MX2010012237A - Micelas para el suministro intracelular de agentes terapeuticos. - Google Patents

Micelas para el suministro intracelular de agentes terapeuticos.

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Anna Gall
Patrick S Stayton
Allan S Hoffman
Anthony J Convertine
Robert Overell
Mary Prieve
Amber Paschal
Charbel Diab
Priyadarsi De
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Abstract

La composición comprende una micela polimérica y un polinucleótido asociado.

Description

MICELAS PARA EL SUMINISTRO INTRACELULAR DE AGENTES TERAPÉUTICOS Referencia cruzada con solicitudes relacionadas j Esta solicitud reclama el beneficio de la j Solicitud Provisional de los Estados Unidos I Núm. 61/052,908, presentada el 13 de mayo de 2008, Solicitud Provisional de los Estados Unidos Núm. 61/052,914, i presentada el 13 de mayo de 2008, Solicitud Provisional de los Estados Unidos Núm. 61/091,294, presentada el 22 de presentada el 24 de diciembre de 2008, Solicitud i Provisional de los Estados Unidos Núm. 61/112,054, , i presentada el 6 de noviembre de 2008, Solicitud Provisional de los Estados Unidos Núm. 61/171,358, presentada el 21 de abril de 2009, cuyos contenidos, en su totalidad, se consideran parte de la presente, como referencia. ¡ CAMPO DE LA INVENCIÓN Se describen en la presente, micelas formadas a partir de polímeros y el uso de estas micelas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En ciertos casos, es benéfico suministrar agentes terapéuticos, como polinucleótidos (por ejemplo, oligonucleótidos) a células vivas. En algunos casos, el suministro de estos polinucleótidos en una célula viva aporta un beneficio terapéutico.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se proporcionan en la presente micelas para el suministro intracelular de agentes terapéuticos (por ejemplo, oligonucleótidos, péptidos o lo similar) . En algunas modalidades, este suministro intracelular es in vitro; en otras modalidades, el suministro intracelular es in vivo.
En algunas modalidades, las micelas de la presente están diseñadas de manera especifica para el suministro dirigido de una carga útil micelar a un punto deseado de intervención terapéutica en un individuo. En consecuencia, la micela es, de preferencia, estable frente a la dilución a un pH fisiológico. En algunas modalidades, las micelas de la presente son estables en condiciones 6459.5 fisiológicas y tienen concentraciones micelares críticas que previenen la disociación indeseada de la micela., En otras modalidades alternas, los copolímero de bloque que constituyen las micelas descritas aquí, tienen relaciones de bloque, tamaños de bloque y/o propiedades del núcleo y/o propiedades de la envoltura, que están diseñadas para una mejor integridad micelar en las condiciones fisiológicas. En otras modalidades alternas, la integridad de una micela en el entorno fisiológico también depende de la composición de los copolímeros de bloque que constituyen la micela. Por lo tanto, se proporcionan aquí ciertos parámetros (por ejemplo, las relaciones de peso molecular promedio numérico para copolímeros de bloque entre el bloque de envoltura y el bloque central de las micelas, el número de entidades con carga en los copolímeros de bloque, y lo similar) que se manipulan para obtener micelas adecuadas para un suministro intracelular eficiente de agentes terapéuticos y con mínima toxicidad y mínima pérdida de carga útil micelar .
En algunas modalidades se proporciona una composición que comprende una micela polimérica y un polinucleótido asociado con la micela, la micela comprende una pluralidad de copolímeros de bloque, cada copolímero de bloque comprende un bloque hidrofílico y un bloque hidrofóbico, la pluralidad de copolímeros de bloque se 6459.5 asocian de tal manera que la micela es estable en un medio acuoso a un pH aproximadamente neutro, (a) la micela tiene también dos o ¡ más i características seleccionadas a partir de: j (i) la micela comprende aproximadamente entre 10 y 100 copolímeros de bloque por micela, i (ii) una concentración micelar crítica1 (CMC o critical micelle concentration) , que varía de aproximadamente 0.2 a 20 µ /t?1, ; J (iii) ensamblado micelar espontáneo en ausencia de ácido nucleico; (iv) un peso molecular promedio en peso de aproximadamente 0.5 x 106 a aproximadamente 3.6 x 106 daltones; ¡ (v) un tamaño de partícula i de aproximadamente 5 nm a 500 nm; y (b) los copolímeros de bloque tienen una o más características seleccionadas a partir de: (i) una relación entre el peso molecular promedio numérico, Mn, del bloque hidrofílico y del bloque hidrofóbico, que varía entre aproximadamente l!:l a aproximadamente 1:10, y j (ii) un índice de polidispersidad de aproximadamente 1.0 a aproximadamente 2.0. ¡ En algunas modalidades se proporciona! una i composición que comprende una micela polimérica y un polinucleótido asociado con la micela, la micela comprende una pluralidad de copolímeros de bloque, cada copolímero de bloque comprende un bloque hidrofílico y un bloque hidrofóbico, la pluralidad de copolímeros de bloque se asocian de tal manera que la micela es estable en un medio acuoso a un pH aproximadamente neutro. (a) la micela tiene también dos o más características seleccionadas a partir de: (i) la micela comprende entre aproximadamente 10 y aproximadamente 100 copolímeros de bloque por micela, (ii) una concentración micelar crítica, CMC, que varía de aproximadamente 0.2 µ<3/p?1 a aproximadamente 20 (iii) ensamblado micelar espontáneo en ausencia de ácido nucleico; (iv) un peso molecular promedio en peso de aproximadamente 0.5 x 106 a aproximadamente 3.6 x 106 daltones; y (b) los copolímeros de bloque tienen una o más características seleccionadas a partir de: (i) una relación entre el peso molecular promedio numérico, n, del bloque hidrofílico y del bloque hidrofóbico, que varía entre aproximadamente 1:1 a 6459.5 aproximadamente 1:10, y (ii) un índice de polidispersidad de aproximadamente 1.0 a aproximadamente 2.0.
En algunas modalidades se proporciona j una composición que comprende una micela polimérica y un polinucleótido asociado con la micela, la micela comprende una pluralidad de copolímeros de bloque, cada copolíméro de bloque comprende un bloque hidrofílico y un ' bloque hidrofóbico, la pluralidad de copolímeros de bloque se asocian de tal manera que la micela es estable en un ¡medio acuoso a un pH aproximadamente neutro, la micela también tiene dos o más características seleccionadas a partirj de: (i) un número de asociación que ¡varía aproximadamente de 10 a aproximadamente 100 cadenas por micela, i (ii) una concentración micelar crítica, CMcj, que varía de aproximadamente 0.2 µ9/???? a aproximadamente 20 (iii) un tamaño de partícula de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 500 nM. : En algunas modalidades se proporciona j una composición que comprende una micela polimérica ¡y un polinucleótido asociado con la micela, la micela comprende una pluralidad de copolímeros de bloque, cada copolíméro de i bloque comprende un bloque hidrofílico y un bloque hidrofóbico, la pluralidad de copolímeros de bloque se asocian de tal manera que la micela es estable en un medio acuoso a un pH aproximadamente neutro, los copolímerbs de bloque tienen dos o más características seleccionadas a partir de: (i) una relación entre el peso molecular promedio numérico, Mn, del bloque hidrofílico y del bloque hidrofóbico, que varía entre aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:10, y j (ii) un índice de polidispersidad ! de I aproximadamente 1.0 a aproximadamente 2.0, y (iii) un peso molecular promedio en peso de aproximadamente 0.5 x 106 a aproximadamente 3.6 x 10 g/mol .
En ciertas modalidades, la composición comprende una micela que tiene tres o más de las características de los incisos (i) , (ii) , (iii) , (iv) y (v) . En ciertas modalidades, la micela tiene todas las características de los incisos (i) , (ii) , (iii) , (iv) y (v) . ! En ciertas modalidades, la composición comprende un copolímero de bloque que tiene todas las características de los incisos (i) , (ii) y (iii) . En algunas modalidades, el copolímero de bloque tiene una relación entre elj peso molecular promedio numérico, Mn, del bloque hidrofílico y j del bloque hidrofóbico, que varía de aproximadamente ¡1:1 a 6459.5 aproximadamente 1:10. En algunas modalidades, el copolímero de bloque tiene una relación entre el peso molecular promedio numérico, Mn, del bloque hidrofílico y del bloque hidrofóbico, que varía de aproximadamente 1:1.5 a aproximadamente 1:6. En ciertas modalidades, el copólímero de bloque tiene una relación entre el peso molecular promedio numérico, Mn, del bloque hidrofílico y del ¿loque hidrofóbico, que varía de aproximadamente 1 :| 2 a aproximadamente 1:4. ¡ En algunas modalidades, la composición comprende una micela que tiene aproximadamente 10 a aproximadamente 100 copolímeros de bloque por micela. En algunas modalidades, la micela tiene aproximadamente 20 a aproximadamente 60 copolímeros de bloque por micela. En algunas modalidades, la micela tiene aproximadamente 30 a aproximadamente 50 copolímeros de bloque por micela.
En algunas modalidades, la composición comprende una micela que tiene una concentración micelar critica, CMC, de aproximadamente 0.2 µ9 a aproximadamente 20 µg/mL. En algunas modalidades, la micela tiene una | tiene una concentración micelar crítica, CMC, de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 10 µg/mL. En algunas modalidades, la micela tiene una tiene una ión micelar crítica, CMC, de aproximadamente a aproximadamente 5 µg/mL.
En algunas modalidades, la composición comprende un copolímero de bloque que tiene una relación entre el peso molecular promedio numérico, Mn, del bloque hidrofílico y del bloque hidrofóbico, que varía de I aproximadamente 1:1.5 a aproximadamente 1:6; y la micela : (i) comprende aproximadamente 20 j a aproximadamente 60 copolímeros de bloque por micela, y! (ii) tiene una concentración micelar crítica, CMC, de aproximadamente 0.5 µ /t?:?- a aproximadamente 10 µg/mL. j í En algunas modalidades, la composición comprende un copolímero de bloque que tiene una relación entre el peso molecular promedio numérico, Mn, del ¿loque hidrofílico y del bloque hidrofóbico, que varía de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1:4; y la micela: (i) comprende aproximadamente de 30 a aproximadamente 50 copolímeros de bloque por micela, .y¡ (ii) tiene una concentración micelar crítica, CMC, de aproximadamente 1 µg/mL a aproximadamente 5 µg|mL.
En algunas modalidades, los copolímeros de bloque descritos aquí, tienen un índice de polidispersidád de aproximadamente 1.0 a aproximadamente 2.0. En algunas j modalidades, los copolímeros de bloque descritos |aquí, tienen un índice de polidispersidád de aproximadamente 1.0 a aproximadamente 1.7. En algunas modalidades,! los 6459. B copolímeros de bloque descritos aquí, tienen un índice de polidispersidad de aproximadamente 1.0 a aproximadamente 1.4.
En algunas modalidades, una composición de la presente comprende una micela que tiene un peso molecular agregado, w, de aproximadamente 0.5 x 106 a aproximadamente 3.6 x 106. En algunas modalidades, una composición de la presente comprende una micela que tiene un peso molecular agregado, Mw de aproximadamente 0.75 x 106 a aproximadamente 2.0 x 10s. En algunas modalidades] una composición de la presente comprende una micela que tiene un peso molecular agregado, Mw, de aproximadamente 1.0 x 106 a aproximdamente 1.5 x 106.
En algunas modalidades, la micela tiene un tamaño de partícula de aproximadamente 5 nra a aproximadamente 500 nm. En algunas modalidades, la micela tiene un tamaño de partícula de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 200 nm. En algunas modalidades, la micela tiene un tamaño de partícula de aproximadamente 20 nm a aproximadamente 100 nm.
En algunas modalidades de composiciones proporcionadas en la presente, el número de polinucleótidos asociados con cada micela es de aproximadamente ; 1 a aproximadamente 10,000. En algunas modalidades, el número de polinucleótidos asociados con cada micela es S459.5 aproximadamente 4 a aproximadamente 5,000. En algunas modalidades, el número de polinucleótidos asociados con cada micela es aproximadamente 15 a aproximadamente 3,000. En algunas modalidades, el número de polinucleótidos asociados con cada micela es aproximadamente 30 a aproximadamente 2,500.
En algunas modalidades, una micela descrita en la presente, comprende un copolímero de bloque que tiene una pluralidad de unidades monoméricas catiónicas, la especie catiónica en el bloque hidrofílico está en asociación iónica con el polinucleótido . En algunas modalidades, la unidades monoméricas catiónicas son residuos de monómeros catiónicos, monómeros base Bronsted sin carga, o una combinación de éstos.
En algunas modalidades de composiciones proporcionadas en la presente, el polinucleótido es AR i o ARNsi. En algunas modalidades, el polinucleótido no es el centro de la micela.
En algunas modalidades, una micela descrita aquí comprende un copolímero de bloque que tiene una pluralidad de unidades monoméricas aniónicas en el bloque hidrofílico y/o en el bloque hidrofóbico.
En algunas modalidades, la micela comprende un copolímero de bloque que tiene una pluralidad de unidades monoméricas sin carga en el bloque hidrofílico y/o en el 6459.5 bloque hidrofóbico .
En algunas modalidades, la micela comprende un copolímero de bloque que tiene una pluralidad de unidades monoméricas zwiteriónicas en el bloque hidrofílico y/o en el bloque hidrofóbico.
En algunas modalidades, la micela comprende un copolímero de bloque que tiene en el bloque hidrofóbico una pluralidad de residuos susceptibles de adquirir carga. En algunas modalidades, la micela comprende un copolímero de bloque que tiene en el bloque hidrofóbico al menos 20 residuos susceptibles de adquirir carga. En algunas modalidades, la micela comprende un copolímero de bloque que tiene en el bloque hidrofóbico al menos 15 residuos susceptibles de adquirir carga. En algunas modalidades, la micela comprende un copolímero de bloque que tiene en el bloque hidrofóbico al menos 10 residuos susceptibles de adquirir carga. En algunas modalidades, la micela comprende un copolímero de bloque que tiene en el bloque hidrofóbico al menos 5 residuos susceptibles de adquirir carga.
En algunas modalidades, una composición descrita aquí, comprende un bioconjugado polimérico que comprende uno o más polinucleótidos unidos por covalencia a uno p más de la pluralidad de copolímeros de bloque. En algunas modalidades, el polinucleótido es ARNsi .
En algunas modalidades, una micela descrita aquí, G459.5 comprende un copolímero de bloque que tiene una pluralidad de unidades monoméricas con especies aniónicas protonables y una pluralidad de especies hidrofóbicas . En algunas modalidades, las unidades monoméricas aniónicas ¡ son residuos de monómeros aniónicos, monómeros de ácidos Br nsted sin carga, o una combinación de éstos.
En algunas modalidades, la micela comprende un copolímero de bloque que tiene una pluralidad de unidades monoméricas derivadas de un monómero polimerizable que tiene especies hidrofóbicas .
En algunas modalidades, el copolímero de bloque es un copolímero de bloque desestabilizante de membrana.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las novedosas particularidades de la invención se exponen en forma detallada en las reivindicaciones adjuntas. Una mejor comprensión de las particularidades y ventajas de la presente invención se obtendrán a partir de la siguiente descripción detallada que expone modalidades ilustrativas en las cuales se utilizan los principios de la invención, y de los dibujos que la acompañan, en los cuales : Figura 1: Ejemplo ilustrativo de la composición y propiedades de polímeros sintetizados por transferencia de cadena por adición- fragmentación reversible (reversible G459.5 addition-fragmentation chain transfer o RAFT) .
Figura 2: Ejemplo ilustrativo de la síntesis de polímeros [PEGMAJ - [B-P-D] .
Figura 3: Ejemplo ilustrativo de la composición y i propiedades de polímeros sintetizados por RAFT.
Figura 4: Ejemplo ilustrativo de la composición y propiedades de copolímeros PEGMA-DMAEMA. j Figura 5: Ejemplo ilustrativo de la síntesis de polímeros [PEGMA^-MAA (NHS) ] - [B-P-D] .
Figura 6: Ejemplo ilustrativo de la composición y propiedades de polímeros sintetizados por RAFT.
Figura 7: Ejemplo ilustrativo de la composición y propiedades de polímeros sintetizados por RAFT. 1 Figura 8: Síntesis de PDS A.
Figura 9: Síntesis de copolímero HPMA-PDSMA para conjugación con AR si .
Figura 10: Ejemplo ilustrativo de la espectroscopia RMN del copolímero de bloque PRx0729v6.
Figura 11: Ejemplo ilustrativo de la estabilidad de partícula del polímero PRx0729v6 en disolventes orgánicos .
Figura 12: Ejemplo ilustrativo de análisis por microscopía electrónica de transmisión {transmission electrón microscopy o TEM) del polímero PRx0729v6.
Figura 13: Ejemplo ilustrativo del efecto del pH 6459.5 en la estructura del polímero.
Figura 14: Ejemplo ilustrativo de la concentración de estabilidad crítica {critical stability concentration o CSC) del polímero PRx0729v6.
Figura 15: Ejemplo ilustrativo de la determinación por dispersión luminosa dinámica (dynamic light scattering o DLS) del tamaño de partícula del polímero PRx0729v6 acomplejado con ARNsi.
Figura 16: Ejemplo ilustrativo del análisis del desplazamiento en del polímero complejo PRx0729v6/ARNsi a diferentes relaciones de carga.
Figura 17: Ejemplo ilustrativo de la actividad de silenciamiento génico o knock-down de los complejos micela-AR si en células de mamíferos cultivadas.
Figura 18: Ejemplo ilustrativo de la actividad de silenciamiento génico o knock-down de los complejos micela- i ARNsi en células de mamíferos cultivadas.
Figura 19: Demostración ilustrativa de la actividad desestabilizadora de membrana de las micelas poliméricas y sus complejos con ARNsi.
Figura 20: Microscopía de fluorescencia ilustrativa de la captación celular y la distribución intracelular de complejos polímero-ARNsi .
Figura 21: Ejemplo ilustrativo de poli [DMAEMA] -macro CTA modificado con grupos terminales galactosa. 6459.5 Figura 22: Ejemplo ilustrativo de copolímeros dibloque DMAE A-MAA (NHS) o PEGMA-MAA (NHS) modificados con grupos terminales galactosa.
Figura 23: Ejemplo ilustrativo de las estructuras de ARNsi conjugable y piridil disulfuro amina.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se proporciona en ciertas modalidades de la presente composiciones que comprenden una micela polimérica y un polinucleótido asociado con la micela, la micela comprende una pluralidad de copolímeros de bloqué. En general, cada copolímero de bloque comprende un bloque hidrofílico y un bloque hidrofóbico . En ciertas modalidades, las micelas poliméricas descritas aquí, se asocian de tal manera que sean estables en medio acuoso, por ejemplo, aproximadamente a pH neutro.
I En algunas modalidades, los copolímeros de bloque constituyen una micela que comprende un bloque de envoltura y un bloque central. En algunas modalidades, las micelas descritas en la presente comprenden un centro hidrofóbico y una envoltura hidrofílica. En algunas modalidades, las micelas descritas en la presente se autoensamblan. En algunas modalidades, la formación de las micelas ocurre en ausencia de un polinucleótido. En algunas modalidades, la formación de micelas ocurre en presencia de un 6459.5 polinucleótido. En modalidades específicas las micelas descritas aquí se autoensamblan de manera espontánea.
En ciertas modalidades, el centro de la micela comprende una pluralidad de grupos hidrofóbicos . En algunas modalidades, los grupos hidrofóbicos son hidrofóbicos a un pH aproximadamente neutro. En modalidades más específicas, los grupos hidrofóbicos son más hidrofóbicos a ün pH ligeramente ácido (por ejemplo, a un pH aproximado de 6 y/o a un pH aproximado de 5) . En ciertas modalidades, dos, cuatro, diez, quince, veinte o más grupos hidrofóbicos están presentes en bloque polimérico que junto con iotros bloques poliméricos similares pueden formar el centro de la micela. En algunas modalidades, un grupo hidrofóbico tiene un valor p de aproximadamente 1 o más . Un valor p de un compuesto es una medida de su valor hidrofílico-lipofílico relativo (véase, por ejemplo, Cates, L.A., "Calculation of Drug Solubilities by Pharmacy Students" A . J. Pharm. Educ. 45 : 11-13 (1981) ) .
En modalidades específicas, el bloque de envoltura es hidrofílico (por ejemplo, a un pH aproximadamente neutro) . En algunas modalidades, la micela se desestabiliza o disocia a un pH entre aproximadamente 4.7 a aproximadamente 6.8.
En algunos casos, se proporcionan aquí composiciones micelares adecuadas para el suministro de i 6459.5 agentes terapéuticos (que incluyen, por ejemplo, oligonucleótidos o péptidos) a una célula viva. En algunas modalidades, las micelas comprenden una pluralidad de copolímeros de bloque y como característica opcional, al menos un agente terapéutico. En ciertas modalidades, las micelas que se proporcionan en la presente son biocompatibles , estables (ya sea química y/o físicamente estables) y/o reproducibles por síntesis. Por otra parte, en algunas modalidades, las unidades micelares de la presente son atóxicas (por ejemplo, presentan baja toxicidad) , protegen la carga útil del principio terapéutico (por ejemplo, oligonucleótido o péptido) contra la degradación, entran a la célula viva mediante procesos naturales (por ejemplo, por endocitosis) y/o suministran la carga útil del principio terapéutico (por ejemplo, oligonucleótido o péptido) en el citoplasma de una célula viva después de entrar en contacto con la célula. En ciertos casos, el polinucleótido (por ejemplo, oligonucleótido) es un ARNsi y/u otro agente "con base nucleotídica" que altera la expresión de al menos un gen en la célula. Por consiguiente, en ciertas modalidades, las micelas que aquí se proporcionan son útiles para el suministro de ARNsi o péptido a una célula. En ciertos casos, la célula es in vitro y en otros casos la célula es in vivo (por ejemplo, una persona) . En algunas modalidades, S459.5 se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de las micelas que comprenden un ARNsi o un péptido, a un individuo que lo necesite (por ejemplo, que necesita un gen silenciado (knocked-down) , en donde el gen es susceptible de ser silenciado (knocked-down) por el ARNsi administrado) . En casos específicos, las composiciones micelares descritas aquí, son útiles o están específicamente diseñadas para suministrar ARNsi o péptido a las células de un individuo seleccionadas de manera específica.
Definiciones i Es preciso entender que, con respecto a esta solicitud, el uso del singular incluye el plural y viceversa, a menos que expresamente se indique de ¡ otro modo. Es decir, "un, una" y "el, la" se refieren a uno o más del objeto que modifiquen. Por ejemplo, "el polímero" o "un nucleótido" se refiere a un polímero o nucleótido o a una pluralidad de polímeros o nucleótidos. En el mismo sentido, "polímeros" y "nucleótidos" se referirán a un polímero o un nucleótido y también a una pluralidad de polímeros o nucleótidos, a menos que expresamente se indique de otra forma o que por el contexto sea obvio que es de otro modo.
En el sentido que se utiliza en la presente, dos 6459.5 entidades o compuestos están "unidos" si están juntos por cualquier interacción que incluye, como ejemplo no limitativo, uno o más enlaces covalentes, una o más interacciones no covalentes (por ejemplo, enlaces iónicos, fuerzas estáticas, interacciones de van der Waals, combinaciones de los mismos, o lo similar) o, una combinación de los mismos.
Alifático o grupo alifático: En el sentido que se utiliza en la presente, los términos "alifático" o "grupo alifático" , se refieren a una entidad que puede ser de cadena recta (es decir, sin ramificar) , ramificada o cíclica (que incluye, fusionada, puenteada y policíclica espirofusionada) y puede estar totalmente saturada o puede tener una o más unidades de instauración, pero que no es aromática. A menos que se especifique de otro modo, los grupos alifáticos contienen 1 a 20 átomos de carbono.
Monómero aniónico: En el sentido que se utiliza en la presente, los términos "monómero aniónico" o "unidad monomérica aniónica", se refieren a una unidad monomérica que tiene un grupo que está presente en un estado cargado aniónico o en un estado sin carga, pero en el estado sin carga es capaz de volverse aniónico con carga, por ejemplo, al eliminar un electrófilo (por ejemplo, un protón (H+) ) , por ejemplo, de una forma dependiente del pH o séa en función del pH) . En ciertos casos, el grupo es 6459.5 prácticamente de carga negativa a un pH aproximado al fisiológico pero se protona y se vuelve prácticamente neutro a un pH débilmente ácido. Los ejemplos no limitativos de estos grupos incluyen grupos carboxilo, ácido barbitúrico y sus derivados, xantina y sus derivados, ácidos borónicos, ácidos fosfínicos, ácidos fosfónicos, ácidos sulfínicos, fosfatos y sulfonamidas .
Especie aniónica: En el sentido que se utiliza en la presente, el término "especie aniónica", es un grupo, residuo o molécula que está presente en un estado aniónico carga o sin carga, pero en el estado sin carga es susceptible de volverse aniónico con carga, por ejemplo, al eliminar un electrófilo (por ejemplo, un protón (H+) ) , por ejemplo, de una forma dependiente del pH o sea en función del pH) . En ciertos casos, el grupo, residuo o molécula es prácticamente de carga negativa a un pH aproximado al fisiológico pero se protona y se vuelve prácticamente neutro a un pH débilmente ácido.
Arilo o grupo arilo: En el sentido que se utiliza en la presente, los términos "arilo" o "grupo arilo" se refieren a sistemas de anillo monocíclicos , bicíclicos y tricíclicos que tienen en total de cinco a catorce miembros, en donde al menos un anillo en el sistema es j aromático y en donde cada anillo en el sistema tiehe de tres a siete miembros. 6459.5 Heteroalquilo : El término "heteroalquilo" se refiere a un grupo alquilo, en donde, al menos uno de los átomos de carbono de la cadena principal está sustituido con un heteroátomo .
Heteroarilo: El término "heteroarilo" se refiere a un grupo arilo, en donde, al menos uno de los miembros del anillo es un heteroátomo.
Heteroátomo: El término "heteroátomo" se refiere a un átomo distinto del hidrógeno o el carbono, por ejemplo, un átomo de oxígeno, azufre, nitrógeno, fósforo, boro, arsénico, selenio o silicio.
En el sentido que se utiliza en la presente, una micela se "disgrega" si no funciona de una manera idéntica, prácticamente similar o similar a una micela estable y/o tiene características físicas y/o químicas idénticas, prácticamente similares o similares a las que tendría si fuera una micela estable. La "disgregación" de una micela se puede determinar de cualquier forma que sea adecuada. En un caso, una micela se "disgrega" si no tiene un tama'ño de partícula hidrodinámico que sea menor de 5, 4, 3, 2, 1.8, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2 ó 1.1 veces el tamaño de partícula hidrodinámico de una micela que comprenda los mismos copolímeros de bloque y se haya formado en una solución acuosa a un pH de 7.4 o se haya formado en suero humano. En un caso, una micela se "disgrega" si no tiene una 6459.5 concentración de ensamble que sea menor de 5, 4, 3, 2, 1.8, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2 ó 1.1 veces la concentración de ensamble de una micela que comprenda los mismos copolímeros de bloque y se haya formado en una solución acuosa a un pH de 7.4 o se haya formado en suero humano .
En el sentido que se utiliza en la presente^, una "especie susceptible de adquirir carga" , un "grupo susceptible de adquirir carga" o una "unidad monomérica susceptible de adquirir carga" es una especie, grupo o unidad monomérica ya sea en estado con carga o sin carga. En ciertos casos, una "unidad monomérica susceptible de adquirir carga" es aquella que puede pasar a un estado con carga (ya sea en su estado con carga aniónico o catiónico) por la adición o eliminación de un electrófilo (por ejemplo, un protón (H+) ) , por ejemplo, de una forma dependiente del pH o sea, en función del pH) . El uso de cualquiera de los términos "especie susceptible de adquirir carga", "grupo susceptible de adquirir carga" o "unidad monomérica susceptible de adquirir carga" incluye la descripción de cualquier otra "especie susceptible de adquirir carga", "grupo susceptible de adquirir carga" o "unidad monomérica susceptible de adquirir carga", a menos que se indique de otro modo. Una "especie susceptible de adquirir carga" que sea "con carga o susceptible de adquirir carga y pasar a anión" o "con carga o susceptible 6459.5 de adquirir carga y pasar a una especie aniónica" , es una especie o grupo que está en un estado cargado aniónico o en un estado sin carga, pero en el estado sin carga es capaz de convertirse a un estado con carga aniónico, por ejemplo, al eliminar un electrófilo, por ejemplo, un protón (H+) . En modalidades específicas, una especie susceptible de adquirir carga es una especie que se carga y se convierte en anión a un pH aproximado al neutro. Cabe enfatizar que no todas las especies susceptibles de adquirir carga en un polímero serán aniónicas a un pH cercano a la pKa (constante de disociación ácida) de la especie susceptible de adquirir carga, sino más bien coexistirá un equilibrio entre las especies aniónicas y no aniónicas. Una "especie susceptible de adquirir carga" que sea "con carga o susceptible de adquirir carga y convertirse en catión" o "con carga o susceptible de adquirir carga y convertirse en especie catiónica", es una especie o grupo que está en un estado cargado catiónico o en un estado sin carga, pero en el estado sin carga es capaz de convertirse a un estado cargado catiónico, por ejemplo, por la adición de un electrófilo, por ejemplo, un protón (H+) . En modalidades específicas, una especie susceptible de adquirir carga es una especie que se carga y se convierte en catión a un pH aproximado al neutro. Cabe enfatizar que no todas las especies susceptibles de adquirir carga en un polímero 6459.5 serán catiónicas a un pH cercano a la pKa (constante de disociación acida) de la especie susceptible de adquirir carga, sino más bien coexistirá un equilibrio entre las especies catiónicas y no catiónicas. Las "unidades monoméricas susceptibles de adquirir carga" descritas en la presente, se usan indistintamente con "residuos monomericos susceptibles de adquirir carga" .
En el sentido que se utiliza en la presente, los términos "prácticamente sin carga" o "carga neutralizada" incluyen un potencial zeta que está entre + 10 a ± 30 mV y/o la presencia de un primer número (z) de especies susceptibles de adquirir carga que se cargan a una carga negativa (por ejemplo, especies ácidas que se vuelven aniónicas al desprotonarse) y un segundo número (0.5-z) de especies que se cargan a una carga positiva (por ejemplo, especies básicas que se vuelven catiónicas al protonarse) .
