CN102076328A - 用于胞内递送治疗剂的胶束 - Google Patents

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R·欧沃瑞尔
A·高尔
M·普里福
A·帕沙尔
C·迪亚布
P·德
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Abstract

一种组合物，其中包含聚合物胶束和缔合的多核苷酸。

Description

用于胞内递送治疗剂的胶束
本申请要求2008年5月13日提交的美国临时申请号61/052,908、2008年5月13日提交的美国临时申请号61/052,914、2008年8月22日提交的美国临时申请号61/091,294、2008年11月6日提交的美国临时申请号61/112,048、2008年12月24日提交的美国临时申请号61/140,774和2009年4月21日提交的美国临时申请号61/171,369、2008年12月24日提交的美国临时申请号61/140,779、2008年11月6日提交的美国临时申请号61/112,054、2009年4月21日提交的美国临时申请号61/171,358的利益，将上述各申请通过参考完整引入本文。
发明领域
本文描述了由聚合物形成的胶束和这种胶束的应用。
发明背景
在一些情况中，给活细胞提供治疗剂，例如多核苷酸(例如寡核苷酸)是有益的。在一些情况中，给活细胞递送这种多核苷酸提供了治疗有益性。
发明概述
本文提供了用于胞内递送治疗剂(例如寡核苷酸、肽类等)的胶束。在一些实施方案中，这种胞内递送是体外的；在其他实施方案中，这种胞内递送是体内的。
在一些实施方案中，特别将本文提供的胶束设计成可靶向递送胶束净载荷至受试者内期望的治疗干预部位处。因此，该胶束优选对生理pH下的稀释是稳定的。在一些实施方案中，本文提供的胶束在生理条件下稳定并且具有可防止不期望的胶束缔合的临界胶束浓度。在另一些或可选择的实施方案中，包含本文所述胶束的嵌段共聚物具有被设计成在生理条件下有提高的胶束完整性的嵌段比、嵌段大小和/或芯特性和/或壳特性。在另一些或可选择的实施方案中，生理环境中胶束的完整性还依赖于包含胶束的嵌段共聚物的组成。因此，本文提供了被加工成可提供适合于以最低的毒性和/或胶束净载荷损失进行有效胞内递送的胶束的某些参数(例如用于胶束壳嵌段和芯嵌段中嵌段共聚物的数均分子量比、嵌段共聚物中带电荷部分的数量等)。
在一些实施方案中，提供了组合物，其包含聚合物胶束和与胶束缔合的多核苷酸，所述胶束包含多个嵌段共聚物，每一嵌段共聚物包含亲水性嵌段和疏水性嵌段，该多个嵌段共聚物缔合而使得胶束在约中性pH下、在含水介质中稳定，
(a)所述胶束还具有两种或更多种选自如下的特征：
(i)胶束包含约10-约100个嵌段共聚物/胶束；
(ii)临界胶束浓度CMC在约0.2ug/mL-约20ug/mL；
(iii)在没有核酸存在时自发胶束装配；
(iv)约0.5x106-约3.6x106道尔顿的重均分子量；
(v)约5nm-约500nm的粒度；和
(b)所述嵌段共聚物具有一种或更多种选自如下的特征：
(i)亲水性嵌段与疏水性嵌段的数均分子量Mn之比在约1∶1-约1∶10；和
(ii)约1.0-约2.0的多分散性指数。
在一些实施方案中，提供了组合物，其包含聚合物胶束和与胶束缔合的多核苷酸，所述胶束包含多个嵌段共聚物，每一嵌段共聚物包含亲水性嵌段和疏水性嵌段，该多个嵌段共聚物缔合使得胶束在约中性pH下、在含水介质中稳定，
(a)所述胶束还具有两种或更多种选自如下的特征：
(i)胶束包含约10-约100个嵌段共聚物/胶束；
(ii)在0.5M NaCl中的临界胶束浓度CMC在约0.2ug/mL-约20ug/mL；
(iii)在没有核酸存在时自发胶束装配；
(iv)约0.5x 106-约3.6x106道尔顿的重均分子量；和
(b)嵌段共聚物具有一种或多种选自如下的特征：
(i)亲水性嵌段与疏水性嵌段的数均分子量Mn之比在约1∶1-约1∶10；和
(ii)约1.0-约2.0的多分散性指数。
在一些实施方案中，提供了组合物，其包含聚合物胶束和与胶束缔合的多核苷酸，所述胶束包含多个嵌段共聚物，每一嵌段共聚物包含亲水性嵌段和疏水性嵌段，所述多个嵌段共聚物缔合而使得胶束在约中性pH下、在含水介质中稳定，所述胶束还具有两种或更多种选自如下的特征：
(i)缔合数量在约10-约100个链/胶束；
(ii)临界胶束浓度CMC在约0.2ug/mL-约20ug/mL；
(iii)约5nm-约500nm的粒度。
在一些实施方案中，提供了组合物，其包含聚合物胶束和与胶束缔合的多核苷酸，所述胶束包含多个嵌段共聚物，每一嵌段共聚物包含亲水性嵌段和疏水性嵌段，所述多个嵌段共聚物缔合而使得胶束在约中性pH下、在含水介质中稳定，所述胶束还具有两种或多种选自如下的特征：
(i)亲水性嵌段与疏水性嵌段的数均分子量Mn之比在约1∶1-约1∶10；
(ii)约1.0-约2.0的多分散性指数；和
(iii)约0.5x106-约3.6x106g/mol的重均分子量。
在一些实施方案中，所述组合物包含具有其子段(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(v)中的三个或更多个特征的胶束。在一些实施方案中，所述胶束具有其子段(i)、(ii)、(iii)、(iv)和(v)的全部特征。
在一些实施方案中，所述组合物包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物具有其子段(i)、(ii)和(iii)的全部特征。在一些实施方案中，所述嵌段共聚物的亲水性嵌段与疏水性嵌段的数均分子量Mn之比为约1∶1-约1∶10。在一些实施方案中，所述嵌段共聚物的亲水性嵌段与疏水性嵌段的数均分子量Mn之比为约1∶1.5-约1∶6。在一些实施方案中，所述嵌段共聚物的亲水性嵌段与疏水性嵌段的数均分子量Mn之比为约1∶2-约1∶4。
在一些实施方案中，所述组合物包含胶束，该胶束包含约10-约100个嵌段共聚物/胶束。在一些实施方案中，该胶束包含约20-约60个嵌段共聚物/胶束。在一些实施方案中，该胶束包含约30-约50个嵌段共聚物/胶束。
在一些实施方案中，所述组合物包含具有约0.2ug/mL-约20ug/mL的临界胶束浓度CMC的胶束。在一些实施方案中，所述胶束具有约0.5ug/mL-约10ug/mL的临界胶束浓度CMC。在一些实施方案中，所述胶束具有约1ug/mL-约5ug/mL的临界胶束浓度CMC。
在一些实施方案中，所述组合物包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物的亲水性嵌段与疏水性嵌段的数均分子量Mn之比为约1∶1.5-约1∶6；且所述胶束(i)包含约20-约60个嵌段共聚物/胶束；和(ii)具有约0.5ug/mL-约10ug/mL的临界胶束浓度CMC。
在一些实施方案中，该嵌段共聚物的亲水性嵌段与疏水性嵌段的数均分子量Mn之比为约1∶2-约1∶4；且所述胶束(i)包含约30-约50个嵌段共聚物/胶束；和(ii)具有约1ug/mL-约5ug/mL的临界胶束浓度CMC。
在一些实施方案中，本文所述的嵌段共聚物具有约1.0-约2.0的多分散性指数。在一些实施方案中，所述的嵌段共聚物具有约1.0-约1.7的多分散性指数。在一些实施方案中，所述的嵌段共聚物具有约1.0-约1.4的多分散性指数。
在一些实施方案中，本文提供的组合物包含胶束，该胶束具有约0.5x106-约3.6x106的聚集分子量Mw。在一些实施方案中，该胶束具有约0.75x106-约2.0x106的聚集分子量Mw。在一些实施方案中，该胶束具有约1.0x106-约1.5x106的聚集分子量Mw。
在一些实施方案中，所述胶束具有的粒度为约5nm-约500nm。在一些实施方案中，所述胶束具有的粒度为约10nm-约200nm。在一些实施方案中，所述胶束具有的粒度为约20nm-约100nm。
在本文提供的组合物的一些实施方案中，与每一胶束缔合的多核苷酸数量为约1-约10,000。在一些实施方案中，与每一胶束缔合的多核苷酸数量为约4-约5,000。在一些实施方案中，与每一胶束缔合的多核苷酸数量为约15-约3,000。在一些实施方案中，与每一胶束缔合的多核苷酸数量为约30-约2,500。
在一些实施方案中，本文所述的胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包含多个阳离子性单体单元，该亲水性嵌段中的阳离子性种类与多核苷酸缔合。在一些实施方案中，所述阳离子性单体单元是阳离子单体的残基、不带电荷的布朗斯台德碱单体的残基或其组合。
在本文提供的组合物的一些实施方案中，所述多核苷酸是RNAi试剂或siRNA。在一些实施方案中，所述多核苷酸不在胶束芯内。
在一些实施方案中，本文所述的胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包含多个在亲水性嵌段和/或疏水性嵌段中的阴离子性单体单元。
在一些实施方案中，所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包含多个在亲水性嵌段和/或疏水性嵌段中的不带电荷的单体单元。
在一些实施方案中，所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包含多个在亲水性嵌段和/或疏水性嵌段中的两性粒子型单体单元。
在一些实施方案中，所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包含多个在疏水性嵌段中的可带电荷的残基。在一些实施方案中，所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物在疏水性嵌段中包含至少20个可带电荷的残基。在一些实施方案中，所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物在疏水性嵌段中包含至少15个可带电荷的残基。在一些实施方案中，所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物在疏水性嵌段中包含至少10个可带电荷的残基。在一些实施方案中，所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物在疏水性嵌段中包含至少5个可带电荷的残基。
在一些实施方案中，本文所述的组合物包含聚合物生物缀合物，其包含与所述多个嵌段共聚物中的一种或多种共价偶合的一个或多个多核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸是siRNA。
在一些实施方案中，本文所述的胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包含多个具有可质子化部分和多个疏水性部分的单体单元。在一些实施方案中，所述阴离子性单体单元是阴离子性单体的残基、不带电荷的布郎斯台德酸单体的残基或其组合。
在一些实施方案中，所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包含多个衍生自具有疏水性部分的可聚合单体的单体单元。
在一些实施方案中，所述嵌段共聚物是膜去稳定化的嵌段共聚物。
附图简述
本发明的新特征特别在所附权利要求中举出。通过参照举出示例性的其中使用本发明原理的实施方案和附图的如下详细描述，可以更好地理解本发明的特征和优点：
图1：RAFT合成聚合物的组成和特性的示例性实例；
图2：[PEGMAW]-[B-P-D]聚合物合成的示例性实例；
图3：RAFT合成聚合物的组成和特性的示例性实例；
图4：PEGMA-DMAEMA共聚物的组成和特性的示例性实例；
图5：[PEGMAW-MAA(NHS)]-[B-P-D]聚合物合成的示例性实例；
图6：RAFT合成聚合物的组成和特性的示例性实例；
图7：RAFT合成聚合物的组成和特性的示例性实例；
图8：PDSMA的合成；
图9：用于siRNA缀合的HPMA-PDSMA共聚物的合成；
图10：嵌段共聚物PRx0729v6的NMR光谱术的示例性实例；
图11：PRx0729v6颗粒在有机溶剂中的稳定性的示例性实例；
图12：聚合物PRx0729v6的示例性透射电子显微镜检查(TEM)分析；
图13：pH对聚合物结构的影响的示例性实例；
图14：聚合物PRx0729v6的临界稳定性浓度(CSC)的示例性实例；
图15：与siRNA复合的聚合物PRx0729v6的粒度的动态光散射(DLS)测定的示例性实例；
图16：聚合物PRx0729v6/siRNA复合物在不同电荷比例下的凝胶移位分析的示例性实例；
图17：siRNA-胶束复合物在培养的哺乳动物细胞中的敲低活性的示例性实例；
图18：siRNA-胶束复合物在培养的哺乳动物细胞中的敲低活性的示例性实例；
图19：聚合物胶束及其siRNA复合物的膜去稳定化活性的示例性证实；
图20：聚合物-siRNA复合物的细胞摄取和胞内分布的示例性荧光显微镜检查；
图21：半乳糖末端官能化的聚[DMAEMA]-大CTA的示例性实例；
图22：半乳糖官能化的DMAEMA-MAA(NHS)或PEGMA-MAA(NHS)二-嵌段共聚物的示例性实例；
图23：可缀合的siRNAs和吡啶基二硫化胺的结构的示例性实例。
发明详述
在一些实施方案中提供了组合物，其包含聚合物胶束和与该胶束缔合的多核苷酸，所述胶束包含多个嵌段共聚物。一般而言，每一嵌段共聚物包含亲水性嵌段和疏水性嵌段。在一些实施方案中，本文所述聚合物胶束按照这种方式缔合，以便在含水介质中例如在约中性pH下稳定。
在一些实施方案中，包含嵌段共聚物的胶束包含壳嵌段和芯嵌段。在一些实施方案中，本文所述的胶束包含疏水性芯和亲水性壳。在一些实施方案中，本文所述的胶束是自我装配的。在一些实施方案中，胶束形成在没有多核苷酸存在时进行。在一些实施方案中，胶束形成在有多核苷酸存在时进行。在一些具体的实施方案中，本文所述的胶束是自发地自我装配的。
在一些实施方案中，胶束芯包含多个疏水性基团。在一些实施方案中，疏水性基团在约中性pH下是疏水性的。在一些更具体的实施方案中，疏水性基团在适度酸性pH(例如在pH约6和/或pH约5)下是更加疏水性的。在一些实施方案中，2、4、10、15、20或20个以上疏水性基团存在于聚合物嵌段上，该聚合物嵌段与其它类似的聚合物嵌段一起可以形成胶束芯。在一些实施方案中，疏水性基团具有约1或更高的π值。化合物的π值是其相对亲水性-亲脂性值的度量(例如，参见Cates，L.A.，″Calculation of Drug Solubilities by Pharmacy Students″Am.J.Pharm.Educ.45：11-13(1981))。
在一些具体的实施方案中，壳嵌段是亲水性的(例如约中性pH下)。在一些实施方案中，胶束在约4.7-约6.8的pH下去稳定或解离。
在一些情况中，本文提供了适合于给活细胞递送治疗剂(包括，例如寡核苷酸或肽类)的胶束组合物。在一些实施方案中，胶束包含多个嵌段共聚物和任选至少一种治疗剂。在一些实施方案中，本文提供的胶束是生物相容性的、稳定的(包括化学和/或物理稳定的)和/或可再现合成的。另外，在一些实施方案中，本文提供的胶束装配组合是无毒性的(例如显示低毒性)、可保护治疗剂(例如寡核苷酸或肽)净载荷(payload)免于降解、通过天然存在的过程(例如通过胞吞作用)进入活细胞和/或在接触细胞后将治疗剂(例如寡核苷酸或肽)净载荷递送入活细胞胞质。在一些情况中，多核苷酸(例如寡聚核苷酸)是siRNA和/或另一种改变细胞中至少一种基因表达的′基于核苷酸′的试剂。因此，在一些实施方案中，本文提供的胶束可用于将siRNA或肽递送入细胞。在一些情况中，细胞是体外的，而在其他情况中，细胞是体内的(例如人体受试者)。在一些实施方案中，对有此需要(例如有具有敲低某一基因的需要，其中该基因能够被施用的siRNA敲低)的个体给予包含siRNA或肽的治疗有效量的胶束。在一些具体的情况中，本文所述胶束组合物可用于或被特别设计成用于将siRNA或肽递送至个体内被特异性地靶向的无冠词修饰或细胞。
定义
有关本申请应理解，除非另有特别指定，否则应用的单数形式包括复数形式，且反之亦然。即无冠词修饰或″一种(个)(a)″和″所述的(the)″均意指该词所修饰名称的一种(个)或多种(个)。例如，″所述聚合物″或″核苷酸″可以意指一种/个聚合物或核苷酸或多种/个聚合物或核苷酸。作为相同标记，除非也有另外特别指定或上下文中明显表明没有这种意图，否则″聚合物″和″核苷酸″可以意指一种/个聚合物或一种/个核苷酸和多种/个聚合物或核苷酸。
如本文所用的，如果两个部分或化合物通过任意相互作用保持在一起，作为非限制性实例，包括一个或多个共价键、一个或多个非共价相互作用(例如离子键、静力、范德瓦尔斯相互作用、其组合等)或其组合，则它们是″结合的″。
脂族或脂族基团：本文所用的术语″脂族″或″脂族基团″意指烃部分，可以是直链(即无支链的)、支链或环状(包括稠合、桥连和螺稠合的多环)并且可以是完全饱和的或可以包含一个或多个不饱和单元，但不是芳族的。除非另有指定，否则脂族基团包含1-20个碳原子。
阴离子性单体：本文所用的″阴离子性单体″或″阴离子性单体单元″是指这样的单体或单体单元，其具有以阴离子带电荷状态存在的基团，或以不带电荷状态存在、但处于不带电荷状态时能够变成阴离子带电荷状态(例如在除去亲电体例如质子(H+)，例如以pH依赖性方式)的基团。在一些情况中，该基团在约生理pH下基本上带负电，但在弱酸性pH下发生质子化并且基本上变成中性。这种基团的非限制性实例包括羧基、巴比妥酸及其衍生物、黄嘌呤及其衍生物、硼酸、次膦酸类、膦酸类、亚磺酸类、磷酸盐/酯类和磺酰胺类。
阴离子性种类：本文所用的″阴离子性种类″是这样的基团、残基或分子，其以阴离子带电荷状态存在，或以不带电荷状态存在，但处于不带电荷状态时能够变成阴离子带电荷状态，例如在除去亲电体时(例如质子(H+)，例如以pH依赖性方式)。在一些情况中，这种基团、残基或分子在约生理pH下基本上带负电，但在弱酸性pH下发生质子化并且基本上变成中性。
芳基或芳基基团：本文所用的术语″芳基″或″芳基基团″意指具有总计5-14个环成员的单环、双环和三环环系，其中该环系中至少一个环是芳族的，且其中该环系中的每一个环都包含3-7个环成员。
杂烷基：术语″杂烷基″意指其中至少一个骨架碳原子被杂原子替代的烷基。
杂芳基：术语″杂芳基″意指其中至少一个环成员是杂原子的芳基。
杂原子：术语″杂原子″意指非氢或碳的原子，例如氧、硫、氮、磷、硼、砷、硒或硅原子。
如本文所用的，如果胶束不以与稳定的胶束相同、基本上类似或类似的方式起作用和/或具有相同、基本上类似或类似的物理和/或化学特征，则它是″破裂的″。胶束的″破裂″可以以任意适合的方式测定。在一种情况中，如果胶束不具有低于包含相同嵌段共聚物并且作为在pH 7.4水溶液或人血清中形成的胶束之流体动力学粒度的5倍、4倍、3倍、2倍、1.8倍、1.6倍、1.5倍、1.4倍、1.3倍、1.2倍或1.1倍的流体动力学粒度，则它是″破裂的″。在一种情况中，胶束不具有低于包含相同嵌段共聚物并且在pH 7.4水溶液或人血清中形成的胶束之装配体浓度的5倍、4倍、3倍、2倍、1.8倍、1.6倍、1.5倍、1.4倍、1.3倍、1.2倍或1.1倍的装配体浓度，则它是″破裂的″。
如本文所用的，″可带电荷的种类″、″可带电荷的基团″或″可带电荷的单体单元″是带电荷或不带电荷状态的种类、基团或单体单元。在一些情况中，″可带电荷的单体单元″是可以通过添加或除去亲电体(例如质子(H+)，例如以pH依赖性方式)转化成带电荷状态(阴离子性或阳离子性带电荷状态)的单体单元。除非另有说明，否则应用的任意术语″可带电荷的种类″、″可带电荷的基团″或″可带电荷的单体单元″包括公开″可带电荷的种类″、″可带电荷的基团″或″可带电荷的单体单元″中的任意其他用语。作为″带电荷或可带电荷成为阴离子″或″带电荷或可带电荷成为阴离子性种类″的″可带电荷种类″是阴离子性的带电荷状态或不带电荷状态的种类或基团，但在不带电荷状态下能够通过例如除去亲电体例如质子(H+)而被转化成阴离子性的带电荷状态。在一些具体的实施方案中，可带电荷的种类是在约中性pH下带电荷成为阴离子的种类。应强调的是，并非聚合物上的每一可带电荷的种类在接近该可带电荷种类的pKa(酸解离常数)的pH下是阴离子性的，而是阴离子性和非阴离子性种类的平衡共存。属″带电荷或可带电荷成为阳离子″或″带电荷或可带电荷成为阳离子性种类″的″可带电荷的种类″是阳离子性的带电荷状态或不带电荷状态的种类或基团，但在不带电荷状态下能够通过例如添加亲电体例如质子(H+)而被转化成阳离子性的带电荷状态。在一些具体的实施方案中，带电荷的种类是在约中性pH下带电荷成为阳离子的种类。应强调，并非聚合物上的每一带电荷的阳离子性种类在接近该带电荷的阳离子性种类的pKa(酸解离常数)的pH下是阳离子性的，而是阳离子性和非阳离子性种类的平衡共存。本文所述的″可带电荷的单体单元″与″可带电荷的单体残基″互换使用。
本文所用的″基本上不带电荷″或″电荷中和的″包括±10-±30mV的ζ电位和/或存在第一数目(z)的可带负电荷的可带电荷种类(例如在去质子化时变成阴离子性的酸性种类)和第二数目(0.5-z)的可带正电荷的可带电荷种类(例如在质子化时变成阳离子性的碱性种类)。
本文所用的″连接部分″或″连接基″是用于连接RNAi试剂例如寡核苷酸和/或靶向剂与嵌段共聚物的化学键或多官能(例如双官能)残基。连接部分包含任意各种化合物，它们可以形成酰胺、酯、醚、硫醚、氨基甲酸酯、脲、胺或其他键，例如常用于亲和色谱法中固定生物分子的键。在一些实施方案中，连接部分包含可裂解的键，例如在一些胞内参数(例如pH或氧化还原电位)改变时不稳定和/或裂解的键。在一些实施方案中，连接部分不能被裂解。在一些实施方案中，连接部分与RNAi试剂或靶向剂通过一个或多个共价键连接。在一些实施方案中，连接部分通过一个或多个共价键与pH-依赖性膜去稳定化聚合物连接。
疏水性种类：本文所用的″疏水性种类″(本文可与″增强疏水性的部分″互换使用)是例如这样的取代基、残基或基团这样的部分，其在与分子例如单体或聚合物共价连接时，能增加分子的疏水性或用作增强疏水性的部分。术语″疏水性″是描述根据化合物在非极性溶剂与水之间的转移自由能衡量的物理特性的专门术语(Hydrophobicity regained.Karplus P.A.，Protein ScL，1997，6：1302-1307.)化合物的疏水性可以根据其logP值即分配系数(P)的对数确定，其被定义为化合物在两种不能溶混的溶剂例如辛醇和水的混合物的两相中的浓度比。疏水性的实验测定方法和计算机辅助的logP值计算方法是本领域技术人员公知的。本发明的疏水性种类包括、但不限于脂族基团、杂脂族基团、芳基和杂芳基。
