비교할 때 개선된 안정성, 효능, 내구성, 및 투여 용이성을 갖는 작용제를 포함하는 안정한 약학적 조성물의 발견을 기초로 한다. 이러한 약학적 조성물은 Serpinc1 유전자의 발현을 억제하고/억제하거나 Serpinc1 유전자의 발현의 억제 또는 감소로 효과를 얻을 장애, 예를 들어, 출혈성 장애, 예컨대, 혈우병을 갖는 대상체를 치료하는 데 유용하다.
하기의 상세한 설명에는 Serpinc1 유전자의 발현을 억제하기 위한 iRNA를 함유하는 조성물의 제조 및 이용 방법, 및 이러한 유전자의 발현의 억제 및/또는 감소로 효과를 얻을 질병 및 장애를 갖는 대상체를 치료하기 위한 조성물, 용도 및 방법이 개시되어 있다.
I. 정의
본 발명을 보다 용이하게 이해할 수 있도록, 소정의 용어가 먼저 정의된다. 또한, 파라미터의 값 또는 값의 범위가 언급될 때는 언제나, 언급된 값의 중간의 값 및 범위도 또한 본 발명의 일부인 것으로 의도되는 것을 주목해야 한다.
관사("a" 및 "an")는 관사의 문법상 대상이 1개 또는 1개 초과(즉, 적어도 1개)인 것을 지칭하기 위해 본원에 사용된다. 예로서, "하나의 요소"는 하나의 요소 또는 1개 초과의 요소, 예를 들어, 복수의 요소를 의미한다.
용어 "약"은 당업계의 통상적인 허용 범위 내를 의미하는 것으로 본원에 사용된다. 예를 들어, "약"은 평균으로부터 약 2 표준 편차로서 이해될 수 있다. 특정 구현예에서, 약은 +10%를 의미한다. 특정 구현예에서, 약은 +5%를 의미한다. 약이 일련의 수치 또는 범위 앞에 존재하는 경우, "약"은 각각의 일련의 수치 또는 범위를 수정할 수 있는 것으로 이해된다.
용어 "포함하는"은 어구 "포함하나, 이에 제한되지는 않는"을 의미하는 것으로 본원에 사용되며, 이와 상호교환 가능하게 사용된다.
용어 "또는"은 문맥에서 명백하게 다르게 나타내지 않는 한, 용어 "및/또는"을 의미하는 것으로 본원에 사용되며, 이와 상호교환 가능하게 사용된다.
본원에 사용되는 용어 "약학적 조성물"은 대상체, 예를 들어, 인간 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하는 데 유용한 조성물을 지칭한다.
용어 "약학적 투여"는 질병 또는 장애를 치료하기 위해 대상체에게 본원에 기재된 바와 같은 dsRNA 작용제를 투여하는 것을 포함하는 조성물의 전달을 지칭한다. 따라서, "약학적 투여에 적합한", 예컨대, "피하 투여에 적합한"은 약학적 조성물의 피하 투여를 통해 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하는 데 사용될 수 있는 dsRNA 작용제를 포함하는 조성물을 나타낸다. 약학적 조성물은 약학적 투여에 적합하고, 예를 들어, 피하 투여에 적합하다.
용어 "오스몰농도"는 용매의 킬로그램 당 용질의 오스몰 수를 지칭한다. 이는 osmol/kg 또는 Osm/kg과 관련하여 표현된다. "오스몰"은 화학 용액의 삼투압에 기여하는 화합물의 몰수를 나타내는 측정 단위이다.
본원에서 사용되는 "Serpinc1"은 세포에서 발현되는 특정 폴리펩티드를 지칭한다. Serpinc1은 세르핀 펩티다제 억제제, 계통군 C(항트롬빈; AT), 구성원 1; 항트롬빈 III; AT3; 항트롬빈; 및 헤파린 보조인자 1로도 알려져 있다. 인간 Serpinc1 mRNA 전사물의 서열은 예를 들어, GenBank 수탁 번호 GI:254588059(NM_000488; SEQ ID NO: 1)에서 찾을 수 있다. 레수스(rhesus) Serpinc1 mRNA의 서열은 예를 들어, GenBank 수탁 번호 GI:157167169(NM_001104583; SEQ ID NO: 2)에서 찾을 수 있다. 마우스 Serpinc1 mRNA의 서열은 예를 들어, GenBank 수탁 번호 GI:237874216(NM_080844; SEQ ID NO: 3)에서 찾을 수 있다. 랫트(rat) Serpinc1 mRNA의 서열은 예를 들어, GenBank 수탁 번호 GI:58865629(NM_001012027; SEQ ID NO: 4)에서 찾을 수 있다.
또한, 본원에 사용되는 용어 "Serpinc1"은 Serpinc1 유전자의 자연 발생 DNA 서열 변이, 예를 들어, Serpinc1 유전자 내의 단일 뉴클레오티드 다형성에 의해 세포에서 발현되는 특정 폴리펩티드를 지칭한다. Serpinc1 유전자 내의 수많은 SNP가 확인되었으며, 예를 들어, NCBI dbSNP(예를 들어, www.ncbi.nlm.nih.gov/snp 참조)에서 찾을 수 있다. Serpinc1 유전자 내의 SNP의 비제한적인 예는 NCBI dbSNP 수탁 번호 rs677; rs5877; rs5878; rs5879; rs941988; rs941989; rs1799876; rs19637711; rs2008946; 및 rs2227586에서 찾을 수 있다.
본원에서 사용되는 "대상체"는 동물, 예를 들어, 영장류(예를 들어, 인간, 비인간 영장류, 예를 들어, 원숭이 및 침팬지), 비-영장류(예를 들어, 소, 돼지, 낙타, 라마, 말, 염소, 토끼, 양, 햄스터, 기니피그(guinea pig), 고양이, 개, 랫트, 마우스, 말 및 고래) 또는 조류(예를 들어, 오리 또는 거위)를 포함하는 포유동물이다. 일 구현예에서, 대상체는 인간, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 Serpinc1 발현의 감소로 효과를 얻을 질병, 장애 또는 질환을 위해 치료 중이거나 이에 대해 평가된 인간; Serpinc1 발현의 감소로 효과를 얻을 질병, 장애 또는 질환의 위험이 있는 인간; Serpinc1 발현의 감소로 효과를 얻을 질병, 장애 또는 질환이 있는 인간; 및/또는 Serpinc1 발현의 감소로 효과를 얻을 질병, 장애 또는 질환에 대하여 치료 중인 인간이다.
본원에서 사용되는 용어 "억제하는"은 "감소시키는", "침묵시키는", "하향조절하는", "저해하는" 및 기타 유사 용어와 상호교환 가능하게 사용되며, 임의의 수준의 억제를 포함한다.
본원에서 사용되는 어구 "Serpinc1의 발현의 억제"는 임의의 Serpinc1 유전자(예를 들어, 마우스 Serpinc1 유전자, 랫트 Serpinc1 유전자, 원숭이 Serpinc1 유전자, 또는 인간 Serpinc1 유전자)뿐만 아니라, Serpinc1 단백질을 인코딩하는 Serpinc1 유전자의 변이체 또는 돌연변이체의 발현의 억제를 포함한다.
"Serpinc1 유전자의 발현의 억제"는 Serpinc1 유전자의 임의의 수준의 억제, 예를 들어, Serpinc1 유전자의 발현의 적어도 부분적인 억제, 예를 들어, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%까지의 억제를 포함한다.
Serpinc1 유전자의 발현은 Serpinc1 유전자 발현과 관련된 임의의 변수의 수준, 예를 들어, Serpinc1 mRNA 수준, Serpinc1 단백질 수준 또는 예를 들어, 트롬빈 생성능의 척도로서의 트롬빈:항트롬빈 복합체 수준, 출혈 시간, 프로트롬빈 시간(PT), 혈소판 계수 및/또는 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT)에 기초하여 평가될 수 있다. 억제는 대조군 수준에 비한 이들 변수 중 하나 이상의 절대 또는 상대 수준의 감소에 의해 평가될 수 있다. 대조군 수준은 당업계에 사용되는 임의의 유형의 대조군 수준, 예를 들어, 사전-투여 기준선 수준, 또는 처리되지 않거나 대조군(예를 들어, 단독의 완충제 대조군 또는 불활성 작용제 대조군)으로 처리된 유사한 대상체, 세포 또는 샘플로부터 결정된 수준일 수 있다.
일 구현예에서, Serpinc1 유전자의 발현의 적어도 부분적 저해는 Serpinc1 유전자가 전사되며, 제1 세포 또는 세포의 그룹과 실질적으로 동일하지만, 그렇게 처리되지 않은 제2 세포 또는 세포의 그룹(대조군 세포)에 비하여, Serpinc1 유전자의 발현이 억제되도록 처리된 제1 세포 또는 세포의 그룹으로부터 분리되거나 그에서 검출될 수 있는 Serpinc1 mRNA의 양의 감소에 의해 평가된다. 억제의 정도는 하기와 같이 표현될 수 있다:
Figure pct00021
본원에서 사용되는 어구, dsRNA와 같이 "세포를 RNAi 작용제와 접촉시키는"은 임의의 가능한 수단에 의해 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 세포를 RNAi 작용제와 접촉시키는 것은 시험관내에서 세포를 iRNA와 접촉시키는 것, 또는 생체내에서 세포를 iRNA와 접촉시키는 것을 포함한다. 접촉은 직접적으로 또는 간접적으로 행해질 수 있다. 따라서, 예를 들어, RNAi 작용제는 방법을 개별적인 수행 방법에 의해 세포와 물리적으로 접촉하게 될 수 있고, 또는 대안적으로, RNAi 작용제는 그것이 후속적으로 세포와 접촉하게 허용하거나, 그와 접촉하게 되는 상황에 놓일 수 있다.
시험관내에서의 세포의 접촉은 예를 들어, 세포를 RNAi 작용제와 인큐베이션시킴으로써 행해질 수 있다. 생체내에서의 세포의 접촉은 예를 들어, 세포가 위치한 조직으로 또는 그 근처로의 RNAi 작용제의 주입에 의해, 또는 작용제가 후속적으로 접촉될 세포가 위치하는 조직에 도달하도록, 또 다른 영역, 예를 들어, 혈류 또는 피하 공간으로의 RNAi 작용제의 주입에 의해 행해질 수 있다. 예를 들어, RNAi 작용제는 리간드, 예를 들어, RNAi 작용제를 대상 위치, 예를 들어, 간으로 지향시키는 GalNAc3를 함유하고/하거나 그에 커플링될 수 있다. 시험관내 및 생체내 접촉 방법의 병용도 또한 가능하다. 예를 들어, 세포는 또한 시험관내에서 RNAi 작용제와 접촉되고, 후속적으로 대상체 내로 이식될 수 있다.
II. 본 발명의 약학적 조성물
본 발명은 Serpinc1 유전자의 발현을 억제하는 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제를 포함하는 안정한 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학적 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 dsRNA 작용제, 및 인산염 완충 염수(PBS)를 포함하고, 대상체에게 피하 투여하기에 적합하다. dsRNA 작용제를 함유하는 약학적 조성물은 Serpinc1 유전자의 발현 또는 활성과 관련된 질병 또는 장애, 예를 들어, Serpinc1-관련 질병, 예를 들어, 혈우병을 치료하는 데 유용하다. 본 발명의 약학적 조성물은 Serpinc1 유전자의 발현을 억제하기에 충분한 투여량으로 투여될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 유리산 형태의 본 발명의 dsRNA 작용제를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 나트륨 염 형태의 본 발명의 dsRNA 작용제를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 작용제가 나트륨 염 형태인 경우, 나트륨 이온은 작용제에 존재하는 실질적으로 모든 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 기에 대해 상대이온으로서 작용제에 존재한다(전기적 중성을 유지하기 위해). 실질적으로 모든 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 결합이 나트륨 상대이온을 갖는 작용제는 나트륨 상대이온이 없는 5개 이하, 4개, 3개, 2개, 또는 1개의 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 작용제가 나트륨 염 형태인 경우, 나트륨 이온은 작용제에 존재하는 모든 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 기에 대해 상대이온으로서 작용제에 존재한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약 50 mg/mL 내지 약 200 mg/mL, 약 50 mg/mL 내지 약 150 mg/mL; 약 90 mg/mL 내지 약 110 mg/mL, 약 90 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 또는 약 80 mg/mL 내지 약 110 mg/mL, 예를 들어, 약 50 mg/mL, 55 mg/mL, 60 mg/mL, 65 mg/mL, 70 mg/mL, 75 mg/mL, 80 mg/mL, 85 mg/mL, 90 mg/mL, 95 mg/mL, 100 mg/mL, 105 mg/mL, 106 mg/mL, 110 mg/mL, 115 mg/mL, 120 mg/mL, 125 mg/mL, 130 mg/mL, 135 mg/mL, 140 mg/mL, 145 mg/mL, 150 mg/mL, 155 mg/mL, 160 mg/mL, 165 mg/mL, 170 mg/mL, 175 mg/mL, 180 mg/mL, 185 mg/mL, 190 mg/mL, 195 mg/mL, 또는 약 200 mg/mL의 농도의 dsRNA 작용제를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 약 100 mg/mL의 농도의 dsRNA 작용제를 포함한다. 상기 언급된 범위 및 값의 중간의 값이 또한 본 발명의 일부인 것으로 의도된다. 또한, 임의의 상기 언급된 값의 조합을 상한치 및/또는 하한치로서 사용하는 값의 범위가 포함되는 것으로 의도된다.
본 발명의 약학적 조성물은 PBS를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, PBS는 소듐 클로라이드 및 소듐 포스페이트를 포함하지만, 포타슘 클로라이드 및/또는 포타슘 포스페이트를 포함하지 않는다. 또 다른 구현예에서, PBS는 소듐 클로라이드, 소듐 포스페이트, 및 포타슘 클로라이드를 포함한다. 추가의 또 다른 구현예에서, PBS는 소듐 클로라이드, 소듐 포스페이트, 및 포타슘 포스페이트를 포함한다. 일 구현예에서, PBS는 소듐 클로라이드, 소듐 포스페이트, 포타슘 클로라이드, 및 포타슘 포스페이트를 포함한다. 특정 구현예에서, 예를 들어, PBS가 소듐 클로라이드 및 소듐 포스페이트를 포함하는 경우, PBS는 약 1 mM 내지 약 10 mM; 또는 약 3 mM 내지 약 6 mM, 예를 들어, 약 1mM, 1.5 mM, 2 mM, 2.5 mM, 3 mM, 3.5 mM, 4 mM, 4.5 mM, 5 mM, 6.5 mM, 7 mM, 7.5.mM, 9 mM, 8.5 mM, 9 mM, 9.5 mM, 또는 약 10 mM PBS의 농도일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물에서 PBS의 농도는 약 5 mM이다(예를 들어, 약 0.64 mM NaH2PO4, 약 4.36 mM Na2HPO4, 약 85 mM NaCl). 상기 언급된 범위 및 값의 중간의 값이 또한 본 발명의 일부인 것으로 의도된다. 또한, 임의의 상기 언급된 값의 조합을 상한치 및/또는 하한치로서 사용하는 값의 범위가 포함되는 것으로 의도된다.
일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 보존제-비함유이다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 보존제를 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물의 pH는 피하 투여에 적합하고, 약 5.0 내지 약 8.0, 약 5.5 내지 약 8.0, 약 6.0 내지 약 8.0, 약 6.5 내지 약 8.0, 약 7.0 내지 약 8.0, 약 5.0 내지 약 7.5, 약 5.5 내지 약 7.5, 약 6.0 내지 약 7.5, 약 6.5 내지 약 7.5, 약 5.0 내지 약 7.2, 약 5.25 내지 약 7.2, 약 5.5 내지 약 7.2, 약 5.75 내지 약 7.2, 약 6.0 내지 약 7.2, 약 6.5 내지 약 7.2, 또는 약 6.8 내지 약 7.2일 수 있다. 상기 언급된 범위 및 값의 중간의 범위 및 값이 또한 본 발명의 일부인 것으로 의도된다.
본 발명의 약학적 조성물의 오스몰농도는 약 400 mOsm/kg 이하, 예를 들어, 50 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 75 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 100 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 125 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 150 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 175 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 200 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 250 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 300 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 50 mOsm/kg 내지 375 mOsm/kg, 75 mOsm/kg 내지 375 mOsm/kg, 100 mOsm/kg 내지 375 mOsm/kg, 125 mOsm/kg 내지 375 mOsm/kg, 150 mOsm/kg 내지 375 mOsm/kg, 175 mOsm/kg 내지 375 mOsm/kg, 200 mOsm/kg 내지 375 mOsm/kg, 250 mOsm/kg 내지 375 mOsm/kg, 300 mOsm/kg 내지 375 mOsm/kg, 50 mOsm/kg 내지 350 mOsm/kg, 75 mOsm/kg 내지 350 mOsm/kg, 100 mOsm/kg 내지 350 mOsm/kg, 125 mOsm/kg 내지 350 mOsm/kg, 150 mOsm/kg 내지 350 mOsm/kg, 175 mOsm/kg 내지 350 mOsm/kg, 200 mOsm/kg 내지 350 mOsm/kg, 250 mOsm/kg 내지 350 mOsm/kg, 50 mOsm/kg 내지 325 mOsm/kg, 75 mOsm/kg 내지 325 mOsm/kg, 100 mOsm/kg 내지 325 mOsm/kg, 125 mOsm/kg 내지 325 mOsm/kg, 150 mOsm/kg 내지 325 mOsm/kg, 175 mOsm/kg 내지 325 mOsm/kg, 200 mOsm/kg 내지 325 mOsm/kg, 250 mOsm/kg 내지 325 mOsm/kg, 300 mOsm/kg 내지 325 mOsm/kg, 300 mOsm/kg 내지 350 mOsm/kg, 50 mOsm/kg 내지 300 mOsm/kg, 75 mOsm/kg 내지 300 mOsm/kg, 100 mOsm/kg 내지 300 mOsm/kg, 125 mOsm/kg 내지 300 mOsm/kg, 150 mOsm/kg 내지 300 mOsm/kg, 175 mOsm/kg 내지 300 mOsm/kg, 200 mOsm/kg 내지 300 mOsm/kg, 250 mOsm/kg 내지 300, 50 mOsm/kg 내지 250 mOsm/kg, 75 mOsm/kg 내지 250 mOsm/kg, 100 mOsm/kg 내지 250 mOsm/kg, 125 mOsm/kg 내지 250 mOsm/kg, 150 mOsm/kg 내지 250 mOsm/kg, 175 mOsm/kg 내지 350 mOsm/kg, 200 mOsm/kg 내지 250 mOsm/kg, 예를 들어, 약 50 mOsm/kg, 55 mOsm/kg, 60 mOsm/kg, 65 mOsm/kg, 70 mOsm/kg, 75 mOsm/kg, 80 mOsm/kg, 85 mOsm/kg, 90 mOsm/kg, 95 mOsm/kg, 100 mOsm/kg, 105 mOsm/kg, 110 mOsm/kg, 120 mOsm/kg, 125 mOsm/kg, 130 mOsm/kg, 135 mOsm/kg, 140 mOsm/kg, 145 mOsm/kg, 150 mOsm/kg, 155 mOsm/kg, 160 mOsm/kg, 165 mOsm/kg, 170 mOsm/kg, 175 mOsm/kg, 180 mOsm/kg, 185 mOsm/kg, 190 mOsm/kg, 195 mOsm/kg, 200 mOsm/kg, 205 mOsm/kg, 210 mOsm/kg, 215 mOsm/kg, 220 mOsm/kg, 225 mOsm/kg, 230 mOsm/kg, 235 mOsm/kg, 240 mOsm/kg, 245 mOsm/kg, 250 mOsm/kg, 255 mOsm/kg, 260 mOsm/kg, 265 mOsm/kg, 270 mOsm/kg, 275 mOsm/kg, 280 mOsm/kg, 285 mOsm/kg, 295 mOsm/kg, 300 mOsm/kg, 305 mOsm/kg, 310 mOsm/kg, 320 mOsm/kg, 325 mOsm/kg, 330 mOsm/kg, 335 mOsm/kg, 340 mOsm/kg, 345 mOsm/kg, 350 mOsm/kg, 355 mOsm/kg, 360 mOsm/kg, 365 mOsm/kg, 370 mOsm/kg, 375 mOsm/kg, 380 mOsm/kg, 385 mOsm/kg, 390 mOsm/kg, 395 mOsm/kg, 또는 약 400 mOsm/kg과 같이 피하 투여에 적합할 수 있다. 상기 언급된 범위 및 값의 중간의 범위 및 값이 또한 본 발명의 일부인 것으로 의도된다. 또한, 임의의 상기 언급된 값의 조합을 상한치 및/또는 하한치로서 사용하는 값의 범위가 포함되는 것으로 의도된다.
본 발명의 약학적 조성물은 물리적으로 그리고 화학적으로 안정하다.
본원에서 사용되는 용어 "안정한"은 이의 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 본질적으로 유지하는 약학적 조성물 및/또는 그러한 약학적 조성물에서 dsRNA 작용제를 지칭한다. 조성물 및 조성물에서 dsRNA 작용제의 안정성을 측정하기 위한 다양한 분석 기술은 당업계에서 입수 가능하며, 본원에 기재되어 있다.
