PT98562B - Processo para a preparacao de composicoes que compreendem sequencias de nucleo-sidos com cerca de 6 a cerca de 200 bases resistentes a nucleases - Google Patents

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE

COMPOSTOS QUE COMPREENDEM SEQUÊNCIAS DE NUCLEÓSIDOS COM CERCA DE 6 A CERCA DE 200 BASES RESISTENTES A NUCLEASES.

Descrição

Âmbito Técnico

A presente invenção refere-se a compostos e a métodos para inibir a expressão de genes. Os compostos da presente invenção englobam: 1) sequências oligonucleotidicas com, aproximadamente, 6 a 200 bases, que possuem uma ligação internucleosídica constituída por três átomos ou 2) sequências oligonucleotídicas com, aproximadamente, 9 a 200 bases, que possuam um diol numa ou nas duas extremidades.

Antecedentes da Presente Invenção

E.I. “

Um composto anti-sentido consiste num composto que se

liga ou se hibridiza com uma sequência nucleotídica num ácido nucleico. ARN ou ADN, para inibir a função ou síntese do referido ácido nucleico. Devido à sua capacidade para se hibridizar quer com o ARN, quer com o ADN, os compostos anti-sentido podem interferir na expressão genética, ao nível da transcrição, do processamento do ADN e da tradução.

Podem oonceber-se e sintetizar-se moléculas anti-sentido para evitar a transcrição de genes específicos para o mARN, por hibridizaçâo com ADN genómico e, inibindo, directa ou indirectamente, a acção da ARN-polimerase. Uma das vantagens do alvejamento do ADN reside no facto de serem necessárias ape^ nas pequenas quantidades de compostos anti-sentido para se alcançar um efeito terapêutico. Como alternativa, podem conceber-se e sintetisar-se os compostos anti-sentido, para se hibridizarem com ARN de modo a inibir os mecanismos de modificação pós-transcricional (processamento do ARN) ou a sintese proteica (tradução). Citam-se como exemplos de ARNs alvo, o ARN mensageiro, (mARN), o ARN de transferência (tARN), o ARN ribossómico (rARN) e similares. Como exemplos de mecanismos de processamento e tradução, podem citar-se a junção do pré-mARN para remover os intrões, o tamponamento da extremidade 5’ do mARN, a paragem de hibridizaçâo e, a hidrólise do mARN mediada por nucleases.

No entanto, actualmente, o desenvolvimento oientífioo e as aplicações terapêuticas das tecnologias anti-sentido encontram-se perante diversos problemas de ordem técnica. Klausner, A., Biotechnology, 8:303-30^ (1990). As moléculas anti-sentido, de síntese, são susceptíveis de se degradarem rapidamente por acção das nucleases que existem nas células alvo. As sequências oligonucleosídicas de ADN ou de ARN anti-sentido, por exemplo, são destruídas pelas exonucleases que actuam quer na extremidade 5', quer na extremidade 3', do ácido nucleico. Para além disto, as endonucleases podem clivar o ADN ou ARN, ao nível das ligações fosfodiester internas, entre nucleósidos individuais. Como resultado desta clivagem, o tempo medio de vida eficaz dos compostos anti-sentido administrados é muito reduzido, sendo necessária a utilização de grandes dosagens frequen2 temente administradas.

Um outro problema, reside no custo extremamente elevado da produção de ADN ou de ARN anti-sentido, utilizando os sintetizadores de ADN semi-automáticos disponíveis. Calculou-se, recentemente, que o custo da produção de um grama de ADN anti-sentido era de aproximadamente $100 000. Armstrong, L., Business Week, March 5, 1990, página 89.

Um outro problema, encontra-se relacionado com a libertação de agentes anti-sentido, nos alvos desejados, no interior do corpo ou das células. Os agentes anti-sentido para alvejamento do ADN genómico, têm de atingir o núcleo (isto é, os agentes têm de atravessar as membranas plasmática e nuclear).

No entanto têm de existir um equilíbrio entre a necessidade de uma maior permeabilidade de membrana (aumento de hidrofobicidade) e a necessidade de solubilidade aquosa, (aumento de hidrofilicidade) nos compartimentos fluídicos orgânicos, tais como o plasma e o citossol celular.

Existe ainda um outro problema, associado com a estabilidade dos agentes anti-sentido, no caso de se encontrarem livres no organismo ou no caso de se encontrarem hibridizados com ácidos nucleicos alvo. As sequências oligonuletídicas, tais como o ADN anti-sentido, têm tendência a formarem reconfigurações estereoquímicas em torno de centros fosforosos quirais.

Atingir os genes através de agentes anti-sentido constitui o inevitável passo seguinte nas acções terapêuticas em seres humanos. Armstrong, Supra, 88. A aplicação bem sucedida da tecnologia anti-sentido para o tratamento de doenças, requer , contudo que se encontrem soluções para os problemas anteriormente indicados.

Uma das abordagens para a preparação de compostos anti-sentido, que sejam estáveis, resistentes às nucleases, de produção pouco dispendiosas e que possam ser libertados e hibridizados com alvos de ácido nucleico, ao longo do organismo, consiste em sintetizar sequências oligonucleotídicas com modificações na estrutura principal normal, fosfato-açúcar.

Referiram-se, dum modo geral, dois tipos de sequências oligonucleosídicas, com a parte principal modificada. 0 primeiro tipo, englobava modificações na ligação internucleosídica fosfodiester normal. 0 segundo tipo englobava a substituição da ligação fosfodiester por ligações internucleosídicas não fosfatadas. Uhlmann, E e Peyman, A. Chemical Reviews, 9(4):544-584 81990).

As ligações fosfodiester modificadas, referidas até agora, consistem em fosforotioatos, alquil-fosfo-triesteres, metil-fosfonatos e alquil-fosforamidatos.

Ligações fosfodiester modificadas em fosforotioato significam pontes fosfodiester nas quais um ou mais dos átomos de oxigénio que constituem a ponte se encontram substituídos por enxofre. No entanto estas ligações não são adequadas para utilização em compostos anti-sentido. A retenção do centro fosforoso quiral origina a variação esterioquimica dos monotioa tos. Para além disso, os mono- e ditioatos não necessitam da hibridização específica de sequências e são rápidamente eliminados pelo plasma. A elevada afinidade dos fosforotioatos para o vidro e plástico também dificulta e torna ineficaz a sintese destes compostos.

Preparou-se metil-fosfo-triesteres e etil-fosfo-triesteres fazendo reagir os oligonucleosidos ligados a fosfodiester com metanol ou etanol anidros. Miller, P.S. e outros.,

J. Am. Chem. Soo., 93:6657-6665 (1971).

A ligação triester em etil-fosfo-triesteres oligodesoxiribonucleotídicos é estável em condições de pH fisiológico normal, apesar de poder ser hidrolisável por um ácido ou base fortes.

Os metil-fosfo-triesteres são menos estáveis do que os etil-fosfo-triesteres e outros alquil-fosfo-triesteres, a pH neutro, tornando possível a substituição nucleofílica do grupo metilo do triester pelo solvente. Os etil-fosfo-triesteres oligo-desoxi-ribonucleotídicos parecem ser totalmente resistentes à hidrólise efectuada pelas exonucleases e não são hidrolizados

pelas nucleases ou estearases que se encontram no soro de feto de bovino ou no soro do sangue humano. Uhlmann, supra.

Os metil-fosfonatos possuem deficiências significativas em termos de potencial terapêutico, incluindo, fraca solubilidade na água, centros quirais fosforosos, incapacidade de controlo da sintese estereo-selectiva de alto rendimento, rápida eliminação do plasma e excreção urinária.

Os fosforamidatos oligo-desoxi-ribonucleotídicos possuem pontes internucleosídicas contendo pontes azoto-fósforo. Podem preparar-se estes análogos de ácidos nucleicos a partir de compostos intermédiários de fosforamidite ou por oxidação dos compostos intermédios H-fosfonados na presença de uma amina primária ou secundária. A preparação de análogos e a reacção de oxidação podem ser fácilmente efectuadas num sintetizador comercial de ADN.

Foram sintetizadas e referidas, diversas sequências oligonucleosídicas não iónicas contendo ligações internucleosídicas não fosfatadas tais como, carbonatos, acetatos, carbamatos, e derivados dialquilícos e, diaril-silílicos.

Embora a ligação carbonato seja resistente à hidrólise, por ácido, é muito mais facilmente clivada com uma base e, por isso, são necessárias precauções especiais para a remoção dos grupos protectores, na parte final da sintese. Apesar de se terem observado cordões duplos estáveis entre os análogos de poli-(dA) contendo ligações internucleotídicas carboxi-metilo e os análogos de poli(U), não se estudaram outras bases. Deste modo, não se sabe se a estabilidade na formação de cordões duplos com outras bases seria perturbada pela ligação carbonato.

Os carbamatos internucleosídicos têm vindo a ser referidos como mais solúveis na água do que outras pontes internucleosidos. A utilidade das ligações carbamato é, contudo, limitada, uma vez que os carbamatos de timina, não formam híbridos com o ADN complementar, enquanto que os carbamatos de citosina não se hibridizam com os oligomeros de guanina.

A ligação carbamato, tal como a ligação carbonato, é

estável sob condições fisiológicas. Contudo, contráriamente aos carbonatos, a ligação carbamato é estável à hidrólise por bases, uma propriedade que simplifica a sintese de olígomeros contendo esta ligação. A ligação carbamato é resistente à hidrólise por nuoleases.

Tal como as ligações carbonato e acetato, a ligação carbamato não deverá assemelhar-se à configuração da ponte internucleotídica fosfodiester. No entanto, os modelos moleculares sugerem que a ligação deverá permitir ao oligomero assumir conformações que lhe permitam formar complexos ligados por pontes de hidrogénio a ácidos nucleicos complementares. Existem referências contraditórias sobre a estabilidade dos cordões duplos formados por olígomeros ligados por carbamato a ácidos nucleicos complementares. Um oligomero ligado a um carbamato contendo seis unidades de timidina não forma complexos oom A(pA)^ ou com dA(pA)ç. Por outro lado, um oligomero ligado a um carbamato, contendo seis unidades de desoxi-citosina forma complexos estáveis com d-(pG)^ e com poli(dG).

A ligação internucleosídica de análogos de olígomeros dialquil- ou difenil-silílicos assemelha-se muito à geometria tetraédrica da ponte internucleosídica fosfo-diester normal. Preparam-se os oliígomeros em solução, fazendo reagir um nucleosido adequado, cloreto de 3’-0-dialquil- ou de difenil-silílo protegido ou um derivado de trifluoro-metano-sulfonilo com um nucleosido 3’-protegido, em piridina anidra. Pode preparar-se o primeiro composto, fazendo reagir o nucleosido 5’-0-tritilo com dialquil- ou difenil-dicloro-silano ou com bis(trifluoro-metano-sulfonil)di-isopropil-silano.

Devido ao facto das ligações dialquil- e difenil-silílicas serem sensíveis à hidrólise, pelos ácidos, deve tomar-se todo o cuidado na escolha dos grupos de protecçâo, para a sintese. Ogilvie e Cormier referiram dímeros e hexâmeros nucleosídicos que possuíam ligações internucleosídicas de siloxano e um método para a sintese destes polímeros. Ver, por exemplo, Ogilvie, K.K: e Cormier, J.F., Tetrahedron Letters, 26(35):

• 4159-4162 ( 1985); Cormier J.F. e Ogilvie, K.K. , Nucleic Acids

Research, 16(10):4503-4594 (1988).

Embora as sequências oligonucleosídicas ligadas por carbonatos, carbamatos e sililo possuam a necessária resistência às nucleases Para os tornarem candidatos atraentes como reagentes anti-sentido, ainda não foi feita qualquer referência à sua capacidade para funcionarem deste modo. Para além disso, também não foi referida a capacidade destes olígomeros para serem incorporados pelas células em cultura. Uma das potenciais desvantagens destes olígomeros reside na sua já referida baixa solubilidade em meio aquoso. Não se encontra totalmente claro se se podem obter concentrações suficientes, para os tornar eficazes em ensaios biológicos, apesar de se poder, presumivelmente, aumentar a solubilidade pela introdução, nas moléculas, de grupos hidrofílicos.

A presente invenção proporciona compostos análogos aos nucleótidos, composições que englobam esses compostos, compostos intermediários para a preparação desses compostos e métodos para a sintese destes análogos oligonucleotídicos novos, estáveis resistentes às nucleases, específicos dos alvos e, lipossolúveis.

Resumo da Presente Invenção

A presente invenção proporciona compostos análogos de oligonucleotidos constituídos por sequências oligonucleosídicas com aproximadamente 6 a 200 bases, e que possuem uma ligação internucleosídica constituída por três átomos. A ligação internucleosídica de tais sequências oligonucleosídicas possui a fór mula:

-D-D-Dem que o símbolo D representa, Individual e independentemente, o grupo CHR, o átomo de oxigénio ou o grupo NR°, em que o radical R representa, independentemente, o átomo de hidrogénio, os grupos OH, SH ou NH₂ > o radical r6 representa 0 átomo de hidrogénio ou 0 grupo alquilo(C₁-C₂), desde que apenas um dos símbolos D represente o átomo de oxigénio ou o grupo NR^.

- 7 De acordo com um aspecto preferencial, as sequências oligonucleosídicas englobam bases seleccionadas entre o grupo constituído por adenina, citosina, guanina, uracilo, timina e suas modificações.

De um modo mais específico, os compostos da presente invenção englobam sequências oligonucleosídicas de fórmula I:

em que o símbolo w representa -D-D-D-, em que o símbolo D representa, individual e independentemente, o grupo CHR, o átomo de oxigénio ou o grupo NR , em que o radical R representa, independentemente, o átomo de hidrogénio, os grupos OH, SH ou NH o radical R^ representa o átomo de hidrogénio ou o grupo alqui lo(C^-C₂), desde que apenas um dos símbolos D represente o áto mo de oxigénio ou o grupo NR^;

o símbolo w’ represente individual e independentemente w ou

II

-0-P-0-;

I θ 0 o radical R^ representa individual e independentemente os grupos OH, SH, NR²R3 , em que os radicais R² e r3 representam in- 8 -

dependentemente, o átomo de hidrogénio ou o grupo alquilo(C^-Cg) ou o grupo NHR^, em que o radical R^ representa o grupo aciloíC^-C^) ?

o símbolo y representa, individual e independentemente o átomo de H ou o grupo OH;

o simbolo B representa individual e independentemente, adenina, oitosina, guanina, timina, uracilo ou uma modificação das referidas bases;

o simbolo j representa um número inteiro de 1 a aproximadamente 200;

o símbolo k representa o átomo de 0 ou um número inteiro de 1 a, aproximadamente 197; e o símbolo q representa o átomo de 0 ou um número inteiro de 1 a aproximadamente 197, desde que a soma de j + k + q se encontre compreendida entre oerca de 4 e oeroa de 200.

I _Λ

Os compostos da presente invenção englobam sequeneias oligonucleotídicas ou sequências oligonucleosídicas que possuem, eventualmente, um grupo diol numa ou em ambas as extremidades .

Os dióis preferenciais são os 1,2-dióis (glicóis). Como exemplos de glicois podem citar-se os poli-alquileno-glicois, de preferência os poli-etileno-glicois ou os poli-propileno-glicois. Os glicois preferenciais são o tetra-etileno-glicol e o hexa-etileno-glicol. Os glicois adequados podem também englobar poliois que possuem todos os grupos hidroxilo bloqueados, com excepção de dois.

Se os compostos da presente invenção forem constituídos por sequências oligonucleosídicas que possuem um diol numa ou em ambas as extremidades, os compostos da presente invenção possuirão a fórmula II:

em que o símbolo Z representa individual e independentemente o radical R’ ou

0 ¹¹

R - (C((j:H)_pO]_n! -P- O)_e([(ÇH)_p-O]_n-P-O)_f-;

R⁵ 0® R⁵ 0®

*J em que o radical R representa individual e independentemente 2 3 os grupos OH, SH, NHR R , ou o grupo alquilo(C^-Cg), ou o grupo NHR¹¹', em que o radical representa o grupo acilo (C_fC₁₂);

o radical R^ representa individual e independentemente o átomo de hidrogénio ou o grupo alquilo (C^-C^) 5

Os símbolos w, w’, Y, B, j, k e q, possuem as significações anteriormente referidas;

os símbolos e e f, representam individual e independentemente um número entre 0 e 50 desde que pelo um deles, e ou f seja, pelo menos igual a 1;

os símbolos, m e n representam individual e independentemente um número de 1 a 200; e o símbolo p representa individual e independentemente, um número de 2 a 4.

De acordo com um aspecto preferencial, a soma de

j + k + q será, aproximadamente, de 9 e 50 bases, preferencialmente de aproximadamente 12 a 25 e, mais preferencialmente de 15 a 18. De acordo com este aspecto, os compostos da presente invenção englobam oligonucleótidos de fórmula:

II

R- ([(CH) 01 -P[(CH) 0] ) (0 , ρ n e ll

-pR¹

0)_e([(CH)_D0]_n -P- O)f[oligo CN)3(0 -PI I I

R¹ 0® 0® [O(CH)_p]_m)_f -R;

em que o radical R representa os grupos 0H, SH, NR^r3 _em que os radicais R² e R^ representam, de modo independente o átomo de hidrogénio ou o grupo alquilo(C<|-Cg) , ou o grupo NHR\ em que o radical R^ representa o grupo acilo (C^-C^) >

o radical R^ representa o átomo de hidrogénio ou o grupo alquilo (C -j — C «i £), oligo (N) representa uma sequência oligonucleotídica natural ou modificada com, aproximadamente, 9 a 200 bases; os símbolos e e f representam, individual e independentemente um número inteiro entre 0 e 50, desde que, pelo menos um dos símbolos e ou f representem, pelo menos, 1; os símbolos m e n representam independentemente um número inteiro entre 1 e 200; e o símbolo p representa individual e independentemente um número entre 2 e 4.

De acordo com um aspecto preferencial, o oligonucleotido contém, numa sequência homopolimérica ou heteropolimérica, qualquer das combinações de dA, dC, dG, T.

Se o glicol for um poli-etileno-gliool, os compostos deste aspecto englobarão oligonucleótidos com a fórmula:

0 h ii

R- [(CH₂CH₂0)_m -P- 0]_e[oligo(N)][0 -P- (0CH₂CH₂)_n]_f -R;

em que o radical representa os grupos OH, SH, Nr2r3_{? em} q_{Ue os} radicais R² e R^ representam, independentemente, o átomo de hidrogénio, o grupo alquilo(C>|-Cg) ou o grupo NHr\ em que o radical representa o grupo acilo(C^-C^₂);

oligo(N) representa uma sequência oligonucleotidica de aproximadamente 9 a 50 bases;

os símbolos e e f representam, independentemente um número entre 0 e 50, desde que pelo menos, um dos símbolos e e f, represente 1 ;

os símbolos m e n representam, independentemente um número entre 0 e 200, desde que, pelo menos, um dos símbolos m e n represente um número entre 1 e 200.