本文所用的″疏水芯″包含疏水性部分。在一些情况中，″疏水芯″基本上不带电荷(例如电荷是基本上净中性的)。
不受权利要求中没有特别引述的理论约束，膜去稳定化聚合物可以直接或间接引起细胞膜结构(例如内体膜)的改变(例如渗透性改变)，以便允许活性剂例如多核苷酸(其与胶束(或其组成聚合物)缔合或与之独立地)通过这种膜结构-例如进入细胞或离开细胞囊泡(例如内体)。膜去稳定化聚合物可以是(但不一定是)膜破裂性聚合物。膜破裂性聚合物可以直接或间接引起细胞囊泡的裂解或细胞膜破裂(例如针对大部分细胞膜群体所观察到的)。
一般而言，可以通过各种方式评价聚合物或胶束的膜去稳定化或膜破裂特性。在一种非限制性手段中，可以通过试验评价来观察细胞膜结构改变，所述试验用于测定(直接或间接)活性剂(例如多核苷酸)从细胞膜(例如内体膜)的释放-例如通过在对这种膜而言是外部的环境中测定这种活性剂的存在或不存在或者这种活性剂的活性。另一种非限制性手段包括测定红细胞溶解(溶血)-例如作为所关注细胞膜的替代试验。这种试验可以在单一pH值下或在一个pH值范围内进行。
本文所用的″胶束″包括包含芯和亲水壳的颗粒，其中芯至少部分地、主要地或基本上通过疏水性相互作用而保持在一起。在一些情况中，本文所用的″胶束″是多成分纳米粒，其包含至少两个结构域，即内域或芯和外域或壳。芯至少部分地、主要地或基本上通过疏水性相互作用而保持在一起，并且存在于胶束中心。本文所用的″胶束壳″定义为胶束的非芯部分。
″pH依赖性膜去稳定化疏水物″是至少部分地、主要地或基本上疏水性并且以pH依赖性方式使膜去稳定化的基团。在一些情况中，pH依赖性膜去稳定化的可带电荷的疏水物是嵌段共聚物的疏水性聚合节段和/或包含多个疏水性种类；并且包含多个阴离子性可带电荷的种类。在一些实施方案中，该阴离子性可带电荷的种类在约中性pH下是阴离子性的。在另一些或可替代选择的实施方案中，该阴离子性的可带电荷种类在较低例如内体pH下不带电荷。在一些实施方案中，使膜去稳定化的可带电荷的疏水物包含多个阳离子性种类。该pH依赖性的膜去稳定化的可带电荷疏水物包含非肽和非脂质的聚合物骨架。
如本文所用的，正常生理pH意指哺乳动物体的主要流体例如血液、血清、正常细胞细胞溶胶等的pH。在一些情况中，正常生理pH约为中性pH，包括例如pH约7.2-约7.4。在一些情况中，约中性pH是pH 6.6-7.6。本文所用的术语中性pH、生理和生理学pH是同义词并且可互换使用。
如本文所用的，如果胶束这一装配体在代表生理条件的水溶液例如在pH 7.4的磷酸缓冲盐水中不解离或变得不稳定，则它被描述为“稳定的”。可以通过临界胶束浓度(CMC)定量地定义胶束的稳定性，该临界胶束浓度被定义为不稳定性发生时的胶束浓度，如疏水性探针分子的摄取(例如芘荧光测定)或胶束大小的改变(例如根据动态光散射测量测定)所显示的。在一些情况中，稳定的胶束是其流体动力学粒度在包含相同嵌段共聚物并且最初在pH 7.4水溶液(例如磷酸缓冲盐水，pH 7.4)中形成的胶束之流体动力学粒度的约60％、50％、40％、30％、20％或10％范围内的胶束。在一些情况中，稳定的胶束是其形成/装配浓度在包含相同嵌段共聚物并且最初在pH 7.4水溶液(例如磷酸缓冲盐水，pH 7.4)中形成的胶束之形成/装配浓度的约60％、50％、40％、30％、20％或10％范围内的胶束。
如本文所用的，如果胶束不以与稳定胶束相同、基本上类似或类似的方式起作用和/或不具有与稳定胶束相同、基本上类似或类似的物理和/或化学特征，则它是“去稳定化的”。可以以任意适合的方式确定胶束的任意″去稳定化″。在一种情况中，如果胶束不具有低于包含相同嵌段共聚物并且在pH 7.4的水溶液或人血清中形成的胶束之流体动力学粒度的5倍、4倍、3倍、2倍、1.8倍、1.6倍、1.5倍、1.4倍、1.3倍、1.2倍或1.1倍的流体动力学粒度，则它是“去稳定化的”。在一种情况中，如果胶束不具有低于包含相同嵌段共聚物并且在pH 7.4的水溶液或人血清中形成的胶束之装配浓度的5倍、4倍、3倍、2倍、1.8倍、1.6倍、1.5倍、1.4倍、1.3倍、1.2倍或1.1的装配浓度，则它是“去稳定化的”。
纳米粒：如本文所用的，术语″纳米粒″意指具有低于1000纳米(nm)的直径的任意颗粒。一般而言，纳米粒应具有小到足以使其被真核细胞摄取的尺寸。典型地，纳米粒具有的最长直线尺寸(例如直径)为200nm或更低。在一些实施方案中，纳米粒具有的直径为100nm或更低。较小的纳米粒，例如具有直径约10nm-约200nm、约20nm-约100nm、约10nm-约50nm或10nm-30nm的纳米粒被用于一些实施方案中。
寡核苷酸敲低剂：如本文所用的，″寡核苷酸敲低剂″是这样的寡核苷酸种类，它们可以通过以序列特异性方式靶向和结合胞内核酸来抑制基因表达。寡核苷酸敲低剂的非限制性实例包括siRNA、miRNA、shRNA、切丁酶(dicer)底物、反义寡核苷酸、诱饵DNA或RNA、反基因寡核苷酸及其任意类似物和前体。
如本文所用的，术语″核苷酸″在其最广义上意指掺入或可以掺入多核苷酸(例如寡核苷酸)链的任意化合物和/或物质。在一些实施方案中，核苷酸是通过磷酸二酯键掺入或可以掺入多核苷酸(例如寡核苷酸)链的化合物和/或物质。在一些实施方案中，″核苷酸″意指各核酸残基(例如核苷酸和/或核苷)。在一些实施方案中，″至少一个核苷酸″意指存在一个或多个核苷酸；在不同的实施方案中，所述一个或多个核苷酸是不连续的核苷酸、彼此以非共价键方式结合或彼此以共价键方式结合。照此，在一些情况中，″至少一个核苷酸″意指一个或多个多核苷酸(例如寡核苷酸)。在一些情况中，多核苷酸是包含至少两个核苷酸单体单元的聚合物。
如本文所用的，术语″寡核苷酸″意指包含7-200个核苷酸单体单元的聚合物。在一些实施方案中，″寡核苷酸″包括单和或/双链RNA以及单和/或双链DNA。此外，术语″核苷酸″、″核酸″、″DNA″、″RNA″和/或类似术语包括核酸类似物，即具有被修饰的骨架的类似物，包括、但不限于肽核酸(PNA)、锁定的核酸(LNA)、膦酰基-PNA、吗啉代核酸或具有被修饰的磷酸酯基的核酸(例如硫代磷酸酯、膦酸酯、5′-N-亚磷酰胺键)。核苷酸可以纯化自天然来源、使用重组表达系统产生并任选地纯化、化学合成等。本文所用的″核苷″是描述包含单糖和碱基的化合物的术语。单糖包括、但不限于戊糖和己糖单糖。单糖还包括通过用卤素、甲氧基、氢或氨基取代羟基或通过酯化其他羟基而修饰的单糖模拟物和单糖。在一些实施方案中，核苷酸是或包含天然核苷磷酸酯(例如腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷磷酸酯)。在一些实施方案中，碱基包括天然存在于各种核酸中的任意碱基和其他模拟或类似这种天然存在碱基的修饰物。被修饰或衍生的碱基的非限制性实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫脲苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-galactosylqueosine、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫脲嘧啶、β-D-mannosylqueosine、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸、怀丁苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸、5-甲基-2-硫脲嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、2-氨基腺嘌呤、吡咯并嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。核苷碱基还包括通用核碱基例如二氟甲苯基、硝基吲哚基、硝基吡咯基或硝基咪唑基。核苷酸还包括携有标记或包含脱碱基即缺乏碱基的单体的核苷酸。除非另有指示，否则核酸序列以5′-3′方向显示。核苷酸可以以序列特异性方式通过经Watson-Crick碱基对的氢键结合另一个核苷酸。这种碱基对被称为彼此互补。寡核苷酸可以是单链、双链或三链的。
RNAi试剂：本文所用的术语″RNAi试剂″意指可以通过RNAi机制介导基因表达抑制的寡核苷酸，并且包括、但不限于siRNA、microRNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、切丁酶底物及其前体。
短干扰RNA(siRNA)：本文所用的术语″短干扰RNA″或″siRNA″意指包含约15-50个碱基对长度且任选包含0-2个单链突出端的核苷酸双链体的RNAi试剂。siRNA的一个链包括与以互补方式与靶RNA杂交的部分。在一些实施方案中，siRNA与靶RNA的被靶向部分之间可能存在一个或多个错配。在一些实施方案中，siRNAs通过导致靶转录物降解而介导基因表达抑制。
短发夹RNA(shRNA)：短发夹RNA(shRNA)意指具有至少两个杂交或能够彼此杂交形成双链(双链体)结构的互补性部分和至少一个单链部分的寡核苷酸。
切丁酶底物：″切丁酶底物″是大于约25个碱基对的双链体RNA，其为细胞中RNase III家族成员切丁酶(Dicer)的底物。切丁酶底物被切割而产生约21个碱基对的双链体小干扰RNAs(siRNAs)，它引起RNA干扰效应，从而通过mRNA敲低而引起基因沉默。
治疗剂：本文所用的术语″治疗剂″意指在对受试者、器官、组织或细胞给药时具有治疗效果和/或引起期望的生物学和/或药理学效应的任意活性剂，包括、但不限于多核苷酸、寡核苷酸、RNAi试剂、肽类和蛋白质。
治疗有效量：如本文所用的，术语治疗剂的″治疗有效量″意指在对患有或易感疾病、障碍和/或病症的受试者给药时足以治疗、诊断、预防和/或延缓该疾病、障碍和/或病症症状发作的用量。
胶束特性
本文提供了用于胞内递送诊断试剂和/或治疗剂(例如寡核苷酸、肽类等)的胶束。在一些实施方案中，这种胞内递送是体外的；在其他实施方案中，这种胞内递送是体内的。在一些实施方案中，本文提供的胶束被特别设计用于在受试者治疗干预的期望部位靶向递送胶束净载荷。在一些实施方案中，本文所述的胶束具有一些期望的特性。例如，在一些情况中稳定(例如在中性/生理pH)、而在其他情况中稳定性较低(例如在更具酸性pH下)的胶束是期望的。因此，本文提供的材料公开了有助于这种期望胶束特性的一些参数。
在一些实施方案中，本文提供的胶束在生理条件下稳定并且具有防止不期望的胶束解离的临界胶束浓度。在其他或可替代选择的实施方案中，胶束的完整性(例如在生理环境中)还依赖于构成胶束的嵌段共聚物的组成。因此，本文提供了一些参数(例如胶束壳嵌段与芯嵌段中的嵌段共聚物的数均分子量比、嵌段共聚物中带电荷部分的数量等)，这些参数被改造成提供适合于以最低毒性和/或胶束净载荷损失而有效胞内递送治疗剂的胶束。
因此，本文描述了包含胶束和与该胶束缔合的多核苷酸的组合物，所述胶束包含多个嵌段共聚物，它们缔合而使得该胶束在约中性pH下的含水介质中稳定。此外，本文所述的胶束具有至少一种如下特性：
(i)胶束包含约10-约100个嵌段共聚物/胶束；
(ii)约0.2ug/mL-约20ug/mL的临界胶束浓度CMC；
(iii)在没有核酸存在下自发胶束装配；
(iv)约5nm-约500nm的粒度；
(v)约0.5x 106-约3.6x 106道尔顿的重均分子量。
在一些实施方案中，本文提供的任意胶束的特征在于具有至少两种上述举出的特性。在一些实施方案中，本文提供的任意胶束的特征在于具有至少三种上述举出的特性。在一些实施方案中，本文提供的任意胶束的特征在于具有全部上述举出的特性。在一些实施方案中，本文所述的胶束对环境介质的高离子强度(例如0.5M NaCl)稳定；和/或所述胶束在有机溶剂浓度增加时具有增加的不稳定性，这种有机溶剂包括、但不限于二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMS)，和二噁烷。
胶束组成
本文提供的胶束包含多个聚合物/胶束。在一些实施方案中，所述聚合物是共聚物。在进一步的实施方案中，所述共聚物是嵌段共聚物。嵌段共聚物是单嵌段共聚物或多嵌段共聚物(例如二嵌段共聚物)。本文所用的术语″共聚物″表示该聚合物是两种或更多种不同单体聚合的结果。″单嵌段共聚物″是单一聚合步骤的合成产物。术语单嵌段聚合物包括共聚物(即一种以上类型单体聚合的产物)和均聚物(即单一类型单体的聚合产物)。″嵌段″共聚物意指包含一个或多个组成性或单体单元的亚组合的结构。在一些实施方案中，在聚合物中发现的单体残基被进一步修饰，以得到组成性单元。在一些实施方案中，本文所述的嵌段共聚物包含非脂质的组成性或单体单元。在一些实施方案中，嵌段共聚物是二嵌段共聚物。二嵌段共聚物包含两个嵌段；这种聚合物的图示概括表示如下：[AaBbCc...]m-[XxYyZz...]n，其中每个字母表示结构单元或单体单元，并且其中每个结构单元的下标表示该具体嵌段中该单元的摩尔分数，三个点表示每个嵌段中可以存在更多(也可以更少)个单体单元，m和n表示二嵌段共聚物中每个嵌段的分子量。正如图示提示的，在一些情况中，对每个嵌段分别控制每个结构单元的数量和性质。图示并不意味着且不应解释为推定各嵌段中单体单元数或不同类型单体单元数之间何种情况下的任何关系。该图示也不意味着描述具体嵌段内的单体单元的任意具体数量或排列。在每一嵌段中，除非另有特别描述，否则单体单元可以以纯粹随机、交替随机、规整交替、规整嵌段或随机嵌段结构形式排列。例如，纯粹随机结构可以具有形式(非限制性的)：x-x-y-z-x-y-y-z-y-z-z-z...。非限制性的示例性交替随机结构可以具有形式(非限制性的)：x-y-x-z-y-x-y-z-y-x-z...，示例性的规整交替结构可以具有形式(非限制性的)：x-y-z-x-y-z-x-y-z...。示例性的规整嵌段结构可以具有如下结构(非限制性的)：...x--x--x-y-y-y-z-z-z-x-x-x...，而示例性的随机嵌段结构可以具有结构(非限制性的)：...x-x-x-z-z-x-x-y-y-y-y-z-z-z-x-x-z-z-z-...。在梯度聚合物中，一个或多个单体单元的含量以梯度方式从聚合物的α端值增加或减少到ω端值。在上述一般实例中无一指的是单个结构单元或嵌段的具体并列或嵌段中的单体单元的数量或嵌段数量，也不应将它们视为以任何方式具有或限制形成本发明胶束的嵌段共聚物的实际结构。
如本文所用的，括入单体单元的括号并非意指且并非视为意指单体单元自身形成嵌段。即方括号内的单体单元可以以任意方式与嵌段内的其他单体单元组合，即纯粹随机、交替随机、规整交替、规整嵌段或随机嵌段结构。本文所述的共聚物是任选、交替、梯度或随机共聚物。在一些情况中，该共聚物主要由随机共聚物组成。
在一些实施方案中，本文所述的胶束包含约10-约500个嵌段共聚物/胶束。在一些实施方案中，本文所述的胶束包含约10-约250个嵌段共聚物/胶束。在一些实施方案中，本文所述的胶束包含约10-约100个嵌段共聚物/胶束。在一些实施方案中，本文所述的胶束包含约30-约50个嵌段共聚物/胶束。
胶束形成和稳定性
在一些实施方案中，本文提供的胶束通过在从水易溶混溶剂(例如、但不限于乙醇)稀释到含水溶剂(例如磷酸缓冲盐水，pH 7.4)时嵌段共聚物自发自我缔合形成有组织的装配物(例如胶束)而形成。在一些实施方案中，胶束形成通过直接将聚合物的干燥形式溶于含水溶剂而发生。在一些实施方案中，自发胶束形成在没有多核苷酸或寡核苷酸存在时发生。
在一些实施方案中，本文所述的胶束在从水易溶混溶剂(例如、但不限于乙醇)稀释到pH约7.4-约5.5的含水溶剂时稳定。在一些实施方案中，本文所述的胶束在从水易溶混溶剂(例如、但不限于乙醇)稀释到pH约7.4-约6.8的含水溶剂时稳定。在一些实施方案中，本文所述的胶束在从水易溶混溶剂(例如、但不限于乙醇)稀释到pH约7.4、约7.2、约7.0、约6.8、约6.4、约6.2、约6.0或约5.8的含水溶剂时稳定。在一些实施方案中，本文提供的胶束在含水介质中稳定。在一些实施方案中，本文提供的胶束在选择的pH例如约生理pH(例如循环人血浆pH)下、在含水介质中稳定。在一些具体的实施方案中，本文提供的胶束在约中性pH(例如在pH约7.4)下、在含水介质中稳定。在一些具体的实施方案中，所述含水介质是动物(例如人)血清或动物(例如人)血浆。应理解胶束的稳定性不限于所指定的pH，而是在最低限度包括该指定pH的pH值下稳定。在一些具体的实施方案中，本文所述的胶束在酸性pH下基本上比在约中性pH下稳定性低。在一些更具体的实施方案中，本文所述的胶束在pH约5.8下的稳定性基本上低于在pH约7.4下的稳定性。
在一些具体的实施方案中，在约中性pH下，本文所述的胶束在约10ug/mL、约50ug/mL、约100ug/mL、约200ug/mL或约250ug/mL的浓度下稳定。
在一些实施方案中，胶束对在水溶液中稀释稳定。在一些具体的实施方案中，胶束对在生理pH(例如人体内循环血液的pH)下的稀释稳定，其中临界稳定性浓度(例如临界胶束浓度(CMC))为约100ug/mL-约0.1ug/mL、约100ug/mL-约1ug/mL、约50ug/mL-约1ug/mL、约50-约10ug/mL。在一些实施方案中，在生理pH下胶束的CMC低于100ug/mL、低于50ug/mL、低于10ug/mL、低于5ug/mL或低于2ug/mL。本文所用的″胶束去稳定化″意指形成胶束的聚合物链至少部分解聚、结构改变(例如尺寸上扩展和/或形状改变)和/或可以形成无定形的超分子结构(例如非胶束超分子结构)。术语临界稳定性浓度(CSC)、临界胶束浓度(CMC)和临界装配浓度(CAC)在本文中可以互换使用。在一些实施方案中，本文所述的胶束对构成临界稳定性浓度或临界胶束浓度(CMC)的稀释稳定。
在一些实施方案中，本文所述任何胶束的临界稳定性浓度或临界胶束浓度CMC在约中性pH下约为100ug/mL-约0.1ug/mL。在一些实施方案中，本文所述任意胶束的CMC在约中性pH下为约80ug/mL-约0.2ug/mL、约60ug/mL-约0.2ug/mL、约40ug/mL-约0.2ug/mL、约20ug/mL-约0.2ug/mL或约10ug/mL-约0.2ug/mL。在一些实施方案中，本文所述胶束的CMC在约中性pH下为约100ug/mL、约90ug/mL、约80ug/mL、约70ug/mL、约60ug/mL、约50ug/mL、约40ug/mL、约30ug/mL、约20ug/mL、约10ug/mL、约5ug/mL、约1ug/mL、约0.5ug/mL或约0.2ug/mL。
在一些实施方案中，本文所述任意胶束在内体裂解性pH(例如pH约5)下的临界胶束浓度或CMC比该胶束在约中性pH(例如pH约7.4)下的CMC高大约20-倍。在一些实施方案中，本文所述任意胶束在内体裂解性pH(例如pH约5)下的临界胶束浓度或CMC比该胶束在约中性pH(例如pH约7.4)下的CMC高大约10-倍。在一些实施方案中，本文所述任意胶束在内体裂解性pH(例如pH约5)下的临界稳定性浓度或CMC比该胶束在约中性pH(例如pH约7.4)下的CMC高大约5-倍或约2-倍。
在一些实施方案中，本文所用任意胶束在内体裂解性pH(例如pH约5)下的临界胶束浓度或CMC为约100ug/mL-约0.5ug/mL、约80ug/mL-约1ug/mL、约60ug/mL-约1ug/mL、约40ug/mL-约1ug/mL、约20ug/mL-约1ug/mL或约10ug/mL-约1ug/mL。在一些实施方案中，本文所述胶束在约内体裂解性pH的CMC为约100ug/mL、约90ug/mL、约80ug/mL、约70ug/mL、约60ug/mL、约50ug/mL、约40ug/mL、约30ug/mL、约20ug/mL、约10ug/mL、约5ug/mL、约1ug/mL或约0.5ug/mL。
粒度
在一些实施方案中，所述胶束是纳米粒。在一些具体的实施方案中，所述胶束是真胶束。在进一步的实施方案中，所述胶束是在不与生物活性剂缀合时具有约10nm-约200nm、约10nm-约100nm或约30-80nm平均流体粒度的纳米粒或胶束。可以以任意方式测定粒度，包括、但不限于凝胶渗透色谱法(GPC)、动态光散射(DLS)、电子显微镜检查技术(例如TEM)和其他方法。
在一些具体的实施方案中，本文所述的胶束包含嵌段共聚物，其(例如以离子方式和/或共价方式)与生物活性剂(例如多核苷酸(例如siRNA)、诊断试剂和/或靶向剂(例如抗体))缔合并且具有不超过约500nm、不超过约450nm、不超过约400nm、不超过约350nm、不超过约300nm或不超过约250nm、不超过约200nm、不超过约150nm、不超过约100nm或不超过约50nm的粒度。
多核苷酸载荷
在一些实施方案中，本文所述的胶束(例如以离子方式和/或共价方式)与1-约10,000个多核苷酸缔合。在一些实施方案中，本文所述的胶束与约4-约5000个、约10-约4000个、约15-约3000个或约30-约2500个多核苷酸缔合。在一些实施方案中，胶束与多核苷酸的电荷比为约5∶1-约1∶1。在一些实施方案中，胶束与多核苷酸的电荷比为约4∶1、约3∶1、约2∶1或约1∶1。
聚合物结构和特性
在一些实施方案中，本文所述的嵌段共聚物包含亲水性嵌段和疏水性嵌段。在一些实施方案中，至少一种这种嵌段是梯度聚合物嵌段。在进一步的实施方案中，本文使用的嵌段共聚物任选地被梯度聚合物取代(即用于胶束的聚合物是具有疏水性嵌段和亲水性嵌段的梯度聚合物)。
亲水性嵌段
在一些实施方案中，亲水性嵌段是壳嵌段，并且例如是不带电荷的、阳离子性、聚阳离子性、阴离子性、聚阴离子性或两性离子性嵌段。在一些实施方案中，亲水性嵌段是中性的(不带电荷)。在一些具体的实施方案中，亲水性嵌段包含净正电荷。在一些具体的实施方案中，亲水性嵌段包含净负电荷。在一些具体的实施方案中，亲水性嵌段为净电中性。
在一些实施方案中，亲水性嵌段是包含单一单体的均聚物嵌段。在其他实施方案中，亲水性嵌段包含多个一种或多种亲水性单体单元(例如DMAEMA、PEGMA、HPMA、丙烯酸寡乙二醇酯、NIPAAM等中的一种或多种)。在一些实施方案中，亲水性单体单元包含亲水性基团(例如羟基、硫氢基、PEG基或其他聚氧化烷基等或其组合)。在一些实施方案中，亲水性单体单元基本上不能带电荷，例如意味着该亲水性单体单元在生理pH(例如pH约中性，例如7.2-7.4)下基本上不带电荷。在一些实施方案中，嵌段共聚物包含5个以上、10个以上、20个以上、50个以上或100个以上亲水性基团或种类。