약학적 조성물(또는 그러한 조성물에서 dsRNA 작용제)은, 예를 들어, 색 및/또는 투명성의 육안 검사 또는 UV 검사 시, 또는, 예를 들어, HPLC 분석, 예를 들어, 변성 IP RP-HPLC, 비-변성 IP RP-HPLC, 및/또는 변성 AX-HPLC 분석에 의해 측정하는 경우 증가된 불순물의 징후를 실질적으로 나타내지 않는 경우 "이의 물리적 안정성을 유지한다".
dsRNA 작용제는 주어진 시간의 화학적 안정성에 의해 dsRNA 작용제가 이의 생물학적 활성을 여전히 유지한 것으로 간주되는 경우 약학적 조성물에서 "이의 화학적 안정성을 유지한다". 화학적 안정성은, 예를 들어, dsRNA 듀플렉스의 화학적으로 변경된 형태 및/또는 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 화학적으로 변경된 형태를 검출하고/검출하거나 정량화함으로써 평가될 수 있다. 화학적 변경은, 예를 들어, 듀플렉스 체류 시간, 및/또는, 예를 들어, 비-변성 IP RP-HPLC를 사용하여 듀플렉스를 형성하는 단일 가닥의 분자량의 확인, 예를 들어, 열적 UV 분광광도계를 사용하여 용융 온도에 의한 확인, 및/또는, 예를 들어, 화염 원자 흡수(화염 AAS)/유도 결합 플라즈마 광 방출 분광기(OCP-OES)를 사용하여 나트륨 함량(무수 기준)에 의해 평가될 수 있는 크기 변경 및/또는 나트륨 함량 변경을 포함할 수 있다.
dsRNA 작용제는 조성물에서 dsRNA 작용제가 이의 의도된 목적으로 생물학적으로 활성인 경우 약학적 조성물에서 "이의 생물학적 활성을 유지한다". 예를 들어, 생물학적 활성은 조성물에서 dsRNA 작용제의 생물학적 활성이 조성물이 제조된 시점에 나타낸 생물학적 활성(예를 들어, 시험관내 RT-PCR 검정에 의해 결정하는 경우)의 약 30%, 약 20%, 또는 약 10% 이내(검정의 오차 이내)인 경우 유지된다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약 2℃ 내지 약 8℃에서 저장될 때 약 6개월 내지 약 36개월 동안 안정하다. 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약 25℃ 및 60% 상대 습도(RH)에서 저장될 때 약 6개월 내지 약 36개월 동안 안정하다. 추가의 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약 40℃ 및 75% 상대 습도(RH)에서 저장될 때 약 6개월 동안 안정하다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약 2℃ 내지 약 8℃에서 저장될 때 약 36개월까지 안정하다. 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약 25℃ 및 60% 상대 습도(RH)에서 저장될 때 약 36개월까지 안정하다. 추가의 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약 40℃ 및 75% 상대 습도(RH)에서 저장될 때 약 6개월까지 안정하다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 순도 비-변성 IPRP-HPLC에 의해 결정하는 경우 약 95.0 면적% 이상(NLT)의 듀플렉스 및 약 5 면적% 이하(NMT)의 총 듀플렉스 불순물을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 순도 변성 AX-HPLC에 의해 결정하는 경우 약 85.0 면적% 이상(NLT)의 총 단일 가닥을 포함한다. 추가의 또 다른 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 순도 변성 IPRP-HPLC에 의해 결정하는 경우 약 80.0 면적% 이상(NLT)의 총 단일 가닥을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 Serpinc1 유전자의 발현을 억제하기 위한 약학적 조성물을 제공한다. 약학적 조성물은 약 50 mg/mL 내지 약 200 mg/mL 농도의 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제 및 약 1 mM 내지 약 10 mM 농도의 인산염 완충 염수(PBS)를 포함하고, 여기서 약학적 조성물의 pH 및 오스몰농도는 대상체에게 피하 투여하기에 적합하고, dsRNA 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 안티센스 가닥은 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3'(SEQ ID NO: 15)의 뉴클레오티드 서열로부터 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 Serpinc1을 인코딩하는 mRNA에 상보적인 영역을 포함하고, 센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드 및 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드이고, 센스 가닥은 3'-말단에 부착된 리간드에 컨쥬게이트되고, dsRNA 작용제는 유리산 형태이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 Serpinc1 유전자의 발현을 억제하기 위한 약학적 조성물을 제공한다. 약학적 조성물은 약 50 mg/mL 내지 약 200 mg/mL 농도의 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제 및 약 1 mM 내지 약 10 mM 농도의 인산염 완충 염수(PBS)를 포함하고, 여기서 약학적 조성물의 pH 및 오스몰농도는 대상체에게 피하 투여하기에 적합하고, dsRNA 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 안티센스 가닥은 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3'(SEQ ID NO: 15)의 뉴클레오티드 서열로부터 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 Serpinc1을 인코딩하는 mRNA에 상보적인 영역을 포함하고, 센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드 및 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드이고, 센스 가닥은 3'-말단에 부착된 리간드에 컨쥬게이트되고, dsRNA 작용제는 염 형태이다.
일 구현예에서, 센스 가닥의 모든 뉴클레오티드 및 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드이다.
일 구현예에서, 변형 뉴클레오티드는 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 변형 뉴클레오티드, 2'-데옥시-변형 뉴클레오티드, 잠금 뉴클레오티드, 무염기 뉴클레오티드, 2'-아미노-변형 뉴클레오티드, 2'-알킬-변형 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포르아미데이트, 및 비-자연 염기 포함 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상보성 영역은 적어도 17개 뉴클레오티드 길이 또는 19개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
일 구현예에서, 상보성 영역은 19개 내지 21개 뉴클레오티드 길이이다. 또 다른 구현예에서, 상보성 영역은 21개 내지 23개 뉴클레오티드 길이이다.
일 구현예에서, 각 가닥은 30개 이하의 뉴클레오티드 길이이다.
이중 가닥 RNAi 작용제의 적어도 하나의 가닥은 적어도 1개의 뉴클레오티드의 3' 오버행 또는 적어도 2개의 뉴클레오티드, 예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 또는 15개의 뉴클레오티드의 3' 오버행을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, RNAi 작용제의 적어도 하나의 가닥은 적어도 1개의 뉴클레오티드의 5' 오버행을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 2개의 뉴클레오티드, 예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 또는 15개의 뉴클레오티드의 5' 오버행을 포함한다. 추가의 다른 구현예에서, RNAi 작용제의 하나의 가닥의 3' 말단과 5' 말단 둘 모두는 적어도 1개의 뉴클레오티드의 오버행을 포함한다.
특정 구현예에서, 리간드는 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)이다. 리간드는 1가, 2가, 또는 3가 분지 링커를 통해 RNAi 작용제에 부착된 하나 이상의 GalNAc일 수 있다. 리간드는 이중 가닥 RNAi 작용제의 센스 가닥의 3' 말단, 이중 가닥 RNAi 작용제의 센스 가닥의 5' 말단, 이중 가닥 RNAi 작용제의 안티센스 가닥의 3' 말단, 또는 이중 가닥 RNAi 작용제의 안티센스 가닥의 5' 말단에 컨쥬게이트될 수 있다.
일부 구현예에서, 이중 가닥 RNAi 작용제는, 각각 독립적으로 복수의 1가 링커를 통해 이중 가닥 RNAi 작용제의 복수의 뉴클레오티드에 부착된 복수의, 예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 GalNAc를 포함한다.
특정 구현예에서, 리간드는
Figure pct00022
이다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 링커를 통해 리간드에 컨쥬게이트되고, 리간드 및 링커는 하기의 도식에 나타낸 바와 같이 RNAi 작용제에 컨쥬게이트된다:
Figure pct00023
(상기 식에서, X는 O 또는 S임).
일 구현예에서, X는 O이다.
일 구현예에서, 상보성 영역은 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3'(SEQ ID NO: 15)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
일 구현예에서, 이중 가닥 RNAi 작용제는 5'-GGUUAACACCAUUUACUUCAA-3'(SEQ ID NO: 16)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 센스 가닥, 및 5'-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3'(SEQ ID NO: 15)의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:13)를 포함하고, 안티센스 가닥은 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasG-3'(SEQ ID NO:14)를 포함하고, 여기서 a, c, g, 및 u는 2'-O-메틸(2'-OMe) A, C, G, 또는 U이고; Af, Cf, Gf 또는 Uf는 2'-플루오로 A, C, G 또는 U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이다.
일 구현예에서, 센스 가닥은 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:13)를 포함하고, 안티센스 가닥은 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasG-3'(SEQ ID NO:14)를 포함하고, 여기서 a, c, g, 및 u는 2'-O-메틸(2'-OMe) A, C, G, 또는 U이고; Af, Cf, Gf 또는 Uf는 2'-플루오로 A, C, G 또는 U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고; 센스 가닥은 링커를 통해 리간드에 컨쥬게이트되고, 리간드 및 링커는 하기의 도식에 나타낸 바와 같이 RNAi 작용제에 컨쥬게이트된다:
Figure pct00024
(상기 식에서, X는 O 또는 S임).
일 양태에서, 본 발명은 Serpinc1 유전자의 발현을 억제하기 위한 약학적 조성물을 제공한다. 약학적 조성물은 약 50 mg/mL 내지 약 200 mg/mL 농도의 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제 및 약 1 mM 내지 약 10 mM 농도의 인산염 완충 염수(PBS)를 포함하고, 여기서 약학적 조성물의 pH 및 오스몰농도는 대상체에게 피하 투여하기에 적합하고, dsRNA 작용제는 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 센스 가닥 및 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasG-3'(SEQ ID NO:960)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 안티센스 가닥을 갖고, a, g, c, 및 u는 2'-O-메틸(2'-OMe) A, G, C, 및 U이고; Af, Gf, Cf, 및 Uf는 2'-플루오로 A, G, C, U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고, 리간드는 링커를 통해 센스 가닥의 3' 말단에 컨쥬게이트되고, 리간드 및 링커는 하기 구조
Figure pct00025
를 갖고, dsRNA 작용제는 유리산 형태이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 Serpinc1 유전자의 발현을 억제하기 위한 약학적 조성물을 제공한다. 약학적 조성물은 약 50 mg/mL 내지 약 200 mg/mL 농도의 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제 및 약 1 mM 내지 약 10 mM 농도의 인산염 완충 염수(PBS)를 포함하고, 약학적 조성물의 pH 및 오스몰농도는 대상체에게 피하 투여하기에 적합하고, dsRNA 작용제는 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 센스 가닥 및 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasG-3'(SEQ ID NO:960)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 안티센스 가닥을 갖고, a, g, c, 및 u는 2'-O-메틸(2'-OMe) A, G, C, 및 U이고; Af, Gf, Cf, 및 Uf는 2'-플루오로 A, G, C, U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고, 리간드는 링커를 통해 센스 가닥의 3' 말단에 컨쥬게이트되고, 리간드 및 링커는 하기 구조
Figure pct00026
를 갖고, dsRNA 작용제는 염 형태이다.
일 양태에서, 본 발명은 Serpinc1 유전자의 발현을 억제하기 위한 약학적 조성물을 제공한다. 조성물은 약 100 mg/mL 농도의 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제 및 약 5 mM 농도의 인산염 완충 염수(PBS)를 포함하고, 여기서 약학적 조성물의 pH는 약 6.8 내지 약 7.2이고, 약학적 조성물의 오스몰농도는 약 300 mOsm/kg이고, dsRNA 작용제는 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 센스 가닥 및 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasG-3'(SEQ ID NO:960)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 안티센스 가닥을 갖고, a, g, c, 및 u는 2'-O-메틸(2'-OMe) A, G, C, 및 U이고; Af, Gf, Cf, 및 Uf는 2'-플루오로 A, G, C, U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고, 리간드는 링커를 통해 센스 가닥의 3' 말단에 컨쥬게이트되고, 리간드 및 링커는 하기 구조
Figure pct00027
를 갖고, dsRNA 작용제는 유리산 형태이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 Serpinc1 유전자의 발현을 억제하기 위한 약학적 조성물을 제공한다. 약학적 조성물은 약 106 mg/mL 농도의 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제 및 약 5 mM 농도의 인산염 완충 염수(PBS)를 포함하고, 여기서 약학적 조성물의 pH는 약 6.8 내지 약 7.2이고, 약학적 조성물의 오스몰농도는 약 300 mOsm/kg이고, dsRNA 작용제는 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 센스 가닥 및 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasG-3'(SEQ ID NO:960)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 안티센스 가닥을 갖고, a, g, c, 및 u는 2'-O-메틸(2'-OMe) A, G, C, 및 U이고; Af, Gf, Cf, 및 Uf는 2'-플루오로 A, G, C, U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고, 리간드는 링커를 통해 센스 가닥의 3' 말단에 컨쥬게이트되고, 리간드 및 링커는 하기 구조
Figure pct00028
를 갖고, dsRNA 작용제는 염 형태이다.
본 발명의 조성물은 당 분야에서 확립된 사용 수준으로 약학적 조성물에서 통상적으로 발견되는 다른 보조 성분을 추가로 함유할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 조성물은 추가의 상용성인 약학적으로 활성인 물질, 예를 들어, 항소양제, 수렴제, 국소 마취제 또는 항염증제를 함유할 수 있거나, 본 발명의 조성물의 다양한 투여 형태를 물리적으로 제형화시키는 데 유용한 추가 물질, 예를 들어, 염료, 착향제, 보존제, 항산화제, 유백제, 증점제 및 안정화제를 함유할 수 있다. 그러나, 상기 물질은 첨가되는 경우 본 발명의 조성물의 성분의 생물학적 활성을 과도하게 방해하지 않아야 한다. 상기 제형은 멸균될 수 있고, 요망시, 제형의 핵산(들)과 유해하게 상호작용하지 않는 보조제, 예를 들어, 윤활제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 미치는 염, 완충제, 착색제, 착향제 및/또는 방향성 물질 등과 혼합될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명에서 특성화된 약학적 조성물은 (a) 하나 이상의 iRNA 화합물 및 (b) 비-RNAi 메커니즘에 의해 작용하며, 출혈성 장애를 치료하는 데 유용한 하나 이상의 작용제를 포함한다. 상기 작용제의 예는 항염증제, 지방증 방지제(anti-steatosis agent), 항바이러스제 및/또는 항섬유증제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는. 또한, 간을 보호하기 위해 통상적으로 사용되는 다른 물질, 예를 들어, 실리마린(silymarin)도 또한 본원에 기재된 iRNA와 함께 사용될 수 있다. 간 질병을 치료하는 데 유용한 다른 작용제에는 텔비부딘(telbivudine), 엔테카비르(entecavir) 및 프로테아제 억제제, 예를 들어, 텔라프레비르(telaprevir) 및 예를 들어, 미국 출원 공개 제2005/0148548호, 제2004/0167116호 및 제2003/0144217호(Tung et al.); 및 미국 출원 공개 제2004/0127488호(Hale et al.)에 개시된 다른 것들이 포함된다.
상기 화합물의 독성 및 치료 효능은, 예를 들어, LD50(집단의 50%에 치사성인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위해 세포 배양물 또는 실험 동물에서의 표준 약학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량 비는 치료 지수이고, 이는 LD50/ED50 비로 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다.
III. 본 발명의 약학적 조성물에 사용하기 위한 iRNA
본 발명의 조성물은 Serpinc1 유전자를 표적으로 하고, 세포, 예를 들어, 대상체, 예를 들어, 포유동물, 예컨대, Serpinc1-관련 장애, 예를 들어, 출혈성 장애, 예를 들어, 혈우병을 갖는 인간 내의 세포의 발현을 억제하는 RNAi 작용제를 포함한다.
본원에 사용되는 "표적 서열"은 일차 전사 산물의 RNA 가공의 산물인 mRNA를 포함하는, Serpinc1 유전자의 전사 동안 형성되는 mRNA 분자의 뉴클레오티드 서열의 연속 부분을 지칭한다. 일 구현예에서, 서열의 표적 부분은 적어도, Serpinc1 유전자의 전사 동안 형성되는 mRNA 분자의 뉴클레오티드 서열의 그 부분에서 또는 그 근처에서, 적어도 iRNA-유도 절단을 위한 기질로서 소용되기에 충분히 길 것이다.
표적 서열은 약 9개 내지 36개 뉴클레오티드 길이, 예를 들어, 약 15개 내지 30개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 예를 들어, 표적 서열은 약 15개 내지 30개 뉴클레오티드, 15개 내지 29개, 15개 내지 28개, 15개 내지 27개, 15개 내지 26개, 15개 내지 25개, 15개 내지 24개, 15개 내지 23개, 15개 내지 22개, 15개 내지 21개, 15개 내지 20개, 15개 내지 19개, 15개 내지 18개, 15개 내지 17개, 18개 내지 30개, 18개 내지 29개, 18개 내지 28개, 18개 내지 27개, 18개 내지 26개, 18개 내지 25개, 18개 내지 24개, 18개 내지 23개, 18개 내지 22개, 18개 내지 21개, 18개 내지 20개, 19개 내지 30개, 19개 내지 29개, 19개 내지 28개, 19개 내지 27개, 19개 내지 26개, 19개 내지 25개, 19개 내지 24개, 19개 내지 23개, 19개 내지 22개, 19개 내지 21개, 19개 내지 20개, 20개 내지 30개, 20개 내지 29개, 20개 내지 28개, 20개 내지 27개, 20개 내지 26개, 20개 내지 25개, 20개 내지 24개, 20개 내지 23개, 20개 내지 22개, 20개 내지 21개, 21개 내지 30개, 21개 내지 29개, 21개 내지 28개, 21개 내지 27개, 21개 내지 26개, 21개 내지 25개, 21개 내지 24개, 21개 내지 23개 또는 21개 내지 22개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 상기 언급된 범위 및 길이의 중간의 범위 및 길이도 또한 본 발명의 일부인 것으로 고려된다.
본원에 사용되는 용어 "서열을 포함하는 가닥"은 표준 뉴클레오티드 명명법을 사용하여 언급된 서열로 기술되는 뉴클레오티드의 사슬을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
각각의 "G", "C", "A", "T" 및 "U"는 일반적으로 각각 염기로서 구아닌, 시토신, 아데닌, 티미딘 및 우라실을 함유하는 뉴클레오티드를 나타낸다. 그러나, 용어 "리보뉴클레오티드", 또는 "뉴클레오티드"는 또한 하기에서 더 상세히 다루어질 변형 뉴클레오티드 또는 대용 대체 모이어티(moiety)를 지칭할 수 있다는 것이 이해될 것이다(예를 들어, 표 1 참조). 당업자는 구아닌, 시토신, 아데닌 및 우라실이 이러한 대체 모이어티를 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 염기쌍 형성 특성을 실질적으로 변경하지 않으면서 다른 모이어티로 대체될 수 있다는 것을 잘 인지하고 있다. 비제한적으로, 예를 들어, 그의 염기로서 이노신을 포함하는 뉴클레오티드는 아데닌, 시토신 또는 우라실을 함유하는 뉴클레오티드와 염기쌍을 형성할 수 있다. 따라서, 본 발명에서 특성화된 dsRNA의 뉴클레오티드 서열에서 우라실, 구아닌 또는 아데닌을 함유하는 뉴클레오티드는 예를 들어 이노신을 함유하는 뉴클레오티드에 의해 대체될 수 있다. 또 다른 예에서, 올리고뉴클레오티드 내 모든 영역의 아데닌 및 시토신은 각각 구아닌 및 우라실로 대체되어, 표적 mRNA와 G-U 동요(Wobble) 염기쌍을 형성할 수 있다. 이러한 대체 모이어티를 함유하는 서열은 본 발명에 특성화된 조성물 및 방법에 적합하다.
본원에 상호교환 가능하게 사용되는 용어 "iRNA", "RNAi 작용제", "iRNA 작용제", "RNA 간섭 작용제"는 그 용어가 본원에 정의된 바와 같은 RNA를 함유하며, RNA-유도 침묵화 복합체(RISC) 경로를 통한 RNA 전사물의 표적화된 절단을 매개하는 작용제를 지칭한다. iRNA는 RNA 간섭(RNAi)으로 공지된 과정을 통하여 mRNA의 서열-특이적 분해를 유도한다. iRNA는 세포, 예를 들어, 포유동물 대상체와 같은 대상체 내의 세포에서의 Serpinc1의 발현을 조절, 예를 들어, 억제한다.
일 구현예에서, 본 발명의 RNAi 작용제는 표적 RNA 서열, 예를 들어, Serpinc1 표적 mRNA 서열과 상호작용하여, 표적 RNA의 절단을 유도하는 단일 가닥 RNA를 포함한다. 이론으로 국한시키려는 것은 아니지만, 세포로 도입된 긴 이중 가닥 RNA는 Dicer로 공지되어 있는 III형 엔도뉴클레아제에 의해 siRNA로 분해되는 것으로 여겨진다(문헌[Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485]). Dicer, 리보뉴클레아제-III-유사 효소는 dsRNA를 특징적인 2개 염기 3' 오버행을 갖는 19 내지 23개 염기쌍의 짧은 간섭 RNA로 가공한다(문헌[Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363]). 그 다음, siRNA는 RNA-유도 침묵화 복합체(RISC)로 통합되고, 여기서, 하나 이상의 헬리카제(helicase)는 siRNA 듀플렉스를 풀어 내어, 상보적 안티센스 가닥이 표적 인지를 안내하게 한다(문헌[Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309]). RISC 내의 하나 이상의 엔도뉴클레아제는 적절한 표적 mRNA로의 결합 시에, 표적을 분해하여, 침묵화를 유도한다(문헌[Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188]). 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 세포 내에 생성되며, RISC 복합체의 형성을 조장하여, 표적 유전자, 즉, Serpinc1 유전자의 침묵화를 초래하는 단일 가닥의 RNA(siRNA)에 관한 것이다. 따라서, 용어 "siRNA"는 또한, 상술된 바와 같은 RNAi를 지칭하기 위해 본원에 사용된다.
또 다른 구현예에서, RNAi 작용제는 세포 또는 유기체로 도입되어, 표적 mRNA를 억제하는 단일-가닥 siRNA일 수 있다. 단일-가닥 RNAi 작용제는 RISC 엔도뉴클레아제, 아르고너트 2에 결합하고, 이는 이후 표적 mRNAfmf 절단한다. 단일-가닥 siRNA는 일반적으로 15개 내지 30개 뉴클레오티드이며, 화학적으로 변형된다. 단일-가닥 siRNA의 설계 및 시험은 미국 특허 제8,101,348호 및 문헌[Lima et al., (2012) Cell 150: 883-894]에 기재되어 있으며, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 임의의 본원에 기재된 안티센스 뉴클레오티드 서열은 본원에 기재된 바와 같은 단일-가닥 siRNA로서 사용되거나, 문헌[Lima et al., (2012) Cell 150;:883-894]에 기재된 방법에 의해 화학적으로 변형될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물, 용도 및 방법에 사용하기 위한 "iRNA"는 이중 가닥 RNA이며, "이중 가닥 RNAi 작용제", "이중-가닥 RNA(dsRNA) 분자", "dsRNA 작용제" 또는 "dsRNA"로 본원에 지칭된다. 용어 "dsRNA"는 표적 RNA, 즉, Serpinc1 유전자에 대하여 "센스" 및 "안티센스" 배향을 갖는 것으로 언급되는 2개의 역평행이며, 실질적으로 상보성인 핵산 가닥을 포함하는 듀플렉스 구조를 갖는 리보핵산 분자의 복합체를 지칭한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 이중 가닥 RNA(dsRNA)는 RNA 간섭 또는 RNAi로 본원에 지칭되는 전사후 유전자-침묵화 메카니즘을 통하여 표적 RNA, 예를 들어, mRNA의 분해를 촉발시킨다.