En el sentido que se utiliza en la presente, una "entidad ligante" o un "ligante" es un enlace químico o un residuo multifuncional (por ejemplo, bifuncional) que se usa para enlazar un ARNi, por ejemplo, un oligonucleotido y/o un agente dirigido (targeting agent) con un copolímero de bloque. Las entidades ligantes comprenden una variedad de compuestos que pueden formar una amida, un éster, éter, tioéter, carbamato, urea, amina u otro enlace, por ejemplo, enlaces de uso común para la inmovilización de biomoléculas 6459.5 en cromatografía por afinidad. En algunas modalidades, la entidad ligante contiene un enlace escindible, por ejemplo, un enlace que es inestable y/o se escinde con cambios en j ciertos parámetros intracelulares (por ejemplo, pH o potencial redox) . En algunas modalidades, la entidad ligante no es escindible. En ciertas modalidadesj, la entidad ligante está unida al ARNi o a un agente dirigido (targeting agent) mediante uno o más enlaces covalentes. En algunas modalidades, la entidad ligante está unida al polímero desestabilizante de membrana en función del pH, a través de uno o más enlaces covalentes . j Especie hidrofóbica: En el sentido que se utjiliza en la presente, el término "especie hidrofóbica" (utilizado indistintamente con el término "entidad que aumenta la hidrofobicidad" ) , es una entidad como un sustitüyente , residuo o un grupo, el cual cuando se une por covalencia a una molécula, por ejemplo, un monómero o un polímero, aumenta la hidrofobicidad de la molécula o sirve como una entidad que aumenta la hidrofobicidad . El término "hidrofobicidad" es un término que describe la propiedad física de un compuesto medida por la energía de ; j transferencia libre del compuesto entre un disolvente no polar y agua (Hydrophobicity regained, Karplus P.A. , Protein Sel., 1997, 6: 1302-1307). La hidrofobicidad de un compuesto se puede medir por su valor logP, el logaritmo^ de 6459.5 un coeficiente de partición (P) , que se define como la relación de concentraciones de un compuesto en las dos fases de una mezcla de dos disolventes inmiscibles, por ejemplo, octanol y agua. Los expertos en la técnica saben de los métodos de determinación de hidrofobicidad experimentales así como los métodos de cálculo por computadora de los valores logP. Las especies hidrofóbicas de la presente invención incluyen, entre otras, grupos alifáticos, heteroalifáticos , arilo y heteroarilo.
En el sentido que se utiliza en la presente, el término "centro hidrofóbico" comprende entidades hidrofóbicas. En ciertos casos, un "centro hidrofóbico" está prácticamente sin carga (por ejemplo, la carga neta es prácticamente neutra) .
Sin limitarlo a alguna teoría que no se mencione expresamente en las reivindicaciones, un polímero desestabilizante de membrana, de manera directa o indirecta, puede provocar un cambio (por ejemplo, un cambio de permeabilidad) en una estructura de membrana celular (por ejemplo, una membrana endosómica) y así sea posible que un agente (por ejemplo, un polinucleótido) , en asociación o independientemente de una micela (o un polímero constitutivo de la misma) , pase a través de la estructura de la membrana, por ejemplo, que entre a una célula o salga de una vesícula celular (por ejemplo, un i S4B9.5 endosoma) . Un polímero desestabilizante de membrana puede ser (aunque no necesariamente) un polímero que disgregue la membrana. Un polímero que disgregue la membrana puede, de manera directa o indirecta, provocar la lisis de una vesícula celular o la disgregación de una membrana celular (por ejemplo, que se observa para una fracción considerable de una población de membranas celulares) .
En general, las propiedades desestabilizantes de membrana o disgregantes de membrana de los polímeros o las 1 micelas, se pueden evaluar por diversos medios. En un enfoque no limitativo, un cambio en una estructura de membrana celular se puede observar por su evaluación en ensayos que miden (de manera directa o indirecta) la liberación de un agente (por ejemplo, un polinucleótido) de las membranas celulares (por ejemplo, membranas endosómicas) , por ejemplo, determinando la presencia o ausencia de ese agente o su actividad, en un medio externo a la membrana. Otro enfoque no limitativo incluye la medición de la lisis de eritrocitos (hemolisis) , por ejemplo, como un ensayo alterno para una membrana celular de interés . Estos ensayos se pueden hacer a un solo valor de pH o en un intervalo de valores de pH.
En el sentido que se utiliza en la presente, el término "micela" incluye una partícula que comprende un centro y una envoltura hidrofílica, en donde el centro se 6459. S mantiene unido al menos en forma parcial, predominante o considerable a través de interacciones hidrofóbicas. En ciertos casos, en el sentido que se utiliza en la presente, una "micela" es una nanopartícula multicomponente que comprende al menos dos dominios, el dominio interno o centro y el dominio externo o envoltura. El centro se mantiene unido al menos en forma parcial, predominante o considerable a través de interacciones hidrofóbicas y es realmente el centro de la micela. En el sentido que se utiliza en la presente, el término "envoltura de una micela" se define como la porción no central de la micela.
La expresión "hidrófobo desestabilizante de membrana en forma dependiente del pH o en función del pH" se refiere a un grupo que al menos en forma parcial, predominante o considerable es hidrofóbico y es desestabilizante de la membrana en una forma dependiente del pH. En ciertos casos, un hidrófobo susceptible de adquirir carga, desestabilizante de la membrana en forma dependiente del pH, es un segmento polimérico hidrofóbico de un copolímero de bloque y/o comprende una pluralidad de I especies hidrofóbicas; y comprende una pluralidad de especies susceptibles de adquirir carga aniónicas. En algunas modalidades, la especie susceptible de adquirir carga aniónica es aniónica a un pH aproximadamente neutro. En otras modalidades o en modalidades alternas, la especie 6459.5 susceptible de adquirir carga está sin carga a un pH inferior, por ejemplo, al pH endosómico. En algunas modalidades, el hidrófobo susceptible de adquirir carga, desestabilizante de la membrana, comprende una pluralidad de especies catiónicas. El hidrófobo susceptible de adquirir carga, desestabilizante de la membrana en forma dependiente del pH, comprende una cadena polimérica principal no peptídica y no lipídica.
En el sentido que se utiliza en la presente, "pH fisiológico normal" se refiere al pH de los fluidos principales del organismo de mamíferos, como sangre, suero, citosol de las células normales, etc. En ciertos casos, el pH fisiológico es un pH aproximadamente neutro,; que incluye, por ejemplo, un pH que es aproximadamente 7.2 a aproximadamente 7.4. En algunos casos, un pH aproximadamente neutro es un pH de 6.6 a 7.6. En el seintido que se utiliza en la presente, los términos pH neutro, fisiológico y pH fisiológico son sinónimos y se usan indistintamente .
En el sentido que se utiliza en la presenté, una micela se describe como "estable" si la unidad ensamblada no se disocia o se desestabiliza en una solución acuosa que reproduzca las condiciones fisiológicas, por ejemplo, solución salina amortiguada con fosfato a pH 7.4. La estabilidad de la micela se puede definir de manera 6459.5 cuantitativa por la concentración micelar crítica (critical icelle concentration o CMC) , definida como la concentración micelar en la que se presenta inestabilidad, según lo indica la captación de una molécula sonda hidrofóbica (por ejemplo, el ensayo de fluorescencia de pireno) o cambios en el tamaño de la micela (según se determina por mediciones de dispersión luminosa dinámica) .
En ciertos casos, una micela estable es aquella que tiene un tamaño de partícula hidrodinámico que está dentro de aproximadamente 60%, 50%, 40%, 30%, 20% ó 10% del tamaño de partícula hidrodinámico de una micela que tiene los mismos copolímeros de bloque formados inicialmente, en! una solución acuosa a un pH de 7.4 (por ejemplo, una solución salina amortiguada con fosfato, pH 7.4). En algunos casos, una micela estable es aquella que tiene una concentración de formación/ensamblado que está dentro de aproximadamente 60%, 50%, 40%, 30%, 20% ó 10% de la concentración de formación/ensamblado de una micela que tiene los mismos copolímeros de bloque iniciales, en una solución acuosa a un pH de 7.4 (por ejemplo, una solución salina amortiguada con fosfato, pH 7.4).
En el sentido que se utiliza en la presente, una micela se "desestabiliza" si no funciona de una manera idéntica, prácticamente similar o similar a una micela estable y/o tiene características físicas y/o químicas S459.5 idénticas, prácticamente similares o similares a las que tendría si fuera una micela estable. La "desestabilización" de una micela se puede determinar de cualquier forma que sea adecuada. En un caso, una micela se "desestabiliza" si no tiene un tamaño de partícula hidrodinámico que sea menor de 5, 4, 3, 2, 1.8, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2 ó 1.1 veces el tamaño de partícula hidrodinámico de una micela que comprenda los mismos copolímeros de bloque y se haya formado en una solución acuosa a un pH de 7.4 o se haya formado en suero humano. En un caso, una micela se "desestabiliza" si no tiene una concentración de ensamble que sea menor de 5, 4, 3, 2, 1.8, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2 ó 1.1 veces la concentración de ensamble de una micela que comprenda los mismos copolímeros de bloque y se haya formado en una solución acuosa a un pH de 7.4 o se haya formado en suero humano . . i Nanopartícula : En el sentido que se utiliza en la presente, el término "nanopartícula" se refiere a cualquier partícula que tenga un diámetro menor de 1000 nanómetros (nm) . En general, las nanopartículas deberán (tener dimensiones suficientemente pequeñas que permitan su captación en células eucariotas. Por lo general, la dimensión recta más larga (por ejemplo, diámetro) de las nanopartículas es de 200 nm o menor. En algunas modalidades, las nanopartículas tienen un diámetro de 100 6459.5 1 nm o menor. En algunas modalidades se usan nanopartículas más pequeñas, por ejemplo, con diámetros ' de aproximadamente 10 a 200 nm, aproximadamente 20 a 100 nm, aproximadamente 10 a 50 nm o aproximadamente 10 a 30 nm.
Agente de silenciamiento génico (knockdown) oligonucleotídico : en el sentido que se utiliza en la presente un "agente de silenciamiento génico {knockdown) i oligonucleotídico" es una especie oligonucleótida que puede inhibir la expresión génica al dirigirse y unirse la un ácido nucleico intracelular de una forma específica de la secuencia. Ejemplos no limitativos de agentesj de silenciamiento génico oligonucleotídicos , incluyen, ARNsi, AR mi, ARNsh, sustratos Dicer, oligonucléótidos antisentido, ADN o AR señuelos, oligonucléótidos antigenes y cualquier análogo y precursor de los mismos.
En el sentido que se utiliza en la presenté, el término "nucleótido" en su sentido amplio se refiére a cualquier compuesto y/o sustancia que se incorpora jo se puede incorporar en una cadena de polinucleótidó ' (por 1 ejemplo, oligonucleótido) . En algunas modalidades, es un compuesto y/o sustancia que se incorpora o se ¡puede I incorporar en una cadena de polinucleótidó (por eje plo, oligonucleótido) a través de un enlace fosfodiéster . En algunas modalidades, "nucleótido" se refiere a residuos de ácido nucleico individuales (por ejemplo, nucleótidos y/o 5459.5 nucleósidos) . En ciertas modalidades, la expresión "al menos un nucleótido" se refiere a uno o más nucleótidos presentes; en varias modalidades, el o los nucleótidos son nucleótidos independientes, están unidos entre sí por enlace distinto de la covalencia o están unidos entre sí por covalencia. Así, en ciertos casos, la expresión "al menos un nucleótido" se refiere a uno o más polinucleótidos (por ejemplo, oligonucleótido) . En algunos casos, un polinucleótido es un polímero que comprende al menos dos unidades monoméricas nucleotídicas .
En el sentido que se utiliza en la presente, el término "oligonucleótido" se refiere a un polímero que comprende 7 a 200 unidades monoméricas nucleotídicas. En algunas modalidades, "oligonucleótido" abarca ARN mono y/o bicatenario así como ADN mono y/o bicatenario. Por otra parte, los términos "nucleótido", "ácido nucleico", "ADN", "ARN" y/o términos similares incluyen análogos de ácido nucleico, es decir, análogos que tienen una cadena principal modificada, que incluyen, entre otros, ácidos nucleicos peptídicos (peptide nucleic acids o PNA) , ácidos nucleicos cerrados (locked nucleic acids o LNA) , ácidos morfolino nucleicos o ácidos nucleicos con grupos fosfato modificados (por ejemplo, fosforotioatos , fosfonatos, enlaces 51 -N-fosforamidita) . Los nucleótidos se pueden purificar a partir de fuentes naturales, producidas por S4S9.5 medio de sistemas de expresión recombinantes y opcionaltrtente purificados, sintetizados químicamente, etc. En el sentido que se utiliza en la presente, un "nucleósido" es el término que describe un compuesto que comprende un monosacárido y una base . El monosacárido incluye, entre otros, los monosacáridos pentosa y hexosa. El monosacárido también incluye pseudomonosacáridos (monosaccharide mimetics) y monosacáridos modificados por sustitución de grupos hidroxilo con grupos halógeno, metoxilo, hidrogeno o ammo o por esterificación de grupos hidroxilo adicionales. En algunas modalidades, un nucleótido es o comprende un fosfato nucleosídico natural (por ejemplo, fosfatos de adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina y desoxicitidina). En algunas modalidades, la base incluye cualesquier base que se encuentre en forma natural en varios ácidos nucleicos, así como otras modificaciones que simulen o se parezcan a estas bases naturales. Ejemplos no limitativos de bases modificadas o derivatizadas incluyen: 5 - fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5- i clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, (5-carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopentiladenina, 1- 6459.5 metilguanina, 1-metilinosina, 2 , 2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2 -metilguanina, 3 -metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5 ' -metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopentiladenina, ácido uracil-5-oxiacético, wybutoxosina, pseudouracilo, queo(sina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, 5-metil-2-tiouracilo, 3- (3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, 2-aminoadenina, pirrolpirimidina y 2 , 6-diaminopurina . Las bases nucleósidas también incluyen nucleobases universales como difluorotolilo, nitroindolilo, nitripirrolilo o nitroimidazolilo . Los nucleótidos . también incluyen nucleótidos que alojan una etiqueta o contienen monómeros sin base, es decir, carecen de una base. La secuencia de ácido nucleico se presenta en la dirección 5'- a 3'-, a menos que se indique de otro modo. Un nucleótido se puede unir a otro nucleótido en una forma específica respecto a la secuencia, mediante un enlace de hidrógeno a través de pares de bases Watson-Crick . Se dice que estos pares de bases son complementarios entre sí. Un oligonucleótido puede ser mono, bi o tricatenario .
Agente AR i : En el sentido que se utiliza en la 6459.5 presente, el término "agente AR i" se refiere a un oligonucleótido que puede mediar la expresión genética a través de un mecanismo de ARNi e incluye, entre otros, ARNsi, micro ARN (ARNmi) , ARN de horquilla corta (ARNsh) , ARN de interferencia asimétrica (ARNai) , sustrato Dicer y sus precursores.
ARN de interferencia corta (ARNsi) : En el sentido que se utiliza en la presente, el término "ARN de interferencia corta" o "ARNsi " se refiere a un agente ARNi que comprende un nucleótido bicatenario que tiene una longitud aproximada de 15 a 50 pares de bases y como característica opcional también comprende de cero á dos salientes monocatenarias . Una hebra del ARNsi incluye una porción que se híbrida con un ARN diana u objetivo de una manera complementaria. En algunas modalidades, puede existir una o más incompatibilidades entre el ARNsi y la porción seleccionada del ARN objetivo. En algunas modalidades, los ARNsi participan en la inhibición de la expresión génica al provocar la degradación de transcritos diana u objetivo.
ARN de horquilla corta (ARNsh) : ARN de horquilla corta (ARNsh) se refiere a un oligonucleótido que tiene al menos dos porciones complementarias hibridadas o capaces de hibridarse entre sí para formar una estructura bicatenaria (dúplex) y al menos una porción monocatenaria . i 6459.5 Sustrato Dicer: Un "sustrato Dicer" es un ARN bicatenario con más de aproximadamente 25 pares de bases que es sustrato para el miembro Dicer de la familia RNasa III en células. Los sustratos Dicer se escinden para producir pequeños ARN de interferencia (ARNsi) bicatenarios (dúplex) de aproximadamente 21 pares de bases que recuerdan un efecto de interferencia de ARN que da como resultado el silenciamiento génico (knockdown) mediante el silenciamiento de ARNm.
Agente terapéutico: En el sentido que se utiliza en la presente, la expresión "agente terapéutico" se refiere a cualquier agente que, cuando se administra' a un individuo, órgano, tejido o célula tiene un efecto terapéutico y/o provoca un efecto biológico ^ y/o farmacológico, que incluye, entre otros, polinucleótidos , oligonucleótidos , ARNi, péptidos y proteínas.
Cantidad terapéuticamente eficaz: En el sentido que se utiliza en la presente, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente terapéutico que es suficiente, cuando se administra a un individuo que padece o es susceptible de padecer una enfermedad, trastorno y/o afección, para tratar, diagnosticar, prevenir y/o retardar la aparición del o los síntomas de la enfermedad, trastorno y/o condición.
PROPIEDADES MICELARES Se proporcionan aquí micelas para el suministro intracelular de agentes de diagnóstico y/o agentes terapéuticos (por ejemplo, oligonucleótidos , péptidos o lo similar) . En algunas modalidades, este suministro intracelular es in vitro,- en otras modalidades, el suministro intracelular es in vivo. En algunas modalidades, las micelas que se proporcionan en la presente están diseñadas específicamente para el suministro dirigido de una carga micelar en un punto deseado de intervención terapéutica en un individuo. En algunas modalidades, una micela, según se describe aquí, tiene ciertas propiedades deseadas. Por ejemplo, puede ser conveniente que una micela sea estable en ciertas circunstancias (por ejemplo, a pH neutro/fisiológico) y menos estable en otras circunstancias (por ejemplo, a un pH más ácido) . Por consiguiente, los materiales presentados aquí exhiben ciertos parámetros que contribuyen a estas propiedades micelares deseadas.
En algunas modalidades, las micelas proporcionadas en la presente, son estables en las condiciones fisiológicas y tienen concentraciones micelares críticas que previenen la disociación indeseable de la micela. En otras modalidades alternas, la integridad de una micela (por ejemplo, en el entorno fisiológico) también depende de la composición de los copolímeros de bloque que 6459.5 , ¡ constituyen la micela. Por lo tanto, se proporcionan aquí ciertos parámetros (por ejemplo, las relaciones de peso molecular promedio numérico para copolímeros de bloque entre el bloque de envoltura y el bloque central de las micelas, el número de entidades con carga en los copolímeros de bloque, y lo similar) que se manipulan para obtener micelas adecuadas para un suministro intracelular eficiente de agentes terapéuticos y con mínima toxicidad y mínima pérdida de carga micelar.
En consecuencia, se describen aquí composiciones que comprenden una micela y un polinucleótido asociado con la micela, la micela comprende una pluralidad de copolímeros de bloque que se asocian de tal manera que la micela es estable en un medio acuoso a un pH aproximadamente neutro. Por otra parte, las micelas descritas aquí tienen al menos una de las siguientes propiedades : (i) la micela comprende entre aproximadamente 10 y aproximadamente 100 copolímeros de bloque por micela, (ii) una concentración micelar crítica, CMO, que varía de aproximadamente 0.2 µg/mL a aproximadamente 20 g/mL, (iii) ensamblado micelar espontáneo en ausencia de ácido nucleico; (iv) un tamaño de partícula de aproximadamente 5 6459.5 nm a aproximadamente 500 nm; (v) un peso molecular promedio en peso de aproximadamente 0.5 x 106 a aproximadamente 3.6 x 106 daltones .
En algunas modalidades, cualquier micela de la presente, se caracteriza por tener al menos dos dé las propiedades anteriormente mencionadas . En algunas modalidades, cualquier micela de la presente,1 se caracteriza por tener al menos tres de las propiedades anteriormente mencionadas. En algunas modalidades, cualquier micela de la presente, se caracteriza por tener todas las propiedades anteriormente mencionadas.
. En algunas modalidades, una micela descrita aquí es estable frente a la fuerza iónica elevada del medio circundante (por ejemplo, NaCl 0.5 M) ; y/o la micela tiene una inestabilidad creciente a medida que aumenta la concentración del disolvente orgánico, estos disolventes orgánicos incluyen, entre otros, dimetilformamida (DMF o dimethylformamide) , sulfóxido de dimetilo (DMS o dimethylsulfoxide) y dioxano .
Composición de las micelas Las micelas que se proporcionan en la presente comprenden una pluralidad de polímeros por micela. En algunas modalidades, los polímeros son copolímeros. En 6459.5 otras modalidades, el copolímero es un copolímero de bloque. El copolímero de bloque es un polímero monobloque o un polímero multibloque (por ejemplo, un polímero j dibloque). El término "copolímero", En el sentido que se utiliza en la presente, significa que el polímero s el resultado de la polimerización de dos o más diferentes monomeros. Un "polímero monobloque" es un pfo(ducto sintético de una sola etapa de polimerización. El término polímero monobloque incluye un copolímero (es decir, un producto de la polimerización de más de un tipo de monomeros) y un homopolímero (es decir, un producto de polimerización de un solo tipo de monomeros) . Un copól|ímero de "bloque" se refiere a una estructura que comprende una o más sub-combinaciones de unidades monoméricas o unidades constitutivas. En algunas modalidades, los residuos monoméricos que se encuentran en el polímero se modifican también para llegar a las unidades constitutivas'. En algunas modalidades, un copolímero de bloque descrito aquí, comprende unidades constitutivas o unidades monoméricas no lipídicas. En algunas modalidades, el copolímero de bloque de un copolímero dibloque. Un copolímero dibloque comprende dos bloques; una generalización esquemática de un polímero de este tipo de polímero representa así: [AaBbCc ...] m - [XxYyZz ...] n en donde cada letra designa un monómero o una ' unidad monomérica, y en donde cada subíndice de una unidad monomérica representa la fracción molar de esa unidad en el bloque particular, los tres puntos indican que puede haber más unidades monoméricas en cada bloque (también puede haber menos) y m y n indican el peso molecular de cada bloque en copolímero dibloque. Como lo sugiere el esquema, en algunos casos, el número y la naturaleza de cada unidad se controla por separado para cada bloque. Se entiende que el esquema no significa ni deberá interpretarse como inferencia de alguna relación, cualquiera que esta sea, entre el número de unidades monoméricas o el número de diferentes tipos de unidades monoméricas en cada uno de los bloques. Ni tampoco el esquema describe ningún número o configuración particular de las unidades monoméricas dentro de un bloque particular. En cada bloque las uniidades monoméricas pueden disponerse en una configuración meramente al azar, al azar alternante, alternante regular, un bloque regular o bloque al azar, a menos que expresamente se indique de otro modo. Una configuración meramente al azar sería, entre otras, por ejemplo, x-x-y-z-x-y-y-z-y-z-z-z-... Una configuración al azar alternante sería, entre otras, por ejemplo: x-y-x-z-y-x-y-z-y-x-z... y una configuración alternante regular ej emplificativa sería, entre otras: x-y-z-x-y-z-x-y-z... Una configuración de bloque regular puede tener la siguiente configuración, entre otras: ...x-x-x-y-y-y-z-z-z-x-x-x-..., mientras que una 6459.5 configuración de bloque al azar puede tener la siguiente configuración, entre otras: x-x-x-z-z-x-x-y-y-y-y-z-z-z-x-x-z-z-z-... En un polímero gradiente, el contenido de una o más unidades monoméricas aumenta o disminuye en forma gradual desde el extremo alfa del polímero hasta el extremo omega. En ninguno de los ejemplos genéricos que anteceden ni la yuxtaposición particular de unidades monoméricas individuales o bloques ni el número de unidades monoméricas en un bloque ni el número de bloques, significan ni deberán interpretarse que de alguna manera influyen o limitan la estructura real de los copolímeros dibloque que forman las micelas de esta invención.
En el sentido que se utiliza en la presente, los paréntesis que contienen las unidades monoméricas no significan ni deberán interpretarse en el sentido de que i las unidades monoméricas por sí mismas forman bloques. Es decir, las unidades monoméricas dentro de los paréntesis cuadrados se pueden combinar de alguna manera con las otras unidades monoméricas dentro del bloque, es decir, configuraciones meramente al azar, al azar alternante, alternante regular, bloque regular o bloque al azar. Los copolímeros descritos aquí son opcionalmente , copolímeros alternantes, gradientes o al azar. En algunos casos, el i copolímero consiste básicamente en un copolímero al azar.
En algunas modalidades, una micela descrita aquí comprende entre aproximadamente 10 y aproximadamente 500 copolímeros de bloque por micela. En algunas modalidades, una micela descrita aquí comprende entre aproximadamente 10 y aproximadamente 250 copolímeros de bloque por micela. En algunas modalidades, una micela descrita aquí comprende entre aproximadamente 10 y aproximadamente 100 copolímeros de bloque por micela. En algunas modalidades, una micela i descrita aquí comprende entre aproximadamente 30 y aproximadamente 50 copolímeros de bloque por micela.
Formación y estabilidad de la micela En algunas modalidades, una micela de la presente se forma por autoasociación espontánea de copolímeros de bloque que forman ensamblados organizados (por ejemplo, micelas) al diluirse de un disolvente miscible en agua (por ejemplo, etanol, entre otros) a disolventes acuosos (por ejemplo, solución salina amortiguada con fosfato, pH 7.4). En algunas modalidades, la formación de micelas se da por disolución directa de una forma seca del polímero en un disolvente acuoso. En algunas modalidades, la formación micelar espontánea se da en ausencia de polinucleótidos y oligonucleótidos .
En algunas modalidades, una micela descrita aquí es estable al diluirse de un disolvente miscible en agua (por ejemplo, etanol, entre otros) a disolventes acuosos a un pH aproximado de 7.4 a aproximadamente 5.5. En algunas modalidades, una micela descrita aquí es estable al diluirse de un disolvente miscible en agua (por ejemplo, etanol, entre otros) a disolventes acuosos a un pH aproximado de 7.4 a aproximadamente 6.8. En algunas modalidades, una micela descrita aquí es estable al diluirse de un disolvente miscible en agua (por ejemplo, etanol, entre otros) a disolventes acuosos a un pH aproximado de 7.4, 7.2, 7.0, 6.8, 6.4, 6.2, 6.0 ó 5.8. En algunas modalidades, una micela proporcionada aquí es estable en un medio acuoso. En ciertas modalidades, una micela proporcionada aquí es estable en un medio acuoso a un pH seleccionado, por ejemplo, a pH aproximado al fisiológico (por ejemplo, el pH de plasma humano circulante) . En modalidades específicas, una micela proporcionada aquí es estable en un pH aproximado al neutro (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7.4) en un medio acuoso. En modalidades específicas, el medio acuoso es suero de origen animal (por ejemplo, humano) o plasma de origen animal (por ejemplo, humano) . Se deberá entender que la estabilidad de la micela no se limita al pH designado sino que es estable a valores de pH que incluyen, como mínimo, el pH designado. En modalidades específicas, una micela descrita aquí es considerablemente menos estable a un pH ácido que a un pH aproximado al neutro. En 6459. S I modalidades más específicas, una micela descrita aquí es considerablemente menos estable a un pH aproximado de 5.8 que aun pH aproximado de 7.4.
En modalidades específicas, a un pH aproximadamente neutro, una micela descrita aquí es estable a una concentración de aproximadamente 10 µ /p?[-, 50 µ9/?t??_, 100 o aproximadamente 250µ9/?????.
En algunas modalidades, las micelas son estables al diluirse en una solución acuosa. En modalidades específicas, las micelas son estables al diluirse a pH fisiológico (por ejemplo, el pH de sangre circulante en un ser humano) con una concentración de estabilidad crítica (por ejemplo, una concentración micelar crítica (CMC) de aproximadamente 100 a aproximadamente 0.1 µg/mL, aproximadamente 100 a aproximadamente 1 µg/mL, aproximadamente 50 a aproximadamente 1 aproximadamente 50 a aproximadamente 10 µg/mL. En algunas modalidades, la CMC de una micela al pH fisiológico es menor de 100 µg/mL, menor de 50 µg/mL, menor de 10 µ?/ta?, menor de 5 µg/mL o menor de 2 µg/mL. En el sentido que se utiliza en la presente, el término "desestabilización de una micela" significa que las cadenas poliméricas que forman una micela se disgregan, al menos en forma parcial, se alteran estructuralmente (por ejemplo, se expanden en ¦ í tamaño y/o cambian de forma) y/o pueden formar estructuras 6459.5 supramoleculares amorfas (por ejemplo, estructuras supramoleculares no micelares) . Los términos concentración de estabilidad crítica (CSC o critical stability concentration) , concentración micelar crítica (CMC o critical micelle concentration) y concentración de ensamblado crítica (CAC critical assembly concentration) se usan aquí indistintamente. En algunas modalidades, una micela descrita aquí, es estable a la dilución que constituye la concentración de estabilidad crítica o la concentración micelar crítica (CMC) .
En algunas modalidades, la concentración de estabilidad crítica o la CMC de cualquier micela descrita aquí, es de aproximadamente 100 µg/mL a aproximadamente 0.1 µg/mL a un pH aproximado al neutro. En algunas modalidades, la CMC de una micela descrita aquí es de aproximadamente 80 de aproximadamente 60 µg/mL a aproximadamente 0.2 µg/mL( de aproximadamente 40 µg/mL a aproximadamente 0.2 µg/mL, de aproximadamente 20 µg/mL a aproximadamente 0.2 µg/mL o de aproximadamente 10 µg mL a aproximadamente 0.2 µg/mL a un pH aproximado al neutro. En algunas modalidades, la CMC de una micela descrita aquí es de aproximadamente 100 µg/mL, aproximadamente 90 µg/mL; aproximadamente 80 aproximadamente 70 µg/mL, aproximadamente 60 µg/mL, aproximadamente 50 µg/mL, aproximadamente 40 µg/mL, 6459.5 aproximadamente 30 µ9/p?1-1, aproximadamente 20 µ /p?--?, aproximadamente 10 µ9/p?1-., aproximadamente 5 /p?, aproximadamente 1 µ /t?:[-, aproximadamente 0.5 µg/mL o aproximadamente 0.2 µ9/???1?( a un pH aproximado al neutro.