在一些实施方案中，本文所述的嵌段共聚物各自具有：(1)中性或不带电荷(例如基本上不带电荷)的亲水性嵌段；和(2)形成胶束疏水芯的疏水性嵌段(例如芯嵌段)，该胶束通过形成芯的聚合节段的疏水相互作用被稳定化。在一些实施方案中，中性或不带电荷的亲水性嵌段包含多个中性单体残基，例如PEGMA或HPMA。
在一些实施方案中，本文所述的嵌段共聚物各自具有：(1)阳离子性或聚阳离子性带电荷的亲水性嵌段；和(2)形成通过形成芯的聚合节段的疏水相互作用被稳定化的胶束疏水芯的疏水性嵌段(例如芯嵌段)。在一些实施方案中，亲水性嵌段包含多个阳离子性单体残基，例如DMAEMA。在一些这种实施方案中，多核苷酸与亲水性嵌段中的阳离子性种类离子性缔合。
在一些实施方案中，本文所述的嵌段共聚物各自具有：(1)阴离子或聚阴离子带电荷的亲水性嵌段；和(2)形成通过形成芯的聚合节段的疏水相互作用稳定的胶束疏水芯的疏水性嵌段(例如芯嵌段)。在一些实施方案中，阴离子或聚阴离子带电荷的亲水性嵌段包含多个阴离子性单体残基，例如马来酸酐或丙烯酸。
在一些实施方案中，本文所述的嵌段共聚物各自具有：(1)两性离子或聚两性离子带电荷的亲水性嵌段；和(2)形成通过形成芯的聚合节段的疏水相互作用稳定的胶束疏水芯的疏水性嵌段(例如芯嵌段)。
疏水性嵌段
在一些实施方案中，本文所述任意嵌段共聚物的疏水性嵌段包含多个疏水性基团、部分、单体单元、种类等。在一些实施方案中，本文所述任意嵌段共聚物的疏水性嵌段包含多个疏水性基团、部分、单体单元、种类等和多个可带电荷的结构单元或单体单元。
在一些实施方案中，嵌段共聚物包含疏水性嵌段，该疏水性嵌段包含第一种和第二种结构单元。在一些实施方案中，第一种结构单元包含去质子化时的阴离子性种类。在一些实施方案中，第一种结构单元在酸性pH(例如内体裂解性pH、pH低于约6.5、pH低于约6.0、pH低于约5.8、pH低于约5.7，等)下不带电荷。在一些实施方案中，第一种结构单元如本文所述且第二种结构单元在质子化时是阳离子性种类。在一些具体的实施方案中，第二种结构单元的pKa为约6-约10、约6.5-约9、约6.5-约8、约6.5-约7.5或任意其他适合的pKa。
在一些实施方案中，本文所述的任意嵌段共聚物的疏水性嵌段还包含疏水性基团、部分、单体单元、种类等。在一些实施方案中，疏水性单体单元包含疏水性基团，例如、但不限于烷基、杂烷基、芳基或杂芳基。在一些实施方案中，嵌段共聚物包含与聚合物骨架连接并且屏蔽邻位可带电荷的结构单元(例如阴离子性种类(例如羧酸基团))的疏水性基团，由此减少或防止胶束解离。在一些实施方案中，嵌段共聚物的疏水性嵌段包含5个以上、10个以上、20个以上、50个以上或100个以上疏水性基团或种类。在一些实施方案中，疏水性种类存在于阴离子可带电荷的单体单元上。在一些实施方案中，疏水性单体单元与包含阴离子可带电荷的结构单元的单体单元之比在约中性pH下为约1∶6到约1∶1、约1∶5到约1∶1、约1∶4到约1∶1、约1∶3到约1∶1、约1∶2到约1∶1。
在一些实施方案中，作为非限制性实例，疏水性单体单元是甲基丙烯酸丁酯、丙烯酸丁酯、苯乙烯等。在一些具体的实施方案中，本文使用的疏水性单体单元是衍生自(C2-C8)烷基丙烯酸的(C2-C8)烷基酯的单体单元。
在一些更具体的实施方案中，本文所述嵌段共聚物的疏水性嵌段包含多个阳离子单体单元和多个阴离子性单体单元。在一些更具体的实施方案中，疏水性嵌段包含基本上类似数量的阳离子和阴离子性种类(即胶束的疏水性嵌段和/或芯基本上净中性)。在一些实施方案中，在嵌段共聚物的疏水性嵌段中存在基本上类似数量的阳离子和阴离子性种类提供了在约中性pH下基本上为净中性的胶束疏水性嵌段和/或芯。
阴离子结构单元
在一些实施方案中，本文所述的嵌段共聚物包含多个阴离子结构单元，它们在生理pH下为阴离子。在一些实施方案中，阴离子结构单元包含可质子化的阴离子性种类。在一些实施方案中，本文所述的嵌段共聚物包含多个阴离子结构单元且每个阴离子结构单元是不带电荷的布郎斯台德酸单体残基(即结构单元是布郎斯台德酸的共轭碱)。在本文所述的各种实施方案中，本文所述在生理pH下为阴离子或带负电荷的结构单元(包括，例如一些亲水性结构单元)包含一个或多个酸性基团或其共轭碱。阴离子结构单元的非限制性实例包括包含羧酸、磺酰胺、硼酸、磺酸、亚磺酸、硫酸、磷酸、次膦酸等和或其组合的单体残基。在一些实施方案中，作为非限制性实例，本文使用的在正常生理pH下为阴离子或带负电荷的结构单元包括丙烯酸的单体残基、C2-C8烷基丙烯酸单体(例如甲基丙烯酸、乙基丙烯酸、丙基丙烯酸、丁基丙烯酸等)等。
当生理流体的pH约为阴离子性种类的pKa时，可带电荷种类的两种形式平衡分布。就阴离子性种类而言，当pH是阴离子性种类的pKa时，约50％的群体为阴离子，约50％不带电荷。pH越远离可带电荷种类的pKa，这种平衡将存在相应移动，使得在更高pH值下，阴离子占优势，而在更低pH值下，不带电荷形式占优势。本文所述的实施方案包括在任意pH值下的嵌段共聚物形式。
在一些实施方案中，在正常生理pH下为阴离子的结构单元包含羧酸，例如、但不限于2-丙基丙烯酸的单体残基(即从其衍生的结构单元，2-丙基丙烯酸，-CH2C((CH2)2CH3)(COOH)-(PAA))，不过，可以作为被保护种类例如酯或游离酸而在选择的聚合过程中存在的任意有机酸或无机酸也在本发明关注的范围内。本文所述的阴离子性单体残基或结构单元包含阴离子带电荷或可带电荷的种类，包括可质子化的阴离子性种类。在一些情况中，阴离子性单体残基在约中性pH下可以是阴离子性的。
单体例如马来酸酐(Scott M.Henry，Mohamed E.H.El-Sayed，Christopher M.Pirie，Allan S.Hoffman，and Patrick S.Stayton″pH-Responsive Poly(styrene-alt-maleic anhydride)alkylamide Copolymers for Intracellular Drug Delivery″Biomacromolecules7：2407-2414，2006)也可以用于将阴离子性种类引入疏水性嵌段。在这种实施方案中，带负电荷的结构单元衍生自马来酸酐单体残基。
阳离子结构单元
在一些实施方案中，本文所述的嵌段共聚物包含在生理pH下为阳离子性或带正电荷的多个阳离子结构单元。在一些实施方案中，阳离子结构单元包含可去质子化的阳离子性种类。在一些实施方案中，本文所述的嵌段共聚物包含多个阳离子性结构单元且每个阳离子性结构单元是不带电荷的布朗斯台德碱单体残基(即结构单元是布朗斯台德碱的缀合酸)。布朗斯台德碱的非限制性实例包括包含二烷基氨基的单体。在一些实施方案中，阳离子性结构单元包含丙烯酸胺、丙烯酸亚胺、环胺、环亚胺、氨基、烷氨基、胍基、咪唑基、吡啶基、三唑基等或其组合。在一些实施方案中，作为非限制性实例，本文使用的在正常生理pH下为阳离子性的结构单元包括二烷基氨基烷基甲基丙烯酸酯类的单体残基(例如DMAEMA)。
当生理流体的pH约为阳离子性种类的pKa时，可带电荷种类的两种形式平衡分布。此外，pH越远离可带电荷种类的pKa，则这种平衡中存在相应移动，使得在更低pH值下，阳离子形式占优势，而在更高pH值下，不带电荷形式占优势。本文所述的实施方案包括在任意pH值下的嵌段共聚物形式。
中性和两性离子性结构单元
在本文所述的不同实施方案中，在生理pH下为中性的结构单元包含一种或多种亲水性基团，例如羟基、多羟化烷基、聚乙二醇、聚丙二醇、硫醇等。在一些实施方案中，作为非限制性实例，本文使用的在正常生理pH下为中性的亲水性结构单元包括聚乙二醇化丙烯酸、聚乙二醇化甲基丙烯酸、羟基烷基丙烯酸、羟基烷基链烷丙烯酸的单体残基(例如HPMA)等。
在本文所述的不同实施方案中，在生理pH下为两性离子性的结构单元包含在生理pH下为阴离子性的或带负电荷的基团和在生理pH下为阳离子性的或带正电荷的基团。在一些实施方案中，作为非限制性实例，本文使用的、在正常生理pH下为两性离子性的亲水性结构单元包括在生理pH下包含磷酸根基团和铵基的单体残基，例如在US 7,300,990(将该文献的这种公开内容引入本文)等中举出的。
嵌段共聚物组成
在一些实施方案中，第一种结构单元在去质子化时是阴离子性种类，第二种结构单元在质子化时是阳离子性种类，且在约中性pH下阴离子性种类与阳离子性种类之比为约1∶10到约10∶1、约1∶6到约6∶1、约1∶4到约4∶1、约1∶2到约2∶1、约1∶2到3∶2或约1∶1。在一些实施方案中，第一种可带电荷的结构单元与第二种可带电荷的结构单元之比为约1∶10和约10∶1、约1∶6和约6∶1、约1∶4和约4∶1、约1∶2和约2∶1、约1∶2和3∶2或约1∶1。
在一些实施方案中，嵌段共聚物中存在的可带电荷成为阴离子性种类、基团或单体单元的结构单元、基团或单体单元是在约中性pH(例如在pH约7.4)下至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％或至少95％带负电荷的种类、基团或单体单元。在一些具体的实施方案中，这些可带电荷的种类、基团或单体单元在约中性pH下因失去H+而使阴离子性种类带电荷。在其他或可替代选择的实施方案中，聚合物中存在的阴离子性种类、基团或单体单元可带电荷的可带电荷种类、基团或单体单元是在适度酸性pH(例如pH约6.5以下；约6.2以下；约6或以下；约5.9以下；约5.8以下；约5.7以下；约5.6以下；约5.5以下；约5.0以下；或约内体裂解性pH)下至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％或至少95％中性或不带电荷的种类、基团或单体单元。
在本文所述嵌段共聚物的具体实施方案中，每一结构单元存在于不同单体单元上。在一些实施方案中，第一种单体单元包含第一种可带电荷的种类。在其他或可替代选择的实施方案中，第二种单体单元包含第二种可带电荷的种类。在其他或可替代选择的实施方案中，第三种单体单元包含第三种可带电荷种类。
示例性结构
在一些实施方案中，嵌段共聚物(例如膜去稳定化的嵌段共聚物)具有化学式I：
Figure BDA0000039273700000271
在一些实施方案中，
A0、A1、A2、A3和A4选自-C-、-C-C-、-C(O)(C)aC(O)O-、-O(C)aC(O)-和-O(C)bO-；其中a是1-4；b是2-4；
Y4选自氢、(1C-10C)烷基、(3C-6C)环烷基、O-(1C-10C)烷基、-C(O)O(1C-10C)烷基、C(O)NR6(1C-10C)、(4C-10C)杂芳基和(6C-10C)芳基，它们中任意个任选被一个或多个氟基团取代；
Y0、Y1和Y2独立地选自共价键、(1C-10C)烷基-、-C(O)O(2C-10C)烷基-、-OC(O)(1C-10C)烷基-、-0(2C-10C)烷基-和-S(2C-10C)烷基-、-C(O)NR6(2C-10C)烷基-、-(4C-10C)杂芳基-和-(6C-10C)芳基-；
Y3选自共价键、-(1C-10C)烷基-、-(4C-10C)杂芳基-和-(6C-10C)芳基-；其中用适当数量的氢原子完成未完全被R1-R5和Y0-Y4取代的A1-A4四价碳原子；
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自氢、-CN、烷基、炔基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基，它们中任意个可以任选被一个或多个氟原子取代；
Q0是选自如下残基的残基，这些残基在生理pH下为亲水性的并且在生理pH下至少部分带正电荷(例如氨基、烷氨基、铵、烷基铵、胍、咪唑基、吡啶基等)；在生理pH下至少部分带负电荷，但在较低下发生质子化(例如羧基、磺酰胺、硼酸根、膦酸根、磷酸根等)；在生理pH下基本上呈中性(或不带电荷)(例如羟基、多羟化烷基、聚乙二醇、聚丙二醇、硫氢基等)；在生理pH下为至少部分两性离子性(例如在生理pH下包含磷酸根和铵基的单体残基)；可缀合或可官能化残基(例如包含反应性基团的残基，例如叠氮化物、炔、琥珀酰亚胺酯、四氟苯基酯、五氟苯基酯、对硝基苯基酯、吡啶基二硫化物等)；或氢；
Q1是在生理pH下为亲水性并且在生理pH下至少部分带正电荷的残基(例如氨基、烷基氨基、铵、烷基铵、胍、咪唑基、吡啶基等)；在生理pH下至少部分带负电荷、但在较低pH下质子化的残基(例如羧基、磺酰胺、硼酸根、膦酸根、磷酸根等)；在生理pH下基本上呈中性的残基(例如羟基、多羟化烷基、聚乙二醇、聚丙二醇、硫氢基等)；或在生理pH下至少部分为两性离子性的残基(例如在生理pH下包含磷酸根和铵基)；
Q2是在生理pH下带正电荷的残基，包括、但不限于氨基、烷氨基、铵、烷基铵、胍、咪唑基和吡啶基；
Q3是在生理pH下带负电荷、但在较低pH下质子化的残基，包括、但不限于羧基、磺酰胺、硼酸根、膦酸根、磷酸根；
m约为0-小于1.0(例如0-约0.49)；
n为大于0-约1.0(例如约0.51-约1.0)；其中m+n＝1；
p为约0.1-约0.9(例如约0.2-约0.5)；
q为约0.1-约0.9(例如约0.2-约0.5)；其中r为0-约0.8(例如0-约0.6)；其中p+q+r＝1；
v为约1-约25kDa或约5-约25kDa；且
w为约1-约50kDa或约5-约50kDa。
在一些实施方案中，p和q表示的单体残基的数量或比例在彼此的约30％、彼此的约20％、彼此的约10％等范围内。在一些具体的实施方案中，p基本上与q相同。在一些实施方案中，至少部分带电荷一般包括多于痕量的带电荷种类，包括，例如至少20％的残基带电荷、至少30％的残基带电荷、至少40％的残基带电荷、至少50％的残基带电荷、至少60％的残基带电荷、至少70％的残基带电荷等。
在一些实施方案中，m是0，且Q1是亲水性的且在生理pH下基本上为中性(或不带电荷)的残基。在一些实施方案中，基本上不带电荷包括，例如5％以下带电荷、3％以下带电荷、1％以下带电荷等。在一些实施方案中，m是0，且Q1是亲水性的且在生理pH下至少部分为阳离子性的残基。在一些实施方案中，m是0，且Q1是亲水性的且在生理pH下至少为阴离子性的残基。在一些实施方案中，m＞0且n＞0，且Q0或Q1之一是亲水性的且在生理pH下至少部分为阳离子性的残基，且Q0或Q1的另一个是亲水性的且在生理pH下基本上为中性的残基。在一些实施方案中，m＞0且n＞0，且Q0或Q1之一是亲水性的且在生理pH下至少部分为阴离子性的残基，且Q0或Q1的另一个是亲水性且在生理pH下基本上为中性的残基。在一些实施方案中，m＞0且n＞0，且Q1是亲水性的且在生理pH下至少部分为阳离子性的残基，且Q0是可缀合或可官能化的残基。在一些实施方案中，m＞0且n＞0，Q1是亲水性的且在生理pH下基本上中性的残基，且Q0是可缀合或可官能化的残基。
在一些实施方案中，本文所述的胶束包含式II的嵌段共聚物：
在一些实施方案中：
A0、A1、A2、A3和A4选自-C-C-、-C(O)(C)aC(O)O-、-O(C)aC(O)-和-O(C)bO-；其中a是1-4；b是2-4；
Y0和Y4独立地选自氢、(1C-10C)烷基、(3C-6C)环烷基、O-(1C-10C)烷基、-C(O)O(1C-10C)烷基、C(O)NR6(1C-10C)、(4C-10C)杂芳基和(6C-10C)芳基，它们中任意个任选被一个或多个氟基团取代；
Y1和Y2独立地选自共价键、(1C-10C)烷基-、-C(O)O(2C-10C)烷基-、-OC(O)(1C-10C)烷基-、-O(2C-10C)烷基-和-S(2C-10C)烷基-、-C(O)NR6(2C-10C)烷基-、-(4C-10C)杂芳基-和-(6C-10C)芳基-；
Y3选自共价键、-(1C-10C)烷基-、-(4C-10C)杂芳基-和-(6C-10C)芳基-；其中
其中用适当数量的氢原子完成未完全被R1-R5和Y0-Y4取代的A1-A4四价碳原子；
R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自氢、-CN、烷基，炔基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基，它们中任意个可以任选被一个或多个氟原子取代；
Q1和Q2是在生理pH下带正电荷的残基，包括、但不限于氨基、烷基氨基、铵、烷基铵、胍、咪唑基、吡啶基；
Q3是在生理pH下带负电荷、但在较低pH下质子化的残基，包括、但不限于羧基、磺酰胺、硼酸根、膦酸根、磷酸根；
m为约0-约0.49；
n为约0.51-约1.0；其中m+n＝1；
p为约0.2-约0.5；
q为约0.2-约0.5，其中p基本上与q相同；
r为0至约0.6；
其中p+q+r＝1；
v为约1-约25kDa或约5-约25kDa；且
w为约1-约50kDa或约5-约50kDa。
在一些实施方案中，本文所述的胶束包含式III的嵌段共聚物(例如在正常生理pH下)：
Figure BDA0000039273700000311
在一些实施方案中，如所示被取代的A0、A1、A2、A3和A4包含式III聚合物的结构单元(本文可以与″单体单元″和″单体残基″互换使用)。在一些具体的实施方案中，构成式III的A基团的单体单元在适合条件下是聚合相容性的。在一些情况中，使用包含碳-碳双键＞C＝C＜的单体聚合乙烯骨架或结构单元-(C-C-)m-聚合物，其中每个C被H和/或任意其他适合的基团二取代。在一些实施方案中，每个A基团(例如A0、A1、A2、A3和A4中各个)可以是(即独立地选自)-C-C-(即乙烯单体单元或聚合物骨架)、-C(O)C)aC(O)O-(即聚酸酐单体单元或聚合物骨架)、-O(C)aC(O)-(即聚酯单体单元或聚合物骨架)、-O(C)bO-(即聚亚烷基二醇单体单元或聚合物骨架)等(其中每个C被H和/或任意其他适合的基团二取代，例如本文所述的，包括如上所述的R12和/或R13)。在一些具体的实施方案中，术语″a″是1-4的整数，且″b″是2-4的整数。在一些情况中，与式III骨架连接的每个″Y″和″R″基团(即Y0、Y1、Y2、Y3、Y4、R1、R2、R3、R4、R5中每一个)与具体单体单元的任意″C″(包括任意(C)a或(C)b)键合。在一些具体的实施方案中，具体单体单元的Y和R与同一″C″键合。在一些具体的实施方案中，具体单体单元的Y和R与同一″C″键合，如果存在的话，则该″C″位于该单体单元羰基的α位。
在具体的实施方案中，R1-R11独立地选自氢、烷基(例如1C-5C烷基)、环烷基(例如3C-6C环烷基)或苯基，其中R1-R11中任意个任选被一个或多个氟、环烷基或苯基取代，它们可以任选进一步被一个或多个烷基取代。
在一些具体的实施方案中，Y0和Y4独立地选自氢、烷基(例如1C-10C烷基)、环烷基(例如3C-6C环烷基)、O-烷基(例如O-(2C-10C)烷基、-C(O)O-烷基(例如-C(O)O-(2C-10C)烷基)或苯基，它们中任意个任选被一个或多个氟取代。
在一些实施方案中，Y1和Y2独立地选自共价键、烷基(优选(1C-10C)烷基)、-C(O)O-烷基(优选-C(O)O-(2C-10C)烷基)、-OC(O)烷基(优选-OC(O)-(2C-10C)烷基)、O-烷基(优选-O(2C-10C))和-S-烷基(优选-S-(2C-10C)烷基)。在一些实施方案中，Y3选自共价键、烷基(优选(1C-5C)烷基)和苯基。
在一些实施方案中，Z-存在或不存在。在一些实施方案中，其中R1和/或R4是氢，Z-是OH-。在一些实施方案中，Z-是任意的抗衡离子(例如一种或多种抗衡离子)，优选生物相容性抗衡离子，例如，作为非限制性实例是氯化物、无机或有机磷酸根、硫酸根、磺酸根、乙酸根、丙酸根、丁酸根、戊酸根、己酸根、辛酸根、癸酸根、月桂酸根、肉豆蔻酸根、软脂酸根、硬脂酸根、棕榈炔酸根、油酸根、亚油酸根、花生酸根、鳕油酸根、牛痘酸根、乳酸根、羟乙酸根、水杨酸根、脱氨基苯丙氨酸、脱氨基丝氨酸、脱氨基苏氨酸、ε-羟基己酸根、3-羟基丁酸根、4-羟基丁酸根或3-羟基戊酸根。在一些实施方案中，当Y、R和任选的氟中每一个与选择的骨架上的碳共价键合时，未完全取代的任意碳可以带有适合数量的氢原子。数目m、n、p、q和r表示其嵌段中每个结构单元的摩尔分数，且v和w提供每个嵌段的分子量。
在一些实施方案中，A0、A1、A2、A3和A4选自-C-、-C-C-、-C(O)(CR12R13)aC(O)O-、-O(CR12R13)aC(O)-和O(CR12R13)bO；其中
a是1-4；
b是2-4；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12和R13独立地选自氢、(1C-5C)烷基、(3C-6C)环烷基、(5C-10C)芳基、(4C-10C)杂芳基，它们中任意个可以任选被一个或多个氟原子取代；
Y0和Y4独立地选自氢、(1C-10C)烷基、(3C-6C)环烷基、O-(1C-10C)烷基、-C(O)O(1C-10C)烷基和苯基，它们中任意个任选被一个或多个氟基团取代；
Y1和Y2独立地选自共价键、(1C-10C)烷基-、-C(O)O(2C-10C)烷基-、-OC(O)(1C-10C)烷基-、-O(2C-10C)烷基-和-S(2C-10C)烷基-；
Y3选自共价键、(1C-5C)烷基和苯基；其中用适当数量的氢原子完成未完全被R1-R5和Y0-Y4取代的A1-A4四价碳原子；
Z是一种或多种生理可接受的抗衡离子，
m为0-约0.49；
n为约0.51-约1.0；其中m+n＝1；
p为约0.2-约0.5；
q为约0.2-约0.5，其中p基本上与q相同；
r为0-约0.6；其中p+q+r＝1；
v为约1-约25kDa或约5-约25kDa；且
w为约1-约50kDa或约5-约50kDa。
在一个具体的实施方案中，
A0、A1、A2、A3和A4独立地选自-C-C-、-C(O)(C)aC(O)O-、-O(C)aC(O)-和-O(C)bO-；其中a是1-4；b是2-4；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10和R11独立地选自氢、(1C-5C)烷基、(3C-6C)环烷基和苯基，它们中任意个可以任选被一个或多个氟原子取代；
Y0和Y4独立地选自氢、(1C-10C)烷基、(3C-6C)环烷基、O-(1C-10C)烷基、-C(O)O(1C-10C)烷基和苯基，它们中任意个任选被一个或多个氟基团取代；
Y1和Y2独立地选自共价键、(1C-10C)烷基-、-C(O)O(2C-10C)烷基-、-OC(O)(1C-10C)烷基-、-O(2C-10C)烷基-和-S(2C-10C)烷基-；
Y3选自共价键、(1C-5C)烷基和苯基；
其中用适当数量的氢原子完成未完全被R1-R5和Y0-Y4取代的A1-A4四价碳原子；
Z是生理可接受的抗衡离子
m为0-约0.49；
n为约0.51-约1.0；其中m+n＝1；
p为约0.2-约0.5；
q为约0.2-约0.5，其中p基本上与q相同；