일반적으로, dsRNA 분자의 각 가닥의 대다수의 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드이지만, 본원에 상세히 기술된 바와 같이, 각각의 또는 둘 모두의 가닥은 또한 하나 이상의 비-리보뉴클레오티드, 예를 들어, 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 "RNAi 작용제"는 화학적 변형이 있는 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있고; RNAi 작용제는 다중 뉴클레오티드에 상당한 변형을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "변형된 뉴클레오티드"는, 독립적으로, 변형된 당 모이어티, 변형된 뉴클레오티드간 결합, 및/또는 변형된 핵염기를 갖는 뉴클레오티드를 지칭한다. 따라서, 용어 변형된 뉴클레오티드는 뉴클레오시드간 결합, 당 모이어티, 또는 핵염기에 대한, 예를 들어, 작용기 또는 원자의 치환, 첨가 또는 제거를 포괄한다. 본 발명의 작용제에 사용하기에 적합한 변형은 본원에 개시되거나 당분야에 공지된 모든 유형의 변형을 포함한다. siRNA 유형 분자에서 사용되는 임의의 이러한 변형은 본 명세서 및 청구항의 목적 상 "RNAi 작용제"에 의해 포괄된다.
듀플렉스 영역은 RISC 경로를 통하여 요망되는 표적 RNA의 특이적 분해를 허용하는 임의의 길이의 것일 수 있으며, 약 9개 내지 36개 염기쌍 길이의 범위, 예를 들어, 약 15개 내지 30개 염기쌍 길이, 예를 들어, 약 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 또는 36개 염기쌍 길이, 예컨대, 약 15개 내지 30개, 15개 내지 29개, 15개 내지 28개, 15개 내지 27개, 15개 내지 26개, 15개 내지 25개, 15개 내지 24개, 15개 내지 23개, 15개 내지 22개, 15개 내지 21개, 15개 내지 20개, 15개 내지 19개, 15개 내지 18개, 15개 내지 17개, 18개 내지 30개, 18개 내지 29개, 18개 내지 28개, 18개 내지 27개, 18개 내지 26개, 18개 내지 25개, 18개 내지 24개, 18개 내지 23개, 18개 내지 22개, 18개 내지 21개, 18개 내지 20개, 19개 내지 30개, 19개 내지 29개, 19개 내지 28개, 19개 내지 27개, 19개 내지 26개, 19개 내지 25개, 19개 내지 24개, 19개 내지 23개, 19개 내지 22개, 19개 내지 21개, 19개 내지 20개, 20개 내지 30개, 20개 내지 29개, 20개 내지 28개, 20개 내지 27개, 20개 내지 26개, 20개 내지 25개, 20개 내지 24개, 20개 내지 23개, 20개 내지 22개, 20개 내지 21개, 21개 내지 30개, 21개 내지 29개, 21개 내지 28개, 21개 내지 27개, 21개 내지 26개, 21개 내지 25개, 21개 내지 24개, 21개 내지 23개, 또는 21개 내지 22개 염기쌍 길이의 범위일 수 있다. 상기 언급된 범위 및 길이의 중간의 범위 및 길이가 또한 본 발명의 일부인 것으로 고려된다.
듀플렉스 구조를 형성하는 두 가닥은 하나의 보다 더 큰 RNA 분자의 상이한 부분일 수 있거나, 그들은 개별 RNA 분자일 수 있다. 두 가닥이 하나의 더 큰 분자의 일부이고 이에 따라 한 가닥의 3'-말단과 다른 가닥의 5'-말단 간의 뉴클레오티드의 비단절(uninterrupted) 사슬에 의해 연결되어 듀플렉스 구조를 형성하는 경우, 연결 RNA 사슬은 "헤어핀 루프"로 지칭된다. 헤어핀 루프는 쌍을 형성하지 않은 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 헤어핀 루프는 쌍을 형성하지 않은 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 23개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
dsRNA의 2개의 실질적으로 상보적인 가닥이 개별 RNA 분자에 포함되는 경우, 그들 분자는 공유 결합될 필요는 없지만, 공유 결합될 수 있다. 두 가닥이 한 가닥의 3'-말단과 각각의 다른 가닥의 5'-말단 간의 뉴클레오티드의 비단절 사슬 이외의 수단에 의해 공유 결합되어, 듀플렉스 구조를 형성하는 경우, 그 연결 구조는 "링커"로 지칭된다. RNA 가닥은 동일하거나 상이한 수의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 최대 염기쌍 개수는 dsRNA의 가장 짧은 가닥 내 뉴클레오티드의 수에서 듀플렉스에 존재하는 임의의 오버행을 뺀 수이다. RNAi는 듀플렉스 구조에 더하여, 하나 이상의 뉴클레오티드 오버행을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 RNAi 작용제는 표적 RNA 서열, 예를 들어, Serpinc1 표적 mRNA 서열과 상호작용하여, 표적 RNA의 절단을 유도하는 24 개 내지 30개 뉴클레오티드이다. 이론으로 국한시키려는 것은 아니지만, 세포로 도입된 긴 이중 가닥 RNA는 Dicer로 공지되어 있는 III형 엔도뉴클레아제에 의해 siRNA로 분해된다(문헌[Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485]). Dicer, 리보뉴클레아제-III-유사 효소는 dsRNA를 특징적인 2개 염기 3' 오버행을 갖는 19개 내지 23개 염기쌍의 짧은 간섭 RNA로 가공한다(문헌[Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363]). 그 다음, siRNA는 RNA-유도 침묵화 복합체(RISC)로 통합되고, 여기서, 하나 이상의 헬리카제(helicase)는 siRNA 듀플렉스를 풀어 내어, 상보적 안티센스 가닥이 표적 인지를 안내하게 한다(문헌[Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309]). RISC 내의 하나 이상의 엔도뉴클레아제는 적절한 표적 mRNA로의 결합 시에, 표적을 분해하여, 침묵화를 유도한다(문헌[Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188]).
본원에서 사용되는 용어 "뉴클레오티드 오버행"은 iRNA, 예를 들어, dsRNA의 듀플렉스 구조로부터 돌출하는 적어도 하나의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오티드를 지칭한다. 예를 들어, dsRNA의 한 가닥의 3'-말단이 다른 가닥의 5'-말단을 넘어서서 연장되는 경우 또는 반대의 경우에, 뉴클레오티드 오버행이 존재한다. dsRNA는 적어도 하나의 뉴클레오티드의 오버행을 포함할 수 있으며; 대안적으로 오버행은 적어도 2개의 뉴클레오티드, 적어도 3개의 뉴클레오티드, 적어도 4개의 뉴클레오티드, 적어도 5개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 오버행은 데옥시뉴클레오티드/뉴클레오시드를 포함하는 뉴클레오티드/뉴클레오시드 유사체를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 오버행(들)은 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 임의의 이들의 조합에 존재할 수 있다. 또한, 오버행의 뉴클레오티드(들)는 dsRNA의 안티센스 또는 센스 가닥 중 어느 하나의 5'-말단, 3'-말단 또는 양 말단에 존재할 수 있다.
일 구현예에서, dsRNA의 안티센스 가닥은 3'-말단 및/또는 5'-말단에서 1개 내지 10개 뉴클레오티드, 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 뉴클레오티드의 오버행을 갖는다. 일 구현예에서, dsRNA의 센스 가닥은 3'-말단 및/또는 5'-말단에서 1개 내지 10개 뉴클레오티드, 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 뉴클레오티드의 오버행을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 오버행 내의 하나 이상의 뉴클레오티드는 뉴클레오시드 티오포스페이트로 대체된다.
특정 구현예에서, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥, 또는 이 둘 모두 상의 오버행은 10개 이상의 연장된 뉴클레오티드 길이, 예를 들어, 10개 내지 30개의 뉴클레오티드, 10개 내지 25개의 뉴클레오티드, 10개 내지 20개의 뉴클레오티드 또는 10개 내지 15개의 뉴클레오티드 길이를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 센스 가닥 상에 존재한다. 특정 구현예에서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 센스 가닥의 3' 말단 상에 존재한다. 특정 구현예에서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 센스 가닥의 5' 말단 상에 존재한다. 특정 구현예에서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 안티센스 가닥 상에 존재한다. 특정 구현예에서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 안티센스 가닥의 3' 말단 상에 존재한다. 특정 구현예에서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 안티센스 가닥의 5' 말단 상에 존재한다. 특정 구현예에서, 연장된 오버행에서 하나 이상의 뉴클레오티드는 뉴클레오시드 티오포스페이트로 대체된다.
"블런트" 또는 "블런트 말단"은 이중 가닥 RNAi 작용제의 말단에 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오티드가 존재하지 않음, 즉, 뉴클레오티드 오버행이 존재하지 않음을 의미한다. "블런트 말단" RNAi 작용제는 이의 전체 길이에 걸쳐 이중 가닥인, 즉, 분자 중 어느 하나의 말단에 뉴클레오티드 오버행이 없는 dsRNA이다. 본 발명의 RNAi 작용제는 하나의 말단에 뉴클레오티드 오버행을 갖는 RNAi 작용제(즉, 하나의 오버행 및 하나의 블런트 말단을 갖는 작용제) 또는 양 말단에 뉴클레오티드 오버행을 갖는 RNAi 작용제를 포함한다.
용어 "안티센스 가닥" 또는 "가이드(guide) 가닥"은 표적 서열, 예를 들어, Serpinc1 mRNA에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 iRNA, 예를 들어, dsRNA의 가닥을 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "상보성 영역"은 서열, 예를 들어, 표적 서열, 예를 들어, 본원에 정의된 바와 같은 Serpinc1 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 안티센스 가닥 상의 영역을 지칭한다. 상보성 영역이 표적 서열에 완전히 상보적이지 않은 경우, 미스매치(mismatch)가 분자의 내부 또는 말단 영역에 존재할 수 있다. 일반적으로, 대부분의 허용되는 미스매치는 iRNA의 말단 영역, 예를 들어, 5'- 및/또는 3'-말단의 5개, 4개, 3개 또는 2개 뉴클레오티드 내에 존재한다.
본원에서 사용되는 용어 "센스 가닥" 또는 "패신저(passenger) 가닥"은 그 용어가 본원에 정의된 바와 같은 안티센스 가닥의 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 iRNA의 가닥을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "절단 영역"은 절단 부위에 바로 인접하여 위치된 영역을 지칭한다. 절단 영역은 절단이 발생하는 표적 상의 부위이다. 일부 구현예에서, 절단 영역은 절단 부위의 어느 한 말단에, 그리고 이에 바로 인접한 세 개의 염기를 포함한다. 일부 구현예에서, 절단 영역은 절단 부위의 어느 한 말단에, 그리고 이에 바로 인접하여 두 개의 염기를 포함한다. 일부 구현예에서, 절단 부위는 안티센스 가닥의 10번 및 11번 뉴클레오티드에 의해 결합된 부위에서 특이적으로 발생하며, 절단 영역은 11번, 12번 및 13번 뉴클레오티드를 포함한다.
본원에서 사용되며 달리 나타내지 않는 한, 용어 "상보적인"은 제2 뉴클레오티드 서열에 대한 제1 뉴클레오티드 서열을 설명하기 위해 사용되는 경우에, 당업자에게 이해될 바와 같이, 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 특정 조건 하에서 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 혼성화하여 듀플렉스 구조를 형성하는 능력을 지칭한다. 이러한 조건은, 예를 들어 엄격한 조건일 수 있으며, 여기서, 엄격한 조건은 다음을 포함할 수 있다: 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA로 50℃ 또는 70℃에서 12 내지 16시간 처리 후 세척(예를 들어, 문헌["Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press] 참조). 유기체 내에서 겪을 수 있는 생리학적으로 적절한 조건과 같은 다른 조건도 적용할 수 있다. 당업자는 혼성화된 뉴클레오티드의 궁극적인 응용에 따라 두 서열의 상보성 시험에 가장 적절한 조건 세트를 결정할 수 있을 것이다.
iRNA 내의, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 dsRNA 내의 상보성 서열은 하나의 또는 둘 모두의 뉴클레오티드 서열의 전장에 걸쳐 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드에 대한 염기쌍 형성을 포함한다. 이러한 서열은 본원에서 서로에 대해 "완전 상보적인" 것으로 지칭될 수 있다. 그러나, 제1 서열이 본원에서 제2 서열에 대해 "실질적으로 상보적인" 것으로 지칭되는 경우, 두 서열은 완전히 상보적일 수도 있거나, 그들은 최대 30개의 염기쌍의 듀플렉스에 대하여, 혼성화 시에 1개 이상의, 그러나 일반적으로는 5개, 4개, 3개 또는 2개 이하의 미스매치 염기쌍을 형성하면서 그들의 궁극적 응용에 가장 적절한 조건 하에서 혼성화하는 능력, 예를 들어, RISC 경로를 통한 유전자 발현의 억제를 보유할 수 있다. 그러나, 2개의 올리고뉴클레오티드가 혼성화 시에 1개 이상의 단일 사슬 오버행을 형성하도록 설계되는 경우, 이러한 오버행은 상보성 결정에 관해 미스매치로 간주되어서는 안된다. 예를 들어, 21개 뉴클레오티드 길이인 하나의 올리고뉴클레오티드 및 23개 뉴클레오티드 길이인 또 다른 올리고뉴클레오티드를 포함하는 dsRNA에서, 더 긴 올리고뉴클레오티드가 더 짧은 올리고뉴클레오티드에 대해 완전히 상보적인 21개 뉴클레오티드 서열을 포함하는 경우, 본원에 기재된 목적을 위해 여전히 "완전히 상보적인" 것으로 지칭될 수 있다.
본원에 사용되는 "상보적인" 서열은 또한 그들의 혼성화 능력에 대한 상기 요건이 충족되는 한, 비-왓슨-크릭(Watson-Crick)형 염기쌍 및/또는 비자연 및 변형 뉴클레오티드로 형성되는 염기쌍을 포함하거나 이로 전부 형성될 수 있다. 이러한 비-왓슨-크릭형 염기쌍에는 G:U 유동 또는 후그스테인(Hoogstein) 염기쌍 형성이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 용어 "상보적인", "완전히 상보적인" 및 "실질적으로 상보적인"은 그들이 사용되는 문맥에서 이해될 바와 같이, dsRNA의 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이, 또는 iRNA 작용제의 안티센스 가닥과 표적 서열 사이의 염기 매칭에 대해 사용할 수 있다.
본원에서 사용되는 메신저 RNA(mRNA)의 "적어도 일부에 실질적으로 상보적인" 폴리뉴클레오티드는 대상 mRNA(예를 들어, Serpinc1을 인코딩하는 mRNA)의 연속 부분에 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 서열이 Serpinc1을 인코딩하는 mRNA의 비-단절 부분에 실질적으로 상보적이라면, Serpinc1 mRNA의 적어도 일부에 상보적이다.
따라서, 일부 구현예에서, 본원에 개시된 안티센스 가닥 폴리뉴클레오티드는 표적 Serpinc1 서열에 완전 상보적이다. 다른 구현예에서, 본원에 개시된 안티센스 가닥 폴리뉴클레오티드는 표적 Serpinc1 서열에 실질적으로 상보적이고, SEQ ID NO:1, 또는 SEQ ID NO:1의 단편의 뉴클레오티드 서열의 등가 영역에 이의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80% 상보적인, 예컨대, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 상보적인 연속 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 RNAi 작용제는, 이후 표적 Serpinc1 서열에 상보적일 안티센스 폴리뉴클레오티드에 실질적으로 상보적인 센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:5, 또는 SEQ ID NO:5 중 어느 하나의 단편의 뉴클레오티드 서열의 등가 영역에 이의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80% 상보적인, 예컨대, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 상보적인 연속 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
표적 유전자(즉, Serpinc1 유전자)의 발현을 생체내에서 억제할 수 있는 적합한 dsRNA 작용제는 화학적 변형을 포함한다. 본 발명의 특정 양태에서, 본 발명의 iRNA의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 변형된다. 본 발명의 다른 구현예에서, 본 발명의 iRNA의 모든 뉴클레오티드는 변형된다. "실질적으로 모든 뉴클레오티드가 변형되는" 본 발명의 iRNA는 전부는 아니지만 대부분 변형되고, 5개 이하, 4개, 3개, 2개, 또는 1개의 비변형 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 iRNA 작용제는 일반적으로 약 30개 이하의 뉴클레오티드 길이, 예를 들어, 15개 내지 30개, 15개 내지 29개, 15개 내지 28개, 15개 내지 27개, 15개 내지 26개, 15개 내지 25개, 15개 내지 24개, 15개 내지 23개, 15개 내지 22개, 15개 내지 21개, 15개 내지 20개, 15개 내지 19개, 15개 내지 18개, 15개 내지 17개, 18개 내지 30개, 18개 내지 29개, 18개 내지 28개, 18개 내지 27개, 18개 내지 26개, 18개 내지 25개, 18개 내지 24개, 18개 내지 23개, 18개 내지 22개, 18개 내지 21개, 18개 내지 20개, 19개 내지 30개, 19개 내지 29개, 19개 내지 28개, 19개 내지 27개, 19개 내지 26개, 19개 내지 25개, 19개 내지 24개, 19개 내지 23개, 19개 내지 22개, 19개 내지 21개, 19개 내지 20개, 20개 내지 30개, 20개 내지 29개, 20개 내지 28개, 20개 내지 27개, 20개 내지 26개, 20개 내지 25개, 20개 내지 24개, 20개 내지 23개, 20개 내지 22개, 20개 내지 21개, 21개 내지 30개, 21개 내지 29개, 21개 내지 28개, 21개 내지 27개, 21개 내지 26개, 21개 내지 25개, 21개 내지 24개, 21개 내지 23개, 또는 21개 내지 22개 뉴클레오티드 길이인 경역을 갖는 RNA 가닥(안티센스 가닥)을 포함하고, 이러한 영역은 Serpinc1 유전자의 mRNA 전사물의 적어도 일부에 실질적으로 상보적이다.
다른 구현예에서, 본 발명의 이중 가닥 RNAi 작용제의 가닥 중 하나 또는 둘 모두는 66개 이하의 뉴클레오티드 길이, 예를 들어, 36개 내지 66개, 26개 내지 36개, 25개 내지 36개, 31개 내지 60개, 22개 내지 43개, 27개 내지 53개 뉴클레오티드 길이이고, 적어도 19개의 연속 뉴클레오티드의 영역이 Serpinc1 유전자의 mRNA 전사물의 적어도 일부에 실질적으로 상보적이다. 일부 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥은 18개 내지 30개의 연속 뉴클레오티드의 듀플렉스를 형성한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 iRNA 작용제는 66개 이하의 뉴클레오티드 길이, 예를 들어, 36개 내지 66개, 26개 내지 36개, 25개 내지 36개, 31개 내지 60개, 22개 내지 43개, 27개 내지 53개 뉴클레오티드 길이일 수 있는 RNA 가닥(안티센스 가닥)을 포함하고, 적어도 19개의 연속 뉴클레오티드의 영역이 Serpinc1 유전자의 mRNA 전사물의 적어도 일부에 실질적으로 상보적이다. 일부 구현예에서, 더 긴 길이의 안티센스 가닥을 갖는 이러한 iRNA 작용제는 20개 내지 60개 뉴클레오티드 길이의 제2 RNA 가닥(센스 가닥)을 포함할 수 있고, 여기서 센스 및 안티센스 가닥은 18개 내지 30개의 연속 뉴클레오티드의 듀플렉스를 형성한다.
RNAi 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다. RNAi 작용제의 각 가닥은 12개 내지 30개 뉴클레오티드 길이의 범위일 수 있다. 예를 들어, 각 가닥은 14개 내지 30개 뉴클레오티드 길이, 17개 내지 30개 뉴클레오티드 길이, 19개 내지 30개 뉴클레오티드 길이, 25개 내지 30개 뉴클레오티드 길이, 27개 내지 30개 뉴클레오티드 길이, 17개 내지 23개 뉴클레오티드 길이, 17개 내지 21개 뉴클레오티드 길이, 17개 내지 19개 뉴클레오티드 길이, 19개 내지 25개 뉴클레오티드 길이, 19개 내지 23개 뉴클레오티드 길이, 19개 내지 21개 뉴클레오티드 길이, 21개 내지 25개 뉴클레오티드 길이, 또는 21개 내지 23개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
센스 가닥 및 안티센스 가닥은 전형적으로 "RNAi 작용제"로도 본원에 지칭되는 듀플렉스 이중 가닥 RNA("dsRNA")를 형성한다. RNAi 작용제의 듀플렉스 영역은 12개 내지 30개 뉴클레오티드 쌍 길이일 수 있다. 예를 들어, 듀플렉스 영역은 14개 내지 30개 뉴클레오티드 쌍 길이, 17개 내지 30개 뉴클레오티드 쌍 길이, 27개 내지 30개 뉴클레오티드 쌍 길이, 17개 내지 23개 뉴클레오티드 쌍 길이, 17개 내지 21개 뉴클레오티드 쌍 길이, 17개 내지 19개 뉴클레오티드 쌍 길이, 19개 내지 25개 뉴클레오티드 쌍 길이, 19개 내지 23개 뉴클레오티드 쌍 길이, 19개 내지 21개 뉴클레오티드 쌍 길이, 21개 내지 25개 뉴클레오티드 쌍 길이, 또는 21개 내지 23개 뉴클레오티드 쌍 길이일 수 있다. 또 다른 예에서, 듀플렉스 영역은 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 및 27개 뉴클레오티드 길이로부터 선택된다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 하나 또는 둘 모두의 가닥의 3'-말단, 5'-말단, 또는 양 말단에 하나 이상의 오버행 영역 및/또는 캡핑 기를 함유할 수 있다. 오버행은 1개 내지 6개 뉴클레오티드 길이, 예를 들어, 2개 내지 6개 뉴클레오티드 길이, 1개 내지 5개 뉴클레오티드 길이, 2개 내지 5개 뉴클레오티드 길이, 1개 내지 4개 뉴클레오티드 길이, 2개 내지 4개 뉴클레오티드 길이, 1개 내지 3개 뉴클레오티드 길이, 2개 내지 3개 뉴클레오티드 길이, 또는 1개 내지 2개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 오버행은 하나의 가닥이 다른 것보다 길어서 생긴 결과일 수 있거나, 동일한 길이의 두 가닥이 엇갈려서 생긴 결과일 수 있다. 오버행은 표적 mRNA와 미스매치를 형성할 수 있거나, 이는 표적화되는 유전자 서열에 상보적일 수 있거나 또 다른 서열일 수 있다. 제1 가닥과 제2 가닥이 또한, 예를 들어, 헤어핀을 형성하는 추가 염기에 의해, 또는 다른 비-염기 링커에 의해 접합될 수 있다.