En algunas modalidades, la concentración micelar i crítica o CMC de cualquier micela descrita aquí, a pH endosmolítico (por ejemplo, pH de aproximadamente 5), es aproximadamente 20 veces más alta que la CMC de la micela a un pH aproximado al neutro (por ejemplo, pH de aproximadamente 7.4). En ciertas modalidades,' la concentración micelar crítica o CMC de cualquier micela descrita aquí, a pH endosmolítico (por ejemplo, pH de aproximadamente 5) , es aproximadamente 10 veces más alta que la CMC de la micela a un pH aproximado al neutro^ (por ejemplo, pH de aproximadamente 7.4) . En algunas modalidades, la concentración micelar crítica o CMC de cualquier micela descrita aquí, a pH endosmolítico (por ejemplo, pH de aproximadamente 5) , es aproximadamente 5 veces más alta o aproximadamente 2 veces más alta que la CMC de la micela a un pH fisiológico (por ejemplo, pH de aproximadamente 7.4).
En algunas modalidades, la concentración micelar crítica o CMC de la micela descrita aquí, al pH endosmolítico (por ejemplo, pH de aproximadamente 5) , es de aproximadamente 100 µg/mL a aproximadamente 0.5 µg/mL, de G459.5 aproximadamente 80 µ /p??1? a aproximadamente 1 µ9/???., de aproximadamente 60 µ9/p?]1? a aproximadamente 1 µ9/??1_? , de aproximadamente 4 0 µ9/p??- a aproximadamente 1 µ /??, de aproximadamente 20 µ9/p??? a aproximadamente 1 o de aproximadamente 10 µ9/?? a aproximadamente 1 . En algunas modalidades, la CMC de una micela descrita aquí, es de aproximadamente 100 µ5/?t??-? , aproximadamente 90 µ /p -.? , aproximadamente 80 µ9/p??-., aproximadamente 70 µ9/??, aproximadamente 60 µ9/?t?1? , aproximadamente 50^g/mL, aproximadamente 40 µg/mL, aproximadamente 3 0 µ¾/t??_, aproximadamente 20 µg/mL, aproximadamente 10 µg/mL, aproximadamente 5 µg/mL( aproximadamente 1 µg/mL o aproximadamente 0 . 5 µg/mL, a un pH aproximadamente endosmolítico .
Tamaño de partícula En ciertas modalidades, la micela es una nanopartícula. En modalidades específicas, la micela es un verdadera micela. Incluso en otras modalidades, la micela es una nanopartícula o una micela con un tamaño de partícula hidrodinámico medio, en ausencia de conjugación con un agente bioactivo, de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 200 nm, aproximadamente 10 nm a aproximadamente 100 nm o aproximadamente 3 0 - 80 nm. El tamaño de partícula se puede determinar de cualquier forma, 6459.5 entre las que se incluyen, cromatografía por permeación en gel (GPC o gel permeation chromatography) , dispersión luminosa dinámica (DLS o dynamic light scattering) , técnicas de microscopía electrónica (por ejemplo, TEM {transmission electrón microscopy o microscopía electrónica de transmisión) y otros métodos.
En modalidades específicas, una micela descrita aquí comprende un copolímero de bloque que está asociado (por ejemplo, por enlace iónico y/o covalente) a un agente bioactivo (por ejemplo, un polinucleótido (por ejemplo, ARNsi) , un agente de diagnóstico y/o un agente dirigido (por ejemplo, un anticuerpo) ) y tiene un tamaño de partícula no mayor de aproximadamente 500 nm, no mayor de aproximadamente 450 nm, no mayor de aproximadamente 400 nm, no mayor de aproximadamente 350 nm, no mayor de aproximadamente 300 nm, no mayor de aproximadamente 250 nm, no mayor de aproximadamente 200 nm, no mayor! de aproximadamente 150 nm, no mayor de aproximadamente 1Ó0 nm o no mayor de aproximadamente 50 nm.
Carga de polinucleótido En algunas modalidades, una micela descrita aquí está asociada (por ejemplo, por enlace iónico y/o covalente con 1 a aproximadamente 10,000 polinucleótidos. En algunas modalidades, una micela descrita aquí está asociada con aproximadamente 4 a aproximadamente 5000, aproximadamente 10 a aproximadamente 4000, aproximadamente 15 a aproximadamente 3000 o aproximadamente 30 a aproximadamente 2500 polinucleótidos . En algunas modalidades, la relación de carga entre una micela y el polinucleótido es de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 1:1. En algunas modalidades, la relación de carga entre una micela y un polinucleótido es de aproximadamente 4:1, aproximadamente 3:1, aproximadamente 2:1 o aproximadamente 1:1.
ARQUITECTURA Y PROPIEDADES DEL POLÍMERO En ciertas modalidades, un copolímero de bloque descrito aquí comprende un bloque hidrofílico y un bloque hidrofóbico. En algunas modalidades, al menos uno de estos bloques es un bloque polimérico de gradiente. En otras modalidades, el copolímero de bloque utilizado en la presente, como característica opcional está sustituido con un polímero de gradiente (es decir, el polímero utilizado en la micela es un polímero de gradiente que tiene un bloque hidrofóbico y un bloque hidrofílico) . 1 Bloque hidrofílico En ciertas modalidades, el bloque hidrofílico es un bloque de envoltura y es, por ejemplo, un bloque sin carga, catiónico, policatiónico, aniónico, polianiónico o 6459.5 zwiteriónico . En ciertas modalidades, el bloque hidrofílico es neutro (sin carga) . En modalidades específicas,, el bloque hidrofílico tiene carga neta positiva.; En modalidades específicas el bloque hidrofílico tiene, carga neta negativa. En modalidades específicas, el bloque hidrofílico tiene carga neta neutra.
En algunas modalidades, un bloque hidrofílico es un bloque de homopolímero que comprende un solo moñomero. En otras modalidades, un bloque hidrofílico comprende una pluralidad de una o más unidades monoméricas (por ejemplo, i uno o más DMAE A, PEGMA, HPMA, acrilato j de oligoetilenglicol , NIPAAM, o lo similar) . En ciertas modalidades, la unidades monoméricas hidrofílicas contienen i grupos hidrofílieos (por ejemplo, grupos hidroxilo, grupos tiol, grupos PEG u otros grupos alquilo polioxilados^ o lo similar, o una combinación de los mismos) . En algunas i modalidades, la unidades monoméricas hidrofílicas prácticamente no son susceptibles de adquirir carga,! por ejemplo, esto significa que las unidades mononiéricas hidrofílicas prácticamente no son susceptibles de adquirir carga al pH fisiológico (por ejemplo, a un pH aproximado al neutro como 7.2 a 7.4). En algunas modalidades! el copolímero de bloque contiene más de 5, más de 10, más de 20, más de 50 o más de 100 grupos o especies hidrofílicas. ciertas modalidades, cada uno los S459.5 copolímeros de bloque descritos aquí tienen: (1) un bloque hidrofílico neutro o sin carga (por ejemplo, prácticamente no cargado); y (2) un bloque hidrofóbico (por ejemplo, un bloque central) que forma la parte central de la micela que se estabiliza a través de interacciones hidrofóbicas de los segmentos poliméricos que forman la parte central. En ciertas modalidades, el bloque hidrofílico neutro o sin carga comprende una pluralidad de residuos monoméricos neutros como PEG A o HPMA.
En ciertas modalidades, cada uno de los copolímeros de bloque descritos aquí tienen: (1) un bloque hidrofílico con carga, catiónico o policatiónico; y (2) un bloque hidrofóbico (por ejemplo, un bloque central) que forma el centro hidrofóbico de la micela que se estabiliza a través de interacciones hidrofóbicas de los segmentos poliméricos que forman la parte central . En ciertas modalidades, el bloque hidrofílico comprende una pluralidad de residuos monoméricos catiónicos como DMAEMA. En algunas de estas modalidades, un polinucleótido está en asociación iónica con las especies catiónicas en un bloque hidrofílico.
En ciertas modalidades, cada uno de los copolímeros de bloque descritos aquí tienen: (1) un bloque hidrofílico con carga, aniónico o polianiónico ; y (2) un bloque hidrofóbico (por ejemplo, un bloque central) que 6459.5 forma el centro hidrofóbico de la micela que se estabiliza I a través de de interacciones hidrofóbicas de los segmentos poliméricos que forman la parte central. En ciertas modalidades, el bloque hidrofílico con carga, anióhíco o polianiónico, comprende una pluralidad de residuos ¦ j monoméricos aniónicos como anhídrido maléico o ¦ acido acrílico.
En ciertas modalidades, cada uno de los copolímeros de bloque descritos aquí tienen: (1) un bloque hidrofílico con carga, zwiteriónico o polizwiteriónico; y (2) un bloque hidrofóbico (por ejemplo, un bloque central) que forma el centro hidrofóbico de la micela qu se estabiliza a través de interacciones de los segmentos poliméricos que forman la parte central.
Bloque hidrofóbico j En ciertas modalidades, un bloque hidrofóbico de cualquier copolímero de bloque descrito aquí comprend una pluralidad de grupos, entidades, unidades monoméric|as o especies, hidrofóbicos, o lo similar. En ciertas modalidades, un bloque hidrofóbico de cualquier copolímero de bloque descrito aquí comprende una pluralidad de grüpos, entidades, unidades monoméricas o especies, hidrofóbicos , . o lo similar y una pluralidad de unidades constitutivas o unidades monoméricas susceptibles de adquirir carga. : ] 6459.5 En ciertas modalidades, un copolímero de bloque comprende un bloque hidrofóbico que tiene una primera y una segunda unidad constitutiva. En ciertas modalidades, la primera unidad constitutiva contiene una especie aniónica al desprotonarse . En ciertas modalidades, la primera unidad constitutiva se encuentra sin carga a pH ácido (por ejemplo, pH endosómico, un pH inferior a aproximadamente 6.5, un pH inferior a aproximadamente 6.0, un pH inferior a aproximadamente 5.8, un pH inferior a aproximadamentej 5.7, o lo similar) . En algunas modalidades, la primera unidad constitutiva es como se describe aquí y la segunda unidad constitutiva es una especie catiónica al protonarsé. En modalidades específicas, el pKa de la segunda unidad constitutiva es aproximadamente 6 a aproximadamente 10, aproximadamente 6.5 a aproximadamente 9, aproximadamente 6.5 a aproximadamente 8 , aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.5 o cualquier otro valor de pKa que sea adecuado .
En algunas modalidades, el bloque hidrofóbico de cualquier copolímero de bloque descrito aquí comprende además grupos, entidades, unidades monoméricas o especies hidrofóbicos , o lo similar. En algunas modalidades, la unidad monomérica hidrofóbica contiene un grupo hidrofóbico, entre otros, grupos alquilo, heteroalquilo , arilo o heteroarilo. En algunas modalidades, un copolímero 6459.5 de bloque contiene un grupo hidrofóbico que está unido a la cadena polimérica principal y protege a una unidad constitutiva vecinal susceptible de adquirir carga (por ejemplo, una entidad aniónica (por ejemplo, un grupo ácido carboxilo) ) y por ello reduce o previene la disociación de una micela. En algunas modalidades, un bloque hidrofóbico de un copolímero de bloque contiene más de 5, más de 10, más de 20, más de 50 o más de 100 grupos o especies hidrofóbicas. En algunas modalidades, las especies hidrofóbicas están presentes en las unidades monoméricas aniónicas susceptibles de adquirir carga. En algunas modalidades, la relación entre las unidades monoméricas hidrofóbicas y las unidades monoméricas que constituyen una unidad constitutiva que es susceptible de adquirir carga y convertirse en anión, está entre aproximadamente 1:6 y aproximadamente 1:1, entre aproximadamente 1:5 y aproximadamente 1:1, entre aproximadamente 1:4 y aproximadamente 1:1, entre aproximadamente 1:3 y aproximadamente 1:1 y entre aproximadamente 1:2 y aproximadamente 1:1, a un pH aproximado al neutro.
En algunas modalidades, la unidad monpmérica hidrofóbica, es entre otras, por ejemplo, metacrilato de butilo, acrilato de butilo, estireno, o lo similar. En modalidades específicas, la unidad monomérica hidrofóbica útil en la presente, es una unidad monomérica derivada de 6459.5 éster alquil (C2-C8) de ácido alquil (C2-C8) acrílico.
En modalidades más específicas, el bloque hidrofóbico del copolímero de bloque descrito aquí, comprende una pluralidad de unidades monoméricas catiohicas y una pluralidad de unidades monoméricas aniónicás. En modalidades incluso más específicas, el bloque hidrofjóbico comprende un número prácticamente similar de espjecies catiónicas y aniónicás (es decir, el bloque hidrofóbic¡o y/o centro de la micela, tienen prácticamente carga neta neutra). En algunas modalidades, la presencia de un número prácticamente similar de especies catiónicas y aniónicás en el bloque hidrofóbico de un copolímero de bloque pejrmite que el bloque hidrofóbico y/o centro de la micela, tengan prácticamente carga neta neutra a un pH aproximado al neutro.
Unidades constitutivas aniónicás ! En algunas modalidades, un copolímero de biloque descrito aquí comprende una pluralidad de unidades constitutivas aniónicás que son aniónicás al pH fisiológico. En algunas modalidades, las unidades constitutivas aniónicás tienen especies aniónicás protonables. En ciertas modalidades, un copolímero de bloque descrito aquí comprende una pluralidad de unidades i constitutivas aniónicás y cada unidad constitutiva aniónica es un residuo de un raonómero de ácido de Bronsted sin carga (es decir, la unidad constitutiva es una base conjugada de un ácido de Bronsted) . En varias modalidades descritas aquí, unidades constitutivas descritas aquí, que son aniónicas o tienen carga negativa al pH fisiológico (incluidas, por ejemplo, ciertas unidades constitutivas hidrofílicas) , contienen uno o más grupos ácido o bases conjugadas de los mismos. Ejemplos no limitativos de unidades constitutivas aniónicas incluyen lácido carboxílico, sulfonamida, ácido borónico, ácido sulfónico, ácido sulfínico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido fosfónico o lo similar y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, las unidades constitutivas utilizadas en la presente, que son aniónicas o tienen carga negativa al pH fisiológico normal incluyen, entre otras, residuos monoméricos de ácido acrílico, monómeros de ácido alquil (C2-C8) acrílico (por ejemplo, ácido metilacrílico, ácido etilacrílico, ácido propilacrílico, ácido butilacrílico, etc.) o lo similar.
Cuando el pH de un fluido fisiológico está aproximadamente al valor pKa de una especie aniónica, existirá una distribución de equilibrio de especies susceptibles de adquirir carga en ambas formas. En el caso de las especies aniónicas, aproximadamente 50% de la población será aniónica y aproximadamente 50% estará sin carga cuando el pH esté al valor pKa de la especie aniónica. Mientras el pH esté más lejos del valor pKa de las especies susceptible de adquirir carga, existirá el desplazamiento correspondiente en este equilibrio, de manera que a valores de pH más altos, la forma aniónica predominará y a valores de pH más bajos, predominará la forma sin carga. Las modalidades descritas aquí incluyen la forma de los copolímeros de bloque a cualquier valor de pH.
En algunas modalidades, las unidades constitutivas que son aniónicas al pH fisiológico normal contienen ácidos carboxílico, entre otros, como residuos monoméricos de ácido 2-propilacrílico (es decir, la unidad constitutiva derivada de éste, ácido 2-propilpropiónico, -CH2C ( (CH2) 2CH3) (COOH) - (PAA) ) , aunque también se prevé en esta invención que puede estar presente en el proceso de polimerización seleccionado, cualquier ácido orgánico o inorgánico, ya sea como especie protegida, por ejemplo, un éster o como ácido libre. Los residuos monoméricos aniónicos o las unidades constitutivas descritas aquí comprende una especie con carga o susceptible de adquirir carga para convertirse en anión, incluidas las especies aniónicas protonables. En ciertos casos, los residuos monoméricos aniónicos pueden ser aniónicos a un pH aproximado al neutro.
Los monómeros como el anhídrido maléico (Scott M.
Henry, Mohamed E. H. El-Sayed, Christopher . Pirie, Alian S. Hoffman y Patrick S. Stayton "pH-Responsive Poly (styrene-alt-raaleic anhydride) Alkylamide Copolymers for Intracellular Drug Delivery" Biomacromolecules 7:2407-2414, 2006) también se pueden usar para la introducción de especies aniónicas en el bloque hidrofóbico. En estas modalidades, la unidad constitutiva negativamente cargada es un residuo monomérico de anhídrido maléico.
Unidades constitutivas catiónicas En algunas modalidades, un copolímero de bloque descrito aquí comprende una pluralidad de unidades constitutivas catiónicas que son catiónicas o tienen carga positiva al pH fisiológico. En algunas modalidades, las unidades constitutivas catiónicas comprenden especies catiónicas desprotonables . En ciertas modalidades, un copolímero de bloque descrito aquí comprende una pluralidad de unidades constitutivas catiónicas y cada unidad constitutiva catiónica es un residuo de un monómero de base de Br nsted sin carga (es decir, la unidad constitutiya es un ácido conjugado de una base de Br0nsted) . Ejemplos no limitativos de monómeros de bases de Bronsted, incluyen monómeros que contienen grupos dialquilamino . En algunas 1 i modalidades, una unidad constitutiva catiónica contiene amina acíclica, imina acíclica, amina cíclica, imina 6459.5 cíclica, grupos amino, alquilamino, guanidina, imidazolilo, piridilo, triazolilo, o lo similar o combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, unidades constitutivas utilizadas aquí, que son catiónicas al pH fisiológico normal, incluyen entre otros, residuos monoméricos de metacrilatos de dialquilaminoalquilo (por ejemplo, DMAEMA) .
Cuando el pH de un fluido fisiológico ¡ está aproximadamente al valor pKa de una especie catiónica, existirá una distribución de equilibrio de especies susceptibles de adquirir carga en ambas formas. Mientras el pH esté más lejos del valor pKa de la especie susceptible de adquirir carga, existirá el desplazamiento correspondiente en este equilibrio, de manera que a valores de pH más bajos, la forma catiónica predominará y a valores de pH más altos, predominará la forma sin carga.; Las modalidades descritas aquí incluyen la forma de los copolímeros de bloque a cualquier valor de pH. j Unidades constitutivas neutras y zwiteriónicas En varias modalidades, descritas aquí, las unidades constitutivas que son neutras al pH fisiológico contienen uno o más grupos hidrofílieos , por ejemplo, hidroxilo, alquil polioxialquilado, polietilenglicol , polipropilenglicol , tiol, y lo similar. En algunas modalidades, unidades constitutivas hidrofílicas utilizadas i 6459.5 aquí, que son neutras al pH fisiológico normal, incluyen entre otros, residuos monoméricos de ácido acrílico PEGilado, ácido metacrílico PEGilado, ácido hidroxialquilacrílico, ácido hidroxialquilalcacrílico (por ejemplo, HPMA) , o lo similar.
En varias modalidades descritas aquí, unidades constitutivas que son zwiteriónicas al pH fisiológico contienen un grupo aniónico o con carga negativa al pH fisiológico y un grupo catiónico o con carga positiva al pH fisiológico. En algunas modalidades, unidades constitutivas hidrofílicas utilizadas aquí que son zwiteriónicas ál pH fisiológico normal, incluyen entre otros, residuos monoméricos que contienen un grupo fosfato y un grupo amonio, al pH fisiológico, como se expone en la Patente de los Estados Unidos Núm. 7,300,990, la cual se considera parte de la presente, para la exposición o lo similar.
Composición de los copolímeros de bloque En ciertas modalidades, la primera unidad constitutiva es una especie aniónica al desprotonarse , la segunda unidad constitutiva es una especie catiónica al desprotonarse, y la relación entre la especie aniónica y la especie catiónica está aproximadamente entre 1:Í0 y aproximadamente 10:1, aproximadamente entre 1:6 y aproximadamente 6:1, aproximadamente entre 1:4 y aproximadamente 4:1, aproximadamente entre 1:2 y aproximadamente 2:1, aproximadamente entre 1:2 y 3:2 o aproximadamente 1:1 a un pH aproximado al neutro . En algunas modalidades, la relación entre la primera unidad constitutiva susceptible de adquirir carga y la segunda unidad constitutiva susceptible de adquirir carga está entre aproximadamente 1:10 y aproximadamente 10:1, aproximadamente entre 1:6 y aproximadamente 6:1, aproximadamente entre 1:4 y aproximadamente t 4:1, aproximadamente entre 1:2 y aproximadamente 2:1, aproximadamente entre 1:2 y 3:2 o aproximadamente 1:1.
En algunas modalidades, los grupos o unidades monoméricas constitutivas que son susceptibles de adquirir carga y convertirse en especies, grupos, o unidades monoméricas aniónicas presentes en los copolímeros de bloque, son especies, grupos, o unidades monoméricas que al menos 50%, al menos 60%, al menos. 70%, al menos 80%, al menos 85% o al menos 95% están negativamente cargadas1 a un pH aproximado al neutro (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7.4). En modalidades específicas, estas especies, grupos, o unidades monoméricas adquieren carga por la pérdida de un H+ para convertirse en una especie aniónica a un pH aproximado al neutro. En otras modalidades o en modalidades alternas, las especies, grupos, o unidades monoméricas susceptibles de adquirir carga y convertirse en especies, grupos, o unidades monoméricas aniónicas presentes en el polímero, son especies, grupos, o unidades monoméricas que al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 85% o al menos 95% son neutras o sin carga a un pH ligeramente ácido (por ejemplo, un pH de aproximadamente 6.5 o menor, aproximadamente 6.2 o menor, aproximadamente 6 o menor, aproximadamente 5.9 o menor, aproximadamente 5.8 o menor, aproximadamente 5.7 o menor, aproximadamente 5.6 o menor, aproximadamente 5.5 o menor, aproximadamente 5.0 o menor o aproximadamente al pH endosómico) .
En modalidades específicas de los copolímeros de bloque aquí descritos, cada unidad constitutiva ' está presente en una unidad monomérica diferente. En algunas modalidades, una primera unidad constitutiva comprende la primera especie susceptible de adquirir carga. En otras modalidades alternas, una segunda unidad constitutiva comprende la segunda especie susceptible de adquirir carga. En otras modalidades o modalidades alternas, una tercera unidad constitutiva comprende la tercera especie susceptible de adquirir carga.
Estructuras ejemplificativas En ciertas modalidades, el copolímero de bloque (por ejemplo, un copolímero de bloque desestabilizante de membrana) tiene la Fórmula química I: En algunas modalidades: A0, A1( A2, A3 y A4 se seleccionan a partir del grupo formado por -C-, -C-C-, -C (O) (C) aC (O) O- , -0(C)¿C(0)-y -0(C)bO-; en donde, a es 1-4; b es 2-4; Y4 se selecciona a partir del grupo formado por hidrógeno, (1C-10C) alquilo, (3C-6C) cicloalquilo, O- (1C-lOOalquilo, -C (O) 0 (1C-10C) alquilo, C (O) NR6 ( 1C-10C) , (4C-10C) heteroarilo y (6C- 10C) arilo y cualquiera de éstos, como opción, puede estar sustituido con uno o más grupos flúor; Yc Yi, Y2 de manera independiente se seleccionan a partir del grupo formado por un enlace covalente, (1C-10C)alquilo, -C (O) 0 (2C-10C) alquilo, -OC(O) ( 1C- 10C) lquilo , -O(2C-10C) alquilo y -S (2C-10C) alquilo- -C(0)NR6(2C-10C)alquilo-, (4C- 10C) heteroarilo y (6C-10C) arilo; 6459 . 5 Y3 se selecciona a partir del grupo formado por un enlace covalente, - (1C-10C) alquilo-, - (4C-10C) heteroarilo y - ( 6C- 10C) arilo- ; en donde, los átomos de carbono tetravalente Ax-A4 que no están totalmente sustituidos con R^Rs y Y0-Y4 se completan con el número correspondiente de átomos de hidrógeno; R1( R2, R3, R„, R5 y Rs se seleccionan, de manera independiente, a partir del grupo formado por hidrqgeno, -CN, alquilo, alquinilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo, de los cuales, cualquiera puede estar sustituido con uno o más átomos de j flúor; Q0 es un residuo seleccionado a partir del grupo formado por residuos que son hidrofílicos al pH fisiológico y al menos en forma parcial están cargados positivamente al pH fisiológico (por ejemplo, amino, alquilamino, amonio, alquilamonio, guanidina, imidazolilo, piridilo, o lo similar) ; al menos en forma parcial están cargados negativamente al pH fisiológico pero se protonan a pH inferior (por ejemplo, carboxilo, sulfonamida, boronato, fosfonato, fosfato, o lo similar) ; son prácticamente neutros (o sin carga) al pH fisiológico (por ejemplo, hidroxilo, alquilo polioxietilado, polietilenglicol , polipropilenglicol , tiol, o lo similar); al menos 6459.5 parcialmente son zwiteriónicos al pH fisiológico (por ejemplo, un residuo monomérico que contiene un grupo fosfato y un grupo amonio a pH fisiológico) ; residuos susceptibles de conjugarse o incluir grupos funcionales (por ejemplo, residuos que comprenden un grupo reacjtivo, por ejemplo, azida, alquino, éster succinimida, éster tetrafluorofenilo, éster pentafluorofenilo, éster p-nitrofenilo, piridil disulfuro, o lo similar) ; o hidrógeno; Q-L es un residuo que es hidrofílico a pH fisiológico y al menos en forma parcial está cargado positivamente al pH fisiológico (por ejemplo, amino, alquilamino, amonio, alquilamonio, guanidina, imidazolilo, piridilo, o lo similar) ; al menos en forma parcial está cargado negativamente al pH fisiológico pero se protpna a pH inferior (por ejemplo, carboxilo, sulfonamida, boronato, fosfonato, fosfato, o lo similar) ; es prácticamente neutro (o sin carga) al pH fisiológico (por ejemplo, hidroxilo, alquilo polioxietilado, polietilenglicol , polipropilenglicol , tiol, o lo similar); o al menos parcialmente es zwiteriónico al pH fisiológico (por ejemplo, contiene un grupo fosfato y un grupo amonio a pH fisiológico) ; Q2 es un residuo que está cargado positivamente al pH fisiológico, que incluye, entre otros, amino, alquilamino, amonio, alquilamonio, guanidina, imidazolilo y S459.5 piridilo; i Q3 es un residuo que está cargado negativamente al pH fisiológico, pero que se protona a un pH inferior, que incluye, entre otros, carboxilo, sulfonamida, boronato, fosfonato y fosfato; m es aproximadamente 0 o menos de 1.0 j (por ejemplo, 0 a aproximadamente 0.49); n es mayor de 0 a aproximadamente 1. Ó ! (por ejemplo, aproximadamente 0.51 a aproximadamente 1.0)j ; en donde J m + n = 1 j p es aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.9 I (por ejemplo, aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.5) ; q es aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.9 (por ejemplo, aproximadamente 0.2 a aproximadamente p.5) ; en donde : r es 0 a aproximadamente 0.8 (por ejemplo ,¡ 0 a aproximadamente 0.6) ; en donde ! ? p + q + r = 1 v es aproximadamente 1 a aproximadamente 25 kDa ó aproximadamente de 5 a aproximadamente 25kDa; y w es aproximadamente 1 a aproximadamente 50 kDa o i aproximadamente 5 a aproximadamente 50kDa.
En algunas modalidades, el número o proporción de residuos monoméricos representados por p y q están dentro 6459.5 de un valor aproximado de 30% uno con respecto a otro, aproximadamente 20% uno con respecto a ptro, aproximadamente 10% uno con respecto a otro, o lo similar.
En modalidades específicas, p es prácticamente igual a q. En ciertas modalidades, la carga parcial incluyei en general, más allá de una cantidad traza de especies con carga, que incluye, por ejemplo, al menos 20% de residuos con carga, al menos 30% de residuos con carga, al menos 40% de residuos con carga, al menos 50% de residuos con c rga, al menos 60% de residuos con carga, al menos 70,% de residuos con carga, o lo similar.
En ciertas modalidades, m es 0 y Q1 es un re!siduo que es hidrofílico y prácticamente neutro (sin carga) al pH fisiológico. En algunas modalidades, "prácticamente' sin carga" incluye que, por ejemplo, menos de 5% tienen : cjarga, menos de 3% tienen carga, menos de 1% tienen carga, | o lo similar. En ciertas modalidades, m es 0 y Q1 es un rejsiduo . i que es hidrofílico y al menos parcialmente catiónicoja pH fisiológico. En ciertas modalidades, m es 0 y QL es un residuo que es hidrofílico y al menos parcialmente ani|ónico a pH fisiológico. En ciertas modalidades, m es >0 y n !es >0 y uno, ya sea Q0 o Q1# es un residuo que es hidrofílico y al menos parcialmente catiónico a pH fisiológico y el ¡otro, ya sea Q0 o Qlf es un residuo que es hidrofíiijco y prácticamente neutro a pH fisiológico. En ciertas 6459.5 modalidades, m es >0 y n es >0 y uno, ya sea Q0 o Q1# es un residuo que es hidrofílico y al menos parcialmente aniónico a pH fisiológico y el otro, ya sea Q0 o Q1( es un residuo que es hidrofílico y prácticamente neutro a pH fisiológico. En ciertas modalidades, m es >0 y n es >0 y Q: es un residuo que es hidrofílico y al menos parcialmente catiónico a pH fisiológico y Q0 es un residuo que es susceptible de conjugarse o tener grupos funcionales. En ciertas modalidades, m es >0 y n es >0 y Q1 es un residuo que es hidrofílico y prácticamente neutro a pH fisiológico y Q0 es un residuo que es susceptible de conjugarse o sustituirse con grupos funcionales. , En ciertas modalidades, una micela descrita aquí comprende un copolímero de bloque de Fórmula II: En algunas modalidades: A0, Alf A2, A3 y A„ se seleccionan a partir del grupo formado por -C-C-, -C (O) (C) aC (O) O- , -0(C)aC(0H y -0(C)b0-; en donde, a es 1-4; b es 2-4; Y0 y Y4 se seleccionan, de manera independiente, a partir del grupo formado por hidrógeno, ( 1C- 10C) alquilo , (3C-6C) cicloalquilo, O- (1C-10C) alquilo, -C(0)0(1C-lOOalquilo, C (0) NR6 (1C-10C) , (4C-10C) heteroarilo y (C6-C10)arilo y cualquiera de éstos, como opción, puede estar sustituido con uno o más grupos flúor; Ylr Y2/ de manera independiente se seleccionan a partir del grupo formado por un enlace covalente, (1C-lOOalquilo, -C (0) 0 (2C-10C) alquilo, -OC(0) (1C-10C) alquilo, -O(2C-10C)alquilo y -S ( 2C- 10C) alquilo- , -C(0)NR6(2C-10C) alquilo- , (4C- 10C) heteroarilo y (C6-C10) arilo; Y3 se selecciona a partir del grupo formado por un enlace covalente, (1C-10C) lquilo, (4C-10C) heteroarilo y (C6 -CIO) arilo; en donde, los átomos de carbono tetravalente ?^?,, que no están totalmente sustituidos con R^-Rs y Y0-Y4 se completan con el número correspondiente de átomos de hidrógeno; Rlf R2, R3, R4, R5 y R6 se selecciona, de manera independiente, a partir del grupo formado por hidrógeno, -CN, alquilo, alquinilo, heteroalquilo , cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo, de los cuales, cualquiera puede estar sustituido con uno o más átomos de flúor .