r为0-约0.6；其中p+q+r＝1；
v为约5-约25kDa；且
w为约5-约50kDa。
在一些实施方案中，
A1是-C-C-；
Y1是-C(O)OCH2CH2-；
R6是氢；
R7和R8各自是-CH3；且
R2是-CH3。
在一些实施方案中，
A2是-C-C-；
Y2是-C(O)OCH2CH2-；
R9是氢；
R10和R11各自是-CH3；且
R3是-CH3。
在一些实施方案中，
A3是-C-C-；
R4是CH3CH2CH2-；
Y3是共价键，且
Z是生理可接受的阴离子。
在一些实施方案中，
A4是-C-C-；
R5选自氢和-CH3；且
Y4是-C(O)O(CH2)3CH3。
在一些实施方案中，
A0是C-C-；
R1选自氢和(1C-3C)烷基；且
Y0选自-C(O)O(1C-3C)烷基。
在一些实施方案中，m是0。
在一些实施方案中，r是0。
在一些实施方案中，m和r均为0。
在一些实施方案中，嵌段共聚物是二嵌段共聚物，其具有式IV1的化学式(在正常生理或约中性pH下)：
Figure BDA0000039273700000351
在一些情况中，化合物IV1的结构单元如左侧方括号内和右侧圆括号内所示，且它们衍生自如下单体；和
字母p、q和r表示其嵌段中每一结构单元的摩尔分数。字母v和w表示其二嵌段共聚物中每一嵌段的分子量(数均)。
在提供的一些实施方案中，本文提供的化合物是具有如下结构的化合物：
Figure BDA0000039273700000361
如上所述，字母p、q和r表示其嵌段中每一结构单元的摩尔分数。字母v和w表示其二嵌段共聚物中每一嵌段的分子量(数均)。
在一些实施方案中，本文提供了如下聚合物：
[DMAEMA]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w                  IV3
[PEGMA]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w                   IV4
[PEGMAm-/-DMAEMAn]v-[BP-/-Pq-/-Dr]w        IV5
[PEGMAm-/-MAA(NHS)n]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w      IV6
[DMAEMAm-/-MAA(NHS)n]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w     IV7
[HPMAm-/-PDSMn]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w           IV8
[PEGMAm-/-PDSMn]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w          IV9
在一些实施方案中，B是甲基丙烯酸丁酯残基；P是丙基丙烯酸残基；D和DMAEMA是甲基丙烯酸二甲氨基乙酯残基；PEGMA是甲基丙烯酸聚乙二醇酯残基(例如具有1-20个环氧乙烷单元，例如化合物IV2所示例的，或4-5个环氧乙烷单元或7-8个环氧乙烷单元)；MAA(NHS)是甲基丙烯酸-N-羟基琥珀酰胺残基；HPMA是N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺残基；且PDSM是吡啶基二硫化物甲基丙烯酸酯残基。在一些实施方案中，术语m、n、p、q、r、w和v如本文所述。在一些具体的实施方案中，w为约1x-约5xv。
式IV1-IV9的化合物是本文提供的聚合物实例，其包含构成聚合物第一嵌段的多个结构单元。在一些实施方案中，改变或以化学方式处理第一嵌段的结构单元，以生成聚合物，其中第一嵌段是或包含为中性的(例如PEGMA)、阳离子性的(例如DMAEMA)、阴离子性的(例如PEGMA-NHS，其中NHS被水解成酸或丙烯酸)、两性的(例如DMAEMA-NHS，其中NHS被水解成酸)或两性离子性的(例如聚[2-甲基丙烯酰氧基-2′三甲铵甲基磷酸酯])的结构单元。在一些实施方案中，第一嵌段中包含吡啶基二硫化物官能团的聚合物例如[PEGMA-PDSM]-[B-P-D]可以与、并且任选地与硫氢基化siRNA反应，形成聚合物-siRNA缀合物。
在一个具体的实施方案中，式IV3的化合物是如本文所述的P7类聚合物并且具有如表1中举出的分子量、多分散性和单体组成。
Figure BDA0000039273700000371
a如通过与Viscotek GPCmax VE2001和折射计VE3580(Viscotek，Houston，TX)串联的SEC Tosoh TSK-GEL R-3000和R-4000柱(Tosoh Bioscience，Montgomery ville，PA)测定的。包含0.1wt％LiBr的HPLC-级DMF用作流动相。使用一系列聚(甲基丙烯酸甲酯)标准品测定合成共聚物的分子量。b如通过1H NMR光谱法(在CDCl3中3wt％；BrukerDRX 499)测定的。
在一些具体的实施方案中，式IV 3的聚合物是表2中P7类的聚合物。
表2
聚合物            结构                嵌段比(w/v)                     粒度(nm)
  PRx-1   [D]113K-[B50-P30-D20]20.7K   1.83   41
  PRx-2   [D]14.5K-[B57-P23-D30]26.4K   1.82   49
  PRx-3   [D]11.5K-[B35-P27-D38]33.4K   2.92   60
  PRx-4   [D]10.7K-[B50-P27-D23]33.8K   3.16   50
  PRx-5   [D]10.7K-[B4-P31-D29]32.2K   3.00   59
  PRx-6   [D]14.5K-[B53-P31-D16]67.0K   4.62   115
在一些具体的实施方案中，式IV3的聚合物是称作P7v6的P7类聚合物。在本申请和各优先权申请中PRx0729v6可与P7v6互换使用。
膜去稳定化的嵌段共聚物
在一个实施方案中，本文提供的胶束或其成分部分是使膜去稳定化的(例如包含膜去稳定化的嵌段、基团、部分等)。在另一些或可替代选择的实施方案中，多个嵌段共聚物形成胶束壳和芯。在具体的实施方案中，胶束包含亲水性和/或带电荷的壳。在另一些或可替代选择的实施方案中，胶束包含基本上疏水性的芯(例如芯包含疏水性基团、单体单元、部分、嵌段等)。在具体的实施方案中，一种或多种嵌段共聚物各自包含：(1)形成胶束壳的亲水性、带电荷的嵌段；和(2)形成胶束芯的基本上疏水性的嵌段。在一些实施方案中，一种或多种嵌段共聚物包含多个第一可电荷种类和多个疏水性促进剂。在具体的实施方案中，第一可带电荷种类是阴离子可带电荷种类(例如在特定pH下是或变成带电荷的)。在其他实施方案中，所述一种或多种嵌段共聚物包含第二可带电荷种类(即亲水性嵌段可以具有一种以上不同类型的阴离子性种类)。在一些实施方案中，胶束包含至少一种多核苷酸(例如寡核苷酸)。在具体的实施方案中，多核苷酸(例如寡核苷酸)不在胶束芯中。
在一些实施方案中，膜去稳定化的嵌段共聚物包含：(i)多个疏水性单体残基；(ii)具有可带电荷种类的多个阴离子性单体残基，该可带电荷的种类在生理pH下为阴离子性的，并且在内体裂解性pH下基本上是中性的或不带电荷；和(iii)任选地多个阳离子性单体残基。在一些实施方案中，两种膜破裂机制(a)聚阳离子(例如DMAEMA)和(b)疏水化聚阴离子(例如丙基丙烯酸)共同起作用的组合对聚合物赋予的膜去稳定化功效具有累加或协同作用。
在一些实施方案中，改变嵌段共聚物中阴离子与阳离子性种类之比能够改变本文所述胶束的膜去稳定化活性。在一些这样的实施方案中，在生理pH下嵌段共聚物中阴离子：阳离子性种类之比在约4∶1-约1∶4。在一些这样的实施方案中，改变嵌段共聚物的疏水性嵌段中阴离子与阳离子性种类之比能够改变本文所述胶束的膜去稳定化的活性。在一些这样的实施方案中，在血清生理pH下本文所述嵌段共聚物的疏水性嵌段中阴离子∶阳离子性种类之比在约1∶2-约3∶1或约1∶1-约2∶1。
在一些实施方案中，本文提供的胶束中存在的膜去稳定化的嵌段共聚物包含芯部分(例如芯嵌段)，其包含多个疏水性基团。在更具体的实施方案中，芯部分(例如芯嵌段)包含多个疏水性基团和多个第一可带电荷种类或基团。在更具体的实施方案中，这种第一可带电荷种类或基团带负电荷和/或可带有带负电荷的种类或基团带电荷(例如在约中性pH或pH约7.4下)。在一些具体的实施方案中，芯部分(例如芯嵌段)包含多个疏水性基团、多个第一可带电荷种类或基团和多个第二可带电荷种类或基团。在更具体的实施方案中，第一可带电荷种类或基团带负电荷和/或可带有带负电荷的种类或基团，且第二可带电荷种类或基团带正电荷和/或可带有带正电荷的种类或基团带电荷(例如在约中性pH或pH约7.4下)。
亲水性嵌段与疏水性嵌段之比
在一些实施方案中，本文提供的胶束的特征还在于或可以在于其他标准：(1)各嵌段的分子量及其相对长度比下降或增加以控制所形成的胶束的大小及其相对稳定性；和(2)聚合物亲水性嵌段大小改变(例如通过改变阳离子性单体的数量)，以提供与阴离子性治疗剂(例如寡核苷酸药物)形成有效复合物和/或呈电中性。
在一些实施方案中，亲水性嵌段与疏水性嵌段的数均分子量(Mn)的嵌段比为约1∶1-约1∶10。在一些实施方案中，本文所述的胶束包含具有亲水性嵌段与疏水性嵌段的数均分子量(Mn)嵌段比为约1∶1-约1∶5或约1∶1-约1∶2.5的共聚物。
在一些实施方案中，亲水性嵌段与疏水性嵌段的数均分子量(Mn)嵌段比为约1∶1-约10∶1。在一些实施方案中，本文所述的胶束包含具有亲水性嵌段与疏水性嵌段的数均分子量(Mn)嵌段比为约1∶1-约5∶1或约1∶1-约2.5∶1的共聚物。
聚合物结构
在具体的实例中，本文提供了如下结构的嵌段共聚物：
α-[Ds-Xt]b-[Bx-Py-Dz]a-ω[结构1]
α-[Bx-Py-Dz]a-[Ds-Xt]b-ω[结构2]
其中x、y、z、s和t是聚合物嵌段中各单体单元D(DMAEMA)、B(BMA)、P(PAA)、和亲水性中性单体(X)的mole％组成(一般为0-50％)，a和b是嵌段的分子量，[Ds-Xt]是亲水性嵌段，且α和ω表示聚合物的相对端。在一些实施方案中，x是50％，y是25％，且z是25％。在一些实施方案中，x是60％，y是20％，且z是20％.在一些实施方案中，x是70％，y是15％，且z是15％。在一些实施方案中，x是50％，y是25％，且z是25％。在一些实施方案中，x是33％，y是33％，且z是33％。在一些实施方案中，x是50％，y是20％，且z是30％。在一些实施方案中，x是20％，y是40％，且z是40％。在一些实施方案中，x是30％，y是40％，且z是30％。
在一些实施方案中，本文所述的嵌段共聚物包含约2,000KDa-约30,000KDa、约5,000KDa-约20,000KDa或约7,000KDa-约15,000KDa的亲水性嵌段。在具体的实施方案中，亲水性嵌段是约7,000KDa、8,000KDa、9,000KDa、10,000KDa、11,000KDa、12,000KDa、13,000KDa、14,000KDa或15,000KDa。在一些实施方案中，本文所述的嵌段共聚物包含约10,000KDa-约100,000KDa、约15,000KDa-约35,000KDa或约20,000KDa-约30,000KDa的疏水性嵌段。在一些具体的实施方案中，包含12,500KDa亲水性嵌段和25,000KDa疏水性嵌段(长度比1∶2)的嵌段共聚物形成胶束。在一些具体的实施方案中，包含10,000KDa亲水性嵌段和30,000KDa疏水性嵌段(长度比1∶3)的嵌段共聚物形成胶束。
在一些具体的实施方案中，包含10,000KDa亲水性嵌段和25,000Kda疏水性嵌段(长度比1∶2.5)的嵌段共聚物形成约45nm的胶束(如通过动态光散射测定或电子显微镜检查测定的)。在一些具体的实施方案中，胶束为80或130nm(如通过动态光散射测定或电子显微镜检查测定的)。典型地，当形成胶束壳的的分子量(或长度)相对于形成芯的疏水性嵌段-[Bx-Py-Dz]增加时，胶束大小增加。在一些情况中，形成壳[Ds-Xt]的聚合物阳离子嵌段[Ds-Xt]大小在提供与寡核苷酸药物有效复合物形成/电中性方面是重要的。例如，在一些情况中，就约20碱基对的s iRNA而言(即40个阴离子电荷)，阳离子性嵌段具有适合于提供有效结合例如40个阳离子电荷的长度。就包含80个DMAEMA单体(MW＝11,680)的具有pKa值7.4的壳嵌段而言，该嵌段在pH 7.4包含40个阳离子电荷。在一些情况中，通过类似数量的相反电荷之间的静电相互作用形成稳定的聚合物-siRNA缀合物(例如复合物)。在一些情况中，避免大量的过量正电荷有助于预防显著的体外和体内毒性。
多分散性
在一些实施方案中，用于本文提供的胶束中的嵌段共聚物具有较低的多分散性指数(polydispersity index，PDI)或链长差异。按照任意适合的方式测定多分散性指数(PDI)，例如通过用聚合物链的重均分子量除以其数均分子量。数均分子量是各链分子量的总和除以链数量。重均分子量与分子量的平方除以该分子量的分子的数量成正比。由于重均分子量始终大于数均分子量，所以多分散性始终大于或等于1。当数值接近或接近相同时，即当多分散性趋近于值1时，聚合物变成接近单分散性，其中每一链具有实际上相同的单体单元数量。趋近于1的多分散性值可以使用活泼自由基聚合得到。测定多分散性的方法例如、但不限于尺寸排阻色谱法、动态光散射、基质辅助的激光解吸/电离色谱法和电喷雾质量色谱法是本领域众所周知的。在一些实施方案中，本文提供的胶束装配物的嵌段共聚物具有小于2.0或小于1.5或小于1.4或小于1.3或小于1.2的多分散性指数(PDI)。
合成
在一些实施方案中，嵌段共聚物包含烯属不饱和单体。在本文中将术语″烯属不饱和单体″定义为具有至少一个碳双键或三键的化合物。烯属不饱和单体的非限制性实例是：(烷基)丙烯酸烷基酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、烷基丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、丙烯酰胺、苯乙烯、烯丙基胺、烯丙基铵、二烯丙基胺、二烯丙基铵、N-乙烯基甲酰胺、乙烯基醚、磺酸乙烯酯、丙烯酸、磺基甜菜碱(sulfobetaine)、羧酸甜菜碱、磷酸酯甜菜碱或马来酸酐。
在一些实施方案中，适用于制备本文提供的嵌段共聚物的单体作为非限制性实例包括一种或多种如下单体：甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丙酯(全部异构体)、甲基丙烯酸丁酯(全部异构体)、甲基丙烯酸2-乙基己酯、甲基丙烯酸异冰片酯、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸苄酯、甲基丙烯酸苯酯、甲基丙烯腈、α-甲基苯乙烯、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯(全部异构体)、丙烯酸丁酯(全部异构体)、丙烯酸2-乙基己酯、丙烯酸异冰片酯、丙烯酸、丙烯酸苄酯、丙烯酸苯酯、丙烯腈、苯乙烯、选自如下的丙烯酸酯类和苯乙烯类：甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸2-羟基乙酯、甲基丙烯酸羟丙酯(全部异构体)、甲基丙烯酸羟丁酯(全部异构体)、甲基丙烯酸N，N-二甲氨基乙酯(DMAEMA)、甲基丙烯酸三乙二醇酯、丙烯酸寡乙二醇酯、甲基丙烯酸寡乙二醇酯、衣康酸酐、衣康酸、丙烯酸缩水甘油酯、丙烯酸2-羟乙酯、丙烯酸羟丙酯(全部异构体)、丙烯酸羟丁酯(全部异构体)、丙烯酸N，N-二甲氨基乙酯、丙烯酸N，N-二乙氨基乙酯、丙烯酸三乙二醇酯、丙烯酸寡乙二醇酯、甲基丙烯酰胺、N-甲基丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、N-叔丁基甲基丙烯酰胺、N-正丁基甲基丙烯酰胺、N-羟甲基丙烯酰胺、N-羟乙基丙烯酰胺、乙烯基苯甲酸(全部异构体)、二乙氨基苯乙烯(全部异构体)、α-甲基乙烯基苯甲酸(全部异构体)、二乙氨基α-甲基苯乙烯(全部异构体)、对-乙烯基苯磺酸、对-乙烯基苯磺酸钠盐、甲基丙烯酸三甲氧基甲硅烷基丙酯、甲基丙烯酸三乙氧基甲硅烷基丙酯、甲基丙烯酸三丁氧基甲硅烷基丙酯、甲基丙烯酸二甲氧基甲基甲硅烷基丙酯、甲基丙烯酸二乙氧基甲基甲硅烷基丙酯、甲基丙烯酸二丁氧基甲基甲硅烷基丙酯、甲基丙烯酸二异丙氧基甲基甲硅烷基丙酯、甲基丙烯酸二甲氧基甲硅烷基丙酯、甲基丙烯酸二乙氧基甲硅烷基丙酯、甲基丙烯酸二丁氧基甲硅烷基丙酯、甲基丙烯酸二异丙氧基甲硅烷基丙酯、丙烯酸三甲氧基甲硅烷基丙酯、丙烯酸三乙氧基甲硅烷基丙酯、丙烯酸三丁氧基甲硅烷基丙酯、丙烯酸二甲氧基甲基甲硅烷基丙酯、丙烯酸二乙氧基甲基甲硅烷基丙酯、丙烯酸二丁氧基甲基甲硅烷基丙酯、丙烯酸二异丙氧基甲基甲硅烷基丙酯、丙烯酸二甲氧基甲硅烷基丙酯、丙烯酸二乙氧基甲硅烷基丙酯、丙烯酸二丁氧基甲硅烷基丙酯、丙烯酸二异丙氧基甲硅烷基丙酯、乙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、苯甲酸乙烯酯、乙烯基氯、乙烯基氟、乙烯基溴、马来酸酐、N-芳基马来酰亚胺、N-苯基马来酰亚胺、N-烷基马来酰亚胺、N-丁基马来酰亚胺、N-乙烯基吡咯烷酮、N-乙烯基咔唑、丁二烯、异戊二烯、氯丁二烯、乙烯、丙烯、1，5-己二烯类、1，4-己二烯类、1，3-丁二烯类、1，4-戊二烯类、乙烯醇、乙烯基胺、N-烷基乙烯基胺、烯丙基胺、N-烷基烯丙基胺、二烯丙基胺、N-烷基二烯丙基胺、亚烷基亚胺、丙烯酸、烷基丙烯酸酯类、丙烯酰胺类、甲基丙烯酸、烷基甲基丙烯酸酯类、甲基丙烯酰胺类、N-烷基丙烯酰胺类、N-烷基甲基丙烯酰胺类、苯乙烯、N-异丙基丙烯酰胺、乙烯基萘、乙烯基吡啶、乙基乙烯基苯、氨基苯乙烯、乙烯基吡啶、乙烯基咪唑、乙烯基联苯、乙烯基茴香醚、乙烯基咪唑基、乙烯基吡啶基、乙烯基聚乙二醇、二甲氨基甲基苯乙烯、三甲基铵乙基甲基丙烯酸酯、三甲基铵乙基丙烯酸酯、二甲氨基丙基丙烯酰胺、三甲基铵乙基丙烯酸酯、三甲基铵乙基甲基丙烯酸酯、三甲基铵丙基丙烯酰胺、丙烯酸十二烷基酯、丙烯酸十八酯或甲基丙烯酸十八酯单体或其组合。
在一些实施方案中，任选使用这些单体的官能化形式。本文所用的官能化单体是包含掩蔽或未掩蔽的官能团(例如在聚合后可以连接其他部分的基团)的单体。这种基团的非限制性实例是伯氨基、羧基、硫氢基、羟基、叠氮化物和氰基。有几种适合的掩蔽基团可供利用(例如，参见T.W.Greene & P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis(第2版)J.Wiley & Sons，1991和P.J.Kocienski，Protecting Groups，Georg Thieme Verlag，1994，将这种公开文献引入本文参考)。
按照任意适合的方式制备本文所述的聚合物。用于生产本文提供的聚合物的适合合成方法包括例如阳离子、阴离子和自由基聚合。在一些情况中，当使用阳离子方法时，用催化剂处理单体以引发聚合。任选地，一种或多种单体用于形成共聚物。在一些实施方案中，这种催化剂是引发剂，包括，例如质子酸(布郎斯台德酸)或路易斯酸，就使用路易斯酸的情况而言，还任选使用一些促进剂，例如水或醇。在一些实施方案中，作为非限制性实例，催化剂是碘化氢、高氯酸、硫酸、磷酸、氟化氢、氯磺酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、三氯化铝、烷基铵氯化物、三氟化硼复合物、四氯化锡、五氯化锑、氯化锌、四氯化钛、五氯化磷、磷酰氯或氯氧化铬。在一些实施方案中，聚合物合成在净的或任意适合的溶剂中进行。适合的溶剂包括、但不限于戊烷、己烷、二氯甲烷、氯仿或二甲基甲酰胺(DMF)。在一些实施方案中，聚合物合成在任意适合的反应温度下进行，包括，例如约-50℃-约100℃或约0℃-约70℃。
在一些实施方案中，通过自由基聚合制备嵌段共聚物。当使用自由基聚合方法时，提供(i)单体、(ii)任选地共聚单体和(iii)任选的自由基来源，以引发自由基聚合过程。在一些实施方案中，自由基来源是任选的，因为一些单体可以在高温加热时自我引发。在一些情况中，在形成聚合混合物后，使该混合物接触聚合条件。聚合条件是如本文所述导致至少一种单体形成至少一种聚合物的那些条件。这种条件任选改变至任意适合的水平，并且作为非限制性实例包括用于聚合混合物和反应时间的温度、压力、气氛、聚合混合物中使用的原料的比例和反应时间。聚合以任意适合的方式进行，例如在溶液、分散液、混悬液、乳剂中或批量进行。
在一些实施方案中，引发剂存在于反应混合物中。如果在本文所述的聚合过程中有用，则任选使用任意适合的引发剂。这种引发剂作为非限制性实例包括一种或多种烷基过氧化物、取代的烷基过氧化物、芳基过氧化物、取代的芳基过氧化物、酰基过氧化物、烷基氢过氧化物、取代的烷基氢过氧化物、芳基氢过氧化物、取代的芳基氢过氧化物、杂烷基过氧化物、取代的杂烷基过氧化物、杂烷基氢过氧化物、取代的杂烷基氢过氧化物、杂芳基过氧化物、取代的杂芳基过氧化物、杂芳基氢过氧化物、取代的杂芳基氢过氧化物、烷基过酸酯类、取代的烷基过酸酯类、芳基过酸酯类、取代的芳基过酸酯类或偶氮化合物。在具体的实施方案中，过氧化苯甲酰(BPO)和/或AIBN用作引发剂。
在一些实施方案中，聚合过程以活泼方式按照任意适合的方式进行，例如，但不限于原子转移自由基聚合(ATRP)、一氧化二氮-为介体的活泼自由基聚合(NMP)、开环聚合(ROP)、简并性转移(DT)或可逆添加分段转移(RAFT)。使用常规和/或活泼/受控聚合方法，可以生产各种聚合物结构，例如、但不限于嵌段、接枝、星形和梯度共聚物，其中单体单元以统计学方式或以梯度方式分布通过链或在嵌段序列或侧链接枝物中均聚化。在其他实施方案中，通过大分子设计，经黄原酸酯类(MADIX)的可逆添加-分段链转移合成聚合物(Direct Synthesis of Double Hydrophilic Statistical Di-和Triblock Copolymer Comprised of Acrylamide and Acrylic Acid Units via the MADIX Process″，Daniel Taton等人，Macromolecular Rapid Communications，22，No.18，1497-1503(2001).)