일 구현예에서, RNAi 작용제의 오버행 영역에서 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 2'-당 변형, 예컨대, 2-F, 2'-O-메틸, 티미딘(T), 2'-O-메톡시에틸-5-메틸우리딘(Teo), 2'-O-메톡시에틸아데노신(Aeo), 2'-O-메톡시에틸-5-메틸시티딘(m5Ceo), 및 임의의 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 변형 또는 비변형 뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들어, TT는 어느 한 가닥 상에 어느 한 말단에 대한 오버행 서열일 수 있다. 오버행은 표적 mRNA와 미스매치를 형성할 수 있거나, 이는 표적화되는 유전자 서열에 상보적일 수 있거나 또 다른 서열일 수 있다.
RNAi 작용제의 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 둘 모두의 가닥에서 5'- 또는 3'-오버행은 인산화될 수 있다. 일부 구현예에서, 오버행 영역(들)은 두 개의 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트를 갖는 두 개의 뉴클레오티드를 함유하고, 여기서 두 개의 뉴클레오티드는 동일하거나 상이할 수 있다. 일 구현예에서, 오버행은 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 둘 모두의 가닥의 3'-말단에 존재한다. 일 구현예에서, 이러한 3'-오버행은 안티센스 가닥에 존재한다. 일 구현예에서, 이러한 3'-오버행은 센스 가닥에 존재한다.
RNAi 작용제는 이의 전반적인 안정성에 영향을 미치지 않으면서 RNAi의 간섭 활성을 강화시킬 수 있는 단일 오버행만을 함유할 수 있다. 예를 들어, 단일 가닥 오버행은 센스 가닥의 3'-말단, 또는, 대안적으로 안티센스 가닥의 3'-말단에 위치할 수 있다. RNAi는 또한 안티센스 가닥의 5'-말단(또는 센스 가닥의 3'-말단)에 위치하거나 그 반대인 블런트 말단을 가질 수 있다. 일반적으로, RNAi의 안티센스 가닥은 3'-말단에서 뉴클레오티드 오버행을 갖고, 5'-말단은 블런트이다. 이론으로 국한시키려는 것은 아니지만, 안티센스 가닥의 5'-말단 및 안티센스 가닥의 3'-말단 오버행에서 비대칭 블런트 말단은 가이드 가닥이 RISC 과정으로 로딩되게 한다.
본 발명에서 특성화된 임의의 핵산은 본원에 참조로 포함되는 문헌["Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA]에 기재된 것과 같은 당 분야에서 널리 확립된 방법에 의해 합성되고/되거나 변형될 수 있다. 변형은, 예를 들어, 말단 변형, 예를 들어, 5'-말단 변형(인산화, 컨쥬게이션, 역전된 결합), 3'-말단 변형(컨쥬게이션, DNA 뉴클레오티드, 역전된 결합 등); 염기 변형, 예를 들어, 안정화 염기, 불안정화 염기, 또는 파트너의 연장된 레퍼토리, 염기의 제거(무염기 뉴클레오티드), 또는 컨쥬게이트된 염기와 염기쌍을 형성하는 염기를 이용한 대체; 당 변형(예를 들어, 2'-위치 또는 4'-위치에서의 변형) 또는 당의 대체; 및/또는 포스포디에스테르 결합의 변형 또는 대체를 포함하는 백본 변형을 포함한다. 본원에 기재된 구현예에 유용한 iRNA 화합물의 특정 예는 변형된 백본 또는 비-자연 뉴클레오시드간 결합을 함유하는 RNA를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 변형된 백본을 갖는 RNA는 특히 백본 내에 인 원자를 갖지 않는 것들을 포함한다. 본 명세서의 목적 상, 그리고 당 분야에 때때로 언급되는 바와 같이, 뉴클레오시드간 백본에서 인 원자를 갖지 않는 변형된 RNA가 또한 올리고뉴클레오시드인 것으로 간주될 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 iRNA는 그의 뉴클레오시드간 백본에서 인 원자를 가질 것이다.
변형된 RNA 백본은, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 예를 들어, 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포르아미데이트, 예를 들어, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상 3'-5' 결합을 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 연결된 유사체, 및 역전된 극성을 갖는 것들을 포함하며, 여기서 뉴클레오시드 단위의 인접한 쌍은 3'-5' 대 5'-3' 또는 2'-5' 대 5'-2'로 연결된다. 다양한 염, 혼합된 염 및 유리산 형태가 또한 포함된다.
상기 인-함유 결합의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제3,687,808호; 제4,469,863호; 제4,476,301호; 제5,023,243호; 제5,177,195호; 제5,188,897호; 제5,264,423호; 제5,276,019호; 제5,278,302호; 제5,286,717호; 제5,321,131호; 제5,399,676호; 제5,405,939호; 제5,453,496호; 제5,455,233호; 제5,466,677호; 제5,476,925호; 제5,519,126호; 제5,536,821호; 제5,541,316호; 제5,550,111호; 제5,563,253호; 제5,571,799호; 제5,587,361호; 제5,625,050호; 제6,028,188호; 제6,124,445호; 제6,160,109호; 제6,169,170호; 제6,172,209호; 제6,239,265호; 제6,277,603호; 제6,326,199호; 제6,346,614호; 제6,444,423호; 제6,531,590호; 제6,534,639호; 제6,608,035호; 제6,683,167호; 제6,858,715호; 제6,867,294호; 제6,878,805호; 제7,015,315호; 제7,041,816호; 제7,273,933호; 제7,321,029호; 및 미국 특허 제RE39464호를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
인 원자를 이에 포함하지 않는 변형된 RNA 백본은 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 결합, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 결합, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로사이클릭 뉴클레오시드간 결합에 의해 형성되는 백본을 갖는다. 이들은 모르폴리노 결합(뉴클레오시드의 당 부분으로부터 부분적으로 형성됨)을 갖는 백본; 실록산 백본; 설피드, 설폭시드 및 설폰 백본; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 알켄 함유 백본; 설파메이트 백본; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 백본; 설포네이트 및 설폰아미드 백본; 아미드 백본; 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 구성 요소 부분을 갖는 다른 백본을 포함한다.
상기 올리고뉴클레오시드의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제5,034,506호; 제5,166,315호; 제5,185,444호; 제5,214,134호; 제5,216,141호; 제5,235,033호; 제5,64,562호; 제5,264,564호; 제5,405,938호; 제5,434,257호; 제5,466,677호; 제5,470,967호; 제5,489,677호; 제5,541,307호; 제5,561,225호; 제5,596,086호; 제5,602,240호; 제5,608,046호; 제5,610,289호; 제5,618,704호; 제5,623,070호; 제5,663,312호; 제5,633,360호; 제5,677,437호; 및 제5,677,439호를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
다른 구현예에서, iRNA에서 사용하는 것으로 고려되는 적합한 RNA 모방체(mimetic)에서, 당과 뉴클레오시드간 결합 둘 모두, 즉, 뉴클레오티드 단위의 백본은 신규한 기로 대체된다. 염기 단위는 적절한 핵산 표적 화합물과의 혼성화를 위해 유지된다. 한 상기 올리고머 화합물인 우수한 혼성화 특성을 갖는 것으로 밝혀진 RNA 모방체는 펩티드 핵산(PNA)으로 지칭된다. PNA 화합물에서, RNA의 당 백본은 아미드 함유 백본, 특히 아미노에틸글리신 백본으로 대체된다. 핵염기는 유지되고, 백본의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직접적 또는 간접적으로 결합된다. PNA 화합물의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제5,539,082호; 제5,714,331호; 및 제5,719,262호를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 iRNA에 사용하기에 적합한 추가의 PNA 화합물은, 예를 들어, 문헌[Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500]에 기재된다.
본 발명에서 특성화된 일부 구현예는 포스포로티오에이트 백본을 갖는 RNA 및 헤테로원자 백본, 및 특히 상기 언급된 미국 특허 번호 제5,489,677호의 --CH2--NH--CH2-, --CH2--N(CH3)--O--CH2--[메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 백본으로 공지됨], --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- 및 --N(CH3)--CH2--CH2--[여기서, 네이티브 포스포디에스테르 백본은 --O--P--O--CH2--로 표현됨], 및 상기 언급된 미국 특허 제5,602,240호의 아미드 백본을 갖는 올리고뉴클레오시드를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 특성화된 RNA는 상기 언급된 미국 특허 제5,034,506호의 모르폴리노 백본 구조를 갖는다.
변형된 RNA는 또한 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 함유할 수 있다. 본원에 특성화된 iRNA, 예를 들어, dsRNA는 2'-위치에 OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬 중 하나를 포함할 수 있고, 상기 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환되거나 비치환된 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있다. 예시적인 적합한 변형은 O[(CH2)nO] mCH3, O(CH2).nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2) nCH3, O(CH2)nONH2, 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2를 포함하고, 여기서 n 및 m은 1 내지 약 10이다. 다른 구현예에서, dsRNA는 2' 위치에 C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단 기, 리포터 기, 인터켈레이터(intercalator), iRNA의 약동학적 특성을 개선하기 위한 기, 또는 iRNA의 약력학적 특성을 개선하기 위한 기, 및 유사한 특성을 갖는 다른 치환기 중 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 2'-메톡시에톡시(2'-O--CH2CH2OCH3, 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로도 공지됨)(문헌[Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504]), 즉, 알콕시-알콕시기를 포함한다. 또 다른 예시적인 변형은 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉, 하기 본원의 실시예에 기재된 바와 같은 2'-DMAOE로도 공지된 O(CH2)2ON(CH3)2 기, 및 2'-디메틸아미노에톡시에톡시(2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 또는 2'-DMAEOE로도 당 분야에 공지됨), 즉, 2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2이다.
다른 변형은 2'-메톡시(2'-OCH3), 2'-아미노프로폭시(2'-OCH2CH2CH2NH2) 및 2'-플루오로(2'-F)를 포함한다. 유사한 변형이 또한 iRNA의 RNA 상의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드 상 또는 2'-5' 연결된 dsRNA 내의 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 이루어질 수 있다. iRNA는 또한 펜토푸라노실 당 대신에 사이클로부틸 모이어티와 같은 당 모방체를 가질 수 있다. 상기 변형된 당 구조의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 제4,981,957호; 제5,118,800호; 제5,319,080호; 제5,359,044호; 제5,393,878호; 제5,446,137호; 제5,466,786호; 제5,514,785호; 제5,519,134호; 제5,567,811호; 제5,576,427호; 제5,591,722호; 제5,597,909호; 제5,610,300호; 제5,627,053; 제5,639,873호; 제5,646,265호; 제5,658,873호; 제5,670,633호; 및 제5,700,920호를 포함하나, 이에 제한되지는 않고, 상기 특허 중 특정 특허는 본 출원과 함께 공동으로 소유된다. 상기 특허 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
iRNA는 또한 핵염기(종종, 당 분야에서 "염기"로 간단히 지칭됨) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 "변형되지 않은" 또는 "천연" 핵염기는 퓨린 염기 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 피리미딘 염기 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)을 포함한다. 변형된 핵염기는 다른 합성 및 천연 핵염기, 예를 들어, 데옥시-티민(dT), 5-메틸시토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸 시토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸 및 아데닌 및 구아닌의 다른 알킬 유도체, 2-프로필 및 아데닌 및 구아닌의 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-다아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함한다. 추가 핵염기는 미국 특허 제3,687,808호에 개시된 것, 문헌[Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008]에 개시된 것, 문헌[The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990]에 개시된 것, 문헌[Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613]에 개시된 것, 및 문헌[Sanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993]에 개시된 것을 포함한다. 상기 핵염기 중 특정 핵염기가 본 발명에서 특성화된 올리고머 화합물의 결합 친화성을 증가시키는 데 특히 유용하다. 이들은 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린, 예를 들어, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함한다. 5-메틸시토신 치환은 핵산 듀플렉스 안정성을 0.6 내지 1.2℃까지 증가시키는 것으로 밝혀졌고(문헌[Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278]), 이는 더욱 더 특히 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합되는 경우에 예시적인 염기 치환이다.
상기 언급된 변형된 핵염기 뿐만 아니라 다른 변형된 핵염기 중 특정 핵염기의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 상기 언급된 미국 특허 제3,687,808호, 제4,845,205호; 제5,130,30호; 제5,134,066호; 제5,175,273호; 제5,367,066호; 제5,432,272호; 제5,457,187호; 제5,459,255호; 제5,484,908호; 제5,502,177호; 제5,525,711호; 제5,552,540호; 제5,587,469호; 제5,594,121호, 제5,596,091호; 제5,614,617호; 제5,681,941호; 제5,750,692호; 제6,015,886호; 제6,147,200호; 제6,166,197호; 제6,222,025호; 제6,235,887호; 제6,380,368호; 제6,528,640호; 제6,639,062호; 제6,617,438호; 제7,045,610호; 제7,427,672호; 및 제7,495,088호를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
iRNA의 RNA는 또한 하나 이상의 바이사이클릭 당 모이어티를 포함하도록 변형될 수 있다. "바이사이클릭 당"은 두 개의 원자의 브릿징에 의해 변형된 푸라노실 고리이다. "바이사이클릭 뉴클레오시드"("BNA")는 당 고리의 두 개의 탄소 원자를 연결하여 바이사이클릭 고리 시스템을 형성하는 브릿지를 포함하는 당 모이어티를 갖는 뉴클레오시드이다. 특정 구현예에서, 브릿지는 당 고리의 4'-탄소와 2'-탄소를 연결한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 작용제는 또한 하나 이상의 잠금(locked) 핵산(LNA)을 포함하도록 변형될 수 있는 iRNA의 RNA를 포함할 수 있다. 잠금 핵산은 리보스 모이어티가 2' 및 4' 탄소를 연결시키는 여분의 브릿지를 포함하는 변형된 리보스 모이어티를 갖는 뉴클레오티드이다. 다시 말해서, LNA는 4'-CH2-O-2' 브릿지를 포함하는 바이사이클릭 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오티드이다. 이러한 구조는 3'-엔도 구조적 형태 내의 리보스를 효과적으로 "잠근다". siRNA에 대한 잠금 핵산의 추가는 혈청 내에서의 siRNA 안정성을 증가시키고, 표적외(off-target) 효과를 감소시키는 것으로 밝혀졌다(문헌[Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193]).
본 발명의 폴리뉴클레오티드에 사용하기 위한 바이사이클릭 뉴클레오시드의 예는 제한 없이 4' 및 2' 리보실 고리 원자 사이의 브릿지를 포함하는 뉴클레오시드를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 안티센스 폴리뉴클레오티드 작용제는 4' 내지 2' 브릿지를 포함하는 하나 이상의 바이사이클릭 뉴클레오시드를 포함한다. 그러한 4' 내지 2' 브릿징된 바이사이클릭 뉴클레오시드의 예는 4'-(CH2)―O-2'(LNA); 4'-(CH2)―S-2; 4'-(CH2)2―O-2'(ENA); 4'-CH(CH3)-O-2'("제약된 에틸" 또는 "cEt"로도 지칭됨) 및 4'-CH(CH2OCH3)-O-2'(및 이의 유사체; 예를 들어, 미국 특허 제7,399,845호 참조), 4'-C(CH3)(CH3)-O-2'(및 이의 유사체; 예를 들어, 미국 특허 제8,278,283호 참조); 4'-CH2-N(OCH3)-2'(및 이의 유사체; 예를 들어, 미국 특허 제8,278,425호 참조); 4'-CH2-O-N(CH3)-2'(예를 들어, 미국 특허 공개 제2004/0171570호 참조); 4'-CH2-N(R)-O-2'(여기서 R은 H, C1-C12 알킬, 또는 보호기임)(예를 들어, 미국 특허 제7,427,672호 참조); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2'(예를 들어, 문헌[Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134] 참조); 및 4'-CH2-C(=CH2)-2'(및 이의 유사체; 예를 들어, 미국 특허 제8,278,426호 참조)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 각각의 상기 특허들의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다,
잠금 핵산 뉴클레오티드의 제조를 교시하는 추가의 대표적인 미국 특허 및 미국 특허 공개는 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 다음을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다: 미국 특허 제6,268,490호; 제6,525,191호; 제6,670,461호; 제6,770,748호; 제6,794,499호; 제6,998,484호; 제7,053,207호; 제7,034,133호; 제7,084,125호; 제7,399,845호; 제7,427,672호; 제7,569,686호; 제7,741,457호; 제8,022,193호; 제8,030,467호; 제8,278,425호; 제8,278,426호; 제8,278,283호; 제US 2008/0039618호; 및 제US 2009/0012281호.
예를 들어, α-L-리보푸라노스 및 β-D-리보푸라노스(제WO 99/14226호 참조)를 포함하는 하나 이상의 입체화학 당 배치를 갖는 임의의 상기 바이사이클릭 뉴클레오시드가 제조될 수 있다.
iRNA의 RNA는 또한 하나 이상의 제약된 에틸 뉴클레오티드를 포함하도록 변형될 수 있다. 본원에서 사용되는 "제약된 에틸 뉴클레오티드" 또는 "cEt"는 4'-CH(CH3)-0-2' 브릿지를 포함하는 바이사이클릭 당 모이어티를 포함하는 잠금 핵산이다. 일 구현예에서, 제약된 에틸 뉴클레오티드는 본원에서 "S-cEt"로 지칭되는 S 형태이다.
본 발명의 iRNA는 또한 하나 이상의 "형태적으로 제한된 뉴클레오티드"("CRN")을 포함할 수 있다. CRN은 리보스의 C2' 및 C4' 또는 리보스의 C3 및 -C5' 탄소를 연결하는 링커를 갖는 뉴클레오티드 유사체이다. CRN은 안정한 형태로 리보스 고리를 잠그고, mRNA에 대한 혼성화 친화성을 증가시킨다. 링커는 더 적은 리보스 고리 퍼커링을 야기하는 안정성 및 친화성을 위한 최적의 위치로 산소를 배치하기에 충분한 길이이다.
특정의 상기 언급된 CRN의 제조를 교시하는 대표적인 공보는 미국 특허 공개 제2013/0190383호; 및 PCT 공개 제WO 2013/036868호를 포함하나, 이에 제한되지는 않고, 각각의 상기 특허들의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 iRNA의 하나 이상의 뉴클레오티드는 또한 하이드록시메틸 치환된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. "하이드록시메틸 치환된 뉴클레오티드"는 "잠금 핵산"("UNA") 변형으로도 지칭되는 비환형 2'-3'-세코-뉴클레오티드이다.
UNA의 제조를 교시하는 대표적인 미국 공보는 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제8,314,227호; 및 미국 특허 공개 제2013/0096289호; 제2013/0011922호; 및 제2011/0313020호를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
RNA 분자의 말단에 대한 잠재적인 안정화 변형은 N-(아세틸아미노카프로일)-4-하이드록시프롤리놀(Hyp-C6-NHAc), N-(카프로일-4-하이드록시프롤리놀(Hyp-C6), N-(아세틸-4-하이드록시프롤리놀(Hyp-NHAc), 티미딘-2'-0-데옥시티미딘(에테르), N-(아미노카프로일)-4-하이드록시프롤리놀(Hyp-C6-아미노), 2-도코사노일-우리딘-3"-포스페이트, 전환 염기 dT(idT) 등을 포함할 수 있다. 이러한 변형의 개시 내용은 PCT 공개 제WO 2011/005861호에서 찾을 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, 본 발명의 이중 가닥 RNAi 작용제는, 예를 들어, 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는, 2011년 11월 18일에 출원된 미국 가출원 제61/561,710호, 또는 2012년 11월 16일에 출원된 제PCT/US2012/065691호에 개시된 바와 같은 화학적 변형을 갖는 작용제를 포함한다.
본 발명의 이중 가닥 RNA(dsRNA) 작용제는 선택적으로 하나 이상의 리간드에 컨쥬게이트될 수 있다. 리간드는 3'-말단, 5'-말단 또는 양 말단에서 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 둘 모두의 가닥에 부착될 수 있다. 예를 들어, 리간드는 센스 가닥에 컨쥬게이트될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 컨쥬게이트된다.
일 구현예에서, 리간드는 탄수화물 컨쥬게이트, 예컨대, 단당류이다. 일부 구현예에서, 리간드는 N-아세틸갈락토사민(GalNAc) GalNAc 또는 GalNAc 유도체이다. 본 발명의 특정 구현예에서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 1가 링커를 통해 본 발명의 iRNA 작용제에 부착된다. 일부 구현예에서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 2가 링커를 통해 본 발명의 iRNA 작용제에 부착된다. 본 발명의 추가의 다른 구현예에서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 3가 링커를 통해 본 발명의 iRNA 작용제에 부착된다. 적합한 리간드는, 예를 들어, 적합한 리간드에 관한 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 제15/371,300호 및 미국 특허 공개 제2009/0239814호에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 리간드, 예를 들어, GalNAc 리간드는 RNAi 작용제의 3' 말단에 부착된다. 일 구현예에서, RNAi 작용제는 하기 도식에 나타낸 바와 같은 링커를 통해 리간드, 예를 들어, GalNAc 리간드에 컨쥬게이트된다:
Figure pct00029
(상기 식에서, X는 O 또는 S임). 일 구현예에서, X는 O이다.