I Qi y Q2 son residuos que al pH fisiológico tienen carga positiva, que incluyen, entre otros, amino, 6459.5 alquilamino, amonio, alquilamonio, guanidina, imidazolilo y piridilo .
Q3 es un residuo que al H fisiológico tiene carga negativa pero que se protona a un pH inferior, que incluye, entre otros, carboxilo, sulfonamida, boronato, fosfonato y fosfato. m es 0 a aproximadamente 0.49; n es aproximadamente 0.51 a aproximadamente 1.0; en donde m + n = 1 i p es aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.5; q es aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.5; en donde : p es prácticamente igual a q; i r es 0 a aproximadamente 0.6; en donde p + q + r = 1 v es aproximadamente 1 a aproximadamente 25 kDa ó aproximadamente 5 a aproximadamente 25 kDa; y w es aproximadamente 1 a aproximadamente 50 kDa o aproximadamente 5 a aproximadamente 50 kDa.
En ciertas modalidades, una micela descrita1 aquí comprende un copolímero de bloque (por ejemplo, al pH fisiológico normal) de Fórmula III: ! 6459.5 En ciertas modalidades, A0, Alf A2, A3 y A4 sustituidas como se indica, son las unidades constitutivas (indistintamente denominadas en la presente como "unidades monoméricas" y "residuos monoméricos " ) del polímero de Fórmula III. En modalidades específicas, las unidades monoméricas que constituyen los grupos A de la Fórmula III, en cuanto a polimerización, son compatibles en¡ las condiciones apropiadas. En ciertos casos, una cadena principal o unidad constitutiva etilénica, -(C†C-)m-polímero, en donde cada C está disustituido con H y/o cualquier grupo adecuado, se polimeriza por medio de monómeros que contienen un doble enlace carbono-carbono, >C=C< . En ciertas modalidades, cada grupo A (por ejemplo, cada A0, Alt A2, A3 y A4) se puede seleccionar (de manera independiente) a partir de -C-C- (es decir, una unidad monomérica o una cadena principal polimérica etilénica) , -C(O) (C)aC(0)0- (es decir, una unidad monomérica o cadena polimérica principal polianhídrido), -0(C)aC(0)- (es decir, una unidad monomérica o una cadena polimérica principal poliéster) y -0(C)bO- (es decir, una unidad monomérica o 6459.5 cadena polimérica principal polialquilenglicol) o lo similar (en donde cada C está disustituido con H y/o con otro grupo adecuado como los que se describen en la presente, que incluyen, R12 y/o R13 según se describen en lo anterior) . En modalidades específicas, el término "a" es un entero de 1 a 4 y "b" es un entero de 2 a 4. En ciertos casos, cada grupo "Y" y "R" unido a la cadena principal de la Fórmula III (es decir, cualquiera de Y0, Y1# Y2, Y3, Y„, Rlf R2, R3, R4, R5) está unido a cualquier "C" (que incluye cualquier (C)a o (C)b de la unidad monomérica especíifica. En modalidades específicas, tanto Y como R de una unidad monomérica específica están unidos al mismo "C" . En ciertas modalidades específicas, tanto Y como R de una unidad monomérica específica están unidos al mismo "C", el "C" es alfa respecto al grupo carbonilo de la unidad monomérica, en caso de estar presente.
En modalidades específicas, R!-Ru se seleccionan, de manera independiente, a partir de hidrógeno, alquilo (por ejemplo, 1C-5C alquilo, cicloalquilo (por ejemplo1, 3C-6C-cicloalquilo) o fenilo, en donde cualquiera de R^R^ está opcionalmente sustituido con uno o más grupos flúor, cicloalquilo o fenilo, los cuales, como opción, pueden estar también sustituidos con uno o más grupos alquilo.
En ciertas modalidades específicas, Y0 y Y„, se seleccionan, de manera independiente, a partir de I 6459.5 hidrógeno, alquilo (por ejemplo, lC-10C-alquilo) , cicloalquilo (por ejemplo, 3C-6C-cicloalquilo) , 0-alquilo (por ejemplo, 0- (2C-10C) alquilo, -C (0) 0-alquilo (por ejemplo, -C (O) O- (2C-10C) -alquilo) o fenilo, de los cuales cualquiera, como opción, puede estar sustituido con úno o más grupos flúor.
En algunas modalidades, Y1 y Y2, se seleccionan, de manera independiente, a partir de un enlace covalente, alquilo, de preferencia (1C-10C) -alquilo, -C (O) 0-alquilo, de preferencia -C (O) 0- (2C- 10C) -alquilo, -0C (O) alquilo, de preferencia -OC (0) - (2C-10C) alquilo, 0-alquilo, de preferencia -0 (2C-10C) alquilo y S-alquilo, de preferencia S- (2C-10C) alquilo. En ciertas modalidades, Y3 se selecciona a partir de un enlace covalente, alquilo, de preferencia (1C-5C) -alquilo y fenilo.
En algunas modalidades, Z está o no presente. En ciertas modalidades, en donde ^ y/o R4 es hidrógeno, Z- es 0H-. En ciertas modalidades, Z~ es un contraión i (por ejemplo, uno o más contraiones) , de preferencia, un contraión biocompatible , entre otros, por ejemplo, cloruro, fosfato orgánico o inorgánico, sulfato, sulfonato, acetato, propionato, butirato, valerato, caproato, caprilato, caprato, laurato, miristato, palmitato, estearato, palmitoleato, oleato, linoleato, araquidato, gadoleato, vaccinato, lactato, glicolato, salicilato, 6459.5 desaminofenilalanina, desaminoserina, desaminotreonina, e-hidroxicaproato, 3 -hidroxibutirato, 4 -hidroxibutirato o 3-hidroxivalerato . En algunas modalidades, cuando cada Y, R y fluoro opcional están unidos por covalencia a un carbono de la cadena principal seleccionada, cualquiera de los carbonos que no esté sustituido totalmente, se completa con el número correspondiente de átomos de hidrógeno. Los números m, n, p, q y r representan la fracción molar de cada unidad constitutiva en su bloque, v, w, representan el peso molecular de cada bloque.
En ciertas modalidades, A0, A1# A2, A3 y A4 se seleccionan a partir del grupo formado por -C-, -C-C-, -C(0) (C R12R13) aC (0) O- , , -0(C R12R13) aC (0) - y 0(C R12Ri3)b0; en donde: a es 1-4; b es 2-4; Rlr R2 , R3 , R4 , R5 , R¾ , R7 , R8 , R9 , R10 , R , R12 , y R13 se seleccionan, de manera independiente, del grupo formado por hidrógeno, (1C-5C) alquilo, (3C-6C) cicloalquilo, (5C-10C)arilo, (4C-10C) heteroarilo, de los cuales cualqüiera, como opción, puede estar sustituido con uno o más átomos de flúor; Y0 y Y„ se seleccionan, de manera independiente, a I partir del grupo formado por hidrógeno, ( 1C- 10C) alquilo , (3C-6C) cicloalquilo, 0- (1C-10C) alquilo, -C(0)0(1C- 6459.5 10C) alquilo y fenilo y cualquiera que, como opción, esté sustituido con uno o más grupos flúor; Y1 Y2, de manera independiente se seleccionan a partir del grupo formado por un enlace covalente, (1C-lOOalquilo, -C (0) 0 (2C-10C) alquilo, -OC(0) ( 1C- 10C) alquilo , -0 (2C-10C) alquilo y -S (2C-10C) alquilo- ; Y3 se selecciona a partir del grupo formado por un enlace covalente, (1C-5C) alquilo y fenilo; en donde, los átomos de carbono tetravalente A1-A4 que no están totalmente sustituidos con R^Rs y Y0-Y4 se completan con el número correspondiente de átomos de hidrógeno; Z es uno o más contraiones fisiológicamente aceptables , m es 0 a aproximadamente 0.49; n es de aproximadamente 0.51 a aproximadamente 1.0; en donde m + n = 1 p es aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.5; q es aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.5; en donde: p es prácticamente igual a q; r es 0 a aproximadamente 0.6; en donde p + q + r = 1 v es aproximadamente 1 a aproximadamente 25 kDa ó aproximadamente 5 a aproximadamente 25 kDa; y 6459.5 w es aproximadamente 1 a 50 kDa o aproximadamente 5 a 50 kDa.
En una modalidad específica, A0, A1( A2, A3 y A4 se seleccionan, de manera independiente, a partir del grupo formado por -C-C-, -C(0) (C)aC(0)0-, -0(C)aC(0)- y -0(C)bO-; en donde, a es 1 -4 ; b es 2-4; R1# R2 , R3 , R4 , R5 , R6 , R7 , R8 , R9, R10 y Ru , se seleccionan, de manera independiente, a partir del grupo formado por hidrógeno, (1C-5C) alquilo, (3C-6C) cicloalquilo y fenilo, de los cuales, como opción, cualquiera puede estar sustituido con uno o más átomos de flúor; Y0 y Y4 se seleccionan, de manera independiente, a partir del grupo formado por hidrógeno, (1C-10C) alquilo, (3C-6C) cicloalquilo, O- (1C-10C) alquilo, -C(0)0(1C- 10C) lquilo y fenilo, cualquiera de éstos, como opción, puede estar sustituido con uno o más grupos flúor; Y1: Y2, de manera independiente se seleccionan a partir del grupo formado por un enlace covalente, (1C-10C)alquilo, -C (O) 0 (2C-10C) alquilo, -OC(0) (1C-10C) alquilo, -O (2C-10C) alquilo y -S (2C-10C) alquilo- ; Y3 se selecciona a partir del grupo formado por un enlace covalente, (1C-5C) alquilo y fenilo; en donde, los átomos de carbono tetravalente Ax-A4 6459.5 que no están totalmente sustituidos con R^Rs y Y0-Y4 completan con el número correspondiente de átomos hidrógeno ; ' ¡ Z es un contraión fisiológicamente aceptable. m es de 0 a aproximadamente 0.49; n es aproximadamente 0.51 a aproximadamente 1. en donde m + n = 1 p es aproximadamente 0.2 a aproximadamente 0.5 q es aproximadamente 0.2 a aproximadamente ; 0 en donde p es prácticamente igual a q; r es 0 a aproximadamente 0.6; en donde p + q + r = 1 v es aproximadamente 5 a aproximadamente 25 kDa; w es aproximadamente 5 a aproximadamente 25 kDa. En algunas modalidades, Aj. es -C-C- Y1 es -C (O) OCH2CH2- ; R6 es hidrógeno; R7 y R8 son cada uno -CH3; y R2 es -CH3.
En algunas modalidades, '¦ A2 es -C-C-; Y, es -C(0)OCH2CH2-; 6459.5 R9 es hidrógeno; Rio Y Rn son cada uno -CH3; y R3 es -CH3.
En algunas modalidades, A3 es -C-C-; R4 es CH3CH2CH2— ; Y3 es un enlace covalente; y Z es un anión fisiológicamente aceptable. En algunas modalidades: A4 es -C-C-; R5 se selecciona a partir del grupo formado por hidrógeno y -CH3; y Y4 es -C(O) 0(CH2) 3CH3.
En algunas modalidades: A0 es -C-C-; R-L se selecciona a partir del grupo formado por hidrógeno y (1C-3C) alquilo; y Y0 se selecciona a partir del grupo formado por -C(0)0(1C-3C) alquilo.
En algunas modalidades, m es 0.
En algunas modalidades, r es 0.
En algunas modalidades, m y r son 0.
En ciertas modalidades, el copolímero de bloque es un copolímero dibloque, que tiene la siguiente fórmula química (al pH fisiológico normal o a un pH aproximado al 6459.5 neutro), Fórmula IVl: En ciertos casos, las unidades constitutivas del compuesto IVl son como se muestran dentro de los paréntesis cuadrados a la izquierda y los paréntesis curvos a la derecha y se derivan de los monómeros : Las letras p, q y r representan la fracción molar de cada unidad constitutiva del bloque. Las letras v, w representan el peso molecular (promedio numérico) de cada bloque en el copolímero dibloque.
En algunas modalidades, se proporciona aquí un compuesto que tiene la estructura: 6459.5 (IV2) Como se comentó en lo anterior, las letras p, q y r representan la fracción molar de cada unidad constitutiva ¦ I en el bloque. Las letras v, w representan el peso molecular (promedio numérico) de cada bloque en el copolímero dibloque .
En algunas modalidades, se proporcionan en la presente los siguientes polímeros: [DMAEMA] v- [Bp-/Pq-/-Dr]w IV3 [PEGMA]V- [Bp-/Pq-/-Dr] w IV4 [PEGMAn-/-DMAEMAn]v- [Bp- /Pq-/-Dr] w IV5 [PEGMAm-/-MAA(NHS)n]v- [Bp-/Pq- / -Dr] w IV6 [DMAEMAm-/-MAA(NHS)J v- [Bp- /Pq- / -Dr] w IV7 [HPMA.-Z-PDSMJ,- [Bp-/Pq-/-Dr]w IV8 [PEGMA_,-/-PDSMn] v- [Bp-/Pq-/-Dr]w IV9 En algunas modalidades, B es un residuo de metacrilato de butilo,- P es un residuo de ácido propilacrílico; D y DMAEMA son residuos de metacrilato de dimetilaminoetilo.; PEGMA es un residuo de metacrilato de 6459.5 polietilenglicol (por ejemplo, con 1 a 20 unidades de óxido de etileno, como se ilustra en el compuesto IV-2 o 4 a 5 unidades de óxido de etileno ó 7 a 8 unidades de óxido de etileno) ; MAA(NHS) es un residuo de N-hidroxisuccinimida de ácido metacrílico; HPMA es un residuo de N-(2-hidroxipropil) metacrilamida; y PDSM es un residuo metacrilato de piridil disulfuro. En ciertas modalidades, los términos m, n, p, q, r, w, v son según se describen aquí. En modalidades específicas, es aproximadamente lx a aproximadamente 5x v. i Los compuestos de fórmulas IV1-IV9 son ejemplos de polímeros que se proporcionan en la presente, que comprenden una variedad de unidades constitutivas que forman el primer bloque del polímero. En algunas modalidades, las unidades constitutivas del primer bloque se modifican o se tratan químicamente a fin de generar polímeros en donde el primer bloque es o comprendé una unidad constitutiva que es neutra (por ejemplo, PEGMA) , catiónica (por ejemplo, DMAEMA) , aniónica (por ejemplo, PEGMA-NHS, en donde NHS se hidroliza para obtener el ácido o ácido acrílico) , anfolítica (por ejemplo, DMAEMA-NHS , en donde NHS se hidroliza para obtener el ácido) o zwiteriónica (por ejemplo, poli [2 -metacriloiloxi- 2 ' - i trimetilamoniometil fosfato] ) . En algunas modalidades los polímeros contienen grupos funcionales piridil disulfuro en 6459.5 el primer bloque, por ejemplo, [PEGMA-PDSM] - [B-P-D] que pueden reaccionar y opcionalmente reaccionan con un derivado tiol de AR si y forman un conjugado de polímero-ARNsi .
En una modalidad específica, un compuesto de Fórmula IV3 es un polímero de clase P7, tal cómo se describe en la presente, y su peso molecular, polidispersidad y composición monomérica se presentan en la Tabla 1. a Según se determina con columnas TSK-GEL R-3000 y R-4000 (Tosoh Bioscience, Mongomeryville , PA) conectadas en serie a un equipo Viscotek GPCmax VE2001 y refractómetro VÉ3580 (Viscotek, Houston, TX) . Como fase móvil se usó DMF grado HPLC que contenía 0.1% en peso de LiBr. Los pesos moleculares de los copolímeros sintetizados se determinaron utilizando una serie de estándares de poli (metacrilato de metilo) . b Según se determina por espectroscopia H1RMN (3% en peso en CDC13; Bruker DRX 499) . i En algunas modalidades específicas, un polímero de Fórmula IV3 es un polímero clase P7 según la Tabla 2.
Tabla 2 de Fórmula IV3 es un polímero de clase P7 denominado P7v6. En esta solicitud y en varias solicitudes de prioridad, las designaciones PRx0729v6 y P7v6 se usan indistintamente.
Copolímeros de bloque desestabilizantes de la membrana En una modalidad, las micelas que se proporcionan en la presente o partes componentes de las mismas/ son desestabilizantes de membrana (por ejemplo, comprenden un bloque, grupo, entidad, o lo similar, que desestabiliza 6459.5 membrana) . En otras modalidades alternas, la pluralidad de copolímeros de bloque forma la envoltura y la parte central de una micela. En modalidades específicas, la micela comprende una envoltura hidrofílica y/o con carga. En otras modalidades alternas, la micela comprende una parte central básicamente hidrofóbica (por ejemplo, la parte central comprende grupos, unidades monoméricas, entidades, bloques, o lo similar, hidrofóbicos) . En modalidades específicas, cada uno del o los copolímeros de bloque contiene: (1) un bloque con carga, hidrofílica que forma la envoltura de la micela; y (2) un bloque básicamente hidrofóbico que forma la parte central de la micela. En algunas modalidades; uno o más copolímeros de bloque comprenden una pluralidad de primeras especies susceptibles de adquirir carga y, una pluralidad de intensificadores de hidrofobicidad. En modalidades específicas, las primeras especies susceptibles de adquirir carga son especies susceptibles de adquirir carga aniónicas (por ejemplo, tienen carga o adquieren carga a un pH específico) . En otras modalidades, el o los copolímeros de bloque comprenden una segunda especie susceptible de adquirir carga (es decir, el bloque hidrofílico puede tener más de un tipo diferente de especies aniónicas). En ciertas modalidades, la micela comprende al menos un polinucleótido (por ejemplo, oligonucleótido) . En modalidades específicas, el 6459.5 polinucleótido (por ejemplo, oligonucleótido) no está en el centro de la micela.
En algunas modalidades, un copolímero de bloque desestabilizante de membrana, comprende: (i) una pluralidad de residuos monoméricos hidrofóbicos , (ii) una pluralidad de residuos monoméricos aniónicos que tienen una especie susceptible de adquirir carga, la especie susceptible de adquirir carga es aniónica al pH fisiológico, y es prácticamente neutra o sin carga a un pH endosómico y (iii) de manera opcional, una pluralidad de residuos monoméricos catiónicos. En algunas modalidades, la combinación de dos mecanismos de disgregación de membrana, (a) un policatión (como DMAEMA) y (b) un polianión hidrofobizado (como ácido poliacrílico) , al actuar juntos tienen un efecto aditivo o sinérgico sobre la potencia de desestabilización de membrana conferida por el polímero.
En algunas modalidades, la modificación de la relación entre la especie aniónica y la especie catiónica en un copolímero de bloque permite la modificación de la actividad desestabilizadora de la membrana de una micela descrita aquí. En algunas de estas modalidades, la relación entre las especies aniónica: catiónica en un copolímero de bloque , varía de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 1 : 4 al pH fisiológico. En algunas de estas modalidades, la modificación de la relación entre la especie aniónica ( y la 6459.5 especie catiónica en un bloque hidrofóbico de un copolímero de bloque, permite la modificación de la actividad desestabilizadora de la membrana de una micela descrita aquí. En algunas de estas modalidades, la relación entre las especies aniónica: catiónica en un bloque hidrofóbico de un copolímero de bloque descrita aquí, varía de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 3:1 o de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 2:1 al pH fisiológico sérico.
En ciertas modalidades, los copolímeros de bloque desestabilizantes de membrana, presentes en una micela aquí provista, comprenden una sección central (por ejemplo, un bloque central) que comprende una pluralidad de grupos hidrofóbicos . En modalidades más específicas, la sección central (por ejemplo, un bloque central) comprende una pluralidad de grupos hidrofóbicos y una pluralidad de primeras especies o grupos susceptibles de adquirir carga. En modalidades aun más específicas, tales primeras especies o grupos susceptibles de adquirir carga, están negativamente cargadas y/o son susceptibles de adquirir carga para convertirse en especies o grupos con carga negativa (por ejemplo, a un pH aproximado al neutro o a un pH de aproximadamente 7.4) . En algunas modalidades específicas, la sección central (por ejemplo, un bloque central) comprende una pluralidad de grupos hidrofóbicos, 6459.5 una pluralidad de primeras especies o grupos susceptibles de adquirir carga y una pluralidad de segundas especies o grupos susceptibles de adquirir carga. En modalidades más específicas, las primeras especies o grupos susceptibles de adquirir carga, están negativamente cargadas y/o son susceptibles de adquirir carga para convertirse en especies o grupos con carga negativa y las segundas especies o grupos susceptibles de adquirir carga, están positivamente cargadas y/o son susceptibles de adquirir carga para convertirse en especies o grupos con carga positiva (por ejemplo, a un pH aproximado al neutro o a un pH de aproximadamente 7.4).
Relación entre el bloque hidrofílico y el bloque hidrofóbico En ciertas modalidades, las micelas que se proporcionan en la presente, también se caracterizan por otros criterios: (1) el peso molecular de los bloques individuales y sus relaciones de longitud relativa disminuyen o aumentan con el fin de controlar el tamaño de la micela formada y su relativa estabilidad y (2) el tamaño del bloque polimérico hidrofílico se varía (por ejemplo, al variar el número de monómeros catiónicos) para que haya una eficaz formación del complejo y/o neutralización de carga de un agente terapéutico aniónico (por ejemplo, un 6459.5 medicamento oligonucleótido) .
En algunas modalidades, la relación de bloque entre el peso molecular promedio numérico (Mn) del bloque hidrofílico y el bloque hidrofóbico es aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1.10. En algunas modalidades, las micelas descritas aquí comprenden copolímeros con una relación de bloque entre el peso molecular promedio numérico (Mn) del bloque hidrofílico y el bloque hidrofóbico es aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:5 o de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:2.5. 1 En algunas modalidades, la relación de bloque entre el peso molecular promedio numérico (Mn) del bloque hidrofílico y el bloque hidrofóbico es aproximadamente 1:1 a aproximadamente 10:1. En algunas modalidades, las micelas descritas aquí comprenden copolímeros con una relación de bloque entre el peso molecular promedio numérico (Mn) del bloque hidrofílico y el bloque hidrofóbico es aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:5 o de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 2.5:1.
Arquitectura del polímero En casos específicos, se proporcionan en la presente copolímeros de bloque con la siguiente estructura: a- [Ds-Xt]b- [Bx-Py-D_] ß-? [Estructura 1] a- [Bx-Py-D_] a- [Ds-Xt]b-a) [Estructura 2] en donde x,y,z,s y t son la composición molar en % (por lo general, 0-50%) de las unidades monoméricas individuales D(DMAEMA), B(BMA), P(PAA) y un raonómero neutro hidrofílico (X) en el bloque polimérico, a y b son los pesos moleculares de los bloques, [Ds-Xt] es el bloque hidrofílico y a y ? representan los extremos opuestos del polímero. En ciertas modalidades , X es 50%, y es 25% y z es 25%. En ciertas modalidades , X es 60%, y es 20% y z es 20^ . En ciertas modalidades , X es 70%, y es 15% y z es 15%. En ciertas modalidades , X es 50%, y es 25% y z es 25% . En ciertas modalidades , X es 33%, y es 33% y z es 33% . En ciertas modalidades , X es 50%, y es 20% y z es 30% . En ciertas modalidades , X es 20%, y es 40% y z es 40%. En ciertas modalidades , X es 30%, y es 40% y z es 30%.
En algunas modalidades, un copolímero de bloque descrito aquí comprende un bloque hidrofílico de aproximadamente 2,000 KDa a aproximadamente 30,000 KDa, aproximadamente 5,000 KDa a aproximadamente 20,000 KDa o aproximadamente 7,000 KDa a aproximadamente 15,000 KDa. En modalidades específicas, el bloque hidrofílico es de aproximadamente 7,000 KDa, 8,000 KDa, 9,000 KDa, 10,000 KDa, 11,000 KDa, 12,000 KDa, 13,000 KDa, 14,000 KDa o 15,000 KDa. En ciertas modalidades, un copolímero de bloque descrito aquí comprende un bloque hidrofóbicó de aproximadamente 10,000 KDa a aproximadamente 100,000 KDa, aproximadamente 15,000 KDa a aproximadamente 35,000 KDa o 6459.5 aproximadamente 20,000 KDa a aproximadamente 30,000 KDa. En algunas modalidades específicas, un copolímero de bloque que comprende un bloque hidrofílico de 12,500 KDa y un bloque hidrofóbico de 25,000 KDa (relación de longitud de 1:2) forma una micela. En algunas modalidades específicas, un copolímero de bloque que comprende un bloque hidrofílico de 10,000 KDa y un bloque hidrofóbico de 30,000 KDa (relación de longitud de 1:3) forma una micela.
En algunas modalidades específicas, un copolímero de bloque que comprende un bloque hidrofílico de 10,000 KDa y un bloque hidrofóbico de 25,000 KDa (relación de longitud de 1:2.5) forma una micela de aproximadamente 45 nm (según se determina por mediciones de dispersión luminosa dinámica o microscopía electrónica) . En algunas modalidades específicas, las micelas son de 80 o 130 nm (según se determina por mediciones de dispersión luminosa dinámica o microscopía electrónica) . Por lo general, a medida que el peso molecular (o longitud) de [Ds-Xt] , la cual forma la envoltura de la micela, aumenta con relación a -[Bx-Py-Dz] , el bloque hidrofóbico que forma la parte central, aumenta el tamaño de la micela. En algunos casos, el tamaño del bloque catiónico polimérico que forma la envoltura [Ds-Xt] , es importante para proveer una formación eficaz de complejo/neutralización de carga con el medicamento oligonucleótido . Por ejemplo, en ciertos casos, para un 6459.5 ARNsi de aproximadamente 20 pares de bases (es decir, 40 cargas aniónicas) un bloque catiónico tiene una longitud adecuada que permite una unión eficaz, por ejemplo, 40 cargas catiónicas . Para un bloque de envoltura que contiene 80 monómeros DMAEMA (PM = 11,680) con un valor pKa de17.4, el bloque contiene 40 cargas catiónicas a pH 7.4. En algunos casos, se forman conjugados de polimero-ARNsi estables (por ejemplo, complejos) mediante interacciones electrostáticas entre cargas opuestas numeradas en forma similar. En ciertos casos, evitar un gran número de cargas positivas en exceso ayuda a prevenir toxicidad significativa in vitro e in vivo.
Polidispersidad En algunas modalidades, los copolímeros de bloque utilizados en las micelas proporcionadas en la presente, tienen un índice de polidispersidad bajo (PDI o polydispersity índex) o diferencias en la longitud de cadena. El índice de polidispersidad (PDI) se determina de cualquier forma que sea adecuada, por ejemplo, dividiendo el peso molecular promedio en peso de las cadenas de polímero entre el peso molecular promedio numérico. El peso molecular promedio numérico es la suma de pesos moleculares de las cadenas dividido entre el número de cadenas . El peso molecular promedio en peso, es proporcional al cuadrado del 6459.5 I peso molecular dividido entre el número de moléculas de ese peso molecular. Puesto que el peso molecular promedio en peso siempre es mayor que el peso molecular promedio numérico, la polidispersidad siempre es mayor o igual a uno. A medida que los números se acercan y se acercan al mismo valor, es decir, a medida que la polidispersidad se acerca al valor de uno, el polímero está más cerca de ser monodisperso en donde cada cadena tiene exactamente el mismo número de unidades monoméricas . Los valores de polidispersidad que se acercan a uno se logran por medio de la polimerización viva por radicales. Los métodos para determinar la polidispersidad, entre otros, por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño, dispersión luminosa dinámica, espectrometría de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz, espectrometría de masas de electropulverización acoplada a cromatografía, son muy conocidas en la técnica. En algunas modalidades, el copolímero de bloque de las unidades micelares que aquí se proporcionan, tienen un índice de polidispersidad (PDI) menor de 2.0 o menor de 1.5 o menor de 1.4 o menor de ¡1.3 o menor de 1.2.
Síntesis En ciertas modalidades, los copolímeros de bloque comprenden monómeros con insaturaciones etilénicas. El I término "monómero etilénicamente insaturado" se define como un compuesto que tiene al menos un doble enlace o un triple enlace de carbono. Ejemplos no limitativos de monómeros etilénicamente insaturados son: alquil (alquil) acrilato, metacrilato, acrilato, alquilacrilamida, metacrilamida, acrilamida, estireno, alilamina, alilamonio, dialilamina, dialilamonio, N-vinilformamida, éter vinílico, vinil sulfonato, ácido acrílico, sulfobetaína, carboxibetaína, fosfobetaína o anhídrido maléico.
