KR20220142445A - 4'-o-메틸렌 포스포네이트 핵산 및 이의 유사체 - Google Patents

4'-o-메틸렌 포스포네이트 핵산 및 이의 유사체 Download PDF

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KR20220142445A
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웨이민 왕
홍추안 유
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다이서나 파마수이티컬, 인크.
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Abstract

본 발명은 강력하고 안정적인 RNA 간섭제로서 유용한 핵산 및 이의 유사체에 관한 것이다.

Description

4'-O-메틸렌 포스포네이트 핵산 및 이의 유사체
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 1월 15일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/961,360호; 2020년 2월 12일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/975,352호; 2020년 3월 19일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/991,738호의 35 U.S.C.§ 119(e)에 따라 이익을 주장하며, 이는 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 기술 분야
본 개시내용은 핵산 및 이의 유사체, 및 본원에 제공된 설명에 따라 제공된 핵산 및 이의 유사체를 사용하여 세포에서 표적 유전자의 발현을 조절하는데 유용한 방법에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 본 상세한 설명의 핵산 및 이의 유사체를 포함하는 약제학적으로 허용가능한 조성물, 및 다양한 장애의 치료에 상기 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
변형된 핵산에 의한 유전자 발현의 조절은 실험실의 연구 도구와 클리닉에서의 치료 접근법으로서 큰 잠재력을 보여준다. 안티센스 올리고(ASO), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 앱타머, 리보자임, 엑손 스키핑 또는 스플라이스 변형 올리고, mRNA 및 CRISPR을 포함한 올리고뉴클레오타이드 또는 핵산-기반 치료제의 여러 종류는 임상 조사하에 있다. 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레아제 안정성 개선, RNA-결합 친화도 및 약동학적 특성들을 포함한, 화학적 변형이 올리고뉴클레오타이드 치료제에 직면한 장애물을 극복하는 데 중요한 역할을 한다. 당, 핵염기 및 포스포디에스테르 백본의 변형을 포함한, 올리고뉴클레오타이드에 대한 다양한 화학적 변형 전략이 지난 33년 동안 개발되어 왔다(DeLavey and Darma, CHEM. BIOL. 2012, 19(8): 937-54; Wan and Seth, J. MED. CHEM. 2016, 59(21): 9645-67; 및 Egli and Manoharan, ACC. CHEM. RES. 2019, 54(4): 1036-47).
ASO 및 siRNA 치료제에서 가장 널리 사용되는 백본 변형 중 하나는 비-브릿징 산소 중 하나를 황 원자로 대체하는 포스포로티오에이트(PS) 연결이다. 이 변형이 그들의 생물학적 기능을 손상시키지 않으면서, 뉴클레아제 내성을 증가시키고, 치료적 올리고뉴클레오타이드의 약동학을 개선시키지만, 전임상 모델 및 클리닉 모두에서 염증, 신독성, 간독성 및 혈소판 감소증과 같은 독성이 알려져 있다(Frazier, TOXICOL. PATHOL. 2015, 43(1):78-89). 독성은 PS 연결을 통해 단백질에 결합하는 ASO의 강한 경향으로부터 발생하는 것으로 여겨진다(Shen et al, NAT. BIOTECH. 2019, 37:640-50). 또한, PS 연결은 키랄이며, 2N 부분입체이성질체가 생성되며, 여기서 N은 백본내 PS 연결의 수이다. PS 연결의 정의된 입체화학을 갖는 올리고뉴클레오타이드의 화학적 합성에서 최근 개발(Iwamoto et al, NAT. BIOTECH. 2017, 35(9):845-51)을 포함하여 수십년의 노력에도 불구하고(Stec et al, NUCLEIC ACID RES. 1991, 1(21):5883-8 및 J. AM. CHEM. SOC. 1998, 120(29):7156-67; Agrawal et al, TETRAHEDRON 1995, 6(5):1051-4; Iyer et al, J. AM. CHEM. SOC. 2000, 112(3), 1253-4; 및 Oka et al, J. AM. CHEM. SOC. 2008, 130(47):16031-7), 이 방법은 여전히 높은 입체선택성과 높은 합성 효율이 부족하고, 일반적으로 강력하지 않고 접근가능하지 않다. 뉴클레아제 내성, RNA-결합 친화도 및 적절한 약동학과 같은 PS 연결의 원하는 특성을 유지할 수 있을뿐만 아니라 생물학적 기능을 손상시키지 않으면서 독성을 완화시킬 수 있는 새로운 뉴클레오타이드간 연결을 개발하는 것이 바람직하다. 이상적으로는, 새로운 결합은 아키랄이어야 한다. 키랄성을 피할 수 없더라도, 입체화학을 통제하는 것이 강력하고 쉽게 접근할 수 있어야 한다.
최근에, 전하-중성 알킬 포스포네이트 결합이 보고되었으며, 독성을 감소시키고 치료 창을 증가시키기 위해 ASO의 PS 연결을 대체하는 데 사용되었다(Migawa et al, NUCLEIC ACIDS RES. 2019, 47(11):5465-79 및 Shen et al, 2019). 그러나, 이들 알킬 포스포네이트 결합은 키랄이며, 혼입 부위 근처의 RNase H 매개 활성을뒷받침하지 않으며, 고체-상 합성 후 올리고뉴클레오타이드를 탈보호하는 데 필요한 기본 조건 하에서 가닥 절단에 더 취약하다.
질병, 특히 암에 대한 효과적인 치료를 위한 분야에서 지속적인 필요가 내재되어 있다. 세포에서 표적 유전자의 발현을 조절하는데 유용한 핵산 치료제는 치료제로서 유망하다. 따라서, 치료제로서 유용한 핵산과 이의 유사체를 찾을 필요가 있다.
발명의 내용
본 출원은 세포에서 표적 유전자의 발현을 조절하는 기능을 하는 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 신규한 핵산 또는 이의 유사체, 및 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다. 본원에 제공된 핵산 및 이의 유사체는 안정하고 RNA 표적에 결합하여 그들의 포스포로티오에이트(PS) 대응물과 유사한 RNase H 활성을 유도하고, 또한 스플라이스 스위칭 및 RNAi에 유용하다. 제공된 핵산 및 이의 유사체는 또한 스플라이스 스위칭, RNAi 등과 같은 다른 메커니즘에도 사용될 수 있다. 4'-O-메틸렌 포스포네이트 연결의 통합은 뉴클레오타이드간 연결에 뉴클레아제 안정성을 부여하고, 인 원자에 키랄 중심을 생성하지 않으며, 단백질(예를 들어, RNase H 또는 Ago2) 결합이 전하-중성 알킬 포스포네이트 접근법과 대조적으로 강력한 유전자 침묵 활성을 발휘하는데 필요할 수 있는 포스페이트 백본의 음 전하를 유지한다(Migawa et al, 2019).
4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 적합한 핵산 또는 이의 유사체는 핵산 억제제 분자, 예컨대 dsRNAi 억제제 분자, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, miRNA, 리보자임, 안타고미르, 앱타머, 및 ssRNAi 억제제 분자를 포함한다. 특히, 본 개시내용은 세포내 RNA 수준의 조절자로서의 유용성을 발견한 핵산 및 이의 유사체를 제공하고, 이는 이어서 본원에 기재된 바와 같은 핵산 및 이의 유사체에 의해 감소된다. 핵산 억제제 분자는 다양한 메커니즘 세트를 통해, 예를 들어 RNA 간섭(RNAi)에 의해 RNA 발현을 조절할 수 있다. 본원에 제공된 핵산 및 이의 유사체의 이점은 세포내 RNA 수준의 조절과 일치하여 광범위한 약리학적 활성이 가능하다는 것이다. 또한, 본 설명은 암, 바이러스 감염 또는 유전적 장애와 같은 질병 상태의 치료 또는 개선을 위해 본원에 기술된 바와 같은 유효량의 핵산 및 이의 유사체를 사용하는 방법을 제공한다.
이제 본 발명의 핵산 및 이의 유사체, 및 이의 약제학적으로 허용가능한 조성물이 세포내 RNA 수준의 조절제로서 효과적인 것으로 밝혀졌다. 이러한 핵산 및 이의 유사체는 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하며, 여기서 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 화학식 I:
[화학식 I]
Figure pct00001
또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로 나타내고, 여기서 각 변수는 본원에 정의되고 기술된 바와 같다.
본 개시내용의 핵산 및 이의 유사체, 및 이의 약제학적으로 허용가능한 조성물은 세포내 RNA 수준의 조절과 관련된 다양한 질환, 장애 또는 병태를 치료하는데 유용하다. 이러한 질환, 장애 또는 병태에는 본원에 설명된 질병들이 포함된다.
본 개시내용에 의해 제공되는 핵산 및 이의 유사체는 또한 생물학적 및 병리학적 현상에서의 유전자 발현 연구; 신체 조직에서의 RNA 수준 연구; 및 시험관내 또는 생체내 신규 RNA 간섭제의 비교 평가에 유용하다.
도 1은 각각 5'-말단에서 3'-말단(x-축)으로 카운팅하여, PBS(y-축) 및 PBS, 벤치마크 SGLT2 ASO(ASO) 및 뉴클레오타이드 1과 2(ASO1), 2와 3(ASO2), 3과 4(ASO3), 4와 5(ASO4), 5와 6(ASO5), 6과 7(ASO6), 7과 8(ASO7), 8과 9(ASO8), 9와 10(ASO9), 10과 11(ASO10), 및 11과 12(ASO11) 사이에 대체된 올리고뉴클레오타이드와 비교하여 남은 %SGLT2를 나타내는 뉴클레오타이드간 포스포디에스테르(PO) 연결로 벤치마크 SGLT2 ASO 상에서의 뉴클레오타이드간 포스포로티오에이트(PS) 연결을 대체한 결과를 포함한다.
도 2는 PBS, SGLT2 벤치마크 ASO(ASO), ASO12 및 ASO13(x-축)의 0.5 및 3.0 mg/kg 체중(mpk)(% 표현 [Slc5a2/Ppib] + SEM))(y-축) 1회 투여 후 5일째에 마우스 신장에서 SGLT2 mRNA 녹다운(KD)에 의해 측정된 바와 같은, 생체내 ASO 백본 상의 뉴클레오타이드간 4'-O-메틸렌 포스포네이트(iMOP) 연결로 뉴클레오타이드간 포스포로티오에이트(PS) 연결을 대체한 결과를 포함한다. ASO12는 2'-MOE 대신 2'-OMe인 뉴클레오타이드 11의 2'-변형(5'-말단에서 카운팅)이 있다는 점에서 벤치마크와 다른 실험 대조군이다. ASO13은 뉴클레오타이드 10과 11 사이의 연결이 PS 대신 iMOP(핵산 I-3으로 나타냄)인 시험 항목이다. ASO12의 나머지 부분은 ASO13과 동일하다.
도 3은 (PBS에 대해 남아있는 % SGLT2 mRNA)(y-축) 및 ASO14, SGLT2 벤치마크 ASO(ASO), ASO12, ASO13, 및 ASO15(x-축)를 나타내는 0.5 mg/kg 체중(mpk)의 단일 투여 후 7일 후 마우스 신장에서 SGLT2 mRNA 녹다운(KD)에 의해 측정된 생체내 ASO 백본 상의 PS 연결을 뉴클레오타이드간 4'-O-메틸렌 포스포네이트(iMOP) 연결 또는 뉴클레오타이드간 4'-O-메틸메틸렌 포스포네이트(iMeMOP) 연결로 대체한 효과의 결과를 포함한다. ASO14는 뉴클레오타이드 10과 11 사이의 연결이 포스포디에스테르 연결이고 뉴클레오타이드 11이 2'-OMe인 PO 대조군이다. ASO12는 모든 연결이 PS이고 뉴클레오타이드 11이 2'-OMe인 PS 대조군이다. ASO13은 뉴클레오타이드 10과 11 사이의 연결이 PS 대신 iMOP인 iMOP 시험 항목이다. ASO15는 뉴클레오타이드 10과 11 사이의 연결이 PS 대신 iMeMOP(핵산 I-6으로 나타냄)인 iMeMOP 시험 항목이다.
도 4는 (PBS에 대해 남아 있는 Aldh2 mRNA %)(y-축) 및 PBS, GalXC1 및 GalXC2(x-축)를 나타내는 1.0 mpk의 단일 투여 후 4일째에 마우스 간에서 표적 유전자 mRNA 녹다운에 의해 측정된 GalXC 분자의 안티센스 가닥의 5'-말단에서 iMOP 연결의 결과를 포함한다. GalXC1은 안티센스 가닥의 5'-말단에서 뉴클레오타이드 1과 2 사이에 PS 연결을 갖는 대조군 GalXC 분자이다. GalXC2는 안티센스 가닥의 5'-말단 PS 연결을 iMOP 연결로 대체하는 GalXC 분자이다. 나머지 GalXC 분자는 대조군과 동일하다.
도 5는 생체내 ASO 백본의 GAP2 위치에 대한 PS 연결을 iMOP 연결 또는 iMeMOP 연결로 대체하는 효과를 개시한다.
도 6은 실시예 8의 표 3에 기술된 바와 같이, 트리토솜 인큐베이션 시간(hrs)(x-축)에 걸쳐 남은 퍼센트(%)(y-축)를 나타내는 벤치마크 ASO(A), ASO12(B), ASO13(C), ASO14(D) 및 ASO15(E)에 대한 HRMS 기반 시험관내 트리토솜 안정성 분석 결과를 도시한다.
도 7은 온도(℃)(x-축)에 걸쳐 표준화된 흡광도(y-축)를 나타내는 벤치마크 ASO:RNA1, ASO12:RNA1, ASO13:RNA1, ASO15:RNA1 및 ASO14:RNA1에 대한 ASO:RNA 이중체의 ASO 가닥에 iMeMOP 및 iMOP를 통합한 열 안정성 결과를 포함한다.
도 8은 시간(분) 경과(x-축)에 따른 남은 RNA(%)(y-축)를 나타내는, 벤치마크 ASO:RNA2, ASO15:RNA2 및 ASO13:RNA2에 대한 ASO:RNA 하이브리드의 ASO 가닥에 iMeMOP 및 iMOP를 통합한 RNase H 활성 결과를 포함한다.
1. 본 발명의 특정 실시형태에 대한 일반적인 설명:
RNAi 효능 및 지속시간을 개선하는 5'-말단 포스페이트 모방체에 대한 4'-O-메틸렌 포스포네이트 화학은 WO 2018/045317 및 미국 2019/177729호에 기재되어 있으며, 그 전문은 본원에 참고로 포함된다. 이러한 유형의 화학적 유사체는 포스페이트 기의 정전 특성 및/또는 입체적 특성을 모방할 뿐만 아니라 우수한 대사 안정성을 가지며, 표준 올리고뉴클레오타이드 고체상 합성과 완전히 호환된다.
본 개시내용의 핵산 및 이의 유사체, 및 이의 조성물은 RNA 간섭제로서 유용하다. 일부 실시형태에서, 제공된 핵산 또는 이의 유사체는 세포에서 유전자 발현을 억제한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제공하고, 여기서 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 하기 화학식 I 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로 나타내며:
[화학식 I]
Figure pct00002
식 중,
B는 핵염기 또는 수소이고;
R1 및 R2는 독립적으로 수소, 할로겐, R5, -CN, -S(O)R, -S(O)2R, -Si(OR)2R, -Si(OR)R2, 또는 -SiR3이거나:
동일한 탄소 상의 R1 및 R2가 그들의 개재 원자와 함께, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 0-3개의 헤테로원자를 갖는 3-7원 포화 또는 부분 불포화 고리를 형성하며;
각각의 R은 독립적으로 수소, 적합한 보호기, 또는 C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이거나:
동일한 원자 상의 2개의 R 기는 그들의 개재 원자와 함께, 질소, 산소, 규소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 0-3개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화, 부분 불포화 또는 헤테로아릴 고리를 형성하고;
R3은 수소, 적합한 보호기, 적합한 전구약물, 또는 C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
각각의 R4는 독립적으로 수소, 적합한 전구약물, R5, 할로겐, -CN, -NO2, -OR, -SR, -NR2, -S(O)2R, -S(O)2NR2, -S(O)R, -C(O)R, -C(O)OR, -C(O)NR2, -C(O)N(R)OR, -OC(O)R, -OC(O)NR2, -OP(O)R2, -OP(O)(OR)2, -OP(O)(OR)NR2, -OP(O)(NR2)2-, -N(R)C(O)OR, -N(R)C(O)R, -N(R)C(O)NR2, -N(R)S(O)2R, -N(R)P(O)R2, -N(R)P(O)(OR)2, -N(R)P(O)(OR)NR2, -N(R)P(O)(NR2)2, -N(R)S(O)2R, -Si(OR)2R, -Si(OR)R2, 또는 -SiR3이고;
각각의 R5는 독립적으로, C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭 고리, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
X1은 O, S 또는 NR이고;
X2는 -O-, -S-, -B(H)2-, 또는 공유 결합이고;
X3은 -O-, -S-, -Se-, 또는 -N(R)-이고;
Y1은 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 2'- 또는 3'-말단에 부착되는 연결 기이고;
Y2는 수소, 보호기, 포스포라미다이트 유사체, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 4'- 또는 5'-말단에 부착되는 뉴클레오타이드간 연결 기, 또는 고체 지지체에 부착되는 연결 기이고;
Z는 -O-, -S-, -N(R)-, 또는 -C(R)2-이고;
n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
2. 화합물 및 정의:
본 발명의 화합물(즉, 핵산 및 이의 유사체)은 일반적으로 본원에 기술된 것들을 포함하고, 본원에 개시된 부류, 하위부류 및 종에 의해 추가로 설명된다. 본원에 사용된 바와 같이, 달리 명시되지 않는한 하기 정의들이 적용된다. 본 발명의 목적 상, 화학 원소들은 원소 주기율표, CAS 버전, Handbook of Chemistry and Physics, 75th Ed.에 따라 식별된다. 또한, 유기 화학의 일반적인 원칙은 "Organic Chemistry", Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999, 및 "March's Advanced Organic Chemistry", 5th Ed., Ed.: Smith, M.B. and March, J., John Wiley & Sons, New York: 2001에 설명되어 있으며, 그 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "지방족" 또는 "지방족 기"는 완전히 포화되거나 하나 이상의 불포화 단위를 함유하는 직쇄(즉, 비분지형) 또는 분지형, 치환된 또는 치환되지 않은 탄화수소 쇄, 또는 완전히 포화되거나 하나 이상의 불포화 단위를 함유하지만 방향족이 아니고(본원에서 "카르보사이클", "고리지방족" 또는 "사이클로알킬"로도 지칭됨), 분자의 나머지 부분에 대한 단일 부착점을 갖는 모노사이클릭 탄화수소 또는 바이사이클릭 탄화수소를 의미한다. 달리 명시되지 않는 한, 지방족 기는 1-6개의 지방족 탄소 원자를 함유한다. 일부 실시형태에서, 지방족 기는 1-5개의 지방족 탄소 원자를 함유한다. 다른 실시형태에서, 지방족 기는 1-4개의 지방족 탄소 원자를 함유한다. 또 다른 실시형태에서, 지방족 기는 1-3개의 지방족 탄소 원자를 함유하고, 다른 실시형태에서, 지방족 기는 1-2개의 지방족 탄소 원자를 함유한다. 일부 실시형태에서, "고리지방족"(또는 "카르보사이클"또는 "사이클로알킬")은 완전히 포화되거나 하나 이상의 불포화 단위를 함유하지만 방향족이 아니고, 분자의 나머지 부분에 대한 단일 부착점을 갖는 모노사이클릭 C3-C6 탄화수소를 지칭한다. 적합한 지방족 기는 선형 또는 분지형, 치환된 또는 치환되지 않은 알킬, 알케닐, 알키닐 기 및 이의 하이브리드, 예컨대 (사이클로알킬)알킬, (사이클로알케닐)알킬 또는 (사이클로알킬)알케닐을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "브릿지된 바이사이클릭"은 적어도 하나의 브릿지를 갖는 임의의 바이사이클릭 고리 시스템, 즉 포화된 또는 부분 불포화된 카르보사이클릭 또는 헤테로사이클릭을 지칭한다. IUPAC에 의해 정의된 바와 같이, "브릿지"는 원자의 비분지형 쇄 또는 2개의 브릿지헤드를 연결하는 원자 또는 원자가 결합으로, 여기서 "브릿지헤드"는 3개 이상의 백본 원자에 결합되는 고리 시스템의 임의의 백본 원자이다(수소 제외). 일부 실시형태에서, 브릿지된 바이사이클릭 기는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 7-12개의 고리 원자와 0-4개의 헤테로원자를 갖는다. 이러한 브릿지된 바이사이클릭 기는 당업계에 잘 알려져 있으며, 각각의 기가 임의의 치환 가능한 탄소 또는 질소 원자에서 분자의 나머지 부분에 부착되는 하기에 제시된 기들을 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 브릿지된 바이사이클릭 기는 지방족 기에 대해 제시된 바와 같은 하나 이상의 치환기로 임의로 치환된다. 추가로, 또는 대안적으로, 브릿지된 바이사이클릭 기의 임의의 치환 가능한 질소가 임의로 치환된다. 예시적인 브릿지된 바이사이클릭은 하기를 포함한다:
Figure pct00003
용어 "저급 알킬"은 C1-4 직쇄형 또는 분지형 알킬기를 나타낸다. 예시적인 저급 알킬기는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸 및 tert-부틸이다.
용어 "저급 할로알킬"은 하나 이상의 할로겐 원자로 치환되는 C1-4 직쇄형 또는 분지형 알킬기를 지칭한다.
용어 "헤테로원자"는 산소, 황, 질소, 인 또는 규소 중 하나 이상(질소, 황, 인 또는 규소의 산화된 형태; 임의의 염기성 질소의 4차화된 형태 또는; 헤테로사이클릭 고리의 치환 가능한 질소, 예를 들어 N(3,4-디하이드로-2H-피롤릴에서와 같음), NH(피롤리디닐에서와 같음) 또는 NR+(N-치환된 피롤리디닐에서와 같음)을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "불포화"는 모이어티가 하나 이상의 불포화 단위를 가짐을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "2가 C1-8(또는 C1-6) 포화 또는 불포화, 직쇄 또는 분지형 탄화수소 쇄"는 본원에 정의된 바와 같이 직쇄 또는 분지형인 2가 알킬렌, 알케닐렌 및 알키닐렌 쇄를 지칭한다.
용어 "알킬렌"은 2가 알킬기를 지칭한다. "알킬렌 쇄"는 폴리메틸렌 기, 즉 -(CH2)n-이며, 여기서 n은 양의 정수, 바람직하게는 1 내지 6, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 2 내지 3이다. 치환된 알킬렌 쇄는 하나 이상의 메틸렌 수소 원자가 치환기로 대체된 폴리메틸렌기이다. 적합한 치환기는 치환된 지방족 기에 대해 아래에 기술된 것들을 포함한다.
용어 "알케닐렌"은 2가 알케닐 기를 지칭한다. 치환된 알케닐렌 쇄는 하나 이상의 수소 원자가 치환기로 대체되는 적어도 하나의 이중 결합을 함유하는 폴리메틸렌기이다. 적합한 치환기는 치환된 지방족 기에 대해 아래에 기술된 것들을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "사이클로프로필레닐"은 다음 구조:
Figure pct00004
의 2가 사이클로프로필 기를 지칭한다.
용어 "할로겐"은 F, Cl, Br 또는 I를 의미한다.
단독으로 또는 "아르알킬", "아르알콕시" 또는 "아릴옥시알킬"에서와 같이 더 큰 모이어티의 일부로 사용되는 용어 "아릴"은 총 5 내지 14개의 고리 원자를 갖는 모노사이클릭 또는 바이사이클릭 고리 시스템을 지칭하며, 여기서 시스템의 적어도 하나의 고리는 방향족이고, 시스템의 각 고리는 3 내지 7개의 고리 원자를 함유한다. 용어 "아릴"은 용어 "아릴 고리"와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에서, "아릴"은 하나 이상의 치환기를 보유할 수 있는 페닐, 비페닐, 나프틸, 안트라실 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 방향족 고리 시스템을 지칭한다. 또한, 용어 "아릴"의 범위 내에는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 방향족 고리가 인다닐, 프탈이미딜, 나프티미딜, 페난트리디닐 또는 테트라하이드로나프틸 등과 같은 하나 이상의 비방향족 고리에 융합된 기가 포함된다.
단독으로 또는 더 큰 모이어티의 일부로서 사용되는, 용어 "헤테로아릴" 및 "헤테로아르-", 예를 들어 "헤테로아르알킬" 또는 "헤테로아르알콕시"는 5 내지 10개의 고리 원자, 바람직하게는 5, 6, 또는 9개의 고리 원자를 갖는; 사이클릭 배열에서 공유되는 6, 10 또는 14개의 π전자를 갖는; 그리고 탄소 원자 외에 1 내지 5개의 헤테로원자를 갖는 기를 지칭한다. 용어 "헤테로원자"는 질소, 산소 또는 황을 지칭하며, 질소 또는 황의 임의의 산화된 형태, 및 염기성 질소의 임의의 4차화된 형태를 포함한다. 헤테로아릴 기는 제한 없이, 티에닐, 푸라닐, 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 옥사디아졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 티아디아졸릴, 피리딜, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 인돌리지닐, 퓨리닐, 나프티리디닐 및 프테리디닐을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "헤테로아릴" 및 "헤테로아르-"는 헤테로방향족 고리가 하나 이상의 아릴, 고리지방족 또는 헤테로사이클릴 고리에 융합된 기를 포함하며, 여기서 라디칼 또는 부착 지점은 헤테로방향족 고리 상에 있다. 비제한적인 예는 인돌릴, 이소인돌릴, 벤조티에닐, 벤조푸라닐, 디벤조푸라닐, 인다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤즈티아졸릴, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 신놀리닐, 프탈라지닐, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 4H-퀴놀리지닐, 카르바졸릴, 아크리디닐, 페나지닐, 페노티아지닐, 페녹사지닐, 테트라하이드로퀴놀리닐, 테트라하이드로이소퀴놀리닐, 및 피리도[2,3-b]-1,4-옥사진-3(4H)-온을 포함한다. 헤테로아릴 기는 모노사이클릭 또는 바이사이클릭일 수 있다. 용어 "헤테로아릴"은 용어들 "헤테로아릴 고리", "헤테로아릴 기" 또는 "헤테로방향족"과 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 이들 중 임의의 용어는 임의로 치환된 고리를 포함한다. 용어 "헤테로아르알킬"은 헤테로아릴에 의해 치환된 알킬 기를 지칭하며, 여기서 알킬 및 헤테로아릴 부분은 독립적으로 임의로 치환된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어들 "헤테로사이클", "헤테로사이클릴", "헤테로사이클릭 라디칼" 및 "헤테로사이클릭 고리"는 상호교환적으로 사용되며, 포화된 또는 부분 불포화되고, 탄소 원자 이외에, 하나 이상, 바람직하게는 1 내지 4개의 상기 정의된 헤테로원자를 갖는 안정한 5- 내지 7-원 모노사이클릭 또는 7-10-원 바이사이클릭 헤테로사이클릭 모이어티를 지칭한다. 헤테로사이클의 고리 원자와 관련하여 사용될 때, 용어 "질소"는 치환된 질소를 포함한다. 예를 들어, 산소, 황 또는 질소에서 선택된 0-3개의 헤테로원자를 갖는 포화 또는 부분 불포화 고리에서, 질소는 (3,4-디하이드로-2H-피롤릴에서와 같은) N, (피롤리디닐에서와 같은) NH, 또는 (N-치환된 피롤리디닐에서와 같은) +NR일 수 있다.
헤테로사이클릭 고리는 안정한 구조를 초래하는 임의의 헤테로원자 또는 탄소 원자에서 그의 펜던트 기에 부착될 수 있고, 임의의 고리 원자는 임의로 치환될 수 있다. 이러한 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭 라디칼의 예는 제한 없이, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로티오페닐 피롤리디닐, 피페리디닐, 피롤리닐, 테트라하이드로퀴놀리닐, 테트라하이드로이소퀴놀리닐, 데카하이드로퀴놀리닐, 옥사졸리디닐, 피페라지닐, 디옥사닐, 디옥솔라닐, 디아제피닐, 옥사제피닐, 티아제피닐, 모르폴리닐, 및 퀴누클리디닐을 포함한다. 용어들 "헤테로사이클", "헤테로사이클릴", "헤테로사이클릴 고리", "헤테로사이클릭 기", "헤테로사이클릭 모이어티" 및 "헤테로사이클릭 라디칼"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 또한 헤테로사이클릴 고리가 하나 이상의 아릴, 헤테로아릴, 또는 고리지방족 고리, 예컨대 인돌리닐, 3H-인돌릴, 크로마닐, 페난트리디닐 또는 테트라하이드로퀴놀리닐에 융합된 기들을 포함한다. 헤테로사이클릴 기는 모노사이클릭 또는 바이사이클릭일 수 있다. 용어 "헤테로사이클릴알킬"은 헤테로사이클릴에 의해 치환된 알킬 기를 지칭하며, 여기서 알킬 및 헤테로사이클릴 부분은 독립적으로 임의로 치환된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "부분 불포화"는 적어도 하나의 이중 또는 삼중 결합을 포함하는 고리 모이어티를 지칭한다. 용어 "부분 불포화"는 다중 불포화 부위를 갖는 고리를 포함하도록 의도되지만, 본원에 정의된 바와 같은 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 화합물은 "임의로 치환된" 모이어티를 함유할 수 있다. 일반적으로, 용어 "임의로"가 앞에 오든 그렇지 않든, 용어 "치환된"은 지정된 모이어티의 하나 이상의 수소가 적합한 치환기로 대체됨을 의미한다. 달리 명시되지 않는 한, "임의로 치환된" 기는 기의 각 치환가능한 위치에 적합한 치환기를 가질 수 있고, 임의의 주어진 구조에서의 하나 이상의 위치가 특정 기로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있는 경우, 치환기는 모든 위치에서 동일하거나 상이할 수 있다. 본 발명에 의해 구상되는 치환기의 조합은 바람직하게는 안정하거나 화학적으로 실현가능한 화합물의 형성을 초래하는 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "안정한"은 이들의 생성, 검출, 및 특정 실시형태에서, 이들의 회수, 정제 및 본원에 개시된 목적들 중 하나 이상을 위한 용도를 허용하는 조건에 적용될 때 실질적으로 변경되지 않는 화합물을 지칭한다.
"임의로 치환된" 기의 치환 가능한 탄소 원자 상의 적합한 1가 치환기는 독립적으로 할로겐; -(CH2)0-4R°; -(CH2)0-4OR°; -O(CH2)0-4Ro, -O-(CH2)0-4C(O)OR°; -(CH2)0-4CH(OR°)2; -(CH2)0-4SR°; R°로 치환될 수 있는, -(CH2)0-4Ph; R°로 치환될 수 있는, -(CH2)0-4O(CH2)0-1Ph; R°로 치환될 수 있는, -CH=CHPh; R°로 치환될 수 있는, -(CH2)0-4O(CH2)0-1-피리딜; -NO2; -CN; -N3; -(CH2)0-4N(R°)2; -(CH2)0-4N(R°)C(O)R°; -N(R°)C(S)R°; -(CH2)0-4N(R°)C(O)NR°2; -N(R°)C(S)NR°2; -(CH2)0-4N(R°)C(O)OR°; -N(R°)N(R°)C(O)R°; -N(R°)N(R°)C(O)NR°2; -N(R°)N(R°)C(O)OR°; -(CH2)0-4C(O)R°; -C(S)R°; -(CH2)0-4C(O)OR°; -(CH2)0-4C(O)SR°; -(CH2)0-4C(O)OSiR°3; -(CH2)0-4OC(O)R°; -OC(O)(CH2)0-4SR-, SC(S)SR°; -(CH2)0-4SC(O)R°; -(CH2)0-4C(O)NR°2; -C(S)NR°2; -C(S)SR°; -SC(S)SR°, -(CH2)0-4OC(O)NR°2; -C(O)N(OR°)R°; -C(O)C(O)R°; -C(O)CH2C(O)R°; -C(NOR°)R°; -(CH2)0-4SSR°; -(CH2)0-4S(O)2R°; -(CH2)0-4S(O)2OR°; -(CH2)0-4OS(O)2R°; -S(O)2NR°2; -(CH2)0-4S(O)R°; -N(R°)S(O)2NR°2; -N(R°)S(O)2R°; -N(OR°)R°; -C(NH)NR°2; -P(O)2R°; -P(O)R°2; -OP(O)R°2; -OP(O)(OR°)2; SiR°3; -(C1-4 직쇄형 또는 분지형 알킬렌)O-N(R°)2; 또는 -(C1-4 직쇄형 또는 분지형 알킬렌)C(O)O-N(R°)2이며, 여기서 각각의 R°는 아래 정의된 바와 같이 치환될 수 있고, 독립적으로 수소, C1-6 지방족, -CH2Ph, -O(CH2)0-1Ph, -CH2-(5-6원 헤테로아릴 고리), 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 포화, 부분 불포화, 또는 아릴 고리, 또는, 위의 정의에도 불구하고 2개의 독립적인 R°발생은 개재 원자(들)과 함께 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0-4개의 헤테로원자를 갖는 3-12원 포화, 부분 불포화 또는 아릴 모노사이클릭 또는 바이사이클릭 고리를 형성하며, 이는 아래 정의된 바와 같이 치환될 수 있다.
R°(또는 2개의 독립적인 R°발생을 개재 원자와 함께 취함으로써 형성된 고리) 상의 적합한 1가 치환기는 독립적으로 할로겐, -(CH2)0-2R●, -(할로R●), -(CH2)0-2OH, -(CH2)0-2OR●, -(CH2)0-2CH(OR●)2; -O(할로R●), -CN, -N3, -(CH2)0-2C(O)R●, -(CH2)0-2C(O)OH, -(CH2)0-2C(O)OR●, -(CH2)0-2SR●, -(CH2)0-2SH, -(CH2)0-2NH2, -(CH2)0-2NHR●, -(CH2)0-2NR● 2, -NO2, -SiR● 3, -OSiR● 3, -C(O)SR● , -(C1-4 직쇄형 또는 분지형 알킬렌)C(O)OR● 또는 -SSR●이며, 여기서 각 R●은 치환되지 않거나 앞에 "할로"가 있는 경우, 하나 이상의 할로겐으로만 치환되고, C1-4 지방족, -CH2Ph, -O(CH2)0-1Ph, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 포화, 부분 불포화 또는 아릴 고리로부터 독립적으로 선택된다. R°의 포화 탄소 원자 상의 적합한 2가 치환기는 =O 및 =S를 포함한다.
"임의로 치환된" 기의 포화 탄소 원자 상의 적합한 2가 치환기는 =O, =S, =NNR* 2, =NNHC(O)R*, =NNHC(O)OR*, =NNHS(O)2R*, =NR*, =NOR*, -O(C(R* 2))2-3O-, 또는 -S(C(R* 2))2-3S-을 포함하며, 여기서 R*의 각각의 독립적인 발생은 수소, 아래 정의된 바와 같이 치환될 수 있는 C1-6 지방족, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0-4개의 헤테로원자를 갖는 치환되지 않은 5-6원 포화, 부분 불포화 또는 아릴 고리로부터 선택된다. "임의로 치환된" 기의 인접 치환 가능한 탄소에 결합된 적합한 2가 치환기는: -O(CR* 2)2-3O-을 포함하며, 여기서 R*의 각각의 독립적인 발생은 수소, 하기 정의된 바와 같이 치환될 수 있는 C1-6 지방족, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0-4개의 헤테로원자를 갖는 치환되지 않은 5-6원 포화, 부분 불포화, 또는 아릴 고리로부터 선택된다.
R*의 지방족 기 상의 적합한 치환기는 할로겐, -R●, -(할로R●), -OH, -OR●, -O(할로R●), -CN, -C(O)OH, -C(O)OR●, -NH2, -NHR●, -NR● 2, 또는 -NO2를 포함하며, 각각의 R●은 치환되지 않거나, "할로"가 앞에 오는 경우 하나 이상의 할로겐으로 만 치환되고, 독립적으로 C1-4 지방족, -CH2Ph, -O(CH2)0-1Ph, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 포화, 부분 불포화, 또는 아릴 고리이다.
"임의로 치환된" 기의 치환가능한 질소 상의 적합한 치환기는 -R†, -NR† 2, -C(O)R†, -C(O)OR†, -C(O)C(O)R†, -C(O)CH2C(O)R†, -S(O)2R†, -S(O)2NR† 2, -C(S)NR† 2, -C(NH)NR† 2, 또는 -N(R†)S(O)2R†를 포함하며; 여기서 각 R†은 독립적으로 수소, 아래 정의된 바와 같이 치환될 수 있는 C1-6 지방족, 치환되지 않은 -OPh, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0-4개의 헤테로원자를 갖는 치환되지 않은 5-6원 포화, 부분 불포화, 또는 아릴 고리이며, 또는 위의 정의에도 불구하고 R†의 2개의 독립적인 발생은 그들의 개재 원자(들)과 함께, 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0-4개의 헤테로원자를 갖는 치환되지 않은 3-12원 포화, 부분 불포화, 또는 아릴 모노사이클릭 또는 바이사이클릭 고리를 형성한다.
R†의 지방족 기 상의 적합한 치환기는 독립적으로 할로겐, -R●, -(할로R●), -OH, -OR●, -O(할로R●), -CN, -C(O)OH, -C(O)OR●, -NH2, -NHR●, -NR● 2, 또는 -NO2이며, 여기서 각 R●은 치환되지 않거나 "할로"가 앞에 오는 경우 하나 이상의 할로겐으로만 치환되며, 독립적으로 C1-4　지방족, -CH2Ph, -O(CH2)0-1Ph, 또는 질소, 산소 또는 황으로부터 독립적으로 선택된 0-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 포화, 부분 불포화, 또는 아릴 고리이다.
달리 언급되지 않는 한, 본원에 도시된 구조는 또한 구조의 모든 이성질체(예를 들어, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 및 기하(또는 입체)) 형태; 예를 들어, 각 비대칭 중심에 대한 R 및 S 배좌, Z 및 E 이중 결합 이성질체, 및 Z 및 E 입체 이성질체를 포함하는 것을 의미한다. 따라서, 단일 입체화학적 이성질체 뿐만 아니라 본 화합물의 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 및 기하(또는 입체) 혼합물은 본 발명의 범위 내에 있다. 달리 언급되지 않는 한, 본 발명의 화합물의 모든 호변이성질체 형태는 본 발명의 범위 내에 있다. 추가로, 달리 언급되지 않는 한, 본원에 도시된 구조는 또한 하나 이상의 동위원소 농축 원자의 존재하에서만 상이한 화합물을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 수소를 중수소 또는 삼중수소로 대체하거나 탄소를 13C- 또는 14C-농축 탄소로 대체하는 것을 포함하는 본 발명의 구조를 갖는 화합물이 본 발명의 범위 내에 있다. 이러한 화합물은 예를 들어 분석 도구로서, 생물학적 검정에서 프로브로서, 또는 본 발명에 따른 치료제로서 유용하다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "한(a)", "일(an)" 및 "그(the)"는 문맥이 달리 명시하지 않는 한 복수의 언급을 포함한다. 예를 들어, "한 방법"에 대한 언급은 하나 이상의 방법, 및/또는 본원에 설명된 유형의 단계들 및/또는 본 개시내용 등을 읽을 때 당업자에게 명백해질 것을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "및/또는"은 달리 나타내지 않는 한 "및" 또는 "또는"을 의미하기 위해 본 개시내용에서 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "4'-O-메틸렌 포스포네이트"는 모든 치환된 메틸렌 유사체(예를 들어, 메틸, 디메틸, 에틸, 플루오로, 사이클로프로필 등으로 치환된 메틸렌) 및 모든 포스포네이트 유사체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티올레이트, 포스포디에스테르 등)를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "5'-말단 뉴클레오타이드"는 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단에 위치한 뉴클레오타이드를 지칭한다. 5'-말단 뉴클레오타이드는 또한 본 출원에서 "N1 뉴클레오타이드"로 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "앱타머"는 핵산, 단백질, 특정 전체 세포 또는 특정 조직을 포함하는 특정 표적에 대한 결합 친화도를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다. 앱타머는 예를 들어, 예를 들어, 핵산의 대규모 무작위 서열 풀로부터 시험관내 선택에 의해 당업계에 공지된 방법을 사용하여 얻을 수 있다. Lee et al.,　NUCLEIC ACID RES.,　2004, 32:D95-D100.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "안타고미르(antagomir)"는 외인성 RNAi 억제제 분자 또는 천연 miRNA의 가이드 가닥을 포함하여 특정 표적에 대한 결합 친화도를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다(Krutzfeldt et al. NATURE 2005, 438(7068): 685-689).
이중 가닥 RNAi 억제제 분자는 2개의 올리고뉴클레오타이드 가닥, 즉 안티센스 가닥과 센스 가닥을 포함한다. 안티센스 가닥 또는 이의 영역은 표적 핵산의 상응하는 영역에 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상호적이다. 또한, 이중 가닥 RNAi 억제제 분자 또는 이의 영역의 안티센스 가닥은 이중 가닥 RNAi 억제제 분자 또는 이의 영역의 센스 가닥에 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상보적이다. 특정 실시형태에서, 안티센스 가닥은 또한 표적 핵산 서열에 비해 비-상보적인 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 비-상보적인 뉴클레오타이드는 상보적 서열의 한쪽에 있거나, 상보적 서열의 양쪽에 있을 수 있다. 특정 실시형태에서, 안티센스 가닥 또는 이의 영역이 센스 가닥 또는 이의 영역에 부분적으로 또는 실질적으로 상보적인 경우, 비-상보적인 뉴클레오타이드는 하나 이상의 상보성 영역(예를 들어, 하나 이상의 미스매치) 사이에 위치될 수 있다. 이중 가닥 RNAi 억제제 분자의 안티센스 가닥은 가이드 가닥으로도 지칭된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "정준 RNA 억제제 분자"는 이중 가닥 핵산의 형성을 위한 19개 염기쌍 길이인 상보성 중심 영역을 갖고 3-말단의 각각에 2개의 뉴클레오타이드 오버핸드를 갖는 각각 21개 뉴클레오타이드 길이의 2개의 핵산 가닥을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상보적"은 2개의 뉴클레오타이드가 서로 염기쌍을 형성하도록 허용하는 2개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 2개의 반대 핵산 또는 단일 핵산 가닥의 반대 영역) 사이의 구조적 관계를 지칭한다. 예를 들어, 반대 핵산의 피리미딘 뉴클레오타이드에 상보적인 한 핵산의 퓨린 뉴클레오타이드는 서로 수소 결합을 형성함으로써 함께 염기쌍을 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상보적 뉴클레오타이드는 왓슨-크릭 방식으로 또는 안정한 이중체의 형성을 허용하는 임의의 다른 방식으로 염기쌍을 형성할 수 있다. "완전한 상보성" 또는 100% 상보성은 제1 올리고뉴클레오타이드 가닥 또는 제1 올리고뉴클레오타이드 가닥의 세그먼트의 각 뉴클레오타이드 단량체가 제2 올리고뉴클레오타이드 가닥 또는 제2 올리고뉴클레오타이드 가닥의 세그먼트의 각 뉴클레오타이드 단량체와 염기쌍을 형성할 수 있는 상황을 지칭한다. 100% 미만의 상보성은 2개의 올리고뉴클레오타이드 가닥(또는 2개의 올리고뉴클레오타이드 가닥의 2개 세그먼트)의 전체가 아닌 일부 뉴클레오타이드 단량체가 서로 염기쌍을 형성할 수 있는 상황을 지칭한다. "실질적인 상보성"은 서로에 대해 90% 이상의 상보성을 나타내는 2개의 올리고뉴클레오타이드 가닥(또는 2개의 올리고뉴클레오타이드 가닥의 세그먼트)을 지칭한다. "충분히 상보적인"은 표적 mRNA와 핵산 억제제 분자 사이의 상보성을 지칭하는 것으로서 표적 mRNA에 의해 암호화된 단백질 양이 감소된 그런 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상보성 가닥"은 다른 가닥에 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상보적인 이중 가닥 핵산 억제제 분자의 가닥을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기존의 안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 다음 메커니즘 중 하나에 의해 표적화된 유전자의 발현을 억제하는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다: (1) 예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 예를 들어, 유전자의 전사, 프리-mRNA의 스플라이싱 및 mRNA의 번역을 직접 간섭함으로써 암호화된 단백질의 유전자 발현 및/또는 생산에 관여하는 일련의 이벤트에서 일부 단계를 저해하는, 입체 장해; (2) RNase H에 의한 표적 유전자의 RNA 전사체의 효소적 소화 유도; (3) RNase L에 의한 표적 유전자의 RNA 전사체의 효소적 소화 유도; (4) RNase P에 의한 표적 유전자의 RNA 전사체의 효소적 소화 유도; (5) 이중 가닥 RNase에 의한 표적 유전자의 RNA 전사체의 효소적 소화 유도; 및 (6) 동일한 안티센스 올리고에서 결합된 입체 장해 및 효소적 소화 활성 유도. 기존의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 RNAi 억제제 분자와 같은 RNAi 작용 메커니즘을 갖고 있지 않다. RNAi 억제제 분자는 안티센스 가닥이 Ago2 단백질을 의도된 표적(들)으로 향하게 하고 Ago2가 표적의 침묵화에 필요한 경우에 RNAi 안티센스 가닥과 결합하는 Ago2에 대한 요건을 포함하여 여러 방식으로 기존의 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 구별될 수 있다.
클러스터링된 규칙적으로 이격된 짧은 회문 반복체("CRISPR")는 침입하는 파지 및 플라스미드에 대한 방어에 관여하는 미생물 뉴클레아제 시스템이다. Wright et al.,　Cell,　2016, 164:29-44. 이 원핵생물 시스템은 진핵생물 세포의 게놈에서 관심 표적 핵산 서열을 편집하는데 사용하도록 적용되었다. Cong et al.,　SCIENCE,　2013, 339:819-23; Mali et al.,　SCIENCE,　2013, 339:823-26; Woo Cho et al.,　NAT. BIOTECHNOLOGY,　2013, 31(3):230-232. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "CRISPR RNA"는 "CRISPR" RNA(crRNA) 부분 및/또는 트랜스 활성화 crRNA(tracrRNA) 부분을 포함하는 핵산을 지칭하며, 여기서 CRISPR 부분은 표적 핵산에 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상보적인 제1 서열과 tracrRNA 부분에 충분히 상보적인 제2 서열(추적자 메이트 서열이라고도 지칭됨)을 가지고 있어, 추적자 메이트 서열 및 tracrRNA 부분이 혼성화하여 가이드 RNA를 형성한다. 가이드 RNA는 Cas 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9)와 같은 엔도뉴클레아제와 복합체를 형성하고 뉴클레아제가 표적 핵산의 절단을 매개하도록 지시한다. 특정 실시형태에서, crRNA 부분은 tracrRNA 부분에 융합되어 키메라 가이드 RNA를 형성한다. Jinek et al., SCIENCE, 2012, 337:816-21. 특정 실시형태에서, crRNA 부분의 제1 서열은 표적 핵산에 혼성화하는 약 16 내지 약 24개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 약 20개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 실시형태에서, 가이드 RNA는 약 10-500개의 뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 가이드 RNA는 약 20-100개의 뉴클레오타이드이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "전달제"는 올리고뉴클레오타이드와 복합체를 형성하거나 이에 결합되고 세포 내로의 그의 진입을 매개하는 형질감염제 또는 리간드를 지칭한다. 이 용어는 예를 들어 올리고뉴클레오타이드의 음전하와 결합하는 순 양전하를 갖는 양이온성 리포솜을 포함한다. 이 용어는 또한 특정 조직으로의 직접 전달을 위해 올리고뉴클레오타이드에 공유적으로 부착될 수 있는 GalNAc 및 콜레스테롤과 같은 본원에 기재된 접합체를 포함한다. 추가의 특정한 적합한 전달제가 또한 본원에 기재되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "데옥시리보뉴클레오타이드"는 당 모이어티의 2'-위치에 수소 기를 갖는 뉴클레오타이드를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "디설파이드"는