RNA 컨쥬게이트의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 각각의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제4,828,979호; 제4,948,882호; 제5,218,105호; 제5,525,465호; 제5,541,313호; 제5,545,730호; 제5,552,538호; 제5,578,717호, 제5,580,731호; 제5,591,584호; 제5,109,124호; 제5,118,802호; 제5,138,045호; 제5,414,077호; 제5,486,603호; 제5,512,439호; 제5,578,718호; 제5,608,046호; 제4,587,044호; 제4,605,735호; 제4,667,025호; 제4,762,779호; 제4,789,737호; 제4,824,941호; 제4,835,263호; 제4,876,335호; 제4,904,582호; 4,958,013호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 5,214,136호; 제5,245,022호; 제5,254,469호; 제5,258,506호; 제5,262,536호; 제5,272,250호; 제5,292,873호; 제5,317,098호; 제5,371,241호; 제5,391,723호; 제5,416,203호, 제5,451,463호; 제5,510,475호; 제5,512,667호; 제5,514,785호; 제5,565,552호; 제5,567,810호; 제5,574,142호; 제5,585,481호; 제5,587,371호; 제5,595,726호; 제5,597,696호; 제5,599,923호; 제5,599,928호 및 제5,688,941호; 제6,294,664호; 제6,320,017호; 제6,576,752호; 제6,783,931호; 제6,900,297호; 제7,037,646호; 제8,106,022호를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
제공된 화합물 내의 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없고, 사실, 상기 언급된 변형 중 하나보다 많은 변형은 단일 화합물 내 또는 심지어 iRNA 내의 단일의 뉴클레오시드에 통합될 수 있다. 본 발명은 또한 키메라 화합물인 iRNA 화합물을 포함한다.
본 발명의 문맥에서 "키메라" iRNA 화합물 또는 "키메라"는 dsRNA 화합물의 경우에 뉴클레오티드와 같은 적어도 하나의 단량체 단위로 각각 구성된 2개 이상의 화학적으로 별개의 영역을 함유하는 iRNA 화합물, 바람직하게는 dsRNA이다. 이들 iRNA는 통상적으로, 뉴클레아제 분해에 대한 증가된 내성, 증가된 세포 흡수, 및/또는 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화성을 iRNA에 부여하도록 RNA가 변형된 적어도 하나의 영역을 함유한다. iRNA의 추가 영역은 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 혼성물을 절단시킬 수 있는 효소에 대한 기질로 작용할 수 있다. 예를 들어, RNase H는 RNA:DNA 듀플렉스의 RNA 가닥을 절단시키는 세포 엔도뉴클레아제이다. 따라서, RNase H의 활성화는 RNA 표적의 절단을 발생시키고, 이에 의해 유전자 발현의 iRNA 억제의 효능을 크게 향상시킨다. 결과로서, 동일 표적 영역에 혼성화되는 포스포로티오에이트 데옥시 dsRNA에 비해 키메라 dsRNA가 사용되는 경우 보다 짧은 iRNA를 이용하여 동등한 결과가 종종 수득될 수 있다. RNA 표적의 절단은 통상적으로 겔 전기영동 및, 필요시, 당 분야에 공지된 관련된 핵산 혼성화 기술에 의해 검출될 수 있다.
특정 예에서, iRNA의 RNA는 비-리간드 기에 의해 변형될 수 있다. iRNA의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 향상시키기 위해 다수의 비-리간드 분자가 iRNA에 컨쥬게이션되었고, 상기 컨쥬게이션을 수행하기 위한 절차는 과학 문헌에서 이용 가능하다. 상기 비-리간드 모이어티는 지질 모이어티, 예를 들어, 콜레스테롤(문헌[Kubo, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54-61]; 문헌[Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553]), 콜산(문헌[Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053]), 티오에테르, 예를 들어, 헥실-S-트리틸티오(문헌[Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306]; 문헌[Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765]), 티오콜레스테롤(문헌[Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533]), 지방족 사슬, 예를 들어, 도데칸디올 또는 운데실 잔기(문헌[Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111]; 문헌[Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327]; 문헌[Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49]), 인지질, 예를 들어, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-0-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트(문헌[Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651]; 문헌[Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777]), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬(문헌[Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969]), 또는 아다만탄 아세트산(문헌[Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651]), 팔미틸 모이어티(문헌[Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229]), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 모이어티(문헌[Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923])를 포함하였다. 상기 RNA 컨쥬게이트의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허가 상기에 나열되어 있다. 통상적 컨쥬게이션 프로토콜은 서열의 하나 이상의 위치에 아미노 링커를 갖는 RNA의 합성을 포함한다. 이후, 아미노기는 적절한 커플링 또는 활성화 시약을 이용하여 컨쥬게이트되는 분자와 반응된다. 컨쥬게이션 반응은 용액 상에서 고체 지지체에 여전히 고정된 RNA와 함께 수행될 수 있거나, RNA의 분해 후에 수행될 수 있다. HPLC에 의한 RNA 컨쥬게이트의 정제는 통상적으로 순수한 컨쥬게이트를 발생시킨다.
V. 본 발명의 약학적 조성물의 용도
본 발명의 약학적 조성물은 출혈성 장애, 예를 들어, 혈우병(예를 들어, A형 혈우병, B형 혈우병, 또는 C형 혈우병)과 같이, Serpinc1 발현의 감소로 효과를 얻을 장애를 갖는 대상체의 치료적 및 예방적 처치에 유용하다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 하나 이상의 증상의 경감 또는 개선, 출혈 정도의 감소, 안정화된(즉, 악화되지 않은) 출혈 상태, 검출 가능 여부와 상관없이 출혈의 개선 또는 일시적 완화(palliation), 또는 출혈 해결을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 유익한 또는 요망되는 결과를 지칭한다. 또한, "치료"는 치료의 부재 하의 예상되는 생존에 비하여 연장된 생존을 의미할 수 있다. 본 발명의 방법에서, 치료는 출혈성 에피소드의 대증 치료 및 제어, 출혈의 수술전후 관리 및 출혈성 에피소드의 빈도를 감소시키기 위한 일상적 예방을 포함한다.
대상체에서 Serpinc1의 수준 또는 질병 마커 또는 증상의 문맥에서 용어 "보다 낮은"은 이러한 수준의 통계적으로 유의미한 감소를 지칭한다. 감소는 예를 들어, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 그 이상일 수 있으며, 바람직하게는 이러한 장애가 없는 개체에 대한 정상의 범위 내와 같이 허용되는 수준으로 감소된다.
본원에 사용되는 "예방" 또는 "예방하는"은 Sertpinc1 유전자의 발현의 감소로부터 효과를 얻을 질병, 장애 또는 질환에 관하여 사용되는 경우에 대상체에서의 이러한 질병, 장애 또는 질환과 관련된 증상, 예를 들어, 출혈과 같은 증상이 발생할 가능성의 감소를 지칭한다. 예를 들어, 출혈에 대한 하나 이상의 위험 인자를 갖는 개체에서 출혈이 발생하지 못하거나, 또는 동일한 위험 인자를 갖고, 본원에 기재된 바와 같은 치료를 제공받지 않는 개체군에 비하여 더 낮은 중증도로 출혈이 발생하는 경우, 출혈 발생 가능성이 감소된다. 질병, 장애 또는 질환의 발생 실패, 또는 이러한 질병, 장애 또는 질환과 관련된 증상의 발생의 감소(예를 들어, 그 질병 또는 장애에 대하여 임상적으로 허용되는 척도에 대해 적어도 약 10%), 또는 지연된(예를 들어, 수일, 수주, 수개월 또는 수년) 증상의 표시는 효과적인 예방으로 여겨진다.
Serpinc1 유전자 발현의 감소 및/또는 억제로 효과를 얻을 대상체는 본원에 기재된 바와 같은 출혈성 장애, 예를 들어, 유전적 출혈성 장애 또는 후천적 출혈성 장애를 갖는 대상체이다. 일 구현예에서, 유전적 출혈성 장애를 갖는 대상체는 혈우병, 예를 들어, A형, B형 또는 C형 혈우병을 갖는다. 일 구현예에서, 유전적 출혈성 장애, 예를 들어, 혈우병을 갖는 대상체는 억제제 대상체(대체 응고 인자에 불응성이 된 대상체)이다. 일 구현예에서, 억제제 대상체는 A형 혈우병을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 억제제 대상체는 B형 혈우병을 갖는다. 추가의 또 다른 구현예에서, 억제제 대상체는 C형 혈우병을 갖는다. Serpinc1 유전자 발현의 감소 및/또는 억제로 효과를 얻을 대상체의 처치는 치료적(예를 들어, 증상이 나타났을 때, 예를 들어, 대상체가 출혈(자발적 출혈 또는 외상의 결과로서의 출혈) 중이며, 혈전 형성불능) 및 예방적(예를 들어, 대상체가 출혈 중이 아니고/아니거나 수술을 받을 예정) 처치를 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "출혈성 장애"는 불충분한 혈액 응고 및/또는 과도한 출혈을 야기하는 질병 또는 장애이다. 출혈성 장애는, 예를 들어, 혈우병 또는 폰빌레브란트병(von Willebrand's disease)과 같은 유전 장애, 또는 예를 들어, 파종성 혈관내 응고, 임신-관련 자간증, 비타민 K 결핍증, 자가면역 장애, 염증성 장 질병, 궤양성 대장염, 피부 장애(예를 들어, 건선, 천포창), 호흡 질병(예를 들어, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질병), 알러지 약물 반응, 예를 들어, 약제, 예를 들어, 아스피린, 헤파린 및 와파린의 결과, 당뇨병, 급성 B형 간염 감염, 급성 C형 간염 감염, 악성 또는 고형 종양(예를 들어, 전립선, 폐, 결장, 췌장, 위, 담관, 두경부, 경부, 유방, 흑색종, 신장 및/또는 혈액 악성종양)과 관련된 후천적 장애일 수 있다. 일 구현예에서, 유전적 출혈성 장애는 혈우병, 예를 들어, A형, B형 또는 C형 혈우병이다. 일 구현예에서, 유전적 출혈성 장애, 예를 들어, 혈우병을 갖는 대상체에는 대체 응고 요법에 대하여 억제제, 예를 들어, 동종항체 억제제가 발생되며, 본원에 "억제제 대상체"로 지칭된다. 일 구현예에서, 억제제 대상체는 A형 혈우병을 갖는다. 다른 구현예에서, 억제제 대상체는 B형 혈우병을 갖는다. 추가의 또 다른 구현예에서, 억제제 대상체는 C형 혈우병을 갖는다.
일 구현예에서, 출혈성 장애는 희귀 출혈 장애(RBD)이다. RBD는 후천성 RBD 또는 유전성 RBD일 수 있다. 유전성 RBD는 응고 인자 피브리노겐, FII, FV, 조합 FV 및 FVIII, FVII, FX, FXI, FXIII의 결핍, 및 비타민 K-의존성 인자(VKCFD)의 선천성 결핍과 관련된 장애를 포함한다. 이들은 일반적으로 상염색체 열성 상태로 전달되지만, FXI 및 이상섬유소원혈증과 같은 일부 경우에, 상염색체 우성일 수 있다. RBD는 대부분의 개체군에서 보고되며, 동형접합 또는 이중 이형접합 발생률은 FVII 결핍의 경우 500,000분의 1 내지 프로트롬빈 및 FXIII 결핍의 경우 2백만 내지 3백만분의 1까지 다르다. 상대적 빈도는 개체군들 간에 다르며, 특정 돌연변이 유전자의 빈도가 증가하는 혈연 또는 동족 결혼이 흔한 곳에서 더 높다.
예시적인 RBD는 무섬유소원혈증(피브리노겐; 인자 I 결핍); 저섬유소원혈증(피브리노겐; 인자 I 결핍); 이상섬유소원혈증(피브리노겐; 인자 I 결핍); 저섬유소원혈증(피브리노겐; 인자 I 결핍); 저프로트롬빈혈증(프로트롬빈; 인자 II 결핍); 프로트롬빈 결핍(프로트롬빈; 인자 II 결핍); 혈전성향증(프로트롬빈; 인자 II 결핍); 선천성 항트롬빈 III 결핍(트롬보플라스틴; 인자 III; 조직 인자); 준혈우병(프로악셀레린; 인자 V; 취약성 인자); 오우렌병(Owren's disease)(프로악셀레린; 인자 V; 취약성 인자); 활성화 단백질 C 내성(프로악셀레린; 인자 V; 취약성 인자); 알렉산더병(Alexander's disease)(안정성 인자 프로콘버틴; 인자 VII); 선천성 프로콘버틴/인자 VII 결핍(안정성 인자 프로콘버틴; 인자 VII); 스튜어트-프라워 결핍(Stuart-Prower deficiency)(스튜어트-프라워 인자; 인자 X); 선천성 인자 XIIIa/b 결핍(피브린 안정화 인자임; 인자 XIII); 유전성 인자 XIII 결핍(피브린 안정화 인자; 인자 XIII); 및 피브린 안정화 인자 결핍(피브린 안정화 인자; 인자 XIII)를 포함한다.
본원에서 사용되는 "치료적 유효량"은 출혈성 장애 및 출혈을 갖는 대상체에게 투여되는 경우, (예를 들어, 존재하는 질병 또는 질병의 하나 이상의 증상을 감소시키거나, 개선하거나, 유지함으로써) 질병의 치료를 야기하기에 충분한 RNAi 작용제의 양을 포함하는 것으로 의도된다. "치료적 유효량"은 RNAi 작용제, 작용제가 투여되는 방법, 질병 그의 중증도 및 병력, 연령, 체중, 가족력, 유전자 구성, 선행 또는 동반 치료의 유형, 필요에 따라 치료할 대상체의 다른 개별 특징에 따라 달라질 수 있다.
본원에 사용되는 "예방적 유효량"은 출혈성 장애를 갖지만, 출혈 중이 아닌 대상체, 예를 들어, 출혈성 장애를 가지며 수술 예정인 대상체(예를 들어, 수술전후 처치)에게 투여되는 경우, 질병 또는 질병의 하나 이상의 증상을 예방하거나 개선하기에 충분한 iRNA의 양을 포함하는 것으로 의도된다. 질병의 개선은 질병의 전개를 늦추거나 이후에 발생하는 질병의 중증도를 감소시키는 것을 포함한다. "예방적 유효량"은 iRNA, 작용제가 투여되는 방법, 질병의 위험도 및 병력, 연령, 체중, 가족력, 유전자 구성, 선행 또는 동반 치료의 유형, 필요에 따라, 치료할 환자의 다른 개별적 특징에 따라 달라질 수 있다.
"치료적 유효량" 또는 "예방적 유효량"은 또한, 임의의 치료에 적용가능한 합리적인 이익/위험 비율로 일부 요망되는 국소 또는 전신 효과를 야기하는 RNAi 작용제의 양을 포함한다. 본 발명의 방법에 사용되는 iRNA는 이러한 치료에 적용가능한 합리적인 이익/위험 비율을 야기하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다.
"권장되는 치료적 유효량의 대체 인자" 및 "권장되는 치료적 유효량의 우회 작용제"는 트롬빈을 생성하고 출혈을 해결하기에 충분하고/충분하거나 세계 혈우병 연맹에 의해 제공된 바와 같은 출혈을 갖는 대상체에서 혈장 인자의 피크 수준을 달성하기에 충분한 대체 인자 또는 우회 작용제 각각의 용량이다(예를 들어, 문헌[Srivastava, et al.　 "Guidelines for the Management of Hemophilia", Hemophilia Epub 6 July 2012]; DOI:10.1111/j.1365-2516.2012.02909.x; ADVATE (항혈우병 인자 (재조합)) 프로덕트 인서트; 11/2016; 및 BeneFIX(응고 인자 IX (재조합) 프로덕트 인서트; 11/2011 참조). 상기 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
예를 들어, 적은 출혈을 갖는 대상체에 대한 대체 인자 또는 우회 작용제의 권장 용량은 약 10 IU/dL 내지 40 IU/dL의 피크 혈장 인자 VIII 수준을 달성하기에 충분한 용량이며; 중간 정도의 출혈을 갖는 대상체에 대한 대체 인자 또는 우회 작용제의 권장 용량은 약 30 IU/dL 내지 60 IU/dL의 피크 혈장 인자 VIII 수준을 달성하기에 충분한 용량이며; 큰 출혈을 갖는 대상체에 대한 대체 인자 또는 위회 작용제의 권장 용량은 약 60 IU/dL 내지 100 IU/dL의 피크 혈장 인자 VIII 수준을 달성하기에 충분한 용량이며; 수술전후 대상체에 대한 대체 인자 또는 우회 작용제의 권장 용량은 약 30 IU/dL 내지 60 IU/dL의 피크 혈장 인자 VIII 수준을 달성하기에 충분한 용량이다(예를 들어, 표 1 및 2의 ADVATE(항혈우병 인자(재조합)) 프로덕트 인서트; 11/2016 참조).
적은 출혈을 갖는 대상체에 대한 대체 인자 또는 우회 작용제의 권장 용량은 약 10 IU/dL 내지 30 IU/dL의 피크 혈장 인자 IX 수준을 달성하기에 충분한 용량이고; 중간 정도의 출혈을 갖는 대상체에 대한 대체 인자 또는 우회 작용제의 권장 용량은 약 25 IU/dL 내지 50 IU/dL의 피크 혈장 인자 IX 수준을 달성하기에 충분한 용량이고; 큰 출혈을 갖는 대상체에 대한 대체 인자 또는 우회 작용제의 권장 용량은 약 50 IU/dL 내지 100 IU/dL의 피크 혈장 인자 IX 수준을 달성하기에 충분한 용량이다.
본 발명의 약학적 조성물의 방법 및 용도는 일반적으로 Serpinc1-관련 질병, 예를 들어, 출혈성 장애, 예를 들어, 혈우병(예를 들어, A형 혈우병, B형 혈우병, 또는 C형 혈우병)을 갖는 대상체에게 본 발명의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 일부 양태에서, 방법은 대상체에게 추가 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 Serpinc1 발현의 감소로 효과를 얻을 장애, 예를 들어, 출혈성 장애, 예를 들어, 혈우병을 갖는 대상체에서 적어도 하나의 증상을 예방하는 방법을 제공한다. 방법은 대상체, 예를 들어, 인간에게 예방적 유효량, 예를 들어, 약 25 mg 내지 약 100 mg의 고정 용량, 예를 들어, 약 80 mg의 고정 용량의 iRNA 작용제, 예를 들어, 본 발명의 dsRNA를 포함하는 본 발명의 약학적 조성물을 투여하고, 이에 의해 Serpinc1 발현의 감소로 효과를 얻을 장애를 갖는 대상체에서 적어도 하나의 증상을 예방하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 Serpinc1 발현의 감소로 효과를 얻을 장애, 예를 들어, 출혈성 장애, 예를 들어, 혈우병을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 대상체, 예를 들어, 인간에게 치료적 유효량, 예를 들어, 약 25 mg 내지 약 100 mg의 고정 용량, 예를 들어, 약 80 mg의 고정 용량의 Serpinc1 유전자를 표적으로 하는 iRNA 작용제를 포함하는 본 발명의 약학적 조성물 또는 Serpinc1 유전자를 표적으로 하는 iRNA 작용제를 포함하는 약학적 조성물을 투여하고, 이에 의해 Serpinc1 발현의 감소로 효과를 얻을 장애를 갖는 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 치료 및 예방 방법은, 예를 들어, 약 75% 이상까지 대상체에서 Serpinc1 활성을 낮추는 양의 본 발명의 iRNA 작용제, 및, 예를 들어, 세계 혈우병 연맹(예를 들어, 문헌[Srivastava, et al. "Guidelines for the Management of Hemophilia", Hemophilia Epub 6 July 2012]; DOI:10.1111/j.1365-2516.2012.02909.x 참조) 및/또는 식품 및 약물 투여(예를 들어, ADVATE(항혈우병 인자 (재조합)) 프로덕트 인서트; 11/2016; BeneFIX(응고 인자 IX (재조합) 프로덕트 인서트; 11/2011 참조)에 의해 권장되는 치료적 유효량(예를 들어, 트롬빈을 생성하고 출혈을 해결하기에 충분한 양(혈전 형성))의 대체 인자 또는 우회 작용제에 비해 감소된 치료적 유효량의 대체 인자 또는 우회 작용제를 포함하는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
적합한 대체 인자는 인자 VIII, 예를 들어, 애드베이트(Advate), 엘록테이트(Eloctate), 헤메이트(Haemate), 헬릭세이트(Helixate), 이뮤네이트(Immunate), 옥타네이트(Octanate), 리콤비네이트(Recombinate), 및 리팩토(Refacto), 또는 인자 IX, 예를 들어, 아이마픽스(Aimafix), 베네픽스(Benefix), 이뮤닌(Immunine), 및 리팩토(Refacto)를 포함한다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 우회 작용제는 활성화 프로트롬빈 복합체 농축물(aPCC), 예를 들어, FEIBA 및 프로트롬플렉스(Prothromplex), 재조합 인자 VIIa(rFVIIa), 예를 들어, 노보세븐(NovoSeven)을 포함한다.
대체 인자는 인자 VIII일 수 있고, 본 발명의 방법에서 대상체에게 투여되는 대체 인자의 치료적 유효량은 약 10 IU/dL 내지 100 IU/dL, 예를 들어, 약 10 IU/dL, 15 IU/dL, 20 IU/dL, 25 IU/dL, 30 IU/dL, 35 IU/dL, 40 IU/dL, 45 IU/dL, 50 IU/dL, 55 IU/dL, 60 IU/dL, 65 IU/dL, 70 IU/dL, 75 IU/dL, 80 IU/dL, 85 IU/dL, 90 IU/dL, 95 IU/dL, 또는 약 100 IU/dL의 피크 혈장 인자 VIII 수준을 달성하기에 충분한 용량이다.