Os oligonucleótidos da presente invenção podem englobar grupos de ligação internucleosídica conhecidos, tais como os grupos fosfodiester, sililo, e outros grupos de ligação bem conhecidos, desde que contenham uma quantidade eficaz de grupos de ligação de tipo -D-D-D- da presente invenção e/ou grupos terminados em diol, da presente invenção.

A presente invenção também se refere a dímeros nucleosídicos, com a fórmula:

em que o símbolo w representa -D-D-D-, em que o símbolo D representa, individual e independentemente o átomo de hidrogénio, os grupos OH, SH, NH₂ , o radical R^ representa o átomo de hidrogénio ou o grupo alquilo(C^-C₂), desde que apenas um dos símbolos D represente o átomo de oxigénio ou o grupo NR^; o símbolo B representa, individual e independentemente, adenina, citosina, guanina, timina, uracilo ou modificações destas;

• o radical R^ representa o grupo OH, t-butil-dimetil-sililoxi,

ou uma fosforamidite e o radical R⁸ representa um grupo OH, um grupo de protecção ou um grupo t-butildimetil-sililoxi.

A presente invenção, proporciona, para além disso, um método para inibir a degradação pelas nucleases dos compostos que englobam sequências oligonucleotidicas. Este método engloba a ligação de um diol a uma ou a ambas as extremidades 5’ e 3’ do referido composto. Ligam-se os diois à extremidade 5’ e/ou à extremidade 3', fazendo reagir os compostos oligonucleotídicos com uma alcoxi-tritil-diol-ciano-fosfina ou com uma mono-metoxi-tritil-glicol-ciano-fosfina.

A presente invenção, proporciona, para além disso, um método para inibir a degradação pelas nucleases dos compostos nucleotidicos originais ou modificados, constituídos por sequências oligonucleotidicas preparadas, que possuem, de aproximadamente δ aproximadamente 200 bases, com uma ligação internucle osídica constituída por três átomos, e que possui a fórmula -D-D-D-, tal como se definiu antes.

A presente invenção proporciona, também, composições úteis para a inibição da expressão dos genes que englobam compostos constituídos por sequências oligonucleosídicas de, aproximadamente 6 a aproximadamente 200 bases, com uma ligação internucleosídica constituída por três átomos, tal como anteriormente se referiu e, um veículo aceitável do ponto de vista fisiológico. Os compostos podem possuir um diol, numa ou em ambas as extremidades. Os diois preferenciais são os poli-etileno-glicois.

A presente invenção proporciona, para além disso, um método para inibir a expressão dos genes, que consiste em administrar a um mamífero, que necessite de tal tratamento, uma quantidade eficaz de um composto constituído por uma sequência oligonucleosídica com aproximadamente 6 a 200 bases, que possua uma ligação internucleosídica constituída por três átomos, tal como se referiu anteriormente. Os compostos podem possuir um diol numa ou em ambas as extremidades. Os diois preferenciais são os poli-etileno-glicois.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1a apresenta um passo de síntese para a preparação de um aldeído nucleosídico (Composto I).

A Figura 1b, apresenta um passo de sintese para a preparação do nucleósido iodeto de fosfónio (Composto II).

A Figura 2, apresenta, um passo de síntese para a preparação de dímeros nucleosídicos conectados por uma ligação internucleosídica constituída por três átomos de carbono, utilizando o aldeído nucleosídico e o nucleósido iodeto de fosfónio, respectivamente, das Figuras 1a e 1b.

A Figura 3, apresenta um passo de síntese para a preparação de um dímero de timidina, utilizando um aldeído de timidina e um iodeto de fosfónio-timidina (respectivamente, Composto I e II).

A Figura 4, apresenta um passo de síntese para a preparação de um dímero nucleosídico conectado por uma ligação internucleosídica constituída por dois átomos de carbono e um de azoto, de tipo 3’-C-C-N-5’. Sintetizaram-se os dímeros fazendo reagir os nucleósidos que contém funcionalidades aldeído (CHO) com nucleósidos que contém funcionalidades amina (NH₂), sob condições redutoras.

A Figura 5, apresenta um passo de síntese para a preparação de um dímero nucleosídico conectado por uma ligação internucleosídica constituída por dois átomos de carbono e um de azoto, de tipo 3’-N-C-C-5’. Sintetizaram-se os dímeros fazendo reagir os nucleósidos que possuíam funcionalidade aldeído e ami na, sob condições redutoras.

A Figura 6, apresenta um passo de síntese para a preparação de um dímero de timidina conectado por uma ligação internucleosídica constituída por dois átomos de carbono e um de azoto, de tipo 3’-C-C-N-5’. Sintetizaram-se os dímeros fazendo reagir timidinas que contêm funcionalidade aldeído (CHO) com timidinas que contém funcionalidades amina (NH₂), sob condições redutoras.

A Figura 7, apresenta um passo de sintese para a preparação de um dímero de timidina conectado por uma ligação internucleosídica constituída por dois átomos de carbono e um de azoto, de tipo 3’-N-C-C-5’. Sintetizaram-se os dímeros fazendo reagir timidinas que contêm funcionalidades aldeído, com timidinas que contém funcionalidades amina, sob condições redutoras .

Descrição Pormenorizada da Presente Invenção

Os compostos da presente invenção, consistem, geralmente, em sequências oligonucleotidicas ou oligonucleosídicas que são resistentes à degradação pelas nuoleases.

De acordo com o modo, segundo o qual se utiliza, na presente invenção, o termo ’'nucleósido’'refere-se à combinação de uma base púrica ou pirimidinica com um açúcar de cinco carbonos (pentose).

De acordo com o modo seguindo o qual é utilizado, na presente invenção, o termo nucleótido, refere-se a um éster de ácido fosfórico de um nucleósido.

De acordo com o modo segundo o qual se utiliza na presente invenção, o termo oligonucleótido refere-se a poli-nucleótidos que possuam apenas ligações internucleosídicas fosfodiester, como por exemplo, ADN ou ARN nativos.

Como exemplo de nucleósidos podem citar-se a adenina (A), a guanosina (G), a citidina (C), a uridina (U), a desoxi-adenosina (dA), a desoxi-guanosina (dG), a desoxi-citidina (dC) e a timidina (T).

Os compostos da presente invenção, englobam sequências oligonucleosídicas com, aproximadamente, 6 a 200 bases, que possuem uma ligação internucleosídica fosfodiester uma ligação internucleosídica constituída por três átomos. Uma ligação internucleosídica constituída por três átomos (-D-D-D-) contém 1) três átomos de carbono; 2) dois átomos de carbono e • um átomo de oxigénio, ou 3) dois átomos de carbono e um átomo • de azoto.

As sequências oligonucleosídicas são sequências de nucleósidos nativos ou modificados. Tal como se utiliza na presente invenção, a frase ligação internucleosídioa” refere-se a átomos e a moléculas que formam uma ponte entre o átomo de carbono da porção açúcar, na posição 3 de um nucleósido nativo ou modificado e o átomo de carbono da porção açúcar, na posição 5 de um nucleósido idêntico adjacente. A porção açúcar pode consistir numa ribose ou numa desoxi-ribose ou num seu análogo. Deste modo, os nucleósidos englobam A, C, G, U, dA, dC, dG, T ou suas modificações, oomo por exemplo, 5-bromo ou 5-iodo-uraoilo, 5-metil-citosina, isocitosina (2-amino-4-oxo-pirimidina), isoguanina (2-oxo-6-amino-purina), inosina (6-oxo-purina), 5-vinil-uracilo e 5-vinil-citosina.

A ligação internucleosídioa oom três átomos possui a fórmula:

-D-D-D-

em que o símbolo D representa, individual e independentemente o grupo CHR, o átomo de oxigénio ou o grupo NR^, em que o radical R representa, independentemente o átomo de hidrogénio, os grupos OH, SH ou o grupo NH₂, o átomo de oxigénio, o radical R^ representa o átomo de hidrogénio ou o grupo alquilo C^-C₂, desde que apenas um dos símbolos D represente o átomo de oxigénio ou o grupo NR^.

Os compostos da presente invenção englobam sequências oligonucleosídicas de fórmula I:

I em que o símbolo w representa -D-D-D-, em que o símbolo D representa, individual e independentemente, o grupo CHR, o átomo de oxigénio ou o grupo NR , em que o radical R representa, independentemente, o átomo de hidrogénio, os grupos OH, SH ou o grupo NH₂, o radical representa o átomo de hidrogénio ou o grupo alquilo C.-Cp desde que apenas um dos símbolos D repreA sente o átomo de oxigénio ou o grupo NR ;

o simbolo w’representa individual e independentemente w ou

-0-P-0-;

em que o radical R representa independentemente os grupos OH, o q 2 8

SH, NR R-¹ , em que os radicais R e R-’ representam independentemente o átomo de hidrogénio ou o grupo alquilo C^-Cg ou o grupo NHR^ em que o radical R^ representa o grupo acilo C^-C^₂; o simbolo y representa individual e independentemente o átomo de H ou o grupo OH;

o símbolo B representa, individual e independentemente adenina, citosina, guanina, timina, uracilo ou as suas modificações; o símbolo j representa um número inteiro de 1 a, aproximadamente 200;

o símbolo k representa um número inteiro de 1 a cerca de 197; e o símbolo q representa 0 ou um número inteiro de 1 a cerca de 197j desde que a soma de j + k +.q seja, igual a 4 ou aproximadamente igual a 4.

De acordo com um aspecto preferencial, a soma de j + k + q encontra-se compreendida entre, aproximadamente, 9 e 50. De acordo com um aspecto a que se dá, ainda, maior preferência, a soma de j = k + q eneontrar-se-à compreendida entre, aproximadamente, 12 e 25 e, preferencialmente, entre aproximadamente 15 e 18.

Os compostos da presente invenção, podem possuir um diol numa ou em ambas as extremidades. Os diois preferenciais são os glicois, também designados por 1,2-diois, que contêm dois grupos hidroxilo nos carbonos adjacentes. Os glicois preferenciais, são os poli-alquileno-glicois. 0 termo alquileno”, de acordo com a forma segunda a qual é utilizado na presente invenção, refere-se a radicais de cadeia linear ou ramificada que possuem 2 a 4 átomos de carbono, que podem ser eventualmente substituídos. Tal como se definirá na presente invenção. Como Exemplo destes radicais podem citar-se o etileno, o propileno, o isobutileno e, similares. Os poli-alquileno-glicois preferenciais são os poli-etileno-glioois tais como o hexa-etileno-glicol e o tetra-etileno-glicol. Os dióis adequados também podem englobar poliois que possuam todos os grupos hidroxilo bloqueados com excepção de dois.

Os diois encontram-se ligados quer à extremidade 5’, quer à extremidade 3’ ou a ambas as extremidades dos oligonucleósidos através de ligações fosfo-diester. De acordo com um dos aspectos, os diois, ligam-se, apenas, a uma extremidade de uma sequência oligonucleosídica.

Liga-se o diol terminal o grupo constituído por hidroxilo (NH₂), alquil-amino (NH-alquilo), amido (NH[acilo]).

uma porção seleccionada entre (OH), sulfidrilo (SH), amino di-alquil-amino (N[alqui]₂) θ

Se os glicois se encontrarem presentes numa ou em am18 bas as extremidades, os compostos da presente invenção englobarão sequências oligonucleosídicas, de fórmula II:

II em que o símbolo Z representa, individual e independentemente, R ’ ou

0 _q 11 (l

R - ([(CH)_pO]_m -P- O)_e([(CH)_p-O]_n-P-O)_f-;

R1 em que o radical R representa, individual e independentemente, os grupos OH, SH, NHR^R^, em que os radicais R^ e R^ representam, independentemente, o átomo de hidrogénio ou o grupo alquilo C^-Cg ou o grujDO NHR^, em que o radical R representa o grupo acilo C^C^;

o radical R^, representa, individual e independentemente, o átomo de hidrogénio ou o grupo alquilo C^-C^j os símbolos w, w’, Y, B, j, K e q, possuem as significações anteriormente definidas;

os símbolos e e f, representam independentemente um número inteiro entre 0 e 50, desde que, pelo menos um dos símbolos e e f, represente, pelo menos 1;

os símbolos men representam, individual e independeatemente um número inteiro entre 1 e 200; e o símbolo p, representa, individual e independentemente um número inteiro, de 2 a 4.

De acordo com um aspecto preferencial, os símbolos m e n representam independentemente, um número inteiro entre 1 e 6 e a soma de j + k + q encontra-se compreendida entre, aproximadamente, 9 e 50. De acordo com um aspecto a que se dá, ainda, maior preferência, a soma de j + k + q encontrar-se-à compreendida entre, aproximadamente, 12 e 25 e, mais preferencialmente, entre aproximadamente 15 e 18.

De acordo com um aspecto preferencial, os compostos da presente invenção englobam sequências oligonucleòtídicas com aproximadamente 9 a 200 bases, que possuem um diol numa ou em ambas as extremidades. De acordo, ainda com um outro aspecto preferencial, os compostos da presente invenção englobam sequências oligonucleotídicas com, aproximadamente, 9 a 200 bases, que possuem uma ligação (-D-D-D-), de acordo com a presente invenção .

Os diois preferenciais são os glicois, também designados por 1,2-diois, que contêm dois grupos hidroxilo nos carbonos adjacentes. Os glicois preferenciais, são os poli-alquileno-glicóis. 0 termo alquileno, de acordo oom a forma segunda a qual é utilizado na presente invenção, refere-se a radicais de cadeia linear ou ramificada que possuem 2 a 4 átomos de carbono, que podem ser eventualmente substituídas, tal como se definirá na presente invenção. Como Exemplo destes radicais podem citar-se o etileno, o propileno, o butileno e, similares.

Os poli-alquileno-glicóis preferenciais são os poli-etileno-glicóis. Dá-se, ainda maior preferência, ao tetra-etileno-glicol e ao hexa-etileno-glicol.

Os dióis encontram-se ligados quer à extremidade 5’, quer à extremidade 3’ ou a ambas as extremidades dos oligonucleótidos através de ligações fosfodiester. De acordo com um dos aspectos, os dióis, ligam-se, apenas, a uma extremidade de uma sequência oligonucleotídica.

Liga-se o diol terminal a um radical seleccionado entre o grupo constituído por hidroxilo (OH), sulfidrilo (SH), amino (NH£), alquil-amino (NH-alquilo), di-alquil-amino (NEalquil^) e amido (NHEacilo]). De acordo com a presente invenção o termo alquilo” refere-se a radicais de cadeia linear ou ramificada que possuem de 1 a 12.átomos de carbono que podem ser, eventualmente, substituídos como anteriormente definido.

Como exemplos de radicais alquil- e dialquil-amino, podem citar-se os grupos metil-, etil-, propil-, butil-, pentil-, hexil-, dimetil-, dietil-, dipropil-, dibutil-, dipentile dihexil-aminas e, similares. De acordo com a presente invenção. NH (acilo) ou amido refere-se a radicais de cadeia linear ou ramificada, que possuem de 1 a 12 átomos de carbono, com um grupo terminal 0=CNH2· Como exemplos de radicais amino, refere-se a metanamida, a etanamida, a propanamida, a butanamida, pentanamida, hexanamida, heptanamida, octanamida, nonanamida, decanamida, undecanamida e dodecanamida.

De acordo com um outro aspecto, os compostos da presente invenção englobam sequências oligonucleotidicas de fórmula:

0 0

H U U

R- ([(CH)_pO]_m -Ρ- 0)_θ([(CH)_pO]_n -P- 0)_f[oligo (N)](0 -P11 lo 11 I λ I „

R¹ 0® R¹ 0^θ 0® n

E(CH)_pO]_n)_e(O -^p- tO(CH)_p]_m)_f -R; l 4 l ft

2 em que o radical R representa os grupos OH, SH, NHR R^J, em que os radicais R^ e R^{2 * * * * * 8} representam, independentemente, o átomo de hidrogénio, ou o grupo alquilo C^-Cg, ou o grupo NHR^, em que o radical R^ representa o grupo acilo C^-C₁₂;

o radical R*' representa o átomo de hidrogénio ou o grupo alquilo C1 - C1 ;

oligo(N) representa uma sequência oligonucleotídica nativa ou modificada com, aproximadamente 9 a 200 bases;

os símbolos e e f representam, individual e independentemente, um número inteiro de 0 a 50;

os símbolos m e n, representam, individual e independentemente, um número inteiro de 1 a 200; e, o símbolo p, representa individual e independentemente um número inteiro de 2 a 4.

A sequência oligonucleotidica é, preferencialmente, uma sequência homopolimérica ou heteropolimérica, contendo qualquer das combinações de dA, dG, dC, T ou dos seus análogos.

De acordo com um aspecto preferencial, os símbolos m e n, representam independentemente um inteiro de 1 a 8 e, mais preferencialmente, os símbolos m e n representam ambos 4. As sequências oligonucleotídicas preferenciais contêm, aproximadamente, de 9 a 50 bases, ainda mais preferencialmente, entre, aproximadamente, 12 e 25 bases e, dum modo a que se dá maior preferência, entre, aproximadamente 15 e 18 bases.

De acordo com um aspecto preferencial, os compostos anti-sentido, possuem um grupo poli-etil-alqulleno-glicol em ambas as extremidades 3’ e 5’ e, possuem a fórmula:

O)_e([(CH)_pO]_n

-P- 0)_f[oligo

U (N)](0 -XÓ®

0® [(CH)_pO]_n)_e(O ll

-p[O(CH)_p]_m)_f -R;

em que o radical R representa os grupos 0H, SH, NHR²R^} em qUe os radicais R² e R^ representam, independentemente o átomo de hidrogénio, ou o grupo alquilo C^-G^, ou o grupo NHR^ , em que o radical R¹* representa o grupo acilo C·,-C^2;

o radical representa o átomo de hidrogénio ou o grupo alquilo C1 —C1₂;

oligo(N) representa uma sequência oligonucleotidica nativa ou modificada com, aproximadamente, 9 a 200 bases;

os símbolos e e f representam, individual e independentemente um número inteiro de 1 a 50;

os símbolos m e n representam, individual e independentemente um número inteiro de 1 a 200; e o símbolo p, representa, individual e independentemente, um número inteiro de 2 a 4.