En algunas modalidades, monómeros adecuados para usarse en la preparación de los copolímeros de bloque proporcionados aquí, incluyen, entre otros, uno o más de los siguientes monómeros: metacrilato de metilo, acrilato de etilo, metacrilato de propilo (todos los isómeros) , metacrilato de butilo (todos los isómeros) , metacrilato de 2-etilhexilo, metacrilato de isobornilo, ácido metacrílico, metacrilato de bencilo, metacrilato de fenilo, metacrilonitrilo, alfa-metilestireno, acrilato de metilo, acrilato de etilo, acrilato de propilo (todos los isómeros) , acrilato de butilo (todos los isómeros) , acrilato de 2-etilhexilo, acrilato de isobornilo, ácido acrílico, acrilato de bencilo, acrilato de fenilo, acrilonitrilo, estireno, acrilatos y estírenos seleccionados a partir de metacrilato de glicidilo, metacrilato de 2 -hidroxietilo, metacrilato de 6459.5 hidroxipropilo (todos los isómeros) , metacrilato de hidroxibutilo (todos los isómeros) , metacrilato de N,N-dimetilaminoetilo (DMAEMA) , metacrilato de trietilenglícol , metacrilato de oligoetilenglicol , anhídrido itacónico, ácido itacónico, acrilato de glicidilo, acrilato de 2-hidroxietilo, acrilato de hidroxipropilo (todos los isómeros) , acrilato de hidroxibutilo (todos los isómeros) , acrilato de N, N-dimetilaminoetilo, acrilato de N,N-dietilaminoetilo, acrilato de trietilenglicol, acrilato de oligoetilenglicol, metacrilamida, N-metilacrilamida, N,N-dimetilacrilamida, N-ter-butilmetacrilamida, N-n-butilmetacrilamida, N-metilolacrilamida, N-etilolacrilamida, ácido vinil benzoico (todos los isómeros) , dietilaminoestireno (todos los isómeros) , ácido alfa-metilvinil benzoico (todos los isómeros) , dietilamino alfa-metilestireno (todos los isómeros), ácido p-vinilbencensulfónico, sal sódica del ácido p-vinilbencensulfónico, metacrilato de trimetoxisililpropilo, metacrilato de trietoxisililpropilo, metacrilato de tributoxisililpropilo, metacrilato de dimetoximetilsililpropilo, metacrilato de dietoximetilsililpropilo, metacrilato de dibutoximetilsililpropilo , metacrilato de . i diisopropoximetilsililpropilo, metacrilato de dimetoxisililpropilo, metacrilato de dietoxisililpropilo, 6459.5 metacrilato de dibutoxisililpropilo, metacrilato de diisopropoxisililpropilo, acrilato de trimetoxisililpropilo, acrilato de trietoxisililpropilo, acrilato de tributoxisililpropilo, acrilato de dimetoximetilsililpropilo, acrilato de dietoximetilsililpropilo, acrilato de dibutoximetilsililpropilo , acrilato de diisopropoximetilsililpropilo, acrilato de dimetoxisililpropilo, acrilato de dietoxisililpropilo, acrilato de dibutoxisililpropilo, acrilato de diisopropoxisililpropilo, acetato de vinilo, butirato de vinilo, benzoato de vinilo, cloruro de vinilo, fluoruro de vinilo, bromuro de vinilo, anhídrido maléico,¡ N-arilraaleimida, N-fenilmaleimida, N-alquilmaleimida, N-butilmaleimida, N-vinilpirrolidona, N-vinilcarbazol , butadieno, isopreno, cloropreno, etileno, propileno, 1,5-hexadienos, 1 , 4 -hexadienos , 1, 3 -butadienos, 1,4-pentadienos, alcohol vinílico, vinilamina, N-alquilvinilaraina, alilamina, N-alquilalilamina, dialilamina, N-alquildialilamina, alquilenimina, ácidos acrílieos, alquilacrilatos , acrilamidas , ácido metacrílieos , alquilmetacrilatos , metacrilamidas , N-alquilacrilamidas , N-alquilmetacrilamidas , estireno, N-isopropilacrilamida, vinilnaftaleno, vinilpiridina, etilvinilbenceno, aminoestireno, vinilpiridina, 6459.5 vinilimidazol , vinilbifenilo, vinilanisol, vinilimidazolilo, vinilpiridinilo, vinilpolietilenglicol , dimetilaminoraetilestireno, metacrilato de etil trimetilamonio, acrilato de etiltrimetilamonio, dimetilaminopropilacrilamida, acrilato de etil trimetilamonio, metacrilato de etil trimetilamonio, trimetilamonio propil acrilamida, acrilato de dodecilo, acrilato de octadecilo o monómeros de metacrilato de octadecilo, o combinaciones de los mismos.
En algunas modalidades, como opción, se utilizan versiones de estos monómeros modificados con grupos funcionales. Un monómero modificado con grupos funcionales, en el sentido que se utiliza en la presente, es un monómero que comprende un grupo funcional enmascarado o no, por ejemplo, un grupo al que se le han unido otras entidades después de la polimerización. Los ejemplos no limitativos I de estos grupos son grupos amino primarios, carboxilos, tioles, hidroxilos, azidas y ciano. Existen varios grupos enmascarantes adecuados (véase, por ejemplo, T.W. Greene & P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis (2nd Ed. J. Wiley & Sons, 1991 y P.J. Kocienski, Protecting Groups, Georg Thieme Verlag, 1994, las cuales se consideran parte de la presente, como referencia para la exposición) .
Los polímeros descritos aquí se preparan de cualquier forma que sea adecuada. Los métodos sintéticos 6459.5 adecuados utilizados para producir los polímeros de la presente, incluyen, entre otros, los de polimerización catiónica, aniónica y de radicales libres. En algunos casos, cuando se usa un proceso catiónico, el monómero se trata con un catalizador que inicia la polimerización. , Como opción, se usan uno o más monómeros para formar un copolímero. En algunas modalidades, este catalizador es un iniciador, que incluye, por ejemplo, ácidos protónicos (ácido de Bronsted) o ácidos de Lewis, si se usan los ácidos de Lewis, opcionalmente también se puede usar algún promotor como agua o alcoholes. En algunas modalidades, el catalizador es, por ejemplo, entre otros, yoduró de hidrógeno, ácido perclórico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, fluoruro de hidrógeno, ácido clorosulfónico, ácido metansulfónico, ácido trifluorometansulfónico, tricloruro de aluminio, cloruros de alquil aluminio, complejos de trifluoruro de boro, tetracloruro de estaño, pentacloruro de antimonio, cloruro de cinc, tetracloruro de titanio, pentacloruro de fósforo, oxicloruro de fósforo u oxicloruro de cromo. En ciertas modalidades, la síntesis del polímero se hace en limpio o en cualquier disolvente adecuado. Los disolventes adecuados incluyen, entre otros, pentano, hexano, diclorometano, cloroformo o dimetilformamida (DMF) , En ciertas modalidades, la síntesis del polímero se lleva a cabo a cualquier temperatura de 6459.5 reacción adecuada, que incluye, por ejemplo, aproximadamente -50°C a aproximadamente 100°C o de aproximadamente 0°C a aproximadamente 70 °C.
En ciertas modalidades, los copolímeros de bloque se preparan por medio de una polimerización por radicales libres. Cuando se usa un proceso de polimerización por radicales libres, se proporciona (i) el monómero, (ii) opcionalmente , el comonómero y (iii) una fuente opcional de radicales libres para iniciar un proceso de polimerización por radicales libres. En algunas modalidades, la fuente de radicales libres es opcional porque algunos monómeros pueden autoiniciarse al calentamiento a alta temperatura. En ciertos casos, después de formar la mezcla de polimerización, la mezcla se somete a condiciones de polimerización. Las condiciones de polimerización son aquellas condiciones que hacen que al menos un monómero forme al menos un polímero, tal como se describe en la presente. Como característica opcional estas condiciones se varían en cualquier grado adecuado, por ejemplo, de manera no exclusiva, temperatura, presión, atmósfera, relación entre los componentes iniciales utilizados en la mezcla de polimerización y tiempo de reacción. La polimerización se lleva a cabo en alguna forma que sea adecuada, que incluye, por ejemplo, en solución, dispersión, suspensión, emulsión o en masa. 6459.5 En algunas modalidades, los iniciadores están presentes en la mezcla de reacción. Como opción, se utiliza cualquier iniciador adecuado si es útil en proceso de polimerización descrito aquí. Estos iniciadores incluyen, entre otros, uno o más alquil peróxidos, alquil peróxidos sustituidos, aril peróxidos, aril peróxidos sustituidos, acil peróxidos, alquil hidroperóxidos , alquil hidroperóxidos sustituidos, aril hidroperóxidos, aril hidroperóxidos sustituidos, heteroalquil peróxidos, heteroalquil peróxidos sustituidos, heteroalquil hidroperóxidos, heteroalquil hidroperóxidos sustituidos, heteroaril peróxidos, heteroaril peróxidos sustituidos, heteroaril hidroperóxidos, heteroaril hidroperóxidos sustituidos, alquil perésteres, alquil perésteres sustituidos, aril perésteres, aril perésteres sustituidos, o compuestos azo. En modalidades específicas, como iniciadores se usan peróxido de benzoílo (BPO) y/o 2,2'-azo-bis-isobutironitrilo (AIBN) .
En algunas modalidades, los procesos de polimerización se llevan a cabo como polimerización viva, en cualquier forma adecuada, entre las que se encuentran la polimerización por radicales con transferencia de átomos (ATRP - atom transfer radical polymerization) , polimerización viva por radicales libres mediada < por nitróxido (NMP - nitroxide-mediated living free radical 6459.5 polymerization) , polimerización por apertura de anillo (ROP - ring-opening polymerization) , transferencia degenerativa (DT- degenerative transfer) o transferencia por adición fragmentación reversible (RAFT - reversible addition fragmentation transfer) . Mediante el uso de métodos de polimerización convencionales y/o viva/controlada, se pueden producir varias arquitecturas poliméricas, por ejemplo, entre otros, copolímeros en bloque, de injerto, de estrella y gradiente, en las cuales la unidades monoméricas están distribuidas de forma estadística o en gradiente a los largo de la cadena u homopolimerizadas en secuencia de bloque o injertos colgantes. En otras modalidades, los polímeros se sintetizan por diseño macromolecular a través de transferencia de cadena por adición- fragmentación reversible de xantatos (MADIX) (Direct Synthesis of Double Hydrophilic Statistical Di- and Triblock Copolymers Comprised of Acrylamide and Acrylic Acid Units via the MADIX process", Daniel Taton, et al., Macromolecular Rapid Communications, 22, Núm. 18, 1497-1503 (2001)).
En ciertas modalidades, se usa transferencia de cadena por adición- fragmentación reversible o RAFT en la síntesis de los polímeros de cadena principal etilénica, de esta invención. La polimerización RAFT es un proceso de polimerización viva. La RAFT consiste en un proceso de transferencia de cadena degenerativo por radicales libres. 6459.5 En algunas modalidades, los procedimientos RAFT ¡para preparar un polímero descrito aquí, emplean compuestos tiocarboniltio, tales como, entre otros, ditioésteres , ditiocarbamatos , tritiocarbonatos y xantatos que participan en la polimerización mediante un mecanismo de transferencia I de cadena reversible. En ciertos casos, la reacción dje un radical polimérico con el grupo C=S de cualquiera dé los compuestos precedentes da lugar a la formación de radicales : i intermedios estabilizados. Por lo general, estos intermediarios radicales estabilizados no llevan a cabo las reacciones de terminación típicas de la polimerización por radicales estándar, sino más bien, reintroducen un radical I con capacidad de reiniciación o propagación con monómero, regenerando el enlace C=S en el proceso. En la mayoría de i los casos, este ciclo de adición al enlace C=S seguido de la fragmentación del radical resultante, continúa hasta que i todos los monómeros se han consumido o la reacción s 1e ha i detenido. Por lo general, la baja concentración de radicales activos en cualquier momento particular, limita las reacciones de terminación normales. i Los procesos de polimerización descritos i aquí opcionalmente se presentan en cualquier disolvente o mezcla de disolventes. Los disolventes adecuados incluyen agua, alcohol (por ejemplo, metanol, etanol, n-própknol, j isopropanol, butanol, tetrahidrofurano (THF) , sulfóxido de 6459.5 dimetilo (DMSO) , dimetilformamida (DMF) , acetona, acetonitrilo, hexametilfosforamida, ácido acético, ácido fórmico, hexano, ciclohexano, benceno, tolueno, dioxanos, cloruro de metileno, éter (por ejemplo, éter dietílico) , cloroformo y acetato de etilo. En un aspecto, el disolvente incluye agua y mezclas de agua y disolventes orgánicos miscibles con agua, como DMF.
En algunas modalidades, se introduce un grupo conjugable en el extremo del polímero proporcionado aquí al preparar el polímero en presencia de un reactivo de transferencia de cadena que contenga un grupo conjugable (por ejemplo, un grupo azida o piridil disulfuro) , en donde el grupo conjugable es compatible con las condiciones del proceso de polimerización. Un ejemplo no limitativo de este reactivo de transferencia de cadena lo describe Heredia, K.L. et al. (Véase Chem. Commun. , 2008, 28, 3245-3247, la cual se considera parte de la presente, como referencia para la exposición). En algunas modalidades, el reactivo de transferencia de cadena contiene un grupo conjugable enmascarado que después de la reacción de desenmascaramiento se une a un agente ARNsi o a un agente dirigido o dirigible (targeting agent) . En algunas modalidades, un agente dirigido o dirigible, entre otras como por ejemplo, un agente dirigido de molécula pequeña (por ejemplo, residuo de biotina o monosacárido) , se une al 6459.5 extremo a del polímero proporcionado en la presente, preparando el polímero en presencia del reactivo de transferencia de cadena, en donde el reactivo de transferencia de cadena comprende el agente dirigido.
En algunos casos, los copolímeros de bloque contienen monómeros conjugables (por ejemplo, monómeros que I tienen grupos conjugables) que se usan para introducir grupos funcionales adicionales (por ejemplo, agentes dirigidos de molécula pequeña) después de la polimerización, a través de las técnicas químicas conocidas, por ejemplo, química "click" (por ejemplo, reacciones "click", véase Wu, P.; Fokin, V. V. Catalytic Azide-Alkyne Cycloaddition : Reactivity and Applications. Aldrichim. Acta, 2007, 40, 7-17), la cual se considera parte de la presente, como referencia) . En algunas modalidades, un monómero que contiene estos grupos conjugables se copolimeriza con un monómero idrofóbico y un monómero que contiene un grupo susceptible de adquirir i carga y convertirse en una especie aniónica. En algunos casos, la N-hidrosuccinimida éster de ácido acrílico o un ácido alquilacrílico se copolimeriza con otros monómeros para formar un copolímero que se hace reaccionar con moléculas que tienen grupo funcional amino, por ejemplo, ligandos dirigidos {targeting linkers) o derivados amino de polietilenglicoles (PEG) . En algunas modalidades, el S459.5 raonómero que contiene un grupo conjugable ; es piridildisulfuro acrilato (PDSA) . j En ciertas modalidades, el copolímero de bloque comprende una unidad monomérica sustituida con PEG | (por ejemplo, el PEG es una cadena lateral y no constituye la cadena principal del bloque portador del polinucleótido) .
En algunos casos, uno o más de los polímeros descritosj aquí i contienen cadenas o bloques de polietilenglicol (PEG) con pesos moleculares de aproximadamente 1,000 a 30,000. En algunas modalidades, el PEG se conjuga con grupos terminales de polímeros o con uno o más de los grupos modificables colgantes presentes en un polímero dje un portador polimérico de la presente. En algunas modalidades, los residuos PEG se conjugan con grupos modificables dgntro del segmento o bloque polimérico (por ejemplo, un bloqüe de envoltura) de un polímero (por ejemplo, copolímero de bloque) de un portador polimérico de la presente!. En ciertas modalidades, un monómero que contiene un residuo PEG de 2 a 20 unidades de óxido de etileno, se copolimjeriza j para formar la porción hidrofílica del polímero que constituye el portador polimérico de la presente. i Carga útil micelar: Polinucleótidos En la presente se proporcionan micelas que suministran a una célula viva agentes de diagnóstico y/o terapéuticos (que incluyen, por ejemplo, oligonucleótidos ) . En algunas modalidades, las micelas comprenden una pluralidad de copolímeros de bloque y como característica opcional, al menos un agente terapéutico (por ejemplo, un polinucleótido, por ejemplo, ARNsi) . Las micelas proporcionadas aquí son biocompatibles , estables (y sea química y/o físicamente estables) y/o reproducibles por síntesis. De preferencia, las unidades micelares de la presente son atóxicas (por ejemplo, presentan baja toxicidad) , protegen la carga útil del agente terapéutico (por ejemplo, un oligonucleótido) contra la degradación, entran a la célula viva mediante procesos naturales (por ejemplo, por endocitosis) y/o suministran la carga útil del principio terapéutico (por ejemplo, un oligonucleótido) en el citoplasma de una célula viva después de entrar en contacto con la célula.
En ciertos casos, el polinucleótido (por ejemplo, un oligonucleótido) es un ARNsi y/u otro agente "con base nucleotídica" que altera la expresión de al menos un gen en la célula. Por consiguiente, en ciertas modalidades |, las micelas que aquí se proporcionan son útiles para el suministro de ARNsi a una célula. En ciertos casos, la célula es in vi tro y en otros casos la célula es in vivo (por ejemplo, un ratón o un ser humano) . En algunas modalidades, se administra una cantidad terapéuticamente 6459.5 eficaz de las micelas que comprenden un ARNsi, a un individuo que lo necesite (por ejemplo, que necesita un gen silenciado (knocked-down) , en donde el gen es susceptible de ser silenciado (knocked-down) por el ARNsi administrado) . En casos específicos, las micelas son útiles o están específicamente diseñadas para suministrar ARNsi a las células de un individuo seleccionadas de manera específica .
En algunas modalidades, las micelas proporcionadas aquí suministran agentes ARNi (por ejemplo, ARNsi) a un individuo que los necesite. En algunas de estas modalidades se proporciona en la presente una micela que comprende un polímero bioconjugado , por ejemplo, un ARNi conjugado (por ejemplo, por enlace iónico o covalente) con un copolímero de bloque. En modalidades más específicas, el agente ARNi se conjuga con el extremo alfa del copolímero de bloque y en otras modalidades específicas, el ARNi se conjuga con el extremo omega del copolímero de bloque. En algunas modalidades, el ARNsi se conjuga por covalencia con las cadenas laterales colgantes de una o más de las unidades monoméricas del polímero.
En algunas modalidades, la molécula ARNi es un polinucleótido . En ciertas modalidades, el polinucleótido es un modulador de la expresión del gen de oligonucléótido . En otras modalidades, el polinucleótido es un agente de 6459.5 silenciamiento génico del oligonucleótido o un agente AR i. En modalidades específicas, el polinucleótido es un sustrato Dicer o ARNsi.
En ciertas modalidades, el polinucleótido comprende los extremos 51 - y 31 - y se une al polímero desestabilizante de membrana en el extremo 5'- ó 3'- del polinucleótido. En varias modalidades, el agente ARNi se une por covalencia al copolímero de bloque a través de una entidad ligante.
En algunas modalidades, la entidad ligante comprende un par de unión por afinidad. En ciertas modalidades, un polinucleótido y/o uno de los extremos del polímero desestabilizante de membrana en función del pH, se modifica con entidades químicas y se obtiene un polinucleótido y/o un polímero que tiene afinidad con otro, por ejemplo, ácido arilborónico-ácido salicilhidroxámico, i cierre de leucina u otro motivo peptídico u otros tipos de enlaces de afinidad química.
La entidad ligante (por ejemplo, un enlace covalente) entre un copolímero de bloque y un agente ARNi de una micela descrita aquí es, opcionalmente , escindible o no escindible. En ciertas modalidades, un precursor de ARNi (por ejemplo, un sustrato dicer) está unido al polímero (por ejemplo, al grupo conjugable terminal alfa u omegá del polímero) por medio de una entidad ligante no escindible. 6459.5 En algunas modalidades, un agente ARNi está unido a través de una entidad ligante escindible. En algunos casos, la entidad ligante entre el agente ARNi y el polímero de la micela descrita aquí contiene un enlace escindible. En otros casos, la entidad ligante entre el agente ARNi y el polímero de la micela descrita aquí es no escindible. En ciertas modalidades, los enlaces escindibles utilizados en las micelas proporcionadas aquí incluyen, entre otros ejemplos, enlaces disulfuro (por ejemplo, enlaces disulfuro que se disocian en el medio reductor del citoplasma) . En algunas modalidades, la entidad ligante es escindible y/o contiene un enlace que es escindible en las condiciones endosómicas . En algunas modalidades, la entidad ligante es escindible y/o contiene un enlace que es escindible mediante una enzima específica (por ejemplo, una fosfatasa o una proteasa) . En algunas modalidades, la entidad ligante es escindible y/o contiene un enlace que es escindible frente a un cambio en un parámetro intracelular (por ejemplo, pH, potencial redox) . En algunas modalidades, la asociación covalente entre un polímero (por ejemplo, el grupo conjugable terminal alfa u omega del polímero) y un agente ARNi (por ejemplo, un oligonucleótido o ARNsi) se logra a través de cualquier método de conjugación química adecuado, que incluye, entre otros, ligantes amino-carboxilo, amino-aldehído, amino-cetona, amino 6459.5 carbohidrato, amino-hidroxilo, amino-amino, carboxilo-sulfhidrilo, carboxilo-carbohidrato, carboxilo-hidroxilo, carboxilo-carboxilo, sulfhidrilo-carbohidrato, sulfhidrilo-hidroxilo, sulfhidrilo-sulfhidrilo, carbohidrato-hidroxilo , carbohidrato-carbohidrato e hidroxilo-hidroxilo . En algunas modalidades, se emplea un reactivo reticulante bifuncional para lograr la conjugación covalente entre los grupos conjugables adecuados del agente ARNi y un copolímero de bloque. En algunas modalidades, la conjugación también se lleva a cabo con enlaces y ligantes sensibles al pH, que incluyen, "entre otros, enlaces hidrazona y acetal. En ciertas modalidades, una molécula de ARNi (por ejemplo, un ribooligonucleótido) se une por covalencia a un grupo funcional de ácido borónico (por ejemplo, un residuo de ácido fenilborónico) incorporado en el extremo alfa u omega del polímero a través de la formación de un éster del ácido borónico con el hidroxilo 2 ' y 31 del residuo de ribosa terminal del agente AR i. Como opción, también se puede usar cualquier otro método de conjugación que sea adecuado, por ejemplo, se dispone de una gran variedad de técnicas químicas de conjugación (véase, por ejemplo, Bioconjugation, Aslam y Dent, Eds . acmillan, 1988 y los capítulos que contiene) .
En ciertas modalidades, un bioconjugado polimérico de un polinucleótido (por ejemplo, ARNsi, 6459.5 oligonucleótido) con un copolímero de bloque descrito aquí (por ejemplo, el grupo conjugable terminal alfa u omega del polímero) , se prepara, según un proceso que comprende las dos etapas siguientes: (1) activación de un grupo terminal modificable (por ejemplo, grupo 5'- ó 3'- hidroxilo o amino) de un oligonucleótido, mediante el uso de cualquier reactivo de activación adecuado, entre los que se incluyen, l-etil-3 , 3 -dimetilaminopropil carbodiimida (EDAC) , imidazol, N-hidroxisuccinimida (NHS) y diciclohexilcarbodiimida (DCC) , HOBt (1-hidroxibenzotriazol) , p-nitrofenilcloroformato , carbonildiimidazol (CDI) y N, ' -disuccinimidil carbonato (DSC); y (2) unión covalente del polímero (por ejemplo, el extremo alfa u omega del polímero) al extremo del oligonucleótido. En algunas modalidades, el grupo modificable terminal 51 - ó 31 - de un oligonucleótido se sustituye con otros grupos funcionales antes de la conjugación con el polímero. Por ejemplo, el grupo hidroxilo (--OH), opcionalmente , se sustituye con un grupo que tenga un ligante sulfhidrilo (--SH), carboxilo (--COOH) o amino ( - -NH2) .
Incluso en otra modalidad, un oligonucleótido que comprende un grupo funcional introducido en una o más de las bases (por ejemplo, 5-aminoalquilpirimidina) se conjuga con un copolímero, que constituye la micela descrita aquí, 6459.5 mediante el uso de un agente de activación o un ligante bifuncional reactivo, según cualquiera de los procedimientos adecuados. Comercialmente, existe un variedad de estos agentes activantes y ligantes bifuncionales y se pueden adquirir de Sigma, Pierce, Invitrogen y otros .
En algunas modalidades específicas, un copolímero de bloque se prepara por polimerización RAFT utilizando un agente de transferencia de cadena que contiene un grupo conjugable enmascarado. En un caso específico, se usa un CTA que tenga piridil disulfuro, para sintetizar el polímero. La conjugación terminal por covalencia de un agente ARNi se logra tratando con el polímero un agente AR i que contenga un tiol. En algunos casos, para lograr la conjugación, la cantidad del agente ARNi que contiene tiol se usa en exceso con relación a la concentración del polímero .
En ciertas modalidades, las núcelas descritas aquí facilitan el suministro intracelular de un agente bioactivo (por ejemplo, un anticuerpo, ARNsi o lo similar) . En ciertas modalidades, las micelas descritas, ¡ aquí facilitan el suministro intracelular de ARNsi que está fijo por conjugación directa polímero-ARN . En ciertas modalidades, una micela que incrementa el suministro intracelular de ARNsi comprende un primer bloque que G459.5 aumenta la solubilidad en agua (por ejemplo, un primer bloque que contiene monómeros hidrofílieos) y/o propiedades farmacocinéticas y un segundo bloque que es sensible al pH.
Entidades dirigidas o dirigibles En ciertos casos, la eficiencia de la captación celular de las micelas se incrementa por la incorporación de entidades dirigidas (targefcingr entities) en la micela. Un "ligando dirigido o dirigible" (término utilizado de manera indistinta con "entidad dirigida o dirigible") se une a la superficie de una célula (por ejemplo, de una célula seleccionada) . En algunas modalidades, las entidades dirigidas reconocen un antígeno de superficie celular específico o se unen a un receptor en la superficie de la célula diana. Los ligandos dirigidos adecuados incluyen, entre otros, anticuerpos, moléculas tipo anticuerpos o péptidos, como los péptidos que se unen a integrina, por ejemplo, péptidos que contienen RGD o moléculas pequeñas como vitaminas, por ejemplo, folato, azúcares como lactosa y galactosa u otras moléculas pequeñas. Los antígenos de superficie celular incluyen una molécula de superficie celular como una proteína, un azúcar, lípido u otro antígeno en la superficie celular. En modalidades específicas, el antígeno de superficie celular es objeto de internalización . Ejemplos de antígenos de superficie 6459.5 objetivados por las entidades dirigidas de las micelas descritas aquí incluyen, entre otros, el receptor de transferrina tipo 1 y 2, el receptor de EGF, HER2/Neu, receptores VEGF, integrinas, NGF, CD2 , CD3 , CD4 , CD8 , CD19, CD20, CD22, CD33, CD43, CD38, CD56, CD69 y el receptor de asialoglucoproteína. Un ligando dirigido también comprende una molécula de afinidad artificial, por ejemplo, un peptidomimético o un aptámero.
Los ligandos dirigidos están unidos, en varias modalidades, ya sea a un extremo de un polímero de la micela (por ejemplo, copolímero de bloque) o a una cadena lateral o a un grupo colgante de una unidad monomérica o bien está incorporado en un polímero. En ciertas modalidades, un monómero que comprende un residuo de agente dirigido (por ejemplo, un monómero vinílico polimerizable que comprenda un agente dirigido) se copolimeriza para formar el copolímero de bloque que forma una micela descrita aquí. En ciertas modalidades, uno o más ligandos dirigidos se acoplan con el copolímero de bloque dé una micela descrita aquí a través de una entidad ligante. En algunas modalidades, la entidad ligante que acopla el ligando dirigido con el copolímero de bloque, es una entidad ligante escindible (por ejemplo, contiene un enlace i escindible) . En algunas modalidades, la entidad ligante es escindible y/o comprende un enlace que es escindible en G459.5 condiciones endosómicas . En algunas modalidades, la entidad ligante es escindible y/o contiene un enlace que es escindible por una enzima específica (por ejemplo; una fosfatasa o una proteasa) . En algunas modalidades!, la entidad ligante es escindible y/o contiene un enlace que es escindible frente al cambio en un parámetro intracejlular (por ejemplo, pH, potencial redox) . j En algunas modalidades, el agente dirigido es un agente dirigido proteico (por ejemplo, un péptido, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo) . La fijación de la entidad dirigida al polímero se logra de cualquier manera que sea adecuada, por ejemplo, por cualquiera de v;arios enfoques de reacciones químicas de conjugación, ! que incluyen, entre otras, ligantes amino-carboxilo, amino-sulfhidrilo, amino-carbohidrato, amino-hidroxilo, amino-amino, carboxilo-sulfhidrilo, carboxilo-carbohidrato, carboxilo-hidroxilo, carboxilo-carboxilo, sulfhidrilo-carbohidrato, sulfhidrilo-hidroxilo, sulfhidrilo-sulfhidrilo, carbohidrato-hidroxilo, carbohidrato- j carbohidrato e hidroxilo-hidroxilo . En modalidades específicas, se usan técnicas químicas como química "click" para unir el ligando dirigido con los copolímeros de bloque de las micelas descritas aquí (por ejemplo, reacciones "click", véase Wu, P . ; Fokin, V. V. Catalytic Azide-Alkyne Cycloaddition: Reactivity and Applications. Aldrichi .
I Acta, 2007, 40, 7-17). Opcionalmente , se puede utilizar una amplia, variedad de técnicas químicas de conjugación (véase, por ejemplo, Bioconjugation, Aslam y Dent, Eds . Macmillan, 1998 y los capítulos que contiene) . En algunas modalidades, los ligandos dirigidos se unen a un monómero y el compuesto resultante se usa entonces en la síntesis de polimerización de un polímero (por ejemplo, copolímero) que se utiliza en la micela descrita aquí. En algunas modalidades, el ligando dirigido se une a una hebra codificante o a una hebra antisentido de un ARNsi unido a un polímero de la mi'cela. En ciertas modalidades, el agente dirigido se une a un extremo 5 ' o 31 de la hebra codificante o de la hebra antisentido.
En modalidades específicas, las micelas descritas aquí son biocompatibles . En el sentido que se utiliza en la presente, "biocompatible" se refiere a la propiedad de un compuesto (por ejemplo, una micela asociada con un polinucleótido) caracterizada porque éste o sus productos de degradación in vivo no perjudican al tejido vivo o lo hacen en forma mínima y/o reparable; y/o no causan una reacción inmunológica en el tejido vivo o lo hacen en forma mínima o controlable. Con respecto a las sales, se prefiere que cualquier contraión (por ejemplo, especies catiónicas o aniónicas) , sean biocompatibles. En el sentido que se utiliza en la presente, el término "fisiológicamente 6459.5 aceptable" se usa indistintamente con el término "biocompatible" . En algunos casos, las micelas y/o polímeros utilizados en la presente (por ejemplo, copolímeros) exhiben baja toxicidad en comparación con los lípidos catiónicos.