예를 들어, 대상체에게 투여되는 인자 VIII 대체 인자의 치료적 유효량은 약 200 IU/kg 미만, 또는 약 190 IU/kg 미만, 또는 약 180 IU/kg 미만, 또는 약 170 IU/kg 미만, 또는 약 160 IU/kg 미만, 또는 약 150 IU/kg 미만, 또는 약 140 IU/kg 미만, 또는 약 130 IU/kg 미만, 또는 약 120 IU/kg 미만, 또는 약 110 IU/kg 미만, 또는 약 100 IU/kg 미만, 또는 약 90 IU/kg 미만, 또는 약 80 IU/kg 미만, 또는 약 70 IU/kg 미만, 또는 약 60 IU/kg 미만, 또는 약 50 IU/kg 미만, 또는 약 40 IU/kg 미만, 또는 약 30 IU/kg 미만, 또는 약 20 IU/kg 미만, 또는 약 10 IU/kg 미만일 수 있다. 일 구현예에서, 대상체에게 투여되는 인자 VIII의 치료적 유효량은 권장되는 유효량보다 약 1 배 및 1/2배 내지 약 5 배 낮은, 예컨대, 약 5 IU/kg 내지 약 20 IU/kg 또는 약 10 IU/kg 내지 약 20 IU/kg, 예를 들어, 5 IU/kg, 10 IU/kg, 15 IU/kg, 또는 20 IU/kg의 용량이다. 일 구현예에서, 출혈 사건은 중간 정도의 출혈 사건이다. 또 다른 구현예에서, 출혈 사건은 큰 출혈 사건이다.
대체 인자는 인자 IX일 수 있고, 본 발명의 방법에서 대상체에게 투여되는 대체 인자의 치료적 유효량은 약 10 IU/dL 내지 100 IU/dL, 예를 들어, 약 10 IU/dL, 15 IU/dL, 20 IU/dL, 25 IU/dL, 30 IU/dL, 35 IU/dL, 40 IU/dL, 45 IU/dL, 50 IU/dL, 55 IU/dL, 60 IU/dL, 65 IU/dL, 70 IU/dL, 75 IU/dL, 80 IU/dL, 85 IU/dL, 90 IU/dL, 95 IU/dL, 또는 약 100 IU/dL의 피크 혈장 인자 IX 수준을 달성하기에 충분한 용량이다.
예를 들어, 인자 IX 대체 인자의 치료적 유효량은 약 200 IU/kg 미만, 또는 약 190 IU/kg 미만, 또는 약 180 IU/kg 미만, 또는 약 170 IU/kg 미만, 또는 약 160 IU/kg 미만, 또는 약 150 IU/kg 미만, 또는 약 140 IU/kg 미만, 또는 약 130 IU/kg 미만, 또는 약 120 IU/kg 미만, 또는 약 110 IU/kg 미만, 또는 약 100 IU/kg 미만, 또는 약 90 IU/kg 미만, 또는 약 80 IU/kg 미만, 또는 약 70 IU/kg 미만, 또는 약 60 IU/kg 미만, 또는 약 50 IU/kg 미만, 또는 약 40 IU/kg 미만, 또는 약 30 IU/kg 미만, 또는 약 20 IU/kg 미만, 또는 약 10 IU/kg 미만일 수 있다. 일 구현예에서, 대상체에게 투여되는 인자 IX의 치료적 유효량은 대체 인자의 권장되는 유효량보다 약 2배 내지 약 6배 더 적고, 예를 들어, 약 10 IU/kg 내지 약 30 IU/kg 또는 약 20 IU/kg 내지 약 30 IU/kg, 예컨대, 약 10 IU/kg, 15 IU/kg, 20 IU/kg, 25 IU/kg, 또는 30 IU/kg의 용량이다. 일 구현예에서, 출혈 사건은 중간 정도의 출혈 사건이다. 또 다른 구현예에서, 출혈 사건은 큰 출혈 사건이다.
우회 작용제는 aPCC일 수 있고, 본 발명의 방법에서 대상체에게 투여되는 우회 작용제의 치료적 유효량은 트롬빈을 생성하고 출혈을 해결하기에 충분한 용량이다.
예를 들어, 우회 작용제 aPCC의 치료적 유효량은 약 100 U/kg 미만, 또는 약 90 U/kg 미만, 또는 약 80 U/kg 미만, 또는 약 70 U/kg 미만, 또는 약 60 U/kg 미만, 또는 약 50 U/kg 미만, 또는 약 40 U/kg 미만, 또는 약 30 U/kg 미만, 또는 약 20 U/kg 미만, 또는 약 10 U/kg 미만일 수 있다. 일 구현예에서, 대상체에게 투여되는 aPCC의 치료적 유효량은 대체 인자의 권장 유효량보다 약 2배 내지 약 3 배 더 적고, 예를 들어, 약 30 U/kg 내지 약 50 U/kg, 예컨대, 약 30 U/kg, 35 U/kg, 40 U/kg, 45 U/kg, 또는 50 U/kg의 용량이다. 일 구현예에서, 출혈 사건은 중간 정도의 출혈 사건이다. 또 다른 구현예에서, 출혈 사건은 큰 출혈 사건이다.
우회 작용제는 rFVIIa일 수 있고, 본 발명의 방법에서 대상체에게 투여되는 우회 작용제의 치료적 유효량은 트롬빈을 생성하고 출혈을 해결하기에 충분한 용량이다.
예를 들어, 우회 작용제 rFVIIa의 치료적 유효량은 약 120 μg/kg 미만, 또는 약 110 μg/kg 미만, 또는 약 100 μg/kg 미만, 또는 약 90 μg/kg 미만, 또는 약 80 μg/kg 미만, 또는 약 70 μg/kg 미만, 또는 약 60 μg/kg 미만, 또는 약 50 μg/kg 미만, 또는 약 40 μg/kg 미만, 또는 약 30 μg/kg 미만, 또는 약 20 μg/kg 미만이다. 일 구현예에서, 대상체에게 투여되는 rFVIIa의 치료적 유효량은 대체 인자의 권장 유효량보다 약 2배 낮고, 예를 들어, 약 45 μg/kg의 용량이다. 일 구현예에서, 출혈 사건은 중간 정도의 출혈 사건이다. 또 다른 구현예에서, 출혈 사건은 큰 출혈 사건이다.
일부 구현예에서, dsRNA 작용제를 포함하는 약학적 조성물은 고정 용량으로 대상체에게 투여된다. "고정 용량"(예를 들어, mg 용량)은 1회 용량의 iRNA 작용제가 체중과 같은 임의의 특정 대상체-관련 인자와 무관하게 모든 대상체에게 사용된다는 것을 의미한다. 하나의 특정 구현예에서, 본 발명의 iRNA 작용제의 고정 용량은 소정의 중량 또는 연령을 기초로 한다.
일부 구현예에서, iRNA 작용제를 포함하는 약학적 조성물은 약 25 mg 내지 약 100 mg, 예를 들어, 약 25 mg 내지 약 95 mg, 약 25 mg 내지 약 90 mg, 약 25 mg 내지 약 85 mg, 약 25 mg 내지 약 80 mg, 약 25 mg 내지 약 75 mg, 약 25 mg 내지 약 70 mg, 약 25 mg 내지 약 65 mg, 약 25 mg 내지 약 60 mg, 약 25 mg 내지 약 50 mg, 약 50 mg 내지 약 100 mg, 약 50 mg 내지 약 95 mg, 약 50 mg 내지 약 90 mg, 약 50 mg 내지 약 85 mg, 약 50 mg 내지 약 80 mg, 약 30 mg 내지 약 100 mg, 약 30 mg 내지 약 90 mg, 약 30 mg 내지 약 80 mg, 약 40 mg 내지 약 100 mg, 약 40 mg 내지 약 90 mg, 약 40 mg 내지 약 80 mg, 약 60 mg 내지 약 100 mg, 약 60 mg 내지 약 90 mg, 약 25 mg 내지 약 55 mg, 약 30 mg 내지 약 95 mg, 약 30 mg 내지 약 85 mg, 약 30 mg 내지 약 75 mg, 약 30 mg 내지 약 65 mg, 약 30 mg 내지 약 55 mg, 약 40 mg 내지 약 95 mg, 약 40 mg 내지 약 85 mg, 약 40 mg 내지 약 75 mg, 약 40 mg 내지 약 65 mg, 약 40 mg 내지 약 55 mg, 또는 약 45 mg 내지 약 95 mg의 고정 용량으로 투여된다.
일부 구현예에서, iRNA 작용제를 포함하는 약학적 조성물은 약 25 mg, 약 30 mg, 약 35 mg, 약 40 mg, 약 45 mg, 약 50 mg, 약 55 mg, 약 60 mg, 약 65 mg, 약 70 mg, 약 75 mg, 약 80 mg, 약 85 mg, 약 90 mg, 약 95 mg, 또는 약 100 mg의 고정 용량으로 투여된다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 약 100 mg의 고정 용량으로 대상체에게 투여된다.
일 구현예에서, RNAi 작용제는 Serpinc1 활성을 약 75% 이상 낮추는 용량으로 대상체에게 투여된다.
iRNA 작용제를 포함하는 약학적 조성물은 1회 이상의 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다.
iRNA 작용제를 포함하는 약학적 조성물은 약 월 1회, 약 5주마다 1회, 약 6주마다 1회, 약 2개월마다 1회, 또는 3개월에 1회 대상체에게 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물의 단일 용량은 후속 용량이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8주 이하의 간격으로 투여되도록 길게 지속될 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물의 단일 용량은 월 1회 투여된다. 일 구현예에서, RNAi 작용제의 고정 용량은 월 1회, 예컨대, 월 1회 80 mg의 고정 용량으로 대상체에 투여하기에 적합하다.
본 발명의 방법 및 용도는 표적 Serpinc1 유전자의 발현이 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 31일, 32일, 33일, 34일, 35일, 36일, 37일, 38일, 39일, 40일, 41일, 42일, 43일, 44일, 45일, 46일, 47일, 48일, 49일, 50일, 51일, 52일, 53일, 54일, 55일, 56일, 57일, 58일, 59일, 60일, 61일, 62일, 63일, 64일, 65일, 66일, 67일, 68일, 69일, 70일, 71일, 72일, 73일, 74일, 75일, 76일, 77일, 78일, 79일, 또는 약 80일 동안과 같이 감소되도록 본원에 기재된 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 표적 Serpinc1 유전자의 발현은 연장된 기간, 예를 들어, 적어도 약 7일 이상, 예를 들어, 약 1주, 2주, 3주, 약 4주, 약 5주, 약 6주, 약 2개월, 약 3개월 이상 동안 감소된다.
유전자 발현의 감소는 당업계에 공지되어 있는 임의의 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, Serpinc1의 발현의 감소는 당업자에게 통상적인 방법, 예를 들어, 노던 블롯팅, qRT-PCR을 사용하여 Serpinc1의 mRNA 발현 수준을 결정함으로써, 당업자에게 통상적인 방법, 예를 들어, 웨스턴 블롯팅, 면역학적 기법을 사용하여 Serpinc1의 단백질 수준을 결정함으로써, 및/또는 예를 들어, 세포 혈액 응고 메카니즘과 관련된 하나 이상의 분자에 영향을 미치는 Serpinc1의 생물학적 활성(또는 생체내 환경에서, 혈액 응고 그 자체)을 결정함으로써 결정될 수 있다. 일 구현예에서, 트롬빈 생성 시간, 혈전 혈성 시간 및/또는 응고 시간은, 예를 들어, 전혈의 ROTEM® 트롬보엘라스토메트리 분석을 이용하여 Serpinc1 발현을 평가하기 위해 결정된다.
본 발명의 방법 및 용도에 따른 dsRNA의 투여는 Serpinc1-관련 질병이 있는 환자에서 이러한 질병 또는 장애의 중증도, 징후, 증상 및/또는 마커의 감소를 야기할 수 있다. 이러한 문맥에서 "감소"는 이러한 수준의 통계적으로 유의미한 감소를 의미한다. 감소는 예를 들어, 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 약 100%일 수 있다.
질병의 치료 또는 예방의 효능은 예를 들어, 질병 진행, 질병의 차도, 증상 중증도, 출혈 빈도, 통증 감소, 삶의 질, 치료 효과를 지속시키는 데 필요한 약제의 용량, 질병 마커 또는 치료 중이거나 예방을 위해 표적화된 주어진 질병에 적절한 임의의 기타 측정 가능한 파라미터의 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다. 이러한 파라미터 중 어느 하나 또는 파라미터의 임의의 조합을 측정함으로써 치료 또는 예방의 효능을 모니터링하는 것이 당업자의 능력 내에 적절히 있다. 예를 들어, 출혈성 장애의 치료 효능은 예를 들어, 트롬빈:항-트롬빈 수준의 주기적인 모니터링에 의해 평가될 수 있다. 이후의 판독치와 초기의 판독치의 비교는 임상의에게 치료가 효과적인지 여부의 지침을 제공한다. 이러한 파라미터 또는 파라미터의 임의의 조합 중 어느 하나를 측정함으로써 치료 또는 예방의 효능을 모니터링하는 것이 당업자의 능력 내에 적절히 있다. Serpinc1을 표적으로 하는 iRNA 또는 그의 약학적 조성물의 투여와 관련하여, 출혈성 장애에 "대해 효과적인"은 임상적으로 적절한 방식의 투여가 적어도 통계적으로 유의미한 환자의 부분에 대하여 유리한 효과, 예를 들어, 증상의 개선, 치유, 질병의 감소, 삶의 연장, 삶의 질의 향상, 또는 출혈성 장애 및 관련 원인을 치료하는 것에 친숙한 의사에 의해 일반적으로 긍정적인 것으로 인지되는 기타 효과를 야기하는 것을 나타낸다.
치료 또는 예방 효과는 질병 상태의 하나 이상의 파라미터의 통계적으로 유의미한 개선이 존재하는 경우에 또는 다르게는 그들이 예상될 증상을 악화시키거나 발생시키지 못함에 의해 분명해진다. 일 예로서, 질병의 측정 가능한 파라미터의 적어도 10%의 바람직한 변화, 및 바람직하게는 적어도 20%, 30%, 40%, 50% 또는 그 이상은 효과적인 치료를 나타낼 수 있다. 주어진 iRNA 약물 또는 그 약물의 제형에 대한 효능도 또한 당업계에 공지되어 있는 주어진 질병에 대한 실험 동물 모델을 사용하여 판단할 수 있다. 실험 동물 모델을 사용하는 경우, 통계적으로 유의미한 마커 또는 증상의 감소가 관찰되는 경우에 치료 효능이 입증된다.
대안적으로, 효능은 임상 허용 질병 중증도 등급화 척도에 기초한 진단 분야의 당업자에 의해 결정하는 경우, 질병의 중증도의 감소에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 적절한 척도를 사용하여 측정되는 질병의 중증도의 감소를 야기하는 임의의 긍정적인 변화는 본원에 기재된 바와 같은 iRNA 또는 iRNA 제형을 사용한 적당한 치료를 나타낸다.
본 발명은 추가로 다른 약제 및/또는 다른 치료 방법, 예를 들어, 공지된 약제 및/또는 공지의 치료 방법, 예를 들어, 출혈성 장애를 치료하기 위해 현재 사용되는 것들과 조합하여, 예를 들어, Serpinc1 발현의 감소 및/또는 억제로 효과를 얻을 대상체, 예를 들어, 출혈성 장애를 갖는 대상체를 치료하기 위한 iRNA 또는 그의 약학적 조성물의 이용을 위한 방법 및 용도를 제공한다.
예를 들어, 특정 구현예에서, Serpinc1을 표적으로 하는 iRNA는 예를 들어, 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 출혈성 장애를 치료하는 데 유용한 작용제와 병용 투여된다. 예를 들어, Serpinc1 발현의 감소로 효과를 얻을 대상체, 예를 들어, 출혈성 장애를 갖는 대상체를 치료하는 데 적합한 추가의 치료제 및 치료 방법은 신선-동결 혈장(FFP); 재조합 FVIIa; 재조합 FIX; FXI 농축물; 바이러스-불활성화 vWF-함유 FVIII 농축물; 스테로이드 또는 정맥내 면역글로불린(IVIG) 및 사이클로포스파미드와 함께 고용량의 FVIII 또는 FIX를 포함할 수 있는 탈감작 요법; 항섬유소용해 요법의 존재 또는 부재 하의, FVIII 또는 FIX의 주입 및 면역억제와 함께, 혈장분리교환법; 면역억제 요법(예를 들어, 사이클로포스파미드, 프레드니손 및/또는 항-CD20)의 존재 또는 부재 하의 면역 관용 요법(ITI); 데스모프레신 아세테이트[DDAVP]; 항섬유소용해제, 예를 들어, 아미노카프로산 및 트라넥삼산; 활성화 프로트롬빈 복합 농축물(PCC); 혈액응고 작용제(antihemophilic agent); 코르티코스테로이드; 면역억제제; 및 에스트로겐을 포함한다.
iRNA 및 추가의 치료제 및/또는 치료는 동일한 시간에 및/또는 동일한 조합으로, 예를 들어, 비경구로 투여될 수 있거나, 추가의 치료제는 개별 조성물의 부분으로서, 또는 개별 시간에 및/또는 당업계에 공지되거나 본원에 기재된 또 다른 방법에 의해 투여될 수 있다.
VI. 본 발명의 용기
본 발명은 또한 본 발명의 약학적 조성물을 포함하는 용기, 예컨대, 바이알, 시린지, 자가주사제 펜, 또는 무침 투여 디바이스를 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 예를 들어, 프리로딩 시린지 또는 자동 주사 디바이스를 사용하는 자가 투여에 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물을 포함하는 용기는 바이알이다. 바이알은 약 0.5 mL 내지 약 2.0 ml의 약학적 조성물을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 바이알은 약 0.8 ml의 약학적 조성물을 포함한다. 일 구현예에서, 바이알은 단일 용량의 약학적 조성물을 포함하는 2R 바이알(즉, 2 ml 주사 바이알)이다. 일 구현예에서, 2R 바이알은 단일의 80 mg 용량의 조성물을 포함하는 약 0.80 ml(예를 들어, 약 0.96 mL 내지 약 1.05 mL)의 본 발명의 약학적 조성물을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 용기는 시린지, 예컨대, 프리-필드 시린지를 포함한다. 일 구현예에서, 프리-필드 시린지는 니들 뾰족 손상 예방 안전 장치(PFS-S)를 포함한다. 적합한 시린지는 1 ml 시린지 또는 3 ml 시린지일 수 있고, 29G 니들 또는 30G 니들을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 시린지는 29G 또는 30G 니들을 구비한 일회용 3 ml 유리 시린지이다. 일 구현예에서, 프리-필드 시린지는 단일의 80 mg 용량의 조성물을 포함하는 약 0.80 ml(예를 들어, 약 0.84 ml, 또는 0.8 ml 내지 0.84 ml)의 본 발명의 약학적 조성물을 포함한다.
본 발명의 예시적인 프리-필드 시린지는 시린지, 예컨대, 29G X 1/2" 니들을 구비한 BD Neopak; 강성 니들 쉴드(RNS); 플런저, 예컨대, FluroTec 코팅이 있는 BD 4023 플런저; 안전 시스템, 예컨대, BD UltraSafelm Plus; 플런저 로드, 예컨대, BD UltraSafe' Passive Plunger Rod; 및 핑거 플랜지, 예컨대, BD UltraSaferm Passive Add-on Finger를 포함할 수 있다.
VII. 본 발명의 키트
본 발명은 또한 약학적 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 이러한 키트는 본 발명의 약학적 조성물을 포함하는 하나 이상의 바이알 또는 하나 이상의 프리-필드 시린지 및 사용 설명서, 예를 들어, 예방적 또는 치료적 유효량의 RNAi 작용제(들)를 투여하기 위한 설명서를 포함한다. 키트는 선택적으로 RNAi 작용제를 투여하기 위한 수단(예를 들어, 주사 디바이스), 또는 Serpinc1의 억제를 측정하기 위한 수단(예를 들어, Serpinc1 mRNA, Serpinc1 단백질, 및/또는 Serpinc1 활성의 억제를 측정하기 위한 수단)을 추가로 포함할 수 있다. Serpinc1의 억제를 측정하기 위한 이러한 수단은, 예를 들어, 혈장 샘플과 같은 대상체로부터의 샘플을 얻기 위한 수단을 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 선택적으로 치료적 유효량 또는 예방적 유효량을 결정하기 위한 수단을 추가로 포함할 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명에서 특성화된 iRNA 및 방법의 실시 또는 시험에 사용될 수 있으나, 적합한 방법 및 재료가 하기에 기재된다. 본원에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 또한, 재료, 방법, 및 예는 단지 예시이며, 이로 제한하고자 하는 것이 아니다.
본 발명은 추가로 하기 실시예에 의해 예시되며, 실시예는 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 공개 특허 출원의 내용뿐만 아니라 도면도 본원에 참조로 포함된다.
실시예
[표 1]
Figure pct00030
Figure pct00031
실시예 1: 피투시란 의약품
피투시란 의약품(피투시란)은 피하 투여를 위한 5 mM 인산염 완충 염수(PBS) 중 100 mg/mL 피투시란(106 mg/mL 피투시란 소듐과 같음)을 함유하는 멸균 용액이다. 상기 의약품은 테프론 코팅 부틸-고무 마개 및 시일 위에 중앙 구멍이 있는 2R 타입 I 유리 바이알에 0.8 mL 용액으로서 상업적으로 공급된다. 상기 의약품은 보존제를 함유하지 않으며, 일회용으로 의도된 것이다.
피투시란 의약품의 조성은 표 2에 요약되어 있다.
[표 2]
Figure pct00032
하기에 나타나 있는 피투시란의 화학적 구조는 포스페이트 백본을 나타내는 확장된 구조식을 사용하여 표현되어 있다. 염기 쌍 형성에 수반된 염기는 점선으로 연결된다. L96, GalNAc 함유 리간드, 및 리간드를 센스 가닥의 3'-말단에 컨쥬게이트하는 링커의 구조가 또한 하기에 제시되어 있다. 피투시란 듀플렉스(AD-57213)의 듀플렉스 및 두 개의 단일 가닥(AD-116858, 센스 가닥; A-116861, 안티센스 가닥)의 분자식 및 질량이 또한 하기 표에 제공되어 있다.