No caso do glicol, consistir num poli-etileno-glicol, os compostos deste aspecto englobam oligonucleótidos de fórmula:

RE(CH₂CH₂0)_m

II

-P0

0]_e[oligo(N)][0 -P- (0CH₂CH₂)_n]_f -R;

Ó®

0® em que o radical R representa os grupos 0H, SH, NHR²r3, em que os radicais R² e r3 representam, independentemente o átomo de hidrogénio, ou o grupo alquilo C^-Cg, ou o grupo NHR\ em que o radical R^ representa o grupo acilo C^-C^j oligo(N) representa uma sequência oligonucleotidica nativa ou modificada com, aproximadamente 9 a 50 bases; e os símbolos e, f, m e n, representam, individual e independentemente um número de 1 a 50;

De tido contém, qualquer das acordo com um aspecto preferencial, o oligonucleónuma sequência homopolimérioa ou heteropolimérioa combinações de dA, dC, dG, T.

De acordo com outros aspectos preferenciais, o poli-etileno-glicol consiste em tetra-etileno-glicol (TEG) e os símbolos m e n representam o número 4 ou consiste em hexa-etileno-glicol e tanto m como n representam 6.

Os compostos da presente invenção são úteis como agen tes anti-sentido. Os agentes anti-sentido hibridam-se com uma sequência nucleotídica complementar num ácido nucleico alvo para inibir a função tradução ou a função transcrição do referido ácido nucleico alvo. 0 ácido nucleico alvo pode consistir em ADN ou em ARN.

Os compostos anti-sentido da presente invenção, englo bam sequências oligonucleosídicas com aproximadamente 6 a 200 bases, que possuem sequências homopoliméricas e heteropoliméricas constituídas por bases seleccionadas entre o grupo que consiste em adenina (A), citosina (C), guanina (G), uracilo (U), timina (T) e modificações destas bases. As sequências especiais seleccionaram-se com base no alvo que se pretendia atingir. A sequência seleccionada hibrida-se com o ácido nucleico alvo. Como exemplos de alvos, podem citar-se o oncogene MYC, o oncogene RAS e os ácidos nucleicos víricos.

Podem preparar-se os compostos da presente invenção, de acordo com os seguintes procedimentos:

A. Compostos que possuem uma ligação internucleosídica constituída por três átomos de carbono

Sintetizaram-se os oligonucleótidos conectados por uma ligação internucleosídioa constituída por três átomos de carbono, fazendo reagir nucleósidos que possuem funcionalidades aldeído e ileto, respectivamente, nas posições 3’ e 6’, sob condições de Wittig.

A síntese de um aldeído nucleosídico e de um nucleósido iodeto de fosfónio, a partir de compostos comercialmente disponíveis, encontra-se ilustrada, respectivamente, nas Figuras 1 a e 1 b. Sintetiza-se o aldeído (Composto I. Figura 1a) a partir do composto conhecido, 3’-alil-3’-desoxi-5’-0-terc-butil-dimetil-silil-3’-timidina (Composto A, Figura 1). Oxida-se regio-selectivamente o composto alílico com uma quantidade catalítica de tetróxido de ósmio e de óxido de N-metilmorfolina, como co-oxidante. Cliva-se o diol resultante (Composto B, Figura 1a) com periodato de sódio para se obter o aldeído, com um rendimento quase quantiflcável.

A síntese do nucleósido iodeto de fosfónio (Composto II, Figura 1b) processa-se, a partir do nucleósido 5’-tritilado comercialmente dispnnível (Composto C, Figura 1b). Silila-se o nucleósido tritilado na posição 3’ com cloreto de terc-butil• !

• -dimetil-sililo eremoveu-se o grupo tritilo sob condições áci- 24 -

das com elevada eficiência. 0 grupo hidroxilo primário resultante (Composto E, Figura 1b) é oxidado sob condições de Swer para se obter o aldeído (Composto F, Figura 1b). Faz-se reagir, imediatamente o aldeído bruto com o ileto derivado de brometo de metil-trifenil-fosfónio para se obter o nucleósido 4’-vinil-4’-desoxi-3’-terc-butil-dimetil-sililo, oorn bom rendimento. Trata-se o composto vinílico, regio-selectivamente, com boro-hidrato para se obter um álcool primário (Composto G, Figura 1b), com bom rendimento. Converte-se, por sua vez, o álcool primário no iodeto correspondente (Composto H, Figura 1b), utilizando trifenil-fosfina-iodo, na presença de imidazolo, com excelente rendimento. Finalmente, transforma-se o iodeto no nucleósido iodeto de fosfónio desejado, utilizando trifenil-fosfina em acetonitrilo.

Prepara-se um ileto a partir do nucleósido de fosfónio, utilizando terc-butóxido de potássio, como uma base e, faz-se imediatamente reagir com o aldeído para se obter o produto de Wittig (Composto 1, Figura 2), com um bom rendimento. Hidrogena-se regio-selectivamente o produto de wittg com paládio-em-carbono, a 10$ (Pd-C a 10$), com hidrogénio à pressão atmosférica, com um rendimento quantificável, para se saturar a ponte dupla da ligação. Dessilila-se o composto saturado (Composto 2, Figura 2) com fluoreto de tetra-butil-amónio para se obter o diol (Composto 3, Figura 2). Depois, protege-se, regio-selectivamente, o hidroxilo primário da extremidade 5’ do diol com cloreto de dimetoxi-tritilo e converte-se o 3'-hidroxilo resultante (Composto 4, Figura 2) em fosforamidite (Composto 5, Figura 2), com 2-ciano-etil-N,N-di-isopropil-cloro-fosforamidite.

Conjugaram-se os dímeros nucleosídicos ou os olígomeros superiores com grupos de protecção trialquil-sililoxi, para se formarem oligonucleótidos qualquer que fosse o comprimento pretendido. Após ter-se completado o alongamento da cadeia, desprotegeram-se os oligomeros, de acordo com métodos normalizados. Para posterior extensão da cadeia num sintetizador de fase sólida, no qual os oligomeros são conectados por ligações

fosfato, funcionalizaram-se adequadamente os grupos terminais, 5’-hidroxilo e 3'-hidroxilo dos olígomeros, com, respectivamente, reagentes de tritilação, tais como cloreto de dimetoxi-tritilo e fosforamidite.

B. Composto que possuem uma ligação internucleosídica constituída por dois átomos de carbono e um átomo de oxigénio

Sintetizaram-se as sequências oligonucleotídicas que possuem uma ligação internucleosídica constituída por dois átomos de carbono e um átomo de oxigénio, fazendo reagir o nucleósido 5’-tolueno-sulfonilo 3’-sililado, com um nucleósido 5’-protegido.

Prepara-se um nucleósido 3’-aoetil-5’-aldeído, a partir do 3’-acetil-nucleósido, comercialmente disponível, utilizando procedimentos normalizados que são do conhecimento do especialista. Converte-se então o nucleósido 3’-aoetil-5’-aldeído no nucleósido 3’-acetil-5’-carbo-metoxi-metileno utilizando uma reaoção de witting modificada.

Reduz-se a cadeia lateral de 5’-metileno com boro-hidreto de sódio em álcool, de preferência com isopropanol, seguindo-se-lhe a desprotecção do grupo 3’-acetilo com metóxido de sódio em álcool, de preferência em metanol. Protege-se, então o grupo 3'-hidroxi com um grupo sílilo. De acordo com um aspecto preferencial, o grupo sililo consiste num grupo t-butil. -dimetil-sililo.

Reduz-se, posteriormente o nucleósido 3’-silil-carbo-metoxi-metilo para proporcionar um 3'-O-silil-5’-desoxi-3’-(2-etanol) do nucleósido com hidreto de di-isobutil-alumínio (DIBAL) em tetra-hidrofurano (THF). Converte-se o grupo 5'-etanol num grupo p-tolueno-sulfonilo com cloreto de p-tolueno-sulfonilo em piridina. Protege-se, eventualmente o grupo amino exocíolico do radical da base do nucleósido 5’-ρ-tolueno-sulfonilo , de acordo eom métodos conhecidos e que se tornarão evidentes para o especialista. Um grupo de protecção preferencial para os grupos amino exocíclicos da adenina e da oitosina e o

radical benzoilo. Um grupo de protecção preferencial para o grupo amino exooíclico da guanina e o radical isobutilo. Também se pode proteger a guanina na posição Οθ.

Faz-se então reagir o nucleósido 3’-0-silil-5’-0-ρ-tolueno-sulfonilo com um nucleósido 5'-protegido para se formar um dímero nucleosídico 3’-0-silil-5’-protegido com uma ligação internucleosídica constituída por dois átomos de carbono e um átomo de oxigénio. 0 grupo protector de 5’-0 consiste, preferencialmente, num grupo tritilo e, ainda mais preferencialmente num grupo dimetoxi-tritilo. Protege-se, eventualmente o nucleósido 3’-0-silil-5’-0-protegido nos grupos amino exocíclicos do radical da base do nucleósido.

Desprotegem-se os dímeros nuoleosídicos e transformam-se novamente no átomo de carbono na posição 3', com um reagente que consiste em cianofosfina, de preferência com 2-ciano-etoxi-di-isopropil-amino-fosfina, para utilização num método de síntese, em fase sólida, com fosforamidite, para alongamento da cadeia. Gait, supra.

Conjugaram-se os dímeros nucleosídicos ou os olígomeros superiores com grupos de protecção trialquil-sililoxi, para se formarem oligonucleótidos qualquer que fosse o comprimento pretendido. Após ter-se completado o alongamento da cadeia, desprotegeram-se os olígomeros, de acordo com métodos normalizados. Para posterior extensão da cadeia num sintetizador de fase sólida, no qual os olígomeros são conectados por ligações fosfato, funcionalizaram-se adequadamente os grupos terminais, 5'-hidroxilo e 3'-hidroxilo dos olígomeros, com, respectivamente, reagentes de tritilação, tais como cloreto de dimetoxi-tritilo e fosforamidite.

C. Compostos que possuem uma ligação internucleosídica constituída por dois átomos de carbono e um átomo de azoto

Sintetizaram-se as sequências oligonucleosídicas conectadas por uma ligação internucleosídica constituída por dois átomos de carbono e um átomo de azoto, de tipo C-C-N, fazendo

reagir os nucleósidos que contém funcionalidades aldeído com nucleósidos que contêm funcionalidades amina, sob condições redutoras, tal como se ilustra na Figura 4.

Preparam-se os compostos, aldeído e amina, a partir de compostos comercialmente disponíveis. Preparou-se o aldeído a partir de 3’-alil-3’-desoxi-5’-O-terc-butil-dimetil-silil-timidina. 0 composto alílico foi regio-selectivamente oxidado com uma quantidade catalítica de tetróxido de ósmio, na presença de N-óxido de N-metil-morfolina, como co-oxidante para se obter o diol. Oxidou-se, por sua vez, o diol com periodato de sódio para se obter o aldeído, com um rendimento quase quantificável.

Sintetizou-se o composto amina a partir de nucleósidos comercialmente disponíveis. De acordo com procedimento habitual, transformou-se regio-selectivamente o grupo hidroxilo primário de um nucleósido num grupo tosilato, com cloreto de p-tolueno-sulfonilo que se converte depois num iodeto. Protege-se o grupo 3’-hidroxi do iodeto intermediário com cloreto de terc-butil-dimetil-sililo e introduz-se o grupo azido, fazendo reagir com azida de sódio.

Converteu-se a funcionalidade amino com eficácia, na amina pretendida, por redução, utilizando 10% de paládio-em-car bono, sob uma atmosfera de hidrogénio ou sob condições de redução de Raney Nickel.

Ligou-se a amina e o aldeído (aminação redutiva) na presença de ciano-boro-hidreto de sódio, sob condições tampão. Formou-se, com um bom redimento o dímero oligonucleosídico com uma ligação internucleosídica de tipo C-C-N. Fez-se reagir o oligonucleótido com anidrido trifluoroacético-trietilamina, para proteger o azoto secundário alifático. Dessililou-se o oligonucleósido com fluoreto de tetrabutil-amónio e protegeu-se selectivamente o grupo hidroxilo primário do diol resultante, com cloreto de dimetoxi-tritilo. Transformou-se o hidroxilo primário restante, na fosforamidite necessária, fazendo-o reagir com 2-ciano-etil-N,N-di-isopropil-cloro-fosforamidite.

Sintetizaram-se os oligonucleósidos acoplados por uma ligação internucleosídica constituída por dois átomos de carbono e um átomo de azoto, fazendo reagir os nucleósidos que possuíam funcionalidades aldeído e amina, respectivamente, nas posições 3’ θ 5’, sob condições redutoras, tal como se ilustra na Figura 5·

Sintetizaram-se os componentes aldeído e amina, a partir de compostos comercialmente disponíveis. Sintetizou-se a amina a partir de 3-azido-3-desoxi-timidina (AZT). Protegeu-se o grupo primário de AZT com cloreto de dimetoxi-tritilo e, transformou-se, regio-selectivamente a azida resultante na amina necessária com 10$ de paládio-em-carbono na presença de uma atmosfera de hidrogénio ou utilizando níquel de Raney.

Sintetiza-se o aldeído, a partir do composto, comercialmente disponível, 5’-Ο-dimetoxi-tritil-timidina. A timidina tritilada é sililada com cloreto de terc-butil-dimetil-sililo e, o grupo tritilo é removido, sob condições ácidas. 0 grupo hidroxilo primário resultante, é oxidado, de acordo com as condições de Swern para se obter o aldeído. Não se isola o aldeído, que se faz imediatamente reagir com (carbetoxi-metileno) trifenil-fosforano para se obter o éster insaturado. Hidrogena-se, regio-selectivamente o éster insaturado com paládio-em-carbono a 10$, para se obter o éster saturado com um rendimento quantitativo. Converte-se, por sua vez, o éster saturado no aldeído necessário com hidreto de di-isobutil-alumínio (DIBAL-H) de um modo altamente selectivo.

Liga-se a amina e o aldeído na presença de ciano-boro -hidreto de sódio, sob condições de aminação redutiva tamponada. Obteve-se a ligação internucleosídica de tipo N-C-C, com um bom rendimento. Protegeu-se o azoto secundário alifático do nucleosido oom anidrido trifluoro-acético e trietil-amina. Dessililou-se a sequência dimérica ou superior do oligonucleósido e converteu-se o hidroxilo resultante em fosforamidite com 2-ciano-etil-N,N-isopropil-cloro-fosforamidite.

Conjugaram-se os dímeros nucleosídicos ou os olígomeros superiores com grupos de protecçâo trialquil-siloxilo pa29

ra formar oligonucleósidos qualquer que fosse o comprimento pretendido. Após ter-se completado o alongamento da cadeia, dessililaram-se os olígomeros, de acordo com métodos normalizados. Para posterior extensão da cadeia num sintetizador de fase sólida no qual os olígomeros são conectados por ligações fosfato, funcionalizaram-se adequadamente os grupos hidroxilo terminais 3’ e 5^r, com reagentes de tritilação tais como, respectivamente, cloreto de dimetoxi-tritilo e fosforamidite.

D. Compostos que possuem um grupo diol numa ou em ambas as extremidades

Sempre que se desejar, podem ligar-se os dióis a uma ou a ambas as extremidades, de acordo com o método de fosforamidite em fase sólida. Oligonucleótide Synthesis: A Praticai Approach, ed, por M. J. Gait, páginas 35-81, IRL, Press, Washington, D.C. (1984).

De acordo com a presente invenção e em conformidade com a modificação do método de fase sólida introduz-se um grupo diol numa ou em ambas as extremidades de um oligonucleótido, de acordo com um procedimento, segundo o qual, se faz reagir o diol com um composto alcoxi-tritílico para se formar um diol tritilado. 0 diol será, preferencialmente, um glicol, mais preferencialmente um poli-alquileno-glicol. 0 reagente alcoxi-tritílico será, preferencialmente, cloreto de mono-metoxi-tritilo ou cloreto de dimetoxi-tritilo e, mais preferencialmente, cloreto de dimetoxi-tritilo. Faz-se, então, reagir os dióis tritilados, com um reagente cianofosfina, para se formar um composto tritil-diol-ciano-fosfina, composto este que se utiliza como um reagente fosforamiditico (referido daqui em diante como um reagente diol-fosforamiditico) na síntese de fase sólida dos compostos da presente invenção.

passo inicial, na síntese de fase sólida, reside na ligação de um nucleósido a um suporte, de preferência um suporte de vidro poroso, controlado (CPG). 0 nucleósido é ligado, preferencialmente, ao CPG, através de uma ligação succinato na posição 3’-hidroxilo, do nucleósido. Na especialidade existem

outros meios conhecidos de ligação de nucleósidos a suportes sólidos, e que serão evidentes para o especialista de sintese de oligonucleótidos.

Como alternativa, e tendo em vista a introdução de um diol na extremidade 3', pode ligar-se um reagente diol-fosforamiditico ao suporte sólido antes da adição do primeiro nucleósido. Liga-se o reagente diol-fosforamidítico ao suporte sólido, utilizando succinato ou outras ligações, de modo análogo aos métodos utilizados para a ligação de nucleósidos. 0 especialista aperceber-se-à, fáoilmente dos meios para a modificação dos métodos, para utilização oom reagentes diol-fosforamidíticos. Pode colocar-se qualquer número de diois no suporte de fase sólida antes de se adicionar o primeiro nucleósido. Utilizam-se, de preferência, entre 1 e, aproximadamente, 50 diois. Quando se ligam os diois, apenas à extremidade 5’, não se colocam os diois no suporte sólido.

A seguir à ligação do primeiro nucleósido ou do (S) diol (diois) ao suporte sólido, efectua-se o alongamento da cadeia através de passos sequenciais de remoção do grupo protector de 5’-hidroxilo (um grupo tritilo funoionalizado), activação do grupo 5’-hidroxilo na presença de um reagente fosforamidítieo, isto é, um nucleósido 5’-tritilo, 3’-fosforamidite de captura dos nucleósidos que não reagiram e oxidação da ligação fosforosa.

Remove-se o grupo de protecção, na posição 5’-hidroxilo dos nucleósidos ligados, com ácido, de preferência com ácido tricloro-acético.

São do conhecimento do especialista, os reagentes de activação que se podem utilizar, de acordo com este método. Os reagentes de activação preferenciais são o tetrazolo e o ouro aotivador (Beckman Instr. Inc. Paio Alto, CA).

passo de activação tem lugar, na presença do reagente fosforamiditico nucleosídico ou d.o reagente diol-fosforamiditico, adicionado, substituindo este último reagente o reagente fosforamiditico nucleosídico dos métodos de síntese con- 31

vencionais quando se adiciona o diol a uma ou a ambas as extre midades do polinucleótido. Determinam-se ou capturam-se as cadeias que não reagiram com reagentes de captura tais como anidrido acético e N-metil-imidazolo.

Oxida-se a ligação fosforosa, lábil, trivalente, de preferência com iodo, para se obter uma ligação estável, pentavalente fosfo-diester, do nucleótido.

Após a junção da cadeia oligonucleótidica desejada se encontrar completa, removem-se os grupos de protecção do fosfato, separam-se as cadeias do suporte de fase sólida e removem-se os grupos protectores de bases de acordo com métodos convencionais. Gaits, supra, 67-70.

especialista verificará que se podem modificar outros meios para a síntese de oligonucleótidos, de modo análogo, para se produzirem oligonucleótidos anti-sentido com extremidade(s) diol.