Captación celular En algunas modalidades, las micelas que comprenden agentes ARNi (por ejemplo, oligonucleótidos o ARNsi) se suministran a la célula por endocitosis . Los términos "vesículas intracelulares" y "endosomas" se usan indistintamente en esta especificación. El suministro exitoso de agentes ARNi (por ejemplo, oligonucleótido o ARNsi) al citoplasma, por lo general, tiene un mecanismo de escape endosómico. En ciertos casos, las micelas que comprenden agentes ARNi (por ejemplo, oligonucleótido o ARNsi) descritas aquí, son sensibles al bajo pH del compartimiento endosómico en la endocitosis. En ciertos casos, la endocitosis desencadena la protonación o neutralización de carga de unidades monoméricas susceptibles de adquirir carga o especies susceptibles de adquirir carga que se convierten en unidades o especies aniónicas (por ejemplo, unidades de ácido propil acrílico) del polímero y/o las micelas descritas aquí, dando lugar a una transición conformacional en el polímero. En ciertos j S459.5 casos, esta transición conformacional da como resultado una forma más desestabilizante de la membrana hidrofóbica que participa en la liberación del agente terapéutico (por ejemplo, oligonucleótido o ARNsi) de los endosomas al citoplasma. En aquellas micelas que comprenden ARNsi, el suministro de ARNsi al citoplasma permite que se genere el efecto de silenciamiento génico (knockdown) del ARNm. En aquellos conjugados poliméricos que comprenden otros tipos de agentes ARNi, el suministro al citoplasma permite que se presente la acción deseada.
Por otra parte, en ciertas modalidades, las micelas descritas aquí, de manera selectiva captan i moléculas hidrofóbicas pequeñas, como los compuestos hidrofóbicos de molécula pequeña (por ejemplo, medicamentos de molécula pequeña hidrofóbica) hacia el centro hidrofóbico de las micelas. En modalidades específicas, las micelas descritas aquí, de manera selectiva captan moléculas hidrofóbicas pequeñas, como el compuesto hidrofóbico de molécula pequeña, pireno, hacia el centro hidrofóbico de las micelas.
Ejemplos En toda la descripción de la presente invención se usan varios acrónimos y abreviaturas para describir monómeros y residuos monoméricos derivados de la 6459.5 polimerización de dichos monómeros . Sin limitación y a menos que se indique de otro modo: "BMA" (o la letra "B" como designación simplificada equivalente) representa metacrilato de butilo o residuo monomérico derivado del mismo; "DMAEMA" (o la letra "D" como designación simplificada equivalente) representa metacrilato de N,N-dimetilaminoetilo o residuo monomérico derivado del mismo; "Gal" se refiere a galactosa o a un residuo galactosa/ que opcionalmente incluye entidades con hidroxilo protegido (por ejemplo, acetilo) o un derivado PEGilado del mismo (como se describe más adelante) ; "HPMA" representa metacrilato de 2-hidroxipropilo o residuo monomérico derivado del mismo; "MAA" representa ácido metacrílico o residuo monomérico derivado del mismo; "MAA (ÑHS) " representa éster N-hidroxil-succinimida de ácido metacrílico o residuo monomérico derivado del mismo; "PAA" (o la letra "P" como designación simplificada equivalente) representa ácido 2-propilacrílico o residuo monomérico derivado del mismo; "PEGMA" se refiere al monómero . i metacrílico PEGilado, CH30 (CH20) 7-8OC (O) C (CH3) CH2 o residuo monomérico derivado del mismo. En cada caso, cualquiera de estas designaciones se refiere al monómero (incluidas todas las sales o sus análogos iónicos) o un residuo monomérico derivado de la polimerización del monómero (incluidas todas las sales o sus análogos iónicos) y la forma específica 6459.5 indicada evidente por el contexto para un experto en la técnica.
Ejemplo 1: Preparación de polímeros y copolímero dibloque Los polímeros y copolímeros dibloque dé la siguiente fórmula general, se preparan como se indica: [Alx-/-A2y]n - [Blx-/-B2y-/-B3z]1.5n En donde [A1-A2] es el primer copolímero de bloque formado por residuos de los monómeros A1 y A2, [Bl-B2-B3] es el segundo copolímero de bloque, formado por residuos de los monómeros Bl, B2, B3. x, y, z es la composición del polímero en % de moles de residuo monomérico n es peso molecular Copolímeros dibloque ej emplificativos : [DMAEMA] - [B-/-P-/-D] [PEGMAj - [B-/-P-/-D] [PEGMA„-DMAEMA] - [B-/-P-/-D] [PEGMA„- / -MAA (NHS ) ] - [B-/-P-/-D] [DMAEMA-/ -MAA (NHS) ]- [B-/-P-/-D] [HPMA-/-PDSM] - [B-/-P-/-D] en donde : B es metacrilato de butilo P es ácido propilacrílico D es DMAEMA, metacrilato de dimetilaminoetilo 6459.5 PEGMA es metacrilato de polietilenglicol en donde, por ejemplo, w = 4-5 o 7-8 unidades de óxido de etileno) MAA(NHS) es N-hidroxisuccinamida de ácido metacrílico HPMA es N- (2 -hidroxipropil) metacrilamida PDSM es metacrilato de piridil disulfuro Estos polímeros representan estructuras en donde la composición del primer bloque del polímero o copolímero está modificada o tratada químicamente con el fin de formar polímeros en los que el primer bloque es neutro (por ejemplo, PEGMA), catiónico (DMAEMA) , aniónico (PEGMA-NHS, en donde NHS se hidroliza a ácido) , anfolítico (DMAEMA NHS , en donde NHS se hidroliza a ácido) o zwiteriónico (por ejemplo, poli [2-metacriloiloxi-21 -trimetilamonioetil fosfato] ) . Por otra parte, el polímero [PEGMA- PDSM] - [B-P-D] contiene un grupo funcional piridil disulfuro en el primer bloque que puede reaccionar con un ARNsi con función tiol y formar un conjugado de polímero-ARNsi .
Ejemplo 1.1: Procedimientos de síntesis generales para la preparación de copolímeros de bloque por RAFT A. Agente de transferencia de cadena RAFT La síntesis del agente de transferencia de cadena (CTA o chain transfer agent) , 4-ciano-4- 6459.5 (etilsulfaniltiocarbonil) sulfanil pentanoico (ECT) , utilizado en las siguientes polimerizaciones RAFT, se adaptó a partir de un procedimiento de Moad et al., Polymer, 2005, 46 (19) : 8458-68. Brevemente, se adicionó etanotiol (4.72 g, 76 mmoles) durante 10 minutos a una suspensión en agitación de hidruro de sodio (60% en aceite) (3.15 g, 79 mmoles) en éter dietílico (150 mi) a 0°C. La solución se dejó en agitación durante 10 minutos antés de adicionar disulfuro de carbono (6.0 g, 79 mmoles) . El S-etil tritiocarbonato crudo (7.85 g, 0.049 moles) se recuperó por filtración, se suspendió en éter dietílico (100 mL) y se hizo reaccionar con yodo (6.3 g, 0.025 moles) . Después de 1 hora, la solución se filtró, se ¡ lavó con tiosulfato de sodio acuoso y se secó en sulfato de sodio. El disulfuro de bis- (etilsulfaniltiocarbonilo) crudo se aisló por evaporación rotativa. Una solución de disulfuro de bis- (etilsulfaniltiocarbonilo) (1.37 g, 0.005 moles) y ácido 4 , 4 ' -azobis (4-cianopentanoico) (2.10 g, i 0.0075 moles) en acetato de etilo (50 mL) se calentó a reflujo durante 18 horas. Después de la evaporación del disolvente en rotavapor, se aisló el ácido 4-ciano-4- (etilsulfaniltiocarbonilo) sulfanil pentanoico (ETC) crudo, por cromatografía en columna utilizando como fase estacionaria gel de sílice y como eluyente acetato de etilo - hexano, 50:50. 6459.5 B. Agente de transferencia de cadena macro poli (metacrilato de N, N-dimetilaminoetilo) (poli-DMAEMA macro CTA) La polimerización RAFT de DMAEMA se hizo en DMF (dimetilformamida) a 30°C y en atmósfera de nitrógeno, durante 18 horas utilizando ECT y 2 , 2 ' -azobis (4 -metoxi-2 , 4 -dimetilvaleronitrilo) (V-70) (Wako Chemicals) como iniciador de radicales. La relación entre monómero inicial ¦ i y CTA ( [CTA] 0/ [M] 0 fue tal que la Mn teórica a una conversión de 100% fue 10,000 g/mol) . La relación entre CTA inicial e iniciador ( [CTA] 0/ [I] Q) fue 10 a 1. El agente de transferencia de cadena macro poli-DMAEMA resultante, se aisló por precipitación en éter dietílico/pentano 50:50 v:v. El polímero resultante se redisolvió en acetona y después se precipitó en pentano (x3) y se seco a yació durante la noche .
C. Copolimerización en bloque de DMAEMA, PAA y BMA a partir de poli (DMAEMA) macro CTA 1 Las cantidades estequiométricas deseadas de DMAEMA, PAA y BMA se adicionaron al poli (DMAEMA) macró CTA disuelto en N, -dimetilformamida (25% en peso de monómero y macroCTA con relación al disolvente) . En todas las polimerizaciones [M]0/[CTA]0 y [CTA]0/[I]0 fueron 250:1 y 10:1, respectivamente. Después de la adición de V70, las 6459.5 soluciones se purgaron con nitrógeno durante 30 minutos y se dejaron reaccionar a 30°C durante 18 horas. Los copolímeros dibloque resultantes se aislaron por precipitación en una mezcla de éter dietilico/pentano 50:50 v/v. Los polímeros precipitados se redisolvieron en acetona y después se precipitaron en pentano (x3) y se secaron a vacío durante la noche. Se utilizó cromatografía de permeación en gel (GPC o gel permeation chromatography) para determinar los pesos moleculares y los índices de polidispersidad (PDI o polydispersity índex) (PDI, Mw/Mn) de las muestras de poli(DMAEMA) macroCTA y de copolímero dibloque en DMF con respecto a los estándares de polimetacrilato de metilo (columnas SEC Tosoh TSK-GEL R-3000 y R-4000 (Tosoh Bioscience, Montgomeryville , PA) conectadas en serie a un equipo Viscotek GPCmax VE2Ó01 y refractómetro VE3580 (Viscotek, Houston, TX) . Como fase móvil se utilizó DMF grado HPLC que contenía 1.0% en peso de LiBr. La Figura 1 resume los pesos moleculares y composiciones de algunos de los polímeros sintetizados por medio de RAFT.
I Ejemplo 1.2. Preparación del segundo bloque (B1-B2-B3) por copolimerización de DMAEMA, PAA y BMA a partir de poli (PEGMA) macroCTA Las cantidades estequiométricas deseadas' de 6459.5 DMAEMA, PAA y BMA se adicionaron al poli (PEGMA) macro CTA disuelto en N, N-dimetilformamida (25% en peso de monómero y macroCTA con relación al disolvente) . En todas las polimerizaciones [M] 0/ [CTA] 0 y [CTA]0/[I]0 fueron 250 :1 y 10:1, respectivamente. Después de la adición de AIBN, las soluciones se purgaron con nitrógeno durante 30 minuáos y se dejaron reaccionar a 68°C durante 6 a 12 horas (Figura 2) . Los copolímeros dibloque resultantes se aislaron por precipitación en una mezcla de éter dietílico/pentano 50:50 v/v. Los polímeros precipitados se redisolvieron en acetona y después se precipitaron en pentano (x3) y se secaron a vacío durante la noche. Se utilizó cromatografía de permeación en gel (GPC o gel permeation chromatography) para determinar los pesos moleculares y i las polidispersidades (PDI, Mw/Mn) de las muestras de poli (PEGMA) macroCTA y de copolímero dibloque en DMF utilizando un equipo Viscotek GPCmax VE2001 y refractómetro VE3580 (Viscotek, Houston, TX) . Como fase móvil se utilizó DMF grado HPLC que contenía 1.0% en peso de LiBr. Por medio de espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) en . I CDCI3 se confirmó la estructura polimérica y se calculó la composición del segundo bloque. La Figura 2 resume la síntesis del polímero [PEGMAJ - [B-/-P-/-D] en donde w = 7.8. Las Figuras 3A, 3B y 3C resumen la caracterización del polímero [PEGMAJ - [B-/-P-/-D] en donde w = 7-8.
G459.5 Ejemplo 1.3. Preparación y caracterización de copolímeros PEGMA-DMAEMA La síntesis de los polímeros se llevó a cabo mediante un procedimiento similar al descrito enj los Ejemplos 1.1 y 1.2. La relación entre PEGM y DMAEMA en el primer bloque se modificó utilizando diferentes proporciones de alimentación de monómeros individuales para obtener los copolímeros descritos en la Figura 4.
Ejemplo 1.4. Preparación y caracterización de copolímeros PEGMA-MAA (NHS) La síntesis de los polímeros se llevó a cabo tal como se describe en los Ejemplos 1.1 y 1.2 (y se resume en la Figura 5) , utilizado relaciones de alimentación de monómero adecuadas para obtener la composición deseada del copolímero del primer loque. Las Figuras 6A, 6B y 6C resumen la síntesis y caracterización del polímero [PEGMA„-MAA(NHS) ] - [B-P-D] en donde la relación de monómeros del copolímero en el primer bloque es 75:25. Los polímeros que contienen NHS se pueden incubar en amortiguador acuoso (fosfato o bicarbonato) a un pH entre 7.4 y 8.5 durante 1 a 4 horas y a temperatura ambiente o 37°C para obtener la forma hidrolizada (acida) . 6459.5 Ejemplo 1.5 Preparación y caracterización de copolímeros DMAEMA-MAA (NHS) ¦ La síntesis del polímero se realizó como se describe en los Ejemplos 1.1 y 1.2 utilizando proporciones de monómeros adecuadas para obtener la composición deseada en el copolímero del primer bloque. Las Figuras 7A, 7B y 7C resumen la síntesis y caracterización del polímero [DMAEMA-MAA(NHS) ] - [B-P-D] en donde la relación de monómeros del copolímero en el primer bloque es 70:30. Los polímeros que contienen NHS se pueden incubar en amortiguador acuoso (fosfato o bicarbonato) a un pH entre 7.4 y 8.5 durante 1 a 4 horas y a temperatura ambiente o 37 °C para obtener la forma hidrolizada ( cida) .
Ejemplo 2. Preparación y caracterización de conjugados copolímero HPMA-PDS (AKN) para suministro de medicamentos A Nsi A. Síntesis de monómero metacrilato de piridil disulfuro (PDSMA) El esquema de síntesis para PDSMA se resume én la Figura 8. Aldrithiol-2™ (5 g, 22.59 mmoles) se disolvió en 40 mi de metanol y 1.8 mi de AcOH. La solución se adicionó como una solución de 2 -aminoetanotiol . HC1 (1.28 g, 11.30 mmoles) en 20 mi de metanol durante más de 30 minutos. La reacción se mantuvo en agitación en atmósfera de N2 durante 6459.5 48 horas a temperatura ambiente. Después de la evaporación de los disolventes, el aceite residual se lavó dos veces con 40 mi de éter dietílico. El compuesto crudo se disolvió en 10 mi de metanol y el producto se precipitó dos veces con 50 mi de éter dietílico y se obtuvo el compuesto 1 deseado como un sólido ligeramente amarillo. Rendimiento: 95% .
Se disolvieron piridina ditioetilamina (1, 6.7 g, 30.07 mmoles) y trietilamina (4.23 mi, 30.37 mmoles) en DMF (25 mi) y piridina (25 mi) y lentamente se adicionó cloruro de metacriloilo (3.33 mi, 33.08 mmoles) por medio de una jeringa a 0°C. La mezcla de reacción se mantuvo en agitación durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de la reacción, la reacción se interrumpió mediante NaHC03 saturado (350 mi) y se extrajo con acetato de etilo (350 mi) . La fase orgánica combinada se lavó después con HCl 10% (100 mi, 1 vez) y agua pura (100 mi, 2 veces) y se secó en MaS04. El producto puro se purificó por cromatografía en columna (EA/Hex: 1/10 a 2/1) y se obtuvo como jarabe de color amarillo. Rf = 0.28 (EA/Hex : 1/1). Rendimiento: 55%.
B . Síntesis de copolímeros HPMA-PDSMA La polimerización RAFT de N- (2-hidroxipropil) metacrilamida (HPMA) y metacrilato de piridil disulfuro (normalmente en una relación monomérica de 70:30) 6459.5 se llevó a cabo en DMF (50 por ciento en pesó de raonómero : disolvente) a 68 °C y en atmósfera de nitrógeno durante 8 horas utilizando 2 , 2 ' azo-bis-isobutironitrilo (AIBN) como iniciador de radicales libres (Figura 9) . La relación molar entre CTA y AIBN es de 10 a 1 y la relación molar entre CTA y monómero se fija de tal manera que se logre un peso molecular de 25,000 g/mol si hay 100% de i conversión. El poli (HPMA-PDS) macro-CTA se aisló por precipitación repetida en éter dietílico a partir de metanol .
El macro-CTA se secó a vacío durante 24 horas y luego se usó para la copolimerización en bloque del metacrilato de dimetilaminoetilo (DMAEMA) , ácido propilacrílico (PAA) y metacrilato de butilo (BMA). Se adicionaron cantidades equimoleculares de DMAEMA, PAA y BMA ([M]0/[CTA] 0 = 250) al HPMA-PDS macroCTA disuelto en N,N-dimetilformamida (25% en peso de monómero y macroCTA con relación al disolvente) . El iniciador de radicales AIBN se adicionó con un CTA en una relación respecto al iniciador de 10 a 1. La polimerización se dejó avanzar en atmósfera de nitrógeno durante 8 horas a 68 °C. Después, el polímero dibloque resultante se aisló por precipitación realizada 4 veces en una mezcla de éter dietílico/pentano 50:50, redisolviendo en etanol entre precipitaciones. Luego, el producto se lavó una vez con éter dietílico y se secó a 6459.5 vacío durante la noche.
C . Conjugación de AR si con el copolímero HPMA- PDSMA El derivado tiol de ARNsi se adquirió comercialícente (Agilent, Boulder, CO) como ARN bicatenario con una hebra 5 ' -codificante modificada con disulfuro. La forma tiol libre que se usará en la conjugación, se prepara disolviendo en agua el compuesto liofilizado y se trata durante 1 hora con el agente reductor de disulfuro 1 TCEP (tris (2-carboxietil) fosfina) inmovilizado en gel de agarosa. El ARN reducido (400 µ?) se hace reaccionar durante 24 horas con el polímero funcionalizado con piridil disulfuro, en un amortiguador de fosfato (pH 7) ¡ que contiene 5 mM de ácido etilendiamino tetraacético (EDTA) (Figura 8) .
La reacción del polímero piridil disulfuro con el ARN tiol da lugar a la 2-piridintiona que se puede medir por espectrofotometría para caracterizar la eficiencia de conjugación. Para validar después el intercambio de disulfuro, los conjugados se corren en gel SDS-PAGE (gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio) 16.5% tricina. En paralelo, se tratan alícuotas de las reacciones de conjugación con TCEP inmovilizado, antes de someterlas a 6459.5 SDS-PAGE para verificar la liberación del ARN del polímero en un ambiente reductor. Las reacciones de conjugación se hicieron con una estequiometría de polímero/ARN de 1, 2 y 5. Se utilizaron mediciones de absorbancia por espectrofotometría UV a 343 nm de la liberación de 2-piridintiona para medir la eficiencia de conjugación., Ejemplo 3: Síntesis de polímeros con agentes dirigidos a la célula: reacción click de polímero de terminal azida, con folato de propargilo Se usa una combinación de polimerización1 por radicales controlada y química click azida-alquino , para preparar micelas de copolímero de bloque conjugados con ligandos biológicos (por ejemplo, folato) con potencial de objetivación activa para tejidos/células específicos que contienen el receptor específico de interés (por ejemplo, folato) . Los copolímeros de bloque se sintetizan por polimerización de transferencia por adición fragmentación reversible (RAFT) , tal como se describe en el Ejemplo 1, con la excepción de que se usa un agente de transferencia (CTA) azida. La terminal azida del polímero se hace reaccionar con el derivado alquino del agente dirigido (por ejemplo, folato) para producir el polímero que contiene el agente dirigido. 6459.5 Síntesis del agente RAFT El agente de transferencia de cadena (CTA) ácido 2 -dodecilsulfaniltiocarbonilsulfañil-2 -metil-propiónico 3 - I azido propil éster (C12-CTAN3) se prepara de la forma siguiente: Síntesis de 3 -azidopropanol . Se hacen reaccionar 3 -cloro-1-propanol (5.0 g, 53 mmoles, 1.0 equivalentes) y azida de sodio (8.59 g, 132 mmoles, 2.5 equivalentes) en DMF (26.5 mL) a 100°C durante 48 horas. La mezcla de reacción se enfría a temperatura ambiente, se vierte en éster etílico (200 mL) y se extrae con una solución saturada de NaCl (500 mL) . La fase orgánica se separa, se seca en MgS04 y se filtra. El sobrenadante se concentra para obtener el producto (5.1 g, 95% de rendimiento).
Síntesis de cloruro del ácido 2- ¦ j dodecilsulfaniltiocarbonilsulfanil-2 -metil-propiónico (DMP-Cl) . Se disuelve ácido 2-dodecilsulfaniltiocarbonilsulfanilo-2 -metilpropiónico ÍDMP, Noveon > 95%) (1.0 g, 2.7 mmoles, 1.0 equivalentes) en cloruro de metileno (15 mL) en un matraz de fondo redondo de 50 mL y la solución se enfría aproximadamente á 0°C. Lentamente, se adiciona cloruro de oxalilo (0.417 g, 3.3 I mmoles, 1.2 equivalentes) en atmósfera de nitrógeno y la solución se deja alcanzar la temperatura ambiente y se mantiene en agitación durante 3 horas en total. La solución 6459.5 resultante se concentra a presión reducida y se obtiene como producto el cloruro del ácido (1.0 g, 99% de rendimiento) .
Síntesis de ácido 2-dodecilsulfaniltiocarbonilsulfanil-2-metil-propiónico, 3-azidopropil éster. Se disolvió 3 -azidopropanol (265 mg, 2.62 inmoles, 1.0 equivalentes) en cloruro de metileno (5 mL) en un matraz de fondo redondo de 50 mL y la solución se enfrió aproximadamente a 0°C. Gota a gota, durante 10 minutos, se adicionó una solución de trietilamina (0.73 mL) en cloruro de metileno (5 mL) . Gota a gota se adicionó una solución de DMP-C1 (1.0 g, 2.6 mmoles) en cloruró de metileno (5 mL) y la solución se dejó alcanzar la temperatura ambiente mientras se mantenía en agitación durante 3 horas. La solución se concentró a presión reducida, se diluyó con éter etílico (100 mL) y se lavó con solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio (50 mL) , agua (50 mL) y solución saturada de NaCl (50 mL) , sucesivamente. La fase orgánica se separó, se secó en MgS04 (1.0 g) y se filtró. El sobrenadante se concentró a presión reducida y se obtuvo el producto (1.05 g, 90% de rendimiento) como aceite residual.
Síntesis de folato de propargilo Se disuelve ácido fólico (1.0 g, 0.0022 mmoles) 6459.5 en DMF (10 mL) y se enfría en un baño de agua con hielo. Se adicionan N-hidroxisuccinimida (260 mg, 0.0025 mmoles) y EDC (440 mg, 0.0025 mmoles) y la mezcla resultante se mantiene en agitación en un baño de hielo durante 30 minutos, después de los cuales se obtiene un precipitado blanco. Se adiciona una solución de propargilamina (124 mg, 2.25 mmoles) en DMF (5.0 mL) y la mezcla resultante se deja calentar a temperatura ambiente y en agitación durante 24 horas. La mezcla de reacción se vierte en agua (100 mL) y se agita durante 30 minutos para formar un precipitado. El precipitado de color amarillo naranja, se filtra, se lava con acetona y se seca a vacío durante 6 horas para obtener 1.01 g de producto (93% de rendimiento).
I Reacción click de polímeros de terminal azido con folato de propargilo .
El polímero de terminal azida se hace reaccionar con folato de propargilo mediante el siguiente procedimiento ej emplificativo . Una solución de N3-a'-[Ds-Xt]b- [Bx-Py-Dz] 9-? (0.0800 mmoles) en DMF (7 mL) y pentametildietilentriamina (PMDETA, Aldrich, 99%), (8.7 mg, 0.050 mmoles) se purga con nitrógeno durante 60 minutos y se transfiere mediante jeringa a un vial, acondicionado con una barra magnética, que contiene CuBr (7.2 mg, Ó.050 mmoles) y folato de propargilo (42 mg, 0.088 mmoles) en 6459.5 atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se agita a 26 °C durante 22 horas en ausencia de oxígeno. La mezcla de reacción se expone al aire y la solución se hace pasar a través de una columna de alúmina neutra. El DMF se elimina a vacío y el producto se precipita en hexanos . El copolímero de bloque con folato terminal, folato-oc- [Ds-Xt] b-[Bx-Py-Dz] a-co, se disolvió en THF y se filtró para eliminar el exceso de folato de propargilo. El THF se eliminó y luego el polímero se disolvió en agua desionizada (DI) y se dializó durante 6 horas con una membrana de peso moleiular límite de 1000 Da. El polímero se aisló por liof ilización.
Ejemplo 4: Espectroscopia RMN del copolímero de bloque PRx0729v6 (Figura 10) Este ejemplo aporta evidencia, por medio de espectroscopia RMN, de que el polímero PRx0729v6 en solución acuosa forma una estructura tipo micela.
El espectro XH RMN se obtuvo en un equipo Bruker AV301, en cloroformo deuterado (CDC13) y agua deuterada (D20) a 25°C. Se usó bloqueo de deuterio (CDC13, D20) y los desplazamientos químicos se determinaron en ppm a partir del tetrametilsilano (para CDC13) y ácido 3-( trimetilsilil) -propiónico-2 , 2 , 3 , 3 -d , sal sódica (para D20) . La concentración del polímero fue 6 mg/ml.
La espectroscopia RMN del polímero sintetizado, 6459.5 con polímero PRx0729v6 como un ejemplo, en amortiguador acuoso aportó evidencia de que los polímeros dibloque de la presente invención forman micelas en solución acuosa. La formación de micelas da lugar a la formación de un núcleo o centro interno viscoso protegido que restringe el desplazamiento de los protones que forman los segmentos centrales e impide el intercambio de deuterio entre el disolvente y los protones de la parte central. Esto se refleja en una significativa supresión o desaparición de las señales 1H RMN de los protones correspondientes. Utilizamos esta propiedad inherente de la espectroscopia RMN en solución para demostrar que el bloque hidrofóbico del centro de la micela está protegido de manera eficaz. Si las micelas se forman en medio acuoso, las señales podrían desaparecer debido al bloque de copolímero hidrofóbico.
La Figura 10 muestra los experimentos de H RMN del polímero PRx0729v6 en CDC13 (disolvente orgánico) y D20 (disolvente acuoso) . El espectro RMN del polímero en CDC13 a temperatura ambiente (Figura 10A) muestra las señales atribuidas a todos los protones del polímero que indican que las cadenas poliméricas permanecen dispersas (sin agregarse) en CDC13 y conservan su movilidad de tal manera que los protones se pueden intercambiar con el disolvente. Esto indica que las micelas estables con centros protegidos no se forman a partir de PRx0729v6 en 6459.5 disolvente orgánico. La Figura 10B muestra el espectro XH RMN de PRx0729v6 en D20. La señales que representan los protones del bloque hidrofílico (BMA, PAA, DMAEMA) desaparecen del espectro. Esto indica que se forman micelas estables con centros protegidos a partir de PRx0729v6 en solución acuosa. Por otra parte, en el mismo espectro, la señal atribuida a la resonancia de los protones de los dos grupos metilo del DMAEMA (2.28 ppm) se suprime de manera significativa, lo que implica que sólo el primer bloque poli DMAEMA que constituye la envoltura, se expone al agua, es decir, principalmente el grupo de DMAEMA con carga. Un cálculo simple indica que el porcentaje integrado de PAA, DMAEMA del bloque hidrofóbico (2900) restado de la señal en CDC13 (5600) da el valor aproximado para la misma señal en D20 (2811) , congruente con esta conclusión.
Considerados en su conjunto, los resultados de . . í los experimentos de H RMN indican que el polímero PRx0729v6 forma micelas con una estructura centro-envoltura ordenada, en donde el primer bloque poli-DMAEMA forma una envoltura externa hidratada que rodea una parte central compuesta de unidades hidrofóbicas (BMA) y unidades electrostáticamente estabilizantes de carga opuesta (PAA, DMAEMA) .
Ejemplo 5: Estabilidad de partícula del polímero PRx0729v6 6459.5 en disolventes orgánicos (Figura 11) Este ejemplo demuestra que la estructura micelar del polímero PRx0729v6 se disocia en disolventes orgánicos, consistente con la naturaleza hidrofóbica del centro micelar.
El polímero PRx0729v6 se disolvió en varios disolventes orgánicos a una concentración de 1 mg/ml y se determinó el tamaño de partícula mediante dispersión luminosa dinámica. La Figura 11 muestra que aumentar la concentración de la dimetilformamida (DMF) da 'como resultado la disociación de la micela y se forman cadenas agregadas .
Ejemplo 6: Análisis por microscopía electrónica; de transmisión (TEM) del polímero PRx0729v6 (Figura 12) Mediante el uso de microscopía electrónica de transmisión este ejemplo proporciona evidencia de que el polímero PRx0729v6 forma partículas esféricas tipo micela.
Se aplicó una solución de 0.5 mg/ml del polímero PRx0729v6 en una rejilla de cobre recubierta de carbono, durante 30 minutos. La rejilla se fijó en solución de Karnovsky y se lavó una vez con amortiguador de cacodilato y luego 8 veces con agua. La rejilla se tiñó con una solución al 6% de acetato de uranilo durante 15 minutos y luego se secó hasta su análisis. La microscopía electrónica 6459.5 de transmisión (TEM) se llevó a cabo en un microscopio JEOL. La Figura 12 ilustra una micrografía electrónica típica del polímero PRx0729v6 que muestra partículas esféricas con dimensiones aproximadas similares a las determinadas en solución por dispersión luminosa dinámica.