Figure pct00005
기를 함유하는 화학적 화합물을 지칭한다. 전형적으로, 각 황 원자는 탄화수소 기에 공유 결합된다. 특정 실시형태에서, 적어도 하나의 황 원자는 탄화수소 이외의 기에 공유 결합된다. 결합은 SS-결합 또는 디설파이드 브릿지라고도 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 핵산(예를 들어, 올리고뉴클레오타이드)과 관련하여 용어 "이중체"는 뉴클레오타이드의 2개의 역평행 서열의 상보적 염기 쌍을 통해 형성된 이중 나선 구조를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "부형제"는 예를 들어 원하는 일관성 또는 안정화 효과를 제공하거나 이에 기여하기 위해 조성물에 포함될 수 있는 비-치료제를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "푸라노스"는 5원 고리 구조를 갖는 탄수화물을 지칭하며, 여기서 고리 구조는
Figure pct00006
로 나타낸 4개의 탄소 원자 및 1개의 산소 원자를 가지며, 여기서 숫자는 5원 고리 구조에서 4개의 탄소 원자의 위치를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "글루타티온”(GSH)은 구조
Figure pct00007
를 갖는 트리펩타이드를 지칭한다. GSH는 대략 1-10 mM의 농도로 세포에 존재한다. GSH는 디설파이드 결합을 포함하여, 글루타티온-민감한 결합을 감소시킨다. 이 과정에서, 글루타티온은 산화된 형태인 글루타티온 디설파이드(GSSG)으로 전환된다. 일단 산화되면, 글루타티온은 NADPH를 전자 공여체로 사용하여 글루타티온 환원효소에 의해 다시 환원될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "글루타티온-민감성 화합물" 또는 "글루타티온-민감성 모이어티"는 상호교환적으로 사용되며, 임의의 화학적 화합물(예를 들어, 올리고뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드) 또는 적어도 하나의 글루타티온-민감성 결합, 예컨대 디설파이드 브릿지 또는 설포닐 기를 함유하는 모이어티를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "글루타티온-민감성 올리고뉴클레오타이드"는 글루타티온-민감성 결합을 함유하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 함유하는 올리고뉴클레오타이드이다. 글루타티온-민감성 모이어티는 당 모이어티의 2'-탄소 또는 3'-탄소에 위치할 수 있으며, 설포닐 기 또는 디설파이드 브릿지를 포함한다. 특정 실시형태에서, 글루타티온-민감성 모이어티는 예를 들어 국제 특허 출원 번호 PCT/US2017/048239에 기재된 바와 같이 포스포라미다이트 올리고뉴클레오타이드 합성 방법과 양립가능하며, 그의 전체가 본원에 참고로 포함된다. 글루타티온-민감성 모이어티는 또한 인 함유 뉴클레오타이드간 연결에 위치할 수 있다. 특정 실시형태에서, 글루타티온-민감성 모이어티는 PCT/US2013/072536에 기재된 바와 같은 것들로부터 선택되며, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "뉴클레오타이드간 연결 기" 또는 "뉴클레오타이드간 연결"은 2개의 뉴클레오사이드 모이어티를 공유적으로 연결할 수 있는 화학 기를 지칭한다. 전형적으로, 화학 기는 포스포 또는 포스파이트 기를 함유하는 인-함유 연결 기이다. 포스포 연결 기는 포스포디에스테르 연결, 포스포로디티오에이트 연결, 포스포로티오에이트 연결, 포스포트리에스테르 연결, 티오노알킬포스포네이트 연결, 티온알킬포스포트리에스테르 연결, 포스포라미다이트 연결, 포스포네이트 연결 및/또는 보라노포스페이트 연결을 포함하여 의미한다. 다수의 인-함유 연결은 예를 들어 미국 특허 제3,687,808호; 제4,469,863호; 제4,476,301호; 제5,023,243호; 제5,177,196호; 제5,188,897호; 제5,264,423호; 제5,276,019호; 제5,278,302호; 제5,286,717호; 제5,321,131호; 제5,399,676호; 제5,405,939호; 제5,453,496호; 제5,455,233호; 제5,466,677호; 제5,476,925호; 제5,519,126호; 제5,536,821호; 제5,541,306호; 제5,550,111호; 제5,563,253호; 제5,571,799호; 제5,587,361호; 제5,194,599호; 제5,565,555호; 제5,527,899호; 제5,721,218호; 제5,672,697호 및 제5,625,050호에 개시된 바와 같이 당업계에 잘 알려져 있다. 다른 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 인 원자를 함유하지 않는 하나 이상의 뉴클레오타이드간 연결 기, 예컨대 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오타이드간 연결, 혼합된 헤테로원자와 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오타이드간 연결, 또는 실록산 백본; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 백본; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 리보아세틸 백본; 알켄 함유 백본; 설파메이트 백본; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 백본; 설포네이트 및 설폰아미드 백본; 및 아미드 백본을 갖는 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 하나 이상의 단쇄 헤테로방향족 또는 헤테로사이클릭 뉴클레오타이드간 연결을 함유한다. 비-인 함유 연결은 예를 들어, 미국 특허 제5,034,506호; 제5,166,315호; 제5,185,444호; 제5,214,134호; 제5,216,141호; 제5,235,033호; 제5,264,562호; 제5,264,564호; 제5,405,938호; 제5,434,257호; 제5,466,677호; 제5,470,967호; 제5,489,677호; 제5,541,307호; 제5,561,225호; 제5,596,086호; 제5,602,240호; 제5,610,289호; 제5,602,240호; 제5,608,046호; 제5,610,289호; 제5,618,704호; 제5,623,070호; 제5,663,312호; 제5,633,360호; 제5,677,437호; 제5,792,608호; 제5,646,269호 및 제5,677,439호에 개시된 바와 같이 당업계에 잘 알려져 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "루프"는 핵산의 단일 가닥에 의해 형성되는 구조를 지칭하며, 특정 단일 가닥 뉴클레오타이드 영역에 인접하는 상보적 영역이 이중체 형성 또는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 형성에서 상보적 영역 사이의 단일 가닥 뉴클레오타이드 영역이 배제되는 방식으로 혼성화된다. 루프는 임의의 길이의 단일 가닥 뉴클레오타이드 영역이다. 루프의 예에는 헤어핀 및 테트라루프와 같은 구조에 존재하는 쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드가 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "microRNA" "성숙한 microRNA" "miRNA" 및 "miR"은 상호교환 가능하며, 식물 및 동물의 게놈에서 암호화된 비-암호화 RNA 분자를 지칭한다. 전형적으로 성숙한 microRNA는 길이가 약 18-25개 뉴클레오타이드이다. 특정 예에서, 고도로 보존되고 내인적으로 발현된 microRNA는 특정 mRNA의 3'-비번역 영역(3'-UTR)에 결합함으로써 유전자의 발현을 조절한다. 특정 성숙한 microRNA는 길이가 수백 뉴클레오타이드인 긴 내인성 기본 microRNA 전사체(pre-microRNA, pri-microRNA, pri-mirs, pri-miR 또는 pri-pre-microRNA로도 지칭됨)에서 유래하는 것으로 보인다(Lee, et al.,　EMBO　1, 2002, 21(17), 4663-4670).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변형된 뉴클레오사이드"는 변형된 또는 일반 핵염기 또는 변형된 당 중 하나 이상을 함유하는 뉴클레오사이드를 지칭한다. 변형된 또는 일반 핵염기(본원에서도 염기 유사체로도 지칭됨)는 일반적으로 뉴클레오사이드 당 모이어티의 1'-위치에 위치하며, 1'-위치에서의 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 및 우라실 이외의 핵염기를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 변형된 또는 일반 핵염기는 질소성 염기이다. 특정 실시형태에서, 변형된 핵염기는 질소 원자를 함유하지 않는다. 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 번호 20080274462호를 참조한다. 특정 실시형태에서, 변형된 뉴클레오타이드는 핵염기를 함유하지 않는다(무염기). 변형된 당(본원에서 당 유사체로도 지칭됨)은 예를 들어 당의 2', 3'-, 4', 또는 5'-탄소 위치에서 변형이 일어나는, 변형된 데옥시리보스 또는 리보스 모이어티를 포함한다. 변형된 당은 또한 잠금 핵산("LNA")(예를 들어, Koshkin et al. (1998),　TETRAHEDRON,　54, 3607-3630 참조); 브릿지된 핵산("BNA")(예를 들어, 미국 특허 제7,427,672호 및 Mitsuoka et al. (2009),　NUCLEIC ACIDS RES.,　37(4):1225-38 참조); 및 잠금해제된 핵산("UNA")(예를 들어, Snead et al. (2013),　MOLECULAR THERAPY―NUCLEIC ACIDS,　2, e103 (doi:10.1038/mtna.2013.36) 참조)에 존재하는 것과 같은 비천연 대체 탄소 구조를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 맥락에서 적합한 변형된 또는 일반 핵염기 또는 변형된 당이 본원에 기재되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변형된 뉴클레오타이드"는 변형된 또는 일반 핵염기 또는 변형된 당 중 하나 이상을 함유하는 뉴클레오타이드를 지칭한다. 변형된 또는 일반 핵염기(본원에서도 핵염기로도 지칭됨)는 일반적으로 뉴클레오사이드 당 모이어티의 1'-위치에 위치하며, 1'-위치에서의 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 및 우라실 이외의 핵염기를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 변형된 또는 일반 핵염기는 질소성 염기이다. 특정 실시형태에서, 변형된 핵염기는 질소 원자를 함유하지 않는다. 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 번호 20080274462호를 참조한다. 특정 실시형태에서, 변형된 뉴클레오타이드는 핵염기를 함유하지 않는다(무염기). 변형된 당(본원에서 당 유사체로도 지칭됨)은 예를 들어 당의 2'-, 3'-, 4'-, 또는 5'-탄소 위치에서 변형이 일어나는, 변형된 데옥시리보스 또는 리보스 모이어티를 포함한다. 변형된 당은 또한 잠금 핵산("LNA")(예를 들어, Koshkin et al. (1998),　TETRAHEDRON,　54, 3607-3630 참조); 브릿지된 핵산("BNA")(예를 들어, 미국 특허 제7,427,672호 및 Mitsuoka et al. (2009),　NUCLEIC ACIDS RES.,　37(4):1225-38 참조); 및 잠금해제된 핵산("UNA")(예를 들어, Snead et al. (2013),　MOLECULAR THERAPY―NUCLEIC ACIDS,　2, e103 (doi:10.1038/mtna.2013.36) 참조)에 존재하는 것과 같은 비천연 대체 탄소 구조를 포함할 수 있다. 변형된 포스페이트 기는 천연 뉴클레오타이드에서 발생하지 않는 포스페이트 기의 변형을 지칭하고, 본원에 기재된 비-천연 발생 포스페이트 모방체를 포함한다. 변형된 포스페이트 기는 또한 본원에 기재된 바와 같이 인 함유 뉴클레오타이드간 연결 기 및 비-인 함유 연결 기를 모두 포함하는 비-천연 발생 뉴클레오타이드간 연결 기를 포함한다. 본 개시내용의 맥락에서 적합한 변형된 또는 일반 핵염기 또는 변형된 당, 또는 변형된 포스페이트가 본원에 기재되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "네이키드 핵산"은 보호 지질 나노입자 또는 기타 보호 제형에서 제형화되지 않아 생체내 투여될 때 혈액 및 엔도솜/리소솜 구획에 노출되는 핵산을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "천연 뉴클레오사이드"는 당(예를 들어, 데옥시리보스 또는 리보스 또는 이들의 유사체)과의 N-글리코사이드 연결에서의 헤테로사이클릭 질소성 염기를 지칭한다. 천연 헤테로사이클릭 질소성 염기에는 아데닌, 구아닌, 시토신, 우라실 및 티민이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "천연 뉴클레오타이드"는 당(예를 들어, 리보스 또는 데옥시리보스 또는 이들의 유사체)과의 N-글리코사이드 연결에서의 헤테로사이클릭 질소성 염기를 지칭한다. 천연 헤테로사이클릭 질소성 염기에는 아데닌, 구아닌, 시토신, 우라실 및 티민이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산 또는 이의 유사체"는 임의의 천연 또는 변형된 뉴클레오타이드, 뉴클레오사이드, 올리고뉴클레오타이드, 기존의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보자임, RNAi 억제제 분자, 안티센스 올리고(ASO), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 정준 RNA 억제제 분자, 앱타머, 안타고미르, 엑손 스키핑 또는 스플라이스 변경 올리고, mRNA, miRNA, 또는 본원에 기재된 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결 중 하나 이상을 포함하는 CRISPR 뉴클레아제 시스템을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 제공된 핵산 또는 이의 유사체는 U.S. 2010/331389, 미국 특허 제8,513,207호, 미국 특허 제10,131,912호, 미국 특허 제8,927,705호, CA 2,738,625호, EP 2,379,083호, 및 EP 3,234,132호에 기재된 것들을 포함하여 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 및 다이서 기질 siRNA에 사용되며, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산 억제제 분자"는 표적 유전자의 발현을 감소시키거나 제거하는 올리고뉴클레오타이드 분자를 지칭하며, 여기서 올리고뉴클레오타이드 분자는 표적 유전자 mRNA의 서열을 특이적으로 표적화하는 영역을 함유한다. 전형적으로, 핵산 억제제 분자의 표적화 영역은 핵산 억제제 분자의 효과를 특정된 표적 유전자로 향하게 하기 위해 표적 유전자 mRNA 상의 서열에 충분히 상보적인 서열을 포함한다. 핵산 억제제 분자는 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 및/또는 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "핵염기"는 천연 핵염기, 변형된 핵염기 또는 일반 핵염기를 지칭한다. 핵염기는 핵산 이중체에 통합될 수 있는 변형된 뉴클레오타이드에서 뉴클레오타이드 당 모이어티의 1' 위치(또는 핵산 이중체에 통합될 수 있는 뉴클레오타이드 당 모이어티 치환에서 등가 위치)에 위치한 헤테로사이클릭 모이어티이다. 따라서, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 및 이의 유사체를 제공하며, 여기서 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 핵염기가 일반적으로 퓨린 또는 피리미딘 염기인 화학식 I로 나타낸다. 일부 실시형태에서, 핵염기는 또한 공통 염기 구아닌(G), 시토신(C), 아데닌(A), 티민(T), 또는 우라실(U), 또는 이들의 유도체, 예컨대 올리고뉴클레오타이드의 제조에 사용하기에 적합한 보호된 유도체를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵염기 G, A, 및 C 각각은 독립적으로 이소부티릴, 아세틸, 디플루오로아세틸, 트리플루오로아세틸, 페녹시아세틸, 이소프로필페녹시아세틸, 벤조일, 9-플루오레닐메톡시카르보닐, 페녹시아세틸, 디메틸포름아미딘, 디부틸포라미딘 및 N,N-디페닐카르바메이트로부터 선택된 보호기를 포함한다. 핵염기 유사체는 dsRNA의 다른 염기 또는 염기 유사체와 이중화될 수 있다. 핵염기 유사체는 핵산 및 이의 유사체 및 본 발명의 방법에 유용한 것들, 예를 들어 Benner의 미국 특허 제5,432,272호 및 제6,001,983호 및 Manoharan의 미국 특허 공개 번호 20080213891에 기재된 것들을 포함하며, 이들은 본원에 참고로 포함된다. 핵염기의 비제한적인 예는 하이포크산틴(I), 크산틴(X), 3β-D-리보푸라노실-(2,6-디아미노피리미딘)(K), 3-O-D-리보푸라노실-(1-메틸-피라졸로[4,3-d]피리미딘-5,7(4H,6H)-디온)(P), 이소-시토신(iso-C), 이소-구아닌(iso-G), 1-β-D-리보푸라노실-(5-니트로인돌), 1-β-D-리보푸라노실-(3-니트로피롤), 5-브로모우라실, 2-아미노퓨린, 4-티오-dT, 7-(2-티에닐)-이미다조[4,5-b]피리딘(Ds) 및 피롤-2-카르브알데하이드(Pa), 2-아미노-6-(2-티에닐)퓨린(S), 2-옥소피리딘(Y), 디플루오로톨릴, 4-플루오로-6-메틸벤즈이미다졸, 4-메틸벤즈이미다졸, 3-메틸 이소카르보스티릴릴, 5-메틸 이소카르보스티릴릴, 및 3-메틸-7-프로피닐 이소카르보스티릴릴, 7-아자인돌릴, 6-메틸-7-아자인돌릴, 이미디조피리디닐, 9-메틸-이미디조피리디닐, 피롤로피리지닐, 이소카르보스티릴릴, 7-프로피닐 이소카르보스티릴릴, 프로피닐-7-아자인돌릴, 2,4,5-트리메틸페닐, 4-메틸인돌릴, 4,6-디메틸인돌릴, 페닐, 나프탈레닐, 안트라세닐, 페난트라세닐, 피레닐, 스틸벤질, 테트라세닐, 펜타세닐 및 이의 구조적 유도체들을 포함한다(Schweitzer et al., J. Org. Chem., 59:7238-7242 (1994); Berger et al., Nucleic Acids Research, 28(15):2911-2914 (2000); Moran et al., J. Am. Chem. Soc., 119:2056-2057 (1997); Morales et al., J. Am. Chem. Soc., 121:2323-2324 (1999); Guckian et al., J. Am. Chem. Soc., 118:8182-8183 (1996); Morales et al., J. Am. Chem. Soc., 122(6):1001-1007 (2000); McMinn et al., J. Am. Chem. Soc., 121:11585-11586 (1999); Guckian et al., J. Org. Chem., 63:9652-9656 (1998); Moran et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:10506-10511 (1997); Das et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans., 1:197-206 (2002); Shibata et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans., 1: 1605-1611 (2001); Wu et al., J. Am. Chem. Soc., 122(32):7621-7632 (2000); O'Neill et al., J. Org. Chem., 67:5869-5875 (2002); Chaudhuri et al., J. Am. Chem. Soc., 117:10434-10442 (1995); 및 미국 특허 제6,218,108호.). 염기 유사체는 또한, 일반 염기일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "뉴클레오사이드"는 천연 뉴클레오사이드 또는 변형된 뉴클레오사이드를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "뉴클레오타이드"는 천연 뉴클레오타이드 또는 변형된 뉴클레오타이드를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "뉴클레오타이드 위치"는 5'-말단의 뉴클레오타이드로부터 계산된 올리고뉴클레오타이드 내의 뉴클레오타이드의 위치를 지칭한다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 위치 1은 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단 뉴클레오타이드를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 2 내지 2500개 뉴클레오타이드 범위의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 지칭한다. 올리고뉴클레오타이드는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 특정 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 예를 들어 올리고뉴클레오타이드가 유전자 요법에 사용되는 경우, 500-1500개 뉴클레오타이드를 갖는다. 특정 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 단일 또는 이중 가닥이며, 7-100개 뉴클레오타이드를 갖는다. 특정 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 단일 또는 이중 가닥이며, 15-100개 뉴클레오타이드를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드가 핵산 억제제 분자인 경우, 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 단일 또는 이중 가닥이며, 15-50개 뉴클레오타이드를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드가 핵산 억제제 분자인 경우, 올리고뉴클레오타이드는 단일 또는 이중 가닥은 25-40개 뉴클레오타이드를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 단일 또는 이중 가닥이며, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드가 이중 가닥 핵산 억제제 분자이며, 적어도 18-25개 염기 쌍의 이중체를 형성하는 경우, 19-40개 또는 19-25개 뉴클레오타이드를 갖는다. 다른 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 단일 가닥이고, 전형적으로 올리고뉴클레오타이드 뉴클레오타이드가 단일 가닥 RNAi 억제제 분자인 경우 15-25개 뉴클레오타이드를 갖는다. 전형적으로, 올리고뉴클레오타이드는 본원에 기재된 바와 같이 하나 이상의 인 함유 뉴클레오타이드간 연결 기를 함유한다. 다른 실시형태에서, 뉴클레오타이드간 연결 기는 본원에 기재된 바와 같이, 비-인 함유 결합이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "돌출부"는 이중 가닥 핵산 억제제 분자의 어느 한 가닥의 양 말단에 있는 말단 비-염기 쌍 뉴클레오타이드(들)를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 돌출부는 제1 가닥 또는 영역이 이중체를 형성하는 상보적 가닥의 말단을 넘어 연장되는 하나의 가닥 또는 영역으로부터 발생한다. 염기쌍의 수소 결합을 통해 이중체를 형성할 수 있는 2개의 올리고뉴클레오타이드 영역들 중 하나 또는 둘 모두는 2개의 폴리뉴클레오타이드들 또는 영역들에 의해 공유된 상보성의 3'- 및/또는 5'-말단을 넘어 연장되는 5'- 및/또는 3'-말단을 가질 수 있다. 이중체의 3'- 및/또는 5'-말단을 넘어 연장되는 단일 가닥 영역을 돌출부라고 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적 조성물"은 약리학적 유효량의 포스페이트 유사체-변형된 올리고뉴클레오타이드 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "약리학적 유효량" "치료적 유효량" 또는 "유효량"은 의도된 약리학적, 치료적 또는 예방적 결과를 생성하는데 효과적인 본 개시내용의 포스페이트 유사체-변형된 올리고뉴클레오타이드의 양을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용가능한 부형제"는 부형제가 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 과도한 부작용(예컨대 독성, 자극 및 알레르기 반응) 없이 인간 및/또는 동물과 함께 사용하기에 적합함을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용가능한 염"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 등 없이 인간 및 하등 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고 합리적인 이익/위험 비율에 적합한 염을 지칭한다. 약제학적으로 허용가능한 염은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, S. M. Berge et al.은 약제학적으로 허용가능한 염을 J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19에 상세히 설명하고 있으며, 이는 여기에 참조로 포함된다. 본 발명의 핵산 및 이의 유사체의 약제학적으로 허용가능한 염은 적합한 무기 및 유기 산 및 염기로부터 유래된 것을 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 무독성 산 부가염의 예는 염산, 브롬화수소산, 인산, 황산 및 과염소산과 같은 무기산 또는 아세트산, 옥살산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 숙신산 또는 말론산과 같은 유기산으로, 또는 이온 교환과 같은 당업계에서 사용되는 다른 방법을 사용하여 형성된 아미노기의 염이다. 다른 약제학적으로 허용가능한 염은 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 바이설페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 시트레이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 글루코네이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 하이드로아이오다이드, 2-하이드록시-에탄설포네이트, 락토비오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, p-톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 발레레이트 염 등을 포함한다.
적당한 염기로부터 유래된 염은 알칼리 금속, 알칼리 토금속, 암모늄 및 N+(C1-4알킬)4 염을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등을 포함한다. 추가의 약제학적으로 허용가능한 염은 적당한 경우 무독성 암모늄, 4차 암모늄, 및 반대이온, 예컨대 할라이드, 하이드록사이드, 카르복실레이트, 설페이트, 포스페이트, 니트레이트, 저급 알킬 설포네이트 및 아릴 설포네이트를 사용하여 형성된 아민 양이온을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "적합한 전구약물"은 생리학적 조건 하에 또는 가용매분해에 의해 본원에 기재된 생물학적 활성 핵산 또는 이의 유사체로 전환될 수 있는 화합물을 나타내어 의미한다. 따라서, 용어 "전구약물"은 약제학적으로 허용가능한 생물학적 활성 핵산 또는 이의 유사체의 전구체를 지칭한다. 전구약물은 대상체에게 투여될 때 불활성일 수 있지만, 생체내에서, 예를 들어 가수분해에 의해 활성 화합물로 전환된다. 전구약물 화합물은 종종 포유동물 유기체에서 용해도, 조직 적합성 또는 지연 방출의 이점을 제공한다(예를 들어, Bundgard, H., Design of Prodrugs (1985), pp. 7-9, 21-24 (Elsevier, Amsterdam) 참조. 전구약물에 대한 논의는 Higuchi, T., et al., "Pro-drugs as Novel Delivery Systems," A.C.S. Symposium Series, Vol. 14, 및 Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987에서 제공되며, 이 둘은 본원에 그 전문이 참조로 포함된다. 용어 "전구약물"은 또한 이러한 전구약물이 포유동물 대상체에게 투여될 때 생체내에서 활성 화합물을 방출하는 임의의 공유 결합된 담체를 포함하여 의미한다. 본원에 기재된 활성 화합물의 전구약물은 통상적인 조작에서 또는 생체내에서 변형이 모 활성 화합물로 절단되는 방식으로 활성 화합물에 존재하는 작용기를 변형함으로써 제조될 수 있다. 전구약물에는 활성 화합물의 전구약물이 포유동물 대상체에게 투여될 때 절단되어 각각 유리 하이드록시, 유리 아미노 또는 유리 메르캅토 기를 형성하는 임의의 기에 하이드록시, 아미노 또는 메르캅토 기가 결합된 화합물이 포함된다. 적합한 전구약물의 예는 인 원자-변형된 핵산의 글루타티온, 아실옥시, 티오아실옥시, 2-카르보알콕시에틸, 디설파이드, 티아민 및 에놀 에스테르 유도체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 용어 "프로올리고뉴클레오타이드" 또는 "프로뉴클레오타이드" 또는 "핵산 전구약물"은 올리고뉴클레오타이드의 전구약물이 되도록 변형된 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다. 포스포네이트 및 포스페이트 전구약물은 예를 들어, Wiener et al., "Prodrugs or phosphonates and phosphates: crossing the membrane" Top. Curr. Chem. 2015, 360:115-160에서 찾아볼 수 있으며, 그 전체는 본원에 참고로 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포스포라미다이트"는 질소 함유 3가 인 유도체를 지칭한다. 적합한 포스포라미다이트의 예가 본원에 설명되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "역가"는 세포에서 의도된 표적에 대한 특정 수준의 활성을 얻기 위해 생체내 또는 시험관내 투여되어야 하는 올리고뉴클레오타이드 또는 기타 약물의 양을 지칭한다. 예를 들어, 1 mg/kg의 투여량에서 대상체에서 표적의 발현을 90%까지 억제하는 올리고뉴클레오타이드는 100 mg/kg의 투여량에서 대상체에서 표적의 발현을 90%까지 억제하는 올리고뉴클레오타이드보다 더 높은 역가를 가진다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "보호기"는 원하는 반응의 특정 조건 하에서 작용기를 가역적으로 가역적으로 만드는 기로서 통상적인 화학적 의미에서 사용된다. 원하는 반응 후, 보호된 작용기를 탈보호하기 위해 보호기가 제거될 수 있다. 모든 보호기는 합성되는 분자의 상당 부분을 분해하지 않는 조건에서 제거할 수 있어야 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "제공된 핵산"은 본원에 제시된 임의의 속, 아속, 및/또는 종을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "리보뉴클레오타이드"는 당 모이어티의 2'-위치에 하이드록실 기를 갖는 천연 또는 변형된 뉴클레오타이드를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "리보자임"은 DNA 또는 RNA일 수 있는 별개의 표적 핵산 서열을 특이적으로 인식하고 절단하는 촉매 핵산 분자를 지칭한다. 각각의 리보자임은 촉매 성분("촉매 도메인"으로도 지칭됨)과, 촉매 도메인의 양쪽에 하나씩 2개의 결합 도메인으로 구성된 표적 서열-결합 성분을 가지고 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "RNAi 억제제 분자"는 (a) 센스 가닥(패신저) 및 안티센스 가닥(가이드)을 갖는 이중 가닥 핵산 억제제 분자("dsRNAi 억제제 분자")를 지칭하며, 여기서 안티센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 일부는 표적 mRNA의 절단에서 아르고노트(Argonaute) 2(Ago2) 엔도뉴클레아제에 의해 사용되며, 또는 (b) 단일 안티센스 가닥을 갖는 단일 가닥 핵산 억제제 분자("ssRNAi 억제제 분자")를 지칭하며, 여기서 안티센스 가닥(또는 그 안티센스 가닥의 일부)은 표적 mRNA의 절단에서 Ago2 엔도뉴클레아제에 의해 사용된다.
이중 가닥 RNAi 억제제 분자는 2개의 올리고뉴클레오타이드 가닥, 즉 안티센스 가닥과 센스 가닥을 포함한다. 센스 가닥 또는 이의 영역은 이중 가닥 RNAi 억제제 분자 또는 이의 영역의 안티센스 가닥에 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상보적이다. 특정 실시형태에서, 센스 가닥은 또한 안티센스 가닥에 비-상보적인 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 비-상보적 뉴클레오타이드는 상보적 서열의 어느 한 쪽에 있을 수 있거나 상보적 서열의 양쪽에 있을 수 있다. 특정 실시형태에서, 센스 가닥 또는 이의 영역이 안티센스 가닥 또는 이의 영역에 부분적으로 또는 실질적으로 상보적인 경우, 비-상보적 뉴클레오타이드는 상보성의 하나 이상의 영역(예를 들어, 하나 이상의 미스매치) 사이에 위치될 수 있다. 센스 가닥은 패신저 가닥이라고도 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "전신 투여"는 혈류에서 약물이 생체 내 전신 흡수 또는 축적된 후 전신에 분포하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "표적 부위" "표적 서열", "표적 핵산", "표적 영역", "표적 유전자"는 상호교환적으로 사용되며, 예를 들어 그 표적 서열에 부분적으로, 실질적으로, 또는 완전하게 또는 충분히 상보적인 그의 가이드/안티센스 영역 내에 서열을 함유하는 RNAi 억제제 분자에 의해 매개되는 절단을 위해 "표적화되는" RNA 또는 DNA 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "테트라루프"는 인접한 왓슨-크릭 하이브리드 뉴클레오타이드의 안정성에 기여하는 안정한 2차 구조를 형성하는 루프(단일 가닥 영역)를 지칭한다. 이론에 제한되지 않으면서, 테트라루프는 스태킹(stacking) 상호작용에 의해 인접한 왓슨-크릭 염기쌍을 안정화할 수 있다. 또한, 테트라루프에서 뉴클레오타이드 간의 상호작용에는 비-왓슨-크릭 염기 쌍, 스태킹 상호작용, 수소 결합 및 접촉 상호작용이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다(Cheong et al., Nature 1990; 346(6285):680-2; Heus and Pardi, Science 1991; 253(5016):191-4). 테트라루프는 무작위 염기로 이루어진 단순 모델 루프 서열에서 예상보다 높은 인접 이중체의 용융 온도(Tm) 증가를 부여한다. 예를 들어, 테트라루프는 적어도 2개 염기쌍 길이의 이중체를 포함하는 헤어핀에 10 mM NaHPO4에서 적어도 50℃, 적어도 55℃, 적어도 56℃, 적어도 58℃, 적어도 60℃, 적어도 65℃ 또는 적어도 75℃의 용융 온도를 부여할 수 있다. 테트라루프는 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 및 이들의 조합을 포함할 수 있습니다. 특정 실시형태에서, 테트라루프는 4개의 뉴클레오타이드로 이루어진다. 특정 실시형태에서, 테트라루프는 5개의 뉴클레오타이드로 이루어진다
RNA 테트라루프의 예는 UNCG 계열의 테트라루프(예를 들어, UUCG), GNRA 계열의 테트라루프(예를 들어, GAAA), 및 CUUG 테트라루프를 포함한다. (Woese et al., PNAS, 1990, 87(21):8467-71; Antao et al., NUCLEIC ACIDS RES., 1991, 19(21):5901-5). DNA 테트라루프의 예는 d(GNNA) 계열의 테트라루프(예를 들어, d(GTTA), d(GNRA)) 계열의 테트라루프, d(GNAB) 계열의 테트라루프, d(CNNG) 계열의 테트라루프 및 d(TNCG) 계열의 테트라루프(예를 들어, d(TTCG))를 포함한다. (Nakano et al., BIOCHEMISTRY, 2002, 41(48):14281-14292. Shinji et al., NIPPON KAGAKKAI KOEN YOKOSHU, 2000, 78(2):731).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "일반 염기"는 변형된 뉴클레오타이드에서 뉴클레오타이드 당 모이어티의 1' 위치, 또는 핵산 이중체에 존재할 때 이중 나선 구조(예를 들어, 포스페이트 백본의 구조)를 변경하지 않으면서 한 종류 이상의 염기 반대쪽에 위치할 수 있는 뉴클레오타이드 당 모이어티 치환에서 등가 위치에 위치한 헤테로사이클릭 모이어티를 의미한다. 추가로, 일반 염기는 표적 핵산에 이중체로 존재하는 단일 가닥 핵산의 능력을 파괴하지 않는다. 표적 핵산을 이중화하는 일반 염기를 함유하는 단일 가닥 핵산의 능력은 당업자에게 명백한 방법(예를 들어, UV 흡광도, 원형 이색성, 겔 이동, 단일 가닥 뉴클레아제 민감성 등)에 의해 분석될 수 있다. 또한, 이중체 형성이 관찰되는 조건은 이중체 안정성 또는 형성을 결정하도록 변화될 수 있으며, 예를 들어 온도와 같이 용융 온도(Tm)가 핵산 이중체의 안정성과 상관관계가 있기 때문에 변화될 수 있다. 표적 핵산에 정확히 상보적인 참조 단일 가닥 핵산과 비교하여, 일반 염기를 함유하는 단일 가닥 핵산은 상보적 핵산으로 형성된 이중체보다 낮은 Tm을 갖는 표적 핵산과 함께 이중체를 형성한다. 그러나, 단일 미스매치를 생성하기 위해 일반 염기가 염기로 대체된 참조 단일 가닥 핵산과 비교하여, 일반 염기를 함유하는 단일 가닥 핵산은 미스매치된 염기를 갖는 핵산으로 형성된 이중체보다 높은 Tm을 갖는 표적 핵산과 함께 이중체를 형성한다.
일부 일반 염기는 염기 쌍 형성 조건 하에 일반 염기와 모든 염기 구아닌(G), 시토신(C), 아데닌(A), 티민(T) 및 우라실(U) 사이에 수소 결합을 형성함으로써 염기 쌍을 형성할 수 있다. 일반 염기는 하나의 상보적인 염기만으로 염기쌍을 형성하는 염기가 아니다. 이중체에서, 일반 염기는 이중체의 반대쪽 가닥에 있는 반대 방향의 G, C, A, T 및 U 각각과 수소 결합이 없거나 하나의 수소 결합을 형성하거나 둘 이상의 수소 결합을 형성할 수 있다. 바람직하게는, 일반 염기는 이중체의 반대쪽 가닥에서 그 반대쪽 염기와 상호작용하지 않는다. 이중체에서, 포스페이트 백본의 이중 나선 구조를 변경하지 않으면서 일반 염기 사이의 염기 쌍이 발생한다. 일반 염기는 또한 스태킹 상호작용에 의해 동일한 핵산 가닥 상의 인접한 뉴클레오타이드의 염기와 상호작용할 수 있다. 이러한 스태킹 상호작용은 특히 일반 염기가 이중체의 반대쪽 가닥에서 반대편에 위치한 염기와 임의의 수소 결합을 형성하지 않는 상황에서 이중체를 안정화한다. 일반-결합 뉴클레오타이드의 비제한적인 예는 이노신, 1-O-D-리보 푸라노실-5-니트로인돌, 및/또는 1-β-D-리보푸라노실-3-니트로피롤을 포함한다(Quay 등의 미국 특허 출원 공보 번호 20070254362호; Van Aerschot et al., An acyclic 5-nitroindazole nucleoside analogue as ambiguous nucleoside, NUCLEIC ACIDS RES. 1995 Nov. 11; 23(21):4363-70; Loakes et al., 3-Nitropyrrole and 5-nitroindole as universal bases in primers for DNA sequencing and PCR, NUCLEIC ACIDS RES. 1995 Jul. 11; 23(13):2361-6; Loakes and Brown, 5-Nitroindole as a universal base analogue, NUCLEIC ACIDS RES. 1994 Oct. 11; 22(20):4039-43).
3. 예시적인 실시형태에 대한 설명:
상기한 바와 같이, 특정 실시형태에서, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제공하고, 여기서 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 하기 화학식 I, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로 나타내며:
[화학식 I]
Figure pct00008
식 중,
B는 핵염기 또는 수소이고;
R1 및 R2는 독립적으로 수소, 할로겐, R5, -CN, -S(O)R, -S(O)2R, -Si(OR)2R, -Si(OR)R2, 또는 -SiR3이거나:
동일한 탄소 상의 R1 및 R2가 개재 원자와 함께, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 0-3개의 헤테로원자를 갖는 3-7원 포화 또는 부분 불포화 고리를 형성하며;
각각의 R은 독립적으로 수소, 적합한 보호기, 또는 C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이거나:
동일한 원자 상의 2개의 R 기는 그들의 개재 원자와 함께, 질소, 산소, 규소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 0-3개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화, 부분 불포화 또는 헤테로아릴 고리를 형성하고;
R3은 수소, 적합한 보호기, 적합한 전구약물, 또는 C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
각각의 R4는 독립적으로 수소, 적합한 전구약물, R5, 할로겐, -CN, -NO2, -OR, -SR, -NR2, -S(O)2R, -S(O)2NR2, -S(O)R, -C(O)R, -C(O)OR, -C(O)NR2, -C(O)N(R)OR, -OC(O)R, -OC(O)NR2, -OP(O)R2, -OP(O)(OR)2, -OP(O)(OR)NR2, -OP(O)(NR2)2-, -N(R)C(O)OR, -N(R)C(O)R, -N(R)C(O)NR2, -N(R)S(O)2R, -N(R)P(O)R2, -N(R)P(O)(OR)2, -N(R)P(O)(OR)NR2, -N(R)P(O)(NR2)2, -N(R)S(O)2R, -Si(OR)2R, -Si(OR)R2, 또는 -SiR3이고;
각각의 R5는 독립적으로, C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭 고리, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
X1은 O, S 또는 NR이고;
X2는 -O-, -S-, -B(H)2-, 또는 공유 결합이고;
X3은 -O-, -S-, -Se-, 또는 -N(R)-이고;
Y1은 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 2'- 또는 3'-말단에 부착되는 연결 기이고;
Y2는 수소, 보호기, 포스포라미다이트 유사체, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 4'- 또는 5'-말단에 부착되는 뉴클레오타이드간 연결 기, 또는 고체 지지체에 부착되는 연결 기이고;
Z는 -O-, -S-, -N(R)-, 또는 -C(R)2-이고;
n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
상기 정의되고 본원에 기재된 바와 같이, B는 핵염기 또는 수소이다.
일부 실시형태에서, B는 핵염기이다. 일부 실시형태에서, B는 핵염기 유사체이다. 일부 실시형태에서, B는 변형된 핵염기이다. 일부 실시형태에서, B는 일반 핵염기이다. 일부 실시형태에서, B는 수소이다.
일부 실시형태에서, B는
Figure pct00009
로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, B는 표 1에 도시된 것들로부터 선택된다.
상기 정의되고 본원에 기재된 바와 같이, R1 및 R2는 독립적으로 수소, 할로겐, R3, -CN, -S(O)R, -S(O)2R, -Si(OR)2R, -Si(OR)R2, 또는 -SiR3이거나, 동일한 탄소 상의 R1 및 R2는 이들의 개재 원자와 함께 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 0-3개의 헤테로원자를 갖는 3-7원 포화 또는 부분 불포화 고리를 형성한다.
일부 실시형태에서, R1 및 R2는 독립적으로 수소이다. 일부 실시형태에서, R1 및 R2는 독립적으로 중수소이다. 일부 실시형태에서, R1 및 R2는 독립적으로 할로겐이다. 일부 실시형태에서, R1 및 R2는 독립적으로 R5이다. 일부 실시형태에서, R1 및 R2는 독립적으로 -CN이다. 일부 실시형태에서, R1 및 R2는 독립적으로 -S(O)R이다. 일부 실시형태에서, R1 및 R2는 독립적으로 -S(O)2R이다. 일부 실시형태에서, R1 및 R2는 독립적으로 -Si(OR)2R이다. 일부 실시형태에서, R1 및 R2는 독립적으로 -Si(OR)R2이다. 일부 실시형태에서, R1 및 R2는 독립적으로 -SiR3이다. 일부 실시형태에서, 동일한 탄소 상의 R1 및 R2는 이들의 개재 원자와 함께 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된, 0-3개의 헤테로원자를 갖는 3-7원 포화 또는 부분 불포화 고리를 형성한다.
일부 실시형태에서, R1은 메틸이고 R2는 수소이다.
일부 실시형태에서, R1 및 R2는 표 1에 도시된 것들로부터 선택된다.
상기 정의되고 본원에 기재된 바와 같이, 각각의 R은 독립적으로 수소, 적합한 보호기, 또는 C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택되는 임의로 치환된 기이거나, 또는 동일한 원자 상의 2개의 R 기가 이들의 개재 원자와 함께, 질소, 산소, 규소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 0-3개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화, 부분 불포화, 또는 헤테로아릴 고리를 형성한다.
일부 실시형태에서, R은 수소이다. 일부 실시형태에서, R은 적합한 보호기이다. 일부 실시형태에서, R은 임의로 치환된 C1-6 지방족이다. 일부 실시형태에서, R은 임의로 치환된 페닐이다. 일부 실시형태에서, R은 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭이다. 일부 실시형태에서, R은 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 5-6원 헤테로아릴 고리이다. 일부 실시형태에서, 동일한 원자 상의 2개의 R 기는 이들의 개재 원자와 함께, 질소, 산소, 규소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 0-3개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화, 부분 불포화, 또는 헤테로아릴 고리를 형성한다.
일부 실시형태에서, R은 하기 표 1에 도시된 것들로부터 선택된다.
상기 정의되고 본원에 기재된 바와 같이, R3은 수소, 적합한 보호기, 적합한 전구약물, 또는 C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리이다.
일부 실시형태에서, R3은 수소이다. 일부 실시형태에서, R3은 적합한 보호기이다. 일부 실시형태에서, R3은 적합한 전구약물이다. 일부 실시형태에서, R3은 글루타티온-민감성 모이어티인 적합한 포스페이트/포스포네이트 전구약물이다. 일부 실시형태에서, R3은 전문이 본원에 참고로 포함되는 국제 특허 출원 PCT/US2017/048239호에 기재된 바와 같은 것들로부터 선택된 글루타티온-민감성 모이어티이다. 일부 실시형태에서, R3은 임의로 치환된 C1-6 지방족이다. 일부 실시형태에서, R3은 임의로 치환된 페닐이다. 일부 실시형태에서, R3은 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭이다. 일부 실시형태에서, R3은 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 5-6원 헤테로아릴 고리이다.
일부 실시형태에서, R3은 메틸이다. 일부 실시형태에서, R3은 에틸이다. 일부 실시형태에서, R3은
Figure pct00010
이다. 일부 실시형태에서, R3은
Figure pct00011
이다. 일부 실시형태에서, R3은
Figure pct00012
이다.
일부 실시형태에서, R3은 하기 표 1에 도시된 것들로부터 선택된다.
상기 정의되고 본원에 기재된 바와 같이, 각각의 R4는 독립적으로 수소, 적합한 전구약물, R5, 할로겐, -CN, -NO2, -OR, -SR, -NR2, -Si(OR)2R, -Si(OR)R2, -S(O)2R, -S(O)2NR2, -S(O)R, -C(O)R, -C(O)OR, -C(O)NR2, -C(O)N(R)OR, -OC(O)R, -OC(O)NR2, -OP(O)R2, -OP(O)(OR)2, -OP(O)(OR)NR2, -OP(O)(NR2)2-, -N(R)C(O)OR, -N(R)C(O)R, -N(R)C(O)NR2, -N(R)S(O)2R, -N(R)P(O)R2, -N(R)P(O)(OR)2, -N(R)P(O)(OR)NR2, -N(R)P(O)(NR2)2, -N(R)S(O)2R, -Si(OR)2R, -Si(OR)R2, 또는 -SiR3이다.