Os compostos da presente invenção são úteis no tratamento de mamíferos com distúrbios de carácter hereditário ou doenças associadas com a alteração dos mecanismos de expressão genética. Actualmente, fazem-se tentativas, para desenvolver as terapias anti-sentido para utilização no tratamento de infecçSes víricas, tais como as infecções por HIV, citomegalovirus, herpes simples, hepatite B, virus do papiloma e virus picorna; cancros do pulmão, do cólon, do colo uterino, da mama e do ovário ;

doenças de carácter inflamatório; e doenças do sistema imunológico, tais como o síndroma da imunodeficiência adquirida (AIDS) (SIDA), neoplasma hematológico e doenças hiperproliferativas. Armstrobg, supra, 89; Klausner, supra 303-304.

As composições da presente invenção, úteis na inibição da expressão dos genes englobam veículos aceitáveis do ponto de vista fisiológico e: 1) compostos que englobam sequências oligonucleosídicas com, aproximadamente, entre 6 e 200 bases, que possuem uma ligação internucleosídica de fórmula -D-D-D-, • tal como anteriormente se definiu, e que possuem, eventualmente

- um diol numa ou em ambas as extremidades ou 2) compostos que englobam sequências oligonucleotidicas com, aproximadamente entre 9 e 200 bases e que possuem um diol numa ou em ambas as extremidades .

As composições da presente invenção, úteis na inibição da expressão dos genes, englobam um ou mais dos compostos da presente invenção formulados em composições, conjuntamente com um ou mais veículos não-tóxicos, aceitáveis do ponto de vista fisiológico, adjuvantes ou veículos, para injecção parenteral, para administração oral, numa forma líquida ou sólida, para administração rectal ou tópica e, similares.

As composições podem ser administradas a seres humanos e a animais, por via oral, rectal, parenteral (intravenosa, intramuscular ou subcutânea), intracistérnica, intravaginal, intraperitoneal, local (pós, uguentos ou gotas) ou como aspersões bucais ou nasais.

As composições adequadas para injecção parenteral podem englobar soluções, dispersões, suspensões ou emulsões aceitáveis do ponto de vista fisiológico, esterilizadas, aquosas ou não aquosas e, pós esterilizados para reconstituição em soluções ou dispersões esterelizadas, para injecção. Como exemplos de veículos, diluentes, e solventes adequados, aquosos ou não aquosos, pode citar-se a água, o etanol, os poliois (propileno-glicol, poli-etileno-glicol, glicerol e similares), as suas misturas, óleos vegetais (tais como o azeite) e esteres orgânicos injectáveis tais como o oleato de etilo. Deve conservar-se uma fluidez adequada, utilizando, por exemplo, um revestimento como a lecitina, conservando o necessário tamanho das partículas, no caso das dispersões e utilizando agentes tensio-activos.

Estas composições contém adjuvantes, tais como conservantes, agentes humectantes, emulsionantes e agentes de dispersão. A prevenção contra a acção de microrganismos pode ser assegurada, por diversos agentes antibacterianos e antifungicos, como por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido . sorbico e similares. Pode também ser aconselhável incluir agen- 33

tes isotónicos, como por exemplo açúcares, cloreto de sódio e similares. Pode conseguir-se uma absorção prolongada da forma injectável, utilizando agentes que retardem a absorção, como por exemplo, mono-estearato de alumínio e gelatina.

Quando pretendido e, para uma distribuição mais eficaz, podem incorporar-se os compostos em sistemas de libertação lenta ou libertação no alvo, tais como matrizes polimérieas, lipossomas e microsferas. Podem ser esterilizados, por exemplo, por filtração através de um filtro de retenção de bactérias, ou por incorporação de agentes de esterilização sob a forma de composições sólidas esterilizadas que podem ser dissolvidas em água esterilizada ou, em outros meios esterilizados para injecção imediatamente antes de se utilizarem.

As formas de dosagem sólidas para administração oral, incluem cápsulas, comprimidos, pílulas, pós e grânulos. Em tais formas de dosagem sólida, o composto activo é misturado com, pelo menos, um excipiente inerte habitual (ou veículo) tal como citrato de sódio ou fosfato dicálcio ou a) expansores ou extensores, como por exemplo, amidos, lactose, glicose, manitol e ácido silícico, b) ligantes, tais como, por exemplo, carboxi-metil-celulose, alginatos, gelatina, polivinil-pirrolidona, sacarose e acácia, c) agentes humectantes, como por exemplo, glicerol, d) agentes de desintegração, como por exemplo agar-agar, carbonato de cálcio, amido de batata ou tapioca, ácido alginíco, determinados silicatos complexos e carbonato de sódio e) retardadores de solução, como por exemplo, parafina; f) aceleradores da absorção, como por exemplo, compostos de amónio quaternário; g) agentes humidificantes, como por exemplo, álcool cetílioo e mono-estearato de glicerol; h) adsorventes, como por exemplo, caulino, e bentonite e, i) lubrificantes, como por exemplo talco, estearato de cálcio, estearato de magnésio, polietileno-glicois sólidos, lauril-sulfato de sódio ou as suas misturas. No caso das cápsulas, comprimidos e pílulas as formas de dosagem podem englobar agentes tampão.

Podem, também empregar-se as composições sólidas, do mesmo tipo, como recheio das cápsulas de gelatina mole e dura,

utilizando exoipientes como a lactose ou açúcar do leite, assim como poli-etileno-glicois de alto peso molecular e similares.

Podem preparar-se as formas de dosagem sólidas, tais oomo os comprimidos, drageias, cápsulas pílulas e grânulos, com revestimentos e invólucros, como, por exemplo o revestimento entérico e, outros bem conhecidos na especialidade. Podem conter agentes de opacificação e, também podem ser constituídos por uma composição tal, que liberte o composto ou os compostos activo(s) numa determinada parte do tracto intestinal, de um modo retardado. Constituem exemplos de composições que se podem utilizar para se embutir as substâncias poliméricas e as ceras.

Os compostos activos, também se podem apresentar numa forma mioroencapsulada, se se desejar, com um ou mais dos exoipientes anteriormente referidos.

As formas de dosagem líquida para administração oral, incluem emulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires fisiológicamente aceitáveis. Para além dos compostos activos, as formas de dosagem líquida podem conter diluentes inertes, habitualmente utilizados na especialidade, tais como água, ou outros solventes, agentes solubillzantes e emulsionantes, como por exemplo, álcool etílico, álcool iso-propílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, álcool benzílico, benzoato de benzilo, propileno-glicol, 1,3-butileno-glicol, dimetil-formamida, óleos especialmente óleo de semente de algodão, óleo de amendoim, óleo de gérmen de trigo, azeite, óleo de ricino e óleo de sésamo, glicerol, álcool tetra-hidro-furfurílico, poli-etileno-glioois e ésteres de ácidos gordos de sorbitano ou misturas destas substâncias e, similares.

Entre estes diluentes inertes as composições também podem englobar, adjuvantes, tais como agentes humectantes, emul sionantes e de suspensão, agentes eduloorantes, aromatizantes e odoríferos.

As suspensões, para além do ingrediente activo, podem conter, agentes de suspensão, como por exemplo, álooóis isostea rílicos etoxilados, ésteres de polioxietileno-sorbitol e de

sorbitano, celulose microcristalina, meta-hidróxido de alumínio, bentonite, agar-agar e goma alcantira, ou misturas destas substâncias e de substâncias idênticas.

As composições para administração por via rectal, consistem, de preferência em supositórios que podem ser preparados, misturando os compostos da presente invenção com excipientes ou veículos não irritáveis, tais como manteiga de cacau, poli-etileno-glicol ou uma cera para supositórios, que sejam sólidos à temperatura normal, mas que se liquefaçam à temperatura corporal, fundindo-se, deste modo, no recto ou na cavidade vaginal e, libertando o ingrediente activo.

As formas de dosagem para administração tópica de um composto da presente invenção englobam unguentos, pós, aspersões e formas para inalação. 0 ingrediente activo é misturado em condições esterilizadas com um veículo fisiologicamente aceitável e, com conservantes, tampões e com os agentes de propulsão, necessários. Também se consideram abrangidos pela presente invenção, as formulações oftálmicas, unguentos, pós e soluções para os olhos.

Também se podem administrar os compostos da presente invenção na forma de lipossomas. Como é do conhecimento do especialista, os lipossomas são, geralmente derivados, de fosfolipidos ou de outras substâncias lipídicas. Os lipossomas são formados por cristais líquidos hidratos mono ou multi-lamelares que são dispersos num meio aquoso. Pode utilizar-se qualquer lipido não tóxico, fisiológicamente aceitável e metabolizável.

As presentes composições, na forma de lipossomas podem conter, para além dos compostos inibidores da lipoxigenase, da presente invenção, estabilízantes, conservantes, excipientes e similares. Os lipidos preferenciais são os fosfolípidos e as fosfatidilcolinas (lecitinas), naturais ou de síntese.

Os métodos para a formação de lipossomas são do conhecimento do especialista. Ver, por exemplo, Methods in Cell Biology, Ed. por Prescott, volume XIV, Academic Press, New York, Ν. Y., páginas 33 e seguintes (1976).

Actualmente, os níveis de dosagem do ingrediente ac- 36 -

tivo nas composições da presente invenção, pode variar de modo a obter-se a resposta terapêutica desejada para uma composição em particular e para um determinado método de administração.

No entanto, o nível de dosagem seleccionado depende do efeito terapêutico pretendido, da via de administração, da duração que se pretende que o tratamento venha a ter e de outros factores.

A dose total, diária, dos compostos da presente invenção, administrada a um hospedeiro, em doses únicas ou divididas , pode ser efectuada em quantidades compreendidas, por exemplo, entre aproximadamente 1 nanomole e 5 micromoles, por quilograma do peso corporal. As composições em dosagem unitária podem conter estas quantidades ou múltiplos das mesmas, tanto quanto o necessário para perfazer a dose diária. Deverá, no entanto, ter-se em consideração que o grau específico de dosagem para um paciente em particular, dependerá de diversos factores incluindo o peso corporal, o estado geral de saúde, o sexo, a dieta, o tempo e via de administração, proporções de absorção e excreção, combinação com outros fármacos e, gravidade da doença em particular que se pretende tratar.

Os exemplos que se seguem, têm por finalidade ilustrar o melhor possível a presente invenção, não devendo de modo algum limitar o âmbito da especificação e reivindicações em anexo.

EXEMPLO 1: Preparação do composto 5-0 *-dimetoxi-tritil-3-0'-t-butil-dimetil-silil-timidina.

Dissolveu-se dimetoxi-tritil-timidina (5,0 g, 9,2 mmol) e imidazolo (1,2 g, 18,4 mmol) em 15 ml de dimetil-formamida anidra (DMF) e adicionou-se a cloreto de terc-butil-dimetil-sililo (1,7 g. 11,5 mmol).

Agitou-se a mistura de reacção durante 4 horas, à temperatura ambiente, diluiu-se com acetato de etilo e lavou-se com água, com uma solução saturada de cloreto de sódio e secou• -se com sulfato de sódio. Obteve-se o composto em epígrafe com . um rendimento quantificável.

EXEMPLO 2: Preparação do composto 3/-O-t-butil-dimetil-silil-timidina.

Tratou-se o composto 5’-0-dimetoxi-3*-t-butil-dimetil -silil-timidina, preparado de acordo com o método do Exemplo 1 (0,7 g, 1,1 mmol), durante uma hora, à temperatura ambiente com 13 ml de uma solução de ácido tricloro-acético em cloreto de metileno, a 3#. Neutralizou-se, então a mistura de reacção, oom uma solução de bicarbonato de sódio (p/v) a 5#· Secou-se a camada orgânica com sulfato de sódio. Purificou-se o composto em epígrafe por cromatografia ultra-rápida, utilizando um gradiente de 0 a 30# de acetato de etilo em cloreto de metileno. 0 rendimento da reacção foi de 85#.

EXEMPLO 3: Preparação de V-aldeído de 3^t-0-t-butil-dimetil-silil-timidina.

A uma solução bem agitada de cloreto de metileno anidro, a -78°C, adicionou-se cloreto de oxalilo (33,0 mmol, 2,88 ml), seguindo-se-lhe a adição, gota a gota de DMSO (3,12 ml,

4,4 mmol). Decorridos 10 minutos, adicionou-se, gota a gota, durante um período de 2 minutos, o álcool (5,6 g, 15,7 mmol), preparado de acordo com o método utilizado no Exemplo 2, em 20,0 ml de , e prolongou-se a agitação durante 45 minutos. Adioionou-se Et^N (8,1 ml, 58,1 mmol) e prolongou-se a agitação durante mais 45 minutos. Trouxe-se, então a mistura de reacção até à temperatura ambiente e, depois lavou-se com água (2 x 10 ml), a seguir, com solução salina (10 ml) e secou-se (Na2S0^). Utilizou-se o aldeído bruto no passo seguinte.

EXEMPLO 4: Preparação do composto 5¹-vinil-5¹-3'-t-butil-dimetil-silil-desoxi-timidina

A uma solução de brometo de metil-trifenil-fosfónio (0,7 mmol) em tetra-hidrofurano anidro (THF) a 0°C, adicionou-se, gota a gota uma solução de sódio-bis(trimetil-sililamida) (0,6 mmol). Decorridos 30 minutos adicionou-se, gota a gota, sob atmosfera de azoto, uma solução do 4’-aldeído correspondente, em THF. Agitou-se a mistura de reacção durante 2 horas, di- 38 -

luiu-se com acetato de etilo, lavou-se com água, depois com solução salina e secou-se (NagSO^). Purificou-se o composto em epígrafe por cromatografia ultra-rápida, utilizando como eluente uma mistura de 20% de acetato de etilo em hexano. 0 rendimento foi de 55-60%.

EXEMPLO 5: Preparação de 3^,-0-t-butil-dimetil-silil-5^t-desoxi-5'-hidroxi-metil-timidina

A uma solução de 2-metil-2-buteno 2N (1,6 eq., 1,5 ml, 3 mmol) em 3 ml de THF anidro a 0°C, adicionou-se, lentamente sob atmosfera de Ng, 1,6 eqs. de complexo borano-tetra-hidrofurano (3 ml, 2 mmol).

Agitou-se a solução durante 10 minutos, seguindo-se-lhe a adição de vinil-timidina, preparada de acordo com o método do Exemplo 4 (0,7 g, 1,9 mmol) em 5 ml de THF anidro. Agitou-se a mistura de reacção, durante 45 minutos e colocou-se no refrigerador durante 2 dias.

Efectuou-se o processamento utilizando uma solução aquosa constituída por 3,1 eq· de hidróxido de sódio 2M e, 3,1 eq. de peróxido de hidrogénio a 30% (adicionando, de preferência, peróxido de hidrogénio, gota a gota à solução aquosa de hidróxido de sódio, a 0°C e agitando durante 10 minutos). Adicionou-se a solução, lentamente, através de um funil de adição à mistura de reacção, a 0°C, agitou-se durante uma hora, removeu-se do banho gelado, dilulu-se com acetato de etilo, lavou-se com água, com solução saturada de cloreto de sódio e secou-se oom sulfato de sódio. Purificou-se o composto em epígrafe por cromatografia ultra-rápida, utilizando um gradiente de 20-28% de acetato de etilo em hexano. 0 rendimento foi de 62%.

EXEMPLO 6: Preparação de 5 *-Iodometil-SJ -desoxl-Sí-p-t-butil-dimetil-silil-timidina

A uma solução de 3’-0-t-butil-dimetil-silil-5’-desoxi-5’-hidroxi-metil-timidina, preparada de acordo com o método do Exemplo 5 (0,3 g, 0,9 mmol) em acetonitrilo anidro (5 ml) e éter (3,4 ml), adicionou-se 4 eq. de imidazol (0,3 g, 3,7 mmol) e 2,2 eq. de iodo (0,5 g, 2,8 mmol). Agitou-se a mistura de reacção durante 45 minutos e evaporou-se o solvente. Adicionou-se acetato de etilo ao resíduo e, lavou-se o resíduo com água, solução saturada de cloreto de sódio e, secou-se com sulfato de sódio. Purificou-se o composto em epígrafe por cromatografia ultra-rápida, utilizando um gradiente de 30-50$ de acetato de etilo em hexano. 0 rendimento foi de 90$.

EXEMPLO 7 : Pj^gJ>A^r-^a-9A°- A^e_ iodeto de 3' -O-t-butil-dimetil-silil-5 *-desoxi-5'-timidil-metil-fosfónio

A uma solução agitada de 5’-iodometil-5’-desoxi-3’-O-t-butil-dimetil-silil-timidina, preparada de acordo com o método do Exemplo 6, (480 mg, 1 mmol) em CH^CN (5 ml) adicionou-se trifenil-fosfina (1,57 g, 6 mmol) e aqueceu-se a mistura ao refluxo durante 12 horas, à temperatura de 90°C. Arrefeceu-se a reacção e removeu-se o solvente. Purificou-se o composto em epígrafe por cromatografia ultra-rápida, utilizando MeOH a 5$ em CH^Cl^· Obteve-se o produto oorn um rendimento entre 95-96$.

EXEMPLO 8: ΡτΑΡΑΓΑΡΑ⁰, _d_^e_ SJ-t-butil-dimetil-silil-S' -desoxi-3’-(1 ” ,2-di-hidroxi-3^l,-propil)timidina

Adicionou-se tetróxido de ósmio (OsO^) (4 gotas, 2,5 $ p/v) em butanol, a uma mistura agitada de 3’-(2-propenil)-3’-desoxi-5’-O-t-butil-dimetil-silil-timidina, preparada de acordo com o procedimento descrito em J. Org. Chem. 1989? 54: 2767-2769 (C.K. Chu e outros), (183 mg, 0,5 mmol) e de N-óxido de 4-metil-morfolina (53 mg, 0,45 mmol) em 0,5 ml de THF anidro, a 0°C. Temperou-se, então, a mistura de reacção com solução aquosa de meta-bissulfeto de sódio a 10$ (2,0 ml), agitou-se durante 20 minutos, filtrou-se sobre uma placa de sílica e diluiu-se com acetato de etilo (25,0 ml). Lavou-se a fase orgânica com água (5,0 ml) e com solução salina e, secou-se, então, com NagSO^. Evaporou-se o solvente e purificou-se o composto em epígrafe por cromatografia ultra-rápida.