Ejemplo 7. Efecto del pH en la estructura polimérica (Figura 13) Este ejemplo demuestra que la estructura micelar del polímero PRx0729v6.2 se disocia al disminuir el pH de 7.4 a 4.7.
El tamaño de partícula del polímero PRx0729v6.2 se determinó por dispersión luminosa dinámica a pH 7.4 y una serie de valores de pH ácido inferiores a pH 4.7 en PBS a diluciones en serie equivalentes a 5 veces de 0.5 mg/ml a 0.004 mg/ml. La Figura 13A muestra que a pH de 7.4, el polímero es estable a diluciones por debajo de 4 µg/mL en donde comienza a disociarse en una forma que produce agregados. La Figura 13B muestra que a valores crecientes de pH ácido por debajo de pH 4.7, aumenta la disociación de la estructura micelar del polímero, es decir, se presenta a concentraciones poliméricas más altas y produce niveles crecientes de monómeros de polímero con tamaño de 1-8 nra.
Ejemplo 8. Concentración micelar crítica (CMC) del polímero 6459.5 PRx0729v6 (Figura 14) El siguiente ejemplo demuestra que las micelas formadas por el polímero PRx0729v6 son estables a una dilución de 100 veces.
Tamaños de partícula del polímero PRx0729v6 en amortiguador PBS, pH 7. , a una concentración de 1 mg/ml ± NaCl 0.5 M. El tamaño de partícula se determinó por dispersión luminosa dinámica en un intervalo de 5 diluciones en serie de 1 mg/ml a 1.6 µg/mL con PBS + NaCl 0.5 M. La Figura 14 muestra que un tamaño de partícula aproximado de 45 nm es estable por debajo de una concentración de aproximadamente 10 µg/mL. Al parecer el polímero PRx0729v6 es inestable por debajo de aproximadamente 5 µg/mL (la CMC) en donde las cadenas poliméricas se disocian y forman agregados no específicos.
Ejemplo 9. Preparación de micelas poliméricas heterogéneas (mixtas) Una micela polimérica heterogénea (mixta) comprende dos o más polímeros de composición distinta. Cada uno del o los polímeros de composición distinta (por ejemplo, Polímero A y Polímero B) pueden ser copolímeros de bloque que contienen un bloque hidrofílico y un bloque hidrofóbico .
La micela heterogénea se puede formar a partir de 6459.5 un primer polímero y un segundo polímero de composición distinta del primer polímero, en un primer medio desnaturalizante para formar una mezcla heterogénea; del primer polímero y el segundo polímero. La mezcla heterogénea se expone a un segundo medio acuoso y el bloque hidrofóbico del primer polímero se deja asociar con el bloque hidrofóbico del segundo polímero en el medio acuoso y al ensamblarse forman una micela heterogénea que comprende el primer polímero y el segundo polímero.
Un polinucleótido se puede asociar (por ejemplo, por enlace iónico o covalente) con al menos uno de los polímeros, el primero o el segundo o una micela heterogénea .
Como ejemplo no limitativo, un primer polímero que constituye el copolímero de bloque #1, se prepara por polimerización RAFT, como se describe en el Ejemplo 1. Un segundo polímero que constituye el copolímero de bloque #2 se prepara de forma similar con un bloque hidrofílico diferente y el mismo bloque hidrofóbico. Por ejemplo, el bloque hidrofílico catiónico (poli-DMAEMA) del copolímero de bloque #1 se prepara de tal forma que contenga un bloque hidrofílico neutro, por ejemplo, un bloque de homopolímero que comprende unidades monoméricas que tienen oligómeros de polietilenglicol unidos por covalencia a los grupos colgantes (por ejemplo, PEGMA) . Como otro ejemplo, una 6459.5 micela polimérica heterogénea también se puede preparar con un segundo polímero alterno, que incluye un bloque hidrofílico que comprende un copolímero al azar de 50% de DMAEMA y 50% de PEGMA formado al mezclar cantidades equivalentes de los dos copolímeros en etanol 100% y después 20 diluciones en PBS, pH 7.4, o diálisis contra PBS, pH 7.4. En cada caso, se puede seguir el procedimiento general anterior para formar la micela heterogénea.
Ejemplo 10: Caracterización del complejo ARNsi/polímero Después de la verificación de la formación completa del complejo suero-ARNsi estable, por medio de retardo en gel de agarosa, los complejos ARNsi/polímero se caracterizaron respecto a su tamaño y potencial zeta utilizando un detector ZetaPALS (Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY, láser 15 mW, haz incidente = í 676 nm) . Brevemente, el polímero se formuló a 0.1 mg/ml en solución salina amortiguada con fosfato (PBS, Gibco) y los complejos se formaron por adición de polímero a GAPDH ARNsi (Ambion) a las relaciones de carga teóricas indicadas, con base en el DMAEMA con carga positiva, el cual está protonado al 50% a pH = 7.4 y en el ARNsi de carga negativa. Las funciones de correlación se recopilaron a un ángulo de dispersión de 90° y los tamaños de partícula se calcularon utilizando la viscosidad y el índice de 6459.5 refracción del agua a 25 °C. Los tamaños de partícula se expresaron como diámetros efectivos suponiendo una distribución logarítmica normal. Las movilidades electroforéticas promedio se midieron a 25°C por medio del software de análisis de potencial zeta ZetaPALS y, los potenciales zeta se calcularon con el modelo Smoluchowsky para suspensiones acuosas.
Ejemplo 11: Cultivo de células HeLa Células de carcinoma cervical humano, HeLa (ATCC CCL-2) , se mantuvieron en medio esencial mínimo (MEM) que contenía L-glutamina (Gibco) , estreptomicina-penicilina 1% (Gibco) y suero fetal de bovino 10% (FBS, Invitrogen) a 37°C y 5% de C02.
Ejemplo 12: Disgregación de membrana dependiente del pH de vehículos y complejos AR si/polímero Se utilizó hemolisis para determinar la actividad endosmolítica potencial del polímero libre y de los conjugados ARNsi/polímero a valores de pH que simulan el tráfico endosómico (pH extracelular = 7.4, endosómico anticipado pH = 6.6 y endosómico tardío pH = 5.8) . En resumen, se recolectó sangre humana completa en tubos de ensaye a vacío (vaccutainers) que contenían EDTA. La sangre se centrifugó, se extrajo el plasma y se lavó tres veces con NaCl 150 mM para aislar los eritrocitos (RBC o red j lood cells) . Los RBC se resuspendieron en amortiguador de fosfato (PB o phosphate buffer) a pH 7.4, pH 6.6 o pH 5.8. Los polímeros (10 µ9/t?1) o complejos polímero/ARNsi se incubaron con los RBC a los tres valores de pH durante 1 hora a 37°C. Luego, los RBC intactos se centrifugaron y la hemoglobina liberada en el sobrenadante se determinó por absorbancia a 541 nm como una indicación de presencia de lisis de la membrana de RBC, dependiente del pH.
Ejemplo 13: Medición de la captación de AR si mediada por el vehículo o portador .
La captación intracelular de los complejos ARNsi/polímero se midió mediante citometría de ¿lujo (analizador Becton Dickinson LSR de mesa) . Las células HeLa se sembraron a 15,000 células/cm2 y se dejaron adherir I durante la noche. El ARNsi marcado con FAM (5-carboxifluoresceína) (Ambion) se acomplejó con el polímero a una relación de carga teórica de 4:1 durante 30 minutos I a temperatura ambiente y luego se adicionó a las células HeLa sembradas hasta una concentración final de ARNsi de 25 nM. Después de la incubación con los complejos durante 4 horas, las células se tripsinizaron y resuspendieron en PBS con BSA 0.5% y azul tripano 0.01%. El azul tripano se utilizó en la misma forma descrita previamente,, para 6459.5 detener la fluorescencia extracelular y la discriminación de los complejos que hayan sido endocitados por las células. Se analizaron 10,000 células por muestra y se determinó la apertura y cierre de fluorescencia utilizando muestras que no recibieron tratamiento y de polímero sin acomplejar con ARNsi marcado con FAM. ! í Ejemplo 14: Citotoxicidad del complejo ARNsi/polímero La citotoxicidad del complejo ARNsi/polímero se determinó mediante el juego (kit) de deteccióri de citotoxicidad con lactato deshidrogenasa (LDH - lactate dehydrogenase) (Roche) . Se sembraron células HeLa en placas de 96 pocilios a una densidad de 12,000 células por pocilio y se dejaron adherir durante la noche. Los complejos se formaron por adición de polímero (soluciones madre dé 0.1 i mg/ml) a GAPDH ARNsi a una relación de carga teórica de 4:1 y para lograr una concentración de 25 nM de ARNsi/pocillo. Los complejos (relación de carga = 4:1) se adicionaron a los pocilios por triplicado. Después de que las células se habían incubado durante 24 horas con los complejojs de polímero, el medio se eliminó y las células se lavaron con PBS dos veces. Luego, las células se lisaroh I con amortiguador de lisis (100 L/pocillo, 20 mM de Tris'-HCl, pH 7.5, 150 mM de NaCl, 1 mM de Na2EDTA, 1 mM de EGTA, Tritón 1%, 2.5 mM de pirofosfato de sodio, 1 mM de ß- 6459.5 ! glicerofosfato, 1 mM de ortovanadato de sodio) durante 1 hora a 4°C. Después de mezclar, se pipetearon 20 pL del lisado de células y se diluyeron a 1:5 en PBS y lactato deshidrogenasa (LDH) se cuantificó mezclando con 100 pL de la solución de sustrato de LDH. Después de 10 a 20 minutos de incubación para la formación de color, la absorbancia se determinó a 490 nm y la referencia se fijó a 650 nm.
Ejemplo 15: Evaluación de proteína GAPDH y silenciamiento génico (knockdown) mediante los complejos ARNsi/polímero La eficacia de la serie de polímeros para el suministro de ARNsi se evaluó utilizando un ensayo de actividad de GAPDH (Ambion) . Células HeLa (12,000 células/cm2) se depositaron en placas de 96 pocilios. Después de 24 horas, los complejos (relaciones de carga = 4:1) se adicionaron a las células a una concentración final de ARNsi de 25 nM en presencia de suero al 10%. El grado de reducción de proteína GAPDH mediada por ARNsi se evaluó a las 48 horas después de la transíección . Como control positivo, se realizaron experimentos paralelos de silenciamiento génico (knockdown) utilizando HiPerFect (Qiagen) de acuerdo a las condiciones indicadas por el fabricante. La actividad GAPDH remanente se midió conforme a las indicaciones del fabricante mediante el método de incremento de la fluorescencia cinética durante más de 5 I 6459.5 minutos y se calculó según la siguiente ecuación: % de expresión remanente = A£luorescencia, GAPDH/A£luorescencia, sin tratamiento, en donde Afluorescencla = fluorescencia5 min - fluorescencia, mlrt. El procedimiento de transfección no afectó de manera significativa la expresión GAPDH cuando se usó una secuencia no dirigida de ARNsi.
Después del tamizaje inicial para identificar el vehículo o portador que produjo el silenciamiento génico de GAPDH mediado por ARNsi, más robusto, se utilizó la reacción en cadena de polimerasa por transcripción inversa en tiempo real (RT-PCR) para evaluar en forma directa el suministro de ARNsi. Después de 48 horas de incubación con los complejos obtenidos según lo anterior, las células se enjuagaron con PBS. El ARN total se aisló mediante el uso de un minijuego Qiashredder y RNeasy de Qiagen. Cualquier ADN genómico residual en las muestras se sometió a digestión (RNase-Free DNase Set, Qiagen) y el ARN se cuantificó mediante el ensayo RiboGreen (Molecular Probes) según las instrucciones del fabricante.
La transcripción inversa se llevó a cabo mediante el estuche Omniscript RT (Qiagen) . Se usó una muestra de 25 ng en total de ARN para la síntesis de ADNc y la PCR se llevó a cabo mediante el sistema ABI Sequence Detection System 7000 que utiliza un cebadorprediseñado y un estuche (kit) de sondas (Assays on Demand, Applied Biosystems) para 6459.5 GAPDH y ß-actina como gen doméstico. Las reacciones (20 L en total) se llevaron a cabo con 10 L de 2X Taqman Universal PCR astermix, 1 µ?? de cebador/sonda y 2 \iL de ADNc, hasta un volumen de 20 pL con agua libre de nucleasa (Ambion) . Se utilizaron los siguientes parámetros PCR: 95 °C durante 90 s seguidos de 45 ciclos de 95°C durante 30 s y 55°C durante 60 s. Se utilizó análisis de ciclo umbral (CT) para cuantificar la GAPDH, normalizado con respecto a ß-actina y con relación a la expresión de células HeLa no tratadas.
Ejemplo 16: Determinación por dispersión luminosa dinámica (DLS) del tamaño de partícula del polímero PRx0729v6 acomplejado con AR si (Figura 15) .
El siguiente ejemplo demuestra que el polímero PRx0729v6 forma partículas uniformes con un tamaño de 45 nm si están solas o de 47 nm después de unirse al ARNsi.
Los tamaños de partícula del polímero solo o de los complejos polímero/ARNsi se determinaron por dispersión luminosa dinámica (DLS) mediante un equipo Maívern Zetasizer Nano ZS . El polímero liofilizado se disolvió en etanol al 100% a 10-50 mg/mL, luego se diluyó 10 veces en amortiguador de fosfato, pH 7.4. Los polímeros se determinaron en solución salina amortiguada de fosfato, pH 7.4 (PBS) a 1 mg/ml para PRx0729v6 solo o a 0.7 mg/ml para 6459.5 PRx0729v6 acomplejado con 1 uM de ARNsi-21 mer específico para GAPDH (Ambion) , con una relación de carga teórica de 4:1 entre cargas positivas en el polímero y cargas negativas en ARNsi. El PRx0729v6 solo (45 nm) y el PRx0729v6 acomplejado con ARNsi (47 nm) (Figura 15) muestran tamaños de partícula similares y con una i distribución uniforme, PDI <0.1.
Ejemplo 17: Análisis del desplazamiento en gel de los complejos polímero PRx0729v6/ARNsi a diferentes relaciones de carga (Figura 16) El siguiente ejemplo demuestra que el polímero PRx0729v6 se une a ARNsi a varias relaciones de carga en un complejo con movilidad electroforática reducida.
La unión polímero-ARNsi se analizó por electroforesis en gel (Figura 16) y demuestra que la unión completa del ARNsi con el polímero se da a una relación de carga polímero/ARNsi de 4:1 y más altas.
Ejemplo 18: Conjugación de ARNsi con micela ¡ A. Conjugación de ARNsi bicatenario con copolímero de bloque que contiene tiol.
Se preparó ARNsi-piridil disulfuro disolviendo amino-ARNsi a 10 mg/ml en fosfato de sodio 50 mM, NaCl 0.15 M, pH 7.2, u otro amortiguador no aminado, por ejemplo, 6459. ? borato, HEPES, bicarbonato con un pH en el intervalo adecuado para la modificación del éster NHS (pH 7-9) . El SPDP se disolvió a una concentración de 6.2 mg/ml en DMSO (solución madre 20 mM) y 25 µ? de la solución madre SPDP se adicionaron por cada mL de amino-ARNsi que se modificaría. La solución se mezcló y se hizo reaccionar durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. Los tiempos de reacción más largos (incluso, durante toda la noche) no afectaron desfavorablemente la modificación. El ARN modificado i (piridil disulfuro) se purificó y se aisló de los subproductos de reacción por diálisis (o filtración en gel), utilizando fosfato de sodio 50 mM, NaCl 0.15 M, EDTA 10 mM, pH 7.2. El ARNsi-piridil disulfuro preparado se í hizo reaccionar con el polímero PRx0729v6 (que contenía el tiol libre en el extremo ?) a una relación molecular de 1:5, en presencia de EDTA 10-50 mM en PBS, pH 7.2. El grado de reacción se monitoreó por espectrofotometria a través de la liberación de piridina-2-tiona y por electroforesis en gel.
B. Conjugación de ARN monocatenario con polímero seguida de la hibridación de la segunda hebra.
El conjugado ARN monocatenario-piridil disulfuro, se preparó mediante el procedimiento del ejemplo anterior, a partir de ARN monocatenario modificado con amina. Después de la unión del ARN piridil disulfuro con la micela del copolímero de bloque, se adicionó a la mezcla de reacción 6459.5 la hebra ARN complementaria y las dos hebras se dejaron aparear durante 1 hora a una temperatura aproximada de 20°C inferior a la Tm del ARN bicatenario.
Ejemplo 19: Actividad de silenciamiento génico (knock-down) del complejo ARNsi-micela en células de mamífero cultivadas .
(Figura 17 y Figura 18) La actividad de silenciamiento génico (KD o knock-down) de los complejos ARNsi/polímero PRx0729v6,, se evaluó en formato de 96 pocilios, determinando la expresión génica específica después de 24 horas de tratamiento con los complejos PRx0729v6 : ARNsi . El polímero y el ARNsi dirigido a GAPDH o el ARNsi de control negativo (Ambion) se mezclaron en 25 µ?. para obtener varias relaciones de carga y concentraciones equivalentes a 5 veces más con respecto a la concentración de transfección final y se dejaron acomplejar durante 30 minutos antes de su adición a células HeLa en 100 ]1? de medio normal que contenía suero fetal de bovino (FBS o fetal jovine serum) 10%. Las concentraciones finales de ARNsi se evaluaron a 100, 50, 25 y 12.5 nM. El polímero se adicionó a relaciones de carga 4:1, 2:1 ó 1:1 o a concentraciones fijas de polímero de 18, 9, 4.5 y 2.2 µg/mL para determinar cuáles condiciones daban la mayor actividad KD. Para las relaciones de carga (Figura 17A) , 6459.5 los complejos se prepararon a concentraciones mayores, se incubaron durante 30 minutos y se diluyeron en serie 5 veces con respecto a la concentración de las gráficas justo antes de la adición a las células. Para la concentración de polímero fijado (Figura 17B) , el ARNsi y el polímero se acomplejaron a concentraciones 5 veces mayores con respecto a las concentraciones que se muestran en la gráfica, se incubaron durante 30 minutos y luego se adicionaron a las células para obtener las concentraciones finales que se presentan. La Figura 17C es el control negativo. El AR total se aisló a las 24 horas posteriores al tratamiento y la expresión GAPDH se midió con relación a 2 genes normalizantes internos, RPL13A y HPRT, por reacción en cadena de polimerasa (PCR o polymerase chain reaction) cuantitativa. Los resultados en las Figuras 17A, 17B, 17C y Figura 18A y 18B, indican una actividad KD >60% (sombreado) obtenida con el polímero PRx0729v6 en concentraciones de 9 µg/mL y mayores a todas las concentraciones de ARNsi analizadas. Esta concentración coincidió con la formación de micelas estables según el análisis de tamaño de partícula. Con 4.5 µg/mL PRx0729v6/ARNsi 12.5 nM se observó actividad KD elevada, sólo cuando los complejos se prepararon a concentraciones altas y se diluyeron en serie (relación de carga 4:1), en comparación con la formación de complejos a concentraciones inferiores (concentración de 6459.5 polímero fija de 4.5 µ9/p???) . Por otra parte, sólo con ARNsi 100 nM con 4.5 µ9/??1? de PRx0729v6, se observó alta actividad KD mientras que con concentraciones de ARNsi inferiores, no. En resumen, las micelas de PRx0729v6 fueron estables a una dilución inferior a -10 µ /p??; y la actividad KD se perdió por debajo de ~5 µg/mL, lo que indica que se requieren micelas estables para lograr una buena actividad KD.
Ejemplo 20: Actividad de silenciamiento génico ( knock-down) de complejos ARNsi sustrato dicer específico de GAPDH/polímero, en células de mamíferos.
La actividad de silenciamiento génico (KD knock-down) de complejos ARNsi sustrato dicer específico de GAPDH/polímero se evaluó en formato de 96 pocilios, determinando la expresión génica de GAPDH después de 24 horas de tratamiento con los complejos de polímero:ARNsi dicer GAPDH. La secuencia ARNsi dicer GAPDH es: hebra codificante : rGrGrUrCrArUrCrCrArUrGrArCrArArCrUrUrUrGrGrUrAdTdC, hebra antisentido : rGrArUrArCrCrArArArGrUrUrGrUrCrArUrGrGrArUrGrArCrCrUrU. El polímero y el ARNsi dirigido a GAPDH o el ARNsi de control negativo (IDT) se mezclaron en 25 µL para obtener varias relaciones de carga y concentraciones equivalentes a 5 6459.5 veces más con respecto a la concentración de transfección final y se dejaron acomplejar durante 30 minutos antes de su adición a células HeLa en 100 µ??. de medio normal que contenía FBS 10%. Las concentraciones finales de ARNsi se evaluaron a 100, 50, 25 y 12.5 nM. El polímero se adicionó i a relaciones de carga 4:1, 2:1 ó 1:1 o a concentraciones fijas de polímero de 40, 20, 10 y 5 para determinar cuáles condiciones daban la mayor actividad KD . El ARN total se aisló a las 24 horas posteriores al tratamiento y la expresión GAPDH se midió con relación a 2 genes normalizantes internos, RPL13A y HPRT, por PCR cuantitativa. Los resultados indican una actividad KD >60% obtenida con el polímero en concentraciones de 10 g/mL y mayores a todas las concentraciones de ARNsi analizadas. Esta concentración coincidió con la formación de micelas estables según el análisis de tamaño de partícula.
Ejemplo 21: Actividad de silenciamiento génico (knock-down) de complejos ApoBlOO ARNsi/polímero, en células cultivadas de mamíferos .
La actividad de silenciamiento génico (KD o knock-down) de ARNsi o ARNsi sustrato dicer específicos para ApoBlOO acomplejados con el polímero, se evaluó en formato de 96 pocilios, determinando la expresión génica de ApoBlOO después de 24 horas de tratamiento con los 6459.5 complejos de polímero: ARNsi ApoB. La secuencia AR si ApoBlOO es: hebra codificante: 51 -rGrArArUrGrürGrGrGrUrGrGrCrArArCrUrUrUrArG-3 ' , hebra antisentido: 5 ' -rArArArGrUrürGrCrCrArCrCrCrArCrArUrUrCrArG-3 ' .
El ARNsi sustrato dicer ApoBlOO es : hebra codificante: 51 -rGrArArUrGrUrGrGrGrUrGrGrCrArArCrUrUrürArArArGdGdA, hebra antisentido: 51 -rUrCrCrUrUrUrArArArGrUrUrGrCrCrArCrCrCrArCrArUrUrCrArG- i 31. ! El polímero y el ARNsi dirigido a ApoB o el ARNsi de control negativo (IDT) se mezclaron en 25 µ?? para obtener varias relaciones de carga y concentraciones equivalentes a 5 veces más con respecto a la concentración de transfeccion final y se dejaron acomplejar durante 30 minutos antes de su adición a células HepG2 en 100 µ?? de medio normal que contenía FBS 10%. Las concentraciones finales de ARNsi se evaluaron a 100, 50, 25 y 12.5 nM. El polímero de adicionó a relaciones de carga 4:1, 2:1 ó 1:1 o a concentraciones fijas de polímero de 40, 20, 10 y 5 µg/mL para determinar cuáles condiciones daban la mayor actividad KD. El ARN total se aisló a las 24 horas posteriores al tratamiento y la expresión de ApoBlOO se midió con relación a 2 genes normalizantes internos, RPL13A y HPRT, por' PCR cuantitativa. Los resultados indican una actividad KD >60% 6459.5 obtenida con el polímero en concentraciones de 10 µ9/??]-1 y mayores a todas las concentraciones de ARNsi analizadas. Esta concentración del polímero coincidió con la formación de micelas estables según el análisis de tamaño de partícula.
Ejemplo 22 : Actividad de silenciamiento génico ( knock-down) de complejos ApoBlOO ARNsi/polímero, en un modelo de ratón.
La actividad de silenciamiento génico de los complejos ARNsi específico para ApoBlOO/polímeró,! se determinó en un modelo de ratón por medición dé la expresión ApoBlOO en tejido hepático y los niveles de colesterol sérico. A ratones Balb/C se les administró en la vena de la cola por vía intravenosa 1, 2 ó 5 mg/kg de ARNsi específico para ApoB acomplejado con polímero a una relación de carga de 1:1, 2:1 ó 4:1 (polímero : ARNsi ) o solución salina de control. 48 horas después de la dosis final los ratones se sacrificaron y se aislaron muestras de sangre y hepáticas. Se midieron los niveles de colesterol sérico. El ARN total se aisló del hígado y se midió la expresión de ApoBlOO con relación a 2 genes normalizantes, HPRT y GAPDH, por PCR cuantitativa. Los resultados mostraron una reducción >60% de los niveles hepáticas de ARNm ApoB a la dosis de 2 mg/kg de ARNsi. Esta reducción es dependiente de la dosis ya que 5 mg/kg de ARNsi mostraron G459.5 >80% de KD y la dosis de 1 mg/kg de ARNsi mostró -50% KD. Se observó una disminución en los niveles de colesterol sérico también en función de la dosis (~30-50% de reducción en comparación con el control salino) .
Ejemplo 23 : Actividad de silenciamiento génico (knock-down) de complejos oligonucleótido ADN antisentido ApoBlOO/polímero, en células de mamífero cultivadas.
La capacidad de silenciamiento génico (KD) de oligonucleótido ADN antisentido específico para ApoBlOO acomplejado con polímero, se evaluó en formato de 96 pocilios por medición de la expresión génica de ApoBlOO después de 24 horas de tratamiento con complejos polímero : oligonucleótido ADN antisentido ApoB. Dos oligonucleótidos antisentido ApoBlOO específicos para ApoB de ratón, son: 5 ' -GTCCCTGAAGATGTCAATGC-3 ' , posición 541 de la régión codificante y 5 ' -ATGTCAATGCCACATGTCCA-31 , posición 531 de la región codificante.
El polímero y un oligonucleótido ADN antisentido dirigido a ApoB o el oligonucleótido ADN de control negativo (secuencia desordenada) se mezclaron en 25 µ?? para obtener varias relaciones de carga y concentraciones i equivalentes a 5 veces más con respecto a la concentración de transfección final y se dejaron reaccionar durante 30 6459.5 minutos antes de su adición a células HepG2 en 100 µ?? de medio normal que contenía FBS 10%. Las concentraciones finales de oligonucleótido se evaluaron a 100, 50, 25 y 12.5 nM. El polímero de adicionó a relaciones de carga 4:1, 2:1 ó 1:1 o a concentraciones fijas de polímero de 40, 20, 10 y 5 µg/mL para determinar cuáles condiciones daban la mayor actividad KD . El ARN total se aisló a las 24 horas posteriores al tratamiento y la expresión de ApoBlOO se midió con relación a 2 genes normalizantes internos, RPL13A i y HPRT, por PCR cuantitativa. I Ejemplo 24 : Demostración de la actividad desestabilizante de membrana de las micelas y sus complejos ARNsi (Figura 19) La actividad desestabilizante de membrana, sensible al pH, se evaluó por titulación del polímero ; solo o de los complejos PRx0729v6 : ARNsi en preparaciones de eritrocitos humanos (RBC o red blood cells) y por determinación de la actividad lítica en membrana por liberación de hemoglobina (lectura de absorbancia a 540 nm) . Se usaron tres diferentes condiciones de pH para simular los entornos de pH endosómico (pH extracelular = 7.4, endosómico anticipado pH = 6.6 y endosómico tardío pH = 5.8). Los eritrocitos humanos (RBC) se aislaron1 por centrifugación a partir de sangre completa en tubos a vacío 6459.5 (vaccutainers) que contenían EDTA. Los RBC se lavaron tres veces con solución salina normal y se llevaron a una concentración final de 2% de RBC en PBS a pH específico (5.8, 6.6 ó 7.4) . El PRx0729v6 solo o los complejos PRx0729v6/ARNsi se evaluaron a concentraciones justo por arriba y por debajo de la concentración de estabilidad crítica (CSC) como se muestra en la Figura 19. Para el complejo polímero/ARNsi, se adicionó AR si 25 nM al polímero PRx0729v6 a relaciones de carga de 1:1, 2:1 y 4:1 y 8:1 las mismas concentraciones de polímero en caso del polímero solo) . Soluciones de polímero solo o de complejos polímero-ARNsi se obtuvieron durante 30 minutos a la concentración final 20X evaluada y se diluyeron en cada preparación RBC. Se compararon dos preparaciones diferentes de solución madre de polímero PRx0729v6 respecto a la estabilidad de la actividad, a los 9 y 15 días posteriores a la preparación, se almacenaron a 4°C a partir del día de la preparación. Los RBC con el polímero solo (Figura 19A) o el complejo polímero/ARNsi (Figura 19B) , se incubaron a 37°C durante 60 minutos y se centrifugaron para eliminar los RBC intactos. Los sobrenadantes se transfirieron a celdas y la absorbancia se determinó a 540 nm. El por ciento de hemolisis se expresó como A540 de muestra/A¾0 de RBC tratados con Tritón X-100 al 1% (control para 100% de lisis) . Los resultados muestran que el polímero PRx0729v6 6459.5 solo o el complejo PRx0729v6/ARNsi no es hemolítico a pH 7.4 y se vuelve más hemolítico a los valores dé pH inferiores asociados con endosomas y a concentraciones más altas de polímero. ; j 'i Ejemplo 25. Microscopía de fluorescencia de la captación celular y distribución intracelular de los complejos j polímero-ARNsi (Figura 20) j Este ejemplo demuestra que el polímero PRx0729v6 i puede intervenir para una captación celular de ARNsi marcado con fluorescentes y de liberación endosómicaj más eficientes que un reactivo de transfeccion lipídico. I I Se depositaron células HeLa en portaobjetos para cámara de cultivo Lab-Tek II. Después de la incubación durante la noche, las células se transfectaron con j FA -AR si 100 nM/lipofectamina 2000 o con FAM 100 nM - ARNsi a una relación de carga polímero-ARNsi de 4:1. Los complejos i se formaron en PBS, pH 7.4, durante 30 minutos a¡ una concentración 5X, se adicionaron a las células para obtíener I una concentración final IX y se incubaron durante la noche. Las células se tiñeron con DAPI (para visualizar el núcleo) durante 10 minutos y luego se fijaron en formaldehído : 3.7% i - PBS IX, durante 5 minutos y se lavaron con PBS . > Las muestras se analizaron en un microscopio de fluorescéncia Zeiss Axiovert. La Figura 20B muestra la microscopía de fluorescencia de la captación celular y la distribución intracelular del complejo polímero-ARNsi comparadas con la lipofectamina (Figura 20A) . La tinción particulada de los complejos lipofectamina-ARNsi sugiere una ubicación endosómica, mientras que la tinción citoplásmica difusa de los complejos polímero-ARNsi indica que se han liberado de los endosomas al citoplasma.