일부 실시형태에서, R4는 수소이다. 일부 실시형태에서, R4는 중수소이다. 일부 실시형태에서, R4는 적합한 전구약물이다. 일부 실시형태에서, R4는 글루타티온-민감성 모이어티인 적합한 포스페이트/포스포네이트 전구약물이다. 일부 실시형태에서, R4는 전문이 본원에 참고로 포함된 국제 특허 출원 PCT/US2013/072536호에 기재된 바와 같은 것들로부터 선택된 글루타티온-민감성 모이어티이다. 일부 실시형태에서, R4는 R5이다. 일부 실시형태에서, R4는 할로겐이다. 일부 실시형태에서, R4는 -CN이다. 일부 실시형태에서, R4는 -NO2이다. 일부 실시형태에서, R4는 -OR이다. 일부 실시형태에서, R4는 -SR이다. 일부 실시형태에서, R4는 -NR2이다. 일부 실시형태에서, R4는 -S(O)2R이다. 일부 실시형태에서, R4는 -S(O)2NR2이다. 일부 실시형태에서, R4는 -S(O)R이다. 일부 실시형태에서, R4는 -C(O)R이다. 일부 실시형태에서, R4는 -C(O)OR이다. 일부 실시형태에서, R4는 -C(O)NR2이다. 일부 실시형태에서, R4는 -C(O)N(R)OR이다. 일부 실시형태에서, R4는 -C(R)2N(R)C(O)R이다. 일부 실시형태에서, R4는 -C(R)2N(R)C(O)NR2이다. 일부 실시형태에서, R4는 -OC(O)R이다. 일부 실시형태에서, R4는 -OC(O)NR2이다. 일부 실시형태에서, R4는 -OP(O)R2이다. 일부 실시형태에서, R4는 -OP(O)(OR)2이다. 일부 실시형태에서, R4는 -OP(O)(OR)NR2이다. 일부 실시형태에서, R4는 -OP(O)(NR2)2-이다. 일부 실시형태에서, R4는 -N(R)C(O)OR이다. 일부 실시형태에서, R4는 -N(R)C(O)R이다. 일부 실시형태에서, R4는 -N(R)C(O)NR2이다. 일부 실시형태에서, R4는 -N(R)P(O)R2이다. 일부 실시형태에서, R4는 -N(R)P(O)(OR)2이다. 일부 실시형태에서, R4는 -N(R)P(O)(OR)NR2이다. 일부 실시형태에서, R4는 -N(R)P(O)(NR2)2이다. 일부 실시형태에서, R4는 -N(R)S(O)2R이다. 일부 실시형태에서, R4는 -Si(OR)2R이다. 일부 실시형태에서, R4는 -Si(OR)R2이다. 일부 실시형태에서, R4는 -SiR3이다.
일부 실시형태에서, R4는 하이드록실이다. 일부 실시형태에서, R4는 플루오로이다. 일부 실시형태에서, R4는 메톡시이다. 일부 실시형태에서, R4는
Figure pct00013
이다.
일부 실시형태에서, R4는 표 1에 도시된 것들로부터 선택된다.
상기 정의되고, 본원에 설명된 바와 같이, 각각의 R5는 독립적으로 C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭 고리, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택되는 임의로 치환된 기이다.
일부 실시형태에서, R5는 임의로 치환된 C1-6 지방족이다. 일부 실시형태에서, R5는 임의로 치환된 페닐이다. 일부 실시형태에서, R5는 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭 고리이다. 일부 실시형태에서, R5는 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 임의로 치환된 5-6원 헤테로아릴 고리이다.
일부 실시형태에서, R5는 아래 표 1에 도시된 것들로부터 선택된다.
상기 정의되고, 본원에 설명된 바와 같이, X1은 O, S 또는 NR이다.
일부 실시형태에서, X1은 O이다. 일부 실시형태에서, X1은 S이다. 일부 실시형태에서, X1은 NR이다.
일부 실시형태에서, X1은 아래 표 1에 도시된 것들로부터 선택된다.
상기 정의되고, 본원에 설명된 바와 같이, X2는 -O-, -S-, -B(H)2-, 또는 공유 결합이다.
일부 실시형태에서, X2는 -O-이다. 일부 실시형태에서, X2는 -S-이다. 일부 실시형태에서, X2는 -B(H)2-이다. 일부 실시형태에서, X2 및 R3은 -BH3을 형성한다. 일부 실시형태에서, X2는 공유 결합이다. 일부 실시형태에서, X2는 보라노포스페이트 백본을 구성하는 공유 결합이다.
일부 실시형태에서, X2는 아래 표 1에 도시된 것들로부터 선택된다.
상기 정의되고, 본원에 설명된 바와 같이, X3은 -O-, -S-, -Se-, 또는 -N(R)-이다.
일부 실시형태에서, X3은 -O-이다. 일부 실시형태에서, X3은 -S-이다. 일부 실시형태에서, X3은 -Se-이다. 일부 실시형태에서, X3은 -N(R)-이다.
일부 실시형태에서, X3은 아래 표 1에 도시된 것들로부터 선택된다.
상기 정의되고, 본원에 설명된 바와 같이, Y1은 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 2'- 또는 3'-말단에 부착되는 연결 기이다.
일부 실시형태에서, Y1은 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 2'-말단에 부착되는 연결 기이다. 일부 실시형태에서, Y1은 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단에 부착되는 연결 기이다.
일부 실시형태에서, Y1의 연결 기는 결합이다. 일부 실시형태에서, Y1의 연결 기는 -C(R)2-이다. 일부 실시형태에서, Y1의 연결 기는 -CH2-이다.
일부 실시형태에서, Y1은
Figure pct00014
이다. 일부 실시형태에서, Y1은
Figure pct00015
이다. 일부 실시형태에서, Y1은
Figure pct00016
이다. 일부 실시형태에서, Y1은
Figure pct00017
이다. 일부 실시형태에서, Y1은
Figure pct00018
이다. 일부 실시형태에서, Y1은
Figure pct00019
이다. 일부 실시형태에서, Y1은
Figure pct00020
이다. 일부 실시형태에서, Y1은
Figure pct00021
이다. 일부 실시형태에서, Y1은
Figure pct00022
이다. 일부 실시형태에서, Y1은
Figure pct00023
이다. 일부 실시형태에서, Y1은
Figure pct00024
이다. 일부 실시형태에서, Y1은
Figure pct00025
이다. 일부 실시형태에서, Y1은
Figure pct00026
이다. 일부 실시형태에서, Y1은
Figure pct00027
이다. 일부 실시형태에서, Y1은
Figure pct00028
이다. 일부 실시형태에서, Y1은
Figure pct00029
이다.
일부 실시형태에서, Y1은 아래 표 1에 도시된 것들로부터 선택된다.
상기 정의되고, 본원에 설명된 바와 같이, Y2는 수소, 보호기, 포스포라미다이트 유사체, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 4'- 또는 5'-말단에 부착되는 뉴클레오타이드간 연결 기, 또는 고체 지지체에 부착되는 연결 기이다.
일부 실시형태에서, Y2는 수소이다. 일부 실시형태에서, Y2는 보호기이다. 일부 실시형태에서, Y2는 포스포라미다이트 유사체이다. 일부 실시형태에서, Y2는 식:
Figure pct00030
의 포스포라미다이트 유사체이며, 식 중, 각각의 R3, X2 및 E는 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 실시형태에서, Y2는 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 4'-말단에 부착되는 뉴클레오타이드간 연결 기이다. 일부 실시형태에서, Y2는 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단에 부착되는 뉴클레오타이드간 연결 기이다. 일부 실시형태에서, Y2는 고체 지지체에 부착되는 연결 기이다.
일부 실시형태에서, Y2는 벤조일이다. 일부 실시형태에서, Y2는 t-부틸디메틸실릴이다. 일부 실시형태에서, Y2는
Figure pct00031
이다. 일부 실시형태에서, Y2는
Figure pct00032
이다. 일부 실시형태에서, Y2는
Figure pct00033
이다. 일부 실시형태에서, Y2는
Figure pct00034
이다. 일부 실시형태에서, Y2는
Figure pct00035
이다.
일부 실시형태에서, Y2는 아래 표 1에 도시된 것들로부터 선택된다.
Y1의 일부 실시형태에서, 볼 수 있는 바와 같이, Y3은 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 2'- 또는 3'-말단에 부착되는 연결 기이다.
일부 실시형태에서, Y3은 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 2'-말단에 부착되는 연결 기이다. 일부 실시형태에서, Y3은 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단에 부착되는 연결 기이다.
일부 실시형태에서, Y3은 아래 표 1에 도시된 것들로부터 선택된다.
Y2의 일부 실시형태에서, 볼 수 있는 바와 같이, Y4는 수소, 보호기, 포스포라미다이트 유사체, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 4'- 또는 5'-말단에 부착되는 뉴클레오타이드간 연결 기, 또는 고체 지지체에 부착되는 연결 기이다.
일부 실시형태에서, Y4는 수소이다. 일부 실시형태에서, Y4는 보호기이다. 일부 실시형태에서, Y4는 포스포라미다이트 유사체이다. 일부 실시형태에서, Y4는 식:
Figure pct00036
의 포스포라미다이트 유사체이며, 식 중, 각각의 R3, X2 및 E는 독립적으로 본원에 기재된 바와 같다. 일부 실시형태에서, Y4는 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 4'-말단에 부착되는 뉴클레오타이드간 연결 기이다. 일부 실시형태에서, Y4는 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 5'-말단에 부착되는 뉴클레오타이드간 연결 기이다. 일부 실시형태에서, Y4는 고체 지지체에 부착되는 연결 기이다.
일부 실시형태에서, Y4는 벤조일이다. 일부 실시형태에서, Y4는 t-부틸디메틸실릴이다. 일부 실시형태에서, Y4는
Figure pct00037
이다. 일부 실시형태에서, Y2는
Figure pct00038
이다. 일부 실시형태에서, Y4는
Figure pct00039
이다.
일부 실시형태에서, Y4는 아래 표 1에 도시된 것들로부터 선택된다.
상기 정의되고, 본원에 설명된 바와 같이, Z는 -O-, -S-, -N(R)-, 또는 -C(R)2-이다.
일부 실시형태에서, Z는 -O-이다. 일부 실시형태에서, Z는 -S-이다. 일부 실시형태에서, Z는 -N(R)-이다. 일부 실시형태에서, Z는 -C(R)2-이다.
일부 실시형태에서, Z는 아래 표 1에 도시된 것들로부터 선택된다.
상기 정의되고, 본원에 설명된 바와 같이, n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
일부 실시형태에서, n은 0이다. 일부 실시형태에서, n은 1이다. 일부 실시형태에서, n은 2이다. 일부 실시형태에서, n은 3이다. 일부 실시형태에서, n은 4이다. 일부 실시형태에서, n은 5이다. 일부 실시형태에서, n은 아래 표 1에 도시된 것들로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체는 4'-C 위치에 메틸 치환을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 화학식 I로 나타내는 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은
Figure pct00040
가 아니다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제공하며, 식 중, 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 화학식 I로 나타내며, 식 중, X3이 -O-이고, n은 1이며, 연결성 및 입체화학은 도시된 바와 같으며, 이에 의해 하기 화학식 I-a-1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 핵산 또는 이의 유사체를 형성하며:
[화학식 I-a-1]
Figure pct00041
식 중, 각각의 B, R1, R2, R3, R4, X1, X2, Y1, Y2, 및 Z는 상기 정의된 바와 같다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제공하며, 식 중, 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 화학식 I로 나타내며, 식 중, X3이 -O-이고, Y2는 적합한 하이드록실 보호기(PG)이고, n은 1이며, 연결성 및 입체화학은 도시된 바와 같으며, 이에 의해 하기 화학식 I-a-2 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 핵산 또는 이의 유사체를 형성하며:
[화학식 I-a-2]
Figure pct00042
식 중, 각각의 B, R1, R2, R3, R4, X1, X2, Y1, 및 Z는 상기 정의된 바와 같다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제공하며, 식 중, 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 화학식 I로 나타내며, 식 중, X3이 -O-이고, Y2는 수소이고, n은 1이며, 연결성 및 입체화학은 도시된 바와 같으며, 이에 의해 하기 화학식 I-a-3 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 핵산 또는 이의 유사체를 형성하며:
[화학식 I-a-3]
Figure pct00043
식 중, 각각의 B, R1, R2, R3, R4, X1, X2, Y1, 및 Z는 상기 정의된 바와 같다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제공하며, 식 중, 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 화학식 I로 나타내며, 식 중, X3이 -O-이고, Y2는 포스포라미다이트
Figure pct00044
이고, n은 1이며, 연결성 및 입체화학은 도시된 바와 같으며, 이에 의해 하기 화학식 I-a-4 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 핵산 또는 이의 유사체를 형성하며:
[화학식 I-a-4]
Figure pct00045
식 중, 각각의 B, R1, R2, R3, R4, X1, X2, Y1, 및 Z는 상기 정의된 바와 같다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제공하며, 식 중, 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 화학식 I로 나타내며, 식 중, X3이 -O-이고, Y2는 고체 지지체에 부착되는 연결 기
Figure pct00046
이고, n은 1이며, 연결성 및 입체화학은 도시된 바와 같으며, 이에 의해 하기 화학식 I-a-5 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 핵산 또는 이의 유사체를 형성하며:
[화학식 I-a-5]
Figure pct00047
식 중, 각각의 B, R1, R2, R3, R4, X1, X2, Y1, 및 Z는 상기 정의된 바와 같다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제공하며, 식 중, 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 화학식 I로 나타내며, 식 중, X3이 -O-이고, n은 1이며, 연결성 및 입체화학은 도시된 바와 같으며, Y1은 뉴클레오사이드
Figure pct00048
의 3'-하이드록실에 부착되는 공유 결합이며, 여기서 Y1의 PG는 적합한 하이드록실 보호기이며, 이에 의해 하기 화학식 I-b-1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 핵산 또는 이의 유사체를 형성하며:
[화학식 I-b-1]
Figure pct00049
식 중, 각각의 B, R1, R2, R3, R4, X1, X2, Y2, 및 Z는 상기 정의된 바와 같다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제공하며, 식 중, 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 화학식 I로 나타내며, 식 중, X3이 -O-이고, Y2는 적합한 하이드록실 보호기 PG1이고, n은 1이며, 연결성 및 입체화학은 도시된 바와 같으며, Y1은 뉴클레오사이드
Figure pct00050
의 3'-하이드록실에 부착되는 공유 결합이며, 여기서 Y1의 PG는 적합한 하이드록실 보호기이며, 이에 의해 하기 화학식 I-c-1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 핵산 또는 이의 유사체를 형성하며:
[화학식 I-c-1]
Figure pct00051
식 중, 각각의 B, R1, R2, R3, R4, X1, X2, 및 Z는 상기 정의된 바와 같다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제공하며, 식 중, 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 화학식 I로 나타내며, 식 중, X3이 -O-이고, Y2는 수소이고, n은 1이며, 연결성 및 입체화학은 도시된 바와 같으며, Y1은 뉴클레오사이드
Figure pct00052
의 3'-하이드록실에 부착되는 공유 결합이며, 여기서 Y1의 PG는 적합한 하이드록실 보호기이며, 이에 의해 하기 화학식 I-d-1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 핵산 또는 이의 유사체를 형성하며:
[화학식 I-d-1]
Figure pct00053
식 중, 각각의 B, R1, R2, R3, R4, X1, X2, 및 Z는 상기 정의된 바와 같다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제공하며, 식 중, 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 화학식 I로 나타내며, 식 중, X3이 -O-이고, Y2는 포스포라미다이트
Figure pct00054
이고, n은 1이며, 연결성 및 입체화학은 도시된 바와 같으며, Y1은 뉴클레오사이드
Figure pct00055
의 3'-하이드록실에 부착되는 공유 결합이며, 여기서 Y1의 PG는 적합한 하이드록실 보호기이며, 이에 의해 하기 화학식 I-e-1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 핵산 또는 이의 유사체를 형성하며:
[화학식 I-e-1]
Figure pct00056
식 중, 각각의 B, R1, R2, R3, R4, X1, X2, 및 Z는 상기 정의된 바와 같다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제공하며, 식 중, 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 화학식 I로 나타내며, 식 중, X3이 -O-이고, Y2는 고체 지지체에 부착되는 연결 기
Figure pct00057
이고, n은 1이며, 연결성 및 입체화학은 도시된 바와 같으며, Y1은 뉴클레오사이드
Figure pct00058
의 3'-하이드록실에 부착되는 공유 결합이며, 여기서 Y1의 PG는 적합한 하이드록실 보호기이며, 이에 의해 하기 화학식 I-f-1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 핵산 또는 이의 유사체를 형성하며:
[화학식 I-f-1]
Figure pct00059
식 중, 각각의 B, R1, R2, R3, R4, X1, X2, Y1, 및 Z는 상기 정의된 바와 같다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제공하며, 식 중, 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 화학식 I로 나타내며, 식 중, X3이 -O-이고, n은 1이며, 연결성 및 입체화학은 도시된 바와 같으며, Y1은 뉴클레오사이드
Figure pct00060
의 3'-하이드록실에 부착되는 공유 결합이며, 이에 의해 하기 화학식 I-g-1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 핵산 또는 이의 유사체를 형성하며:
[화학식 I-g-1]
Figure pct00061
식 중, 각각의 B, R1, R2, R3, R4, X1, X2, Y2, 및 Z는 상기 정의된 바와 같다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제공하며, 식 중, 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 화학식 I로 나타내며, 식 중, X3이 -O-이고, n은 1이며, 연결성 및 입체화학은 도시된 바와 같으며, Y1은 올리고뉴클레오타이드
Figure pct00062
의 3'-하이드록실에 부착되는 공유 결합이며, 이에 의해 하기 화학식 I-h-1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 핵산 또는 이의 유사체를 형성하며:
[화학식 I-h-1]
Figure pct00063
식 중, 각각의 B, R1, R2, R3, R4, X1, X2, Y2, Y3, 및 Z는 상기 정의된 바와 같다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제공하며, 식 중, 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 화학식 I로 나타내며, 식 중, X3이 -O-이고, n은 1이며, 연결성 및 입체화학은 도시된 바와 같으며, Y1은 올리고뉴클레오타이드
Figure pct00064
의 3'-하이드록실에 부착되는 공유 결합이며, 이에 의해 하기 화학식 I-i-1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 올리고뉴클레오타이드를 형성하며:
[화학식 I-i-1]
Figure pct00065
식 중, 각각의 B, R1, R2, R3, R4, X1, X2, Y2, Y3, 및 Z는 상기 정의된 바와 같다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제공하며, 식 중, 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 화학식 I로 나타내며, 식 중, X3이 -O-이고, Y2는 적합한 하이드록실 보호기 PG1이고, n은 1이며, 연결성 및 입체화학은 도시된 바와 같으며, Y1은 올리고뉴클레오타이드
Figure pct00066
의 3'-하이드록실에 부착되는 공유 결합이며, 이에 의해 하기 화학식 I-j-1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 올리고뉴클레오타이드를 형성하며:
[화학식 I-j-1]
Figure pct00067
식 중, 각각의 B, R1, R2, R3, R4, X1, X2, Y3, 및 Z는 상기 정의된 바와 같다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제공하며, 식 중, 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 화학식 I로 나타내며, 식 중, X3이 -O-이고, Y2는 수소이고, n은 1이며, 연결성 및 입체화학은 도시된 바와 같으며, Y1은 올리고뉴클레오타이드
Figure pct00068
의 3'-하이드록실에 부착되는 공유 결합이며, 이에 의해 하기 화학식 I-k-1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 올리고뉴클레오타이드를 형성하며:
[화학식 I-k-1]
Figure pct00069
식 중, 각각의 B, R1, R2, R3, R4, X1, X2, Y3, 및 Z는 상기 정의된 바와 같다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제공하며, 식 중, 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 화학식 I로 나타내며, 식 중, X3이 -O-이고, Y2는
Figure pct00070
이고, n은 1이며, 연결성 및 입체화학은 도시된 바와 같으며, Y1은 올리고뉴클레오타이드
Figure pct00071
의 3'-하이드록실에 부착되는 공유 결합이며, 이에 의해 하기 화학식 I-l-1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 올리고뉴클레오타이드를 형성하며:
[화학식 I-l-1]
Figure pct00072
식 중, 각각의 B, R1, R2, R3, R4, X1, X2, Y3, 및 Z는 상기 정의된 바와 같다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제공하며, 식 중, 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 화학식 I로 나타내며, 식 중, X3이 -O-이고, Y2는 고체 지지체
Figure pct00073
에 부착되는 연결 기이고, n은 1이며, 연결성 및 입체화학은 도시된 바와 같으며, Y1은 올리고뉴클레오타이드
Figure pct00074
의 3'-하이드록실에 부착되는 공유 결합이며, 이에 의해 하기 화학식 I-m-1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 올리고뉴클레오타이드를 형성하며:
[화학식 I-m-1]
Figure pct00075
식 중, 각각의 B, R1, R2, R3, R4, X1, X2, Y3, 및 Z는 상기 정의된 바와 같다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제공하며, 식 중, 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 화학식 I로 나타내며, 식 중, X3이 -O-이고, n은 1이며, 연결성 및 입체화학은 도시된 바와 같으며, Y1은 올리고뉴클레오타이드
Figure pct00076
의 3'-하이드록실에 부착되는 메틸렌 기이며, 이에 의해 하기 화학식 I-n-1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 올리고뉴클레오타이드를 형성하며:
[화학식 I-n-1]
Figure pct00077
식 중, 각각의 B, R1, R2, R3, R4, X1, X2, Y2, Y3, 및 Z는 상기 정의된 바와 같다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제공하며, 식 중, 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 화학식 I로 나타내며, 식 중, X3이 -O-이고, n은 1이며, 연결성 및 입체화학은 도시된 바와 같으며, Y1은 올리고뉴클레오타이드
Figure pct00078
의 3'-탄소에 부착되는 메틸렌 기이며, 이에 의해 하기 화학식 I-o-1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 올리고뉴클레오타이드를 형성하며:
[화학식 I-o-1]
Figure pct00079
식 중, 각각의 B, R1, R2, R3, R4, X1, X2, Y2, Y3, 및 Z는 상기 정의된 바와 같다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제공하며, 식 중, 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 화학식 I로 나타내며, 식 중, X3이 -O-이고, n은 1이며, 연결성 및 입체화학은 도시된 바와 같으며, Y1은 뉴클레오사이드
Figure pct00080
의 3'-하이드록실에 부착되는 공유 결합이며, Y2는
Figure pct00081
이고, 이에 의해 하기 화학식 I-p-1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 올리고뉴클레오타이드를 형성하며:
[화학식 I-p-1]
Figure pct00082
식 중, 각각의 B, R1, R2, R3, R4, X1, X2, Y4, 및 Z는 상기 정의된 바와 같다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제공하며, 식 중, 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 화학식 I로 나타내며, 식 중, X3이 -O-이고, n은 1이며, 연결성 및 입체화학은 도시된 바와 같으며, Y1은 뉴클레오사이드
Figure pct00083
의 3'-하이드록실에 부착되는 공유 결합이며, Y2는
Figure pct00084
이고, 이에 의해 하기 화학식 I-q-1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 올리고뉴클레오타이드를 형성하며:
[화학식 I-q-1]
Figure pct00085
식 중, 각각의 B, R1, R2, R3, R4, X1, X2, Y4, 및 Z는 상기 정의된 바와 같다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 상기 개시된 핵산 유사체 중 하나 이상을 갖는 15 내지 30개 뉴클레오타이드 길이의 안티센스 가닥 및 10 내지 53개 뉴클레오타이드 길이의 센스 가닥을 포함하는 올리고뉴클레오타이드-리간드 접합체를 제공하고, 여기서 센스 가닥은 안티센스 가닥과 함께 이중체 영역을 형성하고, 센스 가닥은 하나 이상의 리간드 모이어티를 포함한다. 특정 실시형태에서, 리간드 모이어티는 GalNAc이다.
특정 실시형태에서, 안티센스 가닥은 5' 말단에 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 하기를 포함하는, 올리고뉴클레오타이드-리간드 접합체, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
위치 3, 5, 8, 10, 12, 13, 15 및 17에 2'-플루오로 변형된 뉴클레오타이드, 위치 1, 2, 4, 6, 7, 9, 11, 14, 16, 18-27, 및 31-36에 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드, 및 위치 1 및 2의 뉴클레오타이드들 사이에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 36개 뉴클레오타이드 길이의 센스 가닥으로서, 위치 27-30의 뉴클레오타이드는 테트라루프를 형성하고, 위치 28-30에 있는 각각의 뉴클레오타이드는 2' 위치에서 1가 GalNac 모이어티에 접합되는, 센스 가닥; 및
위치 3, 4, 5, 7, 10, 14, 16, 및 19에 2'-플루오로 변형된 뉴클레오타이드, 위치 1, 2, 6, 8, 9, 11, 12, 13, 15, 17, 18, 및 20-22에 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드, 및 위치 2 및 3의 뉴클레오타이드들 사이, 위치 20 및 21의 뉴클레오타이드들 사이, 위치 21 및 22의 뉴클레오타이드들 사이의 3개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 22개 뉴클레오타이드 길이의 안티센스 가닥으로서, 위치 1 및 2의 뉴클레오타이드가 하기 구조를 갖는 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 형성하고,
Figure pct00086
식 중, 각각의 B는 독립적으로 본원에 기재된 바와 같은 핵염기, 예를 들어 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 우라실인, 안티세스 가닥.
일부 실시형태에서, 센스 가닥의 위치 27-30은 GAAA 테트라루프를 형성한다.
일부 실시형태에서, 2' 위치에서 1가 GalNac 모이어티에 접합된 뉴클레오타이드는 하기 구조를 가지며:
Figure pct00087
식 중, B는 본원에 기재된 바와 같은 핵염기, 예를 들어, 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 우라실이며; X는 O, S 또는 N이고; L은 결합, 클릭 화학 핸들, 또는 치환된 및 치환되지 않은 알킬렌, 치환된 및 치환되지 않은 알케닐렌, 치환된 및 치환되지 않은 알키닐렌, 치환된 및 치환되지 않은 헤테로알킬렌, 치환된 및 치환되지 않은 헤테로알케닐렌, 치환된 및 치환되지 않은 헤테로알키닐렌, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 1 내지 20개의 연속적인 공유 결합된 원자 길이의 링커이다. 일부 실시형태에서, L은 아세탈 링커이다. 일부 실시형태에서, X는 O이다.
일부 실시형태에서, 2' 위치에서 1가 GalNac 모이어티에 접합된 뉴클레오타이드는 하기 구조를 가지며:
Figure pct00088
여기서, B는 본원에 기재된 바와 같은 핵염기, 예를 들어, 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 우라실이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 도 4에 도시된 바와 같은 GalXC2의 구조를 갖는 올리고뉴클레오타이드-리간드 접합체를 제공한다.
본 발명의 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 예시적인 핵산 및 이의 유사체는 하기 표 1에 제시되어 있다.
Figure pct00089
Figure pct00090
Figure pct00091
일부 실시형태에서, 본 발명은 상기 표 1에 제시된 본 발명의 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제공한다.
4. 핵산 및 이의 유사체를 제공하는 일반적인 방법
본원에 기재된 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 및 이의 유사체는 표준 포스포라미다이트 방법을 비롯한 당업계에 공지된 다양한 합성 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 임의의 포스포라미다이트 합성 방법을 사용하여 본 발명의 제공된 핵산을 합성할 수 있다. 특정 실시형태에서, 포스포라미다이트는 반응성 중간체 포스파이트 화합물을 생성하기 위해 고체상 합성 방법에 사용되며, 이는 후속적으로 공지된 방법을 사용하여 산화되어 전형적으로 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결을 갖는 포스포네이트-변형된 올리고뉴클레오타이드를 생성한다. 본 개시내용의 올리고뉴클레오타이드 합성은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 5'에서 3'으로, 또는 3'에서 5'로 어느 방향으로든 수행될 수 있다.
특정 실시형태에서, 제공된 핵산을 합성하는 방법은 (a) 뉴클레오사이드 또는 이의 유사체를 공유 결합을 통해 고체 지지체에 부착하는 단계; (b) 뉴클레오사이드 포스포라미다이트 또는 이의 유사체를 단계 (a)의 뉴클레오사이드 또는 이의 유사체 상의 반응성 하이드록실기에 커플링하여, 이들 사이에 뉴클레오타이드간 연결을 형성하고, 여기서 고체 지지체 상의 커플링되지 않은 임의의 뉴클레오사이드 또는 이의 유사체를 캡핑 시약으로 캡핑하는 단계; (c) 상기 뉴클레오타이드간 연결을 산화제로 산화시키는 단계; 및 (d) 단계 (b) 내지 (c)를 후속 뉴클레오사이드 포스포라미다이트 또는 이의 유사체와 반복적으로 반복하여, 핵산 또는 이의 유사체를 형성하는 단계로서, 여기서 단계 (a)의 뉴클레오사이드 또는 이의 유사체, 단계 (b)의 뉴클레오사이드 포스포라미다이트 또는 이의 유사체 또는 단계 (d)의 후속 뉴클레오사이드 포스포라미다이트 또는 이의 유사체 중 적어도 하나가 본원에 기재된 포스포네이트-함유 모이어티를 포함하는, 단계를 포함한다. 전형적으로, 커플링, 캡핑/산화 단계 및 임의로, 탈보호 단계는 올리고뉴클레오타이드가 원하는 길이 및/또는 서열에 도달할 때까지 반복되고, 그 후에 고체 지지체로부터 절단된다.
특정 보호기, 이탈기, 또는 변환 조건이 도시된 하기 반응식 A에서, 당업자는 다른 보호기, 이탈기 및 변환 조건이 또한 적합하고 고려된다는 것을 이해할 것이다. 추가 보호기 전략을 필요로 하는 반응식 A의 속에서 구상되는 특정 반응성 작용기(예를 들어, -N(H)-, -OH 등)가 또한 고려되고, 당해 분야의 숙련가에 의해 인식된다. 이러한 기들과 변환은 March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, M. B. Smith and J. March, 5th Edition, John Wiley & Sons, 2001, Comprehensive Organic Transformations, R. C. Larock, 2nd Edition, John Wiley & Sons, 1999, 및 Protecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 3rd edition, John Wiley & Sons, 1999에 상세히 설명되어 있으며, 본원에 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 핵산 및 이의 유사체는 일반적으로 아래 제시된 반응식 A 및 반응식 B에 따라 제조된다:
반응식 A: 3'-방향에서 5'-방향으로 진행되는 본 발명의 핵산 및 이의 유사체의 합성 및 본 발명의 올리고뉴클레오타이드의 합성
Figure pct00092
위의 반응식 A에 도시된 바와 같이, 화학식 A1의 핵산 또는 이의 유사체는 예컨대 루이스산(예를 들어, BF3-OEt2)을 사용하여 화학식 A2의 P(V) 화합물에 커플링되어, 4'-O-메틸렌 포스포네이트를 포함하지만 이에 제한되지 않는 화학식 A3의 핵산 또는 이의 유사체를 형성한다. 그런 다음, 화학식 A3의 핵산 또는 이의 유사체가 먼저 탈보호(예를 들어, 가수분해)되어, 수소 4'-O-메틸렌 포스포네이트를 포함하지만 이에 제한되지 않는 화학식 A4의 핵산 또는 이의 유사체를 형성한 다음, 화학식 A5의 뉴클레오타이드 또는 이의 유사체와 축합되어, 본 발명의 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하지만 이에 제한되지 않는 화학식 I-b의 핵산 또는 이의 유사체를 형성한다. 그런 다음, 화학식 I-b의 핵산 또는 이의 유사체는 탈보호되어 화학식 I-g의 핵산 또는 이의 유사체를 형성하고, 화학식 A6의 포스포라미다이트 유사체와 반응하여 본 발명의 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 화학식 I-h의 핵산 또는 이의 유사체를 형성한다. 그런 다음, 화학식 I-h의 핵산 또는 이의 유사체의 산화는 본 발명의 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하지만 이에 제한되지 않는 화학식 I-i의 올리고뉴클레오타이드 화합물을 제공한다. 각각의 B, E, PG, R1, R2, R3, R4, X1, X2, X3, Y2, Y3, Z, 및 n은 상기 정의되고 본원에 기재된 바와 같다.
반응식 B: 5'-방향에서 3'-방향에서 진행되는 본 발명의 핵산 및 이의 유사체 및 올리고뉴클레오타이드의 합성
Figure pct00093
상기 반응식 B에 도시된 바와 같이, 본 발명의 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 화학식 I-c의 핵산 또는 이의 유사체는 먼저 선택적으로 탈보호되어 본 발명의 화학식 I-d의 핵산 또는 이의 유사체를 형성한 다음, P(III) 형성 시약과 반응하여 본 발명의 화학식 I-e의 핵산 또는 이의 유사체를 형성한다. PG1의 선택적 제거를 가능하게 하는 화학식 I-c의 핵산 또는 이의 유사체에서 PG1 및 PG의 선택에 대한 지침은 본 개시내용 내에서 제공되며, Protecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 3rd edition, John Wiley & Sons, 1999에 상세히 설명되어 있으며, 각각의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된다. 그런 다음, 본 발명의 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하지만 이에 제한되지 않는 화학식 I-e의 핵산 또는 이의 유사체는 화학식 A8의 뉴클레오타이드 또는 이의 유사체와 축합되어 본 발명의 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 하기 화학식 I-p의 핵산 또는 이의 유사체를 형성할 수 있다. 그런 다음, 화학식 I-p의 핵산 또는 이의 유사체의 산화는 본 발명의 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하지만 이에 제한되지 않는 화학식 I-q의 올리고뉴클레오타이드 화합물을 제공한다. 각각의 B, E, PG, PG1, R1, R2, R3, R4, X1, X2, X3, Y4, Z 및 n은 상기 정의되고 본원에 기재된 바와 같다.
당업자는 지방족 기, 알코올, 카르복실산, 에스테르, 아미드, 알데히드, 할로겐 및 니트릴과 같은 본 발명의 핵산 또는 이의 유사체에 존재하는 다양한 작용기가 환원, 산화, 에스테르화, 가수분해, 부분 산화, 부분 환원, 할로겐화, 탈수, 부분 수화 및 수화를 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 잘 알려져 있는 기술에 의해 상호전환될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어,"March's Advanced Organic Chemistry", 5th Ed., Ed.: Smith, M.B. and March, J., John Wiley & Sons, New York: 2001를 참조하며, 본원에 각각 참조로 포함되어 있다. 이러한 상호전환은 전술한 기술들 중 하나 이상을 필요로 할 수 있으며, 제공된 본 발명의 핵산을 합성하기 위한 특정 방법들이 하기 예시에서 설명된다.
한 양태에 따르면, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 화합물의 제조 방법을 제공하고, 여기서 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 하기 화학식 I-i 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로 나타내며,
[화학식 I-i]
Figure pct00094
하기 단계
(a) 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제공하는 단계로서, 여기서 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결이 화학식 I-h 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로 나타내는, 단계:
[화학식 I-h]
Figure pct00095
, 및
(b) 화학식 I-h를 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 산화시켜 화학식 I-i를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 화합물을 형성하는 단계
를 포함하고,
식 중,
각 B가 핵염기 또는 수소이고;
R1 및 R2는 독립적으로 수소, 할로겐, R5, -CN, -S(O)R, -S(O)2R, -Si(OR)2R, -Si(OR)R2, 또는 -SiR3이거나:
동일한 탄소 상의 R1 및 R2가 그들의 개재 원자와 함께, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 0-3개의 헤테로원자를 갖는 3-7원 포화 또는 부분 불포화 고리를 형성하며;
각각의 R은 독립적으로 수소, 적합한 보호기, 또는 C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이거나:
동일한 원자 상의 2개의 R 기는 그들의 개재 원자와 함께, 질소, 산소, 규소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 0-3개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화, 부분 불포화 또는 헤테로아릴 고리를 형성하고;
R3은 수소, 적합한 보호기, 적합한 전구약물, 또는 C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
각각의 R4는 독립적으로 수소, 적합한 전구약물, R5, 할로겐, -CN, -NO2, -OR, -SR, -NR2, -S(O)2R, -S(O)2NR2, -S(O)R, -C(O)R, -C(O)OR, -C(O)NR2, -C(O)N(R)OR, -OC(O)R, -OC(O)NR2, -OP(O)R2, -OP(O)(OR)2, -OP(O)(OR)NR2, -OP(O)(NR2)2-, -N(R)C(O)OR, -N(R)C(O)R, -N(R)C(O)NR2, -N(R)S(O)2R, -N(R)P(O)R2, -N(R)P(O)(OR)2, -N(R)P(O)(OR)NR2, -N(R)P(O)(NR2)2, -N(R)S(O)2R, -Si(OR)2R, -Si(OR)R2, 또는 -SiR3이고;
각각의 R5는 독립적으로, C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭 고리, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
각각의 X1은 독립적으로 O, S 또는 NR이고;
각각의 X2는 독립적으로 -O-, -S-, -B(H)2-, 또는 공유 결합이고;
X3은 -O-, -S-, -Se-, 또는 -N(R)-이고;
Y2는 수소, 보호기, 포스포라미다이트 유사체, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 4'- 또는 5'-말단에 부착되는 뉴클레오타이드간 연결 기, 또는 고체 지지체에 부착되는 연결 기이고;
Y3은 뉴클레오타이드, 뉴클레오사이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 2'- 또는 3'-말단에 부착되는 연결 기이고;
각각의 Z는 독립적으로 -O-, -S-, -N(R)-, 또는 -C(R)2-이고;
각각의 n은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
한 양태에 따르면, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 화합물의 제조 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법을 제공하며, 여기서 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 하기 화학식 I-q 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로 나타낸다:
[화학식 I-q]
Figure pct00096
(a) 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제공하는 단계로서, 여기서 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결이 화학식 I-p 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로 나타내는, 단계:
[화학식 I-p]
Figure pct00097
, 및
(b) 화학식 I-p를 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 산화시켜 화학식 I-q를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 화합물을 형성하는 단계:
식 중,
각 B가 핵염기 또는 수소이고;
PG가 적합한 하이드록실 보호기이고;
R1 및 R2는 독립적으로 수소, 할로겐, R5, -CN, -S(O)R, -S(O)2R, -Si(OR)2R, -Si(OR)R2, 또는 -SiR3이거나:
동일한 탄소 상의 R1 및 R2가 그들의 개재 원자와 함께, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 0-3개의 헤테로원자를 갖는 3-7원 포화 또는 부분 불포화 고리를 형성하며;
각각의 R은 독립적으로 수소, 적합한 보호기, 또는 C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이거나:
동일한 원자 상의 2개의 R 기는 그들의 개재 원자와 함께, 질소, 산소, 규소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 0-3개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화, 부분 불포화 또는 헤테로아릴 고리를 형성하고;
R3은 수소, 적합한 보호기, 적합한 전구약물, 또는 C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
각각의 R4는 독립적으로 수소, 적합한 전구약물, R5, 할로겐, -CN, -NO2, -OR, -SR, -NR2, -S(O)2R, -S(O)2NR2, -S(O)R, -C(O)R, -C(O)OR, -C(O)NR2, -C(O)N(R)OR, -OC(O)R, -OC(O)NR2, -OP(O)R2, -OP(O)(OR)2, -OP(O)(OR)NR2, -OP(O)(NR2)2-, -N(R)C(O)OR, -N(R)C(O)R, -N(R)C(O)NR2, -N(R)S(O)2R, -N(R)P(O)R2, -N(R)P(O)(OR)2, -N(R)P(O)(OR)NR2, -N(R)P(O)(NR2)2, -N(R)S(O)2R, -Si(OR)2R, -Si(OR)R2, 또는 -SiR3이고;
각각의 R5는 독립적으로, C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭 고리, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
각각의 X1은 독립적으로 O, S 또는 NR이고;
각각의 X2는 독립적으로 -O-, -S-, -B(H)2-, 또는 공유 결합이고;
X3은 -O-, -S-, -Se-, 또는 -N(R)-이고;