EXEMPLO 9: Preparação de 5 *-0-t-butil-dimetil-silil-3*-desoxi-timid-3 *-il-acetaldeído

Adicionou-se periodafco de sódio (214 mg, 1 mmol) a uma solução agitada de timidino-diol, preparada, de acordo com o método do Exemplo 2 (200 mg, 0,5 mmol) em THF-H₂0 (proporção de 4:1, 5,0 ml). Decorrida 1 hora, diluiu-se a mistura de reacção com acetato de etilo (25 ml), lavou-se com H₂0 (2x5 ml), com solução salina e, secou-se. Purificou-se o composto em epígrafe por cromatografia ultra-rápida com uma mistura de 70$ de acetato de etilo em hexano.

EXEMPLO 10: Preparação de dímeros de timidina com uma ligação internucleosídioa constituída por três átomos de carbono.

Os procedimentos utilizados nos Exemplos 10a a 10e encontram-se ilustrados na Figura 3.

10a. A uma suspensão agitada do composto iodeto de fosfónio, preparada, de acordo com o método do Exemplo 7 (241 mg, 0,326 mmol), em THF seca (2,0 ml), adicionou-se terc-butóxido de potássio (0,62 ml, solução 1,0 M, em THF, 0,62 mmol), a -78°C, sob atmosfera de azoto.

Decorridos 20 minutos, adicionou-se o composto 3’-acetaldeído, preparado de acordo com o método descrito no Exemplo 9 (80 mg, 0,22 mmol). Após 60 minutos, diluiu-se a mistura de reacção com acetato de etilo (30 ml), lavou-se com água (2x5 ml) e com solução salina (5 ml) e secou-se (Na₂S0^). Evaporou-se 0 solvente e purificou-se 0 produto olefina (Composto 1) por cromatografia ultra-rápida, utilizando uma mistura de 70$ de acetato de etilo em hexano. 0 rendimento encontrava-se compreendido entre 55$-60$.

10b. Adicionou-se Pd-C (20 mg) a 10$ a uma solução agitada do Composto 1 (109 mg) em metanol (5,0 ml), a 25°C e a pressão atmosférica de hidrogénio. Decorridas 4 horas, filtrou-se o agente catalítico sobre uma placa de celite e evaporou-se 0 solvente. Recolheu-se, assim, 0 Composto 2 que, depois ,_H1KBSUWM'

se purificou por cromatografia ultra-rápida, utilizando uma mistura de 80$ de acetato de etilo em hexano.

10c. Adicionou-se, aproximadamente, 2,8 equivalentes de fluoreto de tetra-butil-amónio a 0°C, a uma solução agitada do Composto 2 (350 mg em 5,0 ml de THF. Decorridas 3 horas, e evaporado o solvente, purifioou-se o Composto 3 por cromatografia ultra-rápida utilizando uma mistura de 10$ de metanol em ch₂ci₂.

10d. Adicionou-se, aproximadamente, 0,05 equivalentes de 4-dimetil-amino-piridina, 1,4 equivalentes de trietil-amina e, 1,2 equivalentes de cloreto de 4,4’-dimetoxi-tritilo, a uma solução agitada do Composto 3 (0,6 mmol) em piridina anidra (4,0 ml). Decorridas 2 horas, temperou-se a mistura de reacção com 2,0 ml de água e, depois diluiu-se com 2,0 ml de acetato de etilo. Separou-se a fase orgânica, lavou-se oom solução salina e seoou-se. Purificou-se o Composto 4, por cromatografia ultra-rápida utilizando uma mistura de 5$ de metanol em cloreto de metileno.

10e. Adicionou-se, aproximadamente 2,0 equivalentes de di-isopropil-etil-amina e 1,0 ml de dicloro-metano anidro (CH2CI2) a uma solução agitada do Composto 4 (0,5 mmol). Decorridos 30 minutos, adicionou-se, gota a gota e, durante um período de 20 minutos, 0,75 equivalentes de 2-ciano-etil-N,N-di-isopropil-cloro-fosforamidite e, prolongou-se a agitação durante mais 1 hora. Evaporou-se, então, 0 solvente e, purificou-se o Composto 5, por cromatografia ultra-rápida, utilizando acetato de etilo (contendo 1$ de trietil-amina) sob atmosfera de azoto.

Utilizam-se os processos dos passos anteriores de a-d, para se produzirem dímeros contendo ligações internucleosídicas com três átomos de carbono, nas quais os três átomos de carbono possuem a fórmula -CH2-.

Qualquer dos átomos de carbono ou mesmo todos, podem ser eventualmente hidroxilados, modificando o processo ilustra- 42 -

do na Figura 3, conforme se segue. Adiciona-se uma gota de uma solução a 2,5% (p/v), de tetra-óxido de ósmio em t-butanol, a 0°C a uma solução agitada do Composto 1 e de N-óxido de 4-metil-morfolina (9,1 mg) em 8 ml de THF. Conserva-se a mistura de reacção a 0°C, durante 24 horas, temperou-se com uma solução aquosa de meta-bissulfeto de sódio, diluiu-se com acetato de etilo e lava-se com água e com solução salina. Evapora-se o solvente e purifica-se o dímero hidroxilado resultante, por cromatografia de camada fina, utilizando acetato de etilo como eluente. protege-se, então o dímero hidroxilado e, modificam-se as extremidades 5’ e 3’, tal como nos passos b-d, anteriores.

EXEMPLO 11: Preparação de ligações internucleosídicas com três átomos de carbono hidroxilados

Utilizaram-se os compostos de fosforamidite dos dímeros de timidina produzidos nos passos a-d, num procedimento modificado de síntese de fosforamidite em fase sólida, para se produzirem sequências oligonucleosídicas, de acordo com o Quadro 1 .

Sintetizaram-se os oligodesoxinucleótidos da extremidade 3’ para a extremidade 5'.

Quadro 1

Sequência

5’ TpTpTpTpTp[TcT]pTpTpTpTpypypT 3’ 5’ TpTpTpTpTpTpTp[TcT]pTpTpypypT 3’ 5’ TpTpTpTpTpTpTpTp[TcT]pypT 3’

Código de Ref§.

T = timidina

H ρ = O-P-O o® o = -CH₂-CH₂-CH₂y = tetra-etileno-glicol

A síntese processou-se de acordo com um procedimento de fosforamidite modificado. Fez-se reagir o grupo 5’-hidroxilo

da timidina ligada com ácido tricloro-acético para desproteger o grupo 5’-hidroxilo. A seguir a este passo de desprotecção, fez-se reagir a timidina ligada com o agente de activação, tetrazolo, e um reagente fosforamiditico, constituído por dimetoxi-tritil-tetraetileno-glicol-eiano-fosfina. Ao passo de activação seguiu-se a captura dos grupos 5’-hidroxilo que não haviam reagido, oom anidrido acético e N-metilimidazolo. Oxidou-se, então a ligação fosforosa oom iodo, de acordo com procedimentos normalizados. Nas sequências 1 e 2, contendo dois resíduos de tetraetileno-glicol (TEG) , repetiram-se os passos de desprotecção, activação, captura e oxidação, tal como anteriormente se descreveu. Efectuou-se, então o alongamento da cadeia através de passos sequênciais de desprotecção, activação, captura e oxidação, com excepção de se ter adicionado, quando desejado, um dímero de timidina ligado por três átomos de carbono, preparado de acordo com os Exemplos 1-9, à cadeia, durante um passo de activação.

Na final da junção da cadeia, removeram-se os oligomeros de timidina do suporte de CPG eom hidróxido de amónio concentrado. Tratou-se, depois, a solução a 55°C, durante 8 a 15 horas para remover todos os grupos de protecção das aminas exocíclicas das bases.

EXEMPLO 12: Preparação de 3 *-0-acetil-5*-earbometoxi-metil-5* -desoxi-timidina.

Adicionou-se, aproximadamente, 0,39 g de boro-hidreto de sódio a uma mistura arrefecida (banho de gelo) agitada de 3,17 g de 3’-0-acetil-5’-carbo-metoxi-metileno-5’-desoxi-timidina em 95 ml de isopropanol. Agitou-se a mistura a 0°C, sob atmosfera de azoto, durante meia hora e, depois, à temperatura ambiente, durante mais uma hora e meia.

Temperou-se a mistura endurecida com 20 ml de metanol, e seguidamente, durante 30 minutos com 200 ml de água destilada e, depois extraiu-se com diversas porções de acetato de etilo. Trataram-se os extractos orgânicos combinados com solução salina e secaram-se com sulfato de magnésio anidro. Fil- 44 -

trou-se o agente de secagem e evaporou-se o solvente, obtendo-se 2,7 g do composto em epígrafe como um resíduo de aspecto vidrado.

EXEMPLO 13: Preparação de 5'-carbo-metoxi-metil-ô'-desoxi-timidina

Adicionou-se aproximadamente 10 gotas de uma solução metanólica a 25% (p/v) de metóxido de sódio a uma solução arrefecida e em agitação de 2,22 g de 3 *-0-acetil-6’-carbo-metoxi-metil-5’-desoxi-timidina, preparada de acordo com o método do Exemplo 12, em aproximadamente 300 ml de metanol anidro (passado através de um leito de alumina neutra). Agitou-se a mistura sob atmosfera de azoto, sem reabastecer o banho de gelo, durante aproximadamente 20 horas.

Adicionou-se uma pequena quantidade de resina de permuta de catiões (Bio-Rad AG 50 WXB) e, agitou-se a mistura durante 30 minutos. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida, obtendo-se 2,1 g de um produto residual com aspecto vidrado, que se tratou com tolueno morno e, após arrefecimento se filtrou e se lavou com ciclo-hexano proporcionando 1,64 g de um produto bruto sob a forma de um sólido branco.

Purificou-se, posteriormente, o produto em epigrafe a partir de vestígios de material de partida, por cromatografia sobre gel de sílica, e eluiu-se com acetato de etilo e após recristalização a partir de uma mistura de acetato de etilo/hexano, obtendo-se cristais brancos.

EXEMPLO 14: Preparação de 3'-0-t-butil-dimetil-silil-5'-(2ⁿ-hidroxi-etil)-timidina

Adicionou-se, aproximadamente 19 ml de hidreto de di-isobutil-alumínio 1M em tetra-hidrofurano (THF) a uma solução arrefecida (-40°C a -30°C) de 1,88 g de 3’-0-t-butil-dimetil-silil-5 ’-carbo-etoxi-metil-5’-desoxi-timidina em 40 ml de THF anidro, sob atmosfera de azoto. Depois, aumentou-se, lentamente . a temperatura da mistura de reacção para -20°C.

·_ Pôs-se termo à reacção com aproximadamente 3,5 ml de

metanol e, a temperatura da mistura de reaeção subiu para -10°C. Adioionou-se aproximadamente 18 ml de água em 36 ml de THF à mistura morna e a temperatura subiu para 10°C. Removeu-se a maior parte de THF, através de pressão reduzida e diluiu-se o resíduo com aproximadamente dois volumes de água. Extraiu-se, diversas vezes a fase aquosa com uma mistura de acetato de etilo/clorofórmio. Lavaram-se os extractos combinados com ácido clorídrico 2N frio e, com solução salina, secou-se com sulfato de magnésio anidro e filtrou-se. Removeu-se o solvente a partir do filtrado, sob pressão reduzida, para se obter o composto em epígrafe (aproximadamente 1,6 g).

EXEMPLO 15: Preparação de 3’-0-t-butil-dimetil-silil-5'-(2ⁿ-iodo-etil)-5 *-desoxi-timidina

Adicionou-se, aproximadamente, 1 g de cloreto de p-tolueno-sulfonilo a uma solução de 1 g de 3’-0-t-butil-dimetil. -silil-5 ^,-(2'^,-hidroxi-etil)-5 ’-desoxi-timidina, preparada de acordo com o método do Exemplo 14 em 25 a 3θ ^ml de piridina anidra e, conservou-se a mistura imobilizada a aproximadamente 5°C e, durante aproximadamente 19 horas.

Adicionou-se a mistura a aproximadamente 200 ml de água gelada e extraiu-se, diversas vezes, com éter. Lavaram-se os extractos orgânicos combinados com ácido clorídrico 2N, frio, com água e com solução salina. Secaram-se os extractos lavados com sulfato de sódio anidro e, filtraram-se. Removeu-se o solvente a partir do filtrado, através de pressão reduzida para se obter um composto residual de aspecto vidrado, com 1,24 g, derivado de p-tolueno-sulfonilo.

Dissolveu-se, aproximadamente 0,54 g do derivado de p-tolueno-sulfonilo e, 0,38 g de iodeto de sódio em 55 ml de acetona anidra (crivo molecular, de 4A), durante 3 dias, seguin do-se-lhe a adição de 0,19 g de iodeto de sódio com agitação, no último dia.

Filtrou-se a mistura de reaeção e evaporou-se o solvente para se obter o produto bruto.

Purificou-se o produto bruto por cromatografia sobre

g de gel de sílica e eluiu-se com uma mistura de 25$ de acetato de etilo em hexano. Evaporou-se o solvente e, obteve-se 0,4 g do composto desejado, 3 ’-0-t-butil-dimetil-silil-5 ’-(2’’-iodo-etil)-5’-desoxi-timidina.

EXEMPLO 16: Preparação de 5’-carbo-metoxi-metileno-5¹-desoxi-timldina

Adicionou-se, aproximadamente, 10 gotas de metóxido de sódio a 10$ em metanol, a uma solução agitada de 1,5 g de 3 *-0-acetil-5 *-carbo-metoxi-metileno-5'-desoxi-timidina, em 150 ml de metanol anidro (passado através de um leito de alumina neutra). Agitou-se a mistura, à temperatura ambiente, sob atmosfera de azoto, durante mais 6 horas.

Adicionou-se, à mistura uma pequena quantidade de resina de permuta de iões (Bio-Rad AG-50W-XB), com agitação, durante 10 minutos. Removeu-se o solvente, sob pressão reduzida e, obteve-se um residuo sólido, branco com 1,3 g. Triturou-se o resíduo, duas vezes com tolueno aquecido e, depois, verteu-se em etanol quente, filtrou-se e temperou-se para se obter o composto em epígrafe, sob a forma de um produto cristalino, de côr branca, que após secagem possuia 0,85 g.

EXEMPLO 17 : Preparação de 3'-0-t-butil-dimetil-silil-5'-(2»-hidroxi-etileno)-5'-de s o xi-1 imid i na

Adicionou-se, gota a gota, sob atmosfera de azoto, uma solução de 296 mg de 5’-carbetoxi-metileno-5’-desoxi-timidina a uma solução agitada, arrefecida (banho de gelo) de 205 mg de imidazolo e 227 mg de cloreto de t-butil-dimetil-sililo em 1 ml de dimetil-formamida anidra. Após ter-se completado a adição, removeu-se a mistura do gelo e prolongou-se a agitação, à temperatura ambiente, durante 2 horas e, depois, a 35°C, durante outras duas horas e, finalmente a 40°C, durante meia hora.

Temperou-se, então, a mistura com 2 ml de metanol, seguido de dois a três volumes de água.

Extraiu-se a fase aquosa, diversas vezes, com acetato

de etilo. Lavaram-se os extractos orgânicos combinados com água com solução saturada de bicarbonato e com solução salina, secou-se sobre sulfato de magnésio anidro e filtrou-se. Removeu-se o solvente, por filtração, mediante pressão reduzida, para se obterem 0,40 g de 3’-0-t-butil-dimetil-silil-5’-carbo-metoxi -metileno-5’-desoxi-timidina.

Adicionou-se, gota a gota, aproximadamente 4 ml de uma solução 1M de hidreto de isobutil-alumínio em tetra-hidrofurano, a uma solução arrefecida entre -30°C e -35°C de 0,37 g de 3'-0-t-butil-dimetil-silil-5’-carbo-metoxi-metileno-5’-desoxi-timidina , dissolvida em 10 ml de tetra-hidrofurano anidro a uma temperatura inferior a -30°C. Após ter-se completado a adição, agitou-se a mistura de reacção, sob atmosfera de azoto durante um período adicional de duas horas, conservando a temperatura interna entre, aproximadamente -30°C e aproximadamente -20°C.

Adicionou-se cerca de 0,8 ml de metanol, à mistura de reacção, seguindo-se-lhe a adição de uma solução de 4 ml de água em 8 ml de tetra-hidrofurano. A maior parte do tetra-hidrofurano mais volátil, foi removida sob pressão reduzida. Diluiu-se o resíduo aquoso com aproximadamente o dobro do seu volume de água e extraiu-se, diversas vezes oom acetato de etilo. Lavaram-se os extractos orgânicos combinados com ácido clorídrico 1N, arrefecido, e com solução salina, secaram-se com sulfato de magnésio anidro e filtraram-se. Separau-se o filtrado para se obter 0,267 g do composto residual em epígrafe.

Purifioou-se uma porção deste material até pureza analítica, por cromatografia sobre gel de sílica , eluindo oom uma mistura de 50% de acetato de etilo em hexano.

EXEMPLO 18: Preparação de dímeros de timidina contendo uma ligação internucleosídica constituída por 2 átomos de carbono e um de oxigénio (3 *-O-C-C-5*).

18a. A uma solução agitada de 5’-0-tritil-timidina, adicionou-se uma quantidade equimolar de cada uma das bases e de 3’-0-t-butil-dimetil-silil-5’-(2”-iodo-etil)-5’-desoxi-timi48

dina a 0°C. Monitorizou-se o evoluir da reacção por cromatografia de camada fina (TLC). Após ter-se completado a reacção, isolou-se o dímero desejado e, purificou-se por cromatografia ultra-rápida.

18b. A uma solução agitada de 3’-0-t-butil-dimetil-silil-5(2”-hidroxi-etil)-5’-desoxi-timidina, que se conservou a uma temperatura de aproximadamente -5°C, adicionou-se 2 equivalentes de base e evaporou-se o solvente por secagem. Redissolveu-se o resíduo em DMF e adlcionou-se um equivalente de 5’-dimetoxi-tritil-2’,3'-ciclo-timidina. Aqueceu-se a mistura de reacção até, aproximadamente, 40°C e monitorizou-se a formação do dímero pretendido por TLC. Após ter-se completado a reacção, isolou-se o dímero pretendido e, purificou-se por cromatografia ultra-rápida.

EXEMPLO 19 ϊ Desprotecção da extremidade 3* do dímero do Exemplo 18.

Removeu-se o grupo protector de 3’-t-butil-dimetil-sililo dos dímeros protegidos, por tratamento de uma solução de THF do dímero do Exemplo 18, com 2,8 equivalentes de fluoreto de tetrabutil-amónio, a 0°C. Quando a reacção se encontrava completa (geralmente cerca de 3 horas), evaporou-se o solvente e isolou-se o dímero pretendido por cromatografia ultra-rápida.