Ejemplo 23.[sic] Captación de moléculas hidrofóbicas pequeñas en las micelas de polímero PRx0729v6 Este ejemplo demuestra que las moléculas hidrofóbicas pequeñas son captadas por el centro de la micela predominantemente hidrofóbico del polímero PRx0729v6.
La formación de las micelas poliméricas con o sin ARNsi se confirma mediante una técnica con sonda de fluorescencia que utiliza pireno (C16H10, PM = 202) , en la cual la partición del pireno en el centro micelar se puede determinar mediante la razón de máxima emisión 2 del espectro del pireno. El espectro de emisión de fluorescencia del pireno en la solución de la micela polimérica, se mide entre 300 y 360 nm utilizando una longitud de onda de excitación fija de 395 nm con una concentración de pireno constante de 6 x 10"7 M. El polímero varía de 0.001% a 20% (p/p) con o sin 100 nM de 6459.5 AR si . Los datos espectrofotométricos se obtuvieron en un espectrofotómetro de fluorescencia Varían. Todos los experimentos de fluorescencia se llevaron a cabo a 25 °G. La concentración micelar crítica (CMC) se determina graficando la relación de intensidad I336/I333 como función de la concentración del polímero.
Del mismo modo, un modelo de medicamento de molécula pequeña, el dipiridamol, (2- { [9- (bis (2-hidroxietil) amino) -2 , 7 -bis ( 1 -piperidil ) -3,5,8,10- í tetraazabiciclo [4.4.0] deca-2 , 4 , 7 , 9, ll-pentaen-4-il] -2-hidroxietil) amino} etanol; C24H40H8O4, PM = 505) se incorpora en el centro de la micela de PRx0729v6 de la manera siguiente. El polímero (1.0 mg) y el dipiridamol (DIP) (0.2 mg) se disuelven en THF (0.5 mL) . Gota a gota, se adiciona agua desionizada (10 mL) y la solución se agita a 50°C durante 6 horas para incorporar el medicamento en el centro hidrofóbico de la micela. La solución (2.5 mL) se divide y la absorbancia del dipiridamol se mide a 415 nm por espectroscopia UV a 25 y 37 °C. También se realizan mediciones de control determinando la reducción en función del tiempo de la absorbancia de dipiridamol en agua desionizada en ausencia del copolímero. La absorbancia a 25°C y a 37°C se mide en cada punto de evaluación y el 1 i valor se resta de la observada en la solución. 6459.5 Ejemplo 26. Métodos para conjugar ligandos dirigidos y polinucleótidos con un copolímero Los siguientes ejemplos muestran métodos para conjugar un ligando dirigido (por ejemplo, galactosa) o un agente terapéutico polinucleótido (por ejemplo, AR si) con un copolímero dibloque. (1) El polímero se prepara por transferencia por adición fragmentación reversible (RAFT) (Chiefari et al. Macromolecules, 1998 ;31 (16) : 5559-5562) para formar un copolímero dibloque con grupo galactosa terminal, utilizando un agente de transferencia de cadena con galactosa como grupo sustituyente R. (2) El primer bloque de un copolímero dibloque se prepara como un copolímero que contiene ácido metilacrílico-N-hidroxisuccinimida (MAA(NHS)) en donde la galactosa-PEG-amina se conjuga con los grupos NHS o en donde un ARNsi amino disulfuro se conjuga con el NHS o donde una piridil disulfuro amina se hace reaccionar con grupos NHS para formar un piridil disulfuro que luego reacciona con ARN tiolado y forma un conjugado polímero-ARN .
Ejemplo 26.1: Preparación de galactosa-PEG-amina y galactosa-CTA El esquema 1 ilustra la síntesis esquemática de la galactosa-PEG-amina (compuesto 3) y la galactosá-CTA (agente de transferencia de cadena) (compuesto 4) . 6459.5 Compuesto 1: Pentaacetato de galactosa (10 g, 25.6 mmoles) y 2- [2- (2-cloroetoxi) etoxi] etanol (5.6 mL, 38.4 mmoles) se disolvieron en CH2C12 anhidro (64 mL) y la mezcla de reacción se mantuvo en agitación a temperatura ambiente durante 1 h. Gota a gota se adicionó a la mezcla anterior BF3.OEt2 (9.5 mL, 76.8 mmoles) y se mantuvo en baño de hielo durante 1 h. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente (RT o roo temperature) 48 horas. Al término de la reacción, se adicionaron 30 mL de CH2C12 para diluir la reacción. La fase orgánica se neutralizó con NHC03(ac) saturado, se lavó con salmuera y luego se secó con MgS04. Se eliminó el CH2C12 a presión reducida y se obtuvo el producto crudo. El producto crudo se purificó por cromatografía en columna flash y se obtuvo el producto final 1 como un aceite de color amarillo claro.
Rendimiento. 55% por cromatografía en capa fina (TLC o thin layer chromatography) (l2 y p-anisaldehído) : EA/Hex : 1/1 (Rf: ß = 0.33; a = 0.32; sin reaccionar S.M. 0.30).
Compuesto 2 : El compuesto 1 (1.46 g, 2.9 mmoles) se disolvió en DMF seco (35 mL) y se adicionó NaN3 (1.5 g, 23.2 mmoles) a la mezcla a RT. La mezcla de reacción se calentó a 85-90°C durante la noche. Al término de la reacción, se adicionó EA (15 mL) a la solución y se uso agua (50 mL) para lavar la fase orgánica 5 veces. La fase orgánica se secó con MgS04 y se purificó por cromatografía 6459.5 en columna flash obteniéndose el compuesto 2 como un aceite incoloro. Rendimiento: 80%, TLC (I2 y p-anisaldehído) :EA/Hex : l/l (Rf: 0.33).
Compuesto 3 : El compuesto 2 (1.034 g, 2.05 inmoles) se disolvió en MeOH (24 mL) y se burbujeó N2 durante 10 min, luego se adicionó Pd/C (10%) (90 mg) y TFA (80 µL) ,a la solución anterior. La mezcla de reacción se burbujeó otra vez con H2 durante 30 minutos y luego la reacción se agitó a RT en atmósfera de H2 durante 3 horas más. Con celite se eliminó el Pd/C y el MeOH se evaporó obteniéndose el compuesto 3 como un gel pegajoso. El compuesto 3 se puede usar sin purificación adicional. Rendimiento: 95%. TLC (p-anisaldehído) :MeOH/CH2Cl2 : 1/4 (Rf: 0.05).
Compuesto 4 : ECT (0.5 g, 1.9 mmoles) , NHS (0.33 g, 2.85 mmoles) y DCC (0.45 g, 2.19 mmoles) se disolvieron en CHC13 (15 mL) a 0°C. La mezcla de reacción se agitó en forma continua a RT durante la noche. El compuesto 3 (1.13 g, 1.9 mmoles) y TEA (0.28 mL, 2.00 mmoles) en CHC13 (10 mL) se adicionaron lentamente a la mezcla de reacción previa a 0°C. La mezcla de reacción se agitó en forma continua ¡a RT durante la noche. El CH3C1 se eliminó a presión reducida y el producto crudo se purificó por cromatografía en columna flash obteniéndose el compuesto 4 como un gel de color amarillo. Rendimiento (35%). TLC: MeOH/CH2Cl2 : 1/9 (Rf: 0.75) . 6459.5 Esquema 1. Síntesis de galactosa- PEG-amina (compuesto 3) y galactosa-CTA (compuesto 4) Ejemplo 26.2: Síntesis de [DMAE A] - [BMA-PAA-DMAEMA] A. Síntesis de DMAEMA macroCTA.
Polimerización: En un vial de vidrio de 20 mL (con tapón septa) se adicionaron 33.5 mg de ECT (CTA RAFT) , I 2.1 mg de AIBN (recristalizado dos veces en metanol) , 3.0 g de DMAEMA (Aldrich, 98%, se hizo pasar a través de una pequeña columna de aluminio, justo antes de utilizarse, para eliminar el inhibidor) y 3.0 g de DMF (alta pureza sin inhibidor) . El vial de vidrio se cerró con el tapón septa y se purgó con nitrógeno seco (se llevó a cabo en baño de hielo y con agitación) durante 30 minutos. El vial de reacción se colocó en una placa de reacción precalentada a 70 °C. La mezcla de reacción se mantuvo en agitación durante 6459.5 2 horas 40 minutos. El tapón septa se abrió y la mezcla se agitó en el vial en un baño de hielo durante 2-3 minutos para detener la reacción de polimerización.
Purificación: Se adicionaron 3 mL de acetona a la mezcla de reacción. En un matraz de 300 mL se adicionaron 240 mL de hexano y 60 mL de éter (80/20 (v/v) ) y la mezcla de reacción se adicionaron gota a gota al matraz y se mantuvo la agitación. Inicialmente se produce un aceite que se recolecta al sedimentar por agitación la solución turbia; rendimiento = 1.35 g (45%). Se realizaron varias precipitaciones (por ejemplo, 6 veces) en disolventes mezclados hexano/éter (80/20 (v/v)) a partir de solución de acetona. Por último, el polímero se secó a vacío durante 8 horas a RT; rendimiento «1 g.
Resumen: (Mn te6rico = 11,000 g/mol a 45% de conversión) DMF = 3.0 g; Purga con N2: 30 min; Polimerización a 70 °C durante 2 h 45 min.
B. Síntesis de [BMA-PAA-DMAEMA] a partir de DMAEMA macroCTA Todas las sustancias químicas y reactivos se adquirieron de Sigma-Aldrich Company, a menos que se 6459.5 especifique de otro modo. Metacrilato de butilo (BMA) (99%) y metacrilato de 2- (dimetilamino) etilo (DMAEMA) (98%) se hicieron pasar a través de una columna de alúmina básica (malla 150) para eliminar el inhibidor de polimerización. El ácido 2-propilacrílico (PAA) (>99%) se compró sin inhibidor y se uso tal como se recibió. El azobisisobutironitrilo (AIBN) (99%) se recristalizó de metanol y se secó a vacío. El DMAEMA macroCTA se sintetizó y se purificó tal como se describe en lo anterior (Mn -10000; PDI -1.3; >98%) . La N, N-dimetilformamida (DMF) (99.99%) (de EMD) fue grado reactivo y se utilizó tal como se recibió. El hexano, pentano y éter de EMD, tal como se recibieron, se utilizaron para la purificación del polímero .
Polimerización: BMA (2.1 g, 14.7 mmoles), PAA (0.8389 g, 7.5 mmoles), DMAEMA (1.156 g, 7.35 mmoles), macroCTA (0.8 g, 0.0816 mmoles), AIBN (1.34 mg, 0.00816 mmoles; CTA:AIBN 10:1) y DMF (5.34 mL) se adicionaron en atmósfera de nitrógeno en un vial cerrado herméticamente. La relación CTA: Monómeros utilizada fue 1:360 (suponiendo 50% de conversión) . La concentración de monómeros fue 3 M. La mezcla se desgasificó por burbujeo de nitrógeno en la mezcla durante 30 minutos y luego se colocó sobre una placa de calentamiento (termómetro: 67°C; visualización : 70-71; velocidad de agitación 300-400 rpm) . La reacción se dejó 6459.5 durante 6 horas, luego se detuvo colocando el vial en hielo y exponiendo la mezcla al aire.
Purificación: La purificación del polímero se hizo de acetona/DMF 1:1 a hexano/éter 75/25 (tres veces) . El polímero resultante se secó a vacío durante un mínimo de 18 horas. El espectro R N mostró alta pureza en el polímero. No se observaron grupos vinílieos. El polímero se dializó de etanol contra agua bidesionizada durante 4 días y luego se liofilizó. El polímero se analizó por cromatografía de permeación en gel (GPC) en las siguiéntes condiciones: Disolvente: DMF/LiBr 1%. Velocidad de flujo: 0.75 mL/min. Volumen de inyección: 100 pL.
Temperatura de la columna: 60 °C. Se uso poliestireno para calibrar los detectores. Análisis GPC del polímero resultante: Mn = 40889 g/mol . PDI = 1.43. dn/dc = 0.049967.
Ejemplo 26.3. Síntesis de gal- [DMAEMA] - [BMA-PAA-DMAEMA] La síntesis se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 20.2. Primero, se preparó galactosa-DMAEMA macroCTA (Ejemplo 20.2. A) pero se usó galactosa-CTA (Ejemplo 20.1, compuesto 4) en lugar de ECT como agente de transferencia de cadena. Esto dio lugar a la síntesis de poli-DMAEMA con un grupo galactosa terminal (Figura 21) . La galactosa-DMAEMA-macro-CTA se usó después para sintetizar 6459.5 el segundo bloque [BMA-PAA-DMAEMA] tal como se describe en el Ejemplo 20.2. B. Después de la síntesis, los grupos protectores acetilo en la galactosa se eliminaron por incubación en 100 mM de amortiguador de bicarbonato de sodio, pH 8.5, durante 2 horas, seguida de diálisis y liofilización. Se utilizó espectroscopia RMN para confirmar la presencia en el polímero de la galactosa desprotegida.
Ejemplo 26.4. Preparación y caracterización de copolímeros dibloque [PEGMA-MAA (NHS) ] - [B-P-D] y DMAEMA-MMA (NHS) - ¿B-P-D]_.
La síntesis del polímero se realizó como se describe en el Ejemplo 20.2 (y se resume en la Figura 5) con proporciones de alimentación de monómeros adecuadas para obtener la composición deseada en el primer copolímero de bloque. La Figura 6 resume la síntesis y caracterización i del polímero [PEGMA-MAA (NHS) ]- [B-P-D] en donde la relación de monómeros en el copolímero en el primer bloque es de 70:30.
Ejemplo 26.5. Conjugación de galactosa-PEG-amina con PEGMA-MAA(NHS) para producir el polímero [PEGMA-MAA (Gal) ]- [B-P-D] La Figura 22 ilustra la preparación de copolímeros dibloque DMAEMA-MAA (NHS) con grupo funcional galactosa o PEGMA-MAA (NHS ) . El polímero [DMAEMA-MMA (NHS) ] - 6459.5 [B-P-D] o [PEGMA-MAA (NHS ) ] - [B-P-D] se disolvió en DMF a una concentración entre 1 y 20 mg/ml. La galactosa- PEG-amina preparada como se describe en el Ejemplo 20.1 (compuesto 3) se neutralizó con 1 a 2 equivalentes de trietilamina y se adicionó a la mezcla de reacción en una proporción de 5 a 1 con respecto al polímero. La reacción se llevó a cabo a i 35°C durante 6 a 12 horas, después se adicionó un volumen igual de acetona, se dializó contra agua desionizada durante 1 día y se liofilizó.
Ejemplo 26.6. Conjugación de ARNsi con [PEGMA-MAA (NHS) ]- [B-P-D] para producir polímero [PEGMA-MAA (ARN) ] - [B-P-D] Las Figuras 23A y 23B muestran las estructuras de 2 ARNsi modificados que se pueden conjugar con polímeros que contienen NHS preparados tal como se describe en el Ejemplo 20.4. Los ARNsi se obtuvieron de Agilent (Boúlder, CO) . La Figura 23C muestra la estructura de la piridil disulfuro amina utilizada para derivatizar los polímeros que contienen NHS y proporcionar un grupo reactivo disulfuro para la conjugación del ARN tiol (Figura 23B) .
Reacción del polímero que contiene NHS con ARNsi-disulfuro-amina . La reacción se lleva a cabo en condiciones estándar en un disolvente orgánico (por ejemplo, DMF o DMSO o una mezcla de DMSO/amortiguador pH 7.8) a 35°C durante 4 a 8 horas, después se adicionó un volumen igual de acetona, G459.5 ¡ se dializó contra agua desionizada durante 1 día y se liofilizó .
Reacción de polímero que contiene NHS con piridil disulfuro amina y reacción con ARNsi tiol . La reacción de piridil disulfuro amina con polímeros que contienen NHS se lleva a cabo tal como se describe en el Ejemplo 20.5. Posteriormente, el polímero liofilizado se disolvió en etanol a 50 mg/ml y se diluyó 10 veces en amortiguador de bicarbonato de sodio a pH 8. El ARNsi tiol (Figura 23B) se hizo reaccionar, con un exceso molar de 2 a 5 respecto a los grupos NHS del polímero, a 35°C durante 4 a 8 horas y después se dializó contra amortiguador de fosfato, pH 7.4.
Ejemplo 27. Determinación del número de agregación micelar (cadenas poliméricas por micela) El peso molecular promedio en peso (Mw) y el número de agregación (Naggr) de las micelas se determinó por mediciones de dispersión luminosa estática (SLS) utilizando una gráfica Debye . Este método supone que la intensidad de la luz dispersa que produce una partícula es proporcional al producto del peso molecular promedio en peso y la concentración de la partícula, como se representa en la siguiente ecuación: 6459.5 en donde R0 es la relación Rayleigh (relación entre la luz dispersa y la luz incidente de la muestra) ; M es el peso molecular de la muestra; A2 es el 2 ° coeficiente viral; C es la concentración; K es la constante óptica definida como K = 4p2(?0 dn/dc)2A0 Na, en donde NA es el número de Avogadro; ?0 es longitud de onda láser; n0 es el índice de refracción del disolvente; y dn/dc es el incremento diferencial del índice de refracción de las micelas (0.2076 mL/g) .
La medición de la intensidad de luz dispersa (K/CR) de varias concentraciones (C) de polímeros a un ángulo, se determinó en un equipo Malvern Zetasizer Nano ZS y se comparó con la dispersión producida a partir de un estándar (es decir, tolueno) . La gráfica de Debye es una línea recta y permite la determinación del peso molecular absoluto de las micelas que es la intersección en el eje "y" de la gráfica a la concentración cero (K/CR = l/Mw en Daltones) . El número de agregación se calculó dividiendo el peso molecular de las micelas (determinado a partir de la gráfica Debye) entre el peso molecular de la cadena polimérica simple (calculada por el método de triple detección en GPC) . Los valores típicos fluctúan entre 30 y 50 para los polímeros dibloque, por ejemplo, [D] 10K - [B50-P25- Aun cuando se han presentado y descrito las 6459.5 modalidades preferidas de la invención, resultará obvio para los expertos en la técnica que estas modalidades se presentan sólo como ejemplo. Los expertos en la técnica concebirán numerosas variaciones, cambios y sustituciones sin desviarse de la invención. Se deberá entender que al llevar a la práctica la invención se pueden emplear varias alternativas a las modalidades de la invención que aquí se describen. Se pretende que las siguientes reivindicaciones definan el alcance de la invención y que los métodos y estructuras que están dentro del alcance de estas reivindicaciones y sus equivalentes queden cubiertos por las mismas. 6459.5

Claims (49)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende una micela polimérica y un polinucleótido asociado con la micela, la micela comprende una pluralidad de copolímeros de bloque, cada copolímero de bloque comprende un bloque hidrofílico y un bloque hidrofóbico, la pluralidad de copolímeros de bloque se asocia de tal forma que la micela es estable en medio acuoso a un pH aproximado al neutro, (a) la micela también tiene dos o más características seleccionadas a partir de: (i) la micela comprende aproximadamente entre 10 y 100 copolímeros de bloque por micela, (ii) una concentración micelar crítica, CMC, que varía de aproximadamente 0.2 µ9/?t?1 a 20 (iii) ensamblado micelar espontáneo en ausencia de ácido nucleico; (iv) un peso molecular promedio en peso de aproximadamente 0.5 x 106 a aproximadamente 3.6 x 106 daltones ; (v) un tamaño de partícula de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 500 nm; y (b) los copolímeros de bloque tienen una o más características seleccionadas a partir de: ¡ (i) una relación entre el peso molecular promedio numérico, Mn, del bloque hidrofílico y del bloque 6459.5 hidrofóbico, que varía entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:10, y (ii) un índice de polidispersidad de aproximadamente 1.0 a aproximadamente 2.0.
2. Una composición que comprende una micela polimérica y un polinucleótido asociado con la micela, la micela comprende una pluralidad de copolímeros de bloque, cada copolímero de bloque comprende un bloque hidrofílico y un bloque hidrofóbico, la pluralidad de copolímeros de bloque se asocia de tal forma que la micela es estable en medio acuoso a un pH aproximado al neutro, (a) la micela también tiene dos o más características seleccionadas a partir de: (i) la micela comprende entre aproximadamente 10 y aproximadamente 100 copolímeros de bloque por micela, (ii) una concentración micelar crítica, CMC, que varía de aproximadamente 0.2 µg/ml a aproximadamente 20 (iii) ensamblado micelar espontáneo en ausencia de ácido nucleico; (iv) un peso molecular promedio en peso de aproximadamente 0.5 x 106 a aproximadamente 3.6 x 10s daltones; y (b) los copolímeros de bloque tienen una o 6459.5 más características seleccionadas a partir de: (i) una relación entre el peso molecular promedio numérico, Mn, del bloque hidrofílico y del bloque hidrofóbico, que varía entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:10, y (ii) un índice de polidispersidad de aproximadamente 1.0 a aproximadamente 2.0.
3. Una composición que comprende una micela polimérica y un polinucleótido asociado con la micela, la micela comprende una pluralidad de copolímeros de bloque, cada copolímero de bloque comprende un bloque hidrofílico y un bloque hidrofóbico, la pluralidad de copolímeros de bloque se asocian de tal manera que la micela es estable en medio acuoso a un pH aproximado al neutro, la micela también tiene dos o más características seleccionadas a partir de: (i) un número de asociación que varía aproximadamente de 10 a aproximadamente 100 cadenas por micela, (ii) una concentración micelar crítica, CMC, que varía de aproximadamente 0.2 µ<3/??1, a aproximadamente 20 µg/mL, (iii) un tamaño de partícula de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 500 nM.
4. Una composición que comprende una micela 6459.5 polimérica y un polinucleótido asociado con la micela, la raicela comprende una pluralidad de copolímeros de bloque, cada copolímero de bloque comprende un bloque hidrofílico y un bloque hidrofóbico, la pluralidad de copolímeros de bloque se asocian de tal manera que la micela es estable en medio acuoso a un pH aproximado al neutro, los copolímeros de bloque tienen dos o más características seleccionadas a partir de: (i) una relación entre el peso molecular promedio numérico, Mn, del bloque hidrofílico y del bloque hidrofóbico, que varía entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 1:10, y (ii) un índice de polidispersidad de aproximadamente 1.0 a aproximadamente 2.0, y (iii) un peso molecular promedio en peso de aproximadamente 0.5 x 10s a aproximadamente 3.6 x 106 g/mol .
5. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde la micela tiene tres o más de las características de los subincisos (i) , (ii) , (iii) y (iv) .
6. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde la micela tiene todas las características de los subincisos (i), (ii) , (iii) y (iv) .
7. La composición según cualquiera de las 6459.5 reivindicaciones 1 ó 3, en donde el copolíraero de bloque tiene todas las características de los subincisos (i) , (ii) y (iii) .
8. La composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el copolímero de bloque tiene una relación entre el peso molecular promedio numérico, Mn, del bloque hidrofílico y el bloque hidrofóbico, que varía de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:10.
9. La composición según cualquiera de ; las reivindicaciones precedentes, en donde el copolímero de bloque tiene una relación entre el peso molecular promedio numérico, Mn, del bloque hidrofílico y el bloque hidrofóbico, que varía de aproximadamente 1:1.5 a 1:6.
10. La composición según cualquiera dé las reivindicaciones precedentes, en donde el copolímero de bloque tiene una relación entre el peso molecular promedio numérico, Mn, del bloque hidrofílico y el bloque hidrofóbico, que varía de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1:4.
11. La composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la micela comprende aproximadamente 10 a aproximadamente 100 copolímeros de bloque por micela.
12. La composición según cualquiera de las 6459.5 reivindicaciones precedentes, en donde la micela comprende aproximadamente 20 a aproximadamente 60 copolímeros de bloque por micela.
13. La composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la micela comprende aproximadamente 30 a aproximadamente 50 copolímeros de bloque por micela.
14. La composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la micela tiene una concentración micelar crítica, CMC, que varíaj de aproximadamente 0.2 µg/mL a aproximadamente 20 µg/mL.
15. La composición según cada reivindicación de las reivindicaciones precedentes, en donde la micela tiene una concentración micelar crítica, CMC, que varía de aproximadamente 0.5 µg/mL a aproximadamente 10 µg/mL.
16. La composición según cada reivindicación de las reivindicaciones precedentes, en donde la micela tiene una concentración micelar crítica, CMC, que varía de aproximadamente 1 µg/mL a aproximadamente 5 g/mL.
17. La composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el copolímero de bloque tiene una relación entre el peso molecular promedio numérico, Mn, del bloque hidrofílico y el bloque hidrofóbico, que varía de aproximadamente 1:1.5 a aproximadamente 1:6; y la micela: G459.5 (i) comprende aproximadamente 20 a aproximadamente 60 copolímeros de bloque por micela, y (ii) tiene una concentración micelar crítica, CMC, que varía de aproximadamente 0.5 µg/mL a aproximadamente 10 µ9/p?]??.
18. La composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el copolímero de bloque tiene una relación entre el peso molecular promedio numérico, Mn, del bloque hidrofílico y el bloque hidrofóbico, que varía de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1:4; y la micela: (i) comprende aproximadamente 30 a aproximadamente 50 copolímeros de bloque por micela, y (ii) tiene una concentración micelar crítica, CMC, que varía de aproximadamente 1 µg/mL a aproximadamente 5 µg/mL.
19. La composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde los copolímeros de bloque tienen un índice de polidispersidad aproximado de 1.0 a aproximadamente 2.0.
20. La composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde los copolímeros de bloque tienen un índice de polidispersidad aproximado de 1.0 a aproximadamente 1.7.
21. La composición según cualquiera de las 6459.5 reivindicaciones precedentes, en donde los copolímeros de bloque tienen un índice de polidispersidad aproximado de 1.0 a aproximadamente 1.4.
22. La composición según cualquiera dé las reivindicaciones precedentes, en donde la micela tiene un peso molecular agregado, Mw, de aproximadamente 0.5 x 106 a aproximadamente 3.6 x 106.
23. La composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la micela tiene un peso molecular agregado, Mw, de aproximadamente 0.75 x 106 a aproximadamente 2.0 x 106.
24. La composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la micela tiene un peso molecular agregado, Mw, de aproximadamente 1.0 x 106 a aproximadamente 1.5 x 106.
25. La composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la micela tiene un tamaño de partícula de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 500 nm.
26. La composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la micela tiene un tamaño de partícula de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 200 nm.
27. La composición según cualquiera de' las reivindicaciones precedentes, en donde la micela tiene un 6459.5 tamaño de partícula de aproximadamente 20 nm a aproximadamente 100 nm.
28. La composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el número de polinucleótidos asociados con cada micela es aproximadamente 1 a aproximadamente 10,000.
29. La composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el número de polinucleótidos asociados con cada micela es aproximadamente 4 a aproximadamente 5,000.
30. La composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el número de polinucleótidos asociados con cada micela es aproximadamente 15 a 3,000.
31. La composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el número de polinucleótidos asociados con cada micela es aproximadamente 30 a aproximadamente 2,500.
32. La composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la micela comprende un copolímero de bloque que comprende una pluralidad de unidades monoméricas catiónicas, las especies catiónicas en el bloque hidrofílico están en asociación iónica con el polinucleótido .
33. La composición según la reivindicación 34, G459.5 en donde las unidades monoméricas catiónicas son residuos de monómeros catiónicos, monómeros de base de Bronsted sin carga, o una combinación de los mismos.
34. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33, en donde el polinucleótido es un agente AR i o un ARNsi.
35. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33, en donde el polinucleótido no está en el centro de la micela.
36. La composición según cualquiera de ! las reivindicaciones 1 a 33, en donde la micela comprende un copolímero de bloque que comprende una pluralidad de unidades monoméricas aniónicas en el bloque hidrofílico y/o en el bloque hidrofóbico.
37. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33, en donde la micela comprende un copolímero de bloque que comprende una pluralidad de unidades monoméricas sin carga en el bloque hidrofílico y/o en el bloque hidrofóbico. '
38. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33, en donde la micela comprende un copolímero de bloque que comprende una pluralidad de unidades monoméricas zwiteriónicas en el bloque hidrofílico y/o en el bloque hidrofóbico.
39. La composición según cualquiera de las 6459.5 reivindicaciones 1 a 33, en donde la micela comprende un copolímero de bloque que comprende en el bloque hidrofóbico una pluralidad de residuos susceptibles de adquirir carga.
40. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33, en donde la micela comprende un copolímero de bloque que comprende en el bloque hidrofóbico al menos 20 residuos susceptibles de adquirir carga.
41. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33, en donde la micela comprende un copolímero de bloque que comprende en el bloque hidrofóbico al menos 15 residuos susceptibles de adquirir carga.
42. La composición según cualquiera de; las reivindicaciones 1 a 33, en donde la micela comprende un copolímero de bloque que comprende en el bloque hidrofóbico al menos 10 residuos susceptibles de adquirir carga.
43. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33, en donde la micela comprende un copolímero de bloque que comprende en el bloque hidrofóbico al menos 5 residuos susceptibles de adquirir carga.
44. La composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende un polímero bioconjugado que comprende uno o más polinucleótidos unidos por covalencia a uno o más de la pluralidad de copolímeros de bloque .
45. La composición según la reivindicación 44, 6459.5 en donde el polinucleótido es un ARNsi.
46. La composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la micela comprende un copolímero de bloque que comprende una pluralidad de unidades monoméricas que tienen especies aniónicas protonables y una pluralidad de especies hidrofóbicas .
47. La composición según la reivindicación 46, en donde las unidades monoméricas aniónicas son residuos de monómeros aniónicos, monómeros de ácido de Bronsted sin carga, o una combinación de los mismos. ¡
48. La composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la micela comprende un copolímero de bloque que comprende una pluralidad de unidades monoméricas derivadas de un monómero polimerizable que tiene especies hidrofóbicas .
49. La composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el o los copol meros de bloque son copolímeros de bloque desestabilizantes de membrana .
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