在一些实施方案中，可逆添加-分段链转移或RAFT用于合成本发明的乙烯骨架聚合物。RAFT是活泼聚合过程。RAFT包含自由基简并性链转移过程。在一些实施方案中，用于制备本文所述聚合物的RAFT方法使用硫羰基硫代化合物，例如、但不限于二硫酯类、二硫氨基甲酸酯类和黄原酸酯类，以通过可逆链转移机制介导聚合。在一些情况中，聚合物自由基与任意上述化合物的C＝S基团的反应导致形成稳定化的自由基中间体。典型地，这些稳定化的自由基中间体不发生标准自由基聚合所典型的终止反应，而是再引入能够再引发或增殖单体的自由基，从而在该过程中重新形成C＝S键。在大部分情况中，这种添加到C＝S键上、然后使随后的自由基分段的循环持续至全部单体耗尽或反应停止。一般而言，低浓度活性自由基在任意具体时间均限制正常终止反应。
本文所述的聚合过程任选在任意适合的溶剂或其混合物中发生。适合的溶剂包括水、醇(例如甲醇、乙醇、正-丙醇、异丙醇、丁醇)、四氢呋喃(THF)二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮、乙腈、六甲基磷酰胺、乙酸、甲酸、己烷、环己烷、苯、甲苯、二噁烷、二氯甲烷、醚(例如乙醚)、氯仿和乙酸乙酯。在一个方面中，溶剂包括水和水与水易溶混有机溶剂例如DMF的混合物。
在一些实施方案中，通过在包含可缀合基团(例如叠氮化物或吡啶基二硫化物基团)的链转移试剂的存在下制备聚合物而将可缀合基团引入本文提供的聚合物的α端，其中可缀合基团与聚合过程的条件相容。这种链转移试剂的非限制性实例由Heredia，K.L等人描述(参见Chem.Commun.，2008，28，3245-3247，将该文献的公开内容通过参考引入本文)。在一些实施方案中，链转移试剂包含掩蔽的可缀合基团，在去掩蔽反应后，其与siRNA剂或靶向剂连接。在一些实施方案中，通过在链转移试剂的存在下制备聚合物，将靶向剂例如、但不限于小分子靶向剂(例如生物素残基或单糖)与本文提供的聚合物的α端连接，其中所述链转移试剂包含靶向剂。
在一些情况中，嵌段共聚物包含可缀合单体(例如具有可缀合基团的单体)，其用于聚合后通过化学领域公知的方法(例如″click″化学)引入其他官能团(例如小分子靶向剂)(例如″click″反应，参见Wu，P.；Fokin，V.V.Catalytic Azide-Alkyne cycloaddition：Reactivity and Applications.Aldrichim.Acta，2007，40，7-17，将该文献通过参考引入本文)。在一些实施方案中，包含这种可缀合基团的单体与疏水性单体和包含使阴离子性种类带电荷的单体共聚合。在一些情况中，丙烯酸或烷基丙烯酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯与其他单体共聚合，形成共聚物，其与氨基-官能化分子例如靶向配体或PEGs的氨基衍生物反应。在一些实施方案中，包含可缀合基团的单体是吡啶二硫基丙烯酸酯(PDSA)。
在一些实施方案中，嵌段共聚物包含PEG取代的单体单元(例如PEG是侧链且不含多核苷酸载体嵌段骨架)。在一些情况中，本文所述的一种或多种聚合物包含具有约1,000-约30,000分子量的聚乙二醇(PEG)链或嵌段。在一些实施方案中，PEG与聚合物端基或本文所提供聚合物载体的聚合物中存在的一个或多个侧链可修饰基团缀合。在一些实施方案中，PEG残基与本文所提供聚合物载体的聚合物(例如嵌段共聚物)中亲水性节段或嵌段(例如壳嵌段)内的可修饰基团缀合。在一些实施方案中，包含2-20个环氧乙烷单元的PEG残基的单体共聚合形成聚合物的亲水性部分，其形成本文提供的聚合物载体。
胶束载荷(payload)：多核苷酸
本文提供的是将诊断和/或治疗剂(包括，例如寡核苷酸)递送至活细胞的胶束。在一些实施方案中，胶束包含多个嵌段共聚物和任选至少一种治疗剂(例如多核苷酸，例如siRNA)。本文提供的胶束是生物相容性的、稳定的(包括化学和/或物理稳定的)和/或可再现合成的。优选本文提供的胶束是无毒性的(例如显示低毒性)、防止治疗剂(例如寡核苷酸)有效载荷降解、通过天然存在的过程(例如通过胞吞作用)进入活细胞和/或将治疗剂(例如寡核苷酸)有效载荷在接触细胞后递送入活细胞的细胞质。
在一些情况中，多核苷酸(例如寡核苷酸)是siRNA和/或另一种′基于核苷酸′的活性剂，其改变细胞中至少一种基因的表达。因此，在一些实施方案中，本文提供的胶束可用于将siRNA递送入细胞。在一些情况中，细胞是体外的，而在其他情况中，细胞是体内的(例如小鼠或人)。在一些实施方案中，对有此需要的个体给予包含siRNA的治疗有效量的胶束(例如在需要基因敲低时，其中该基因能够被给予的siRNA敲低)。在一些具体情况中，所述胶束可用于或特别被设计成用于将siRNA递送至个体的特异性靶向的细胞。
在一些实施方案中，本文提供的胶束将RNAi试剂(例如siRNA)递送至有此需要的个体。在一些这样的实施方案中，本文提供包含聚合物生物缀合物例如与嵌段共聚物缀合(例如离子或共价方式)的RNAi试剂的胶束。在更具体的实施方案中，RNAi试剂与嵌段共聚物的α端缀合，在其他具体实施方案中，RNAi试剂与嵌段共聚物的ω端缀合。在一些实施方案中，siRNA与一种或多种聚合物单体单元的侧链共价缀合。
在一些实施方案中，RNAi分子是多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸是寡核苷酸基因表达调节剂。在其他实施方案中，多核苷酸是寡核苷酸敲低剂或RNAi试剂。在具体的实施方案中，多核苷酸是切丁酶(dicer)底物或siRNA。
在一些实施方案中，多核苷酸包含5′和3′末端并且在该多核苷酸5′或3′末端上与所述膜去稳定化的聚合物偶合。在不同的实施方案中，RNAi试剂与嵌段共聚物通过连接部分共价偶合。
在一些实施方案中，连接部分包含亲和结合剂对。在一些实施方案中，多核苷酸和/或pH-依赖性膜去稳定化聚合物的末端之一被化学部分修饰，所述化学部分提供多核苷酸和/或聚合物，它们彼此具有亲和力，例如芳基硼酸-水杨基羟肟酸、亮氨酸拉链或其他肽基元或其他类型的化学亲和键。
本文所述胶束的嵌段共聚物与RNAi试试剂之间的连接部分(例如共价键)任选是不能裂解的或可裂解的。在一些实施方案中，RNAi试剂前体(例如切丁酶底物)通过不能裂解的连接部分与聚合物(例如聚合物的α或ω端可缀合基团)连接。在一些实施方案中，RNAi试剂通过可裂解的连接部分连接。在一些情况中，本文提供胶束的RNAi试剂与聚合物之间的连接部分包含可裂解键。在其他情况中，本文提供胶束的RNAi试剂与聚合物之间的连接部分是不能裂解的。在一些实施方案中，用于本文所述的胶束的可裂解键作为非限制性实例包括二硫键(例如在胞质的还原环境内解离的二硫键)。在一些实施方案中，连接部分是可裂解的和/或包含在内体条件中可裂解的键。在一些实施方案中，连接部分是可裂解的和/或包含被特异性酶(例如磷酸酶或蛋白酶)裂解的键。在一些实施方案中，连接部分是可裂解的和/或包含在胞内参数(例如pH、氧化还原电位)改变时可裂解的键。在一些实施方案中，聚合物(例如聚合物的α或ω端可缀合基团)与RNAi试剂(例如寡核苷酸或s iRNA)之间的共价结合通过任意适合的化学缀合方法进行，包括、但不限于胺-羧基连接基、胺-醛连接基、胺-酮连接基、胺-碳水化合物连接基、胺-羟基连接基、胺-胺连接基、羧基-硫氢基连接基、羧基-碳水化合物连接基、羧基-羟基连接基、羧基-羧基连接基、硫氢基-碳水化合物连接基、硫氢基-羟基连接基、硫氢基-硫氢基连接基、碳水化合物-羟基连接基、碳水化合物-碳水化合物连接基和羟基-羟基连接基。在一些实施方案中，双官能交联试剂用于RNAi试剂与嵌段共聚物的适合的可缀合基团之间的共价轭合。在一些实施方案中，缀合还使用pH-敏感性键和连接基进行，包括、但不限于腙和乙缩醛键。在一些实施方案中，RNAi(例如芯糖寡核苷酸)分子与引入聚合物的α或ω端的硼酸官能团(例如苯基硼酸残基)共价连接，该过程通过硼酸与RNAi试剂的末端芯糖残基的2′和3′-羟基形成酯进行。任选也使用任意其他适合的缀合方法，例如，有多种缀合化学法可供利用(例如，参见Bioconjugation，Aslam和Dent，Eds，Macmillan，1998和其中的章节)。
在一些实施方案中，根据一种方法制备多核苷酸(例如siRNA、寡核苷酸)与本文所述的嵌段共聚物(例如聚合物的α或ω端可缀合基团)的聚合物生物缀合物，该方法包括如下两步：(1)使用适合的活化试剂活化寡核苷酸的可修饰的端基(例如5′-或3′-羟基或氨基)，例如、但不限于1-乙基-3，3-二甲氨基丙基碳二亚胺(EDAC)、咪唑、N-氢琥珀酰亚胺(NHS)和二环己基碳二亚胺(DCC)、HOBt(1-羟基苯并三唑)、对-硝基苯基氯甲酸酯、羰基二咪唑(CDI)和碳酸N，N′-二琥珀酰亚胺酯(DSC)；和(2)使聚合物(例如聚合物的α或ω端)与寡核苷酸末端共价连接。在一些实施方案中，在与聚合物缀合前，寡核苷酸的5′-或3′-端可修饰基团被其他官能团取代。例如，羟基(-OH)任选被携带硫氢基(-SH)、羧基(-COOH)或胺基(-NH2)的连接基取代。
在另一个实施方案中，使用活化剂或反应性双官能连接基，根据任意适合的方法使包含引入一个或多个碱基(例如5-氨基烷基嘧啶)的官能团的寡核苷酸与本文提供的胶束的共聚物缀合。多种这类活化剂和双官能连接基可购自如Sigma、Pierce、Invitrogen等这样的供应商。
在一些具体的实施方案中，通过RAFT聚合、使用包含掩蔽的可缀合基团的链转移剂制备嵌段共聚物。在一种具体情况中，包含CTA的吡啶基-二硫化物用于合成这种聚合物。通过用聚合物处理包含硫氢基的RNAi试剂进行RNAi试剂的共价末端-缀合。在一些情况中，与聚合物浓度相比过量的包含硫氢基的RNAi试剂用于进行缀合。
在一些实施方案中，本文所述的胶束有利于生物活性剂(例如抗体、siRNA等)的胞内递送。在一些实施方案中，本文所述的胶束有利于通过直接聚合物-RNA缀合而连接的siRNA的胞内递送。在一些实施方案中，促进siRNA胞内递送的胶束包含提高水溶性和/或药代动力学特性的第一嵌段(例如包含亲水性单体的第一嵌段)和具有pH-响应性的第二嵌段。
靶向部分
在一些情况中，通过将靶向部分掺入胶束而促进胶束的细胞摄取效率。″靶向配体″(与″靶向部分″可互换使用)结合细胞(例如选择的细胞)的表面。在一些实施方案中，靶向部分识别特异性细胞表面抗原或结合靶细胞表面上的受体。适合的靶向配体作为非限制性实例包括抗体、抗体样分子或肽类，例如整联蛋白结合肽类，例如包含RGD的肽类；或小分子，例如维生素，例如叶酸；糖类，例如乳糖和半乳糖，或其他小分子。细胞表面抗原包括细胞表面分子，例如细胞表面上的蛋白质、糖、脂质或其他抗原。在具体的实施方案中，细胞表面抗原发生内化。本文提供的胶束中的靶向部分所靶向的细胞表面抗原实例包括、但不限于铁传递蛋白受体1和2型、EGF受体、HER2/Neu、VEGF受体、整联蛋白、NGF、CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD33、CD43、CD38、CD56、CD69和唾液酸糖蛋白受体。靶向配体还可以包含人工亲和分子，例如拟肽或适体。
在不同的实施方案中，靶向配体与胶束聚合物(例如嵌段共聚物)的任一端或单体单元侧链或侧基连接或掺入聚合物。在一些实施方案中，包含靶向剂残基的单体(例如包含靶向剂的可聚合乙烯基单体)共聚合，形成嵌段共聚物，其形成本文提供的胶束。在一些实施方案中，一种或多种靶向配体与本文提供的胶束的嵌段共聚物通过连接部分偶合。在一些实施方案中，使靶向配体与嵌段共聚物偶合的连接部分是可裂解的连接部分(例如包含可裂解的键)。在一些实施方案中，连接部分是在内体条件中可裂解的和/或包含在其中可裂解的键。在一些实施方案中，连接部分是可被特异性酶(例如磷酸酶或蛋白酶)裂解的和/或包含可被其裂解的键。在一些实施方案中，连接部分是在胞内参数(例如pH、氧化还原电位)改变时可裂解的和/或包含在这种情况下可裂解的键。
在一些实施方案中，靶向剂是蛋白质靶向剂(例如肽和抗体、抗体片段)。靶向部分与聚合物连接以任意适合的方式进行，例如通过一系列缀合化学手段中的任一种，包括、但不限于胺-羧基连接基、胺-硫氢基连接基、胺-碳水化合物连接基、胺-羟基连接基、胺-胺连接基、羧基-硫氢基连接基、羧基-碳水化合物连接基、羧基-羟基连接基、羧基-羧基连接基、硫氢基-碳水化合物连接基、硫氢基-羟基连接基、硫氢基-硫氢基连接基、碳水化合物-羟基连接基、碳水化合物-碳水化合物连接基和羟基-羟基连接基。在具体的实施方案中，″click″化学用于连接靶向配体与本文提供的胶束的嵌段共聚物(例如″click″反应，参见Wu，P.；Fokin，V.V.Catalytic  Azide-Alkyne cycloaddition：Reactivity和Applications.Aldrichim.Acta 2007，40，7-17)。任选使用大量不同的缀合化学法(例如，参见Bioconjugation，Aslam和Dent，Eds，Macmillan，1998和其中的章节)。在一些实施方案中，靶向部分与单体连接，然后得到的化合物用于本文所述胶束中使用的聚合物(例如共聚物)的聚合合成。在一些实施方案中，靶向配体与胶束的聚合物所结合的siRNA的有义或反义链连接。在一些实施方案中，靶向剂与有义或反义链的5′或3′端连接。
在具体的实施方案中，本文提供的胶束是生物相容性的。本文所用的″生物相容性″意指化合物(例如与寡核苷酸缔合的胶束)的一种特性，其特征在于它本身或它在体内的降解产物不会损伤活组织或对其损伤至少是最低限度的和/或可修补性的；和/或不会导致或至少最低限度地和可控地导致活组织中的免疫反应。就盐而言，目前优选任意抗衡离子(例如阳离子性种类或阴离子性种类)为生物相容性的。本文所用的″生理可接受的″与生物相容性可互换使用。在一些情况中，其中所用的胶束和/或聚合物(例如共聚物)与阳离子性脂质相比显示低毒性。
细胞摄取
在一些实施方案中，包含RNAi试剂(例如寡核苷酸或siRNA)的胶束通过胞吞作用被递送至细胞。在本说明书上下文中，胞内小囊泡和内体可互换使用。RNAi试剂(例如寡核苷酸或siRNA)成功递送入细胞质一般具有内体逃逸机制。在一些情况中，本文提供的包含RNAi试剂(例如寡核苷酸或siRNA)的胶束在胞吞作用时对内体区室中的较低pH敏感。在一些情况中，胞吞作用引起本文提供的聚合物和/或胶束中成为阴离子性单元(例如丙基丙烯酸单元)或种类的带电荷单体单元或种类发生质子化或电荷中和，导致聚合物中的构象转换。在一些情况中，这种构象转换产生更具疏水性的膜去稳定化的形式，其介导治疗剂(例如寡核苷酸或siRNA)从内体释放至细胞质。在包含siRNA的那些胶束中，siRNA向细胞质的递送使其mRNA敲低效应发生。在那些包含其他类型RNAi试剂的聚合物缀合物中，向细胞质的递送使其期望的作用发生。
此外，在一些实施方案中，本文提供的胶束将小的疏水性分子，例如疏水性小分子化合物(例如疏水性小分子药物)选择性摄入胶束的疏水性芯。在具体的实施方案中，本文提供的胶束将小的疏水性分子，例如疏水性小分子化合物例如疏水性小分子化合物芘选择性摄入胶束的疏水性芯。
实施例
在本发明上下文的描述中，利用不同的已知首字母缩写和缩写描述单体或衍生自这种单体的聚合的单体残基。除非另有指定，否则不限于：″BMA″(或字母″B″作为等效的速记符号)表示甲基丙烯酸丁酯或衍生自它的单体残基；″DMAEMA″(或字母″D″作为等效的速记符号)表示甲基丙烯酸N，N-二甲氨基乙酯或衍生自它的单体残基；″Gal″意指半乳糖或半乳糖残基，任选包括羟基保护部分(例如乙酰基)或其聚乙二醇化衍生物(如下所述)；HPMA表示甲基丙烯酸2-羟丙酯或衍生自它的单体残基；″MAA″表示甲基丙烯酸或衍生自它的单体残基；″MAA(NHS)″表示甲基丙烯酸的N-羟基-琥珀酰亚胺酯或衍生自它的单体残基；″PAA″(或字母″P″作为等效的速记符号)表示2-丙基丙烯酸或衍生自它的单体残基；″PEGMA″意指聚乙二醇化的甲基丙烯酸单体CH3O(CH2O)7-8OC(O)C(CH3)CH2或衍生自它的单体残基。在每种情况中，任意这种命名表示单体(包括其所有的盐或离子性类似物)或衍生自该单体的聚合的单体残基(包括其所有的盐或离子性类似物)，且上下文中具体显示的形式对本领域技术人员显而易见。
实施例1：二嵌段聚合物和共聚物的制备
制备如下通式的二嵌段聚合物和共聚物：
[A1x-/-A2y]n-[B1x-/-B2y-/-B3z]1-5n
其中[A1-A2]是由单体A1和A2的残基组成的第一嵌段共聚物，[B1-B2-B3]是由单体B1、B2、B3的残基组成的第二嵌段共聚物，
x、y、z是以mole％单体残基计的聚合物组成，
n是分子量。
典型的二-嵌段共聚物：
[DMAEMA]-[B-/-P-/-D]
[PEGMAw]-[B-/-P-/-D]
[PEGMAw-DMAEMA]-[B-/-P-/-D]
[PEGMAw-MAA(NHS)]-[B-/-P-/-D]
[DMAEMA-/-MAA(NHS)]-[B-/-P-/-D]
[HPMA-/-PDSM]-[B-/-P-/-D]
其中：
B是甲基丙烯酸丁酯
P是丙基丙烯酸
D是DMAEMA，其为甲基丙烯酸二甲氨基乙酯
PEGMA是甲基丙烯酸聚乙二醇酯，其中，例如w＝4-5或7-8个环氧乙烷单元)
MAA(NHS)是甲基丙烯酸-N-羟基琥珀酰亚胺
HPMA是N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺，
PDSM为吡啶基二硫化物甲基丙烯酸酯
这些聚合物表示这样的结构，其中聚合物或共聚物的第一嵌段的组成被改变或以化学方式被处理，以生成这样的聚合物，其中第一嵌段是中性的(例如PEGMA)、阳离子性的(DMAEMA)、阴离子性的(PEGMA-NHS，其中NHS被水解成酸)、两性的(DMAEMA-NHS，其中NHS被水解成酸)或两性离子性的(例如聚[2-甲基丙烯酰氧基-2′三甲铵甲基磷酸])。此外，[PEGMA-PDSM]-[B-P-D]聚合物在第一嵌段中包含吡啶基二硫化物官能团，其可以与硫氢基化siRNA反应，形成聚合物-siRNA缀合物。
实施例1.1：通过RAFT制备嵌段共聚物的一般合成方法
A.RAFT链转移剂
采用Moad等人，Polymer，2005，46(19)：8458-68的方法稍加改动用于合成用于下列RAFT聚合的链转移剂(CTA)4-氰基-4-(乙基硫烷基硫羰基)硫烷基戊酸(ECT)。简言之，在0℃在10分钟内向搅拌的氢化钠(60％的油溶液)(3.15g，79mmol)在乙醚(150ml)中的混悬液中加入乙硫醇(4.72g，76mmol)。然后将该溶液搅拌10分钟，然后添加二硫化碳(6.0g，79mmol)。通过过滤收集粗S-乙基三硫代碳酸钠(7.85g，0.049mol)，混悬于乙醚(100inL)，与碘(6.3g，0.025mol)反应。1小时后，过滤该溶液，用硫代硫酸钠水溶液洗涤，用硫酸钠干燥。然后通过旋转蒸发分离粗的双(乙基硫烷基硫羰基)二硫化物。将双-(乙基硫烷基硫羰基)二硫化物(1.37g，0.005mol)和4，4′-偶氮双(4-氰基戊酸)(2.10g，0.0075mol)在乙酸乙酯(50mL)中的溶液在回流状态下加热18h。旋转蒸发溶剂后，通过柱色谱法、使用硅胶作为固定相和50∶50乙酸乙酯己烷作为洗脱剂分离粗的4-氰基-4-(乙基硫烷基硫羰基)硫烷基戊酸(ECT)。
B.聚(甲基丙烯酸N，N-二甲氨基乙酯)大链转移剂(聚DMAEMAmacroCTA)