EXEMPLO 20: Preparação de uma unidade dimérica funcionalizada e adequada para síntese autónoma

Dissolveu-se o dímero do Exemplo 19 em dicloro-metano e, adicionou-se 2 equivalentes de di-isopropil-etil-amina. Agitou-se a mistura durante 30 minutos, seguindo-se-lhe a adição, gota a gota de 0,75 equivalentes de 2-ciano-etil-N,N-di-isopropil-cloro-fosforamidite, durante um período de 20 minutos. Continuou-se a agitação durante mais uma hora, evaporou-se o solvente e, isolou-se o dímero funcionalizado resultante, que se purificou por cromatografia ultra-rápida utilizando acetato de etilo, sob atmosfera de gás inerte.

EXEMPLO 21: Preparação de 5 *-t-butil-dimetil-silil-3'-desoxi-31-(1 n _>2^lt-di-hidroxi-3^l,-propil)-timidina

Adicionou-se tetraóxido de ósmio (OsOip (4 gotas, 2,5$, p/v), em butanol, a uma mistura agitada de 3’-(2-propenil)-3’-desoxi-5’-O-t-butil-dimetil-silil-timidina (183 mg, 0,5 mmol), preparada de acordo com 0 procedimento já divulgado e, N-óxido de 4-metil-morfolina (53 mg, 0,45 mmol) em 5,0 ml de THF seco a 0°C. Temperou-se, então, a mistura de reacção com meta-bissulfeto de sódio em solução aquosa, a 10$ (2,0 ml), agitou-se durante 20 minutos, filtrou-se sobre uma placa de sílica e diluiu-se com acetato de etilo (25,0 ml). Lavou-se a fase orgânica com água (5,0 ml) e com solução salina e, depois, secou-se com Na₂S0||. Evaporou-se o solvente e, purifieou-se o composto por cromatografia ultra-rápida.

EXEMPLO 22: Ρτβρ3Γ8^0_άΌ_3221^3£ϊΪΣί2^ί^Σ^ΣίΑΣ£5θ^θΑ^θί^2Σ52Σ.

-O-t-butil-dimetil-silil-timidina

Adicionou-se periodato de sódio (214 mg, 1 mmol), a uma solução agitada de timidina-diol preparada, de acordo com o método do Exemplo 21 (200 mg, 0,5 mmol) em THF-H₂0 (proporção de 4:1, 5,0 ml). Decorrida uma hora, diluiu-se a mistura de reacção com acetato de etilo (25,0 ml), lavou-se com H₂0 (2 x 5,0 ml), com solução salina e, secou-se. Purificou-se 0 composto em epígrafe por cromatografia ultra-rápida, com uma mistura de 70$ de acetato de etilo em hexano.

EXEMPLO 23: Preparação de 5^,-0-(p-tolueno-sulfonil)timidina

A uma solução agitada de timidina (20 g, 82,6 mmol) em piridina seca (200 ml), adicionou-se cloreto de p-tolueno-sulfonilo (47,2 g, 247,6 mmol) a 0°C, sob atmosfera de azoto. Decorridas 3 horas, verteu-se a mistura de reacção sobre gelo e extralu-se com acetato de etilo. Evaporou-se o solvente e, 0 produto cristalizou a partir de uma mistura de acetato de etilo e de metanol. Obteve-se o composto em epígrafe, na forma de um sólido branco, cristalino, com um rendimento de 70-75$.

EXEMPLO 24: Preparação de 5 *-iodo-5'-desoxi-timidina

A uma solução agitada de tosilato de timidina (10,65 g, 26,9 mmol), preparada, de acordo com o método descrito no Exemplo 23, em acetona anidra (75 ml), adicionou-se iodeto de sódio (10 g, 66,7 mmol) e, aqueceu-se a mistura até ao refluxo, durante 16 horas. Evaporou-se o solvente e diluiu-se com acetato de etilo. Lavou-se a fase orgânica com água (2 x 20 ml) e com solução salina (10 ml) e, secou-se com sulfato de sódio. 0 composto em epígrafe cristalizou a partir de metanol, na forma de um sólido branco cristalino, com um rendimento de 90—95%.

EXEMPLO 25: Preparação de 3^T-0-t-butil-dimetil-silil-5^iodo-desoxi-timidina

A uma solução agitada de iodeto de timidina (8,0 g,

24,7 mmol), preparada de aeordo com o método do Exemplo 24, em DMF seca, adicionou-se imidazol (4,2 g, 61,7 mmol). Decorridos 5 minutos, adicionou-se cloreto de terc-butil-dimetil-sililo (4,47 g, 29,64 mmol) e, agitou-se a mistura durante 4 horas. Diluiu-se, então, a mistura de reaeção com acetato de etilo (250 ml), lavou-se com água (2 x 100 ml) e com solução salina (50 ml) e secou-se sobre sulfato de sódio. Purificou-se o composto em epígrafe por cromatografia ultra-rápida, utilizando 60% de acetato de etilo em hexano, com um rendimento de 92%.

EXEMPLO 26: Preparação de 3 *-0-t-butil-dimetil-silil-5*-azido-5'-desoxi-timidina

A uma solução agitada de 3*-0-t-butil-dimetil-silil-5’-iodo-5'-desoxi-timidina (10,8 g, 20 mmol), preparada de acordo com o método descrito no Exemplo 25, em DMF anidro (50 ml), adicionou-se azida de sódio (3,9 g, 60 mmol) e, aqueceu-se a mistura para 0°C, durante 12 horas. Diluiu-se, então, à mistura de reacção com acetato de etilo (200 ml), lavou-se com água (2 x 50 ml) e com solução salina (50 ml) e, secou-se, depois, sobre sulfato de sódio. Purificou-se o composto em epígrafe por cromatografia ultra-rápida, utilizando uma mistura de 50% de acetato de etilo em hexano, com um rendimento de 90%.

EXEMPLO 27: Preparaçao de S^O-t-butil-dimetil-silil-^-amino-5¹-desoxi-timidina

A uma solução agitada de azida de timidina (5,0 g,

13,1 mmol), preparada, de acordo com o método descrito no Exemplo 26, em MeOH, adicionou-se 200 mg de Pd-C, a 10%, sob atmosfera de azoto. Removeu-se então o azoto gasoso e substituiu-se por hidrogénio. Repetiram-se duas vezes os procedimentos de remoção e substituição e, continuou-se a agitar-se, a 1 pressão atmosférica de hidrogénio durante 12 horas. Removeu-se o hidrogénio e filtrou-se o agente catalítico sobre uma placa de celite e, removeu-se o solvente no vácuo. Purificou-se o produto bruto por cromatografia ultra-rápida, utilizando uma mistura de

5—10% de MeOH em CH₂C1₂, para se obter o composto em epígrafe, com um rendimento de 85—87%EXEMPLO 28: Preparação de 3 *-azido-3¹-desoxi-5*-0-dimetoxi-tritil-timidina

A uma solução agitada de 3’-azido-3’-desoxi-timidina (2,67 g, 10 mmol) em piridina seca (50 ml), adicionou-se 4-dimetil-amino-piridina (61 mg, 0,5 mmol), trietil-amina (1,9 ml, 14 mmol) e cloreto de 4,4 *-dimetoxi-tritilo (4,1 g, 12 mmol) por ordem sequencial. Decorridas 3 horas, adieionou-se água (30 ml) e extraiu-se com acetato de etilo (250 ml). Separou-se a fase orgânica, lavou-se com solução salina (50 ml) e secou-se com sulfato de sódio. Purificou-se o composto em epígrafe por cromatografia ultra-rápida, utilizando 5% de metanol em cloreto de metileno, com um rendimento entre 80-85$.

EXEMPLO 29: Preparação de 3'-amino-S'-desoxi-5'-O-dímetoxi-tritil-timidina

A uma solução agitada de azida de timidina (3,99 g, mmol), preparada, de acordo com o método descrito no Exemplo 28, em MeOH, adicionou-se'200 mg de Pd-C, a 10%, sob atmosfera de argon. Removeu-se, o árgon, sob vácuo e introduziu-se hidrogénio. Repetiu-se duas vezes este procedimento e, continuou a • agitar-se, a 1 pressão atmosférica de hidrogénio durante 12 ho52

ras. Removeu-se, então, o hidrogénio e filtrou-se o agente catalítico sobre uma placa de celite e, removeu-se o solvente no vácuo. Purificou-se o produto bruto por cromatografia ultra-rápida, utilizando 5$ de MeOH em cloreto de metileno, para se obter o composto em epígrafe com um rendimento de 90—93%¹H RMN (300 MHz, CDC1₃) $ 7.61 (s, 1 Η), 7.60-7.21 (m, 1H ) 6.83-6.8? (m, 3 Η), 6.85 (t, J=8.5 Hz, 1 Η), 3.80 (s, 6 Η), 3.81-3.73 (m, 2 Η), 3.53-3.49(m, 1 Η), 3.38-3·33(m, 1H), 2.36-2.33(m, 1H ), 2.25-2.20 (m, 1 Η), 1.51(s, 3 Η); IV nítido vmax 3020, 2962, 1697, 1605, 1512, 1246, 1030 cm^-1.

EXEMPLO 30: Preparação de S-O^dimetoxi-tritil-S-O^t-butil-dimetil-silil-timidina

Dissolveu-se dimetoxi-tritil-timidina (5,0 g, 9,2 mmol) e imidazolo (1,2 g, 18,4 mmol) em 15 ml de dimetil-formamida (DMF) anidra e, adicionou-se a cloreto de terc-butil-dimetil-sililo (1,7 g, 11,5 mmol), Agitou-se a mistura de reacção durante 4 horas, à temperatura ambiente, diluiu-se com acetato de etilo e lavou-se com água, com solução saturada de cloreto de sódio e, secou-se com sulfato de sódio. Obteve-se um rendimento quantificável do composto em epígrafe.

EXEMPLO 31: Preparação de 3'-O-t-butil-dimetil-silil-timidina

Tratou-se, 5’-0-dimetoxi-tritil-3’-0-butil-dimetil-silil-timidina, preparada de acorde oom o método do Exemplo 30, (0,7 g, 1,1 mmol), durante 1 hora, à temperatura ambiente, com 13 ml de uma solução a 3$ de ácido tricloro-acético em cloreto de metileno. Neutralizou-se, depois, a mistura de reacção com uma solução de bicarbonato de sódio. Secou-se a camada orgânica com sulfato de sódio. Purificou-se o composto em epígrafe por cromatografia ultra-rápida, utilizando um gradiente de 0 a 30% de acetato de etilo em cloreto de metileno. 0 rendimento da reacção foi de 85$.

EXEMPLO 32: Preparação de 3’-0-t-butil-dimetil-silil-5¹-carbetoxi-metileno-5'-desoxi-timidina

A uma solução bem agitada de cloreto de metileno seco a -78°c, adicionou-se cloreto de oxalilo (33,0 mmol, 2,88 ml), seguindo-se-lhe a adição, gota a gota, de DMSO (3,12 ml, 44 mmol). Decorridos 10 minutos, adicionou-se, gota a gota, o álcool timidínico (5,6 g, 15,7 mmol), preparado de acordo com o método do Exemplo 31, em 20,0 ml de CH₂C1₂, durante um período de 2 minutos e continuou-se a agitação durante 45 minutos. Adicionou-se Et^N (8,1 ml, 58,1 mmol) e, prolongou-se a agitação durante mais 30 minutos. Trouxe-se, então a mistura de reacção até aos -23°C, durante um período de 30 minutos. Adicionou-se, então, trifenil-fosforano de carbetoxi-metileno (10,94 g, 31,4 mmol) e, agitou-se a mistura de reacção durante 12 horas, à temperatura ambiente. Diluiu-se a mistura de reacção com água (2 x 125 ml) e com solução salina (50 ml) e secou-se (Na₂S0{|). Purificou-se o produto bruto por cromatografia ultra-rápida, utilizando 20% de acetato de etilo - hexano - 40$ de acetato de etilo-hexano, para se produzirem os isómeros trans e cis do composto em epígrafe, numa proporção de 3:1. 0 rendimento combinado foi de aproximadamente 72-76$.

Dados para o composto trans. IV (nítido) vmax 3205, 3180, 2982, 2964, 1698, 1490, 1274 em“¹; 1fí RMN (300 MHz,

CDC1₃) $ 7.04 (s, 1 H), 6.87 (dd. J=15.6 e 5.4 Hz, 1 H), 6.23 (t, J=6.7 Hz, 1 H), 6.03 (dd, J=15.6 e 1.6 Hz, 1 H), 4.33-4.28 (m, 1 H), 4.l4(q, J=71 Hz 2 H) 4.16-4.12 (m, 1 H), 2.28-2.19 (m, 1 H), 2.09-1.98 (m, 1 H), 1.87 (s, 3 H), 1.23 (t, J=7.1 Hz, 3 H), 0.81 (s, 9 H), 0.01 (s, 6 H); Calculado para C_2QH₃₂O₆N₂Si C, 56.58; H, 7.60; N, 6.60; Encontrado: C, 56.36; H, 7-30;

N, 6.60.

EXEMPLO 33: Preparação de 3 *-0-t-butil-dimetil-silil-5*-carbetoxi-metil-5 *-desoxi-timidina

A uma solução agitada de éster insaturado de timidina (4,24 g, 10 mmol), preparada, de acordo com o método do Exemplo

32, em EtOAc, adicionou-se 200 mg de Pd-C a 10$, sob atmosfera de azoto. Removeu-se o azoto gasoso, sob vácuo e, introduziu-se hidrogénio. Repetiu-se este procedimento duas vezes e, continu- 54 -

ou-se a agitação a uma pressão atmosférica de hidrogénio, durante 16 horas. Depois, filtrou-se o agente catalítico sobre uma placa de celite e removeu-se o solvente no vácuo. 0 produto cristalizou a partir de uma mistura de hexano e de acetato de etilo. Obteve-se o composto em epígrafe com um rendimento de 95$.

IV (nítido) vmax 3180, 2925, 2950, 1696, 1486, 1260, 1240 cm^-1; ¹H RMN (300 MHz, CDC1₃) 8 7.20 (s, 1 H), 6.11 (t, 6.6=Hz, 1 H) 4.07 (q, J=7.1 Hz, 2 H), 4.03-3-98 (m, 1 H), 3.73-7.69 (m, 1 H), 2.51-2.32 (m, 2 H), 2.24-2.15 (m, 1 H), 1.l8(t, J=7.1 Hz, 3 H), 0.18 (s, 9 H), 0.01 (s, 6 H),

Anal. Cale, para C^H^O^Si: C, 56.31; H, 8.03; N, 6.57 Encontrado: C, 55.91; H, 7.74; N, 6.50.

EXEMPLO 34: Preparação de 3^,-0-t-butil-dimetil-silil-5^t-desoxi-timid-5-il-acetaldeído

A uma solução agitada de éster de timidina (3,41 mg, mmol), preparada, de acordo com 0 método do Exemplo 33, em 60 ml de CH₂C1₂ a -78°C, adicionou-se DIBAL-H (16,4 ml de uma solução 1,0 M, em hexano, 16,4 mmol), gota a gota, durante um período de 3 minutos. Decorridos 20 minutos, diluiu-se a mistura de reaoção com 300 ml de EtOAc e, lavou-se, duas vezes, com 50 ml de uma solução saturada de tartrato de sódio-potássio. Lavou-se a fase orgânica com solução salina (25 ml) e secou-se (Na₂S0i|). Purificou-se 0 composto em epígrafe por cromatografia ultra-rápida utilizando 50$-70$ de acetato de etilo em hexano, com um rendimento de 85-87$.

EXEMPLO 35: Preparação de um dímero de desoxi-timidina com uma ligação internucleosídica do tipo 3^,-Ο-Ο-Ν-5' (Figura 3).

35a. A uma solução agitada de amina timidinica do exemplo 27 (1,07 g, 3 mmol) e do aldeído timidinico do Exemplo 22 (1,38 g, 3,6 mmol) em 50 ml de etanol em 10 ml de solução aquosa (pH=5,5, NaH₂P0i|-Na0H) , adioionou-se uma solução de NaCNBH₃ em THF (12 ml, solução 1,0 M em THF, 12 mmol), gota a

gota, a 5°C, durante um período de uma hora. Agitou-se a mistura de reacção durante outras 4 horas e, diluiu-se oom 2,50 ml de acetato de etilo. Lavou-se a mistura de reacção oom água (2 x 40 ml) e com solução salina (25 ml) e secou-se (Na₂S0_i|). Purificou-se o Composto 1 (Figura 6), por cromatografia ultra-rápida, eluindo, em primeiro lugar com acetato de etilo e, em seguida com 5-8$ de MeOH-CH₂Cl₂, com um rendimento de 62-64$.

¹H RMN (300 MHz, CDC1₃) S 7.60 (s, 1H) , 7.19 (s, 1 H) 6.l8(t, J=6.6 Hz, 1 H), 6.08 (t, J=3-9 Hz, 1 Η), 4.29-4.23 (m, 1 H), 4.15-3.98 (m, 1 Η), 3-91-1.85 (m, 1 Η), 3.70-3-78 (m, 2 H), 2.95-2.87 (m, 1 Η), 2.84-2.66 (m, 3 Η), 2.35-2.05 (m, 5 H), 1.94 (s, 3 Η), 1.93 (s, 3 Η), 1.80-1.63 (m, 1 Η) ,

1.55-1.45 (m, 1 Η) , 0.93 (s, 9 Η), 0.69 (s, 9 Η), 0.11 (s, 6H),

0.07 (s, 6 H).

35b. Adicionou-se o Composto 1 (Figura 6) (166 mg, 0,23 mmol) a uma solução agitada de anidrido trifluoro-acético (0,32 ml, 2,3 mmol) e de trietilamina (0,64 ml, 4,6 mmol) em CH₂C1₂ (5,0 ml). Decorridas 2 horas, temperou-se a mistura de reacção com NaHCO^ aquoso (5,0 ml) e diluiu-se com EtOAc (25 ml). Lavou-se a fase orgânica com água (2 x 10 ml), com solução salina (5 ml) e secou-se (Na₂S0^). Purificou-se o Composto 2 (Figura 6) por cromatografia ultra-rápida utilizando 7$ de MeOH em CH2CI2, com um rendimento de 91-93$.

35c. A uma solução agitada do Composto 2 (164 mg,

0,2 mmol) em THF (4,0 ml), adicionou-se fluoreto de tetra-butil-amónio (0,8 mmol), a 0°C. Decorridas duas horas, evaporou-se o solvente e, purificou-se o Composto 3 (Figura 6), por cromatografia ultra-rápida, utilizando 5$-8$ de MeOH em CH₂C1₂, com 90$ de rendimento.

35d. A uma solução agitada do Composto 3 (151 mg,

0,26 mmol) em piridina seca (3,0 ml) adicionou-se 4,4-dimetil-amino-piridina (1,6 mg, 0,0128 mmol) e trietil-amina (0,057 ml, 0,42 mmol). Decorridos 5 minutos, adicionou-se cloreto de dimetoxi-tritilo (121 mg, 0,358 mmol) e, manteve-se a agitação.