Figure pct00033
실시예 2: 피투시란 제형 개발
피투시란 제형은 피하 투여용으로 구성되었다. 피하 투여용으로 구성된 제형은 자극 및 화학적 비상용성 증가의 위험을 막기 위해 너무 산성이거나 너무 알칼리성이지 않아야 한다. 긴장성, pH, 및 점도를 고려하여, 제형을 가능한 생리학적에 가깝게 구성하였다. 100 mg/mL의 피투시란 의약품 수용액의 pH는 5.0 내지 6.8로 다양하다. 음이온성 포스포디에스테르와 나트륨 상대 이온의 존재는 수용액의 농도에 좌우되는 소정량의 오스몰농도에 기여한다. 100 mg/mL 원료 의약품의 표적 제형에서, 상대 이온으로 대략 118 mOsm/kg 용액을 생성하였다. 완제 의약품의 등장성 및 완충능을 유지하기 위해, 원료 의약품을 5 mM 인산염 완충 염수(0.64 mM NaH2PO4, 4.36 mM Na2HPO4, 84 mM NaCl)에 용해시켰다.
상술된 의약품 제형은 다음 물리화학적 특성을 가졌다: 약 6.8 내지 약 7.2의 pH; 약 300 mOsm/kg의 오스몰농도; 및 약 1.038 g/mL의 밀도.
피투시란 의약품 제조는 5 mM 인산염 완충 염수에 필요량의 분말화된(동결건조된) 피투시란 원료 의약품을 용해시키고, 소듐 하이드록사이드 또는 인산에 의해 pH를 대략 7.0까지 조절하고, 이어서 멸균 여과하고, 충전하는 것으로 이루어졌다.
비임상 및 1/2 상 임상 연구를 포함하여 초기 개발에 사용된 의약품은 바이알 당 공칭 0.5 mL 중 100 mg/mL(피투시란 소듐) 용액으로 공급되었다. 3 상 연구에 사용되고 상업적 생산용으로 의도된 의약품은 바이알 당 공칭 0.8 mL 중 100 mg/mL(피투시란 유리산, 106 mg/mL 피투시란 소듐과 같음)으로 공급된다. 하기 표는 피투시란 의약품 제형의 차이를 요약한 것이다.
Figure pct00034
실시예 3: 피투시란 의약품의 분석 평가
의약품이 물리적으로 그리고 화학적으로 안정하다는 것을 입증하기 위해 피투시란 의약품의 다양한 분석 평가를 수행하였다.
외관
피투시란 의약품을 균일한 확산 조명 하에 흑백 배경에 대해 색상, 균질성 및 미립자 물질에 대하여 육안으로 검사하였다.
피투시란 의약품에 대한 외관 검사를 상이한 배치에 걸쳐 동일한 육안 검사로 수행하였고, 결과는 "미립자를 본질적으로 함유하지 않는 투명, 무색 내지 담황색 용액"의 규격을 충족했다.
듀플렉스 체류 시간에 의한 확인
피투시란 의약품을 피투시란 참조 표준과 함께 비-변성 IP RP-HPLC에 의해 분석하고, 샘플의 듀플렉스 체류 시간을 참조 표준과 비교하였다. 지금까지 제조된 모든 피투시란 의약품 배치는 "참조 표준과 일치하는 체류 시간"의 규격을 충족했는데, 이는 어닐링된 siRNA 듀플렉스로서의 이들의 정체성을 확인시켜 주는 것이다.
UV에 의한 피투시란 의약품의 어세이
피투시란 의약품에서 피투시란의 어세이(assay)(mg/mL)의 결정을 위해 UV 흡광도법을 이용하였다. 0.9% 염수 중 적절하게 희석된 의약품의 흡광도를 260 nm에서 UV 분광광도계로 측정하였다.
C = (A × F × M)/(ε × b)
상기 식에서, A는 측정된 흡광도이고, F는 희석 인자이고, b는 세포의 경로 길이(1 cm)이고, ε는 듀플렉스 참조 표준의 몰 흡수도이고, M은 분자량이고, C는 농도(mg/mL)이다. 듀플렉스 순도를 설명하기 위해, 주어진 의약품에 대한 피투시란 어세이 결과를 이의 순도 인자에 대하여 보정하였다((비-변성 IP-RP HPLC 면적-%)/100를 곱함).
피투시란 의약품의 어세이(mg/mL)를 UV 분광광도계로부터 결정하고, 비-변성 IP RP-HPLC 방법으로부터 듀플렉스 순도에 대하여 보정하고, 결과를 듀플렉스의 H-형태(유리산)의 농도를 기준으로 보고하였다. 모든 결과는 101.5 mg/mL의 평균 어세이 값 및 3.4%의 표준 편차로 90 mg/mL 내지 110 mg/mL의 규격 제한치 내에 있었다(유리산 형태로 측정). 결과는 시험된 모든 피투시란 로트의 어세이 값들 간에 우수한 동등성을 나타냈다.
피투시란 의약품의 pH
피투시란 의약품의 pH를 직접적으로 측정하였다. 피투시란 의약품 로트에 대한 비교 pH 결과는 0.0의 표준 편차로 7.1의 pH인 것으로 관찰되었다. 모든 결과는 피투시란 의약품에 대한 pH에 대하여 6.0 내지 8.0의 현재 규격을 충족했다. 피투시란 의약품 배치에 대한 pH 데이터의 분석은 피투시란 로트들 간에 높은 정도의 동등성을 나타냈다.
피투시란 의약품의 오스몰농도
피투시란 의약품의 오스몰농도는 어는점 강하의 원리를 기초로 한다. 오스몰농도는 mOsm/kg 값으로 보고되었다. 제형은 소듐 포스페이트 완충액 및 피투시란 듀플렉스로부터 고정된 염 농도를 갖기 때문에, 관찰된 오스몰농도 값은 좁은 범위만을 나타냈다. 피투시란 의약품 배치에 대한 오스몰농도 결과는 304 mOsm/kg의 평균 및 5.3%의 표준 편차로 297 내지 310(mOsm/kg)의 범위였다. 모든 결과는 피투시란 의약품의 오스몰농도에 대하여 240 mOsm/kg 내지 390 mOsm/kg의 규격 내에 있었다.
피투시란 의약품 중의 미립자 물질
피투시란 의약품을 감광법에 의해 용기 당 눈에 보이지 않는 미립자 물질의 수에 대하여 분석하고, 결과를 용기 당 총 입자 수(10 μm 이상 및 25 μm 이상)로 보고하였다. 피투시란 의약품에서 10 μm 이상의 입자의 경우, 관찰된 범위는 약 188개 입자의 평균 및 268.2%의 표준 편차로 약 29개 내지 588개 입자(10 μm 이상)였다. 모든 결과는 피투시란 의약품의 용기 당 NMT 6,000의 규격 내에 있었다.
25 μm 이상의 입자의 경우, 관찰된 범위는 약 13개 입자의 평균 및 22.4%의 표준 편자로 약 0개 내지 46개 입자의 범위였다. 모든 결과는 피투시란 의약품의 용기 당 NMT 600의 규격 내에 있었다.
피투시란 의약품을 위한 용기에서의 부피
피투시란 의약품을 포함하는 용기에서의 부피는 0.8 mL 이상(NLT)으로 설정된 규격 제한치로 측정되었다. 상이한 피투시란 의약품 로트에서 관찰된 용기에서의 부피는 0.0의 표준 편차로 피투시란 의약품 배치 간에 우수한 정도의 동등성을 나타냈다.
피투시란 의약품 배치에서 세균 내독소 및 멸균성
피투시란 의약품의 모든 배치는 세균 내독소(100 내독소 단위(EU)/mL 이하(NMT))에 대한 미생물 안전성 시험 기준을 충족했는데, 이는 피투시란 의약품 공정에 대한 적절한 제어 및 이의 미생물 안전성 프로파일을 입증하는 것이다.
비-변성 이온-쌍 역상 고성능 액체 크로마토그래피(IP RP-HPLC)에 의한 듀플렉스 순도
비-변성 IP RP-HPLC는 임의의 잔류 단일 가닥으로부터 듀플렉스를 분해한다. 듀플렉스의 면적 퍼센트 순도가 이 방법에 의해 결정된다. 피투시란 의약품에서 원료 의약품의 정체성을 듀플렉스 참조 표준과 일치하는 체류 시간에 의해 확립하였다.
질량 분광기(ESI-MS)와 탠덤으로 의약품에서 구성 단일 가닥, 센스 및 안티센스 가닥의 확인을 위해 비-변성 IPRP HPLC 방법을 이용하였다. 듀플렉스 피크는 잔류 단일 가닥으로부터 분해되기 때문에, 듀플렉스 순도를 이 방법에 의해 결정하였다. 피투시란 의약품의 대표적인 IP RP 크로마토그램은 도 1에 나타나 있다.
정지상: Waters XBridge C8 2.1×50 컬럼, 2.5 μm 입도.
이동상 A: 물 중 95 mM 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올(HFIP), 16 mM 트리에틸아민(TEA), 5 μM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA).
이동상 B: 5 μM EDTA와 100% 메탄올.
유량: 0.25 mL/min.
컬럼 온도: 15℃
구배:
Figure pct00035
검출: 260 nm에서의 UV 및 700 Da 내지 2700 Da에 대한 음성 이온 모드의 MS
샘플 제조: 샘플을 단일 가닥 중간체의 경우 ~0.1 mg/mL 및 듀플렉스 원료 의약품(피투시란)의 경우 0.2 mg/mL의 농도까지 1X PBS에서 제조하였다.
주입 부피는 20 μL였다.
검출 한계: 크로마토그래피 소프트웨어를 사용하여 0.05 면적% 이상의 모든 피크를 통합하고 보고하였다.
순도 계산: 주요 듀플렉스 피크의 면적%를 크로마토그래피 소프트웨어에 의해 계산하고, 듀플렉스 순도로서 보고하였다. 잔류 단일 가닥 및 기타 불순물의 면적-%를 또한 보고하였다.
정체성: 동일한 듀플렉스 피크 하에 존재하는 센스 및 안티센스인 구성 단일 가닥의 정체성을 크로마토그래피 소프트웨어를 사용하여 액체 크로마토그래피 질량 분광기(LC-MS)에 의해 듀플렉스 피크 스펙트럼의 디콘볼루션으로부터 결정된 분자량에 의해 확립하였다.
비-변성 IP RP-HPLC에 의한 피투시란 의약품의 비-변성 프로파일은 이의 듀플렉스 형태의 의약품의 존재를 확인시켜 주었다. 듀플렉스 순도는 피투시란 의약품 중 어닐링된 듀플렉스 siRNA의 백분율을 나타냈다. 본 연구에 포함된 의약품 배치의 경우, 듀플렉스 순도 값은 약 98.9 면적% 내지 99.5 면적%의 범위 내에 있었다. 데이터 분석에 의해 약 0.3%의 표준 편차로 약 99.2%의 평균(n = 4) 순도가 얻어졌고, 듀플렉스 순도 값은 이 보고에서 비교된 모든 피투시란 의약품 배치에 대해 일관되고 서로 유사한 것으로 나타났다.
비-변성 이온-쌍 역상 고성능 액체 크로마토그래피(IP RP-HPLC)에 의한 총 불순물
비-변성 IP RP-HPLC에 의한 비-듀플렉스(비-어닐링) 불순물을 ≥0.050 면적%의 모든(비-듀플렉스) 피크의 합으로서 보고하였다. 비-변성 IP RP-HPLC에 의한 총 불순물에 대한 결과는 2% 이내인 것으로 관찰되었고, 본 연구에 포함된 피투시란 의약품의 모든 배치에 대하여 NMT 10.0 면적%의 규격을 충족했다. 비-변성 IP RP-HPLC에 의한 총 불순물에 대한 평균 값(n = 4)은 0.3%의 표준 편차로 0.85%였다. 전반적으로, 결과는 본 보고에서 검사된 피투시란 의약품 로트가 특정(단일 가닥) 불순물과 불특정 불순물 둘 모두와 관련하여 매우 유사한 프로파일을 가졌다는 것을 보여주었다.
변성 음이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피(AX-HPLC)에 의한 순도
의약품에서 단일 가닥의 순도를 결정하기 위해, 변성 AX-HPLC 분석을 수행하였다.
안티센스 가닥에 대한 다중 피크의 존재는 포스포로티오에이트 부분입체이성질체에 기인했다. 피투시란 의약품의 대표적인 AX-HPLC 크로마토그램은 도 2에 나타나 있다.
정지상: Dionex DNA Pac PA200 컬럼, 4 × 250mm
이동상 A: 20 mM 소듐 포스페이트, 10% ACN, pH 11
이동상 B: 20 mM 소듐 포스페이트, 1 M NaBr, 10% ACN, pH 11
구배:
Figure pct00036
검출 한계: 크로마토그래피 소프트웨어를 사용하여 0.05 면적% 이상의 모든 피크를 통합하고 보고하였다.
순도 계산: 각각의 주요 피크(센스 및 안티센스)의 면적%를 크로마토그래피 소프트웨어에 의해 계산하고, 센스 가닥 면적%와 안티센스 가닥 면적%의 합을 순도로서 보고하였다. 0.050 면적% 초과의 불순물의 % 면적의 합을 총 불순물로서 보고하였다.
정체성: 시험 샘플의 체류 시간을 상응하는 참조 표준과 비교함으로써 단일 가닥 정체성을 확인하였다.
AX-HPLC는 피투시란 듀플렉스를 변성시켜 구성 센스 및 안티센스 단일 가닥을 형성한다. 이 방법에 의해 단일 가닥의 면적-퍼센트 순도를 결정하였다.
변성 AX-HPLC 방법은 피투시란 듀플렉스를 포함하는 개별 단일 가닥의 순도를 측정한다. 단일 가닥 면적 백분율의 합은 피투시란 의약품의 변성 순도를 나타낸다. 본 연구에서 피투시란 로트에 대한 센스 가닥의 면적%와 안티센스 가닥의 면적%의 합에 대한 분석에 의해, 0.8%의 표준 편차로 94.2 면적%의 평균 값(n = 4)을 얻었다. 대표적인 피투시란 의약품 배치로부터의 모든 결과는 NLT 85.0 면적%의 규격을 충족했고, 피투시란 의약품에 대한 전반적인 비슷한 순도 결과를 나타냈다.
변성 음이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피(AX-HPLC)에 의한 총 불순물
데이터 분석에 의해 0.7%의 표준 편차로 모든 불순물 NLT 0.050 면적%의 합에 대해 5.6%의 평균 값(n = 4)을 얻었다. 결과는 본 보고에 포함된 피투시란 배치에 대한 총 불순물 값이 일관되고 비슷하다는 것을 보여주었다.
변성 이온-쌍 역상 고성능 액체 크로마토그래피(IP RP-HPLC)에 의한 순도
IP RP-HPLC는 피투시란 듀플렉스를 변성시켜 구성 센스 및 안티센스 단일 가닥을 형성한다. 단일 가닥의 면적-퍼센트 순도는 이 방법에 의해 결정된다.
변성 IP RP-HPLC 방법은 AX-HPLC에 직교성이며, 의약품에서 피투시란 듀플렉스를 포함하는 개별 단일 가닥의 순도를 측정한다. 단일 가닥 면적 백분율의 합은 피투시란 의약품의 변성 IP RP-HPLC 순도를 나타낸다.
변성 IP RP-HPLC 분석을 또한 수행하여 의약품에서 단일 가닥의 순도를 결정하였다.
정지상: Waters XBridge C18 (OST 또는 XP) 2.1×50 컬럼, 2.5 μm 입도.
이동상 A: 90:10 물:메탄올 중 550 mM 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올(HFIP), 13 mM 트리메틸아민(TEA), 및 5 M 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)
이동상 B: 100% 메탄올
유량: 0.40 mL/min.
컬럼 온도: 80℃
구배:
Figure pct00037
검출: 260 nm에서의 UV 및 700 Da 내지 2700 Da에 대한 음성 이온 모드의 MS
샘플 제조: 샘플을 단일 가닥 중간체의 경우 ~0.1 mg/mL 및 듀플렉스 원료 의약품(피투시란)의 경우 0.2 mg/mL의 농도까지 1X PBS에서 제조하였다.
주입 부피는 25 μL였다.
검출 한계: 크로마토그래피 소프트웨어를 사용하여 0.05 면적% 이상의 모든 피크를 통합하고 보고하였다.
순도 계산: 주요 듀플렉스 피크의 면적%를 크로마토그래피 소프트웨어에 의해 계산하고, 듀플렉스 순도로서 보고하였다. 잔류 단일 가닥 및 기타 불순물의 면적-%를 또한 보고하였다.
피투시란 의약품의 대표적인 변성 IP RP-HPLC 크로마토그래피 프로파일은 도 3에 나타나 있다.
본 연구에서 피투시란 로트에 대한 센스 가닥의 면적%와 안티센스 가닥의 면적%의 합에 대한 분석에 의해 1.4%의 표준 편차로 88.7 면적%의 평균 값(n = 4)을 얻었다. 피투시란 의약품 로트에 대한 모든 결과는 NLT 80.0 면적%의 규격을 충족했고, 분석적 변동성 내에서 피투시란 의약품 로트에 대하여 비슷한 순도 결과를 나타냈다.
변성 이온-쌍 역상 고성능 액체 크로마토그래피(IP RP-HPLC)에 의한 총 불순물
데이터 분석에 의해 1.5%의 표준 편차로 NLT 0.050 면적%의 모든 불순물의 합에 대하여 11.0%의 평균 값(n = 4)을 얻었다. 결과는 본 보고에 포함된 모든 피투시란 배치에 대한 총 불순물 값이 일관되고 비슷하다는 것을 보여주었다.
실시예 4: 피투시란 의약품의 용기 클로저 시스템 및 상용성
피투시란 의약품을 위한 용기 클로저 시스템을 미생물 오염으로부터 멸균 의약품을 보호하기 위해 선택하였다. 바이알을 멸균하고, 300℃ 이상에서 5분 이상 동안 건열에 의해 멸균하고 발열원을 제거하였다. 부틸-고무 시일을 121℃ 내지 125℃에서 60분 이상 동안 고압멸균하였다. 부틸-고무 마개를 검증된 사이클을 통해 오토클레이브에 의해 증기 멸균하였다. 모든 부품은 비경구 의약품을 위한 표준 품목이었다. 동일한 용기 클로저 시스템에서 저장된 의약품을 사용하여 피투시란 의약품 안정성 연구를 실시하였다.
피투시란을 피하 주입용으로 제형화하였다. 투여하고자 하는 추정 계산된 용량을 기초로, 1 mL 또는 3 mL 시린지가 사용될 것이다. 하나의 구성 소재가 폴리카보네이트이고 다른 하나의 구성 소재가 폴리프로필렌인 두 개의 시린지 타입을 피투시란과의 상용성에 대하여 시험하였다. 바이알에 100 mg/mL 충전된 의약품을 시린지에 빨아들였다. 한 세트의 충전된 시린지를 25℃에서 8 h 동안 인큐베이션하고, 또 다른 세트의 충전된 시린지를 대조와 함께 2℃ 내지 8℃에서 48 h 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 의약품을 어세이 및 AX-HPLC에 의한 순도에 대하여 시험하고, 바이알에 있는 의약품과 비교하였다. 라벨 함량 및 순도와 관련하여 대조 의약품과 두 개의 시린지 타입에 인큐베이션된 의약품 간에 차이는 없었는데, 이는 하기에서 표 3에 나타낸 바와 같은 의도된 주사 디바이스와 피투시란의 상용성을 나타내는 것이다.
[표 3]
Figure pct00038
표 3에 나타낸 바와 같은 동일한 구성 소재의 시린지로, 희석되지 않은 의약품의 추출과 분배 둘 모두를 위한 더 큰 게이지(더 좁은 보어) 니들의 사용을 또한 평가하였다. 두 가지 시린지 타입 및 두 가지 분배 속도를 분석하였다. 결과는 표 4에 나타나 있고, 29G 또는 30G 니들을 통한 사용시에 피투시란 의약품의 온전성이 그대로 유지된다는 것을 입증시켜 준다.
[표 4]
Figure pct00039
실시예 5: 피투시란 의약품의 저장 안정성 분석
2℃ 내지 8℃의 권장된 저장 조건에서, 그리고 하나 이상의 가속화된 조건에서 피투시란 의약품에 대한 저장 안정성 데이터를 수집하였다. 안정성 연구를 인체용 약제 등록을 위한 기술 요구 사항의 조화에 대한 국제 컨퍼런스(ICH) 지침 Q1A(R2)에 따라 설계하고, 샘플을 임상 물질의 저장에 사용된 것(즉, 테프론 표면가공 부틸 고무 마개가 있는 2 mL USP 타입 I 유리 바이알)과 동일한 용기 클로저에 저장하였다. 안정성 데이터를 표 5에 나타낸 바와 같이 수집하였다.
[표 5]
Figure pct00040
피투시란 의약품의 안정성을 다음 분석 절차를 이용하여 경향에 대해 평가하였다: 시각적 외관, UV 분광광도계에 의한 어세이, pH, 오스몰농도, 비-변성 IPRP-HPLC에 의한 듀플렉스 순도, 및 두 가지 직교 방법에 의해 측정된 바와 같은 단일 가닥 순도: 변성 AX HPLC에 의한 순도, 및 변성 IPRP-HPLC에 의한 순도.
의약품의 열 안정성을 더 명확히 하기 위해, 여러 안정성 연구는 25℃/60%RH에서의 의약품 장기간 평가, 뿐만 아니라 40℃/75%RH에서 수행된 6개월의 가속화 에이징 연구를 포함하였다. 추가 데이터(즉, 25℃/60%RH에서 6개월 초과, 및 40℃/75%RH에서 모든 데이터 수집)를 수집하여 ICH 구역 II 기후 조건에서 장기간 저장 동안 의약품의 적합성을 평가하였다.
피투시란 의약품의 세 가지 대표적인 로트(P02314, P02715, 및 P07916)에 대한 저장 안정성 데이터는 표 6 내지 표 14에 제공되어 있으며, 하기에서 요약된다.