Y4는 수소, 보호기, 포스포라미다이트 유사체, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 4'- 또는 5'-말단에 부착되는 뉴클레오타이드간 연결 기, 또는 고체 지지체에 부착되는 연결 기이고;
각각의 Z는 독립적으로 -O-, -S-, -N(R)-, 또는 -C(R)2-이고;
각각의 n은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
화학식 I-i를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 화합물을 형성하기 위한 화학식 I-h를 포함하는 핵산 또는 이의 유사체 또는 화학식 I-q를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 화합물을 형성하기 위한 화학식 I-p를 포함하는 핵산 또는 이의 유사체의 산화는 공지된 산화 조건을 사용하여 수행될 수 있다. 당업자는 P(III)의 P(V)로의 산화가 과산화수소, 하이드로과산화물, 과산화물, 과산, 요오드 및 이들의 혼합물과 같은 다양한 시약에 의해 수행될 수 있음을 인지할 것이다. 과산화수소는 아세토니트릴과 같은 용매의 존재하에 사용될 수 있다. 하이드로과산화물(즉, ROOH)은 R이 알킬 또는 아릴인 과산화물, 및 t-부틸 퍼옥사이드(tBuOOH)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 그의 염을 포함한다. 과산화물은 알킬, 아릴 또는 혼합 알킬/아릴 과산화물, 및 그의 염을 포함한다. 과산은 클로로퍼옥시벤조산(mCPBA)을 비롯한, 알킬 및 아릴 과산을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 브롬(Br2), 염소(Cl2) 또는 요오드(I2)와 같은 염기성 할로겐의 사용은 물 및 기타 성분들, 예컨대 피리딘, 테트라하이드로푸란 및 물의 존재하에 수행될 수 있다. 대안적으로, TEMPO 존재하의 Cl2 수용액도 고려된다. 따라서, 용어 "산화제"는 "황화제"를 포함하며, 이는 또한 "티화제(thiation)"와 동일한 의미를 갖는 것으로 간주된다. 포스포로티오에이트(PS) 연결을 함유하는 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 데 사용된 황화 시약의 예는 원소 황, 디벤조일테트라설파이드, 3-H-1,2-벤지디티올-3-온 1,1-디옥사이드(Beaucage 시약), 테트라에틸티우람 디설파이드(TETD), 및 비스(O,O-디이소프로폭시 포스피노티오일) 디설파이드(Stec 시약)을 포함한다. 포스포로티오에이트 디에스테르 연결을 생성하기 위한 산화제는 Cole et al.의 미국 특허 제6,242,591호에 기재된 바와 같은 페닐아세틸디설파이드(PADS)를 포함한다. 특정 실시형태에서, 산화는 수성 피리딘 중 요오드를 사용하여 수행된다.
특정 양태에서, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 화합물의 제조 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법을 제공하며, 여기서 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 하기 화학식 I-i-1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로 나타낸다:
[화학식 I-i-1]
Figure pct00098
(a) 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제공하는 단계로서, 여기서 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결이 화학식 I-h-1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로 나타내는, 단계:
[화학식 I-h-1]
Figure pct00099
, 및
(b) 화학식 I-h-1을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 산화시켜 화학식 I-i-1을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 화합물을 형성하는 단계:
식 중, 각각의 B, R1, R2, R3, R4, X1, X2, Y2, Y3, 및 Z가 본원에 기재되고 상기 정의된 바와 같다.
특정 양태에서, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 화합물의 제조 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법을 제공하며, 여기서 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 하기 화학식 I-q-1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로 나타낸다:
[화학식 I-q-1]
Figure pct00100
(a) 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제공하는 단계로서, 여기서 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결이 화학식 I-p-1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로 나타내는, 단계:
[화학식 I-p-1]
Figure pct00101
, 및
(b) 화학식 I-p-1을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 산화시켜 화학식 I-q-1을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 화합물을 형성하는 단계:
식 중, B, PG, R1, R2, R3, R4, X1, X2, Y4, 및 Z가 본원에 기재되고 상기 정의된 바와 같다.
한 양태에 따르면, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체의 제조 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법을 제공하며, 여기서 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 하기 화학식 I-h 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로 나타낸다:
[화학식 I-h]
Figure pct00102
(a) 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제공하는 단계로서, 여기서 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결이 화학식 I-g로 나타내는, 단계:
[화학식 I-g]
Figure pct00103
, 및
(b) 화학식 I-g를 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 하기 화학식 A6의 포스포라미다이트 유사체와 반응시켜 화학식 I-h를 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 형성하는 단계:
[화학식 A6]
Figure pct00104
식 중,
각 B가 핵염기 또는 수소이고;
R1 및 R2는 독립적으로 수소, 할로겐, R5, -CN, -S(O)R, -S(O)2R, -Si(OR)2R, -Si(OR)R2, 또는 -SiR3이거나:
동일한 탄소 상의 R1 및 R2가 그들의 개재 원자와 함께, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 0-3개의 헤테로원자를 갖는 3-7원 포화 또는 부분 불포화 고리를 형성하며;
각각의 R은 독립적으로 수소, 적합한 보호기, 또는 C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이거나:
동일한 원자 상의 2개의 R 기는 그들의 개재 원자와 함께, 질소, 산소, 규소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 0-3개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화, 부분 불포화 또는 헤테로아릴 고리를 형성하고;
R3은 수소, 적합한 보호기, 적합한 전구약물, 또는 C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
각각의 R4는 독립적으로 수소, 적합한 전구약물, R5, 할로겐, -CN, -NO2, -OR, -SR, -NR2, -S(O)2R, -S(O)2NR2, -S(O)R, -C(O)R, -C(O)OR, -C(O)NR2, -C(O)N(R)OR, -OC(O)R, -OC(O)NR2, -OP(O)R2, -OP(O)(OR)2, -OP(O)(OR)NR2, -OP(O)(NR2)2-, -N(R)C(O)OR, -N(R)C(O)R, -N(R)C(O)NR2, -N(R)S(O)2R, -N(R)P(O)R2, -N(R)P(O)(OR)2, -N(R)P(O)(OR)NR2, -N(R)P(O)(NR2)2, -N(R)S(O)2R, -Si(OR)2R, -Si(OR)R2, 또는 -SiR3이고;
각각의 R5는 독립적으로, C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭 고리, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
E는 할로겐 또는 -NR2이고;
X1은 O, S 또는 NR이고;
각각의 X2는 독립적으로 -O-, -S-, -B(H)2-, 또는 공유 결합이고;
X3은 -O-, -S-, -Se-, 또는 -N(R)-이고;
Y2는 수소, 보호기, 포스포라미다이트 유사체, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 4'- 또는 5'-말단에 부착되는 뉴클레오타이드간 연결 기, 또는 고체 지지체에 부착되는 연결 기이고;
Y3은 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 2'- 또는 3'-말단에 부착되는 연결 기이고;
각각의 Z는 독립적으로 -O-, -S-, -N(R)-, 또는 -C(R)2-이고;
각각의 n은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
한 양태에 따르면, 본 발명은 화학식 I-e, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 핵산 또는 이의 유사체를 제조하는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법을 제공한다:
[화학식 I-e]
Figure pct00105
(a) 화학식 I-d의 핵산 또는 이의 유사체를 제공하는 단계:
[화학식 I-d]
Figure pct00106
(b) 화학식 I-d의 핵산 또는 이의 유사체를 P(III) 형성 시약과 반응시켜 화학식 I-e의 핵산 또는 이의 유사체를 형성하는 단계:
식 중,
각 B가 핵염기 또는 수소이고;
PG가 적합한 하이드록실 보호기이고;
R1 및 R2는 독립적으로 수소, 할로겐, R5, -CN, -S(O)R, -S(O)2R, -Si(OR)2R, -Si(OR)R2, 또는 -SiR3이거나:
동일한 탄소 상의 R1 및 R2가 그들의 개재 원자와 함께, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 0-3개의 헤테로원자를 갖는 3-7원 포화 또는 부분 불포화 고리를 형성하며;
각각의 R은 독립적으로 수소, 적합한 보호기, 또는 C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이거나:
동일한 원자 상의 2개의 R 기는 그들의 개재 원자와 함께, 질소, 산소, 규소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 0-3개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화, 부분 불포화 또는 헤테로아릴 고리를 형성하고;
R3은 수소, 적합한 보호기, 적합한 전구약물, 또는 C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
각각의 R4는 독립적으로 수소, 적합한 전구약물, R5, 할로겐, -CN, -NO2, -OR, -SR, -NR2, -S(O)2R, -S(O)2NR2, -S(O)R, -C(O)R, -C(O)OR, -C(O)NR2, -C(O)N(R)OR, -OC(O)R, -OC(O)NR2, -OP(O)R2, -OP(O)(OR)2, -OP(O)(OR)NR2, -OP(O)(NR2)2-, -N(R)C(O)OR, -N(R)C(O)R, -N(R)C(O)NR2, -N(R)S(O)2R, -N(R)P(O)R2, -N(R)P(O)(OR)2, -N(R)P(O)(OR)NR2, -N(R)P(O)(NR2)2, -N(R)S(O)2R, -Si(OR)2R, -Si(OR)R2, 또는 -SiR3이고;
각각의 R5는 독립적으로, C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭 고리, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
E는 할로겐 또는 -NR2이고;
X1은 O, S 또는 NR이고;
각각의 X2는 독립적으로 -O-, -S-, -B(H)2-, 또는 공유 결합이고;
X3은 -O-, -S-, -Se-, 또는 -N(R)-이고;
각각의 Z는 독립적으로 -O-, -S-, -N(R)-, 또는 -C(R)2-이고;
각각의 n은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
한 실시형태에 따르면, 상기 단계 (b)에서 화학식 A6의 포스포라미다이트 유사체는 포스포라미다이트 올리고뉴클레오타이드 합성에 일반적으로 사용되는 포스포라미다이트 모이어티를 포함하는, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 또는 올리고뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 포스포라미다이트 또는 이의 유사체는 P(III) 형성 시약을 사용하여 제조된다. 일부 실시형태에서, P(III) 형성 시약은 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트 또는 2-시아노에틸 포스포로디클로리데이트이다. 특정 실시형태에서, P(III) 형성 시약은 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트이다. 당업자는 단계 (b)의 P(III) 유사체에서의 이탈기가 각각 화학식 I-d 또는 화학식 I-g를 포함하는 핵산 또는 이의 유사체의 하이드록실 또는 X3 모이어티에 의해 변위되는 것이 적합한 염기의 유무에 관계없이 달성된다는 것을 인지할 것이다. 이러한 적합한 염기는 당업계에 잘 알려져 있으며, 유기 및 무기 염기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 염기는 트리에틸아민 또는 디이소프로필에틸아민과 같은 3차 아민이다. 특정 실시형태에서, 염기는 4,5-디시아노이미다졸이다.
특정 양태에서, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제조하는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법을 제공하며, 여기서 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 하기 화학식 I-h-1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로 나타내며:
[화학식 I-h-1]
Figure pct00107
(a) 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제공하는 단계로서, 여기서 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 하기 화학식 I-g-1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로 나타내며:
[화학식 I-g-1]
Figure pct00108
(b) 화학식 I-g-1의 핵산 또는 이의 유사체를 하기 화학식 A6의 포스포라미다이트 유사체와 반응시켜 화학식 I-h-1의 핵산 또는 이의 유사체를 형성하는 단계:
[화학식 A6]
Figure pct00109
식 중, 각각의 B, E, R1, R2, R3, R4, X1, X2, Y2, Y3, 및 Z는 본원에 기재된 바와 같이, 상기 정의된다.
특정 양태에서, 본 발명은 화학식 I-e-1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 핵산 또는 이의 유사체를 제조하는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는, 방법을 제공한다:
[화학식 I-e-1]
Figure pct00110
(a) 화학식 I-d-1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 핵산 또는 이의 유사체를 제공하는 단계:
[화학식 I-d-1]
Figure pct00111
, 및
(b) 화학식 I-d-1의 핵산 또는 이의 유사체를 P(III) 형성 시약과 반응시켜 화학식 I-e-1의 핵산 또는 이의 유사체를 형성하는 단계:
식 중, 각각의 B, PG, R1, R2, R3, R4, X1, X2, 및 Z는 본원에 기재된 바와 같이, 상기 정의된다.
한 양태에 따르면, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제조하는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법을 제공하며, 여기서 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 화학식 I-g, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로 나타낸다:
[화학식 I-g]
Figure pct00112
(a) 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제공하는 단계로서, 여기서 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 화학식 I-b, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로 나타내는, 단계,
[화학식 I-b]
Figure pct00113
(b) 화학식 I-b를 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 탈보호하여, 화학식 I-g를 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 형성하는 단계:
식 중,
각 B가 핵염기 또는 수소이고;
PG가 적합한 하이드록실 보호기이고;
R1 및 R2는 독립적으로 수소, 할로겐, R5, -CN, -S(O)R, -S(O)2R, -Si(OR)2R, -Si(OR)R2, 또는 -SiR3이거나:
동일한 탄소 상의 R1 및 R2가 그들의 개재 원자와 함께, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 0-3개의 헤테로원자를 갖는 3-7원 포화 또는 부분 불포화 고리를 형성하며;
각각의 R은 독립적으로 수소, 적합한 보호기, 또는 C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이거나:
동일한 원자 상의 2개의 R 기는 그들의 개재 원자와 함께, 질소, 산소, 규소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 0-3개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화, 부분 불포화 또는 헤테로아릴 고리를 형성하고;
R3은 수소, 적합한 보호기, 적합한 전구약물, 또는 C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
각각의 R4는 독립적으로 수소, 적합한 전구약물, R5, 할로겐, -CN, -NO2, -OR, -SR, -NR2, -S(O)2R, -S(O)2NR2, -S(O)R, -C(O)R, -C(O)OR, -C(O)NR2, -C(O)N(R)OR, -OC(O)R, -OC(O)NR2, -OP(O)R2, -OP(O)(OR)2, -OP(O)(OR)NR2, -OP(O)(NR2)2-, -N(R)C(O)OR, -N(R)C(O)R, -N(R)C(O)NR2, -N(R)S(O)2R, -N(R)P(O)R2, -N(R)P(O)(OR)2, -N(R)P(O)(OR)NR2, -N(R)P(O)(NR2)2, -N(R)S(O)2R, -Si(OR)2R, -Si(OR)R2, 또는 -SiR3이고;
각각의 R5는 독립적으로, C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭 고리, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
X1은 O, S 또는 NR이고;
각각의 X2는 독립적으로 -O-, -S-, -B(H)2-, 또는 공유 결합이고;
X3은 -O-, -S-, -Se-, 또는 -N(R)-이고;
Y2는 수소, 보호기, 포스포라미다이트 유사체, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 4'- 또는 5'-말단에 부착되는 뉴클레오타이드간 연결 기, 또는 고체 지지체에 부착되는 연결 기이고;
각각의 Z는 독립적으로 -O-, -S-, -N(R)-, 또는 -C(R)2-이고;
각각의 n은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
한 양태에 따르면, 본 발명은 화학식 I-d 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 핵산을 제조하는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법을 제공한다:
[화학식 I-d]
Figure pct00114
(a) 화학식 I-c 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 핵산 또는 이의 유사체를 제공하는 단계:
[화학식 I-c]
Figure pct00115
, 및
(b) 화학식 I-d를 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 탈보호하여, 화학식 I-c를 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 형성하는 단계:
식 중,
각 B가 핵염기 또는 수소이고;
PG가 적합한 하이드록실 보호기이고;
PG1이 보호기이고;
R1 및 R2는 독립적으로 수소, 할로겐, R5, -CN, -S(O)R, -S(O)2R, -Si(OR)2R, -Si(OR)R2, 또는 -SiR3이거나:
동일한 탄소 상의 R1 및 R2가 그들의 개재 원자와 함께, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 0-3개의 헤테로원자를 갖는 3-7원 포화 또는 부분 불포화 고리를 형성하며;
각각의 R은 독립적으로 수소, 적합한 보호기, 또는 C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이거나:
동일한 원자 상의 2개의 R 기는 그들의 개재 원자와 함께, 질소, 산소, 규소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 0-3개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화, 부분 불포화 또는 헤테로아릴 고리를 형성하고;
R3은 수소, 적합한 보호기, 적합한 전구약물, 또는 C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
각각의 R4는 독립적으로 수소, 적합한 전구약물, R5, 할로겐, -CN, -NO2, -OR, -SR, -NR2, -S(O)2R, -S(O)2NR2, -S(O)R, -C(O)R, -C(O)OR, -C(O)NR2, -C(O)N(R)OR, -OC(O)R, -OC(O)NR2, -OP(O)R2, -OP(O)(OR)2, -OP(O)(OR)NR2, -OP(O)(NR2)2-, -N(R)C(O)OR, -N(R)C(O)R, -N(R)C(O)NR2, -N(R)S(O)2R, -N(R)P(O)R2, -N(R)P(O)(OR)2, -N(R)P(O)(OR)NR2, -N(R)P(O)(NR2)2, -N(R)S(O)2R, -Si(OR)2R, -Si(OR)R2, 또는 -SiR3이고;
각각의 R5는 독립적으로, C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭 고리, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
X1은 O, S 또는 NR이고;
각각의 X2는 독립적으로 -O-, -S-, -B(H)2-, 또는 공유 결합이고;
X3은 -O-, -S-, -Se-, 또는 -N(R)-이고;
각각의 Z는 독립적으로 -O-, -S-, -N(R)-, 또는 -C(R)2-이고;
각각의 n은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
본원에 기재된 실시형태에 따르면, 상기 단계 (b)에서 보호기(예를 들어, PG 또는 PG1)의 탈보호는 문헌[Protecting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 3rd edition, John Wiley & Sons, 1999]에 상세히 기재된 보호기를 포함하며, 각각의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된다. 일부 실시형태에서, 보호기는 적합한 하이드록실 보호기, 적합한 아미노 보호기, 또는 적합한 티올 보호기이다.
본원에 사용된 바와 같이, "적절한 하이드록실 보호기"라는 문구는 당업계에 잘 알려져 있고, 이것이 결합된 산소 원자와 함께 취해질 때, 에스테르, 에테르, 실릴 에테르, 알킬 에테르, 아릴알킬 에테르 및 알콕시알킬 에테르로부터 독립적으로 선택된다. 이러한 에스테르의 예는 포르메이트, 아세테이트, 카르보네이트 및 설포네이트를 포함한다. 구체적인 예는 포르메이트, 벤조일 포르메이트, 클로로아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 메톡시아세테이트, 트리페닐메톡시아세테이트, p-클로로페녹시아세테이트, 3-페닐프로피오네이트, 4-옥소펜타노에이트, 4,4-(에틸렌디티오)펜타노에이트, 피발로에이트(트리메틸아세틸), 크로토네이트, 4-메톡시-크로토네이트, 벤조에이트, p-베닐벤조에이트, 2,4,6-트리메틸벤조에이트, 카르보네이트, 예컨대 메틸, 9-플루오레닐메틸, 에틸, 2,2,2-트리클로로에틸, 2-(트리메틸실릴)에틸, 2-(페닐설포닐)에틸, 비닐, 알릴 및 p-니트로벤질을 포함한다. 이러한 실릴 에테르의 예는 트리메틸실릴, 트리에틸실릴, t-부틸디메틸실릴, t-부틸디페닐실릴, 트리이소프로필실릴 및 기타 트리알킬실릴 에테르를 포함한다. 알킬 에테르는 메틸, 벤질, p-메톡시벤질, 3,4-디메톡시벤질, 트리틸, t-부틸, 알릴, 및 알릴옥시카르보닐 에테르 또는 유도체를 포함한다. 알콕시알킬 에테르는 메톡시메틸, 메틸티오메틸, (2-메톡시에톡시)메틸, 벤질옥시메틸, 베타-(트리메틸실릴)에톡시메틸, 및 테트라하이드로피라닐 에테르와 같은 아세탈을 포함한다. 아릴알킬 에테르의 예는 벤질, p-메톡시벤질, 3,4-디메톡시벤질, O-니트로벤질, p-니트로벤질, p-할로벤질, 2,6-디클로로벤질, p-시아노벤질, 및 2- 및 4-피콜릴을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적합한 히드록실 보호기는 예를 들어, 디클로로아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 또는 아세트산을 사용하여 산-민감성 올리고뉴클레오타이드의 용액상 및 고체상 합성 동안 탈보호에 적합한, 트리틸, 4-메톡시트리틸, 4,4'-디메톡시트리틸(DMTr), 4,4',4''-트리메톡시트리틸, 9-페닐-크산텐-9-일, 9-(p-톨릴)-크산텐-9-일, 픽실, 2,7-디메틸픽실 등과 같은 산 불안정성 기이다. t-부틸디메틸실릴 기는 합성 동안 DMTr 기를 제거하는 데 사용되는 산성 조건 하에서 안정하지만, 불소 공급원, 예를 들어 테트라부틸암모늄 플루오라이드 또는 피리딘 하이드로플루오라이드를 사용한 RNA 올리고머의 절단 및 탈보호 후에 제거될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "적합한 아미노 보호기"라는 문구는 당업계에 잘 알려져 있고, 이것이 부착된 질소 원자와 함께 취해질 때, 아랄킬아민, 카르바메이트, 알릴 아민, 아미드 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 아민에 대한 단일-보호기의 예는 t-부틸옥시카르보닐(BOC), 에틸옥시카르보닐, 메틸옥시카르보닐, 트리클로로에틸옥시카르보닐, 알릴옥시카르보닐(Alloc), 벤질옥소카르보닐(CBZ), 알릴, 벤질(Bn), 플루오레닐메틸카르보닐(Fmoc), 아세틸, 클로로아세틸, 디클로로아세틸, 트리클로로아세틸, 트리플루오로아세틸, 페닐아세틸, 벤조일 등을 포함한다. 아민에 대한 이중-보호기의 예는 단일-보호기로 상기 기재된 것들로부터 독립적으로 선택된 2개의 치환기로 치환된 아민을 포함하고, 고리형 이미드, 예컨대 프탈이미드, 말레이미드, 숙신이미드, 2,2,5,5-테트라메틸-1,2,5-아자디실로리딘, 아지드 등을 추가로 포함한다. 아미노 보호기의 산 가수분해시, 그의 염 화합물이 형성됨을 이해할 것이다. 예를 들어, 염산과 같은 산으로 처리하여 아미노 보호기가 제거되면, 생성된 아민 화합물이 그의 염산염으로 형성된다. 당업자는 다양한 산이 산에 불안정한 아미노 보호기를 제거하는 데 유용하므로 다양한 염 형태가 고려된다는 것을 인식할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이,"적합한 티올 보호기"라는 문구는 디설파이드, 티오에테르, 실릴 티오에테르, 티오에스테르, 티오카르보네이트, 및 티오카르바메이트 등을 추가로 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 기의 예에는 예를 들어, 알킬 티오에테르, 벤질 및 치환된 벤질 티오에테르, 트리페닐메틸 티오에테르, 및 트리클로로에톡시카르보닐 티오에스테르가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
특정 양태에서, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제조하는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법을 제공하며, 여기서 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 화학식 I-g-1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로 나타낸다:
[화학식 I-g-1]
Figure pct00116
(a) 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제공하는 단계로서, 여기서 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 화학식 I-b-1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로 나타내는, 단계,
[화학식 I-b-1]
Figure pct00117
(b) 화학식 I-b-1을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 탈보호하여, 화학식 I-g-1을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 형성하는 단계:
식 중, 각각의 B, PG, R1, R2, R3, R4, X1, X2, Y2, 및 Z는 본원에 기재된 바와 같이, 상기 정의된다.
특정 양태에서, 본 발명은 화학식 I-d-1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 핵산 또는 이의 유사체를 제조하는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법을 제공한다:
[화학식 I-d-1]
Figure pct00118
(a) 화학식 I-c-1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 핵산 또는 이의 유사체를 제공하는 단계:
[화학식 I-c-1]
Figure pct00119
, 및
(b) 화학식 I-d-1의 핵산 또는 이의 유사체를 탈보호하여, 화학식 I-c-1의 핵산 또는 이의 유사체를 형성하는 단계:
식 중, 각각의 B, PG, PG1, R1, R2, R3, R4, X1, X2, 및 Z는 본원에 기재된 바와 같이, 상기 정의된다.
한 양태에 따르면, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체의 제조 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법을 제공하며, 여기서 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 하기 화학식 I-b 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로 나타낸다:
[화학식 I-b]
Figure pct00120
(a) 화학식 A4 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 핵산 또는 이의 유사체를 제공하는 단계:
[화학식 A4]
Figure pct00121
, 및
(b) 화학식 A4의 핵산 또는 이의 유사체를 화학식 A5의 뉴클레오사이드 또는 이의 유사체와 함께 축합시켜서,
[화학식 A5]
Figure pct00122
화학식 I-b를 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 형성하는 단계:
식 중,
각 B가 핵염기 또는 수소이고;
PG가 적합한 하이드록실 보호기이고;
R1 및 R2는 독립적으로 수소, 할로겐, R5, -CN, -S(O)R, -S(O)2R, -Si(OR)2R, -Si(OR)R2, 또는 -SiR3이거나:
동일한 탄소 상의 R1 및 R2가 그들의 개재 원자와 함께, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 0-3개의 헤테로원자를 갖는 3-7원 포화 또는 부분 불포화 고리를 형성하며;
각각의 R은 독립적으로 수소, 적합한 보호기, 또는 C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이거나:
동일한 원자 상의 2개의 R 기는 그들의 개재 원자와 함께, 질소, 산소, 규소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 0-3개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화, 부분 불포화 또는 헤테로아릴 고리를 형성하고;
R3은 수소, 적합한 보호기, 적합한 전구약물, 또는 C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
각각의 R4는 독립적으로 수소, 적합한 전구약물, R5, 할로겐, -CN, -NO2, -OR, -SR, -NR2, -S(O)2R, -S(O)2NR2, -S(O)R, -C(O)R, -C(O)OR, -C(O)NR2, -C(O)N(R)OR, -OC(O)R, -OC(O)NR2, -OP(O)R2, -OP(O)(OR)2, -OP(O)(OR)NR2, -OP(O)(NR2)2-, -N(R)C(O)OR, -N(R)C(O)R, -N(R)C(O)NR2, -N(R)S(O)2R, -N(R)P(O)R2, -N(R)P(O)(OR)2, -N(R)P(O)(OR)NR2, -N(R)P(O)(NR2)2, -N(R)S(O)2R, -Si(OR)2R, -Si(OR)R2, 또는 -SiR3이고;
각각의 R5는 독립적으로, C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭 고리, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
X1은 O, S 또는 NR이고;
각각의 X2는 독립적으로 -O-, -S-, -B(H)2-, 또는 공유 결합이고;
X3은 -O-, -S-, -Se-, 또는 -N(R)-이고;
Y2는 수소, 보호기, 포스포라미다이트 유사체, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 4'- 또는 5'-말단에 부착되는 뉴클레오타이드간 연결 기, 또는 고체 지지체에 부착되는 연결 기이고;
각각의 Z는 독립적으로 -O-, -S-, -N(R)-, 또는 -C(R)2-이고;
각각의 n은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
한 양태에 따르면, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체의 제조 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법을 제공하며, 여기서 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 하기 화학식 I-p 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로 나타낸다:
[화학식 I-p]
Figure pct00123
(a) 화학식 I-e 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 핵산 또는 이의 유사체를 제공하는 단계:
[화학식 I-e]
Figure pct00124
, 및
(b) 화학식 I-e의 핵산 또는 이의 유사체를 화학식 A8의 뉴클레오사이드 또는 이의 유사체와 함께 축합시켜서,
[화학식 A8]
Figure pct00125
화학식 I-p를 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 형성하는 단계:
식 중,
각 B가 핵염기 또는 수소이고;
PG가 적합한 하이드록실 보호기이고;
R1 및 R2는 독립적으로 수소, 할로겐, R5, -CN, -S(O)R, -S(O)2R, -Si(OR)2R, -Si(OR)R2, 또는 -SiR3이거나:
동일한 탄소 상의 R1 및 R2가 그들의 개재 원자와 함께, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 0-3개의 헤테로원자를 갖는 3-7원 포화 또는 부분 불포화 고리를 형성하며;
각각의 R은 독립적으로 수소, 적합한 보호기, 또는 C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이거나:
동일한 원자 상의 2개의 R 기는 그들의 개재 원자와 함께, 질소, 산소, 규소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 0-3개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화, 부분 불포화 또는 헤테로아릴 고리를 형성하고;
R3은 수소, 적합한 보호기, 적합한 전구약물, 또는 C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
각각의 R4는 독립적으로 수소, 적합한 전구약물, R5, 할로겐, -CN, -NO2, -OR, -SR, -NR2, -S(O)2R, -S(O)2NR2, -S(O)R, -C(O)R, -C(O)OR, -C(O)NR2, -C(O)N(R)OR, -OC(O)R, -OC(O)NR2, -OP(O)R2, -OP(O)(OR)2, -OP(O)(OR)NR2, -OP(O)(NR2)2-, -N(R)C(O)OR, -N(R)C(O)R, -N(R)C(O)NR2, -N(R)S(O)2R, -N(R)P(O)R2, -N(R)P(O)(OR)2, -N(R)P(O)(OR)NR2, -N(R)P(O)(NR2)2, -N(R)S(O)2R, -Si(OR)2R, -Si(OR)R2, 또는 -SiR3이고;
각각의 R5는 독립적으로, C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭 고리, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
E는 할로겐 또는 -NR2이고;
X1은 O, S, 또는 NR이고;
각각의 X2는 독립적으로, -O-, -S-, -B(H)2-, 또는 공유 결합이고;
X3은 -O-, -S-, -Se-, 또는 -N(R)-이고;
Y4는 수소, 보호기, 포스포라미다이트 유사체, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 4'- 또는 5'-말단에 부착되는 뉴클레오타이드간 연결 기, 또는 고체 지지체에 부착되는 연결 기이고;
각각의 Z는 독립적으로 -O-, -S-, -N(R)-, 또는 -C(R)2-이고;
각각의 n은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
일부 실시형태에 따르면, 위의 단계 (b)에서의 축합에는 축합제의 사용이 포함된다. 화학식 A4의 핵산 또는 이의 유사체와 화학식 A5의 뉴클레오사이드 또는 이의 유사체 또는 화학식 I-e를 포함하는 핵산 또는 이의 유사체와 화학식 A8의 뉴클레오사이드 또는 이의 유사체의 축합에 사용되는 축합제는 설포닐 클로라이드, 예컨대 메탄설포닐 클로라이드, 톨루엔설포닐 클로라이드, 2,4,6-트리이소프로필벤젠설포닐 클로라이드, 또는 메시틸렌-2-설포닐 클로라이드; 설포닐테트라졸, 예컨대 1-톨루엔설포닐테트라졸, 1-(메시틸렌-2-설포닐)테트라졸, 또는 1-(2,4,6-트리이소프로필벤젠설포닐)테트라졸; 설포닐트리아졸, 예컨대 3-니트로-1-톨루엔설포닐-1,2,4-트리아졸, 3-니트로-1-(메시틸렌-2-설포닐)-1,2,4-트리아졸 또는 3-니트로-1-(2,4,6-트리이소프로필벤젠설포닐)-1,2,4-트리아졸; 등을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 축합제는 트리이소프로필벤젠설포닐 클로라이드이다. 축합 동안 염기가 공존할 수 있다. 이에 사용되는 염기의 예는 트리에틸아민, 에틸디이소프로필아민, 피리딘, 루티딘, 이미다졸, N-메틸이미다졸, N-메틸벤즈이미다졸 등을 포함한다. 특정 실시형태에서, 염기는 N-메틸이미다졸이다.
특정 양태에서, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체의 제조 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법을 제공하며, 여기서 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 하기 화학식 I-b-1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로 나타낸다:
[화학식 I-b-1]
Figure pct00126
(a) 화학식 A4-1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 핵산 또는 이의 유사체를 제공하는 단계:
[화학식 A4-1]
Figure pct00127
, 및
(b) 화학식 A4-1을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 화학식 A5-1의 뉴클레오사이드 또는 이의 유사체와 함께 축합시켜서,
[화학식 A5-1]
Figure pct00128
화학식 I-b-1을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 형성하는 단계:
식 중, 각각의 B, PG, R1, R2, R3, R4, X1, X2, Y2, 및 Z는 본원에 기재된 바와 같이, 상기 정의된다.
특정 양태에서, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체의 제조 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법을 제공하며, 여기서 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 하기 화학식 I-p-1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로 나타낸다:
[화학식 I-p-1]
Figure pct00129
(a) 화학식 I-e-1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 핵산 또는 이의 유사체를 제공하는 단계:
[화학식 I-e-1]
Figure pct00130
, 및
(b) 화학식 I-e-1의 핵산 또는 이의 유사체를 화학식 A8-1의 뉴클레오사이드 또는 이의 유사체와 함께 축합시켜서,
[화학식 A8-1]
Figure pct00131
화학식 I-p-1을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 형성하는 단계:
식 중, 각각의 B, PG, R1, R2, R3, R4, X1, X2, Y4, 및 Z는 본원에 기재된 바와 같이, 상기 정의된다.
한 양태에 따르면, 본 발명은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 제조하는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법을 제공하며, 여기서 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 화학식 A4, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로 나타낸다:
[화학식 A4]
Figure pct00132
(a) 화학식 A3, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 핵산 또는 이의 유사체를 제공하는 단계:
[화학식 A3]
Figure pct00133
(b) 화학식 A3의 핵산 또는 이의 유사체를 탈보호하여, 화학식 A4의 핵산 또는 이의 유사체를 형성하는 단계:
식 중,
B가 핵염기 또는 수소이고;
R1 및 R2는 독립적으로 수소, 할로겐, R5, -CN, -S(O)R, -S(O)2R, -Si(OR)2R, -Si(OR)R2, 또는 -SiR3이거나:
동일한 탄소 상의 R1 및 R2가 그들의 개재 원자와 함께, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 0-3개의 헤테로원자를 갖는 3-7원 포화 또는 부분 불포화 고리를 형성하며;
각각의 R은 독립적으로 수소, 적합한 보호기, 또는 C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이거나:
동일한 원자 상의 2개의 R 기는 그들의 개재 원자와 함께, 질소, 산소, 규소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 0-3개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화, 부분 불포화 또는 헤테로아릴 고리를 형성하고;
R3은 수소, 적합한 보호기, 적합한 전구약물, 또는 C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
각각의 R4는 독립적으로 수소, 적합한 전구약물, R5, 할로겐, -CN, -NO2, -OR, -SR, -NR2, -S(O)2R, -S(O)2NR2, -S(O)R, -C(O)R, -C(O)OR, -C(O)NR2, -C(O)N(R)OR, -OC(O)R, -OC(O)NR2, -OP(O)R2, -OP(O)(OR)2, -OP(O)(OR)NR2, -OP(O)(NR2)2-, -N(R)C(O)OR, -N(R)C(O)R, -N(R)C(O)NR2, -N(R)S(O)2R, -N(R)P(O)R2, -N(R)P(O)(OR)2, -N(R)P(O)(OR)NR2, -N(R)P(O)(NR2)2, -N(R)S(O)2R, -Si(OR)2R, -Si(OR)R2, 또는 -SiR3이고;
각각의 R5는 독립적으로, C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭 고리, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
X1은 O, S, 또는 NR이고;
각각의 X2는 독립적으로, -O-, -S-, -B(H)2-, 또는 공유 결합이고;
X3은 -O-, -S-, -Se-, 또는 -N(R)-이고;
Y2는 수소, 보호기, 포스포라미다이트 유사체, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 4'- 또는 5'-말단에 부착되는 뉴클레오타이드간 연결 기, 또는 고체 지지체에 부착되는 연결 기이고;
Z는 독립적으로 -O-, -S-, -N(R)-, 또는 -C(R)2-이고;
n은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
특정 실시형태에서, Y2는 보호기이다.
본원에 기재된 실시형태에 따르면, 상기 단계 (b)에서 화학식 A3의 탈보호는 상기 개시되거나 본원에 정의된 임의의 적합한 보호 기의 탈보호를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 화학식 A3의 핵산 또는 유사체는 4'-O-메틸렌 포스포네이트 에스테르를 포함하고, 단일-탈보호는 염기성 수성 조건 하에 수행된다. 적합한 염기 금속 수산화물(예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화리튬 및 수산화바륨), 금속 탄산염(예를 들어, 탄산리튬, 탄산나트륨, 탄산칼륨, 탄산칼슘, 탄산세슘), 탄산수소나트륨, 유기 아민(예를 들어, 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민(DIEA), N-메틸모르폴린, N-에틸모르폴린, 트리부틸아민, 1,4-디아자비시클로[2.2.2]옥탄(DABCO), N-메틸이미다졸(NMI), 피리딘, 2,6-루티딘, 2,4,6-콜리딘, 4-디메틸아미노피리딘(DMAP), 1,8-비스(디메틸아미노)나프탈렌("양성자 스폰지"), 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데크-7-엔(DBU), 1,5-디아자비시클로[4.3.0]논-5-엔(DBN), 7-메틸-1,5,7-트리아자비시클로[4.4.0]덱-5-엔(MTBD), 2-tert-부틸 -1,1,3,3-테트라메틸구아니딘, 2,8,9-트리메틸-2,5,8,9-테트라아자-1-포스파비시클로[3.3.3]운데칸 또는 포스파젠 염기).
특정 양태에서, 본 발명은 화학식 A4-1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 핵산 또는 이의 유사체를 제조하는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법을 제공한다:
[화학식 A4-1]
Figure pct00134
(a) 화학식 A3-1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 핵산 또는 이의 유사체를 제공하는 단계:
[화학식 A3-1]
Figure pct00135
, 및
(b) 화학식 A4-1의 핵산 또는 이의 유사체를 탈보호하여, 화학식 A3-1의 핵산 또는 이의 유사체를 형성하는 단계:
각각의 B, PG, R1, R2, R3, R4, X1, X2, Y2, 및 Z는 본원에 기재된 바와 같이, 상기 정의된다.