DMAEMA的RAFT聚合在30℃、在氮气气氛中、在DMF中使用ECT和2，2′-偶氮双(4-甲氧基-2.4-二甲基戊腈)(V-70)(Wako chemicals)作为自由基引发剂进行18小时。起始单体与CTA之比([(CTA]0/[M]0使得在100％转化率下的理论值Mn是10,000(g/mo l)。起始CTA与引发剂之比([CTA]0/[I]0)是10∶1。通过沉淀入50∶50v∶v乙醚/戊烷分离所得到的聚DMAEMA大链转移剂。将得到的聚合物再溶于丙酮，然后沉淀入戊烷(x3)，真空干燥过夜。
C.DMAEMA、PAA和BMA从聚(DMAMEA)macroCTA的嵌段共聚合
将期望的化学计算量的DMAEMA、PAA和BMA加入到溶于N，N-二甲基甲酰胺的聚(DMAEMA)macroCTA中(25wt％单体和macroCTA：溶剂)。就全部聚合而言，[M]o/[CTA]o和[CTA]o/[I]o分别是250∶1和10∶1。在添加V70后，用氮气将溶液净化30min，使其在30℃反应18h。通过沉淀入50∶50v∶v乙醚/戊烷分离所得到的二嵌段共聚物。然后将沉淀的聚合物再溶于丙酮，然后沉淀入戊烷(x3)，真空干燥过夜。利用凝胶渗透色谱法(GPC)测定在DMF中的聚(DMAEMA)macroCTA和二嵌段共聚物样品相对于聚甲基丙烯酸甲酯标准品而言的分子量和多分散性(PDI，Mw/Mn)(与Viscotek GPCmax VE2001和折射计VE 3580(Viscotek，Houston，TX)串联的SEC Tosoh TSK-GEL R-3000和R-4000柱(Tosoh Bioscience，Montgomery ville，PA))。包含1.0wt％LiBr的HPLC-级DMF用作流动相。图1概括了一些RAFT合成聚合物的分子量和组成。
实施例1.2.由聚(PEGMA)macroCTA制备DMAEMA、PAA和BMA的第二嵌段(B1-B2-B3)共聚物
将期望的化学计算量的DMAEMA、PAA和BMA加入到溶于N，N-二甲基甲酰胺的聚(PEGMA)macroCTA中(25wt％单体和macroCTA：溶剂)。就全部聚合而言，[M]o/[CTA]o和[CTA]o/[I]o分别是250∶1和10∶1。在添加AIBN后，用氮气将溶液净化30min，使其在68℃反应6-12h(图2)。通过沉淀入50∶50v∶v乙醚/戊烷分离所得到的二嵌段共聚物。然后将沉淀的聚合物再溶于丙酮，然后沉淀入戊烷(x3)，真空干燥过夜。利用凝胶渗透色谱法(GPC)，使用Viscotek GPCmax VE2001和折射计VE3580(Viscotek，Houston，TX)测定在DMF中的聚(PEGMA)macroCTA和二嵌段共聚物样品的分子量和多分散性(PDI，Mw/Mn)。包含1.0wt％LiBr的HPLC-级DMF用作流动相。CDCl3中的NMR光谱法用于证实聚合物结构和计算第二嵌段的组成。图2概括了[PEGMAW]-[B-P-D]聚合物的合成，其中w＝7-8，图3A、3B和3C概括了[PEGMAW]-[B-P-D]聚合物的表征，其中w＝7-8。
实施例1.3.PEGMA-DMAEMA共聚物的制备和表征
使用与实施例1.1和1.2中所述类似的方法进行聚合物合成。通过使用各单体的不同进料比改变PEGM和DMAEMA在第一嵌段中的比例，生成图4中所述的共聚物。
实施例1.4.PEGMA-MAA(NHS)共聚物的制备和表征
使用单体进料比，如实施例1.1和1.2所述(和图5中概括的)进行聚合物合成，得到期望的第一嵌段共聚物的组成。图6A、6B和6C概括了[PEGMAW-MAA(NHS)]-[B-P-D]聚合物的合成和表征，其中第一嵌段中单体的共聚物之比是75∶25。可以在室温或37℃、在pH 7.4-8.5的含水缓冲液(磷酸盐或碳酸氢盐)中将包含NHS的聚合物孵育1-4hrs，生成水解(酸性)形式。
实施例1.5.DMAEMA-MAA(NHS)共聚物的制备和表征
使用单体进料比，如实施例1.1和1.2所述进行聚合物合成，得到期望的第一嵌段共聚物的组成。图7A、7B和7C概括了[DMAEMA-MAA(NHS)]-[B-P-D]聚合物的合成和表征，其中第一嵌段中单体的共聚物之比是70∶30。可以在室温或37℃、在pH 7.4-8.5的含水缓冲液(磷酸盐或碳酸氢盐)中将包含NHS的聚合物孵育1-4hrs，生成水解(酸性)形式.
实施例2.用于siRNA药物递送的HPMA-PDS(RNA)共聚物缀合物的制备和表征
A.吡啶基二硫化物甲基丙烯酸酯单体(PDSMA)的合成
将PDSMA的合成反应路线概括在图8中。将Aldrithiol-2TM(5g，22.59mmol)溶于40ml甲醇和1.8ml AcOH。将该溶液作为2-氨基乙硫醇.HCl(1.28g，11.30mmol)在20ml甲醇中的溶液的形式在30min内加入。将该反应体系在N2气氛中在R.T.搅拌48h。蒸发溶剂后，用40ml乙醚将残余油状物洗涤2次。将粗化合物溶于10ml甲醇，用50ml乙醚将产物沉淀2次，得到期望的化合物1，为淡黄色固体。收率：95％。
将吡啶二硫乙胺(1，6.7g，30.07mmol)和三乙胺(4.23ml，30.37mmol)溶于DMF(25ml)和吡啶(25ml)，在0℃通过注射器缓慢加入甲基丙烯酰氯(3.33ml，33.08mmol)。将该反应混合物在R.T.搅拌2h。反应后，用饱和NaHCO3(350ml)使反应停止，用乙酸乙酯(350ml)萃取。再用10％HCl(100ml，1次)和纯水(100ml，2次)洗涤合并的有机层，用MgSO4干燥。通过柱色谱法纯化纯产物(EA/Hex：1/10-2/1)，为黄色糖浆状物。Rf＝0.28(EA/Hex＝1/1).收率：55％。
B.HPMA-PDSMA共聚物合成
N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)和吡啶基二硫化物甲基丙烯酸酯(典型地以70∶30的单体比)的RAFT聚合在DMF(50重量％单体：溶剂)中、在68℃、在氮气气氛中使用2，2′-偶氮-双-异丁腈(AIBN)作为自由基引发剂进行8小时(图9)。CTA与AIBN的摩尔比为10∶1，设定单体与CTA之比，使得若转化率为100％则可以得到25,000g/mol的分子量。通过反复从甲醇中沉淀入乙醚分离聚(HPMA-PDS)macro-CTA。
真空干燥macro-CTA 24小时，然后用于甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)、丙基丙烯酸(PAA)和甲基丙烯酸丁酯(BMA)的嵌段共聚合。将等摩尔量的DMAEMA、PAA和BMA([M]o/[CTA]o＝250)加入到溶于N，N-二甲基甲酰胺的HPMA-PDS macroCTA中(25wt％单体和macroCTA：溶剂)。加入自由基引发剂AIBN，其中CTA与引发剂之比为10∶1。使聚合在氮气气氛中在68℃进行8小时。然后通过沉淀入50∶50乙醚/戊烷、在沉淀之间再溶于乙醇而分离所得到的二嵌段聚合物。用乙醚将产物洗涤1次，真空干燥过夜。
C.siRNA与HPMA-PDSMA共聚物的缀合
硫氢基化siRNA以商品方式得到(Agilent，Boulder，CO)，为具有二硫化物修饰的5′-有义链的双链体RNA。通过将冻干化合物溶于水制备用于缀合的游离硫氢基形式，用固定在琼脂糖凝胶内的二硫化物还原剂TCEP处理1小时。然后将还原的RNA(400uM)与吡啶基二硫化物-官能化聚合物在包含5mM乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸盐缓冲液(pH 7)中反应24小时(图8)。
吡啶基二硫化物聚合物与RNA硫醇的反应生成2-吡啶硫酮，其可以以分光光度方式测定以表征缀合效率。为了进一步验证二硫化物交换，使缀合物上SDS-PAGE 16.5％三(羟甲基)甲基甘氨酸凝胶。平行用固定的TCEP处理缀合反应的等分部分，然后上SDS-PAGE，以验证在还原环境中RNA从聚合物中释放。缀合反应以聚合物/RNA化学计量比为1、2和5进行。在343nm对2-吡啶硫酮释放的UV分光光度吸光度测量值用于测定缀合效率。
实施例3：用细胞靶向剂合成聚合物：叠氮基-终止的聚合物与叶酸炔丙酯的Click反应
受控自由基聚合和叠氮化物-炔click化学法的组合用于制备与生物配体(例如叶酸)缀合的嵌段共聚物胶束，这种生物配体具有活跃地靶向包含所关注特异性受体的特异性组织/细胞的潜能(例如叶酸)。通过如实施例1所述的可逆添加-分段链转移(RAFT)聚合合成嵌段共聚物，只是使用叠氮基链转移剂(CTA)。然后使聚合物的叠氮基末端与靶向剂(例如叶酸)的炔衍生物反应，产生包含靶向剂的聚合物。
RAFT剂的合成
如下制备RAFT链转移剂(CTA)2-十二烷基硫烷基硫羰基硫烷基-2-甲基-丙酸3-叠氮基丙酯(C12-CTAN3)：
3-叠氮基丙醇的合成。使3-氯-1-丙醇(5.0g，53mmol，1.0当量)和叠氮化钠(8.59g，132mmol，2.5当量)在DMF(26.5mL)中、在100℃反应48h。将该反应混合物冷却至室温，倾入乙醚(200mL)，用饱和NaCl水溶液(500mL)萃取。分离有机层，用MgSO4干燥，过滤。浓缩上清液，得到产物(5.1g，95％收率)。
2-十二烷基硫烷基硫羰基硫烷基-2-甲基-丙酰氯(DMP-Cl)的合成
在50mL圆底烧瓶中将2-十二烷基硫烷基硫羰基硫烷基-2-甲基-丙酸(DMP，Noveon＞95％)(1.0g，2.7mmol，1.0当量)溶于二氯甲烷(15mL)，将该溶液冷却至约0℃。在氮气气氛中缓慢加入草酰氯(0.417g，3.3mmol，1.2当量)，使该溶液达到室温，总计搅拌3h。减压浓缩所得到的溶液，得到酰氯产物(1.0g，99％收率)。
2-十二烷基硫烷基硫羰基硫烷基-2-甲基-丙酸3-叠氮基丙酯的合成
在50mL圆底烧瓶中将3-叠氮基丙醇(265mg，2.62mmol，1.0当量)溶于二氯甲烷(5mL)，将该溶液冷却至约0℃。在10min内滴加三乙胺(0.73mL)在二氯甲烷(5mL)中的溶液。滴加DMP-Cl(1.0g，2.6mmol)在二氯甲烷(5mL)中的溶液，使该溶液达到室温，同时搅拌3h。减压浓缩该溶液，用乙醚(100mL)稀释，用饱和碳酸氢钠水溶液(50mL)、水(50mL)和饱和NaCl溶液(50mL)依次洗涤。分离有机层，用MgSO4干燥(1.0g)，过滤。减压浓缩上清液，得到产物(1.05g，90％收率)，为残余油状物。
叶酸炔丙酯的合成
将叶酸(1.0g，0.0022mol)溶于DMF(10mL)，用水/冰浴冷却。加入N-羟基琥珀酰亚胺(260mg，0.0025mol)和EDC(440mg，0.0025mol)，将得到的混合物在冰浴中搅拌30min，得到白色沉淀。加入炔丙胺(124mg，2.25mmol)在DMF(5.0mL)中的溶液，将得到的混合物温至室温，搅拌24h。将该反应混合物倾入水(100mL)，搅拌30min，形成沉淀。过滤橙-黄色沉淀，用丙酮洗涤，真空干燥6h，得到1.01g产物(93％收率)。
叠氮基-终止的聚合物与叶酸炔丙酯的Click反应
通过下列实施例方法使叠氮基-终止的聚合物与叶酸炔丙酯反应。用氮气将N3-α-[Ds-Xt]b-[Bx-Pv-Dz]a-ω(0.0800mmol)在DMF(7mL)中的溶液和五甲基二亚乙基三胺(PMDETA，Aldrich，99％)(8.7mg，0.050mmol)净化60min，在氮气气氛中通过注射器转入安装了磁搅拌棒的包含CuBr(7.2mg，0.050mmol)和叶酸炔丙酯(42mg，0.088mmol)的小瓶中。将该反应混合物在26℃、在没有氧的存在下搅拌22h。使该反应混合物接触空气，使该溶液通过中性氧化铝柱。真空除去DMF，使产物沉淀入己烷。将得到的叶酸-终止的嵌段共聚物叶酸-α-[Ds-XL]b-[Bx-Py-Dz]a-ω溶于THF，过滤，以除去过量叶酸炔丙酯。除去THF，然后将聚合物溶于去离子(DI)水，使用具有1000Da分子量截留值的膜透析6h。通过冻干分离聚合物。
实施例4：嵌段共聚物PRx0729v6的NMR光谱(图10)
本实施例使用NMR光谱法提供聚合物PRx0729v6在水溶液中形成胶束样结构的证据。
在25℃在氘代氯仿(CDCl3)和氘代水(D2O)中用Bruker AV301记录1HNMR光谱。使用氘锁(CDCl3，D2O)，以ppm计来自四甲基硅烷(用于CDCl3)和3-(三甲代甲硅烷基)丙酸-2，2，3，3-d4酸钠盐(用于D2O)的化学位移。聚合物浓度是6mg/mL。
使用聚合物PRx0729v6作为实例的在含水缓冲液中的合成聚合物NMR光谱提供了本发明二嵌段聚合物在水溶液中形成胶束的证据。胶束的形成导致隔离的粘性内芯形成，它限制了形成芯段的质子运动并且防止了溶剂与芯质子之间的氘交换。这反映为相应质子的1H NMR信号显著抑制或消失。我们使用这种溶液NMR光谱法的内在特性证实胶束芯的疏水性嵌段被有效隔离。如果胶束在含水介质中形成，则应出现因疏水性共聚物嵌段的质子导致的信号消失。
图10显示聚合物PRx0729v6在CDCl3(有机溶剂)和D2O(含水溶剂)中的1H NMR实验。在室温下聚合物在CDCl3中的1H NMR光谱(图10A)显示信号归因于全部聚合物质子，显示聚合物链保持分散在(未聚集)在CDCl3中，防止其运动，所以，其质子可以与溶剂交换。这显示具有隔离芯的稳定胶束并非由PRx0729v6在有机溶剂中形成。图10B显示PRx0729v6在D2O中的1H NMR光谱。代表疏水性嵌段(BMA、PAA、DMAEMA)质子的信号从光谱中消失。这显示具有隔离芯的稳定胶束由PRx0729v6在水溶液中形成。此外，在同一光谱中，归因于DMAEMA(2.28ppm)的两个甲基共振的信号发生显著抑制，这意味着仅构成壳的第一聚DMAEMA嵌段接触水，即主要是DMAEMA的带电荷基团。简单计算显示从CDCl3中的信号(5600)扣除疏水性嵌段的PAA、DMAEMA的积分百分比(2900)得到在D2O中同一信号的近似值(2811)，符合该结论。
1H NMR实验结果共同显示聚合物PRx0729v6形成具有有序芯-壳结构的胶束，其中第一嵌段聚DMAEMA形成包围由疏水性单元(BMA)和带相反电荷的静电稳定单元(PAA，DMAEMA)组成的芯的水化外壳。
实施例5.聚合物PRx0729v6颗粒在有机溶剂中的稳定性(图11)
本实施例显示聚合物PRx0729v6的胶束结构在有机溶剂中解离，这符合胶束芯的疏水性。
将聚合物PRx0729v6以1mg/mL的浓度溶于不同有机溶剂，通过动态光散射测定粒度。图11显示增加浓度的二甲基甲酰胺(DMF)导致胶束解离成聚集的链。
实施例6：聚合物PRx0729v6的透射电子显微镜检查(TEM)分析(图12)
本实施例使用电子能谱学提供了聚合物PRx0729v6形成球形胶束样颗粒的证据。
将聚合物PRx0729v6在PBS中的0.5mg/mL溶液施用于碳涂敷的铜载网30分钟。将该网在Karnovsky溶液中固定，用二甲基胂酸盐缓冲液洗涤一次，然后用水洗涤8次。用乙酸双氧铀的6％溶液将该网染色15分钟，然后干燥至分析为止。用JEOL显微镜进行透射电子显微镜检查(TEM)。图12显示聚合物PRx0729v6的典型电子显微照片，证实了具有与通过动态光散射在溶液中测定的那些类似的近似大小的球形颗粒。
实施例7.pH对聚合物结构的影响(图13)
本实施例显示聚合物PRx0729v6.2的胶束结构在pH从7.4降至4.7时解离。
通过在pH 7.4的动态光散射和以从0.5mg/mL到0.004mg/mL的5-倍连续稀释的一系列在PBS中的酸性pH值(降至pH4.7)测定聚合物PRx0729v6.2的粒度。图13A显示在pH 7.4，聚合物在低至4μg/ml的稀释下稳定，在4μg/ml开始解离成产生聚集物的形式。图13B显示在增加的酸性pH值(降至pH 4.7)时，聚合物从胶束结构中的解离得到促进，即以较高聚合物浓度发生，产生增加水平的1-8nm大小的聚合物单体。
实施例8.聚合物PRx0729v6的临界胶束浓度(CMC)(图14)
下列实施例显示聚合物PRx0729v6形成的胶束对100-倍稀释稳定。
聚合物PRx0729v6以1mg/mL±0.5M NaCl的浓度在PBS缓冲液pH 7.4中的粒度。通过动态光散射、在从1mg/mL到1.6ug/mL的5-倍连续稀释度(用PBS±0.5M NaCl)范围内测定粒度。图14显示约45nm的粒度对降至约10ug/mL的浓度稳定。聚合物PRx0729v6显示在低于约5ug/mL(CMC)下不稳定，在该浓度下各聚合物链解离并且形成非特异性聚集物。
实施例9：异质(混合的)聚合物胶束的制备
异质(混合的)聚合物胶束包含两种或多种组成不同的聚合物。两种或多种组成不同的聚合物(例如聚合物A和聚合物B)各自可以是包含亲水性嵌段和疏水性嵌段的嵌段共聚物。
可以通过在第一变性介质中提供第一聚合物和在组成上不同于第一聚合物的第二聚合物，形成第一聚合物和第二聚合物的异质混合物，从而形成异质胶束。使异质混合物接触第二含水介质，使第一种聚合物的疏水性嵌段与第二种聚合物的疏水性嵌段在该含水介质中缔合，以装配成和形成包含第一聚合物和第二聚合物的异质胶束。
多核苷酸可以(例如离子性或共价方式偶合)与至少一种第一种聚合物、第二种聚合物或异质胶束缔合。
作为非限制性实例，通过如实施例1所述的RAFT聚合制备包含嵌段共聚物#1的第一种聚合物。类似地使用不同亲水性嵌段和相同疏水性嵌段制备包含嵌段共聚物#2的第二种聚合物。例如，制备嵌段共聚物#1的(聚DMAEMA)阳离子亲水性嵌段，其具有中性的亲水性嵌段，例如包含如下单体单元的均聚物嵌段，所述单体单元具有与其侧基共价连接的聚乙二醇寡聚体(例如PEGMA)。作为另一个实例，还可以使用可替代选择的第二种聚合物制备异质聚合物胶束，所述可替代选择的第二种聚合物包括亲水性嵌段，其包含通过在100％乙醇中混合等量的两种共聚物DMAEMA和PEGMA、然后在PBS pH 7.4中20倍稀释或对PBS pH 7.4透析所形成的50％DMAEMA和50％PEGMA的随机共聚物。在每种情况中，可遵循上述一般方法形成异质胶束。
实施例10：siRNA/聚合物复合物表征
在通过琼脂糖凝胶阻滞验证完全的血清稳定的siRNA复合后，使用ZetaPALS检测器(Brookhaven Instruments Corporation，Holtsville，NY，15mW激光，入射束＝676nm)表征siRNA/聚合物复合物的大小和ζ电位。简言之，将聚合物在磷酸缓冲盐水(PBS，Gibco)中配制成0.1mg/mL，通过以所示的基于带正电荷的DMAEMA(在pH＝7.4下50％质子化)和带负电荷的siRNA的理论电荷比添加聚合物至GAPDH siRNA(Ambion)中形成复合物。在90°散射角采集相关函数，在25℃使用水的粘度和折射率计算粒度。将粒度表示为有效直径(推定对数正态分布)。在25℃使用ZetaPALSζ电位分析软件测定平均电泳迁移率，使用针对含水混悬液的Smoluchowsky模型计算ζ电位。
实施例11：HeLa细胞培养
在37℃和5％CO2将HeLa细胞即人宫颈癌细胞(ATCC CCL-2)维持在包含L-谷氨酰胺(Gibco)、1％青霉素-链霉素(Gibco)和10％胎牛血清(FBS，Invitrogen)的极限必需培养基(MEM)中。
实施例12：载体和siRNA/聚合物复合物的pH-依赖性膜破裂
溶血用于测定在模拟内体运输的pH值(胞外pH＝7.4、初级内体pH＝6.6和次级内体pH＝5.8)下游离聚合物和siRNA/聚合物缀合物的潜在内体裂解活性。简言之，将人全血采集在包含EDTA的真空容器内。离心血液，抽吸血浆，用150mM NaCl洗涤3次以分离红细胞(RBC)。然后将RBC混悬于pH 7.4、pH 6.6或pH 5.8的磷酸盐缓冲液(PB)。然后在37℃将聚合物(10ug/mL)或聚合物/siRNA复合物与RBC一起在上述3种pH值下孵育1小时。然后离心完整RBC，通过541nm的吸光度测定释放入上清液中的血红蛋白，作为pH-依赖性RBC膜裂解的指示。