. Decorridas duas horas, diluiu-se a mistura de reacção com ace- 56 -

tato de etilo (25 ml) e, lavou-se com água (2 x 10 ml), com solução salina (5 ml) e secou-se (Na₂S0j|). Purificou-se o produto bruto por cromatografia ultra-rápida, utilizando 7% de MeOH em CH₂C1₂, para se obter o Composto 4 (Figura 3) com um rendimento de 85-87%.

35e. Adicionou-se di-isopropil-etilamina seca (0,15 ml, 0,67 mmol) ao Composto 4 (150 mg, 0,168 mmol), e, seguidamente, CH₂C1₂ seco (0,5 ml). Agitou-se o balão até dissolver o álcool e, adicionou-se 2-ciano-etil-N,N-di-isopropil-cloro-fosforamidite (0,056 ml, 0,25 mmol), durante um período de 20 segundos. Decorridos 45 minutos, temperou-se a mistura de reacção com CH^OH (1,0 ml), diluiu-se com EtOAc (50 ml) e EtgN (1,0 ml) lavou-se com solução aquosa a 10$ de K₂C0g (2 x 5,0 ml), e seguidamente eom solução salina (5,0 ml) e secou-se (Na₂S0]j). Purificou-se o produto bruto por cromatografia ultra-rápida utilizando EtOAc, para se obter o Composto 5 (Figura 6) com um rendimento de 70-75$.

EXEMPLO 36: Preparaçãode um dímero de desoxi-timidina com uma ligação internucleosídiea do tipo 3*-Ν-Ο-Ο-5’ (Figura 4) .

36a. A uma solução agitada da amina do Exemplo 29 (2,72 g, 5 mmol) e do aldeído do Exemplo 34 (2,29 g, 6 mmol) em 50 ml de etanol e 10 ml de solução aquosa tampão (pH=5,5, NaHgPOjj-NaOH) , adicionou-se uma solução de NaCNBH^ em THF (12 ml, solução 1,0 M em THF, 12 mmol), gota a gota, a 5°C, durante um período de 1 hora. Agitou-se a mistura de reacção durante mais 4 horas e, depois diluiu-se com 250 ml de acetato de etilo. Lavou-se a mistura de reacção com água (2 x 60 ml) e com solução salina e secou-se (Na^O^). Purifieou-se o Composto 1 (Figura 7) por cromatografia ultra-rápida, eluindo em primeiro lugar com acetato de etilo e, depois com 5$ de MeOH-CH₂Cl₂· Obteve-se o Composto 1 (Figura 7) com um rendimento de 72-74$.

¹H RMN (300 MHz, CDClg) S 7.56 (m, 1 H), 7.36-7.34 (m, 2 H), 7.29-7.15 (m, 8 H), 7.03 (s, 1 H), 6.77 (m, 3 H),

6.20 (t, J=6.0 Hz, 1 H), 6.08 (t, J=6.7 Hz, 1 H), 4.01-3.97

(m, 2 Η), 3.84-3.72 (m, 1 Η), 3.72 (s, 6 Η), 3.71-3.63 (m, 1H), 3.48-3-32 (m, 2 Η), 3-30-3.22 (m, 1 Η), 3.48-3-32 (m, 2 Η),

3.30-3.22 (m, 1 Η), 7.52 (m, 2 Η), 2.27-2.14 (m, 3 Η), 2.08-1.97 (m, 1 Η), 1.83 (s, 3 Η), 1.67-1.48 (m, 3 Η), 1.43 (s, 3H)

1.22-1.15 (m, 1 Η), 0.82 (s, 9 Η), 0.01 (s, 6 Η).

36b. A uma solução agitada de anidrido trifluoro-acético (0,32 ml, 2,3 mmol) e de trietil-amina (0,64 ml, 4,6 mmol) em CH^Cl^ (5,0 ml) adieionou-se o Composto 1 (Figura 7) (210 mg 0,23 mmol). Decorridas 2 horas, arrefeceu-se a reacção com NaHCOg (5,0 ml) e diluiu-se com EtOAc (25 ml). Lavou-se a fase orgânica com água (2 x 10 ml), com solução salina (5 ml) e secou-se (Na₂S0}|). Purificou-se o Composto 2 (Figura 7) por cromatografia ultra-rápida, utilizando 7$ de MeOH em CH₂C1₂. Obteve-se o composto 2 com um rendimento de 89-91$.

36c. A uma solução agitada do Composto 2 (180 mg,

0,2 mmol) em THF (4,0 ml), adicionou-se fluoreto de tetra-butil_ -amónio (0,4 ml, solução 1,0 M em THF, 0,4 mmol) a 0°C. Decorridas 2 horas, evaporou-se o solvente e purificou-se o produto por cromatografia ultra-rápida utilizando um gradiente de polaridade crescente, 5->8$ de MeOH, em CH₂C1₂ para se obter o composto 3 (Figura 7) com um rendimento de 89$.

36d. Adicionou-se di-isopropil-etil-amina seca (0,15 ml, 0,67 mmol) ao Composto 3 (150 mg, 0,168 mmol), segulndo-se-lhe a adição de CH₂C1₂ seco (0,5 ml). Agitou-se, depois 0 balão, para se dissolver o álcool e, adicionou-se 2-ciano-etil-N,N-di-isopropil-cloro-fosforamidite (0,056 ml, 0,25 mmol), durante um período de 20 segundos. Decorridos 45 minutos temperou-se a mistura de reacção com CH^OH (0,1 ml) e diluiu-se com EtOAc (50 ml) e com Et^N (1,0 ml) e lavou-se com uma solução aquosa a 10$ de Κ₂00β (2 x 5,0 ml), e com solução salina (5,0 ml) e secou-se (Na₂S0i|), Purificou-se o produto por cromatografia ultra-rápida utilizando EtOAc, para se obter o Composto 4, com um rendimento de 70-75$.

EXEMPLO 37 í síntese de olígomeros de desoxi-timidina contendo uma ponte internucleosídioa de tipo 3'-N-C-C-5'

Utilizaram-se os compostos fosforamidíticos do dímero timidina produzidos, de acordo com os passos anteriores, a-d, num procedimento de síntese de fosforamidite, em fase sólida, modificado, para se produzirem as sequências oligonucleotídicas do Quadro 2.

Quadro 2

Sequência

5’ TpTpTpTpTpTpTpTp[TnT]pT 3’

5’ TpTpTpTpTp[TnT]pTpTpTpT 3’

5’ [TnTjpTpTpTpTpTpTpTpTpT 3’

T = timidina

II p = -o-p-oCódigo de Refg.

0^θ n = 3’-N-C-C-5’

Sintetizaram-se as sequências oligodesoxinucleosídicas a partir da extremidade 3’ para a extremidade 5’.

passo inicial foi de ligação, através de uma ligação 3’-succinato, de uma 5’-dimetoxi-tritil-desoxi-timidina a um suporte de CPG. Fez-se reagir o grupo 5’-0-dimetoxi-tritilo da timidina ligada com ácido tricloroacético para desproteger o grupo 5’-hidroxilo.

Procedeu-se, então, ao alongamento da cadeia, através de passos normalizados sequênciais de desprotecção, activação, captura e oxidação, havendo uma modificação que reside no facto de se ter adicionado à cadeia, no local desejado, um dímero de timidina ligado por uma ponte de tipo -N-C-C-, preparado de acordo com os métodos dos Exemplos 30-37, durante um passo de activação.

No final da união da cadeia, removeram-se os ológomeros de timidina do suporte de CPG com hidroxido de amónio concentrado. Depois tratou-se a solução, a 55°C, durante 8 a 15

horas, para remover os grupos de protecção das aminas exociclicas das bases.

EXEMPLO 38: Preparação de ADN do onoogene Anti-RAS terminado em tetra-etileno-glicol

38a. Preparação de dimetoxi-tritil-tetra-etileno-gliool (DMTTEG).

Misturou-se, uma quantidade excessiva de tetra-etileno-glicol, TEG, (aproximadamente 100 ml) com cerca de 7 ml (5,1 g; 40 mmol) de base de Hunig, num balão de fundo redondo. Adicionou-se, aproximadamente, 3,08 g (10 mmol) de cloreto de dimetoxi-tritilo (DMTC1) à mistura de TEG e, conservou-se a mistura, de DMTC1-TEG, com constante agitação, à temperatura ambiente (cerca de 25°C), durante 8 a 12 horas, para se formar DMTTEG.

38b. Preparação de dimetoxi-tritil-tetra-etileno-glicol-ciano-fosfina (DMTTEGCP).

Misturou-se seis gramas de DMTTEG do passo (a) com 20 ml de dicloro-metano seco. Adicionou-se, aproximadamente 6,2 ml de base de Hunig à mistura, seguindo-se-lhe a adição, gota a gota de uma mistura de clorofosfina para se formar DMTTEGCP. Preparou-se a mistura de clorofosfina, dissolvendo 1,67 g de 2-ciano-etil-N,N-di-isopropil-cloro-fosforamidite em 5 ml de dicloro-metano seco.

38c. Preparação do ADN do ©ncogene Anti-RAS terminado em TEG.

Prepararam-se os oligodesoxinucleotidos do Quadro 3, de acordo com um método modificado de fosforamidite em fase sólida. GAIT, supra. Sintetizaram-se os oligodesoxinucleótidos da extremidade 3’ para a extremidade 5’.

Quadro 3

Sequência Código de Ref§.

5'	X GGA GCT GGT GGC GTA X (A) 3’	7
5'	XX GGA GCT GGT GGC GTA XX (A) 3’	8
5’	X CCT CGA CCA CCG CAT X (A) 3’	9
5’	XX CCT CGA CCA CCG CAT XX (A) 3’	10
5’	CCT CGA CCA CCG CAT 3’	11

X representa TEG

Os símbolos A, C, G e T, representam, respectivamente, os desoxinucleótidos ácidos adenílico, citidílico, guanidílico e timidílioo.

Os nucleosido adenosina (7, 8, 9, 10) ou timidina (11), foram ligados ao suporte sólido utilizando uma ligação succinato, GAIT, supra. A síntese de 11, processou-se em concordância com procedimentos normalizados de fosforamidite, em fase sólida. Nas sequências 7, 8, 9 e 10, a síntese proceesou-se em concordância com um método modificado de fosforamidite. Fez-se reagir o grupo hidroxilo da posição 5’ do nucleosido adenosina, ligado, com o ácido trifluoroacético para desproteger o grupo hidroxilo da extremidade 5’. A seguir a este passo de desprotecção, fez-se reagir o nucleosido adenosina, ligado, com o agente de activação, tetrazolo e oom um reagente fosforamidítico, constituído por DMTTEGCP, preparado de acordo com o prooesso descrito nos passos a e b, antecedentes. Ao passo de activação seguiu-se a captura dos grupos hidroxilo da extremidade 5’, não reactivos, com anidrido acético e N-metilimidazolo. Oxidou-se, então, a ligação fosforosa com iodo, de acordo com procedimentos normalizados.

Nas sequências 8 e 10, contendo dois resíduos de TEG, repetiram-se os passos de desprotecção, activação, captura e oxidação, tal como se descreveu anteriormente. 0 alongamento da cadeia processou-se através de passos sequenciais de desprotecção, activação, captura e oxidação, tal oomo anteriormente se descreveu, exceptuando o facto de se ter substituído o reagente nucleosídico fosforamidítico pretendido, por DMTTEGCP, durante o passo de activação. A seguir à ligação dos últimos nucleósi61

dos desejados, ligaram-se um ou dois resíduos de TEG à extremidade 5’, de modo análogo a ligação de TEG na extremidade 3'·

No final da ligação da cadeia, removeu-se o cordão de ADN do suporte de CPG, com hidróxido de amónio concentrado. Tratou-se, depois a solução, a 55°C, durante 8 a 15 horas, para remover todos os grupos de protecção nas aminas exocíolicas das bases.

EXEMPLO 39: Preparação de ADN do oncogene Anti-RAS terminado em hexa-etileno-glicol (HEG).

Preparou-se o ADN do oncogene Anti-RAS terminado em hexa-etileno-glicol (HEG), de acordo com os métodos do Exemplo 38. Fez-se reagir HEG com DMTC1 para formar DMTHEG. Fez-se reagir, então, DMTHEG com um composto cianofosfina, para formar DMTHEGCP, que se utilizou no método de síntese fosforamidítico, modificado, em fase sólida, do Exemplo 38 (c) para formar ADN do oncogene Anti-RAS terminado em HEG. No Quadro 4, que se segue, indicam-se as sequências destes oligonucleótidos.

Quadro 4

Sequência

5’ X GGA GCT GGT GGC GTA X (A) 3’

5’ XX GGA GCT GGT GGC GTA XX (A) 3’

5’ X CCT CGA CCA CCG CAT X (A) 3'

5’ XX CCT CGA CCA CCG CAT XX (A) 3’

5’ CCT CGA CCA CCG CAT 3’

X representa HEG

Os símbolos A, C, G e T representam, respectivamente, os desoxinucleótidos, ácidos adenílico, citidílico, guanidílico e timidílico.

EXEMPLO 40: Resistência à Nuolease do ADN do oncogene Anti-RAS terminado em TEÇ

Dissolveram-se, em água, os oligonucleótidos indicados no Quadro 4. Determinaram-se, então, as concentrações de

ADN, medindo a absorvência das amostras a 260 nm (num espectro- 62 -

fotómetro perkin Elmer Lambda 4C, à temperatura ambiente) e, utilizando coeficientes de extinção calculados [método de Cantor e Warsaw, CRC Handbook of Biochemestry and Molecular Biology, 3^â edição, volume 1, CRC Press, página 589 (1975)].

Incubaram-se os oligonucleótidos durante 2 horas, a 37°C, numa concentração total de cordão de 6 a 7 μΜ, num meio de cultura de células contendo RPMI 1640; N-(2-hidroxi-etil)-piperazina-N’-(2-ácido-etano-sulfónico) 20 mM, a pH 7,4; e soro de feto de vitela (FCS) (GIBCO Laboratories, Grand Island, NY), a 10%. Inactivou-se o FCS por aquecimento a 56°C, durante 0,5 horas antes de ser utilizado. Colocaram-se as amostras em gelo e desproteinizaram-se, utilizando cinco extracções com clorofórmio: álcool isoamílico, numa proporção de 24:1. As amostras foram armazenadas congeladas a -20°C ou foram colocadas imediatamente num auto-injector HPLC WISP (Waters), refrigerado (4°C).

Quantificou-se à hidrólise dos oligonucleótidos, determinando a quantidade desaparecida do composto parental. Separaram-se os oligonucleótidos ( a partir da mistura de reacção) num sistema de cromatografia de bomba dupla Ultracromático LKB, GTi, equipado com um detector de comprimentos de onda, fixo, (260 nm) e com um integrador de registo, utilizando uma coluna de permuta de aniões GenPack Fax (Waters), equilibrada em Tampão A (EDTA 1 mM; fosfato de sódio 15 mM, pH 8,5). Conservou-se a temperatura da coluna a 60°C, utilizando uma estufa de coluna Water. Utilizaram-se volumes de injecção de cinquenta microlitros de amostra. Eluiram-se os oligonucleótidos utilizando um gradiente linear de 0% a 100% de Tampão B (Tampão A contendo NaCl 0,5 Μ), durante 60 minutos. 0 débito do tampão foi de 1 ml/minuto.

A seguir à incubação (2 horas) na presença de exonuclease associada a soro de feto de vitela, não se observou a mínima degradação dos compostos 7 ou 10 (Quadro 5, ver percentagem de degradação do pico principal). Durante um período de incubação idêntico, conservou-se, 87,0% e 82,1% respectivamente . de 9 e 8. Em comparação, restou apenas 24,7% do olígomero 11,

- 63 após o mesmo período de incubação.

Quadro 5

AMOSTRA ID	ÁREA-PICO PRIN-	ÁREA-PICO PRIN-	% DE DEGRADAÇÃO
	CIPAL/0,0 MIN	CIPAL/2,0 H	D0 PICO PRINCIPAL
7	0,2325	0,3663	0,0
9	0,3744	0,3258	13,0
8	0,2164	0,1777	17,9
10	0,3642	0,3697	0,0
11	1 ,2861	0,3177	75,3

Os quatro TEG-olígomeros mostraram-se resistentes à hidrólise pelas exonucleases associadas a FCS. Os bis-diTEG-olígomeros (7 θ 10) pareceram ser totalmente resistentes à hidrólise. Os oligo-desoxinucleótidos com a derivação TEG representam melhoramentos significativos sobre os compostos não modificados, em termos de resistência à hidrólise pelas exonucleases .

EXEMPLO 41: Capacidade dos oligomeros anti-sentido de TEG, para inibirem a expressão das proteínas e o crescimento das linhas de células tumorígenas humanas e a estimulação de PHA dos linfócitos sanguíneos periféricos

Foi demonstrado, por outros investigadores (Heikkila,

R. e outros, Nature, 328:445-449, 1987) que os oligonucleótidos anti-sentido, não modificados dirigidos contra a região do codão de iniciação do oncogene c-myc, podia inibir a expressão da proteína de c-myc em linfócitos do sangue periférico (PBL) estimulados por PHA, originando um bloqueio na progressão das células na fase S do ciclo celular. Também se demonstrou que o ADN anti-sentido que comanda c-myc inibia o crescimento das células eritroleucémicas humanas, HL-60, in vitro (Wckstrom, E.L. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85:1028-1032, 1988). As sequências indicadas no Quadro 6, foram preparadas e determinadas, de acordo com os procedimentos descritos no Exemplo 41a e 41b.

Quadro 6

5’ AAC GTT GAG GGG CAT 3’

5’ XX AAC GTT GAG GGG CAT XX A 3’ (X = TEG)

41a. Comparação do Efeito de ADN Anti-Sentido de C-myc, Modificado (com TEG) e Não Modificado na Progressão de PBL Estimulado por PHA na Fase S do Ciclo Celular.

Estimularam-se PBLs humanos com PHA, durante 48 horas na presença ou ausência de sequências oligonucleotidicas anti-sentido, do Quadro 6. Determinou-se a percentagem da população celular, em cada grupo de tratamento na fase S do ciclo celular em comparação com as células de controlo não tratadas, utilizando técnicas normalizadas de citométria de fluxo. No Quadro 7, apresentam-se os resultados.

Quadro 7

OLIGONUCLEÓTIDO CONCENTRAÇÃO % CONTROLO (μΜ)FASE S

Nenhum 100

5’ AAC GTT GAG GGG CAT 3’ 30 75 ± 6

9 ± 10

5’ XX AAC GTT GAG GGG CAT XX A 3’ 30 ± 4 <6

Os dados indicam que a presença de TEG em ambas as extremidades 3’ e 5’ não altera o efeito inibidor do ADN anti-sentido.

41b. Comparação do Efeito do ADN anti-sentido de C-myc Modificado (com TEG) e Não Modificado sobre a expressão das proteínas C-MYC em Células Leucémicas, células T humanas, MOLT-4.