2℃ 내지 8℃의 권장된 저장 조건에서, 피투시란 의약품에 대한 36개월까지의 안정성 데이터를 수집하였다. 2℃ 내지 8℃에서의 저장 동안 임의의 파라미터에 대하여 유의미한 변화가 확인되지 않았는데, 이는 이러한 조건이 의약품의 장기간 저장 동안 적합하다는 것을 나타낸다. 추가로, 25℃/60%RH에서의 저장 동안, 또는 심지어 40℃/75%RH에서의 저장 동안 유의미한 변화가 관찰되지 않았다. 이를 기초로 할 때, 그리고 ICH 구역 II 기후 조건(즉, 25℃/60%RH)에서의 장기간 저장 동안 의약품의 적합성 평가를 기초로 할 때, 2℃ 내지 8℃에서 저장된 피투시란 의약품에 36개월 유통 기한이 지정되었고, 이는 마지막 업데이트 시간 이후에 수집된 추가 데이터에 의해 확인되었다.
[표 6]
Figure pct00041
[표 6]
Figure pct00042
[표 7]
Figure pct00043
[표 7]
Figure pct00044
[표 8]
Figure pct00045
[표 9]
Figure pct00046
[표 9]
Figure pct00047
[표 10]
Figure pct00048
[표 10]
Figure pct00049
[표 11]
Figure pct00050
[표 12]
Figure pct00051
[표 12]
Figure pct00052
[표 13]
Figure pct00053
[표 13]
Figure pct00054
[표 14]
Figure pct00055
SEQUENCE LISTING <110> Genzyme Corporation <120> SERPINC1 iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF <130> 117811-03020 <140> <141> <150> 62/793,020 <151> 2019-01-16 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1599 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tctgccccac cctgtcctct ggaacctctg cgagatttag aggaaagaac cagttttcag 60 gcggattgcc tcagatcaca ctatctccac ttgcccagcc ctgtggaaga ttagcggcca 120 tgtattccaa tgtgatagga actgtaacct ctggaaaaag gaaggtttat cttttgtcct 180 tgctgctcat tggcttctgg gactgcgtga cctgtcacgg gagccctgtg gacatctgca 240 cagccaagcc gcgggacatt cccatgaatc ccatgtgcat ttaccgctcc ccggagaaga 300 aggcaactga ggatgagggc tcagaacaga agatcccgga ggccaccaac cggcgtgtct 360 gggaactgtc caaggccaat tcccgctttg ctaccacttt ctatcagcac ctggcagatt 420 ccaagaatga caatgataac attttcctgt cacccctgag tatctccacg gcttttgcta 480 tgaccaagct gggtgcctgt aatgacaccc tccagcaact gatggaggta tttaagtttg 540 acaccatatc tgagaaaaca tctgatcaga tccacttctt ctttgccaaa ctgaactgcc 600 gactctatcg aaaagccaac aaatcctcca 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gatgtcctag agcagaaggt tccggaagcc accaaccggc gggtctggga 300 actgtccaag gccaattctc gatttgccac taacttctat cagcacctgg cagactccaa 360 gaacgacaac gacaacattt tcctgtcacc cttgagcatc tccacggcgt ttgctatgac 420 caagctgggt gcttgtaata acaccctcaa gcagctgatg gaggttttta aatttgatac 480 catctccgag aagacatccg accagatcca cttcttcttt gccaaactga actgccgact 540 ctatcgaaaa gccaacaagt cctctaactt ggtgtcagcc aaccgccttt ttggagacaa 600 atcccttacc ttcaatgaga gctatcaaga cgttagtgag attgtctatg gagccaagct 660 tcagcccctg gacttcaagg agaatccgga gcaatccaga gtgaccatca acaactgggt 720 agctaataag actgaaggcc gcatcaaaga cgtcatcccc caaggagcca ttgatgagct 780 cactgccctg gtgctggtta acaccattta cttcaagggc ctgtggaagt caaagttcag 840 ccctgagaac acaaggaagg aaccattcca caaagttgat gggcagtcat gcctggtgcc 900 catgatgtac caggaaggca aattcaaata caggcgtgtg ggagagggta cccaggtgct 960 agagatgccc ttcaaggggg acgacatcac catggtgctc atcctgccca agcctgagaa 1020 gagcctggct aaggtggagc aggaactcac cccggagctg ctgcaggagt ggctggatga 1080 gctgtcggag gtcatgcttg 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ggagtttgga cttttcaggg ctgaacagat 360 cgacaaggcc catgtcttgc agctgctcct tcaaactgaa gccgtcctca atgcggaagc 420 ggggcatgtg gaccaccagc atcatctcct ccaattcatc cagccactct tgcagcacct 480 ctggggtgag ttccttctct accttggcca ggctcttctc aggcttgggc aagatgagga 540 ccatggtgat gtcatcacct ttgaagggca actcaagcac ctgggtgcct tcagccacgc 600 gccgataacg gaacttgcct tcctggtaca tcatagatgc tgaacacgac tctccatcag 660 ccttgtagaa cagttccttc cttgtgttct cagggctgaa ctttgacttc cacaggccct 720 tgaagtaaat ggtgttaacc agcaccagaa cagtgagctc attgatggct tccgagggaa 780 tgacatcggt gattcggcct tcggtcttat tggacaccca tttgttgatg gccgctctgg 840 attgctctgc attttccttg aagtccaggg gctggagctt ggctccatat accaactcac 900 tgatgtcctg gtaggtctca ttgaaggtaa gggatttgtc tccaaaaagg cgattggctg 960 atactaactt ggaggatttg ttggcttttc gatagagtcg gcagttcagt ttggcaaaga 1020 agaagtggat ctgatcagat gttttctcag atatggtgtc aaacttaaat acctccatca 1080 gttgctggag ggtgtcatta caggcaccca gcttggtcat agcaaaagcc gtggagatac 1140 tcaggggtga caggaaaatg ttatcattgt cattcttgga 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aaggcccatg tcttgcagct gctccttcaa actgaagccg 420 tcctcaatgc ggaagcgggg catgtgaacc accagcatca tctcctccaa ctcatccagc 480 cactcctgca gcacctctgg ggtgagttcc tgctccacct tggtcaggct cttctcaggc 540 ttgggcagga tgagcaccat ggtgatgtca tcacccttga agggcaactc aagcacctgg 600 gtgccttcag ccacgcgccg ataacagaac ttgccttcct ggtacatcat agacgctgaa 660 cacgactctc catcagcctt gtagaacggt tccatccttg tgttctcagg gctaaacttt 720 gacttccaca ggcccttgaa gtaaatggtg ttaaccagca ccagaacagt gagctcgttg 780 atggcttccg ggggaatgac atcggtgatt cggccttcgg tcttattgga cacccatttg 840 ttgatggccg ctctggattg ctctgcattt tccttgaagt ccaggggctg gagcttggct 900 ccgtatacca actcactgat gtcctggtag gtctcattga aggtaaggga tttgtctcca 960 aaaaggcgat tggctgatac taacttggag gatttgttgg cttttcgata gagtcggcag 1020 ttcagtttgg caaagaagaa gtggatctga tcagatgttt tctcagatat ggtgtcaaac 1080 ttaaatacct ccatcagttg cttgagggtg tcattacagg cacccagctt ggtcatagca 1140 aaagccgtgg agacactcag gggtgacagg aaaatgttat ccttgtcgtt cttggaatct 1200 gccaggtgct gatagaaagt ggtagcaaag 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ctcgtgaggt ggcagtcgta tttattttta cttctattca caaacaccaa agtaggaaaa 540 ggtgcaaaga ttaagaatat tttagttcac acaaggatta gccactctcc ccatgaatat 600 aatagtgttc agtgcaactt cccttataag aaccaggaag ggcctgttgg ccttgaaggt 660 caccctattg gggttcagtg accggccagt aatcacgaca gaagtactcg ctgctgcttc 720 actgccttcc tcatttacct caagaaatgc tttgtggaat gcgtcggaga catagaggtc 780 gtccctgcct ccagcaacga tccctgggag ttgggacttt tcagggctga agagatcaat 840 gaggcccatg tcttgcagct gctccttcag actgaagcca tcctcggtgc ggaagcgggg 900 catgtggacc acaagcatag tctctgacag ctcatccagc cactcctgca gcagctctgg 960 ggtgagctcc tgctccacct tggccaggct cttctcaggc ttgggcagga tgagcaccat 1020 ggtgatgtca tcccccttga agggcagctc tagcacctgg gtgccctctg ccacgcgccg 1080 gtatttgaat ttgccttcct ggtacatcat aggcactggg catgactgcc catcgacctt 1140 atagaacggt tccttccttg tgttctcagg gctgaacttt gacttccaca ggcccttgaa 1200 gtaaatggtg ttaaccagaa ccagggcagt gagctcgtta atggcgccct gtgggatgac 1260 atctttgatg cggccttcag tcttattagc tacccagttg ttgatggtca ctctggattg 1320 ctccggattc tccttgaagt ccaggggctg gagcttggct ccatagacaa cctcactaac 1380 atcttgatag ctctcgttga aggtgaggga tttgtctcca aaaaggcggt tggctgatac 1440 caagtcagag gacttgttgg cttttcgata gagtcggcag ttcagtttgg caaagaagaa 1500 gtggatctgg tcggatgtct tctcggagat ggtatcaaat ttaaaaacct ccatcagctg 1560 cttgagagtg tcgttacagg cacccagctt ggtcatagca aaagcagtgg agatgctcaa 1620 gggtgacagg aaaatgttgt cgttgtcatt cttggagtct gccaggtgct ggtagaagtt 1680 agtggcaaat cgcgaattgg ccttggacag ttcccagacc cgccggttgg tggcttctgg 1740 aaccttctgc tctgagccat cctcctcggt ggccttcttc ccaggggagc ggtaaatgca 1800 caagggattc acggggatgt ctcggggctt cgctatgcag atgtcgtcca cagggtttcc 1860 gtgacagata gcacagccca aggcaccgat gaggagcaga gagaggagac aaagcttcct 1920 ctcaccagca gccccacttc ctgccccagg ggaatacatg gccgatgctc ctacagagat 1980 ggtgctgact gagacgatca ctccgaaaac tggttctttc ccctaaatct gagaggtcca 2040 gaggccaggt gggggaggga gctctcccct taaagtcttc aggtagatat gtcttctgat 2100 tatgtcttat atctcaccac ttcactaaaa tgtctcagat acaaatcaga tctatttcta 2160 aaattaccta t 2171 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gggggatgac gtctttgatg cggccttcag tcttattagc 840 tacccagttg ttgatggtca ctctggattg ctccggattc tccttgaagt ccaggggctg 900 aagcttggct ccatagacaa tctcactaac gtcttgatag ctctcattga aggtaaggga 960 tttgtctcca aaaaggcggt tggctgacac caagttagag gacttgttgg cttttcgata 1020 gagtcggcag ttcagtttgg caaagaagaa gtggatctgg tcggatgtct tctcggagat 1080 ggtatcaaat ttaaaaacct ccatcagctg cttgagggtg ttattacaag cacccagctt 1140 ggtcatagca aacgccgtgg agatgctcaa gggtgacagg aaaatgttgt cgttgtcgtt 1200 cttggagtct gccaggtgct gatagaagtt agtggcaaat cgagaattgg ccttggacag 1260 ttcccagacc cgccggttgg tggcttccgg aaccttctgc tctaggacat cctcctccgt 1320 ggccttcttc gcaggggagc ggtaaatgca catggggttc acggggatgt ctcggggctt 1380 cgctatgcag atgtcgtcca cagggtttcc atgacagaca gcacagccca aggcaccaat 1440 gagtagcaga gagaggagac aaagcttcct ctctccagca accgcacttc ctattcccgg 1500 ggaatacatg gtggacgctt ctgcagagaa gccgtggaga cagtgctgag caatccctcc 1560 g 1561 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: RFGF peptide" <400> 9 Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 1 5 10 15 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: RFGF analogue peptide" <400> 10 Ala Ala Leu Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Pro 1 5 10 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 11 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 1 5 10 <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Drosophila sp. <400> 12 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 13 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 13 gguuaacacc auuuacuuca a 21 <210> 14 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 14 uugaaguaaa ugguguuaac cag 23 <210> 15 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> 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Claims (55)

  1. 약 50 mg/mL 내지 약 200 mg/mL 농도의 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제 및 약 1 mM 내지 약 10 mM 농도의 인산염 완충 염수(PBS)를 포함하는, Serpinc1 유전자의 발현을 억제하기 위한 약학적 조성물로서,
    약학적 조성물의 pH 및 오스몰농도는 대상체에게 피하 투여하기에 적합하고,
    dsRNA 작용제는 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 센스 가닥 및 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 안티센스 가닥을 갖고,
    a, g, c, 및 u는 2'-O-메틸(2'-OMe) A, G, C, 및 U이고; Af, Gf, Cf, 및 Uf는 2'-플루오로 A, G, C, U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고,
    리간드는 링커를 통해 센스 가닥의 3' 말단에 컨쥬게이트되고, 리간드 및 링커는 하기 구조
    Figure pct00056

    를 갖고,
    dsRNA 작용제는 유리산 형태인, 약학적 조성물.
  2. 약 50 mg/mL 내지 약 200 mg/mL 농도의 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제 및 약 1 mM 내지 약 10 mM 농도의 인산염 완충 염수(PBS)를 포함하는, Serpinc1 유전자의 발현을 억제하기 위한 약학적 조성물로서,
    약학적 조성물의 pH 및 오스몰농도는 대상체에게 피하 투여하기에 적합하고,
    dsRNA 작용제는 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 센스 가닥 및 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 안티센스 가닥을 갖고,
    a, g, c, 및 u는 2'-O-메틸(2'-OMe) A, G, C, 및 U이고; Af, Gf, Cf, 및 Uf는 2'-플루오로 A, G, C, U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고,
    리간드는 링커를 통해 센스 가닥의 3' 말단에 컨쥬게이트되고, 리간드 및 링커는 하기 구조
    Figure pct00057

    를 갖고,
    dsRNA 작용제는 염 형태인, 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 염 형태는 나트륨 염 형태인, 약학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 작용제에서 실질적으로 모든 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 기는 나트륨 상대이온을 포함하는, 약학적 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 작용제에서 모든 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 기는 나트륨 상대이온을 포함하는, 약학적 조성물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, PBS의 농도는 약 2 mM 내지 약 7 mM인, 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, PBS의 농도는 약 3 mM 내지 약 6 mM인, 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, PBS의 농도는 약 5 mM인, 약학적 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물의 pH는 약 5.0 내지 약 8.0인, 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 조성물의 pH는 약 6.0 내지 약 8.0인, 약학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 조성물의 pH는 약 6.5 내지 약 7.5인, 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 조성물의 pH는 약 6.8 내지 약 7.2인, 약학적 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물의 오스몰농도는 약 50 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg인, 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 조성물의 오스몰농도는 약 100 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg인, 약학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 조성물의 오스몰농도는 약 240 mOsm/kg 내지 약 390 mOsm/kg인, 약학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 조성물의 오스몰농도는 약 290 mOsm/kg 내지 약 320 mOsm/kg인, 약학적 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적 조성물에서 dsRNA 작용제의 농도는 약 50 mg/mL 내지 약 150 mg/mL인, 약학적 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 약학적 조성물 중 dsRNA 작용제의 농도는 약 80 mg/mL 내지 약 110 mg/mL인, 약학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 약학적 조성물 중 dsRNA 작용제의 농도는 약 100 mg/mL인, 약학적 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 약 2℃ 내지 약 8℃에서 저장될 때 약 36개월까지 안정한, 약학적 조성물.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 약 25℃ 및 60% 상대 습도(RH)에서 저장될 때 약 36개월까지 안정한, 약학적 조성물.
  22. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 약 40℃ 및 75% 상대 습도(RH)에서 저장될 때 약 6개월까지 안정한, 약학적 조성물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 순도 비-변성 IPRP-HPLC에 의해 결정하는 경우 약 90.5 면적% 이상(NLT)의 듀플렉스 및 약 5 면적% 이하(NMT)의 단일 가닥을 포함하는, 약학적 조성물.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 순도 변성 AX-HPLC에 의해 결정하는 경우 약 85.0 면적% 이상(NLT)의 총 단일 가닥을 포함하는, 약학적 조성물.
  25. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 순도 변성 IPRP-HPLC에 의해 결정하는 경우 약 80.0 면적% 이상(NLT)의 총 단일 가닥을 포함하는, 약학적 조성물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 포함하는, 바이알.
  27. 제26항에 있어서, 약 0.5 ml 내지 약 2.0 ml의 약학적 조성물을 포함하는, 바이알.
  28. 제27항에 있어서, 약 0.8 ml의 약학적 조성물을 포함하는, 바이알.
  29. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 포함하는, 시린지.
  30. 제29항에 있어서, 1 ml 시린지인, 시린지.
  31. 제29항에 있어서, 3 ml 시린지인, 시린지.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 29G 니들을 포함하는, 시린지.
  33. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 30G 니들을 포함하는, 시린지.
  34. 약 100 mg/mL 농도의 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제 및 약 5 mM 농도의 인산염 완충 염수(PBS)를 포함하는, Serpinc1 유전자의 발현을 억제하기 위한 약학적 조성물로서,
    약학적 조성물의 pH는 약 6.8 내지 약 7.2이고,
    약학적 조성물의 오스몰농도는 약 300 mOsm/kg이고,
    dsRNA 작용제는 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 센스 가닥 및 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 안티센스 가닥을 갖고,
    a, g, c, 및 u는 2'-O-메틸(2'-OMe) A, G, C, 및 U이고; Af, Gf, Cf, 및 Uf는 2'-플루오로 A, G, C, U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고,
    리간드는 링커를 통해 센스 가닥의 3' 말단에 컨쥬게이트되고, 리간드 및 링커는 하기 구조
    Figure pct00058

    를 갖고,
    dsRNA 작용제는 유리산 형태인, 약학적 조성물.
  35. 약 106 mg/mL 농도의 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제 및 약 5 mM 농도의 인산염 완충 염수(PBS)를 포함하는, Serpinc1 유전자의 발현을 억제하기 위한 약학적 조성물로서,
    약학적 조성물의 pH는 약 6.8 내지 약 7.2이고,
    약학적 조성물의 오스몰농도는 약 300 mOsm/kg이고,
    dsRNA 작용제는 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 센스 가닥 및 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 안티센스 가닥을 갖고,
    a, g, c, 및 u는 2'-O-메틸(2'-OMe) A, G, C, 및 U이고; Af, Gf, Cf, 및 Uf는 2'-플루오로 A, G, C, U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고,
    리간드는 링커를 통해 센스 가닥의 3' 말단에 컨쥬게이트되고, 리간드 및 링커는 하기 구조
    Figure pct00059

    를 갖고,
    dsRNA 작용제는 염 형태인, 약학적 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 염 형태는 나트륨 염 형태인, 약학적 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 작용제에서 실질적으로 모든 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 기는 나트륨 상대이온을 포함하는, 약학적 조성물.
  38. 제36항에 있어서, 작용제에서 모든 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 기는 나트륨 상대이온을 포함하는, 약학적 조성물.
  39. 약 100 mg/mL 농도의 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제 및 약 5 mM 농도의 인산염 완충 염수(PBS)를 포함하는, Serpinc1 유전자의 발현을 억제하기 위한 약학적 조성물로서,
    약학적 조성물의 pH는 약 6.8 내지 약 7.2이고,
    dsRNA 작용제는 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 센스 가닥 및 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 안티센스 가닥을 갖고,
    a, g, c, 및 u는 2'-O-메틸(2'-OMe) A, G, C, 및 U이고; Af, Gf, Cf, 및 Uf는 2'-플루오로 A, G, C, U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고,
    리간드는 링커를 통해 센스 가닥의 3' 말단에 컨쥬게이트되고, 리간드 및 링커는 하기 구조
    Figure pct00060

    를 갖고,
    dsRNA 작용제는 유리산 형태인, 약학적 조성물.
  40. 약 106 mg/mL 농도의 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 작용제 및 약 5 mM 농도의 인산염 완충 염수(PBS)를 포함하는, Serpinc1 유전자의 발현을 억제하기 위한 약학적 조성물로서,
    약학적 조성물의 pH는 약 6.8 내지 약 7.2이고,
    dsRNA 작용제는 5'-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3'(SEQ ID NO:941)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 센스 가닥 및 5'-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3'(SEQ ID NO:960)의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 안티센스 가닥을 갖고,
    a, g, c, 및 u는 2'-O-메틸(2'-OMe) A, G, C, 및 U이고; Af, Gf, Cf, 및 Uf는 2'-플루오로 A, G, C, U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고,
    리간드는 링커를 통해 센스 가닥의 3' 말단에 컨쥬게이트되고, 리간드 및 링커는 하기 구조
    Figure pct00061

    를 갖고,
    dsRNA 작용제는 염 형태인, 약학적 조성물.
  41. 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 약 2℃ 내지 약 8℃에서 저장될 때 약 36개월까지 안정한, 약학적 조성물.
  42. 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 약 25℃ 및 60% 상대 습도(RH)에서 저장될 때 약 36개월까지 안정한, 약학적 조성물.
  43. 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 약 40℃ 및 75% 상대 습도(RH)에서 저장될 때 약 6개월까지 안정한, 약학적 조성물.
  44. 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 순도 비-변성 IPRP-HPLC에 의해 결정하는 경우 약 95.0 면적% 이상(NLT)의 듀플렉스 및 약 5 면적% 이하(NMT)의 단일 가닥을 포함하는, 약학적 조성물.
  45. 제34항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 순도 변성 AX-HPLC에 의해 결정하는 경우 약 85.0 면적% 이상(NLT)의 총 단일 가닥을 포함하는, 약학적 조성물.
  46. 제34항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 순도 변성 IPRP-HPLC에 의해 결정하는 경우 약 80.0 면적% 이상(NLT)의 총 단일 가닥을 포함하는, 약학적 조성물.
  47. 제34항 내지 제46항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 포함하는, 바이알.
  48. 제47항에 있어서, 약 0.5 ml 내지 약 2.0 ml의 약학적 조성물을 포함하는, 바이알.
  49. 제48항에 있어서, 약 0.8 ml의 약학적 조성물을 포함하는, 바이알.
  50. 제34항 내지 제46항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 포함하는, 시린지.
  51. 제50항에 있어서, 1 ml 시린지인, 시린지.
  52. 제50항에 있어서, 3 ml 시린지인, 시린지.
  53. 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 29G 니들을 포함하는, 시린지.
  54. 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 30G 니들을 포함하는, 시린지.
  55. 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 프리-필드 시린지인, 시린지.
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