특정 실시형태에서, Y2는 보호기이다.
5. 용도, 제형 및 투여
약제학적으로 허용가능한 조성물
또 다른 실시형태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 아주반트 또는 비히클을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물에서 제공된 핵산의 양은 생물학적 샘플 또는 환자에서 표적 유전자의 발현을 측정가능하게 조절하는데 효과적이다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 이러한 조성물을 필요로 하는 환자에게 투여하기 위해 제형화된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 환자에 대한 비경구 또는 경구 투여용으로 제형화된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 아주반트 또는 비히클, 및 핵산 억제제 분자를 포함하고, 여기서 핵산 억제제 분자는 본원에 기재된 바와 같이, 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결 또는 이의 유사체를 포함하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "환자"는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간을 의미한다.
용어 "약제학적으로 허용가능한 담체, 아주반트 또는 비히클"은 그것이 제형화되는 제공된 핵산의 약리학적 활성을 파괴하지 않는 무독성 담체, 아주반트 또는 비히클을 지칭한다. 본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용가능한 담체, 아주반트 또는 비히클은 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 완충액 물질, 예컨대 포스페이트, 글리신, 소르브산, 소르브산칼륨, 포화 식물성 지방산의 부분 글리세리드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예컨대 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연염, 콜로이드 실리카, 삼규산마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로오스계 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 울 지방을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
"약제학적으로 허용가능한 유도체"는 수혜자에게 투여 시 본 발명의 제공된 핵산 또는 이의 억제 활성 대사산물 또는 잔기를 직접 또는 간접적으로 제공할 수 있는 본 발명의 제공된 핵산의 임의의 무독성 염, 에스테르, 에스테르 염 또는 기타 유도체를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이의 억제 활성 대사산물 또는 잔기"는 이의 대사산물 또는 잔기가 생물학적 샘플 또는 환자에서 표적 유전자의 발현을 조절하는 데에도 유용함을 의미한다.
본 발명의 조성물은 경구로, 비경구로, 흡입 스프레이에 의해, 국소적으로, 직장으로, 비강으로, 협측으로, 질로, 또는 이식된 저장소를 통해 투여될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "비경구"는 피하, 정맥내, 근육내, 관절내, 활막내, 흉골내, 척추강내, 간내, 병변내 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 바람직하게는, 조성물은 예를 들어 피하, 근육내, 정맥내 또는 경막외 주사에 의한 비경구 투여를 위한 액체 형태로 제형화된다. 비경구 투여에 적합한 투여 형태는 전형적으로 예를 들어 멸균 수용액, 식염수, 저분자량 알코올, 예컨대 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 젤라틴, 지방산 에스테르, 예컨대 에틸 올레이트 등을 포함하는, 비경구 투여에 적합한 하나 이상의 비히클을 포함한다. 비경구 제형은 당, 알코올, 항산화제, 완충제, 정균제, 제형을 의도된 수혜자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질 또는 현탁제 또는 증점제를 함유할 수 있다. 예를 들어, 계면활성제를 사용하여 적절한 유동성이 유지될 수 있다. 액체 제형은 동결건조되어, 멸균 주사 용액으로 재구성할 때 나중에 사용하기 위해 보관될 수 있다.
본 발명의 조성물의 멸균 주사 가능한 형태는 수성 또는 유지성 현탁액일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성 비경구적으로 허용가능한 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사용 용액 또는 현탁액, 예를 들어 1,3-부탄디올 중의 용액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매 중에는 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 고정 오일은 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로 사용된다.
이 목적을 위해, 합성 모노- 또는 디-글리세리드를 포함한 임의의 블랜드(bland) 고정 오일이 사용될 수 있다. 올레산 및 그의 글리세리드 유도체와 같은 지방산은 특히 폴리옥시에틸화된 버전의 올리브 오일 또는 피마자 오일과 같은 천연 약제학적으로 허용가능한 오일과 마찬가지로 주사제 제조에 유용하다. 이러한 오일 용액 또는 현탁액은 또한 에멀젼 및 현탁액을 포함하는 약제학적으로 허용가능한 투여 형태의 제형화에 통상적으로 사용되는 카르복시메틸 셀룰로오스 또는 유사한 분산제와 같은 장쇄 알코올 희석제 또는 분산제를 함유할 수 있다. Tweens, Spans 및 기타 유화제와 같은 일반적으로 사용되는 다른 계면활성제 또는 약제학적으로 허용가능한 고체, 액체 또는 기타 투여 형태의 제조에 일반적으로 사용되는 생체이용률 향상제도 제형화 목적으로 사용할 수 있다.
본 발명의 약제학적으로 허용가능한 조성물은 캡슐, 정제, 수성 현탁액 또는 용액을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 경구로 허용가능한 투여 형태로 경구 투여될 수 있다. 경구용 정제의 경우, 일반적으로 사용되는 담체에는 락토스 및 옥수수 전분이 포함된다. 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제가 또한 전형적으로 첨가된다. 캡슐 형태의 경구 투여를 위해, 유용한 희석제는 락토스 및 건조 옥수수 전분을 포함한다. 경구 사용을 위해 수성 현탁액이 필요할 때, 활성 성분은 유화제 및 현탁제와 조합된다. 원하는 경우, 특정 감미료, 향미료 또는 착색제가 첨가될 수도 있다. 경구 투여용으로 제형화된 본 발명의 조성물은 음식과 함께 또는 음식 없이 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 약제학적으로 허용가능한 조성물은 음식 없이 투여된다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 약제학적으로 허용가능한 조성물은 음식과 함께 투여된다.
대안적으로, 본 발명의 약제학적으로 허용가능한 조성물은 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다. 이들은 실온에서는 고체이지만 직장 온도에서는 액체이므로 직장에서 녹아 약물을 방출하는 적합한 비자극성 부형제와 제제를 혼합하여 제조될 수 있다. 이러한 재료에는 코코아 버터, 밀랍 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다.
본 발명의 약제학적으로 허용가능한 조성물은 특히 치료 표적이 눈, 피부 또는 하부 장관의 질환을 비롯한 국소 적용에 의해 쉽게 접근할 수 있는 영역 또는 기관을 포함할 때 국소 투여될 수도 있다. 적합한 국소 제형은 이러한 부위 또는 기관 각각에 대해 쉽게 준비된다.
하부 장관에 대한 국소 적용은 직장 좌제 제형(상기 참조) 또는 적합한 관장 제형에서 영향을 받을 수 있다. 국소 경피 패치도 사용될 수 있다.
국소 적용의 경우, 제공된 약제학적으로 허용가능한 조성물은 하나 이상의 담체에 현탁되거나 용해된 활성 성분을 함유하는 적합한 연고로 제형화될 수 있다. 본 발명의 핵산 또는 이의 유사체의 국소 투여를 위한 담체는 광유, 액체 바셀린, 화이트 바셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화 왁스 및 물을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 대안적으로, 제공된 약제학적으로 허용가능한 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체에 현탁되거나 용해된 활성 성분을 함유하는 적합한 로션 또는 크림으로 제형화될 수 있다. 적합한 담체는 광유, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알코올, 2-옥틸도데칸올, 벤질 알코올 및 물을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
안과용으로 제공된 약제학적으로 허용가능한 조성물은 등장성 pH 조정 멸균 식염수 중 미분된 현탁액으로서, 또는 바람직하게는 등장성 pH 조정 멸균 식염수 중 용액으로서 벤질알코늄 클로라이드와 같은 보존제가 있거나 없이 제형화될 수 있다. 대안적으로, 안과용으로, 약제학적으로 허용가능한 조성물은 바셀린과 같은 연고로 제형화될 수 있다.
본 발명의 약제학적으로 허용가능한 조성물은 또한 비강 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 약제학적 제형 분야에서 잘 알려진 기술에 따라 제조되고 벤질 알코올 또는 기타 적합한 보존제, 생체이용률을 향상시키기 위한 흡수 촉진제, 플루오로카본, 및/또는 기타 통상적인 가용화제 또는 분산제를 사용하여 식염수 용액으로서 제조될 수 있다.
특정 실시형태에서, 제공된 핵산(예를 들어, 핵산 억제제 분자)은 예를 들어, 미국 특허 제6,815,432호, 제6,586,410호, 제6,858,225호, 제7,811,602호, 제7,244,448호 및 제8,158,601호에 개시된 것과 같은 리포솜 및 지질; 미국 특허 제6,835,393호, 제7,374,778호, 제7,737,108호, 제7,718,193호, 제8,137,695호 및 미국 특허 출원 번호 제2011/0143434호, 제2011/0129921호, 제2011/0123636호, 제2011/0143435호, 제2011/0142951호, 제2012/0021514호, 제2011/0281934호, 제2011/0286957호 및 제2008/0152661호에 개시된 것과 같은 중합체 물질; 섭취, 분포 또는 흡수를 보조하기 위한 캡시드, 캡소이드, 또는 수용체 표적 분자를 포함하는 다른 분자, 분자 구조 또는 화합물의 혼합물과 혼합되거나, 캡슐화되거나, 접합되거나 다른 방식으로 회합될 수 있으며, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
특정 실시형태에서, 제공된 핵산(예를 들어, 핵산 억제제 분자)은 지질 나노입자(LNP)에 제형화된다. 지질-핵산 나노 입자는 전형적으로 지질을 핵산과 혼합하여 복합체를 형성할 때 자발적으로 형성한다. 원하는 입자 크기 분포에 따라, 생성된 나노입자 혼합물이 예를 들어, LIPEX® 압출기(Northern Lipids, Inc)와 같은 써모배럴(thermobarrel) 압출기를 사용하여 폴리카르보네이트 막(예를 들어, 100 nm 컷-오프)을 통해 선택적으로 압출될 수 있다. 치료적 사용을 위한 지질 나노입자를 제조하기 위해, 예를 들어, 투석 또는 접선(tangential) 흐름 여과에 의해 달성될 수 있는 나노입자 및/또는 교환 완충액을 형성하는 데 사용되는 용매(예를 들어, 에탄올)를 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 핵산 억제제 분자를 함유하는 지질 나노입자를 제조하는 방법은 예를 들어 미국 공개 특허 출원 번호 2015/0374842 및 2014/0107178에 공개된 바와 같이 당 분야에 공지되어 있으며, 각각의 전체는 본원에 참조로 포함된다.
특정 실시형태에서, LNP는 양이온성 리포솜 및 페길화된 지질을 포함하는 지질 코어를 포함한다. LNP는 양이온성 지질, 구조적 또는 중성 지질, 스테롤, 페길화된 지질, 또는 이들의 혼합물과 같은 하나 이상의 외피 지질을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 제공된 핵산은 관심 조직으로의 핵산 전달을 지시하는 리간드에 공유적으로 접합된다. 많은 그러한 리간드가 탐구되었다. 예를 들어, Winkler, THER. DELIV., 2013, 4(7): 791-809를 참조한다. 예를 들어, 제공된 핵산은 핵산의 간으로의 흡수를 지시하기 위해 다중 당 리간드 모이어티(예를 들어, N-아세틸갈락토사민(GalNAc))에 접합될 수 있다. 예를 들어 WO 2016/100401을 참조한다. 사용될 수 있는 다른 리간드는 만노스-6-포스페이트, 콜레스테롤, 폴레이트, 트랜스페린 및 갈락토스를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다(다른 특정 예시적인 리간드에 대해서는 예를 들어 WO 2012/089352 참조). 전형적으로, 제공된 핵산이 리간드에 접합될 때, 핵산은 네이키드 핵산으로서 투여되고, 여기서 올리고뉴클레오타이드는 또한 LNP 또는 다른 보호 코팅으로 제형화되지 않는다. 특정 실시형태에서, 네이키드 핵산 내의 각각의 뉴클레오타이드는 당 모이어티의 2'-위치에서, 전형적으로 2'-F 또는 2'-OMe로 변형된다.
이들 약제학적 조성물은 종래의 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있거나 멸균 여과될 수 있다. 생성된 수용액은 그대로 사용하기 위해 포장되거나 동결건조될 수 있으며, 상기 동결건조 제제는 투여 전에 멸균 수성 부형제와 조합된다. 제제의 pH는 전형적으로 3 내지 11, 보다 바람직하게는 5 내지 9 또는 6 내지 8, 가장 바람직하게는 7 내지 8, 예컨대 7 내지 7.5일 것이다. 고체 형태의 약제학적 조성물은 다수의 단일 용량 단위로 포장될 수 있으며, 각각은 정제 또는 캡슐의 밀봉된 패키지와 같이 고정된 양의 상기 언급된 작용제 또는 작용제들을 함유한다. 고체 형태의 약제학적 조성물은 또한 국소 적용 가능한 크림 또는 연고용으로 설계된 짜낼 수 있는 튜브와 같이, 유연한 양을 위한 용기에 포장될 수 있다.
단일 투여 형태의 조성물을 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 본 발명의 핵산 또는 이의 유사체의 양은 치료되는 숙주, 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 바람직하게는, 제공된 조성물은 핵산 또는 이의 유사체의 0.01-100 mg/kg 체중/일의 투여량이 이러한 조성물을 받는 환자에게 투여될 수 있도록 제형화되어야 한다.
임의의 특정 환자에 대한 특정 투여량 및 치료 요법은 사용된 특정 핵산 또는 이의 유사체의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 식이 요법, 투여 시간, 배설 속도, 약물 조합 및 치료 의사의 판단 및 치료되는 특정 질환의 중증도를 비롯한 다양한 요인에 따라 달라질 수 있음을 이해해야 한다. 조성물 중 본 발명의 핵산 또는 이의 유사체의 양은 또한 조성물 중 특정 핵산 또는 이의 유사체에 의존할 것이다.
핵산 및 이의 유사체 및 약제학적으로 허용가능한 조성물의 용도
본원에 기재된 핵산 및 이의 유사체 및 조성물은 일반적으로 세포내 RNA 수준의 조절에 유용하다. 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 제공된 핵산 또는 이의 유사체는 세포에서 표적 유전자의 발현을 조절하는 방법에 사용될 수 있다. 전형적으로, 이러한 방법은 제공된 핵산 억제제 분자를 표적 유전자의 발현을 조절하기에 충분한 양으로 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 방법은 생체내에서 수행된다. 방법은 또한 시험관내 또는 생체외에서 수행될 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포는 인간 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 포유동물 세포이다.
특정 실시형태에서, 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결 또는 이의 유사체(예를 들어, 핵산 억제제 분자)를 포함하는 제공된 핵산은 이를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 전형적으로, 이러한 방법은 본원에 기재된 바와 같은 제공된 핵산 억제제 분자를 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료", "치료하다" 및 "치료하는"은 본원에 기재된 바와 같은 질환 또는 장애, 또는 그의 하나 이상의 증상을 역전, 완화, 발병 지연 또는 진행 억제를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 치료는 하나 이상의 증상이 발생한 후에 투여될 수 있다. 다른 실시형태에서, 치료는 증상의 부재하에 투여될 수 있다. 예를 들어, 치료는 (예를 들어, 증상의 이력에 비추어, 및/또는 유전적 또는 기타 민감성 인자에 비추어) 증상의 발병 이전에 민감한 개체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 증상의 재발을 예방하거나 지연시키기 위해 증상이 해결된 후에도 치료를 계속할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 개시된 약제학적 조성물은 이를 필요로 하는 환자에서 바이러스 감염과 관련된 증상의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다. 한 실시형태는 본원에 기재된 바와 같이, 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 제공된 핵산 또는 이의 유사체(예를 들어, 핵산 억제제 분자)의 치료적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 바이러스 감염을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이러한 바이러스 감염의 비제한적인 예는 HCV, HBV, HPV, HSV 또는 HIV 감염을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본원에 개시된 약제학적 조성물은 이를 필요로 하는 환자에서 암과 관련된 증상의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다. 한 실시형태는 본원에 기재된 바와 같은 치료적 유효량의 제공된 핵산 억제제 분자를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이러한 암의 비제한적인 예는 담도암, 방광암, 이행 세포 암종, 요로상피암, 뇌암, 신경교종, 성상세포종, 유방암, 화생성 암종, 자궁경부암, 자궁경부 편평세포암, 직장암, 결장직장암, 결장암, 유전성 비용종증 결장직장암, 결장직장 선암종, 위장관 기질종양(GIST), 자궁내막암, 자궁내막 기질육종, 식도암, 식도 편평세포암종, 식도 선암종, 신안 흑색종, 포도막 흑색종, 담낭 암종, 담낭 선암종, 신세포 암종, 투명 세포 신세포 암종, 이행 세포 암종, 요로상피 암종, 윌름스(Wilms) 종양, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성(CLL), 만성 골수성(CML), 만성 골수단핵구(CMML), 간암, 간암종, 간세포암, 간세포암종, 담관암종, 간모세포종, 폐암, 비소세포폐암(NSCLC), 중피종, B-세포 림프종, 비호지킨 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 외투세포 림프종, T-세포 림프종, 비호지킨 림프종, 전구 T-림프모구 림프종/백혈병, 말초 T-세포 림프종, 다발성 골수종, 비인두 암종(NPC), 신경모세포종, 구인두암, 구강 편평 세포 암종, 골육종, 난소 암종, 췌장암, 췌관 선암종, 가유두상 종양, 세엽세포 암종, 전립선암, 전립선 선암종, 피부암, 흑색종, 악성 흑색종, 피부 흑색종, 소장 암종, 위암, 위 암종, 위장관 기질 종양(GIST), 자궁암 또는 자궁 육종을 포함한다. 전형적으로, 본 개시내용은 치료적 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 투여함으로써 간암, 간 암종, 간세포암, 간세포 암종, 담관암종 및 간모세포종을 치료하는 방법을 특징으로 한다.
특정 실시형태에서, 본원에 개시된 약제학적 조성물은 증식성, 염증성, 자가면역, 신경계, 안구, 호흡기, 대사, 피부병, 청각, 간, 신장 또는 감염성 질환과 관련된 증상의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다. 한 실시형태는 치료적 유효량의 본원에 기재된 제공된 핵산 억제제 분자를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 증식성, 염증성, 자가면역, 신경계, 안구, 호흡기, 대사, 피부병, 청각, 간, 신장 또는 감염성 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 전형적으로, 질환 또는 병태는 간 질환이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 표적 유전자의 발현을 감소시키기에 충분한 양으로 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 표적 유전자의 발현을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 약제학적 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 제공된 핵산 억제제 분자 또는 이의 유사체 및 또한 본원에 기재된 바와 같은 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제공된 핵산 억제제 분자는 dsRNAi 억제제 분자 또는 ssRNAi 억제제 분자를 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 RNAi 억제제 분자이다.
표적 유전자는 인간 표적 유전자와 같은 임의의 포유동물로부터의 표적 유전자일 수 있다. 임의의 유전자는 본 발명의 방법에 따라 침묵될 수 있다. 예시적인 표적 유전자는 인자 VII, Eg5, PCSK9, TPX2, apoB, SAA, TTR, HBV, HCV, RSV, PDGF 베타 유전자, Erb-B 유전자, Src 유전자, CRK 유전자, GRB2 유전자, RAS 유전자, MEKK 유전자, JNK 유전자, RAF 유전자, Erk1/2 유전자, PCNA(p21) 유전자, MYB 유전자, JUN 유전자, FOS 유전자, BCL-2 유전자, 사이클린(Cyclin) D 유전자, VEGF 유전자, EGFR 유전자, 사이클린 A 유전자, 사이클린 E 유전자, WNT-1 유전자, 베타-카테닌 유전자, c-MET 유전자, PKC 유전자, NFKB 유전자, STAT3 유전자, 서바이빈(survivin) 유전자, Her2/Neu 유전자, 토포이소머라제 I 유전자, 토포이소머라제 II 알파 유전자, p73 유전자, p21(WAF1/CIP1) 유전자, p27(KIP1) 유전자, PPM1D 유전자, RAS 유전자, 카베올린(caveolin) I 유전자, MIB I 유전자, MTAI 유전자, M68 유전자, 종양 억제제 유전자 돌연변이, p53 종양 억제제 유전자, LDHA, 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 제공된 핵산 억제제 분자 또는 이의 유사체는 표적 유전자를 침묵시키고, 따라서 표적 유전자의 원치 않는 발현을 특징으로 하는 장애를 갖거나 이에 걸릴 위험이 있는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 제공된 핵산 억제제 분자는 베타-카테닌 유전자를 침묵시키고, 따라서 원치 않는 베타-카테닌 발현을 특징으로 하는 장애, 예를 들어, 선암종 또는 간세포 암종을 갖거나 걸릴 위험이 있는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다.
전형적으로, 본 발명의 제공된 핵산(예를 들어, 핵산 억제제 분자)은 정맥내 또는 피하로 투여된다. 그러나, 본원에 개시된 약제학적 조성물은 또한 예를 들어 경구, 협측, 설하, 직장, 질, 요도내, 국소, 안내, 비강 및/또는 귀내를 포함하는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 투여될 수 있으며, 투여는 정제, 캡슐, 과립, 수성 현탁액, 겔, 스프레이, 좌약, 고약, 연고 등을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 간과 같은, 대상체 또는 유기체의 관련 조직 또는 세포에 전신 투여를 통해 (예컨대, 정맥내 또는 피하 투여를 통해) 전달된다. 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 국소 투여 또는 전신 투여를 통해 전달된다. 특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 폐 전달과 같은 폐 세포 및 조직과 같은 관련 조직 또는 세포로의 국소 투여를 통해 전달된다.
본원에 개시된 핵산 또는 이의 유사체의 치료적 유효량은 투여 경로 및 환자의 신체적 특성, 예컨대 대상체의 체격 및 체중, 질환 진행 또는 침투 정도, 연령, 건강 및 성별에 따라 달라질 수 있다.
특정 실시형태에서, 제공된 핵산은 본원에 기재된 바와 같이 1일 당 수혜자의 체중 킬로그램당 20마이크로그램 내지 10밀리그램, 1일 당 수혜자의 체중 킬로그램당 100마이크로그램 내지 5밀리그램, 또는 1일 당 수혜자의 체중 킬로그램당 0.5 내지 2.0밀리그램의 투여량으로 투여된다.
본 개시내용의 약제학적 조성물은 매일 또는 간헐적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 핵산 또는 이의 유사체의 간헐적 투여는 매주 1 내지 6일, 매월 1 내지 6일, 매주 1회, 격주로 1회, 매월 1회, 격월로 1회, 또는 1년에 1회 또는 2회, 또는 1년, 월간, 주간 또는 1일 용량으로 여러 번에 나누어 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 간헐적 투여는 주기로 투여하는 것을 의미할 수 있거나(예를 들어, 1일, 1주 또는 연속 2 내지 8주 동안 매일 투여한 후, 최대 1주, 최대 1개월, 최대 2개월, 최대 3개월 또는 최대 6개월 이상 동안 투여 없이 휴식 기간) 또는 격일, 격주, 격월 또는 격년으로 투여하는 것을 의미할 수 있다.
본 발명의 임의의 치료 방법에서, 핵산 또는 이의 유사체는 단독요법으로서 단독으로 또는 당업계에 공지된 추가 요법과 조합하여 대상체에게 투여될 수 있다.
예시
약어
Ac: 아세틸
AcOH: 아세트산
ACN: 아세토니트릴
Ad: 아다만틸
AIBN: 2,2'-아조 비스이소부티로니트릴
Anhyd: 무수
Aq: 수성
B2Pin2: 비스(피나콜라토)디보론-4,4,4',4',5,5,5',5'-옥타메틸-2,2'-비(1,3,2-디옥사보롤란)
BINAP: 2,2'-비스(디페닐포스피노)-1,1'-비나프틸
BH3: 보란
Bn: 벤질
Boc: tert-부톡시카르보닐
Boc2O: 디-tert-부틸 디카르보네이트
BPO: 벤조일 퍼옥사이드
nBuOH: n-부탄올
CDI: 카르보닐디이미다졸
COD: 사이클로옥타디엔
d: 일
DABCO: 1,4-디아조비사이클로[2.2.2]옥탄
DAST: 디에틸아미노황 트리플루오라이드
dba: 디벤질리덴아세톤
DBU: 1,8-디아조비사이클로[5.4.0]운덱-7-켄
DCE: 1,2-디클로로에탄
DCM: 디클로로메탄
DEA: 디에틸아민
DHP: 디하이드로피란
DIBAL-H: 디이소부틸알루미늄 하이드라이드
DIPA: 디이소프로필아민
DIPEA 또는 DIEA: N,N-디이소프로필에틸아민
DMA: N,N-디메틸아세트아미드
DME: 1,2-디메톡시에탄
DMAP: 4-디메틸아미노피리딘
DMF: N,N-디메틸포름아미드
DMP: 데스-마틴(Dess-Martin) 페리오디난
DMSO-디메틸 설폭사이드
DMTr: 4,4'-디메톡시트리틸
DPPA: 디페닐포스포릴 아지드
dppf: 1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센
EDC 또는 EDCI: 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드
ee: 거울상 이성질체 과량
ESI: 전자분무 이온화
EA: 에틸 아세테이트
EtOAc: 에틸 아세테이트
EtOH: 에탄올
FA: 포름산
h 또는 hrs: 시간
HATU: N,N,N',N'-테트라메틸-O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)우로늄 헥사플루오로포스페이트
HCl: 염산
HPLC: 고성능 액체 크로마토그래피
HOAc: 아세트산
IBX: 2-요오독시벤조산
IPA: 이소프로필 알코올
KHMDS: 헥사메틸디실라지드 칼륨
K2CO3: 탄산칼륨
LAH: 리튬 알루미늄 하이드라이드
LDA: 리튬 디이소프로필아미드
L-DBTA: 디벤조일-L-타르타르산
m-CPBA: 메타-클로로퍼벤조산
M: 몰
MeCN: 아세토니트릴
MeOH: 메탄올
Me2S: 디메틸 설파이드
MeONa: 나트륨 메틸레이트
MeI: 요오도메탄
min: 분
mL: 밀리리터
mM: 밀리몰
mmol: 밀리몰
MPa: 메가 파스칼
MOMCl: 메틸 클로로메틸 에테르
MsCl: 메탄설포닐 클로라이드
MTBE: 메틸 tert-부틸 에테르
nBuLi: n-부틸리튬
NaNO2: 아실산나트륨
NaOH: 수산화나트륨
Na2SO4: 황산나트륨
NBS: N-브로모숙신이미드
NCS: N-클로로숙신이미드
NFSI: N-플루오로벤젠설폰이미드
NMO: N-메틸모르폴린 N-옥사이드
NMP: N-메틸피롤리딘
NMR: 핵 자기 공명
℃: 섭씨 도
Pd/C: 탄소상의 팔라듐
Pd(OAc)2: 팔라듐 아세테이트
PBS: 인산염 완충 식염수
PE: 석유 에테르
POCl3: 옥시염화 인
PPh3: 트리페닐포스핀
PyBOP: (벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트
Rel: 상대
R.T. 또는 rt: 실온
sat: 포화
SEMCI: 클로로메틸-2-트리메틸실릴에틸 에테르
SFC: 초임계 유체 크로마토그래피
SOCl2: 이염화황
tBuOK: 칼륨 tert-부톡사이드
TBAB: 테트라부틸암모늄 브로마이드
TBAF: 테트라부틸암모늄 플루오라이드
TBAI: 테트라부틸암모늄 요오다이드
TEA: 트리에틸아민
Tf: 트리플루오로메탄설포네이트
TfAA, TFMSA 또는 Tf2O: 트리플루오로메탄설폰산 무수물
TFA: 트리플루오로아세트산
TIBSCl: 2,4,6-트리이소프로필벤젠설포닐 클로라이드
TIPS: 트리이소프로필실릴
THF: 테트라하이드로푸란
THP: 테트라하이드로피란
TLC: 박층 크로마토그래피
TMEDA: 테트라메틸에틸렌디아민
pTSA: 파라-톨루엔설폰산
UPLC: 초고성능 액체 크로마토그래피
wt: 중량
Xantphos: 4,5-비스(디페닐포스피노)-9,9-디메틸크산텐
일반적인 합성 방법
하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 이에 대한 제한으로 해석되어서는 안 된다. 온도는 섭씨로 표시된다. 달리 언급되지 않는 한, 모든 증발은 감압, 바람직하게는 약 15 mmHg 내지 100 mmHg(= 20-133 mbar)에서 수행된다. 최종 생성물, 중간체 및 출발 물질의 구조는 표준 분석 방법, 예를 들어, 미세분석 및 분광 특성, 예를 들어 MS, IR, NMR에 의해 확인된다. 사용된 약어는 당업계에 통상적인 것이다.
본 발명의 핵산 또는 이의 유사체를 합성하는 데 사용되는 모든 출발 물질, 빌딩 블록, 시약, 산, 염기, 탈수제, 용매 및 촉매는 상업적으로 입수가능하거나, 당업자에게 공지된 유기 합성 방법에 의해 생성될 수 있다(Houben-Weyl 4th Ed. 1952, Methods of Organic Synthesis, Thieme, Volume 21). 또한, 본 발명의 핵산 또는 이의 유사체는 하기 실시예에 나타낸 바와 같이 당업자에게 공지된 유기 합성 방법에 의해 생성될 수 있다.
달리 명시되지 않는한, 모든 반응은 질소 또는 아르곤 하에서 수행된다.
양성자 NMR(1H NMR)은 중수소화 용매에서 수행된다. 본원에 개시된 특정 핵산 또는 이의 유사체에서, 하나 이상의 1H 이동은 잔류 단백질 용매 신호와 중첩되고; 이러한 신호는 이후 제공된 실험에서 보고되지 않았다.
하기 실시예에 도시된 바와 같이, 특정 예시적인 실시형태에서, 핵산 또는 이의 유사체는 하기 일반 절차에 따라 제조하였다. 일반적인 방법이 본 발명의 특정 핵산 또는 이의 유사체의 합성을 설명하지만, 하기의 일반적인 방법 및 당업자에게 공지된 다른 방법이 본 명세서에 기재된 바와 같은 모든 핵산 또는 이들의 유사체 및 이들 핵산 또는 이들의 유사체 각각의 하위부류 및 종에 적용될 수 있음을 이해할 것이다.
실시예 1. (2R,3S,4R,5R)-2-(((((2R,3S,5R)-2-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-5-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)테트라하이드로푸란-3-일)옥시)(메톡시)포스포릴)메톡시)-5-(2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)-4-메톡시테트라하이드로푸란-3-일 (2-시아노에틸) 디이소프로필포스포라미다이트(I-3)
Figure pct00136
단계 1: 디메틸 ((((2R,3S,4R,5R)-3-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-5-(2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)-4-메톡시테트라하이드로푸란-2-일)옥시)메틸)포스포네이트.( 1.2 )
1.10 g의 1.1을 10 mL 무수 DMF에 용해시켰다. 이어서 1.22 g의 이미다졸을 용액에 첨가하였다. 1.36 g의 TBSCl을 첨가한 후, 반응 혼합물을 실온에서 10시간 동안 계속 교반하였다. UPLC에 의해 확인된 바와 같이 반응 완료 후, DMF를 감압하에 제거하였다. 황색을 띤 잔류물을 200 mL EA에 재용해하고, 75 mL 물로 2회, 염수로 1회 세척하였다. 생성된 용액을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 휘발성 물질을 회전 증발에 의해 제거하였다. 그런 다음, 미정제 생성물을 플래시 컬럼(DCM 중 0-10% MeOH)으로 정제하여 1.2(1.21 g, 83% 수율)를 백색 폼(foam)으로서 수득하였다. 1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ (ppm): 8.42 (s, 1H), 7.59 (d, J=8Hz, 1H), 7.58 (d, J=4Hz, 1H), 6.33 (dd, J1=8Hz, J2=1.6Hz, 1H), 4.89 (s, 1H), 4.25 (d, J=4Hz, 1H), 4.03 (m, 1H), 3.76-3.91 (m, 2H), 3.85 (d, J=4Hz, 3H), 3.82 (d, J=4Hz, 3H), 3.37 (s, 3H), 0.91 (s, 9H), 0.13 (s, 3H), 0.11 (s, 3H). C18H33N2NaO9PSi-에 대해 계산된 MS (ESI) m/z 503.5150, 실측치: 503.55.
단계 2: 메틸 수소 ((((2R,3S,4R,5R)-3-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-5-(2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)-4-메톡시테트라하이드로푸란-2-일)옥시)메틸)포스포네이트.( 1.3 )
3.30 g의 1.2를 120 mL 수성 피리딘(피리딘:물 3:2)에 용해시켰다. 반응 혼합물을 50℃로 가열하고, 16시간 동안 계속 교반하였다. UPLC에 의해 확인된 바와 같이 반응 완료 후, 휘발성 물질을 감압 하에 제거하였다. 미정제 생성물 1.3(3.74g, 정량적)을 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. 1H-NMR (400MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 11.16 (br, 1H), 7.75 (d, J=1Hz, 1H), 6.09 (d, J=8Hz, 1H), 5.67 (d, J1=8Hz, 1H), 4.94 (s, 1H), 4.24 (d, J=4Hz, 1H), 3.95 (m, 1H), 3.45-3.61 (m, 2H), 3.43 (d, J=4Hz, 3H), 3.26 (s, 3H), 0.87 (s, 9H), 0.11 (s, 3H), 0.10 (s, 3H). 31P-NMR (200MHz, DMSO-d6): 19.96. C17H30N2O9PSi-에 대해 계산된 MS(ESI) m/z 465.4913, 실측치: 465.23.
단계 3: (2R,3S,5R)-2-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-5-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)테트라하이드로푸란-3-일 메틸 ((((2R,3S,4R,5R)-3-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-5-(2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)-4-메톡시테트라하이드로푸란-2-일)옥시)메틸)포스포네이트( I-1 ).
4.65 g의 1.3을 100 mL 무수 피리딘에 용해시켰다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 7.72 g의 TIBSCl(3eq)을 5분 동안 교반하면서 첨가한 다음, 실온으로 가온하고 추가 15분 동안 교반하였다. 그런 다음, 4.63 g의 1-((2R,4R,5R)-5-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-4-하이드록시테트라하이드로푸란-2-일)-5-메틸피리미딘-2,4(1H,3H)-디온을 생성된 용액에 첨가한 다음, 4.1 mL의 1-메틸이미다졸을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. UPLC로 반응 완료를 확인하고, 25 mL 포화 중탄산나트륨을 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 휘발성 물질을 감압 하에 제거하고, 생성된 황색/갈색 오일을 플래시 크로마토그래피(0.1% TEA를 포함하는 DCM 중 0-10% MeOH)로 정제하여 I-1(3.67 g, 44% 수율)을 백색 분말로서 수득하였다. C48H61N4NaO15PSi+에 대해 계산된 MS (ESI) m/z 1016.0770, 실측치: 1016.01.
단계 4: (2R,3S,5R)-2-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-5-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)테트라하이드로푸란-3-일 메틸 ((((2R,3S,4R,5R)-5-(2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)-3-하이드록시-4-메톡시테트라하이드로푸란-2-일)옥시)메틸)포스포네이트( I-2 ).
2.50 g의 I-1을 50 mL 무수 THF에 용해시켰다. 그런 다음, 용액에 7.5 mL의 TBAF(1 M)를 실온에서 교반하면서 3분에 걸쳐 적가하였다. 생성된 용액을 실온에서 30분 동안 계속 교반하였다. UPLC가 출발 물질의 85% 초과가 소모되었음을 나타낼 때 반응을 중단하였다. 휘발성 물질을 감압 하에 제거하여 황색 오일을 수득하고 이를 플래시 크로마토그래피(0.1% TEA를 포함하는 DCM 중 0-10% MeOH)로 정제하여 I-2(1.07 g, 49% 수율)를 백색 분말로서 수득하였다. 31P-NMR(200 MHz, CDCl3): 21.93, 21.91. C42H46N4O15P-에 대해 계산된 MS(ESI) m/z 877.8173, 실측치: 877.91.
단계 5: (2R,3S,4R,5R)-2-(((((2R,3S,5R)-2-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-5-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)테트라하이드로푸란-3-일)옥시)(메톡시)포스포릴)메톡시)-5-(2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)-4-메톡시테트라하이드로푸란-3-일(2-시아노에틸)디이소프로필포스포라미다이트( I-3 ).
440 mg의 화합물 I-2를 6 mL의 무수 DCM에 용해시켰다. 실온에서 10분 동안 교반한 후, 262 μL의 2-시아노에틸 N',N',N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트를 반응 혼합물에 첨가한 다음, 100 mg의 4,5-디시아노이미다졸을 첨가하였다. 생성된 투명한 용액을 실온에서 4시간 동안 계속 교반하였다. UPLC 모니터링은 출발 물질의 완전한 전환을 확인했다. 그런 다음, 반응 혼합물을 5 mL 포화 중탄산나트륨 및 5 mL 염수로 세척하였다. 무수 황산나트륨 상에서 건조시킨 후, 휘발성 물질을 감압하에 제거하였다. 그런 다음, 백색 오일 잔류물을 플래시 크로마토그래피(0.1% TEA를 포함하는 DCM 중 0-8% MeOH)로 정제하여, I-3(346 mg, 64% 수율)을 백색 분말로서 수득하였다. 31P-NMR(200MHz, CDCl3): 152.80, 152.75, 151.53, 151.38, 22.65, 22.47, 22.19, 22.16. C51H64N6NaO16P2 +에 대해 계산된 MS(ESI) m/z 1102.0357, 실측치: 1102.08.
실시예 2. (2R,3S,4R,5R)-2-(1-((((2R,3S,5R)-2-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-5-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)테트라하이드로푸란-3-일)옥시)(메톡시)포스포릴)에톡시)-5-(2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)-4-메톡시테트라하이드로푸란-3-일(2-시아노에틸)디이소프로필포스포라미다이트(I-6)의 합성
Figure pct00137
단계 1: (2R,3S,4R,5R)-5-(3-((벤질옥시)메틸)-2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)-2-((디메톡시포스포릴)메톡시)-4-메톡시테트라하이드로푸란-3-일 벤조에이트( 2.2 ).
3.06 g의 2.1을 20 mL 무수 DCM에 용해시켰다. 그런 다음, 용액을 0℃로 냉각시키고, 3.77 mL BF3·Et2O에 이어 3 mL의 디메틸(1-하이드록시에틸)포스포네이트를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반한 후 추가 1.9 mL BF3·Et2O 및 1.5 mL 디메틸(1-하이드록시에틸)포스포네이트를 반응에 첨가하였다. 생성된 용액을 추가로 84시간 동안 계속 교반하였다. UPLC에 의해 확인된 바와 같이 반응 완료 후, 반응을 15 mL 물로 켄칭하고 40 mL DCM으로 희석하였다. 층을 분리하고, 유기층을 포화 중탄산나트륨 30 mL 및 염수 30 mL로 세척하였다. 무수 황산나트륨 상에서 건조시킨 후, 혼합물을 농축하고 플래시 크로마토그래피(헥산 중 30-100% EA, 이어서 DCM 중 0-5% MeOH)로 정제하여 2.2(2.04 g, 56% 수율)를 백색 분말로서 수득하였다. C28H32N2NaO11P+에 대해 계산된 MS(ESI) m/z 627.5380, 실측치: 627.21.
단계 2: (2R,3S,4R,5R)-2-(1-(디메톡시포스포릴)에톡시)-5-(2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)-4-메톡시테트라하이드로푸란-3-일 벤조에이트(2.3).
1.80 g의 2.2를 0.9 mL 무수 톨루엔에 용해시키고, 7.2 mL의 TFA를 용액에 첨가하였다. 그런 다음, 반응 혼합물을 45℃로 가열하고 3시간 동안 교반하였다. UPLC에 의해 확인된 바와 같이 반응 완료 후, 혼합물을 70 mL 톨루엔으로 희석하고 휘발성 물질을 감압 하에 제거하였다. 그런 다음, 보라색/갈색 잔류물을 100 mL EA에 용해하고 50 mL 중탄산나트륨 및 50 mL 염수로 세척하였다. 무수 황산나트륨 상에서 건조시킨 후, 휘발성 물질을 감압하에 제거하였다. 그런 다음, 생성된 갈색 오일을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 2.3(1.11 g, 77% 수율)을 백색 분말로서 수득하였다. C20H25N2NaO10P+에 대해 계산된 MS(ESI) m/z 507.3870, 실측치: 507.43
단계 3: (2R,3S,4R,5R)-5-(2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)-2-(1-(하이드록시(메톡시)포스포릴))에톡시)-4-메톡시테트라하이드로푸란-3-일 벤조에이트(2.4).
1.11 g의 화합물 2.3을 40 mL의 3:2 피리딘 및 물 혼합물에 용해시켰다. 반응 혼합물을 50℃로 가열하고 16시간 동안 교반하였다. UPLC에 의해 확인된 바와 같이 반응 완료 후, 휘발성 물질을 감압 하에 제거하고, 미정제 2.4(1.26 g, 정량적)를 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
단계 4: (2R,3S,4R,5R)-2-(1-((((2R,3S,5R)-2-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-5-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)테트라하이드로푸란-3-일)옥시)(메톡시)포스포릴)에톡시)-5-(2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)-4-메톡시테트라하이드로푸란-3-일 벤조에이트(I-4).
1.04 g의 2.4를 24 mL 무수 피리딘에 용해시키고, 0℃로 냉각시켰다. 1.81 g의 TIBSCl을 첨가하고, 혼합물을 실온으로 가온하고, 실온에서 10분 동안 교반하였다. 2.16 g의 1-((2R,4R,5R)-5-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-4-하이드록시테트라하이드로푸란-2-일)-5-메틸피리미딘-2,4(1H,3H)-디온을 생성된 용액에 첨가한 다음, 1.0 mL 1-메틸이미다졸을 첨가하였다. 그런 다음, 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. UPLC에 의해 확인된 바와 같이 반응 완료 후, 포화 중탄산나트륨 10 mL를 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 휘발성 물질을 감압 하에 제거하고 생성된 황색 오일을 플래시 크로마토그래피(0.1% TEA를 포함하는 DCM 중 0-10% MeOH)로 정제하여 I-4(0.89 g, 47% 수율)를 백색 분말로서 수득하였다. C50H53N4NaO16P+에 대해 계산된 MS(ESI) m/z 1019.9490, 실측치: 1019.78.
단계 5: (2R,3S,5R)-2-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-5-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)테트라하이드로푸란-3-일 메틸(1-(((2R,3S,4R,5R)-5-(2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)-3-하이드록시-4-메톡시테트라하이드로푸란-2-일)옥시)에틸)포스포네이트(I-5).
탄산칼륨 1.38 g을 MeOH 20 mL에 첨가하고, 생성된 슬러리를 12시간 동안 교반하였다. I-4 0.89 g을 무수 MeOH 5 mL에 용해시키고, 사전-제조된 탄산칼륨 슬러리 5 mL를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 교반하였다. UPLC에 의해 확인된 바와 같이 반응 완료 후, 반응 혼합물을 여과하고, 여액을 2 mL 1 M 아세트산으로 켄칭하였다. 휘발성 물질을 감압하에 제거하였다. 그런 다음, 미정제 물질을 플래시 크로마토그래피(헥산 중 30-100% EA, 이어서 0.1% TEA를 포함하는 DCM 중 0-5% MeOH)로 정제하여 I-5(0.42 g, 53% 수율)를 백색 폼으로서 수득하였다. C43H49N4NaO15P+에 대해 계산된 MS(ESI) m/z 915.8410, 실측치: 915.48.
단계 6: (2R,3S,4R,5R)-2-(1-((((2R,3S,5R)-2-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-5-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)테트라하이드로푸란-3-일)옥시)(메톡시)포스포릴)에톡시)-5-(2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)-4-메톡시테트라하이드로푸란-3-일(2-시아노에틸)디이소프로필포스포라미다이트(I-6).
550 mg의 I-5를 7.5 mL 무수 DCM에 용해시켰다. 실온에서 10분 동안 교반한 후, 320 μL 2-시아노에틸 N',N',N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트를 반응 혼합물에 첨가한 다음 90 mg 4,5-디시아노이미다졸을 첨가하였다. 생성된 투명한 용액을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. UPLC에 의해 확인된 바와 같이 반응 완료 후, 반응 혼합물을 5 mL 포화 중탄산나트륨 및 5 mL 염수로 세척하였다. 무수 황산나트륨 상에서 건조시킨 후, 휘발성 물질을 감압 하에 제거하였다. 그런 다음, 백색 오일 잔류물을 플래시 크로마토그래피(0.1% TEA를 포함하는 DCM 중 0-10% MeOH)로 정제하여 I-6(451 mg, 67% 수율)을 백색 분말로서 수득하였다. 31P-NMR (200MHz, CDCl3): 152.48, 152.46, 151.32, 151.29, 24.74, 24.50, 24.13, 23.96. C52H66N6NaO16P2 +에 대해 계산된 MS(ESI) m/z 1116.0627, 실측치: 1116.12.