实施例13：载体-介导的siRNA摄取的测定
使用流式细胞计量术(Becton Dickinson LSR台式分析仪)测定siRNA/聚合物复合物的胞内摄取。以15,000个细胞/Gm2接种Hela细胞，使其贴壁过夜。在室温下使FAM(5-羧基荧光素)标记的siRNA(Ambion)与聚合物以4∶1的理论电荷比复合30min，然后以25nM的siRNA终浓度加入到铺板的HeLa细胞中。与复合物孵育4h后，使细胞胰蛋白酶化，重新混悬于含有0.5％BSA和0.01％台盼蓝的PBS。如上所述使用台盼蓝以使胞外荧光猝灭和区分被细胞胞吞的复合物。每份样品分析10,000个细胞，使用未接受处理和接受未与FAM标记的siRNA复合的聚合物的样品测定荧光门控。
实施例14：siRNA/聚合物复合物细胞毒性
使用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒(Roche)测定siRNA/聚合物复合物细胞毒性。以12,000个细胞/孔的密度将HeLa细胞接种在96-孔培养板上，使其贴壁过夜。通过以4∶1的理论电荷比将聚合物(0.1mg/mL储备溶液)添加到GAPDH siRNA中，得到25nM siRNA/孔的浓度，由此形成复合物。一式三份将复合物(电荷比＝4∶1)加入到各孔中。将细胞与聚合物复合物一起孵育24小时后，除去培养基，用PBS将细胞洗涤2次。然后在4℃用裂解缓冲液(100uL/孔，20mM Tris-HCl，pH 7.5，150mM NaCl、1mM Na2EDTA、1mM EGTA、1％Triton、2.5mM焦磷酸钠、1mM β-甘油磷酸酯、1mM原钒酸钠)将细胞裂解1小时。通过移液混合后，用PBS按照1∶5稀释20uL细胞裂解液，通过与100uL LDH底物溶液混合而对乳酸脱氢酶(LDH)定量。进行10-20min孵育以形成颜色后，在490nm测定吸光度，将参比物设定在650nm。
实施例15：用siRNA/聚合物复合物评价GAPDH蛋白质和基因敲低
使用GAPDH活性测定法(Ambion)筛选用于siRNA递送的系列聚合物的功效。将HeLa细胞(12,000个细胞/cm2)在96-孔培养板上铺板。24h后，在10％血清的存在下以25nM siRNA终浓度将复合物(电荷比＝4∶1)加入到细胞中。转染后48h评价siRNA-介导的GAPDH蛋白质减少程度。作为阳性对照，使用HiPerFect(Qiagen)、按照制造商的说明进行平行敲低实验。如制造商所述、使用动态荧光增加法在5min内测定剩余GAPDH活性，根据下式计算：％剩余表达＝Δ荧光，GAPDH/Δ荧光，未处理组，其中Δ荧光＝荧光5min-荧光1min。当使用siRNA的非靶向序列时，转染方法不会显著影响GAPDH表达。
在最初筛选以鉴定产生最强烈siRNA-介导的GAPDH敲低的载体后，利用实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)直接评价siRNA递送。与如上所述形成的复合物一起孵育48小时后，用PBS冲洗细胞。使用Qiagen的Qiashredder和RNeasy小型试剂盒分离总RNA。消化样品中的任意残留基因组DNA(RNase-Free DNase Set，Qiagen)，使用RiboGreen测定法(Molecular Probes)基于制造商说明书对RNA定量。
使用Omniscript RT试剂盒(Qiagen)进行逆转录。25ng总RNA样品用于cDNA合成，使用ABI Sequence Detection System 7000、应用预先设计的GAPDH和β-肌动蛋白(作为持家基因)引物和探针组(Assays on Demand，Applied Biosystems)进行PCR。反应物(总计20ul)由10uL2X Taqman Universal PCR Mastermix、1uL引物/探针和2uL cDNA组成，其中使用不含核酸酶(Ambion)的水达到20uL。使用如下PCR参数：95℃，90s，然后是95℃30s和55℃60s的45个循环。阈值循环(CT)分析用于定量GAPDH、对β-肌动蛋白标准化并且表示为相对于未处理的HeLa细胞表达的水平。
实施例16：与siRNA复合的聚合物PRx0729v6的粒度的动态光散射(DLS)测定(图15)
下列实施例证实了聚合物PRx0729v6单独时形成均匀的仅45nm的颗粒，而在结合siRNA之后形成47nm大小的颗粒。
通过动态光散射(DLS)、使用Malvern Zetasizer Nano ZS测定单独聚合物或聚合物/siRNA复合物的粒度。将冻干聚合物以10-50mg/mL溶于100％乙醇，然后稀释10-倍入磷酸盐缓冲液pH 7.4。就单独的PRx0729v6而言以1mg/mL或就与1uM GAPDH-特异性21mer-siRNA(Ambion)复合的PRx0729v6而言以0.7mg/mL测定磷酸缓冲盐水pH 7.4(PBS)中的聚合物，其中复合物中理论电荷比为4∶1，即聚合物上的正电荷：siRNA上的负电荷。单独的PRx0729v6(45nm)和与siRNA复合的PRx0729v6(47nm)(图15)显示具有接近均匀分布的类似粒度，PDI＜0.1。
实施例17：不同电荷比的聚合物PRx0729v6/siRNA复合物的凝胶迁移分析(图16)
下列实施例证实聚合物PRx0729v6以不同电荷比结合siRNA，从而产生具有减少电泳迁移率的复合物。
通过凝胶电泳分析聚合物siRNA结合(图16)，显示完全的siRNA与聚合物结合在聚合物/siRNA电荷比为4∶1及更高时发生。
实施例18：siRNA与胶束的缀合
A.双链siRNA与含硫氢基的嵌段共聚物的缀合
通过将氨基-siRNA以10mg/mL溶于50mM磷酸钠、0.15M NaCl pH7.2或另一种非-胺缓冲液例如硼酸盐、Hepes、碳酸氢盐(具有适合于NHS酯修饰范围的pH，pH 7-9)制备siRNA-吡啶基二硫化物。将SPDP以6.2mg/mL的浓度溶于DMSO(20mM储备溶液)，将25ul SPDP储备溶液加入到待修饰的每ml氨基-siRNA中。混合该溶液，在室温反应至少30min。较长反应时间(包括过夜)不会对修饰产生不良影响。通过使用50mM磷酸钠、0.15M NaCl、10mM EDTA pH 7.2透析(或凝胶过滤)，从反应副产物中纯化经修饰的RNA(吡啶基二硫化物)。使制备的s iRNA-吡啶基二硫化物以1∶5的摩尔比与聚合物PRx0729v6(在ω-端上包含游离硫氢基)在10-50mM EDTA的PBS溶液(pH 7.2)的存在下反应。根据吡啶-2-硫酮的释放以分光光度法和通过凝胶电泳监测反应程度。
B.单链RNA与聚合物的缀合、然后是第二链退火
使用上述实施例的方法、以单链氨基修饰的RNA为原料制备单链RNA吡啶基二硫化物缀合物。在使RNA吡啶基二硫化物与嵌段共聚物胶束偶合后，将互补的RNA链加入到该反应混合物中，使两链在低于双链体RNA的Tm约20℃的温度下退火1hr。
实施例19：siRNA-胶束复合物在培养的哺乳动物细胞中的敲低活性(图17和图18)
在96-孔格中通过测定用PRx0729v6：siRNA复合物处理24小时后的特异性基因表达检测siRNA/聚合物PRx0729v6复合物的敲低(KD)活性。在25uL中混合聚合物和GAPDH靶向s iRNA或阴性对照siRNA(Ambion)，得到不同电荷比和超过最终转染浓度范围内5-倍浓度的浓度，使其复合30分钟，然后添加到包含10％FBS的100uL标准培养基中的HeLa细胞中。在100、50、25和12.5nM评价最终s iRNA浓度。以4∶1、2∶1或1∶1电荷比或18、9、4.5和2.2ug/mL的固定聚合物浓度添加聚合物，以测定何种条件产生最高KD活性。就电荷比而言(图17A)，制备较高浓度的复合物，孵育30分钟，然后恰在添加到细胞中前以图表所示5-倍以上浓度系列稀释。就固定聚合物浓度而言(图17B)，如图所示以5-倍以上浓度复合s iRNA和聚合物，孵育30分钟，然后添加到细胞中至所示终浓度。图17C是阴性对照。处理后24小时分离总RNA，通过定量PCR测定相对于2种内部校准基因RPL13A和HPRT的GAPDH表达。图17A、17B、17C以及图18A和图18B的结果显示，使用9ug/mL和较高浓度的PRx0729v6在全部测试siRNA浓度下均得到＞60％KD活性(阴影)。该浓度符合来自粒度分析的稳定胶束形成。当制备高浓度复合物并且系列稀释时(4∶1电荷比)，与较低浓度(4.5ug/mL固定聚合物浓度)下的胶束形成相比，仅使用4.5ug/mL PRx0729v6/12.5nM siRNA就得到了高KD活性。另外，仅100nM siRNA与4.5ug/mL PRx0729v6显示高KD活性，而较低siRNA浓度没有显示。概括地说，PRx0729v6胶束对降至～10ug/mL的稀释稳定，KD活性在低于～5ug/mL时失去，显示稳定的胶束是良好KD活性所需的。
实施例20：切丁酶底物GAPDH siRNA-聚合物复合物在培养的哺乳动物细胞中的敲低活性
在96-孔b格中通过测定用聚合物：GAPDH切丁酶siRNA复合物处理24小时后的GAPDH基因表达而检测GAPDH特异性切丁酶底物siRNA/聚合物复合物的敲低(KD)活性。GAPDH切丁酶siRNA序列为：有义链：TGrGrUrCrArUrCrCrArUrGrArCrArArCrUrUrUrGrGrUrAdTdC；反义链：TGrArUrArCrCrArArArGrUrUrGrUrCrArUrGrGrArUrGrArCrCrUrU。在25uL中混合聚合物和GAPDH靶向siRNA或阴性对照siRNA(IDT)，得到不同电荷比和超过最终转染浓度范围内5-倍的浓度，使其复合30分钟，然后添加到包含10％FBS的100uL标准培养基中的HeLa细胞中。在100、50、25和12.5nM检验最终siRNA浓度。以4∶1、2∶1或1∶1电荷比或40、20、10和5ug/mL的固定聚合物浓度添加聚合物，以测定何种条件产生最高KD活性。处理后24小时分离总RNA，通过定量PCR测定相对于2种内部校准基因RPL13A和HPRT的GAPDH表达。结果显示，在测试的全部siRNA浓度下，使用10ug/mL和更高浓度的聚合物得到＞60％KD活性。这种聚合物浓度符合从粒度分析得到的稳定胶束形成。
实施例21：ApoB100siRNA-聚合物复合物在培养的哺乳动物细胞中的敲低活性
在96-孔格中通过测定用聚合物：ApoB siRNA复合物处理24小时后ApoB100基因的表达检测与聚合物复合的ApoB100特异性s iRNA或切丁酶底物s i RNA的敲低(KD)活性。ApoB100siRNA序列为：有义链：5′rGrArArUrGrUrGrGrGrUrGrGrCrArArCrUrUrUrArG-S′；反义链：5′-rArArArGrUrUrGrCrCrArCrCrCrArCrArUrUrCrArG-3′。ApoB100切丁酶底物siRNA序列为：有义链：5′-TGrArArUrGrUrGrGrGrUrGrGrCrArArCrUrUrUrArArArGdGdA；反义链：5′-TUrCrCrUrUrUrArArArGrUrUrGrCrCrArCrCrCrArCrArUrUrCrArG-S′。在25uL中混合聚合物和ApoB靶向s iRNA或阴性对照siRNA(IDT)，得到不同电荷比和超过最终转染浓度范围内5-倍的浓度，使其复合30分钟，然后添加到包含10％FBS的100uL标准培养基中的HepG2细胞中。在100、50、25和12.5nM检验最终s i RNA浓度。以4∶1、2∶1或1∶1电荷比或40、20、10和5ug/mL的固定聚合物浓度添加聚合物，以测定何种条件产生最高KD活性。处理后24小时分离总RNA，通过定量PCR测定相对于2种内部校准基因RPL13A和HPRT的ApoB100表达。结果显示，在测试的全部siRNA浓度下，使用10ug/mL和更高浓度的聚合物得到＞60％KD活性。这种聚合物浓度符合从粒度分析得到的稳定胶束形成。
实施例22：ApoB100 siRNA-聚合物复合物在小鼠模型中的敲低活性
通过测定肝组织中ApoB100的表达和血清胆固醇水平，测定小鼠模型中ApoB100特异性siRN A/聚合物复合物的敲低活性。通过尾静脉对Balb/C小鼠静脉内给予1，2或5mg/kg的与聚合物以1∶1、2∶1或4∶1电荷比(聚合物：siRNA)复合的ApoB特异性siRNA或盐水对照。最终剂量后48小时处死小鼠，分离血液和肝样品。测定血清中的胆固醇水平。从肝中分离总RNA，通过定量PCR测定相对于2种内部校准基因HPRT和GAPDH的ApoB100表达。结果显示，在2mg/kg siRNA剂量下，肝中ApoB mRNA水平下降＞60％。这种下降是剂量依赖性的，因为5mg/kg siRNA剂量显示＞80％KD，而1mg/kg siRNA剂量显示～50％KD。还以剂量依赖性方式观察到血清胆固醇水平下降(与盐水对照相比下降～30-50％)。
实施例23.ApoB100反义DNA寡核苷酸-聚合物复合物在培养的哺乳动物细胞中的敲低活性
在96-孔格中通过测定用聚合物：ApoB反义DNA寡核苷酸复合物处理24小时后的ApoB100基因表达，检测与聚合物复合的ApoB100特异性反义DNA寡核苷酸的敲低(KD)能力。对小鼠ApoB具有特异性的2种ApoB100反义寡核苷酸为：
5′-GTCCCTGAAGATGTCAATGC-3′，编码区的541位；和
5′-ATGTCAATGCCACATGTCCA-3′，编码区的531位。
在25uL中混合聚合物和ApoB靶向反义DNA寡核苷酸或阴性对照DNA寡核苷酸(乱序的序列)，得到不同电荷比和超过最终转染浓度范围内5-倍的浓度，使其复合30分钟，然后添加到包含10％FBS的100uL标准培养基中的HepG2细胞中。在100、50、25和12.5nM检验最终寡核苷酸浓度。以4∶1、2∶1或1∶1电荷比或40、20、10和5ug/mL的固定聚合物浓度添加聚合物，以测定何种条件产生最高KD活性。处理后24小时分离总RNA，通过定量PCR测定相对于2种内部校准基因RPL13A和HPRT的ApoB100表达。
实施例24：证实胶束及其siRNA复合物的膜去稳定化活性(图19)
通过将单独聚合物或将PRx0729v6：siRNA复合物滴定入人红细胞(RBC)制品，并且根据血红蛋白释放测定膜裂解活性(在540nm吸光度读数)，检测pH响应性膜去稳定化活性。3种不同的pH条件用于模拟内体裂解性pH环境(胞外pH＝7.4，初级内体＝6.6，次级内体＝5.8)。通过离心采集在包含EDTA的真空容器中的全血中分离人红细胞(RBC)。用生理盐水将RBC洗涤3次，使在具体pH(5.8、6.6或7.4)的PBS中达到2％RBC的终浓度。恰好在高于和低于如所示的临界稳定浓度(CSC)的浓度下测试单独的PRx0729v6或PRx0729v6/siRNA复合物(图19)。就聚合物/siRNA复合物而言，将25nM siRNA以1∶1、2∶1、4∶1和8∶1电荷比加入到PRx0729v6(对于单独聚合物，采用相同的聚合物浓度)。在20X最终检测浓度下形成单独的聚合物或聚合物-siRNA复合物的溶液30分钟，将其稀释到各RBC制品中。将2种PRx0729v6聚合物储备溶液的不同制品比较制备后9和15天的活性稳定性，从制备日开始就贮存在4℃。将RBC与单独的聚合物(图19A)或聚合物/siRNA复合物(图19B)一起在37℃孵育60分钟，离心以除去完整RBC。将上清液转入比色杯，在540nm测定吸光度。将溶血百分比表示为A540样品/经1％TritonX-100处理的RBC的A540(对照组100％裂解)。结果显示，单独的PRx0729v6或PRx0729v6/siRNA复合物在pH 7.4下是非溶血性的，并且在与内体相关的较低pH值和较高聚合物浓度下逐步变得更具溶血性。
实施例25.聚合物-siRNA复合物的细胞摄取和胞内分布的荧光显微镜检查(图20)
本实施例显示聚合物PRx0729v6可以介导比基于脂质的转染试剂更有效的荧光标记siRNA的细胞摄取和内体释放。
将HeLa细胞在Lab-Tek II分室盖玻片上铺板。过夜孵育后，用100nM FAM-siRNA/lipofectamine 2000或100nM FAM-siRNA以聚合物-siRNA 4∶1的电荷比转染细胞。复合物在PBS pH 7.4中以5X浓度形成30分钟，将其加入到细胞中达最终1X浓度，孵育过夜。用DAPI染色细胞(用于使芯显影)10分钟，然后在3.7％甲醛-1X PBS中固定5分钟，用PBS洗涤。用Zeiss Axiovert荧光显微镜使样品成像。图20B显示与lipofectamine相比，聚合物-siRNA的细胞摄取和胞内分布的荧光显微镜检查(图20A)。lipofectamine-siRNA复合物的颗粒染色启示了内体定位，而聚合物-s iRNA复合物的弥撒性胞质染色显示它们已经从内体释放入胞质。
实施例23.小的疏水性分子被摄入聚合物PRx0729v6胶束
本实施例显示小的疏水性分子被聚合物PRx0729v6的主要疏水性胶束芯吸收。
通过使用芘(C15H10，MW＝202)的荧光探针技术证实具有或不具有siRNA的聚合物胶束的形成，其中可以使用芘光谱的2个发射最大值之比确定芘分配入胶束芯。使用395nm的固定激发波长与恒定芘浓度6x10-7M从300到360nm测定聚合物胶束溶液中芘的荧光发射光谱。在有或没有100nM siRNA的情况下聚合物从0.001％改变至20％(w/w)。使用Varian荧光分光光度计获取光谱数据。全部荧光实验均在25℃进行。通过绘制作为聚合物浓度函数的强度比I336/I333的图确定临界胶束浓度(CMC)。
类似地，如下将模型小分子药物双嘧达莫(2-{[9-(双(2-羟乙基)氨基)-2，7-双(1-哌啶基)-3，5，8，10-四氮杂双环[4.4.0]癸-2，4，7，9，11-戊烯-4-基]-(2-羟乙基)氨基}乙醇；C24H40N8O4，MW＝505)掺入PRx0729v6胶束芯。将聚合物(1.0mg)和双嘧达莫(DIP)(0.2mg)溶于THF(0.5mL)。滴加去离子水(10mL)，将该溶液在50℃搅拌6h以将药物掺入胶束的疏水芯，分开该溶液(2.5mL)，在25和37℃通过UV-vis光谱法在415nm测定双嘧达莫吸光度。还通过测定没有共聚物存在时在去离子水中的双嘧达莫吸光度的时间依赖性减小进行对照品测量。对每一时间点测定25和37℃的吸光度，从在该溶液中观察到的值中扣除该值。
实施例26：靶向配体和多核苷酸与共聚物缀合的方法
下列实施例显示靶向配体(例如半乳糖)或多核苷酸治疗剂(例如siRNA)与二嵌段共聚物的缀合方法。(1)使用可逆添加碎片链转移(RAFT)制备聚合物(Chiefari等人Macromolecules.1998；31(16)：5559-5562)，以便使用具有半乳糖作为R-基团取代基的链转移剂形成半乳糖末端官能化的二嵌段共聚物。(2)将二嵌段共聚物的第一嵌段制备成包含甲基丙烯酸-N-羟基琥珀酰亚胺(MAA(NHS))的共聚物，其中半乳糖-PEG-胺与NHS基团缀合，或其中氨基-二硫化siRNA与NHS缀合，或其中吡啶基二硫化胺与NHS基团反应，形成吡啶基二硫化物，其随后与硫氢基化RNA反应，形成聚合物-RNA缀合物。
实施例26.1：半乳糖-PEG-胺和半乳糖-CTA的制备
反应路线1示例半乳糖-PEG-胺(化合物3)和半乳糖-CTA(链转移剂)(化合物4)的合成反应路线。