Incubaram-se células M0LT-4 em crescimento exponensial assíncrono, durante 8 horas na presença ou na ausência de 60 μΜ de ADN anti-sentido dirigido para c-myc. Incubaram-se, então . as células durante 45 minutos, na presença de 35s__metionina e,

quantificou-se o teor de proteínas de c-myc, utilizando radio-imunoprecipitação com um anticorpo c-rayc. No quadro 8, apresentam-se os resultados.

Quadro 8

OLIGONUCLEÓTIDO

CONCENTRAÇÃO (μΜ) $ DE REDUÇÃO DE PROTEÍNA DE

C-MYC

Nenhum

5’ AAC GTT GAG GGG CAT 3’ 60

5’ XX AAC GTT GAG GGG CAT XX A 3’ 60

61,0 ± 2,6 67,9 ± 0,7 mais

O ADN anti-sentido, contendo potente do que o ADN anti-sentido

TEG mostrou-se levemente não modificado.

41c. Comparação do Efeito do ADN -MYC Modificado (com TEG) e Não Modificado cimento das células leucémicas, células T,

Anti-Sentido de CPara Inibir o cresCCRF-CEM, In Vitro.

Incubaram-se células em fase de crescimento exponensial assíncrono, CCRF-CEM, durante 48 horas, na presença ou na ausência de ADN anti-sentido e, determinou-se, então, o número de células em cada grupo de tratamento. Determinou-se, assim a concentração de ADN anti-sentido necessária para inibir, em 50$ o crescimento celular (CI₅₀). Os ADNs anti-sentido modificados ou não modificados apresentaram concentrações aproximadamente equivalentes (CI^q) de 40 μΜ.

Estes dados demonstram que a presença de TEG nas extremidades 3’ e 5* do ADN anti-sentido não afecta a capacidade destes ADNs anti-sentido para se hibridizarem com os ácidos nucleicos alvo e inibirem a função dos mesmos.

EXEMPLO 42: Outros oligonucleótidos Estáveis Perante as Exonucleases

Os oligonucleótidos estáveis perante as exonucleases, que se indicam no Quadro 9, foram preparados de acordo com os métodos descritos no Exemplo 38.

Quadro 9

5’ XX A-ACG-TTG-AGG-GGC-ATX-XA 3’

XX GCC,CGC-CTC-GGT-CCC-CGC-CCX-XA XX GGG GCG GAG TTA GGG GCG GCG GGX XA XX GGG-GAG-GAG-GGA-GGG-GAG-GGA-XXA XX GGG-GAG-GTG-GGT-GGG-GAG-GGT-XXA

AAG GTT GAG GGG CAT XXA X AA-CGT-TGA-GGG-GCA-TTX-A XX TTC-GCT-TAC-CAG-AGT=XXA XX GCG-GGA-GGC-TGC-TGG-XXA XX GGA-GGC-TGC-TGG-AGC-XXA XX CAA-GTT-CAT-AGG-TGA-TTG-CTC-XXA AL-CAC-TCC-TTT-AGC-AAG-XXA AL-GAA-CGA-TTT-CCT-CAC-XXA XX CTC-ACT-GCC-GCG-CAT-XXA XX GGG-TCT-TCG-GGC-CAT-XXA XX GTC-GAC-CGG-TTC-CAT-XXA XX TGT-AAC-TGC-TAT-AAA-XXA XX GTT-CCT-CCT-CTT-TAA-XXA XX TAC-TGC-CTT-ATA-TTC-XXA XX TAC-TGA-CTT-ATA-TTT-XXA XX TTT-ATA-TTC-AGT-CAT-XXA XX TGG-GGA-GGG-TGG-GGA-GGG-TGG-GGA-AGG-XXA XX CTT-ATA-TTC-CGT-CAT-XXA XX TAA-CGC-CTA-TTC-TGC-XXA XX CGT-CTT-ATC-CGC-AAT-XXA XX TTG-CTC-TCC-TCT-GTC-XXA XX CTG-TCT-CCT-CTC-GTT-XXA XX ATC-TAC-TGG-GTC-CAT-XXA XX TAC-CTC-GGT-CAT-CTA-XXA XX ACA-CCC-AAT-TCT-GAA-ATG-GXX-A XX GGT-AAA-GTC-TTA-ACC-CAC-AXX-A XX TAC-GGG-GAG-TTG-CAA-XXA X representa TEG

Como será evidente para o especialista, podem levar* -se a efeito muitas variações e modificações sem fugir ao espírito e âmbito da presente invenção.

Claims (5)

1. _ 1§ _

   Processo para a preparação de um composto que compreende uma sequência de nuoleósidos oom ceroa de 6 a ceroa de 200 bases, resistente a nucleases e que inibe a expressão de genes e possui uma ligação internucleosídioa de três átomos de f órmula

   -D-D-Dem que cada D é, independentemente uns dos outros, CHR, oxigénio ou Nr6 em que R é, independentemente, hidrogénio, OH, SM ou NH₂ e r6 é hidrogénio ou alquilo em C1-C2, oom a condição de apenas um dos símbolos D ser oxigénio ou NR^, caracterizado por se realizar a síntese do composto com a sequência dos oligonucleósidos pretendida por

   A) no caso de compostos que têm uma ligação internucleosídica com três átomos de carbono, fazendo reagir nucleósidos que tem as funções aldeído e ileto nas posições 3’ e 6' sob as condições da reacção de Wittig; ou

   B) no caso de compostos que têm uma ligação internucleosídioa com dois átomos de carbono e um átomo de oxigénio, fazendo reagir um nucleósido 3’-sililado 5’-toluenossulfonilado com um nucleósido 5’-protegido; ou

   C) no caso de compostos que têm uma ligação internucleosídica com dois átomos de carbono e um átomo de azoto, fazendo reagir nucleósidos que contêm aldeídos com nucleósidos que contêm funções amina em condições redutoras; ou

   D) no caso de compostos que têm um diol numa ou nas duas extremidades, fazendo reagir o diol oom um composto de alcoxitrltilo de modo a obter-se o diol tritilado que se faz reagir com cianofosfina que é utilizado como reagente de fosforamidite .

   - 2§ Processo de acordo com a reivindicação 1, ca- 68 racterizado pelo facto de o composto obtido ter um diol numa ou nas duas extremidades.

   Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto do diol ser tetraetilenoglicol ou hexaetilenoglicol.

   - 4* -

   Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter um composto que compreende uma sequência de oligonucleósidos de fórmula na qual

   W é -D-D-D- em que cada D é, independentemente uns dos outros, CHR, oxigénio ou NR^, em que R é, independentemente, hidrogénio, OH, SH ou NHg θ R⁸ é hidrogénio ou alquilo em C-|-C₂ com a condi ção de que apenas um dos símbolos D é oxigénio ou NR^· cada w’ é, independentemente, w ou um radical de fórmula ο

   ιι

   -Ο-Ρ-Ο;

   Οθ cada R¹ é, independentemente, OH, SH, NR²r3 em que R² e R^ são, independentemente, hidrogénio ou alquilo em C-j-Cg ou NHR^ em que R^ é acilo em C^-C^í cada Y é, independentemente, H ou OH;

   cada B é, independentemente, adenina, citosina, guanina, tirnina, uraeilo ou as suas modificações; j é, um inteiro desde 1 até cerca de 200; k é zero ou um inteiro desde 1 até cerca de 197; e q é zero ou um inteiro desde 1 até cerca de 197;

   com a condição de que a soma j + k + q esteja compreendida entre cerca de 4 e cerca de 200.

   - 5§ Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter um composto que compreende uma sequência de oligonucleósidos com desde cerca de 6 até cerca de 200 bases que tem a fórmula • na qual cada Z é, independentemente, R’ ou lf lf

   R¹-([(CH)_pO]_m-P- O)_e([(CH)_p-O]_n-P-O)_f-;

   R5

   R0^c

   W é -D-D-D- em que cada símbolo D é, independentemente, CHR, oxigénio ou NR^, em que R é, independentemente, hidrogénio, OH, SH ou NH₂ e r6 é hidrogénio ou alquilo em CpC₂, com a condição de que apenas um D é oxigénio ou NR^;

   cada w’ é, independentemente, w ou

   I!

   -0-P-0-;

   le

   0^e cada R¹ é, independentemente, OH, SH, NR²R^ em que R² e r3 são, independentemente, hidrogénio ou alquilo em CpCg ou NHR^ em que R¹^ é acilo em CpC^5 cada R³ e, independentemente, hidrogénio ou alquilo CpCpj cada Y é, independentemente, H ou OH;

   cada B éindependentemente, adenina, citosina, guanina, timina, uracilo ou uma das suas modificações;

   cada e e F é, independentemente, um inteiro desde zero até 50, com a condição de que, pelo menos, um dos símbolos e_ e F seja pelo menos 1;

   j é um inteiro desde 1 até cerca de 200;

   k é zero ou um inteiro desde 1 até eerca de 197; θ cada m e n é, independentemente, um inteiro desde 1 até 200; cada p é, independentemente, 2 a 4; e q é zero ou um inteiro desde 1 até cerca de 197, com a condição de que a soma j + k + q esteja compreendida entre cerca de 4 e cerea de 200.

   - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter um composto resistente a nuoleases compreendertio uma sequência de oligonucleótidos com desde cerca de 9 até cerca de 200 bases tendo um diol numa ou nas duas extremidades .

   _ ₇a _

   Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de o diol ser hexaetilenoglicol ou tetra etilenoglicol.

   Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por se obter um composto que compreende um oligonucleótido de fórmula

   R- (E(ÇH)_pO]_m

   I!

   -P0

   I!

   -ΡΟ

   0)_f[oligO (N)](0 -P0^e

   0^e tt

   E(CH)_pO]_n)_e(O -Pna qual
2. 2
3. 3 ρ p

   R é OH, SH, NR R em que R e R-⁵ são, independentemente, hidrogénio ou alquilo em C^—Cg ou NHR^ em que R^ é acilo em é hidrogénio ou alquilo em oligo (N) é uma sequência de oligonucleótidos natural ou modifi cada com desde cerca de 9 até cerca de 200 bases;

   cada e e f é, independentemente, 0 a 50, com a condição de que, pelo menos, um dos símbolos £ e f seja pelo menos igual a 1;

   cada m e n é, independentemente, 1 a 200; e cada p é, independentemente, 2 a
4. 4.

   - 9- Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por se obter um composto que compreende um oligonu- 72 cleótido de fórmula

   0 0

   I! II

   R- E(CH₂CH₂O)_m -P- 0]_eEoligo(N)]EO -P- (0CH₂CH₂)_n]_f -R;

   Ò^e Ò^e na qual

   R é OH, SH, Nr2r3 _em que R^ e R^ são independentemente, hidrogénio ou alquilo em C^-Cg, ou NHR^ em que R^ é aoilo em C^-C^₂; oligo (N) é uma sequência de oligonucleétidos com desde cerca de 9 até cerca de 50 bases; e e e f são, independentemente, 0 a 50, com a condição de que pelo menos um dos símbolos e_ e f seja pelo menos um; e m e n são, independentemente, 0 a 200.

   - 103 Processo para inibir a degradação por nucleases de compostos, caracterizado por se preparar sequências de oligonucleósidos de 6 a 200 bases aproximadamente possuindo uma ligação internucleosídica de três átomos de fórmula

   -D-D-D-;

   em que cada D e, independentemente, CHR, oxigénio ou NR° em que R é independentemente hidrogénio, OH, SH ou NH₂ e R⁶ é hidrogénio ou alquilo em C^-C₂, com a condição de só um D ser oxigénio ou NR⁶.

   - 113 Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por as sequências de oligonucleósidos possuirem a fórmula em que W é -D-D-D- em que cada D é independentemente CHR, oxigénio ou NR , em que R é independentemente hidrogénio, OH, SH ou NH2 e R^ hidrogénio, ou alquilo em Cq—C2» ^com a condição de somente um D ser oxigénio ou NR^j θ oada W’ é independentemente W ou -0-P-0-;

   cada r1 é independentemente OH, SH, NR²r3 em que R² e r3 são independentemente hidrogénio ou alquilo em C^-Cg ou NHR^ em que R¹* é acilo em cada Y é independentemente H ou OH;

   cada B é independentemente adenina, citosina, guanina, timina, uracilo ou as suas modificações;

   j é um número inteiro entre 1 e 200 aproximadamente;

   k é zero ou um número inteiro entre 1 e 197;

   e q é zero ou um número inteiro entre 1 e 197;

   com a oondição de a soma de j + k + q estar compreendida entre 4 e 200.

   - 12* Processo para estabilizar nucleótidos ou sequências de oligonucleósidos, caracterizado por se ligar um diol

   - 74 a uma extremidade ou às duas extremidades do referido nucleótido ou sequência de oligonucleósidos.

   - 13- Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por se utilizar uma tritil-diol-ciano-fosfina para proteger a extremidade 5’ do referido composto.

   _ 14a _

   Processo para a preparação de uma composição útil para inibir a expressão de genes, num mamífero que necessita esse tratamento, caracterizado por se incorporar num veículo fisiologicamente aceitável um composto compreendendo sequências de oligonucleósidos com desde cerca de 6 até cerca de 200 bases tendo uma ligação internucleosídioa não fosfatada com três átomos de fórmula

   -D-D-D_z Z A em que cada D e independentemente CHR, oxigénio ou NR° em que R é, independentemente hidrogénio, OH, SH ou NH₂ e R^ é hidrogénio ou alquilo em C^-C₂, com a condição de apenas um D ser oxigénio ou NR^, quando preparado de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9.

   - 15- Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a sequência de oligonucleótidos ter a fórmula

   R1 na qual

   W é -D-D-D- em que cada D é, independentemente, CHR, oxigénio ou NR^d em que R é independentemente hidrogénio, OH, SH ou NH₂ e R⁶ é hidrogénio ou alquilo em C^-C^, com a condição de apenas um D ser oxigénio ou NR^;

   cada w’ é independentemente w ou

   II

   -O-P-O;

   cada r) q independentemente OH, SH, NR²r3 em que R² e R^ são independentemente hidrogénio ou alquilo em C^-C^ ou NHR^ em que é acilo em C^-C^₂; cada Y é independentemente H ou OH;

   cada B é independentemente adenina, citosina, guanina, timina, uracilo ou as suas modificações;

   j é um inteiro desde 1 até cerca de 200;

   k é zero ou um inteiro desde 1 até cerca de 197; e q é zero ou um inteiro desde 1 até cerca de 197, com a condição de a soma j + k + q estar compreendida entre cerca de 4 e cerca de 200.

   - 163 - 76 -

   Processo para a preparação de uma composição farmacêutica para inibir a expressão de genes num mamífero que necessita esse tratamento, caracterizado por se incorporar num veículo fisiologicamente aceitável um composto resistente a nucleases compreendendo uma sequência de oligonucleótidos com desde cerca de 9 até cerca de 200 bases tendo um diol numa ou ambas as extremidades.

   - 17^ã Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o referido diol ser hexaetilenoglicol ou tetraetilenoglicol.

   - 18^

   Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo facto de o mencionado composto compreender um oligonucleótido de fórmula

   R- ([(CH)_pO]_m -P- O)_e([(CH)_pO]_n -P- O)_f[oligo (N)](O -P0 tr ^[(<?^H>AV” [°<^CHWf -^S; na qual

   R é OH, SH, NR R³ em que R² e r3 são, independentemente, hidrogénio ou alquilo, em C^-Cg, ou NHR^ em que R^ é acilo em C^-C^j R1 é hidrogénio ou alquilo C^-C^;

   oligo (N) é uma sequência de oligonucleótidos natural ou modificada com desde cerca de 9 até cerca de 200 bases; cada e e f é, independentemente, 0 a 50, com a condição de, pelo menos, um dos símbolos e e f ser pelo menos 1; cada m e n é, independentemente, 1 a 200; e cada p é, independentemente, 2 a 4.

   - 19- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter um composto que compreende um nueleó- na qual

   W é -D-D-D- em que D é, independentemente, CHR, oxigénio ou

   CHR^ en que R é, independentemente, hidrogénio, OH, SH ou NH₂ e

   R^ é hidrogénio ou alquilo em C.-C?, com a condição de apenas fi um D ser oxigénio ou NR°;

   cada B é, independentemente, adenina, citosina, guanina, timina uracilo ou uma sua modificação;

   r7 é OH, t-butil-dimetil-sililoxi ou fosforamidite; e

   O

   R é OH, um grupo de protecção ou t-butil-dimetil-sililoxi.

   - 20§ Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter um composto de fórmula
5. 5’ X_n CCT CGA CCA CCG CAT X_n (A) 3’ na qual

   X é tetraetilenoglicol; e n é 1 ou 2.

   A requerente reivindica as prioridades dos pedidos norte-americanos apresentados em 3 de Agosto de 1990, sob ο N2. 652180, em 13 de Setembro de 1990, sob os N^s.

   - 78 582287, 582456 e 582457 e em 9 de Abril de 1991, sob o N 682784.

   Lisboa, 2 de Agosto de 1991.

   RESUMO

   PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSTOS QUE COMPREENDEM SEQUÊNCIAS DE NUCLEÓSIDOS COM CERCA DE 6 A CERCA DE 200 BASES RESISTENTES A NUCLEASES

   A invenção refere-se a um processo para a preparação de um composto que compreende uma sequência de nucleósidos com cerca de 6 a cerca de 200 bases, resistente a nucleases e que inibe a expressão de genes e possui uma ligação internucleosídica de três átomos de fórmula

   -D-D-Dem que cada D é, independentemente uns dos outros, CHR, oxigénio ou NRÕ em que R é, independentemente, hidrogénio, OH, SH ou NH₂ e R° e hidrogénio ou alquilo em 0-,-02, com a condição de apenas um dos símbolos D ser oxigénio ou NR^, que compreende realizar-se a síntese do composto com a sequência dos oligonucleósidos pretendida por

   A) no caso de compostos que têm uma ligação internucleosídica com três átomos de carbono, fazendo reagir nucleósidos que tem as funções aldeído e ileto nas posições 3’ e 6’ sob as condições da reacção de Wittig; ou

   B) no caso de compostos que têm uma ligação internucleosídica com dois átomos de carbono e um átomo de oxigénio, fazendo reagir um nucleósido 3’-sililado 5’-toluenossulfonilado com um nucleósido 5’-protegido; ou

   C) no caso de compostos que têm uma ligação internucleosídica com dois átomos de carbono e um átomo de azoto, fazendo reagir nucleósidos que contêm aldeídos com nucleósidos que contêm funções amina em condições redutoras; ou

   D) no caso de compostos que têm um diol numa ou nas duas extremidades, fazendo reagir o diol com um composto de alcitritilo de modo a obter-se o diol tritilado que se faz reagir com cianofosfina que é utilizado como reagente de fosforamidite.