실시예 3. (2R,3R,4S,5R)-2-(((((2R,4S,5R)-5-(6-벤즈아미도-9H-퓨린-9-일)-2-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-4-메톡시테트라하이드로푸란-3-일)옥시)(메톡시)포스포릴)메톡시)-5-(2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)-4-메톡시테트라하이드로푸란-3-일(2-시아노에틸)디이소프로필포스포라미다이트(I-9)의 합성
Figure pct00138
단계 3: (2R,3S,5R)-2-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-5-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)테트라하이드로푸란-3-일 메틸((((2R,3S,4R,5R)-3-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-5-(2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)-4-메톡시테트라하이드로푸란-2-일)옥시)메틸)포스포네이트( I-7 ).
2.60 g의 1.3을 55 mL 무수 피리딘에 용해시키고 0℃로 냉각시켰다. TIBSCl(3eq)을 첨가하고, 교반을 0℃에서 15분 동안 유지하였다. 실온으로 가온한 후, 2.48 g N-(9-((2R,3S,4S,5R)-5-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-4-하이드록시-3-메톡시테트라하이드로푸란-2-일)-9H-퓨린-6-일)벤즈아미드를 첨가한 다음, 2.3 mL의 1-메틸이미다졸을 첨가하였다. 그런 다음, 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 완료를 UPLC로 확인한 후, 포화 중탄산나트륨 10 mL를 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 휘발성 물질을 감압 하에 제거하고, 생성된 황색 오일을 플래시 크로마토그래피(0.1% TEA를 포함하는 DCM 중 0-10% MeOH)로 정제하여 I-7(2.26 g, 55% 수율)을 백색 분말로서 수득하였다. C56H67N7O15PSi+에 대해 계산된 MS(ESI) m/z 1137.2442, 실측치: 1137.45.
단계 4: (2R,3S,5R)-2-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-5-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)테트라하이드로푸란-3-일 메틸((((2R,3S,4R,5R)-5-(2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)-3-하이드록시-4-메톡시테트라하이드로푸란-2-일)옥시)메틸)포스포네이트( I-8 ).
1.30 g의 I-7을 40 mL의 무수 THF에 용해시키고 3.0 mL의 TBAF(1M)를 교반하면서 실온에서 3분에 걸쳐 적가하고, 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. UPLC에 의해 확인된 바와 같이 출발 물질의 90% 초과가 소모된 경우, 휘발성 물질을 감압 하에 제거하여 황색 오일을 수득하고 이를 플래시 크로마토그래피(0.1% TEA를 포함하는 DCM 중 0-10% MeOH)로 정제하여 I-8(0.53 g, 45% 수율)을 회백색 분말로서 수득하였다. C50H51N7O15P-에 대해 계산된 MS(ESI) m/z 1021.9663, 실측치: 1020.84.
단계 5: (2R,3S,4R,5R)-2-(((((2R,3S,5R)-2-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-5-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)테트라하이드로푸란-3-일)옥시)(메톡시)포스포릴)메톡시)-5-(2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)-4-메톡시테트라하이드로푸란-3-일(2-시아노에틸)디이소프로필포스포라미다이트( I-9 ).
416 mg의 I-8을 5 mL 무수 DCM에 용해시켰다. 실온에서 10분 동안 교반한 후, 2-시아노에틸 N',N',N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트 224 μL를 반응 혼합물에 첨가한 다음, 4,5-디시아노이미다졸 63 mg을 첨가하였다. 생성된 투명한 용액을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. UPLC에 의해 확인된 바와 같이 반응이 완료된 후, 반응 혼합물을 5 mL 포화 중탄산나트륨, 5 mL 염수로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 그런 다음, 생성된 백색 오일 잔류물을 플래시 크로마토그래피(0.1% TEA를 포함하는 DCM 중 0-10% MeOH)에 의해 정제하여 I-9(305 mg, 61% 수율)를 백색 폼으로서 수득하였다. 31P-NMR (200MHz, CDCl3): 152.89, 152.71, 151.60, 151.51, 23.19, 22.81, 22.16, 21.75. C59H70N9O16P2 +에 대해 계산된 MS(ESI) m/z 1223.2023, 실측치: 1222.91.
실시예 4. (2R,3R,5R)-2-(((((2R,3R,5R)-5-(6-벤즈아미도-9H-퓨린-9-일)-2-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)테트라하이드로푸란-3-일)옥시)(메톡시)포스포릴)메톡시)-5-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)테트라하이드로푸란-3-일(2-시아노에틸)디이소프로필포스포라미다이트(I-12)의 합성
Figure pct00139
단계 1: (2R,3S,5R)-5-(3-((벤질옥시)메틸)-5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)-2-(1-(디메톡시포스포릴)에톡시)테트라하이드로푸란-3-일 벤조에이트( 3.2 )
4.10 g의 3.1을 24 mL 무수 DCM에 용해시켰다. 그런 다음, 용액을 0℃로 냉각시키고, 5.40 mL BF3·Et2O에 이어 3.60 mL의 디메틸(하이드록시메틸)포스포네이트를 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반하고, 실온으로 점차 가온되도록 하였다. 생성된 용액을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. UPLC에 의해 확인된 바와 같이 반응 완료 후, 반응을 20 mL 물로 켄칭하고, 60 mL DCM으로 희석하였다. 층을 분리하고, 유기층을 포화 중탄산나트륨 30 mL 및 염수 30 mL로 세척하였다. 무수 황산나트륨 상에서 건조시킨 후, 혼합물을 농축시키고 플래시 크로마토그래피(헥산 중 30-100% EA, 이어서 DCM 중 0-10% MeOH)로 정제하여 3.2(2.15 g, 45% 수율)를 백색 분말로서 수득하였다. 1H-NMR (400MHz, CDC13) δ(ppm): 8.04 (dd, J1=12Hz, J2=4Hz, 2H), 7.24-7.64 (m, 9H), 6.86 (t, J=8Hz, 1H), 5.53 (s, 1H), 5.52 (s, 2H), 5.21 (s, 1H), 4.72 (s, 2H), 4.06 (dd, J1=14Hz, J2=8Hz, 1H), 3.82-3.90 (m, 7H), 2.58-2.63 (m, 1H), 2.32-2.39 (m, 1H), 2.02 (s, 3H). C27H31N2NaO10P+에 대해 계산된 MS(ESI) m/z 597.1614, 실측치: 597.1783.
단계 2: (2R,3S,5R)-2-((디메톡시포스포릴)메톡시)-5-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)테트라하이드로푸란-3-일 벤조에이트.( 3.3 )
2.12 g의 화합물 3.2를 2.0 mL 무수 톨루엔에 용해시키고, 16.0 mL의 TFA를 용액에 첨가하였다. 그런 다음, 반응 혼합물을 45℃로 가열하고 5시간 동안 교반하였다. UPLC에 의해 확인된 바와 같이 반응 완료 후, 혼합물을 70 mL 톨루엔으로 희석하고, 휘발성 물질을 감압 하에 제거하였다. 그런 다음, 보라색/갈색 잔류물을 100 mL EA에 용해시키고, 100 mL 중탄산나트륨 및 100 mL 염수로 세척하였다. 무수 황산나트륨 상에서 건조시킨 후, 휘발성 물질을 감압하에 제거하였다. 그런 다음, 생성된 갈색 오일을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 3.3(1.21 g, 75% 수율)을 백색 분말로서 수득하였다. 1H-NMR (400MHz, CDC13) δ (ppm): 8.46 (s, 1H), 7.40-8.05 (m, 6H), 6.82 (t, J=8Hz, 1H), 5.53 (s, 1H), 5.22 (s, 1H), 4.07 (dd, J1=14Hz, J2=8Hz, 1H), 3.83-3.91 (m, 7H), 2.59-2.64 (m, 1H), 2.38-2.44 (m, 1H), 1.98 (s, 3H). C19H23N2NaO9P+에 대해 계산된 MS(ESI) m/z 477.3615, 실측치: 477.4387
단계 3: (2R,3S,5R)-2-((하이드록시(메톡시)포스포릴)메톡시)-5-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)테트라하이드로푸란-3-일 벤조에이트( 3.4 )
1.2 g의 화합물 3.4를 40 mL의 3:2 피리딘 및 물 혼합물에 용해시켰다. 반응 혼합물을 50℃로 가열하고 16시간 동안 교반하였다. UPLC에 의해 확인된 바와 같이 반응 완료 후, 휘발성 물질을 감압 하에 제거하고 미정제 3.4(1.37 g, 정량적)를 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
단계 4: (2R,3R,5R)-2-(((((2R,3R,5R)-5-(6-벤즈아미도-9H-퓨린-9-일)-2-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)테트라하이드로푸란-3-일)옥시)(메톡시)포스포릴)메톡시)-5-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)테트라하이드로푸란-3-일 벤조에이트( I-10 ).
2.56 g의 3.4 및 2.98 g의 1-((2R,4R,5R)-5-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-4-하이드록시테트라하이드로푸란-2-일)-5-메틸피리미딘-2,4(1H,3H)-디온을 64 mL 무수 피리딘에 용해시키고, 0℃로 냉각시켰다. 3.44 g의 TIBSCl을 첨가하였다. 그런 다음, 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반하였다. 실온으로 가온한 후, 반응 혼합물에 1-메틸이미다졸 2.5 mL를 첨가하였다. 그런 다음, 반응 혼합물을 실온에서 3.5시간 동안 교반하였다. UPLC에 의해 확인된 바와 같이 반응 완료 후, 포화 중탄산나트륨 30 mL를 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 휘발성 물질을 감압 하에 제거하고, 생성된 황색 오일을 플래시 크로마토그래피(0.1% TEA를 포함하는 EA 중 0-10% MeOH)로 정제하여 I-10(2.42 g, 46% 수율)을 백색 분말로서 수득하였다. C56H55N7O14P+에 대해 계산된 MS(ESI) m/z 1080.3545, 실측치: 1080.3895.
단계 5: (2R,3R,5R)-5-(6-벤즈아미도-9H-퓨린-9-일)-2-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)테트라하이드로푸란-3-일 메틸((((2R,3R,5R)-3-하이드록시-5-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)테트라하이드로푸란-2-일)옥시)메틸)포스포네이트( I-11 ).
탄산칼륨 1.38 g을 MeOH 20 mL에 첨가하고, 생성된 슬러리를 12시간 동안 교반하였다. 그런 다음, 슬러리를 여과하여 탄산칼륨 용액으로서 투명한 여액을 얻었다. I-10 1.0 g을 무수 MeOH 45 mL에 용해시키고, 사전-제조된 탄산칼륨 용액 5 mL를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. UPLC로 확인된 바와 같이 반응 완료 후, 반응 혼합물을 여과하고, 여액을 1.5 mL 1M 아세트산으로 켄칭하였다. 휘발성 물질을 감압하에 제거하였다. 그런 다음, 미정제 물질을 플래시 크로마토그래피(0.1% TEA를 포함하는 헥산 중 30-100% EA, 이어서 DCM 중 0-10% MeOH)로 정제하여 I-11(0.52 g, 58% 수율)을 백색 폼으로서 수득하였다. C49H51N7O13P+에 대해 계산된 MS(ESI) m/z 976.3283, 실측치: 976.6138.
단계 6: (2R,3R,5R)-2-(((((2R,3R,5R)-5-(6-벤즈아미도-9H-퓨린-9-일)-2-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)테트라하이드로푸란-3-일)옥시)(메톡시)포스포릴)메톡시)-5-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)테트라하이드로푸란-3-일(2-시아노에틸)디이소프로필포스포라미다이트( I-12 ).
291 mg의 I-11을 4.0 mL 무수 DCM에 용해시켰다. 실온에서 10분 동안 교반한 후, 143 μL 2-시아노에틸 N',N',N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트를 반응 혼합물에 첨가한 다음, 39 mg 4,5-디시아노이미다졸을 첨가하였다. 생성된 투명한 용액을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. UPLC에 의해 확인된 바와 같이 반응 완료 후, 반응 혼합물을 5 mL 포화 중탄산나트륨 및 5 mL 염수로 세척하였다. 무수 황산나트륨 상에서 건조시킨 후, 휘발성 물질을 감압 하에 제거하였다. 그런 다음, 백색 오일 잔류물을 플래시 크로마토그래피(0.1% TEA를 포함하는 DCM 중 0-10% MeOH)로 정제하여 I-12(220 mg, 62% 수율)를 백색 분말로서 수득하였다. 31P-NMR (200MHz, DMSO-d6): 149.64, 149.51, 149.49, 149.37, 23.67, 23.65, 23.38, 23.33. C58H68N9O14P2 +에 대해 계산된 MS(ESI) m/z 1176.4361, 실측치: 1176.7185.
실시예 5. (2R,3R,5R)-2-(1-((((2R,3R,5R)-5-(6-벤즈아미도-9H-퓨린-9-일)-2-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)테트라하이드로푸란-3-일)옥시)(메톡시)포스포릴)에톡시)-5-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H))-일)테트라하이드로푸란-3-일(2-시아노에틸)디이소프로필포스포라미다이트(I-15)의 합성
Figure pct00140
단계 1: (2R,3S,5R)-5-(3-((벤질옥시)메틸)-5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)-2-(1-(디메톡시포스포릴)에톡시)테트라하이드로푸란-3-일 벤조에이트( 4.1 )
4.50 g의 3.1을 27 mL 무수 DCM에 용해시켰다. 그런 다음, 용액을 0℃로 냉각시키고, 5.90 mL BF3ㆍEt2O를 첨가하고, 4.50 mL의 디메틸(1-하이드록시에틸)포스포네이트를 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반하고, 실온으로 점차 가온되도록 하였다. 생성된 용액을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. UPLC에 의해 확인된 바와 같이 반응 완료 후, 반응을 40 mL 물로 켄칭하고 100 mL DCM으로 희석하였다. 층을 분리하고, 유기층을 포화 중탄산나트륨 30 mL 및 염수 30 mL로 세척하였다. 무수 황산나트륨 상에서 건조시킨 후, 혼합물을 농축시키고 플래시 크로마토그래피(헥산 중 30-100% EA, 이어서 DCM 중 0-10% MeOH)로 정제하여 4.1(2.15 g, 45% 수율)을 백색 분말로서 수득하였다. C28H33N2NaO10P+에 대해 계산된 MS(ESI) m/z 611.1771, 실측치: 611.3412.
단계 2: (2R,3S,5R)-2-(1-(디메톡시포스포릴)에톡시)-5-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)테트라하이드로푸란-3-일 벤조에이트.( 4.2 )
1.90 g의 화합물 4.1을 2.0 mL의 무수 톨루엔에 용해시키고, 16.0 mL의 TFA를 용액에 첨가하였다. 그런 다음, 반응 혼합물을 45℃로 가열하고, 5시간 동안 교반하였다. UPLC에 의해 확인된 바와 같이 반응 완료 후, 혼합물을 70 mL 톨루엔으로 희석하고, 휘발성 물질을 감압 하에 제거하였다. 그런 다음, 보라색/갈색 잔류물을 100 mL EA에 용해시키고, 100 mL 중탄산나트륨 및 100 mL 염수로 세척하였다. 무수 황산나트륨 상에서 건조시킨 후, 휘발성 물질을 감압하에 제거하였다. 그런 다음, 생성된 갈색 오일을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 4.2(1.15 g, 76% 수율)를 백색 분말로서 수득하였다. C20H25N2NaO9P+에 대해 계산된 MS(ESI) m/z 491.1195, 실측치: 491.2625.
단계 3: (2R,3S,5R)-2-(1-(하이드록시(메톡시)포스포릴)에톡시)-5-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)테트라하이드로푸란-3-일 벤조에이트( 4.3 )
1.0 g의 화합물 4.2를 40 mL의 3:2 피리딘 및 물 혼합물에 용해시켰다. 반응 혼합물을 50℃로 가열하고, 16시간 동안 교반하였다. UPLC에 의해 확인된 대로 반응 완료 후, 휘발성 물질을 감압 하에 제거하고 미정제 4.3(1.14 g, 정량적)을 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
단계 4: (2R,3R,5R)-2-(1-((((2R,3R,5R)-5-(6-벤즈아미도-9H-퓨린-9-일)-2-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)테트라하이드로푸란-3-일)옥시)(메톡시)포스포릴)에톡시)-5-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)테트라하이드로푸란-3-일 벤조에이트( I-13 ).
1.35 g의 4.3 및 1.50 g의 1-((2R,4R,5R)-5-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-4-하이드록시테트라하이드로푸란-2-일)-5-메틸피리미딘-2,4(1H,3H)-디온을 27 mL 무수 피리딘에 용해시키고, 0℃로 냉각시켰다. 메시틸렌-2-설포닐 클로라이드 2.35 g을 첨가하였다. 그런 다음, 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반하였다. 실온으로 가온한 후, 반응 혼합물을 1-메틸이미다졸 1.20 mL를 첨가하였다. 그런 다음, 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. UPLC에 의해 확인된 바와 같이 반응 완료 후, 포화 중탄산나트륨 30 mL를 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 휘발성 물질을 감압 하에 제거하고, 생성된 황색 오일을 플래시 크로마토그래피(0.1% TEA를 포함하는 EA 중 0-10% MeOH)로 정제하여 I-13(1.03 g, 46% 수율)을 백색 분말로서 수득하였다. C57H57N7O14P+에 대해 계산된 MS(ESI) m/z 1094.3701, 실측치: 1094.3352.
단계 5: (2R,3R,5R)-5-(6-벤즈아미도-9H-퓨린-9-일)-2-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)테트라하이드로푸란-3-일 메틸(1-(((2R,3R,5R)-3-하이드록시-5-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)테트라하이드로푸란-2-일)옥시)에틸)포스포네이트( I-14 ).
탄산칼륨 1.38 g을 MeOH 20 mL에 첨가하고, 생성된 슬러리를 12시간 동안 교반하였다. 그런 다음, 슬러리를 여과하여 탄산칼륨 용액으로서 투명한 여액을 얻었다. 680 mg의 I-13을 45 mL 무수 MeOH에 용해시키고, 사전 제조된 탄산칼륨 용액 5 mL를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. UPLC로 확인된 바와 같이 반응 완료 후, 반응 혼합물을 여과하고, 여액을 1.5 mL 1 M 아세트산으로 켄칭하였다. 휘발성 물질을 감압하에 제거하였다. 그런 다음, 미정제 물질을 플래시 크로마토그래피(0.1% TEA를 포함하는 헥산 중 30-100% EA, 이어서 DCM 중 0-10% MeOH)로 정제하여 I-14(310 mg, 51% 수율)를 백색 폼으로서 수득하였다. C50H53N7O13P+에 대해 계산된 MS(ESI) m/z 990.3439, 실측치: 990.5858.
단계 6: (2R,3R,5R)-2-(1-((((2R,3R,5R)-5-(6-벤즈아미도-9H-퓨린-9-일)-2-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)테트라하이드로푸란-3-일)옥시)(메톡시)포스포릴)에톡시)-5-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)테트라하이드로푸란-3-일(2-시아노에틸)디이소프로필포스포라미다이트( I-15 ).
300 mg의 I-14를 4.0 mL 무수 DCM에 용해시켰다. 실온에서 10분 동안 교반한 후, 150 μL 2-시아노에틸 N',N',N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트에 이어 42 mg 4,5-디시아노이미다졸을 반응 혼합물에 첨가하였다. 생성된 투명한 용액을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. UPLC에 의해 확인된 바와 같이 반응 완료 후, 반응 혼합물을 5 mL 포화 중탄산나트륨 및 5 mL 염수로 세척하였다. 무수 황산나트륨 상에서 건조시킨 후, 휘발성 물질을 감압 하에 제거하였다. 그런 다음, 백색 오일 잔류물을 플래시 크로마토그래피(0.1% TEA를 포함하는 DCM 중 0-10% MeOH)로 정제하여 I-15(225 mg, 74% 수율)를 백색 분말로서 수득하였다. 31P-NMR (200MHz, DMSO-d6): 149.41, 148.96, 148.84, 148.74, 148.73, 148.66, 148.61, 148.53, 24.61, 24.58, 24.55, 24.52, 24.48, 24.46, 24.42, 24.37. C59H70N9O14P2 +에 대해 계산된 MS(ESI) m/z 1190.4518, 실측치: 1190.4528.
실시예 6. (2R,3S,5R)-2-(((((2R,3R,5R)-5-(4-벤즈아미도-5-메틸-2-옥소피리미딘-1(2H)-일)-2-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)테트라하이드로푸란-3-일)옥시)(메톡시)포스포릴)메톡시)-5-(6-벤즈아미도-9H-퓨린-9-일)테트라하이드로푸란-3-일(2-시아노에틸)디이소프로필포스포라미다이트(I-18)의 합성
Figure pct00141
단계 1: (2R,3S,5R)-5-(6-벤즈아미도-9H-퓨린-9-일)-2-((하이드록시(메톡시)포스포릴)메톡시)테트라하이드로푸란-3-일 아세테이트( 5.2 )
화합물 5.1 ((2R,3S,5R)-5-(6-벤즈아미도-9H-퓨린-9-일)-2-((디메톡시포스포릴)메톡시)테트라하이드로푸란-3-일 아세테이트) 2.0 g을 72 mL의 5:4 피리딘과 물 혼합물에 용해시켰다. 반응 혼합물을 50℃로 가열하고, 16시간 동안 교반하였다. UPLC에 의해 확인된 바와 같이 반응 완료 후, 휘발성 물질을 감압 하에 제거하고, 미정제 5.2(2.26 g, 정량적)를 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
단계 2: (2R,3R,5R)-2-(((((2R,3R,5R)-5-(6-벤즈아미도-9H-퓨린-9-일)-2-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)테트라하이드로푸란-3-일)옥시)(메톡시)포스포릴)메톡시)-5-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)테트라하이드로푸란-3-일 벤조에이트( I-16 ).
1.87 g의 5.2 및 2.02 g의 N-(1-((2R,4R,5R)-5-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)-4-하이드록시테트라하이드로푸란-2-일)-5-메틸-2-옥소-1,2-디하이드로피리미딘-4-일)벤즈아미드를 47.5 mL 무수 피리딘에 용해시키고, 0℃로 냉각시켰다. 메시틸렌-2-설포닐 클로라이드 3.44 g을 첨가하였다. 그런 다음, 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반하였다. 실온으로 가온한 후, 반응 혼합물에 1.6 mL 1-메틸이미다졸을 첨가하였다. 그런 다음, 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. UPLC에 의해 확인된 바와 같이 반응 완료 후, 포화 중탄산나트륨 30 mL를 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 휘발성 물질을 감압 하에 제거하고, 생성된 황색 오일을 플래시 크로마토그래피(0.1% TEA를 포함하는 EA 중 0-10% MeOH)로 정제하여 I-16(1.72 g, 46% 수율)을 백색 분말로서 수득하였다. C58H58N8O14P+에 대해 계산된 MS(ESI) m/z 1121.3810, 실측치: 1121.4519.
단계 5: (2R,3R,5R)-5-(4-벤즈아미도-5-메틸-2-옥소피리미딘-1(2H)-일)-2-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)테트라하이드로푸란-3-일 메틸(((((2R,3S,5R)-5-(6-벤즈아미도-9H-퓨린-9-일)-3-하이드록시테트라하이드로푸란-2-일)옥시)메틸)포스포네이트( I-17 ).
탄산칼륨 1.38 g을 MeOH 20 mL에 첨가하고, 생성된 슬러리를 12시간 동안 교반하였다. 그런 다음, 슬러리를 여과하여 탄산칼륨 용액으로서 투명한 여액을 얻었다. I-16 1.4 g을 무수 MeOH 100 mL에 용해시키고, 사전-제조된 탄산칼륨 용액 4 mL를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반하였다. UPLC로 확인된 바와 같이 반응 완료 후, 반응 혼합물을 여과하고, 여액을 1.5 mL 1 M 아세트산으로 켄칭하였다. 휘발성 물질을 감압하에 제거하였다. 그런 다음, 미정제 물질을 플래시 크로마토그래피(0.1% TEA를 포함하는 헥산 중 30-100% EA, 이어서 DCM 중 0-10% MeOH)로 정제하여 I-17(0.85 g, 63% 수율)을 백색 폼으로서 수득하였다. C56H56N8O13P+에 대해 계산된 MS(ESI) m/z 1079.3705, 실측치: 1079.6301.
단계 6: (2R,3S,5R)-2-(((((2R,3R,5R)-5-(4-벤즈아미도-5-메틸-2-옥소피리미딘-1(2H)-일)-2-((비스(4-메톡시페닐)(페닐)메톡시)메틸)테트라하이드로푸란-3-일)옥시)(메톡시)포스포릴)메톡시)-5-(6-벤즈아미도-9H-푸린-9-일)테트라하이드로푸란 -3-일(2-시아노에틸)디이소프로필포스포라미다이트( I-18 ).
640 mg의 I-17을 10.0 mL 무수 DCM에 용해시켰다. 실온에서 10분 동안 교반한 후, 285 μL 2-시아노에틸 N',N',N',N'-테트라이소프로필포스포로디아미다이트를 반응 혼합물에 첨가한 다음, 99 mg 4,5-디시아노이미다졸을 첨가하였다. 생성된 투명한 용액을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. UPLC에 의해 확인된 바와 같이 반응 완료 후, 반응 혼합물을 5 mL 포화 중탄산나트륨 및 5 mL 염수로 세척하였다. 무수 황산나트륨 상에서 건조시킨 후, 휘발성 물질을 감압 하에 제거하였다. 그런 다음, 백색 오일 잔류물을 플래시 크로마토그래피(0.1% TEA를 포함하는 DCM 중 0-10% MeOH)로 정제하여 I-18(420 mg, 55% 수율)을 백색 분말로서 수득하였다. 31P-NMR (200MHz, DMSO-d6): 149.59, 149.56, 149.47, 149.46, 23.83, 23.82, 23.38, 23.36. C65H73N10O15P2 +에 대해 계산된 MS(ESI) m/z 1279.4783, 실측치: 1279.7819.
실시예 7. SGLT2 ASO 백본에서 포스포로티오에이트 연결을 포스포디에스테르 연결로 대체하는 것의 효과.
도 1에서, ASO는 SGLT2 벤치마크 ASO이다. ASO1, ASO2, ASO3, ASO4, ASO5, ASO6, ASO7, ASO8, ASO9, ASO10 및 ASO11은 벤치마크 ASO의 뉴클레오타이드간 포스포로티오에이트(PS) 연결을 뉴클레오타이드 1과 2, 2와 3, 3과 4, 4와 5, 5와 6, 6과 7, 7과 8, 8과 9, 9와 10, 10과 11, 11과 12(5'-말단에서 3'-말단까지 각각 계산) 사이의 뉴클레오타이드간 포스포디에스테르(PO) 연결로 대체하는 것을 나타낸다.
상기 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 암컷 CD-1 IGS 마우스(6-8주령)를 0.2 ml의 용량 부피를 사용하여 피하로 치료하였다. 투여된 용량은 RNA 중량을 기준으로 1.3 mg/kg이었고, 인산염 완충 식염수에서 제형화되었다. 5일 후, 동물을 CO2로 안락사시키고, 심장 천자를 통해 방혈시켰다. 4 mm 직경의 일회용 펀치 생검을 사용하여 신장 샘플을 수집하고, RNAlater™ 용액을 사용하여 24시간 동안 고정했다. 조직 샘플을 5 mm 강철 비드를 사용하여 Trizol™ 시약에서 균질화하고, 제조업체의 권장 사항을 사용하여 MagMAX™ 시스템을 사용하여 전체 RNA를 단리했다. 전체 RNA에서, 표준 산업 방법론을 사용하여 cDNA(단일-가닥 합성)를 생성하고, cDNA를 SGLT2 mRNA의 정량적 검출을 위한 TaqMan™ 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)의 기질로 사용했다. 상대 SGLT2 mRNA는 표준 ddCt 방법을 사용하여 계산하였고, 참조 유전자로서 Ppib mRNA로 정규화하였다.
도 1의 SGLT2 mRNA 녹다운 결과는 단일 PS 뉴클레오타이드간 연결을 SGLT2 ASO 분자의 PO 연결로 대체하는 것이 뉴클레오타이드 2와 3(ASO2) 사이의 위치를 제외한 백본 상의 모든 위치에서 효능을 유의하게 감소시킨다는 것을 입증했다. PS가 뉴클레오타이드 1과 2(ASO1), 3과 4(ASO3), 뿐만 아니라 11과 12(ASO11) 사이에서 PO로 대체되었을 때 활성 감소가 부분적이었다. 임의의 다른 위치에서, PS를 PO로 바꾸면 활성이 폐지된다.
실시예 8. SGLT2 ASO 백본에서 포스포로티오에이트 연결을 iMOP로 대체하는 것의 효과.
도 2에서 ASO는 SGLT2 벤치마크 ASO이다. ASO12는 벤치마크와의 유일한 차이점이 2'-MOE 대신 2'-OMe인 뉴클레오타이드 11의 2'-변형(5'-말단에서 계산)이라는 실험 대조군이다. ASO13은 뉴클레오타이드 10과 11 사이의 연결이 PS 대신 iMOP(핵산 I-3으로 표시됨)인 시험 항목이다. ASO13의 나머지 부분은 ASO12와 동일하다.
상기 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 암컷 CD-1 IGS 마우스(6-8주령)를 0.2 ml의 용량 부피를 사용하여 피하로 치료하였다. 투여된 용량은 RNA 중량을 기준으로 0.5 또는 3 mg/kg이었고, 인산염 완충 식염수(PBS)에서 제형화되었다. 5일 후, 동물을 CO2로 안락사시키고, 심장 천자를 통해 방혈시켰다. 4 mm 직경의 일회용 펀치 생검을 사용하여 신장 샘플을 수집하고, RNAlater™ 용액을 사용하여 24시간 동안 고정했다. 조직 샘플을 5 mm 강철 비드를 사용하여 Trizol™ 시약에서 균질화하고, 제조업체의 권장사항을 사용하여 MagMAX™ 시스템을 사용하여 전체 RNA를 단리했다. 전체 RNA에서 표준 산업 방법론을 사용하여 cDNA(단일-가닥 합성)를 생성하고, cDNA를 SGLT2 mRNA의 정량적 검출을 위한 TaqMan™ 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)의 기질로 사용하였다. 상대 SGLT2 mRNA는 표준 ddCt 방법을 사용하여 계산되었고, 참조 유전자로서 Ppib mRNA로 정규화되었다.
도 2는 SGLT2 ASO에서 PS 연결을 iMOP 연결로 대체하는 것이 도 1에 나타낸 포스포디에스테르 대체와 대조적으로, ~0.5 mpk의 ED50으로 생체내 mRNA KD 활성을 실질적으로 유지한다는 것을 입증한다. 2'-OMe 실험 대조군(ASO12)은 벤치마크(ASO)와 동등한 효능을 보였다. 3가지 올리고뉴클레오타이드 ASO, ASO12, 및 ASO13 모두 용량-의존적 활성을 보였다.
실시예 9. SGLT2 ASO 백본에서 포스포로티오에이트 연결을 iMOP 및 iMeMOP로 대체하는 것의 효과.
도 3에서, ASO는 SGLT2 벤치마크 ASO이다. ASO14는 뉴클레오타이드 10과 11 사이의 연결이 포스포디에스테르 연결이고 뉴클레오타이드 11이 2'-OMe인 PO 대조군이다. ASO12는 모든 연결이 PS이고 뉴클레오타이드 11이 2'-OMe인 PS 대조군이다. ASO13은 뉴클레오타이드 10과 11 사이의 연결이 PS 대신 iMOP(핵산 I-3에 표시됨)인 iMOP 시험 항목이다. ASO15는 뉴클레오타이드 10과 11 사이의 연결이 PS 대신 iMeMOP(핵산 I-6에 표시됨)인 iMeMOP 시험 항목이다.
상기 기재된 시험 물품을 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해시키고, 암컷 CD-1 마우스에 0.5 mg/kg으로 피하 주사하였다. 조직 샘플을 PBS 또는 시험 물품 주입 후 7일에 수확하였다. 그런 다음, 조직 샘플을 TissueLyser II(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 QIAzol 용해 시약에서 균질화하였다. 그런 다음, 제조업체 지침(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)에 따라 MagMAX 기술을 사용하여 RNA를 정제하였다. 고용량 cDNA 역전사 키트(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)를 사용하여 cDNA를 제조하였다. CFX384 실시간 PCR 검출 시스템(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA)에서 PCR을 위해 마우스-특이적 SGLT2 프라이머(Integrated DNA Technology, Coralville, IA)를 사용하였다.
도 3의 결과는 SGLT2 ASO에서 PS 뉴클레오타이드간 연결을 iMeMOP로 대체하는 것이 전체 PS 벤치마크 ASO의 활성과 비교하여 mRNA KD 활성을 완전히 유지한다는 것을 입증했다. 벤치마크 ASO(ASO)와 PS 대조군(ASO12)은 0.5 mpk 미만의 ED50으로 유사한 녹다운 활성을 보여주었다. PO 대조군(ASO14)은 대부분의 녹다운 활성을 상실했다(ED50 >0.5 mpk). iMOP(ASO13)는 약간의 녹다운 활성(ED50 ~0.5 mpk)을 유지했으며, 이는 도 2에 도시된 결과와 유사하다.
실시예 10. GalXC 분자에서 안티센스 가닥의 5'-말단에서 iMOP 연결의 효과.
도 4에서, GalXC1은 안티센스 가닥의 5'-말단에서 뉴클레오타이드 1과 2 사이에 PS 연결 중 하나를 갖는 대조군 GalXC 분자이다. GalXC2는 안티센스 가닥의 5'-말단 PS 연결을 iMOP 연결로 대체하는 GalXC 분자이다. 나머지 분자는 대조군과 동일하다.
시험 핵산을 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해시키고, 암컷 CD-1 마우스에 0.5 mg/kg으로 피하 주사하였다. 조직 샘플을 PBS 또는 시험 핵산 주입 후 7일에 수확하였다. 그런 다음, 조직 샘플을 TissueLyser II(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 QIAzol 용해 시약에서 균질화하였다. 그런 다음, 제조업체 지침(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)에 따라 MagMAX 기술을 사용하여 RNA를 정제하였다. 고용량 cDNA 역전사 키트(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)를 사용하여 cDNA를 제조하였다. CFX384 실시간 PCR 검출 시스템(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA)에서 PCR을 위해 마우스-특이적 ALDH2 프라이머(Integrated DNA Technology, Coralville, IA)를 사용하였다.
도 4의 결과는 GalXC1의 PS 뉴클레오타이드간 연결을 안티센스 가닥의 5'-말단에 있는 GalXC 분자의 핵산 I-9에서 유래한 GalXC2의 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결로 대체하는 것이 생체 내에서 mRNA KD 활성을 유지시킨다는 것을 입증했다.
실시예 11. SGLT2 ASO 백본의 GAP 2 위치에서 포스포로티오에이트 연결을 iMOP로 대체하는 것.
도 5에서, ASO는 SGLT2 벤치마크 ASO이다. ASO4는 벤치마크와의 유일한 차이점이 포스포로티오에이트(PS) 연결 대신 뉴클레오타이드 간 포스포디에스테르(PO)인 뉴클레오타이드 4와 5(5'-말단에서 계산) 간의 연결이라는 실험적 PO 대조군이다. ASO18은 뉴클레오타이드 4와 5 사이의 연결이 PS 대신 iMOP(핵산 I-12에 표시됨)인 시험 항목이다. ASO19는 뉴클레오타이드 4와 5 사이의 연결이 PS 대신 iMeMOP(핵산 I-15에 표시됨)인 iMeMOP 시험 항목이다.
상기 기재된 시험 물품을 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해시키고, 암컷 CD-1 마우스에 0.5 mg/kg으로 피하 주사하였다. 조직 샘플을 PBS 또는 시험 물품 주입 후 5일에 수확하였다. (다른 실험에서 주사 후 7일에 샘플을 수확한 시험 물품 ASO* 그룹 제외.) 그런 다음, 조직 샘플을 TissueLyser II(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 QIAzol 용해 시약에서 균질화하였다. 그런 다음, 제조업체 지침(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)에 따라 MagMAX 기술을 사용하여 RNA를 정제하였다. 고용량 cDNA 역전사 키트(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)를 사용하여 cDNA를 제조하였다. CFX384 실시간 PCR 검출 시스템(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA)에서 PCR을 위해 마우스-특이적 SGLT2 프라이머(Integrated DNA Technology, Coralville, IA)를 사용하였다.
도 5의 결과는 SGLT2 ASO에서 PS 뉴클레오타이드간 연결을 iMOP(ASO18) 또는 iMeMOP(ASO19)로 대체하는 것이 전체 PS 벤치마크 ASO의 활성과 비교하여 생체 내 mRNA KD 활성을 실질적으로 유지한다는 것을 입증했다. 두 ASO의 ED50은 ~0.5 mpk이다. 벤치마크 ASO(ASO)는 0.5 mpk 미만의 ED50으로 녹다운 활성을 보여주었다. PO 대조군(ASO4)은 대부분의 녹다운 활성을 상실했다(ED50 >0.5 mpk).
실시예 12. 트리토솜 안정성
시험관내에서 뉴클레오타이드간 변형을 갖는 화합물의 대사 안정성을 평가하기 위해, ~ 4 μM의 시험 화합물 및 이들의 상응하는 대조군 화합물을 38℃에서 랫트 간 트리토솜(산 포스파타제 활성)(Sekisui Xenotech, Kansas City, KS)에서 인큐베이션하였다. 래트 간 트리토솜은 Triton WR 1339(Tyloxapol로도 지칭됨)로 처리된 래트 간 세포의 리소좀이다. 인큐베이션된 시험 화합물 및 각각의 대조군 화합물을 서로 다른 예정된 시점에서 트리토솜을 인큐베이션하여 수집한 후, 96-웰/100 mg CLARITY® OTX™ 카트리지 SPE 플레이트(Phenomenex, Torrance, CA) 및 제조사의 지침에 따른 96-웰 플레이트 진공 매니폴드를 사용하여 리소좀 매트릭스에서 추출했다. 용리액을 TURBOVAP®(Biotage, Charlotte, NC) 용매 증발 장치를 사용하여 증발시키고, 물로 재구성하고 LC-MS를 통해 분석했다.
ACQUITY UPLC® 기기(Waters Corporation, Milford, MA)는 ACQUITY UPLC® 올리고뉴클레오타이드 BEH C18 컬럼 1.7 μm 입자 크기 역상 초고성능 액체 크로마토그래피(2.1 x 50 mm) 컬럼(Waters Corporation, Milford, MA)을 사용하여 달성된 크로마토그래피 분리와 함께 0.4 mL/분으로 완충제 첨가제를 함유하는 이동상을 전달하는 데 사용하였다. 컬럼 온도는 70℃로 유지되었고, 시료 주입량은 8 μL였다. 음이온 모드 및 전자분무 이온화(ESI) 조건에서 작동하는 SYNAPT® G2S 고분해능 비행 시간 질량 분석기(HRMS, Waters Corporation, Milford, MA)를 사용하여 대조군, 시험 화합물 및 이의 대사산물을 검출했다. PROMASS DECONVOLUTION™ 소프트웨어(Novatia, Newtown, PA)를 사용하여 전하-상태 디콘볼루션(deconvolution)을 통해 0 전하-상태 분자 이온 질량을 얻었다. 대조군, 시험 화합물 및 이들의 대사산물은 실험적으로 결정된 질량을 예상 이론 분자량과 비교하여 확인했다.
GalXC 분자와 관련하여 iMOP 연결의 대사 안정성을 평가하기 위해, 도 4에 도시된 2개의 화합물을 위에서 설명한 트리토솜 분석에서 테스트하였다. GalXC1은 안티센스 가닥의 5'-말단에서 뉴클레오타이드 1과 2 사이에 PS 연결이 있는 GalXC 분자이다. GalXC2는 안티센스 가닥의 5'-말단 PS 연결을 iMOP 연결로 대체하는 GalXC 분자이다.
24시간의 인큐베이션 기간 동안, 테스트 핵산의 iMOP 연결에서 절단 산물이 관찰되지 않았다. 표 2의 데이터는 iMOP 뉴클레오타이드간 연결을 함유하는 안티센스 가닥이 PS 연결을 갖는 대조군 안티센스 가닥과 비교하여 개선된 전체 대사 안정성을 나타냄을 시사한다. 관찰된 주요 대사산물은 안티센스 가닥의 3' 말단에서 유래했다(데이터는 표시되지 않음).
Figure pct00142
ASO 플랫폼의 맥락에서 iMOP 및 iMeMOP 연결의 대사 안정성을 평가하기 위해, 도 3에 도시된 시험 물품을 위에서 설명한 트리토솜 분석에서 테스트하였다. 표 3에 나타난 바와 같이, iMOP 또는 iMeMOP 연결이 있는 시험 물품은 모 대조군 및 2'OMe PS 대조군과 비교하여 유사한 대사 안정성을 나타냈다. 뉴클레오타이드 10과 11 사이의 연결이 포스포디에스테르 연결(ASO14)인 PO 대조군은 가장 낮은 안정성을 보였다. 도 6은 표 3의 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
Figure pct00143
실시예 13. 이중체 안정성에 대한 iMOP 및 iMeMOP 변형의 효과
완전한 왓슨-크릭 상보성으로 SGLT2 ASO에 결합하도록 설계된 12mer RNA인 SGLT2 ASO 및 RNA1의 이중체 형성 및 용융은 펠티에 온도 조절기가 장착된 Agilent Cary 3500 UV-VIS 분광광도계 및 자외선(UV) 분광기로 모니터링하였다. 이중체 농도는 PBS(인산염 완충 식염수)(1X, pH 7.4)에서 2 μM(가닥의 총 농도 4 μM)이었다. 90℃로 가열한 후, 샘플을 천천히 실온으로 냉각시키고, 밤새 냉장시켰다. 그런 다음, 샘플을 분광 광도계의 차가운 큐벳으로 옮기고, 0.5℃/분의 속도로 5℃에서 90℃로 가열할 때 260 nm에서의 흡광도 변화를 모니터링하였다. 샘플은 20℃ 미만일 때 흐르는 질소 하에 유지되었고, 흡광도 값은 30초마다 기록하였다. 기준선 방법을 사용하여 Tm 값을 계산하고 도 7에 나타내었다.
ASO는 완전히 인산화된 SGLT2 벤치마크 ASO이다. ASO14는 벤치마크의 PO 대조군이며, 뉴클레오타이드 10과 11 사이에 포스포디에스테르 연결이 있다. ASO13은 뉴클레오타이드 10과 11 사이의 연결이 PS 대신 iMOP인 iMOP 시험 항목이다. ASO15는 뉴클레오타이드 10과 11 사이의 연결이 PS 대신 iMeMOP인 iMeMOP 시험 항목이다. 결과는 ASO14가 상보적 RNA1에 결합될 때 가장 높은 열 안정성을 나타냄을 나타낸다. 결과는 또한 PS 뉴클레오타이드간 연결을 새로운 iMeMOP 또는 iMOP 변형으로 대체하면 ASO:RNA 이중체 열 안정성을 유지하는 반면, iMeMOP의 통합은 -1℃만큼 불안정해지며(도 6의 ASO15:RNA1 참조), iMOP의 통합은 +1.5℃로 안정화된다(도 7의 ASO13:RNA1 참조).
실시예 14. RNase H 활성에 대한 iMOP 및 iMeMOP 변형의 효과
RNase H 효소는 ASO:RNA 하이브리드의 RNA 부분을 분해하는 반면, ASO 가닥은 그대로 유지되는 것으로 알려져 있다. ASO에 통합될 때 RNase H 활성을 유도하는 뉴클레오타이드간 연결 변형의 효능을 모니터링하기 위해, iMOP 및 iMeMOP 변형 ASO를 상보적 RNA에 혼성화하고, 인간 RNase H에 의한 절단에 대한 민감성에 대해 테스트했다. 고전적인 전기영동 방법 대신 고-분해능 LC-MS 방법을 사용하여 절단 반응을 모니터링하였다. 생성된 RNA 단편의 질량 피크를 분석하면, RNA의 정확한 절단 부위를 결정할 수 있으며, LC 스펙트럼에서 RNA 단편 및/또는 남아 있는 전장 RNA에 해당하는 피크 면적을 정량화하면 다양한 ASO에 의해 유도된 절단 반응 동역학을 비교할 수 있다(도 8).
SGLT2 12mer ASO에 대해 완전한 상보성을 갖는 12개 뉴클레오타이드 스트레치를 포함하는 32개 뉴클레오타이드 긴 RNA 가닥(RNA2)을 설계했다. 보체 RNA에 대한 각 ASO의 어닐링은 이중 기질(ASO15:RNA2, ASO13:RNA2 및 ASO:RNA2)을 제공한다. ASO는 모든 연결이 PS인 SGLT2 벤치마크 ASO이다. ASO13은 뉴클레오타이드 10과 11 사이의 연결이 PS 대신 iMOP인 iMOP 시험 항목이다. ASO15는 뉴클레오타이드 10과 11 사이의 연결이 PS 대신 iMeMOP인 iMeMOP 시험 항목이다.
일반적으로, 각각의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 2 nmol을 1X RNase H 반응 완충액(pH 8.3에서 50 mM Tris-HCl, 75 mM KCl, 3mM MgCl2, 및 10 mM DTT)에서 1 nmol의 RNA와 혼합하였다. 샘플을 90℃에서 5분 동안 가열하고, 실온으로 천천히 냉각시켜 이중체 기질이 형성되도록 하였다. 각 어닐링 용액은 모든 RNA가 ASO에 혼성화되고 유리 RNA가 용액에 존재하지 않도록 하기 위해 RNA에 비해 2배 과량의 AON으로 제조되었다. 다음으로, 100 μL 분취량을 유리 총 회수 MS 바이알로 옮기고, LC-MS 샘플 홀더에서 20℃(분석 온도)에서 1분 동안 보관했다. 분석 온도는 모든 RNA가 ASO에 혼성화되도록 하기 위해 ASO:RNA 혼성체의 열 용융 온도보다 훨씬 더 낮게 선택하였다. 1분 인큐베이션 후, ASO:RNA 이중체 기질을 Waters Synapt 고해상도 LC-MS에서 분석하여 0 시점에 대한 스펙트럼을 산출했다.
RNA 절단 반응은 1X RNase H 완충액에서 새로 희석된 E. coli RNase H 효소 0.25 U 2 μL를 첨가하여 시작되었다. 효소는 활성 손실을 피하기 위해 얼음 위에서 처리되었다. 혼합물을 피펫팅으로 부드럽게 혼합하고, 효소 첨가 후 30초, 15분, 30분 및 45분 시점에서 LC-MS에서 RNA 절단을 모니터링하였다. 이러한 분석을 위한 0.25 U 최적 RNase H 농도는 일련의 예비 효소 희석액(10 U, 5 U, 1 U, 0.5 U 및 0.25 U)에서 선택되었다. 0.25 U에서 RNA의 소화는 느려서 도 8에 도시된 바와 같이 절단 속도의 계산 및 비교가 가능하다. 각 시점에서, 절단 생성물로 전환된 RNA의 비율은 해당 시점에서 남아있는 전장 RNA에 해당하는 LC 피크 면적의 정량화를 통해 계산된다. 도 8에 도시된 바와 같이, 결과는 SGLT2 ASO 서열에서 PS 뉴클레오타이드간 연결을 iMeMOP 또는 iMOP로 대체하는 것이 SGLT2 벤치마크의 절단 속도와 비슷한 절단 속도로 RNase H 활성을 완전히 유지한다는 것을 나타낸다.
본 발명의 다수의 실시형태가 본원에 기재되어 있지만, 본원에 제공된 기본 예는 본 발명의 핵산 또는 이의 유사체 및 방법을 이용하는 다른 실시형태를 제공하도록 변경될 수 있음이 명백하다. 따라서, 본 발명의 범위는 예로서 나타낸 특정 실시형태에 의해서가 아니라 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 의해 정의되어야 함을 이해할 것이다.