[002781化合物1：将半乳糖五乙酸酯(10g，25.6mmol)和2-[2-(2-氯乙氧基)乙氧基]乙醇(5.6mL，38.4mmol)溶于无水CH2Cl2(64mL)，将该反应混合物在RT搅拌1h。在1h内在冰浴中将BF3-OEt2(9.5ml，76.8mmol)滴加到上述混合物中。将该反应混合物在室温(RT)搅拌48h。反应后，加入30mL CH2Cl2以稀释该反应体系。用饱和NaHCO3(水溶液)中和有机层，用盐水洗涤，然后用MgSO4干燥。减压除去CH2Cl2，得到粗产物。通过闪蒸柱色谱法纯化粗产物，得到终产物1，为淡黄色油状物。收率：55％TLC(I2和对-茴香醛)：EA/Hex：1/1(Rf：β＝0.33；α＝0.32；未反应的S.M 0.30)。
化合物2：将化合物1(1.46g，2.9mmol)溶于无水DMF(35mL)，在RT将NaN3(1.5g，23.2mmol)加入到该混合物中。将该反应混合物加热至85-90℃过夜。反应后，将EA(15mL)加入到该溶液中，水(50mL)用于洗涤有机层5次。用MgSO4干燥有机层，通过闪蒸柱色谱法纯化，得到化合物2，为无色油状物。收率：80％，TLC(I2和对-茴香醛)：EA/Hex：1/1(Rf：0.33)。
化合物3：将化合物2(1.034g，2.05mmol)溶于MeOH(24mL)，用N2发泡10min，然后将Pd/C(10％)(90mg)和TFA(80uL)加入到上述溶液中。用H2使该反应混合物再发泡30min，然后在RT下、在H2气氛中将该反应体系再搅拌3h。用C盐除去Pd/C，蒸发MeOH，得到化合物3，为粘稠凝胶。化合物3可以不经进一步纯化使用。收率：95％.TLC(对-茴香醛)：MeOH/CH2Cl2：1/4(Rf：0.05)。
化合物4：在0℃将ECT(0.5g，1.9mmol)、NHS(0.33g，2.85mmol)和DCC(0.45g，2.19mmol)溶于CHCl3(15mL)。将该反应混合物在RT连续搅拌过夜。在0℃向上述反应体系中缓慢加入在CHCl3(10mL)中的化合物3(1.13g，1.9mmol)和TEA(0.28mL，2.00mmol)。将该反应混合物在RT连续搅拌过夜。减压除去CH3Cl，通过闪蒸柱色谱法纯化粗产物，得到化合物4，为黄色凝胶。收率(35％)。TLC：MeOH/CH2Cl2：1/9(Rf：0.75)。
Figure BDA0000039273700000731
反应路线1.半乳糖-PEG-胺(化合物3)和半乳糖-CTA(化合物4)的合成
实施例26.2：[DMAEMA]-[BMA-PAA-DMAEMA]的合成
A.DMAEMA macroCTA的合成
聚合：在20mL玻璃小瓶(带有隔离帽)中加入33.5mg ECT(RAFTCTA)、2.1mg AIBN(从甲醇中重结晶2次)、3.0g DMAEMA(Aldrich，98％，使用前过小的氧化铝柱以除去抑制剂)和3.0g DMF(高纯度，不含抑制剂)。用隔离帽封闭玻璃小瓶，用干燥氮气净化(在搅拌下在冰浴中进行)30min。在70℃将反应小瓶放入预加热的反应块。将该反应混合物搅拌2h 40min。打开隔离帽，在冰浴中将小瓶内的混合物搅拌2-3分钟以终止聚合反应。
纯化：将3mL丙酮加入到反应混合物中。在300mL烧杯中加入240mL己烷和60mL乙醚(80/20(v/v))，在搅拌下将该反应混合物滴加到烧杯中。最初产生油状物，通过旋降混浊溶液收集；收率＝1.35g(45％)。从丙酮溶液中进行几次己烷/乙醚(80/20(v/v))混合溶剂中的沉淀(例如6次)。最终在RT真空干燥聚合物8h；收率～1g。
概述：(Mn，理论＝11,000g/mol，45％转化率)
Figure BDA0000039273700000741
DMF＝3.0g；N2净化：30min；在70℃进行聚合2h 45min。
B.由DMAEMA macroCTA合成[BMA-PAA-DMAEMA]
除非另有指定，否则全部化学品和试剂购自Sigma-Aldrich Company。使甲基丙烯酸丁酯(BMA)(99％)、甲基丙烯酸2-(二甲氨基)乙酯(DMAEMA)(98％)通过碱性氧化铝柱(150目)，以除去聚合抑制剂。采购不含抑制剂的2-丙基丙烯酸(PAA)(＞99％)并且原样使用。使偶氮(双异丁腈(AIBN)(99％)从甲醇中重结晶，真空干燥。合成DMAEMA macroCTA，如上所述纯化(Mn～10000；PDI-1.3；＞98％)。N，N-二甲基甲酰胺(DMF)(99.99％)(购自EMD)为试剂级并且原样使用。己烷、戊烷和乙醚购自EMD并且原样用于聚合物纯化。
聚合：在密封小瓶中、在氮气气氛中加入BMA(2.1g，14.7mmoles)、PAA(0.8389g，7.5mmoles)、DMAEMA(1.156g，7.35mmoles)、MacroCTA(0.8g，0.0816mmoles)、AIBN(1.34mg，0.00816mmoles；CTA：AIBN 10∶1)和DMF(5.34ml)。CTA：单体比为1∶360(推定50％转化率)。单体浓度为3M。然后通过使氮气进入该混合物发泡30分钟给该混合物脱气，然后放入加热块(温度计：67℃；显示：70-71；搅拌速度300-400rpm)。将该反应体系静置6小时，然后通过将小瓶放入冰和使该混合物接触空气而使反应停止。
纯化：聚合物纯化从丙酮/DMF 1∶1到己烷/乙醚75/25进行(3次)。将得到的聚合物真空干燥至少18小时。NMR光谱显示高纯度聚合物。未观察到乙烯基。将该聚合物从乙醇对双去离子水透析4天，然后冻干。通过凝胶渗透色谱法、使用如下条件分析该聚合物：溶剂：DMF/LiBr 1％.流速：0.75ml/min.注射体积：100ul。
柱温：60℃。聚(苯乙烯)用于校准检测器。得到的聚合物的GPC分析：Mn＝40889g/mol.PDI＝I.43.dn/dc＝0.049967。
实施例26.3.gal-[DMAEMA]-[BMA-PAA-DMAEMA]的合成
如实施例20.2所述进行合成。首先，制备半乳糖-DMAEMAmacroCTA(实施例20.2.A.)，只是使用半乳糖-CTA(实施例20.1，化合物4)替代ECT作为链转移剂。这导致合成具有末端官能化半乳糖的聚DMAEMA(图21)。半乳糖-[DMAEMA]-macro-CTA然后如实施例20.2.B所述用于合成第二嵌段[BMA-PAA-DMAEMA]。合成后，通过在pH 8.5的100mM碳酸氢钠缓冲液中孵育2hrs除去半乳糖上的乙酰基保护基，然后透析，冻干。NMR光谱法用于证实聚合物上脱保护的半乳糖的存在情况。
实施例26.4.[PEGMA-MAA(NHS)]-[B-P-D]和DMAEMA-MMA(NHS)-[B-P-D]二嵌段共聚物的制备和表征
如实施例20.2所述(和图5中概述的)、使用单体进料比进行聚合物合成，得到期望的第一嵌段共聚物组成。图6概述了[PEGMA-MAA(NHS)]-[B-P-D]聚合物的合成和表征，其中第一嵌段中单体的共聚物比为70∶30。
实施例26.5.半乳糖-PEG-胺与PEGMA-MAA(NHS)缀合产生[PEGMA-MAA(Gal)]-[B-P-D]聚合物
图22示例半乳糖官能化的DMAEMA-MAA(NHS)或PEGMA-MAA(NHS)二嵌段共聚物的制备。将聚合物[DMAEMA-MAA(NHS)]-[B-P-D]或[PEGMA-MAA(NHS)]-[B-P-D]以1-20mg/mL的浓度溶于DMF。用1-2当量的三乙胺中和如实施例20.1(化合物3)所述制备的半乳糖-PEG-胺，以5∶1的胺∶聚合物之比加入到该反应混合物中。反应在35℃进行6-12hrs，然后添加等体积的丙酮，对去离子水透析，冻干。
实施例26.6.siRNA与PEGMA-MAA(NHS)]-[B-P-D]缀合产生[PEGMA-MAA(RNA)]-[B-P-D]聚合物
图23A和图23B显示2种修饰的可以与如实施例20.4所述制备的包含NHS的聚合物缀合的siRNAs的结构。siRNAs获自Agilent(Boulder，CO)。图23C显示用于衍生包含NHS的聚合物、得到二硫化物反应基团用于缀合硫氢基化RNA的吡啶基二硫化胺的结构(图23B)。
包含NHS的聚合物与氨基-二硫化物-siRNA的反应。该反应在由有机溶剂(例如DMF或DMSO或混合溶剂DMSO/缓冲液pH 7.8.)组成的标准条件下，在35℃进行4-8hrs，然后添加等体积的丙酮，对去离子水透析1天，冻干。
包含NHS的聚合物与吡啶基-二硫化物-胺的反应和与硫氢基化siRNA的反应。吡啶基二硫化胺与包含NHS的聚合物的反应如实施例20.5进行。然后将冻干的聚合物以50mg/mL溶于乙醇，用pH 8的碳酸氢钠缓冲液稀释10-倍。在35℃将硫氢基化siRNA(图23B)以2-5摩尔过量在聚合物NHS基团上反应4-8hrs，然后对pH 7.4磷酸盐缓冲液透析。
实施例27.胶束聚集数目的测定(聚合物链/胶束)
通过静态光散射(SLS)测定、使用德拜图测定胶束的重均分子量(Mw)和聚集数目(Naggr)。该方法推定颗粒产生的散射光强度与颗粒的重均分子量和浓度结果成正比，正如下式所示：
KC R θ = ( 1 M + 2 A 2 C )
其中Rθ是瑞利比(样品散射光与入射光之比)；M是样品分子量；A2是第二病毒系数；C是浓度；K是定义为K＝40||2(n0 dn/dc)2/λ0 4NA的光学常数，其中NA是阿伏伽德罗数；λ0是激光波长；n0是溶剂折射率；且dn/dc是胶束的差异折光指数增量(0.2076ml/g)。
使用Malvern Zetasizer Nano ZS仪测定一个角度下不同浓度(C)聚合物的散射光强度测量值(K/CR)，并且与由标准品(即甲苯)产生的散射比较。散射光图是直线并且能够测定胶束的绝对分子量，它是0浓度下图的y截距(以道尔顿计的K/CR＝1/MW)。用单聚合物链的分子量(通过GPC-三元检测法计算)除胶束分子量(从德拜图测定)计算聚集数目。对二嵌段共聚物例如[D]10K-[B50-P25-D25]20-66K而言典型值范围在30-50。
尽管本文已经显示和描述了本发明的优选实施方案，但是本领域技术人员显而易见，这种实施方案仅作为实例提供。本领域技术人员目前可以在不脱离本发明的情况下进行大量变化、改变和替代。应理解本文所述本发明实施方案的各种可替代选择可以用于实施本发明。指定下列权利要求定义本发明的范围，并且涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等效方案。

Claims (49)

1.一种组合物，其中包含聚合物胶束和与胶束缔合的多核苷酸，所述胶束包含多个嵌段共聚物，每一嵌段共聚物包含亲水性嵌段和疏水性嵌段，该多个嵌段共聚物缔合使得胶束在约中性pH下、在含水介质中稳定，
(a)所述胶束还具有两种或更多种选自如下的特征：
(i)胶束包含约10-约100个嵌段共聚物/胶束；
(ii)临界胶束浓度CMC在约0.2ug/mL-约20ug/mL；
(iii)在没有核酸存在时自发胶束装配；
(iv)重均分子量为约0.5x 106-约3.6x 106道尔顿；
(v)粒度为约5nm-约500nm；和
(b)所述嵌段共聚物具有一种或更多种选自如下的特征：
(i)亲水性嵌段与疏水性嵌段的数均分子量Mn之比在约1∶1-约1∶10；和
(ii)多分散性指数为约1.0-约2.0。
2.一种组合物，其中包含聚合物胶束和与该胶束缔合的多核苷酸，所述胶束包含多个嵌段共聚物，每一嵌段共聚物包含亲水性嵌段和疏水性嵌段，该多个嵌段共聚物缔合使得胶束在约中性pH下、在含水介质中稳定，
(a)所述胶束还具有两种或更多种选自如下的特征：
(i)胶束包含约10-约100个嵌段共聚物/胶束；
(ii)在0.5M NaCl中的临界胶束浓度CMC在约0.2ug/mL-约20ug/mL；
(iii)在没有核酸存在时自发胶束装配；
(iv)重均分子量为约0.5x106-约3.6x106道尔顿；和
(b)所述嵌段共聚物具有一种或更多种选自如下的特征：
(i)亲水性嵌段与疏水性嵌段的数均分子量Mn之比在约1∶1-约1∶10；和
(ii)多分散性指数为约1.0-约2.0。
3.一种组合物，其中包含聚合物胶束和与胶束缔合的多核苷酸，所述胶束包含多个嵌段共聚物，每一嵌段共聚物包含亲水性嵌段和疏水性嵌段，该多个嵌段共聚物缔合使得胶束在约中性pH下、在含水介质中稳定，所述胶束还具有两种或更多种选自如下的特征：
(i)缔合数量为约10-约100个链/胶束；
(ii)临界胶束浓度CMC在约0.2ug/mL-约20ug/mL；
(iii)粒度为约5nm-约500nm。
4.一种组合物，其中包含聚合物胶束和与胶束缔合的多核苷酸，所述胶束包含多个嵌段共聚物，每一嵌段共聚物包含亲水性嵌段和疏水性嵌段，该多个嵌段共聚物缔合使得胶束在约中性pH下、在含水介质中稳定，所述胶束还具有两种或更多种选自如下的特征：
(i)亲水性嵌段与疏水性嵌段的数均分子量Mn之比在约1∶1-约1∶10；
(ii)多分散性指数为约1.0-约2.0；和
(iii)重均分子量为约0.5x106-约3.6x106g/mol。
5.权利要求1或2任一项的组合物，其中所述胶束具有三种或更多种其子段(i)、(ii)、(iii)和(iv)的特征。
6.权利要求1或2任一项的组合物，其中所述胶束具有全部其子段(i)、(ii)、(iii)和(iv)的特征。
7.权利要求1或3任一项的组合物，其中所述嵌段共聚物具有全部其子段(i)、(ii)和(iii)的特征。
8.上述权利要求任一项的组合物，其中所述嵌段共聚物中，亲水性嵌段与疏水性嵌段的数均分子量Mn之比在约1∶1-约1∶10。
9.上述权利要求任一项的组合物，其中所述嵌段共聚物中，亲水性嵌段与疏水性嵌段的数均分子量Mn之比在约1∶1.5-约1∶6。
10.上述权利要求任一项的组合物，其中所述嵌段共聚物中，亲水性嵌段与疏水性嵌段的数均分子量Mn之比在约1∶2-约1∶4。
11.上述权利要求任一项的组合物，其中所述胶束包含约10-约100个嵌段共聚物/胶束。
12.上述权利要求任一项的组合物，其中所述胶束包含约20-约60个嵌段共聚物/胶束。
13.上述权利要求任一项的组合物，其中所述胶束包含约30-约50个嵌段共聚物/胶束。
14.上述权利要求任一项的组合物，其中所述胶束的临界胶束浓度CMC为约0.2ug/mL-约20ug/mL。
15.上述权利要求任一项的组合物，其中所述胶束的临界胶束浓度CMC为约0.5ug/mL-约10ug/mL。
16.上述权利要求任一项的组合物，其中所述胶束的临界胶束浓度CMC为约1ug/mL-约5ug/mL。
17.上述权利要求任一项的组合物，其中所述嵌段共聚物中，亲水性嵌段与疏水性嵌段的数均分子量Mn之比在约1∶1.5-约1∶6；且所述胶束：
(i)包含约20-约60个嵌段共聚物/胶束；和
(ii)具有约0.5ug/mL-约10ug/mL的临界胶束浓度CMC。
18.上述权利要求任一项的组合物，其中所述嵌段共聚物中，亲水性嵌段与疏水性嵌段的数均分子量Mn之比在约约1∶2-约1∶4；且所述胶束：
(i)包含约30-约50个嵌段共聚物/胶束；和
(ii)具有约1ug/mL-约5ug/mL的临界胶束浓度CMC。
19.上述权利要求任一项的组合物，其中所述嵌段共聚物具有约1.0-约2.0的多分散性指数。
20.上述权利要求任一项的组合物，其中所述嵌段共聚物具有约1.0-约1.7的多分散性指数。
21.上述权利要求任一项的组合物，其中所述嵌段共聚物具有约1.0-约1.4的多分散性指数。
22.上述权利要求任一项的组合物，其中所述胶束具有约0.5x106-约3.6x106的聚集分子量Mw。
23.上述权利要求任一项的组合物，其中所述胶束具有约0.75x106-约2.0x106的聚集分子量Mw.
24.上述权利要求任一项的组合物，其中所述胶束具有约1.0x106-约1.5x106的聚集分子量Mw.
25.上述权利要求任一项的组合物，其中所述胶束具有约5nm-约500nm的粒度。
26.上述权利要求任一项的组合物，其中所述胶束具有约10nm-约200nm的粒度。
27.上述权利要求任一项的组合物，其中所述胶束具有约20nm-约100nm的粒度。
28.上述权利要求任一项的组合物，其中与每一胶束缔合的多核苷酸数量为约1-约10,000。
29.上述权利要求任一项的组合物，其中与每一胶束缔合的多核苷酸数量为约4-约5,000。
30.上述权利要求任一项的组合物，其中与每一胶束缔合的多核苷酸数量为约15-约3,000。
31.上述权利要求任一项的组合物，其中与每一胶束缔合的多核苷酸数量为约30-约2,500。
32.上述权利要求任一项的组合物，其中所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包含多个阳离子单体单元，亲水性嵌段中的阳离子性种类与多核苷酸离子型缔合。
33.权利要求34的组合物，其中所述阳离子单体单元是阳离子单体残基、不带电荷的布朗斯台德碱单体的残基或其组合。
34.权利要求1-33任一项的组合物，其中所述多核苷酸是RNAi试剂或siRNA。
35.权利要求1-33任一项的组合物，其中所述多核苷酸不在胶束芯内。
36.权利要求1-33任一项的组合物，其中所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包含多个在亲水性嵌段和/或疏水性嵌段中的阴离子性单体单元。
37.权利要求1-33任一项的组合物，其中所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包含多个在亲水性嵌段和/或疏水性嵌段中的不带电荷的单体单元。
38.权利要求1-33任一项的组合物，其中所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包含多个在亲水性嵌段和/或疏水性嵌段中的两性离子型单体单元。
39.权利要求1-33任一项的组合物，其中所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包含多个在疏水性嵌段中的可带电荷的残基。
40.权利要求1-33任一项的组合物，其中所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包含至少20个在疏水性嵌段中的可带电荷的残基。
41.权利要求1-33任一项的组合物，其中所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包含至少15个在疏水性嵌段中的可带电荷的残基。
42.权利要求1-33任一项的组合物，其中所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包含至少10个在疏水性嵌段中的可带电荷的残基。
43.权利要求1-33任一项的组合物，其中所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包含至少5个在疏水性嵌段中的可带电荷的残基。
44.上述权利要求中任一项的组合物，其中包含聚合物生物缀合物，其包含与所述多个嵌段共聚物的一个或多个共价偶合的一个或多个多核苷酸。
45.权利要求44的组合物，其中所述多核苷酸是siRNA。
46.上述权利要求任一项的组合物，其中所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包含多个具有能够质子化的阴离子性种类和多个疏水性种类的单体单元。
47.权利要求46的组合物，其中所述阴离子性单体单元是阴离子性单体的残基、不带电荷的布郎斯台德酸单体的残基或其组合。
48.上述权利要求任一项的组合物，其中所述胶束包含嵌段共聚物，该嵌段共聚物包含多个衍生自具有疏水性种类的可聚合单体的单体单元。
49.上述权利要求任一项的组合物，其中所述一种或多种嵌段共聚物是膜去稳定化的嵌段共聚物。
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