Claims (34)

  1. 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체로서, 여기서 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 하기 화학식 I, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로 나타내고:
    [화학식 I]
    Figure pct00144

    식 중,
    B는 핵염기 또는 수소이고;
    R1 및 R2는 독립적으로 수소, 할로겐, R5, -CN, -S(O)R, -S(O)2R, -Si(OR)2R, -Si(OR)R2, 또는 -SiR3이거나:
    동일한 탄소 상의 R1 및 R2가 그들의 개재 원자와 함께, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 0-3개의 헤테로원자를 갖는 3-7원 포화 또는 부분 불포화 고리를 형성하며;
    각각의 R은 독립적으로 수소, 적합한 보호기, 또는 C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이거나:
    동일한 원자 상의 2개의 R 기는 그들의 개재 원자와 함께, 질소, 산소, 규소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 0-3개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화, 부분 불포화 또는 헤테로아릴 고리를 형성하고;
    R3은 수소, 적합한 보호기, 적합한 전구약물, 또는 C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
    각각의 R4는 독립적으로 수소, 적합한 전구약물, R5, 할로겐, -CN, -NO2, -OR, -SR, -NR2, -S(O)2R, -S(O)2NR2, -S(O)R, -C(O)R, -C(O)OR, -C(O)NR2, -C(O)N(R)OR, -OC(O)R, -OC(O)NR2, -OP(O)R2, -OP(O)(OR)2, -OP(O)(OR)NR2, -OP(O)(NR2)2-, -N(R)C(O)OR, -N(R)C(O)R, -N(R)C(O)NR2, -N(R)S(O)2R, -N(R)P(O)R2, -N(R)P(O)(OR)2, -N(R)P(O)(OR)NR2, -N(R)P(O)(NR2)2, -N(R)S(O)2R, -Si(OR)2R, -Si(OR)R2, 또는 -SiR3이고;
    각각의 R5는 독립적으로, C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭 고리, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
    X1은 O, S 또는 NR이고;
    X2는 -O-, -S-, -B(H)2-, 또는 공유 결합이고;
    X3은 -O-, -S-, -Se-, 또는 -N(R)-이고;
    Y1은 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 2'- 또는 3'-말단에 부착되는 연결 기이고;
    Y2는 수소, 보호기, 포스포라미다이트 유사체, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 4'- 또는 5'-말단에 부착되는 뉴클레오타이드간 연결 기, 또는 고체 지지체에 부착되는 연결 기이고;
    Z는 -O-, -S-, -N(R)-, 또는 -C(R)2-이고;
    n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5인, 핵산 또는 이의 유사체.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 하기 대표적인 화학식 중 어느 하나 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로부터 선택되며:
    Figure pct00145

    Figure pct00146

    식 중,
    Y3은 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 2'- 또는 3'-말단에 부착되는 연결 기이고;
    Y4는 수소, 보호기, 포스포라미다이트 유사체, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 4'- 또는 5'-말단에 부착되는 뉴클레오타이드간 연결 기, 또는 고체 지지체에 부착되는 연결 기인, 핵산 또는 이의 유사체.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 핵산 또는 이의 유사체가 하기 화학식 중 어느 하나 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로부터 선택되는, 핵산 또는 이의 유사체:
    Figure pct00147

    Figure pct00148
    .
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    R1이 수소이고 R2가 수소 또는 메틸인, 핵산 또는 이의 유사체.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 R4가 독립적으로 수소, 하이드록시, 플루오로, 메톡시, 또는
    Figure pct00149
    인, 핵산 또는 이의 유사체.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 B가
    Figure pct00150
    로부터 선택되는, 핵산 또는 이의 유사체.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산 또는 이의 유사체가 표 1에 기재된 것들 중 어느 하나, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로부터 선택되는, 핵산 또는 이의 유사체.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 핵산 또는 이의 유사체가 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 이중-가닥 RNAi 억제제 분자이고, 여기서 제1 가닥은 센스 가닥이고 제2 가닥은 안티센스 가닥인, 핵산 또는 이의 유사체.
  9. 청구항 8에 있어서,
    이중 가닥 RNAi 억제제 분자가 15 내지 45개 뉴클레오타이드의 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이에 상보성 영역을 포함하는, 핵산 또는 이의 유사체.
  10. 청구항 9에 있어서,
    센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 상보성 영역이 20 내지 30개의 뉴클레오타이드인, 핵산 또는 이의 유사체.
  11. 청구항 10에 있어서,
    센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 상보성 영역이 21 내지 26개의 뉴클레오타이드인, 핵산 또는 이의 유사체.
  12. 청구항 9에 있어서,
    센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 상보성 영역이 19 내지 24개의 뉴클레오타이드인, 핵산 또는 이의 유사체.
  13. 청구항 12에 있어서,
    센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 상보성 영역이 19 내지 21개의 뉴클레오타이드인, 핵산 또는 이의 유사체.
  14. 청구항 8에 있어서,
    이중-가닥 RNAi 억제제 분자가 테트라루프를 함유하는, 핵산 또는 이의 유사체.
  15. 청구항 1에 있어서,
    상기 핵산 또는 이의 유사체가 단일 가닥 핵산인, 핵산 또는 이의 유사체.
  16. 청구항 15에 있어서,
    상기 단일 가닥 핵산이 단일 가닥 RNAi 억제제 분자인, 핵산 또는 이의 유사체.
  17. 청구항 15에 있어서,
    상기 단일 가닥 핵산이 기존의 안티센스 핵산, 리보자임 또는 앱타머인, 핵산 또는 이의 유사체.
  18. 청구항 16 또는 청구항 17에 있어서,
    상기 단일 가닥 RNAi 억제제 분자의 길이가 14-50개 뉴클레오타이드인, 핵산 또는 이의 유사체.
  19. 청구항 18에 있어서,
    상기 단일 가닥 RNAi 억제제 분자의 길이가 약 16-30, 18-22, 또는 20-22개 뉴클레오타이드인, 핵산 또는 이의 유사체.
  20. 청구항 1에 있어서,
    상기 핵산 또는 이의 유사체가 네이키드(naked) 핵산인, 핵산 또는 이의 유사체.
  21. 청구항 1에 있어서,
    적어도 하나의 전달제를 추가로 포함하고, 여기서 적어도 하나의 전달제는 세포 외막을 가로질러 핵산 또는 이의 유사체의 수송을 용이하게 하기 위해 핵산 또는 이의 유사체에 접합되는, 핵산 또는 이의 유사체.
  22. 청구항 1에 있어서,
    상기 전달제가 탄수화물, 펩타이드, 지질, 비타민 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산 또는 이의 유사체.
  23. 청구항 1에 있어서,
    상기 전달제가 N-아세틸갈락토사민(GalNAc), 만노스-6-포스페이트, 갈락토스, 올리고당류, 다당류, 콜레스테롤, 폴리에틸렌 글리콜, 엽산, 비타민 A, 비타민 E, 리토콜산 및 양이온성 지질로부터 선택되는, 핵산 또는 이의 유사체.
  24. 청구항 1에 따른 핵산 또는 이의 유사체, 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 아주반트 또는 비히클을 포함하는, 약제학적 조성물.
  25. 청구항 24의 약제학적 조성물을 표적 유전자의 발현을 감소시키기에 충분한 양으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 표적 유전자의 발현을 감소시키는 방법.
  26. 청구항 24의 약제학적 조성물을 암, 바이러스 감염 또는 유전적 장애를 치료하기에 충분한 양으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 암, 바이러스 감염 또는 유전적 장애를 치료하는 방법.
  27. 청구항 24 또는 청구항 25에 있어서,
    상기 투여가 전신 투여를 포함하는, 방법.
  28. 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체의 제조 방법으로서, 여기서 4'-O-메틸렌 포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결은 화학식 I-c 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로 나타내고,
    [화학식 I-c]
    Figure pct00151

    하기 단계:
    (a) 화학식 A4 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 핵산 또는 이의 유사체를 제공하는 단계:
    [화학식 A4]
    Figure pct00152
    , 및
    (b) 화학식 A4의 핵산 또는 이의 유사체를 화학식 A5의 뉴클레오사이드 또는 이의 유사체와 축합시켜서,
    [화학식 A5]
    Figure pct00153

    화학식 I-b를 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 형성하는 단계
    를 포함하며,
    식 중,
    각 B가 핵염기 또는 수소이고;
    PG가 적합한 하이드록실 보호기이고;
    R1 및 R2는 독립적으로 수소, 할로겐, R5, -CN, -S(O)R, -S(O)2R, -Si(OR)2R, -Si(OR)R2, 또는 -SiR3이거나:
    동일한 탄소 상의 R1 및 R2가 그들의 개재 원자와 함께, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 0-3개의 헤테로원자를 갖는 3-7원 포화 또는 부분 불포화 고리를 형성하며;
    각각의 R은 독립적으로 수소, 적합한 보호기, 또는 C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이거나:
    동일한 원자 상의 2개의 R 기는 그들의 개재 원자와 함께, 질소, 산소, 규소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 0-3개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화, 부분 불포화 또는 헤테로아릴 고리를 형성하고;
    R3은 수소, 적합한 보호기, 적합한 전구약물, 또는 C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
    각각의 R4는 독립적으로 수소, 적합한 전구약물, R5, 할로겐, -CN, -NO2, -OR, -SR, -NR2, -S(O)2R, -S(O)2NR2, -S(O)R, -C(O)R, -C(O)OR, -C(O)NR2, -C(O)N(R)OR, -OC(O)R, -OC(O)NR2, -OP(O)R2, -OP(O)(OR)2, -OP(O)(OR)NR2, -OP(O)(NR2)2-, -N(R)C(O)OR, -N(R)C(O)R, -N(R)C(O)NR2, -N(R)S(O)2R, -N(R)P(O)R2, -N(R)P(O)(OR)2, -N(R)P(O)(OR)NR2, -N(R)P(O)(NR2)2, -N(R)S(O)2R, -Si(OR)2R, -Si(OR)R2, 또는 -SiR3이고;
    각각의 R5는 독립적으로, C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭 고리, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
    X1은 O, S 또는 NR이고;
    각각의 X2는 독립적으로 -O-, -S-, -B(H)2-, 또는 공유 결합이고;
    X3은 -O-, -S-, -Se-, 또는 -N(R)-이고;
    Y2는 수소, 보호기, 포스포라미다이트 유사체, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 4'- 또는 5'-말단에 부착되는 뉴클레오타이드간 연결 기, 또는 고체 지지체에 부착되는 연결 기이고;
    각각의 Z는 독립적으로 -O-, -S-, -N(R)-, 또는 -C(R)2-이고;
    각각의 n은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4 또는 5인, 방법.
  29. 청구항 27에 있어서,
    Y2가 보호기인, 방법.
  30. 청구항 29에 있어서,
    화학식 I-d 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 핵산을 제조하는 단계들을 추가로 포함하고,
    [화학식 I-d]
    Figure pct00154

    하기 단계:
    (a) 화학식 I-c 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 제공하는 단계,
    [화학식 I-c]
    Figure pct00155
    , 및
    (b) 화학식 I-c를 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 탈보호하여, 화학식 I-d를 포함하는 핵산 또는 이의 유사체를 형성하는 단계
    를 포함하며,
    식 중,
    각 B가 핵염기 또는 수소이고;
    PG가 적합한 하이드록실 보호기이고;
    PG1이 보호기이고;
    R1 및 R2는 독립적으로 수소, 할로겐, R5, -CN, -S(O)R, -S(O)2R, -Si(OR)2R, -Si(OR)R2, 또는 -SiR3이거나:
    동일한 탄소 상의 R1 및 R2가 그들의 개재 원자와 함께, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 0-3개의 헤테로원자를 갖는 3-7원 포화 또는 부분 불포화 고리를 형성하며;
    각각의 R은 독립적으로 수소, 적합한 보호기, 또는 C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이거나:
    동일한 원자 상의 2개의 R 기는 그들의 개재 원자와 함께, 질소, 산소, 규소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 0-3개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화, 부분 불포화 또는 헤테로아릴 고리를 형성하고;
    R3은 수소, 적합한 보호기, 적합한 전구약물, 또는 C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
    각각의 R4는 독립적으로 수소, 적합한 전구약물, R5, 할로겐, -CN, -NO2, -OR, -SR, -NR2, -S(O)2R, -S(O)2NR2, -S(O)R, -C(O)R, -C(O)OR, -C(O)NR2, -C(O)N(R)OR, -OC(O)R, -OC(O)NR2, -OP(O)R2, -OP(O)(OR)2, -OP(O)(OR)NR2, -OP(O)(NR2)2-, -N(R)C(O)OR, -N(R)C(O)R, -N(R)C(O)NR2, -N(R)S(O)2R, -N(R)P(O)R2, -N(R)P(O)(OR)2, -N(R)P(O)(OR)NR2, -N(R)P(O)(NR2)2, -N(R)S(O)2R, -Si(OR)2R, -Si(OR)R2, 또는 -SiR3이고;
    각각의 R5는 독립적으로, C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭 고리, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
    X1은 O, S 또는 NR이고;
    각각의 X2는 독립적으로 -O-, -S-, -B(H)2-, 또는 공유 결합이고;
    X3은 -O-, -S-, -Se-, 또는 -N(R)-이고;
    각각의 Z는 독립적으로 -O-, -S-, -N(R)-, 또는 -C(R)2-이고;
    각각의 n은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4 또는 5인, 방법.
  31. 청구항 30에 있어서,
    화학식 I-e, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 핵산 또는 이의 유사체를 제조하는 단계를 추가로 포함하고,
    [화학식 I-e]
    Figure pct00156

    하기 단계:
    (a) 화학식 I-d의 핵산 또는 이의 유사체를 제공하는 단계:
    [화학식 I-d]
    Figure pct00157

    (b) 화학식 I-d의 핵산 또는 이의 유사체를 P(III) 형성 시약과 반응시켜 화학식 I-e의 핵산 또는 이의 유사체를 형성하는 단계
    를 포함하며,
    식 중,
    각 B가 핵염기 또는 수소이고;
    PG가 적합한 하이드록실 보호기이고;
    R1 및 R2는 독립적으로 수소, 할로겐, R5, -CN, -S(O)R, -S(O)2R, -Si(OR)2R, -Si(OR)R2, 또는 -SiR3이거나:
    동일한 탄소 상의 R1 및 R2가 그들의 개재 원자와 함께, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택되는 0-3개의 헤테로원자를 갖는 3-7원 포화 또는 부분 불포화 고리를 형성하며;
    각각의 R은 독립적으로 수소, 적합한 보호기, 또는 C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이거나:
    동일한 원자 상의 2개의 R 기는 그들의 개재 원자와 함께, 질소, 산소, 규소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 0-3개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화, 부분 불포화 또는 헤테로아릴 고리를 형성하고;
    R3은 수소, 적합한 보호기, 적합한 전구약물, 또는 C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
    각각의 R4는 독립적으로 수소, 적합한 전구약물, R5, 할로겐, -CN, -NO2, -OR, -SR, -NR2, -S(O)2R, -S(O)2NR2, -S(O)R, -C(O)R, -C(O)OR, -C(O)NR2, -C(O)N(R)OR, -OC(O)R, -OC(O)NR2, -OP(O)R2, -OP(O)(OR)2, -OP(O)(OR)NR2, -OP(O)(NR2)2-, -N(R)C(O)OR, -N(R)C(O)R, -N(R)C(O)NR2, -N(R)S(O)2R, -N(R)P(O)R2, -N(R)P(O)(OR)2, -N(R)P(O)(OR)NR2, -N(R)P(O)(NR2)2, -N(R)S(O)2R, -Si(OR)2R, -Si(OR)R2, 또는 -SiR3이고;
    각각의 R5는 독립적으로, C1-6 지방족, 페닐, 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-2개의 헤테로원자를 갖는 4-7원 포화 또는 부분 불포화 헤테로사이클릭 고리, 및 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1-4개의 헤테로원자를 갖는 5-6원 헤테로아릴 고리로부터 선택된 임의로 치환된 기이고;
    E는 할로겐 또는 -NR2이고;
    X1은 O, S 또는 NR이고;
    각각의 X2는 독립적으로 -O-, -S-, -B(H)2-, 또는 공유 결합이고;
    X3은 -O-, -S-, -Se-, 또는 -N(R)-이고;
    각각의 Z는 독립적으로 -O-, -S-, -N(R)-, 또는 -C(R)2-이고;
    각각의 n은 독립적으로 0, 1, 2, 3, 4 또는 5인, 방법.
  32. 청구항 28 내지 청구항 31 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 R1이 수소이고, R2가 수소 또는 메틸인, 방법.
  33. 청구항 28 내지 청구항 32 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 R4는 독립적으로 수소, 하이드록시, 플루오로, 메톡시, 또는
    Figure pct00158
    인, 방법.
  34. 청구항 28 내지 청구항 33 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 B는
    Figure pct00159
    로부터 선택되는, 방법.
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